CN104995204B - 一种秋茄钠氢转运蛋白nha1及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

提供了一种来源于秋茄的钠氢转运蛋白NHA1、其编码基因及其在培育耐盐提高的转基因植物中的应用。

Description

一种秋茄钠氢转运蛋白NHA1及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种来源于秋茄的钠氢转运蛋白NHA1及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。
背景技术
盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有4亿公顷，占灌溉农田的1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约0.4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3％以下的土壤上，土壤中过量的Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。
植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展(Zhu JK.2002.Salt and drought stress singal transduction inplants.Annu.Rev.Plant Biol.53：1247-1273；Zhang ZL.2011.Arabidopsis FloralInitiator SKB1Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription andPre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3 and Small NuclearRibonucleoprotein LSM4 Methylation.Plant Cell，23：396-411)。高等植物细胞可通过多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号传递到胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内激活转录因子。激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达，从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。
发明内容
本发明人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆了一种秋茄钠氢转运蛋白(本文命名为NHA1)的编码基因，并测定了其DNA序列。并且发现通过转基因技术将其导入植株并使其表达后，可显著改善转基因植株的耐盐性，而且这些性状可稳定遗传。
本发明第一方面提供秋茄的一种钠氢转运蛋白NHA1的编码基因(本文命名为KcNHA1)，其序列为SEQ ID NO：2。
本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因，其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述表达载体是pCAMBIA2300；优选地，所述重组表达载体为附图2所示的35S-KcNHA1-2300载体。
本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。
本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。
本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。
本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
附图说明
图1是KcNHA1基因的植物表达载体(35S-KcNHA1-2300)构建流程(图1a-1b)。
图2是KcNHA1基因的植物表达载体(35S-KcNHA1-2300)的质粒图。
图3是转KcNHA1基因的T1代拟南芥植株的耐盐实验结果，T1m1表现出显著的耐盐性，T1m10、T1m18的结果与其类似，在此未示出。
图4为利用反转录PCR对T1代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中KcNHA1基因的转录水平进行分子水平检测的结果。M为DNA Ladder Marker(DL2000)，1-8为耐盐T1代转基因拟南芥植株(分别属于T1m1、T1m10、T1m18三个株系)，9-12为非转基因对照拟南芥植株。
具体实施方式
提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。
以下实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自New England Biolabs公司。
在本发明中，如果没有注明并且在上下文中没有歧义，比例和百分比是基于重量计算的。
实施例1.盐胁迫下秋茄SSH文库构建：
具体方法为：
按照Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建SSH文库(抑制差减文库)。在实验过程中以盐处理的秋茄根中提取的mRNA作为样本(Tester)，以未处理的秋茄根中提取的mRNA作为对照(Driver)。具体步骤如下：
(1)供试材料：
秋茄采自广东省深圳市福田国家级自然保护区(N22°53′，E114°01′)。采集无虫害、发育良好、成熟程度接近的秋茄(Kandelia candel)胚轴，选取大小、长度、重量接近的胚轴用于实验。在塑料桶(盆口径18cm，高15cm)中沙培，每个桶底部垫塑料托盘，细沙为河沙，平均粒径约为1mm，自来水洗净，每个小桶种植胚轴4个。在28℃，自然光照12小时每天的条件下萌发生长苗木培养期间，每天浇适量的自来水补充水分，并且每一周浇一次Hoagland营养液(D.R.Hoagland and D.I.Arnon.The water-culture method of growingplants without soil.Calif.Agr.Expt.Sta.Circ.347.1950)。
(2)材料处理：
选择生长发育外观一致(幼苗高度一致、每株幼苗长至6片叶子)的秋茄幼苗，分成两组，一组浇2L 500mM NaCl，一组浇2L蒸馏水，处理时间为6小时。收集处理组和对照组的根。用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。
(3)总RNA提取：
分别取对照组和盐处理组的秋茄根各3.0g，用植物RNA提取试剂盒(购自Invitrogen)提取总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定所得总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高；用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒(从总RNA中纯化polyA+RNA)分离mRNA。
(4)抑制差减杂交：
按Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进行抑制差减杂交。先将Driver mRNA和Tester mRNA分别反转录(反转录引物为试剂盒所提供引物)，得到双链cDNA，再以2μg Tester cDNA和2μg Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在37℃水浴下分别将Tester cDNA和Driver cDNA用Rsa I酶切1.5小时，然后将酶切后的Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的Tester cDNA分别与过量的Driver cDNA混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次正向差减杂交的产物混合，再与新变性的Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，通过两次抑制性PCR扩增富集差异表达基因的片段(PCR进行前，将第二次正向差减杂交产物进行末端补平)。
(5)差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定
依照pGEM-T Easy试剂盒(购自Promega)的说明书，将所述第二次正向差减杂交cDNA片段的第二次抑制性PCR扩增产物(使用QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自Qiagen)与pGEM-T Easy载体连接，其具体步骤如下：在200μl PCR管中依次加入下列成分：纯化的合并后的正向差减杂交cDNA片段的第二次抑制性PCR产物3μl、2×T4 DNA连接酶缓冲液5μl、pGEM-T Easy载体1μl、T4 DNA连接酶1μl，于4℃连接过夜。然后取10μl连接反应产物，加入到100μl大肠杆菌JM109感受态细胞(购自TAKARA)中，冰浴30分钟、热休克60秒、冰浴2分钟，然后加入250μl LB液体培养基(含有1％胰蛋白胨(Tryptone，购自OXOID)、0.5％酵母提取物(Yeast Extract，购自OXOID)和1％NaCl(购自国药))后置于37℃摇床中，以225rpm振荡培养30分钟，然后从中取200μl菌液接种于含50μg/ml氨苄青霉素、40μg/mL X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、24μg/mL IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的LB(同上)固体(1.5％琼脂，下同)培养板上(X-gal和IPTG均购自TAKARA)，37℃培育18小时。计数培养板中直径＞1mm的清晰白色及蓝色菌落，随机挑取300个白色菌落(编号：Kc-SR-001至Kc-SR-300)。将所挑取白色菌落分别接种于96孔细胞培养板(CORNING)中的含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(同上)中，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度为20％(体积比)，然后于-80℃保存备用。使用巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R(来自Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒)对所培养的菌液分别进行PCR扩增验证，得到232个阳性克隆，然后将所有阳性克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。
(6)差异克隆的cDNA测序分析：
将DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的cDNA后，共得到214个有效表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)(Unigene)。
实施例2秋茄钠氢转运蛋白编码基因KcNHA1的克隆
将所述鉴定的秋茄SSH文库中编号为Kc-SR-142的克隆子去掉冗余DNA后，序列为SEQ ID No：3，序列分析表明该序列编码的蛋白属于钠氢转运蛋白。本文将SEQ ID No：3序列对应的全长编码基因命名为KcNHA1，其对应的蛋白命名为NHA1。
SEQ ID No：3：
KcNHA1全长编码基因的克隆
根据已经获得的SEQ ID No：3序列，设计如下两条特异性引物，作为3’RACE的5’端特异性引物。
KcNHA1 GSP1：SEQ ID No：4：
GCATACCTTT CGTATATGCT GGC
KcNHA1 GSP2：SEQ ID No：5：
ACTACCAAGC ATGCTTTTGC AACC
实验步骤按试剂盒说明书操作(3’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends试剂盒购自Invitrogen公司)。
用SEQ ID NO：4与通用引物AUAP(试剂盒自带)，以盐处理组提取的mRNA反转录得到的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。具体步骤如下：
50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、2.0μl cDNA、1.0μlEx Taq(购自TAKARA)、10μM的引物SEQ ID NO：4和AUAP各2.0μl以及35μl双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。
将所得的PCR产物用双蒸水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO：5与通用引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：
50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、2.0μl稀释的第一轮PCR产物、1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：5和AUAP各2.0μl以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。
回收第二轮PCR产物中片段约为1000bp的条带(Gel Extraction Kit购自OMEGA)，并将其连接于pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中(具体方法同上)，并将转化后的菌液涂布于含50μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL X-gal、24μg/mL IPTG的LB固体培养基上进行筛选。随机挑取10个白色菌落分别接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度为20％(体积比)，-80℃保存备用。用SEQ ID NO：5与通用引物AUAP进行菌液PCR扩增验证，得9个阳性克隆，将3个阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，获得该基因的cDNA的3’端。
根据已经获得的KcNHA1基因片段，设计如下三条特异性引物，作为5’RACE的3’端特异性引物。
KcNHA1 GSP3：SEQ ID No：6：
GAGACTAAGA TGACTGAGAT CAAA
KcNHA1 GSP4：SEQ ID No：7：
AGGACCTGCA ACGTGCAAAC AGA
KcNHA1 GSP5：SEQ ID No：8：
TCCCCAACAT CTAGTGAACC AAT
实验步骤按试剂盒说明书操作(5’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends试剂盒购自Invitrogen公司)。
用SEQ ID NO：7与通用引物AAP(试剂盒自带)，以盐处理组秋茄提取的mRNA反转录得到的cDNA(反转录引物SEQ ID NO：6，dCTP加尾)为模板进行第一轮PCR扩增，具体步骤如下：
50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、2.0μl cDNA、1.0μlEx Taq(购自TAKARA)、10μM的引物SEQ ID NO：7和AAP各2.0μl以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。
将所得的PCR产物用双蒸水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO：8与引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：
50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、2.0μl稀释的第一轮PCR产物、1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：8和AUAP各2.0μl以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。
回收第二轮PCR产物中片段约为600bp的条带(Gel Extraction Kit购自OMEGA)，并将其连接于pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中(具体方法同上)，并将转化后的菌液涂布于含50μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL X-gal、24μg/mL IPTG的LB固体培养基上进行筛选。随机挑取10个白色菌落分别接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度为20％(体积比)，-80℃保存备用。用SEQ ID NO：8与引物AUAP进行菌液PCR扩增验证(反应体系及反应条件同上)，得到6个阳性克隆，选取其中3个克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，获得该基因的cDNA的5’端。所得的5'RACE产物克隆测序后，将其与上述3'RACE产物测序结果以及SEQ ID No：3序列进行拼接，获得KcNHA1全长cDNA序列SEQ ID No：9。
SEQ ID No：9：
根据SEQ ID NO：9序列设计一对引物如下：
SEQ ID No：10：
ATGGATTCGT ACGTTAGCTC GGTT
SEQ ID No：11：
TCAAGATTCT TCAAGATGCC ATTG
通过SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11来克隆KcNHA1全长编码基因。
采用TAKARA的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以盐处理组秋茄根提取的mRNA反转录的cDNA为模板进行PCR反应。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、2.0μl cDNA、1.0μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11各2.0μl以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分钟)，72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物加A尾：PCR产物中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，然后用21μl双蒸水溶解所得沉淀。然后向其中加入2.5μl 10×ExBuffer、0.5μl 5mM的dATP、1.0μl Ex Taq。反应条件：70℃反应30分钟。将得到的约1500bp的DNA片段回收(Omega回收试剂盒)，并将其连接至pGEM T-easy载体上得到KcNHA1-pGEM质粒，然后将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中(方法同上)，并将转化后的菌液涂布于含50μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL X-gal、24μg/mL IPTG的LB固体培养基上进行筛选。随机挑取10个白色菌落分别接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度为20％(体积比)，-80℃保存备用。用SEQ ID NO：10与SEQ ID NO：11进行菌液PCR扩增验证(反应体系及反应条件同上)，得到9个阳性克隆，选取其中3个阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，所得序列为SEQ ID NO：2，其编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
NHA1蛋白的氨基酸序列：SEQ ID NO：1
KcNHA1基因的核苷酸序列SEQ ID NO：2
实施例3 KcNHA1基因植物表达载体构建
选择植物双元表达载体pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选择35S启动子及Tnos终止子分别作为KcNHA1基因的启动子和终止子，构建流程图如图1所示。
使用引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13，以植物表达载体pBI121质粒(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增Pnos，采用TAKARA的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μlPCR反应体系：10μl 5×PS Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、1.0μl pBI121质粒、1.0μlPrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13各2.0μl以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒)，72℃延伸10分钟。通过EcoRI、BglII酶切将所得的PCR产物按试剂盒说明(Promega，T4连接酶试剂盒)连接到pCAMBIA2300获得pCAMBIA2300-1。
SEQ ID NO：12
GCACGAATTC ggcgggaaac gacaatctga
SEQ ID NO：13
ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG
用引物SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15以pBI121质粒为模板扩增Tnos，采用TAKARA的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、1.0μl pBI121质粒、1.0μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：15各2.0μl以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒)，72℃延伸10分钟。通过KpnI、EcoRI酶切将所得的PCR产物连接(Promega T4连接酶试剂盒)到pCAMBIA2300-1获得pCAMBIA2300-2。
SEQ ID NO：14：
AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA
SEQ ID NO：15：
TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA
用引物SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17以pCAMBIA2300质粒为模板扩增35S启动子。采用TAKARA的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl5×PS Buffer、3μl2.5mM的dNTP、1.0μl pCAMBIA2300质粒、1.0μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQID NO：16和SEQ ID NO：17各2.0μl以及31μl双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒)，72℃延伸10分钟。通过HindIII、SalI酶切将所得的PCR产物连接(连接方法同上)到pCAMBIA2300-2获得pCAMBIA2300-3。
SEQ ID NO：16：
ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG
SEQ ID NO：17：
TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT
用引物SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19扩增KcNHA1编码基因的全长序列(模板是实施例2所获得阳性KcNHA1-pGEM质粒)，采用TAKARA的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer、3μl 2.5mM的dNTP、1.0μl KcNHA1-pGEM质粒、1.0μlPrimeSTAR HS DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19各2.0μl以及31μl双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，33个循环(94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分钟)，72℃延伸10分钟。通过SalI、KpnI酶切将所得的PCR产物连接(连接方法同上)到pCAMBIA2300-3，经验证后获得植物表达载体35S-KcNHA1-2300(图2)。
SEQ ID NO：18
ACTGTCGAC ATGGATTCGT ACGTTAGCTC GGTT
SEQ ID NO：19
ACTGGTACC TCAAGATTCT TCAAGATGCC ATTG
实施例4 35S-KcNHA1-2300表达载体转化农杆菌
农杆菌GV3101(购自上海迈其生物科技有限公司)感受态细胞的制备：将农杆菌GV3101在含50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素的LB固体培养基上划单斑接种，28℃培养1至2天。挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素的LB液体培养基中，28℃下摇动培养过夜(约12-16小时)至OD600值为0.4，形成种子菌液。取5ml培养活化后的菌液(1∶20的比例)接种于100ml含50μg/ml利福平和50μg/ml庆大霉素的LB液体培养基中，28℃摇动培养2-2.5小时至OD600＝0.8。冰浴菌液10分钟，每隔3分钟摇匀一次，使所述细菌均匀进入休眠状态。于4℃下4000g离心10分钟，弃上清液；加入1ml冰预冷的10％(体积比)甘油重悬浮菌体，4℃下4000g离心10分钟，收集沉淀；用冰预冷的10％(体积比)甘油重复洗3-4次；然后加入适量冰预冷的10％(体积比)甘油重新悬浮细菌沉淀，即制得GV3101感受态细胞，以40μl/管将其分装，于-70℃保存备用。
转化农杆菌：在冰上融化所述的GV3101感受态细胞，向40μl的所述感受态细胞中加入1μl实施例3获得的质粒35S-KcNHA1-2300，混匀后冰浴约10分钟。将冰浴后的感受态细胞和35S-KcNHA1-2300质粒的混合物用微量移液器转移到冰预冷的0.1cm规格的电击杯(购自Bio-Rad)中，轻敲使悬浮液到达电击杯底部(注意不要有气泡)。将所述电击杯放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。将MicroPulser(购自Bio-Rad)的程序设置为“Agr”，电击一次。立即取出电击杯，加入28℃预热的200μl LB培养基。快速而轻柔的用微量移液器将感受态细胞打匀。将悬浮液转入1.5ml的离心管，在28℃下225rpm摇动培养1小时。取100-200μl的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上(LB固体培养基，含50μg/ml利福平、50μg/ml庆大霉素、50μg/ml卡那霉素)，28℃培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于-70℃保存备用。
实施例5受体材料拟南芥培养
选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土(1∶1)作为拟南芥种植土壤。使用直径9cm的花盆，每盆播种20-30颗拟南芥种子(哥伦比亚型，来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心)。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温22℃，光照强度3500-4000lx，光照周期为12小时黑暗/12小时光照培养，每7天浇灌一次1/2MS液体培养基。培养30天后，每盆保留4-5棵植株，光照周期调整为8小时黑暗/16小时光照培养，待大部分植株都抽苔之后，在花序基部剪掉整个主苔，去其顶端优势，约1周后在腋芽部位长出4-6个新生侧苔，待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成1-2个角果时，便可用于转化。
实施例6拟南芥花浸转化
将实施例4获得的已转化35S-KcNHA1-2300表达载体的GV3101农杆菌菌液接种至含有含50μg/ml利福平、50μg/ml庆大霉素、50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜，第二天早上按1∶50接种至含有含50μg/ml利福平、50μg/ml庆大霉素、50μg/ml卡那霉素的新的LB培养基(1L)中，培养约8个小时，至农杆菌液OD600在1.0到1.2之间。室温5000rpm离心5分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于浸染培养基(1/2MS液体培养基，并含有5％蔗糖；用KOH调至pH5.7；0.02％Silwet L-77)中，使OD600在0.8左右。将实施例5制备的用于转化的拟南芥的上部缓缓、螺旋式浸入所述含农杆菌的浸染培养基内，轻轻顺时针晃动，约2分钟，用透明塑料罩盖严以保持湿度，放入温室过夜。24小时后移去塑料透明罩，用水浇透。之后2-3周，保证植株水分充足。当植株停止开花，第一个果荚成熟变黄时，用纸袋套住，当纸袋内的所有果荚变黄后，停止浇水，1-2周干燥后收取种子，进行转化子筛选，同时取未经转化处理的拟南芥果荚作为对照。
实施例7拟南芥转基因阳性转化子的筛选
种子消毒：先用70％乙醇浸泡10分钟，并不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次，并不时地使种子悬浮。然后，将处理后的种子均匀涂布在含50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体筛选培养基表面上(一块150mm直径的平皿最多播种1500粒种子)，4℃春化2天，然后在恒温22℃、光照强度3500-4000lx、光照周期为12小时黑暗/12小时光照条件下培养7-10天。转基因种子在所述筛选培养基上萌发2周以后，将能够萌发并正常生长的植株转入土壤继续培养。剪取所述能够在筛选培养基上正常生长的每株植物的1-2个叶片，提取其DNA作为模板，用SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19作为引物进行PCR检测(反应体系及条件同上)，去除PCR阴性植株，收集PCR阳性植株的种子分别编号(T0m1-T0m22)并保存。
实施例8过表达KcNHA1的转基因拟南芥T1代植株的种植
选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土(1∶1)作为拟南芥种植土壤。将编号T0m1-T0m22的每种转化子及非转基因对照拟南芥种子各播种2盆(每盆播种20-30颗种子)。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温22℃，光照强度3500-4000lx，光照周期为12小时黑暗/12小时光照培养，每7天浇灌一次1/2MS液体培养基。培养25天后，每株剪取1-2个叶片并提取其DNA作为模板，用SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19作为引物进行PCR检测(反应体系及条件同上)。去除PCR阴性植株，每盆保留7-8棵PCR阳性苗，继续培养10天后，每盆保留大小较一致的5-7棵转基因拟南芥或非转基因对照拟南芥苗进行耐盐实验。
实施例9过表达KcNHA1的转基因拟南芥T1代植株的耐盐实验
将实施例8中转基因拟南芥、对照拟南芥各保留一盆植株不作处理，正常浇灌1/2MS液体培养基，同时各取一盆植株浇灌含有150mM NaCl的1/2MS液体培养基，恒温22℃、光照强度3500-4000lx、12小时光培养/12小时暗培养循环，14天后观察实验结果。T1代转基因植株(T0代转基因植株的种子长成的植株)的耐盐性鉴定表明，T1代转基因植株T1m1、T1m10、T1m18三个株系表现出显著的耐盐性(见图3，以T1m1例，T1m10、T1m18的结果与类似，在此未示出)。
实施例10在转录水平上验证KcNHA1基因的表达
将实施例9中耐盐性好的T1代转基因植株中随机选取8棵(分别属于上述T1m1、T1m10、T1m18三个耐盐株系)，实施例9中对照植株随机选取4棵，各剪取盐(150mM NaCl)处理14天的叶片0.05g，用植物RNA提取试剂盒(Invitrogen)提取总RNA。紫外分光光度测定所得总RNA在260nm和280nm的吸光度值，计算各个RNA浓度。依照Invitrogen反转录试剂盒SuperScript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录，取1μg总RNA作为模板反转录。使用引物SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：20(SEQ ID NO：20：GCCAGCATAT ACGAAAGGTATGC)扩增KcNHA1片段，检测其转录情况。使用引物SEQ ID NO：21(SEQ ID NO：21：5-GCCATCCAAGCTGTTCTCTC-3)和SEQ ID NO：22(SEQ ID NO：22：TTCTCGATGGAAGAGCTGGT)扩增AtACT2片段(拟南芥看家基因：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AK317453.1)，作为对照。
采用TAKARA的Ex DNA聚合酶，以上述反转录所得的cDNA为模板进行PCR反应。50μlPCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，0.3μl Ex DNA聚合酶、10μM的引物SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：20各2.0μl，以及35.7μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5分钟，30个循环(94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。
PCR产物电泳结果如图4所示：1-8为耐盐T1代转基因拟南芥植株(分别属于T1m1、T1m10、T1m18三个株系)，9-12为非转基因的对照拟南芥植株。结果表明，耐盐T1代转基因拟南芥植株中KcNHA1均有显著转录，非转基因对照拟南芥植株中没有KcNHA1的转录。

Claims (8)

1.一种编码秋茄钠氢转运蛋白的基因编码的蛋白，其序列为SEQ ID NO：1。
2.编码权利要求1所述的蛋白的基因，其序列为SEQ ID NO：2。
3.一种重组表达载体，其是通过将权利要求2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；所述表达载体是pCAMBIA2300。
4.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的基因或者权利要求3所述的重组表达载体；所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
5.一种改善植物耐盐性的方法，包括：将权利要求2所述的基因或者权利要求3所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；所述植物是拟南芥。
6.一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求2所述的基因或者权利要求3所述的重组表达载体的植物或植物组织。
7.权利要求6所述的方法，其中所述植物是拟南芥。
8.权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组表达载体或者权利要求4所述的重组细胞用于改善植物盐性以及用于植物育种的用途；所述植物是拟南芥。
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