CN104995205A

CN104995205A - 一种秋茄钠氢转运蛋白nha2及其编码基因与应用

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Publication number: CN104995205A
Application number: CN201380072646.4A
Authority: CN
Inventors: 崔洪志; 田大翠; 游婵平; 梁远金
Original assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Current assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Priority date: 2013-09-25
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2015-10-21
Also published as: WO2015042732A1

Abstract

提供了一种来源于秋茄的钠氢转运蛋白NHA2、其编码基因及其在培育耐盐提高的转基因植物中的应用。

Description

一种秋茄钠氢转运蛋白 NHA2及其编码基因与应用

技术领域本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种来源于秋茄的钠氢转运蛋白 NHA2及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。背景技术盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有 4亿公顷，占灌溉农田的 1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约 0. 4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为 0.3%以下的土壤上，土壤中过量的 Na⁺会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展 (Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53 : 1247-1273; Zhang ZL. 2011. Arabidopsis Floral Initiator SKB1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cell, 23 : 396-411 ) 。高等植物细胞可通过多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号传递到胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内激活转录因子。激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达，从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。发明内容本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE ( cDNA末端快速扩增）相结合的方法克隆了一种秋茄钠氢转运蛋白（本文命名为 HA2)的编码基因，并测定了其 DNA 序列。并且发现通过转基因技术将其导入植株并使其表达后，可显著改善转基因植株的耐盐性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供一种秋茄钠氢转运蛋白 HA2 的编码基因（本文命名为 KcNHA2 ) ，其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因，其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述表达载体是 pCAMBIA2300_; 优选地，所述重组表达载体为附图 2 所示的 35S-KcNHA2-2300 载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。附图说明

图1 ^¾2基因的植物表达载体（35S-KCNHA2-2300 ) 构建流程（图 la-lb) 。图2 ^¾2基因的植物表达载体（35S-KcNHA2-2300 ) 的质粒图。

图 3是转 KcNIU2基因的 T1代拟南芥植株的耐盐实验结果， Tln3表现出显著的耐盐性， Τ1η7、 Τ1η16的结果与其类似，在此未示出。

图 4为利用反转录 PCR对 T1代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中 KcNfU2 基因的转录水平进行分子水平检测的结果。 M为 DNA Ladder Marker ( DL2000 ) ， 1-8 为耐盐 T1代转基因拟南芥植株（分别属于 Tln3、 Τ1η7、 Τ1η16三个株系）， 9-12为非转基因对照拟南芥植株。具体实施方式提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。

以下实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。在本发明中，如果没有注明并且在上下文中没有歧义，比例和百分比是基于重量计算的。实施例 1. 盐胁迫下秋茄 SSH文库构建：

具体方法为：

按照 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建 SSH文库（抑制差减文库）。在实验过程中以盐处理的秋茄根中提取的 mRNA作为样本（Tester) ，以未处理的秋茄根中提取的 mRNA作为对照（Driver) 。具体步骤如下：

( 1 ) 供试材料：

秋茄采自广东省深圳市福田国家级自然保护区（Ν22° 53 ' ， E114° 01 ' )。采集无虫害、发育良好、成熟程度接近的秋茄 ( andelia candel 胚轴，选取大小、长度、重量接近的胚轴用于实验。在塑料桶（盆口径 18 cm, 高 15 cm) 中沙培，每个桶底部垫塑料托盘，细沙为河沙，平均粒径约为 1 mm，自来水洗净，每个小桶种植胚轴 4个。在 28 。C，自然光照 12小时每天的条件下萌发生长苗木培养期间，每天浇适量的自来水补充水分，并且每一周浇一次 Hoagland营养液 (D.R. Hoagland and D.I. Arnon. The water-culture method of growing plants without soil. Calif. Agr. Expt. Sta. Circ. 347. 1950)。

( 2 ) 材料处理：

选择生长发育外观一致（幼苗高度一致、每株幼苗长至 6片叶子）的秋茄幼苗，分成两组，一组浇 2L 500 mM NaCl，一组浇 2L蒸熘水，处理时间为 6小时。收集处理组和对照组的根。用液氮迅速冷冻后，于 -70°C冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和盐处理组的秋茄根各 3.0 g，用植物 RNA 提取试剂盒（购自 Invitrogen)提取总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定所得总 RNA 在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为 1.8-2.0，表明总 RNA纯度较高; 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2 倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒（从总 RNA中纯化 polyA+ RNA) 分离 mRNA。

( 4 ) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进行抑制差减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录（反转录引物为试剂盒所提供引物），得到双链 cDNA, 再以 2 μ g Tester cDNA和 2 μ g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I 酶切 1.5 小时，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而 Driver cDNA 不连接头。两种连有不同接头的 Tester cDNA 分别与过量的 Driver cDNA混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次正向差减杂交的产物混合，再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，通过两次抑制性 PCR扩增富集差异表达基因的片段（PCR进行前，将第二次正向差减杂交产物进行末端补平）。

( 5 ) 差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒（购自 Promega) 的说明书，将所述第二次正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR扩增产物（使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy载体连接，其具体步骤如下：在 200 l PCR管中依次加入下列成分：纯化的合并后的正向差减杂交 cDNA 片段的第二次抑制性 PCR 产物 3 μ 1、 2 X T4 DNA连接酶缓冲液 5 μ 1、 pGEM-T Easy载体 1 μ 1、 Τ4 DNA连接酶 1 μ 1，于 4°C连接过夜。然后取 10 μ ΐ连接反应产物，加入到 100 μ ΐ大肠杆菌 JM109感受态细胞（购自 TAKARA)中，冰浴 30分钟、热休克 60秒、冰浴 2分钟，然后加入 250 μ ΐ LB液体培养基（含有 1%胰蛋白胨（Tryptone, 购自 OXOID)、 0.5% 酵母提取物（Yeast Extract, 购自 OXOID) 禾 P 1% NaCl (购自国药））后置于 37°C摇床中，以 225 rpm振荡培养 30分钟，然后从中取 200 μ 1菌液接种于含 50 μ g/ml氨苄青霉素、 40 g/mL X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚 - β -D-半乳糖苷）、 24 g/mL IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃半乳糖苷）的 LB (同上）固体（1.5%琼脂，下同）培养板上（X-gal 和 IPTG均购自 TAKARA) ， 37°C培育 18小时。计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落，随机挑取 300个白色菌落（编号： Kc-SR-001至 Kc-SR-300) 。将所挑取白色菌落分别接种于 96孔细胞培养板（CORNING) 中的含 50 μ g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基（同上）中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比），然后于 - 80°C保存备用。使用巢式 PCR引物 Primer 1和 Primer 2R (来自 Clontech 公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒）对所培养的菌液分别进行 PCR扩增验证，得到 232个阳性克隆，然后将所有阳性克隆送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

( 6) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后，共得到 214个有效表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST) (Unigene) 。实施例 2 秋茄钠氢转运蛋白编码基因 KcNiU2的克隆

将所述鉴定的秋茄 SSH文库中编号为 Kc-SR-132的克隆子去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID No: 3，序列分析表明该序列编码的蛋白属于钠氢转运蛋白。本文将 SEQ ID No: 3序列对应的全长编码基因命名为 ΜΜ2，其对应的蛋白命名为 ΝΗΑ2。

SEQ ID No: 3：

1 ACATTGATAT CCTGTTGTAT CATATCTGCA GGTGCTACAC TAGCCTTTGA GAAATTGGAT

61 ATTGGTTCTC TGGATGTTGG GGATTATCTT GCAATTGGTG CAATA TCGC TGCCACCGAT 121 TCTGTTTGCA CATTGCAGGT CCTTGATCAG GATGAGACAC CTTTACTCTA TAGTCTGGTT 181 TCGGAGAAG GTGTTGTAAA TGATGCCACA TCGGT GTGC TCTTTAATGC AATCCAGAGC 241 TTTGATCTCA CTCATCTTAG TCCCAGTATT ACTGGGCAGT TTGTTGGCAG ΟΊΊΊΊΊΆΤΑΤ 301 TTATTITTCA CGAGCACTAT GCTGGGAGTG GTTACTGGTC TGGTTAGTGC CTACATCATC 361 AAAAAACTTT ATTTTGGCAG GCACTCAACA GATCGTGAGG TGCTCTTAT GATCCTTATG 421 GCATACCTTT CGTATATGCT GGCTGAACTT TTCTACTTAA GTGGCATTCT CACTGTATTT 481 TTCTGTGGGA TTGTGATGTC ACATTACACC TGGCACAATG TGACAGAGAG TTCAAGGGTA 541 ACTACCAAGC ATGCTITTGC AACCTTATCA TTGTTGCTG AGATTTTCAT CTTCCITTAT 601 GTTGGCATGG ATGCCTTGGA CATTGAAAAG TGGCGTTTTG TGAGTGATAG CCCGGGAACA

661 TCAATTGCAG TGAGCTCCAT ACTGCTAGCT TTTGTCCTGA TTGGGAGAGC AGCTITTGTC

721 TTTCCATTAT CCTTCATATC CAACCTATCT AAGAAATCAA CTAGCGAAAA GATAGGCATC

781 AAGCAGCAAA TTATAGTATG GTGGGCTGGA CTAATGAGAG GCGCTGTGTC GATGGCACTA

841 GCATACAATA AGTTTACAAG CTTGGGTCAT ACCAATGTGC GAGATAATGC AATAATGATC

901 ACAAGT

KcNHA2全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列，设计如下两条特异性引物，作为 3 ' RACE 的 5 ' 端特异性引物。

KcNHA2 GSP1 : SEQ ID No: 4：

GATGTTGGGGATTATCTTGCA

KcNHA2 GSP2: SEQ ID No: 5：

TTGCAGGTCCTTGATCAGGATG 实验步骤按试剂盒说明书操作（ 3 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA

Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 4与通用引物 AUAP (试剂盒自带），以盐处理组提取的 mRNA 反转录得到的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 4和 AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 60°C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。

将所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 5 与通用引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 60°C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。

回收第二轮 PCR 产物中片段约为 1200 bp 的条带（Gel Extraction Kit 购自 OMEGA)，并将其连接于 pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中（具体方法同上），并将转化后的菌液涂布于含 50 ^lmL氨苄青霉素、 40 ^glmL X-gaK 24 g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 5与通用引物 AUAP进行菌液 PCR扩增验证，得 9个阳性克隆，将 3个阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，获得该基因的 cDNA的 3 ' 端。

根据已经获得的基因片段，设计如下三条特异性引物，作为 5 ' RACE 的 3 ' 端特异性引物。

KcNHA2 GSP3： SEQ ID No: 6：

GGCACTAACC AGACCAGTAA CCACT

KcNHA2 GSP4: SEQ ID No: 7：

CAACAAACTG CCCAGTAATA CTGG

KcNHA2 GSP5 : SEQ ID No: 8：

TCTGGATTGC ATTAAAGAGC ACAACC

实验步骤按试剂盒说明书操作（ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA

Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 7与通用引物 AAP (试剂盒自带），以盐处理组秋茄提取的 mRNA 反转录得到的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 6， dCTP加尾）为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 7禾 P AAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C 变性 30秒， 60°C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。

将所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 8 与引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 60°C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。

回收第二轮 PCR 产物中片段约为 800 bp 的条带（Gel Extraction Kit 购自

OMEGA) ，并将其连接于 pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中（具体方法同上），并将转化后的菌液涂布于含 50 μ_§/ηΛ氨苄青霉素、 40 μ_§/ηΛ X-gaK 24 g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 8与引物 AUAP进行菌液 PCR扩增验证（反应体系及反应条件同上），得到 8个阳性克隆，选取其中 3个克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，获得该基因的 cDNA 的 5 ' 端。所得的 5 'RACE产物克隆测序后，将其与上述 3'RACE产物测序结果以及 SEQ ID No: 3序列进行拼接，获得 KcNHA2全长 cDNA序列 SEQ ID No _: 9。

SEQ ID No: 9：

61 C TCCTCCGG TGTCTGCAAA GCCACACGGC AGCATTAGAT ATGCAAAACT CTGTACCTCC

121 TGAAATGGAC TGTTCAGAGA CATAAAAAAG AAAAAAGGAA ACTGTGAAGA TTTTTACCTC

181 TGTAGAGATA AAGCTGAGTT TTTCATAGAC CCAATTGCCT TTTCATTGGT TTGGAGAGGA

241 AGGGGAGACA GTGAGACATA TACGATGGA TACCTACATA AGCTCGGCCA TGTCGAGATG

301 GCAGATGGTT TTAGCGTCTG ACCACGCCTC TGTGGTATCT ATGAACCTAT TTGTGGCGCT

361 TCTTTGCGCT TGCATTGTGG TTGGTCATCT TTTAGAAGAG AATCGATGGA TGAATGAGTC

421 GATCACCGCC CTCGTCAT G GTGTATGCAC TGGCGTTGTT ATITIGCTGA TCAGTGGAGG

481 AAAAAGCTCG CGTC rr丄 TCTTCAGCGA GGATC rr丄' C TTCATATATC T CTGCCGCC

541 AATTATATTC AATGCTGGGT TTCAGGTGAA GAAGAAGCAG T CI TCGTA ATTTCATTAC

601 CATCATGCTA TTTGGCGCTG TTGGTACATT GATATCCTGT TGTATCATAT CTGCAGGTGC

661 TACACTAGCC TTTGAGAAAT TGGATATTGG TTCTCTGGAT GTTGGGGATT ATCTTGCAAT

721 TGGTGCAATA TCGCTGCCA CCGAT CTGT TTGCACATTG CAGGTCCTTG ATCAGGATGA

781 GACACCTTTA CTCTATAGTC TGGT TTCGG AGAAGGTGTT GTAAATGATG CCACATCGGT

841 TGTGCTCITT AATGCAATCC AGAGCITTGA TCTCACTCAT CTTAGTCCCA GTATTACTGG

901 GCAGTTTGTT GGCAGCrriT TATATTTATT T TCACGAGC ACTATGCTGG GAGTGGTTAC

961 TGGTCTGGTT AGTGCCTACA TCATCAAAAA ΑΟΓΓΤΑΊΊΊΊ' GGCAGGCACT CAACAGATCG

1021 TGAGGTTGCT CTTATGATCC TTATGGCATA CC TTCGTAT ATGCTGGCTG ΑΆΟΊΊΊΊ'ΟΤΑ

1081 CTTAAGTGGC ATTCTCACTG TATTTTTCTG TGGGATTGTG ATGTCACATT ACACCTGGCA

1141 CAATGTGACA GAGAGTTCAA GGGTAACTAC CAAGCATGCT TTTGCAACCT TATCATTTGT

1201 TGCTGAGATT TTCATCTTCC TTTATGTTGG CATGGATGCC TTGGACATTG AAAAGTGGCG

1261 '丄'丄'丄'丄 GTGAGT GATAGCCCGG GAACATCAAT TGCAGTGAGC TCCATACTGC TAGCriTlGT

1321 CCTGATTGGG AGAGCAGCTT TTGTCITTCC ATTATCCTTC ATATCCAACC TATCTAAGAA

1381 ATCAACTAGC GAAAAGATAG GCATCAAGCA GCAAATTATA GTATGGTGGG CTGGACTAAT

1441 GAGAGGCGCT GTGTCGATGG CACTAGCATA CAATAAGTTT ACAAGCTTGG GTCATACCAA

1501 TGTGCGAGAT AATGCAATAA TGATCACAAG TACCATAACT GTTGTTCTCT TCAGCACAGT 1561 GGTGTTTGGT CTGCTGACTA AACCTCTTAT AAGGTGTCTG CTGCCTCATA CAAAACAAAA

1621 CCCAAAAGGC ATATTGGATT CAACTTCTCC AAAATCAAAT ACAGTGCCAC TCCTTGGAGA

1681 GGGGCAGGAT TCCTTGGATG ACATAGGTGG GCATGAGGTT CTACGCCCAA ACAGTTTGCG

1741 TGCCCTCCTG ACAACCCCAG CACACACCGT TCATTACTAC TGGCGCAAAT T GACGATGC

1801 ATTCATGCGT CCCGTGT TG GCGGTCGGGG '丄'丄'丄'丄 GT CCG T TGT CCCG GCTCACCAAC

1861 AGAACGGAGT GTCCACAATC AGTCTCAATG AAGAGAAAGA CAAAGCAAGA TGTACAAATT

1921 ATGTAAAGTT ATAAGCATCT TGAAGATGGT TAAACAGTAT CACTTATCTT TGGACCTGCT

1981 GCTGAAAATA GTGGTTTTGT 'I'l'l'l'CCTCTC TCACACTCAA CTAATTCCCT GTTAAATTTG

2041 TTACAGTAGA ACATTCTTAT GGCGCCAAAA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΆ ΑΑΑΆ 根据 SEQ ID NO: 9序列设计一对引物如下：

SEQ ID No: 10：

ATGTCGAGAT GGCAGATGGT TT SEQ ID No: 11：

TCATTGAGAC TGATTGTGGA CA 通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11来克隆全长编码基因。

采用 TAKARA的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以盐处理组提取的 mRNA反转录得到的 cDNA的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 y l PCR反应体系： 10 y l 5 X PS Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10禾 P SEQ ID NO: 11各 2.0 μ 1以及 30 μ 1的双蒸水。

PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物中加入 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10分钟，离心，去上清，晾干，然后用 21 μ ΐ双蒸水溶解所得沉淀。然后向其中加入 2.5 μ 1 lO X Ex Buffer 0.5 μ 1 5 mM的 dATP、 1.0 l Ex Taq。反应条件： 70°C反应 30分钟。将得到的约 1500 bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒），并将其连接至 pGEM T-easy载体上得到 KcNHA2-pGEM质粒，然后将连接产物转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中（方法同上），并将转化后的菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素、 40 g/mL X-gaK 24 g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 10与 SEQ ID NO: 11进行菌液 PCR 扩增验证（反应体系及反应条件同上），得到 9个阳性克隆，选取其中 3 个阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列为 SEQ ID NO: 2，其编码的蛋白质的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。

NHA2蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MSRWQMVLAS DHASWSMNL

21 FVALLCACIV VGHLLEENRW

41 MNES ITALVI GVCTGWILL

61 ISGGKSSRLL VFSEDLFFIY

81 LLPPI I FNAG FQVKKKQFFR

101 NFITIMLFGA VGTLISCCI I

121 SAGATLAFEK LDIGSLDVGD

141 YLAIGAI FAA TDSVCTLQVL

161 DQDETPLLYS LVFGEGWND

181 ATSWLFNAI QSFDLTHLSP

201 S ITGQFVGSF LYLFFTSTML

221 GWTGLVSAY I IKKLYFGRH

241 STDREVALMI LMAYLSYMLA

261 ELFYLSGILT VFFCGIVMSH

281 YTWHNVTESS RVTTKHAFAT

301 LSFVAEI FI F LYVGMDALDI

321 EKWRFVSDSP GTS IAVSS IL

341 LAFVLIGRAA FVFPLSFISN

361 LSKKSTSEKI GIKQQI IVWW

381 AGLMRGAVSM ALAYNKFTSL

401 GHTNVRDNAI MITSTITWL

421 FSTWFGLLT KPLIRCLLPH

441 TKQNPKGILD STSPKSNTVP

461 LLGEGQDSLD DIGGHEVLRP

481 NSLRALLTTP AHTVHYYWRK

501 FDDAFMRPVF GGRGFVPFVP

521 GSPTERSVHN QSQ*

KcNHA2基因的核苷酸序列 SEQ ID NO: 2

1 ATGTCGAGAT GGCAGATGGT TTTAGCGTCT GACCACGCCT CTGTGGTATC TATGAACCTA

61 TTTGTGGCGC TCTTTGCGC TTGCATTGTG GTTGGTCATC TTTTAGAAGA GAATCGATGG

121 ATGAATGAGT CGATCACCGC CCTCGTCA T GGTGTATGCA CTGGCGTTGT TATTTTGCTG

181 ATCAGTGGAG GAAAAAGCTC GCGTCTITTG GTCTTCAGCG AGGATCTITT CTTCATATAT 241 C TCTGCCGC CAATTATATT CAATGCTGGG TTTCAGGTGA AGAAGAAGCA GT CI TCGT

301 AATTTCATTA CCATCATGCT ATTTGGCGCT GTTGGTACAT TGATATCCTG TTGTATCATA

361 TCTGCAGGTG CTACACTAGC CTTTGAGAAA TTGGATATTG GTTCTCTGGA TGTTGGGGAT

421 TATCTTGCAA TTGGTGCAAT A TCGCTGCC ACCGAT CTG TTTGCACATT GCAGGTCCTT

481 GATCAGGATG AGACACCTTT ACTCTATAGT CTGGT TTCG GAGAAGGTGT TGTAAATGAT

541 GCCACATCGG TTGTGCTCTT TAATGCAATC CAGAGCITTG ATCTCACTCA TCTTAGTCCC

601 AGTATTACTG GGCAGTTTGT TGGCAGCITT TTATATTTAT T TTCACGAG CACTATGCTG

661 GGAGTGGTTA CTGGTCTGGT TAGTGCCTAC ATCATCAAAA AACTTTATTT TGGCAGGCAC

721 TCAACAGATC GTGAGGTTGC TCTTATGATC CTTATGGCAT ACC TTCGTA TATGCTGGCT

781 GAAC'l'l'l'l'CT ACTTAAGTGG CATTCTCACT GTATTTTTCT GTGGGATTGT GATGTCACAT

841 TACACCTGGC ACAATGTGAC AGAGAGTTCA AGGGTAACTA CCAAGCATGC TTTTGCAACC

901 TTATCA.TTTG TTGCTGAGAT TTTCATCTTC CTTTATGTTG GCATGGATGC CTTGGACATT

961 GAAAAGTGGC GTTTTGTGAG TGATAGCCCG GGAACATCAA TTGCAGTGAG CTCCATACTG

1021 CTAGCriTlG TCCTGATTGG GAGAGCAGCT TTTGTCTrTC CATTATCCTT CATATCCAAC

1081 CTATCTAAGA AATCAACTAG CGAAAAGATA GGCATCAAGC AGCAAATTAT AGTATGGTGG

1141 GCTGGACTAA TGAGAGGCGC TGTGTCGATG GCACTAGCAT ACAATAAGTT TACAAGCTTG

1201 GGTCATACCA ATGTGCGAGA TAATGCAATA ATGATCACAA GTACCATAAC TGTTGTTCTC

1261 TTCAGCACAG TGGTGTTTGG TCTGCTGACT AAACCTCTTA TAAGGTGTCT GCTGCCTCAT

1321 ACAAAACAAA ACCCAAAAGG CATATTGGAT TCAACTTCTC CAAAATCAAA TACAGTGCCA

1381 CTCCTTGGAG AGGGGCAGGA TTCCTTGGAT GACATAGGTG GGCATGAGGT TCTACGCCCA

1441 AACAGTTTGC GTGCCCTCCT GACAACCCCA GCACACACCG TTCATTACTA CTGGCGCAAA

1501 T TGACGATG CATTCATGCG TCCCGTGT T GGCGGTCGGG GTTTTGTTCC GTTTGTTCCC

1561 GGCTCACCAA CAGAACGGAG TGTCCACAAT CAGTCTCAAT GA 实施例 3 KcNHA2基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子，以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择 35S启动子及 Tnos终止子分别作为基因的启动子和终止子，构建流程图如图 1所示。

使用引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13，以植物表达载体 pBI121质粒（购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos，采用 TAKARA的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ρΒΙ121质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 56°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒）， 72 °C延伸 10 分钟。通过 EcoRI、 Bglll酶切将所得的 PCR产物按试剂盒说明（Promega, T4 连接酶试剂盒）连接到 pCAMBIA2300获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 12

GCACGAATTC ggcgggaaac gacaatctga

SEQ ID NO: 13

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

用引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15以 pBI121质粒为模板扩增 Tnos，采用 TAKARA的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ρΒΙ121质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 14禾 P SEQ ID NO: 15各 2.0 μ 1以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30 秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。通过 Kpnl、 EcoRI酶切将所得的 PCR产物连接（Promega T4 连接酶试剂盒）到 pCAMBIA2300-l获得 pCAMBIA2300-2。 SEQ ID NO: 14：

AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 15：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA 用引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增 35S 启动子。采用 TAKARA的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 1.0 μ 1 pCAMBIA2300 质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO: 17各 2.0 μ ΐ以及 31 μ ΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 30秒）， 72°C延伸 10分钟。通过 HindIII、 Sail 酶切将所得的 PCR 产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-2 获得 pCAMBIA2300-3。

SEQ ID NO: 16：

ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG SEQ ID NO: 17：

TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT 用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19扩增编码基因的全长序列（模板是实施例 2所获得阳性 dVH^^-pGEM质粒），采用 TAKARA的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 KcNHA2-pGEM质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19各 2.0 μ 1以及 31 μ 1双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C 延伸 10 分钟。通过 Sall、 Kpnl 酶切将所得的 PCR产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-3 , 经验证后获得植物表达载体 35S-KcNHA2-2300 (图 2) 。

SEQ ID NO: 18

ACTGTCGAC ATGTCGAGAT GGC AGATGGT TT

SEQ ID NO: 19

ACTGGTACC TCATTGAGAC TGATTGTGGA CA 实施例 4 35S-KcNHA2-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 GV3101 (购自上海迈其生物科技有限公司）感受态细胞的制备：将农杆菌 GV3101在含 50 μ_§/ιη1利福平和 50 μ_§/ιη1庆大霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28 °C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ_§/ιη1利福平和 50 μ_§/ιη1庆大霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜（约 12-16小时）至 OD₆。。值为 0.4，形成种子菌液。取 5 ml培养活化后的菌液（1 :20的比例）接种于 100 ml含 50 μ_§/ιη1 利福平和 50 μ_§/ιη1 庆大霉素的 LB 液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2.5 小时至 OD_6QQ=0.8。冰浴菌液 10 分钟，每隔 3 分钟摇匀一次，使所述细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10分钟，弃上清液；加入 l ml冰预冷的 10% (体积比）甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10分钟，收集沉淀；用冰预冷的 10% (体积比）甘油重复洗 3-4次；然后加入适量冰预冷的 10% (体积比）甘油重新悬浮细菌沉淀，即制得 GV3101感受态细胞，以 40 μΐ/管将其分装，于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化所述的 GV3101感受态细胞，向 40 μΐ的所述感受态细胞中加入 1 μΐ实施例 3获得的质粒 35S-KcNHA2-2300，混匀后冰浴约 10分钟。将冰浴后的感受态细胞和 35S-KcNHA2-2300 质粒的混合物用微量移液器转移到冰预冷的 0.1 cm规格的电击杯（购自 Bio-Rad) 中，轻敲使悬浮液到达电击杯底部（注意不要有气泡）。将所述电击杯放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。将 MicroPulser (购自 Bio-Rad)的程序设置为 "Agr"，电击一次。立即取出电击杯，加入 28°C预热的 200 μΙ ίΒ培养基。快速而轻柔的用微量移液器将感受态细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管，在 28°C下 225 rpm摇动培养 1小时。取 100-200 μΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 g/ml利福平、 50 μ_§/ιη1庆大霉素、 50 μ_§/ιη1卡那霉素）， 28°C培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于 -70°C保存备用。实施例 5 受体材料拟南芥培养

选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1:1) 作为拟南芥种植土壤。使用直径 9 cm的花盆，每盆播种 20-30颗拟南芥种子（哥伦比亚型，来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心）。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温 22V, 光照强度 3500-4000 lx, 光照周期为 12小时黑暗 /12小时光照培养，每 7天浇灌一次 1/2MS液体培养基。培养 30天后，每盆保留 4-5棵植株，光照周期调整为 8小时黑暗 /16小时光照培养，待大部分植株都抽苔之后，在花序基部剪掉整个主苔，去其顶端优势，约 1周后在腋芽部位长出 4-6个新生侧苔，待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成 1-2个角果时，便可用于转化。实施例 6 拟南芥花浸转化

将实施例 4获得的已转化 35S-KcNHA2-2300表达载体的 GV3101农杆菌菌液接种至含有含 50 g/ml利福平、 50 μ_§/ιη1庆大霉素、 50 g/ml卡那霉素的 LB液体培养基中培养过夜，第二天早上按 1:50接种至含有含 50 g/ml利福平、 50 μ_§/ιη1庆大霉素、 50 μ_§/ιη1卡那霉素的新的 LB培养基（1L) 中，培养约 8个小时，至农杆菌液 OD_6(K) 在 1.0到 1.2之间。室温 5000 rpm离心 5分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于浸染培养基（1/2MS液体培养基，并含有 5%蔗糖；用 KOH调至 pH5.7; 0.02% Silwet L-77) 中，使 OD_6QQ在 0.8左右。将实施例 5制备的用于转化的拟南芥的上部缓缓、螺旋式浸入所述含农杆菌的浸染培养基内，轻轻顺时针晃动，约 2分钟，用透明塑料罩盖严以保持湿度，放入温室过夜。 24小时后移去塑料透明罩，用水浇透。之后 2-3周，保证植株水分充足。当植株停止开花，第一个果荚成熟变黄时，用纸袋套住，当纸袋内的所有果荚变黄后，停止浇水， 1-2周干燥后收取种子，进行转化子筛选，同时取未经转化处理的拟南芥果荚作为对照。实施例 7 拟南芥转基因阳性转化子的筛选

种子消毒：先用 70%乙醇浸泡 10 分钟，并不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次，并不时地使种子悬浮。然后，将处理后的种子均匀涂布在含 50 μ_§/ιη1卡那霉素的 1/2MS固体筛选培养基表面上（一块 150 mm直径的平皿最多播种 1500粒种子）， 4°C春化 2天，然后在恒温 22°C、光照强度 3500-4000 k、光照周期为 12小时黑暗 /12小时光照条件下培养 7-10天。转基因种子在所述筛选培养基上萌发 2周以后，将能够萌发并正常生长的植株转入土壤继续培养。剪取所述能够在筛选培养基上正常生长的每株植物的 1-2 个叶片，提取其 DNA作为模板，用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19作为引物进行 PCR 检测（反应体系及条件同上），去除 PCR阴性植株，收集 PCR阳性植株的种子分别编号 ( T0nl-T0n20) 并保存。实施例 8 錄达 KcNHA2的转基因拟南芥 T1代植株的种植

选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。将编号 T0nl-T0n20的每种转化子及非转基因对照拟南芥种子各播种 2盆（每盆播种 20-30颗种子）。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温 22°C，光照强度 3500-4000 lx, 光照周期为 12小时黑暗 /12小时光照培养，每 7天浇灌一次 1/2MS 液体培养基。培养 25天后，每株剪取 1-2个叶片并提取其 DNA作为模板，用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19作为引物进行 PCR检测（反应体系及条件同上）。去除 PCR 阴性植株，每盆保留 7-8棵 PCR阳性苗，继续培养 10天后，每盆保留大小较一致的 5-7棵转基因拟南芥或非转基因对照拟南芥苗进行耐盐实验。实施例 9 錄达 KcNHA2的转基因拟南芥 T1代植株的耐盐实验

将实施例 8 中转基因拟南芥、对照拟南芥各保留一盆植株不作处理，正常浇灌 1/2MS液体培养基，同时各取一盆植株浇灌含有 150 mM NaCl的 1/2MS液体培养基，恒温 22°C、光照强度 3500-4000 k、 12小时光培养 /12小时暗培养循环， 14天后观察实验结果。 T1代转基因植株（T0代转基因植株的种子长成的植株）的耐盐性鉴定表明， T1代转基因植株 Tln3、 Τ1η7、 Τ1η16三个株系表现出显著的耐盐性（见图 3，以 Tln3例， Τ1η7、 Τ1η16的结果与类似，在此未示出）。实施例 10 在转录水平上验证基因的表达

将实施例 9中耐盐性好的 T1代转基因植株中随机选取 8棵（分别属于上述 Τ1η3、 Tln7、 Τ1η16三个耐盐株系），实施例 9中对照植株随机选取 4棵，各剪取盐（150 mM NaCl)处理 14天的叶片 0.05 g，用植物 RNA提取试剂盒（Invitrogen)提取总 RNA。紫外分光光度测定所得总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA浓度。依照 Invitrogen反转录试齐 [J盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录，取 1 总 RNA作为模板反转录。使用引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 20 ( SEQ ID NO: 20： ATTATCTCGC ACATTGGTAT GACC ) 扩增片段，检测其转录情况。使用弓 I 物 SEQ ID NO ： 21 ( SEQ ID NO ： 21 ： 5- GCCATCCAAGCTGTTCTCTC -3 ) 禾口 SEQ ID NO： 22 ( SEQ ID NO： 22： TTCTCGATGGAAGAGCTGGT ) 扩增 AtACT2 片段（拟南芥看家基因： http：〃 www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/AK317453.1 ) ，作为对 ,照。采用 TAKARA的 Ex DNA聚合酶，以上述反转录所得的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 0.3 μΐ Ex DNA聚合酶、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 10禾 P SEQ ID NO: 20各 2.0 μ1，以及 35.7 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 30个循环（94°C变性 30 秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟）， 72°C延伸 10分钟。

PCR产物电泳结果如图 4所示： 1-8为耐盐 T1代转基因拟南芥植株（分别属于 Tln3、 Τ1η7、 Τ1η16三个株系）， 9-12为非转基因的对照拟南芥植株。结果表明，耐盐 T1代转基因拟南芥植株中 KcNIU2均有显著转录，非转基因对照拟南芥植株中没 KcNHA2的转录。

Claims

权利要求书

1. 一种编码秋茄钠氢转运蛋白的基因编码的蛋白，其序列为 SEQ ID NO: 1。
2. 编码权利要求 1所述的蛋白的基因，其序列为 SEQ ID NO: 2。
3. 一种重组表达载体，其是通过将权利要求 2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接，优选地，所述表达载体是 pCAMBIA2300。
4. 权利要求 3所述的重组表达载体，其为图 2所示的 35S-KcNHA2-2300载体。
5. 一种重组细胞，其含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
6. 一种改善植物耐盐性的方法，包括：将权利要求 2所述的基因或者权利要求 3 或 4所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。
7. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体的植物或植物组织。
8. 权利要求 7所述的方法，其中所述植物是拟南芥。
9. 权利要求 2所述的基因、权利要求 3或 4所述的重组表达载体或者权利要求 4 所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途。
10. 权利要求 9所述的用途，其中所述植物是拟南芥。