CN101701037A - 一种调控植物耐盐和抗旱性的转运蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开一种沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，来源于沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)，名称为AmNHX1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO：1；2)编码序列表中SEQ ID NO：2氨基酸序列的多核苷酸。本发明的基因将在沙冬青耐盐耐旱分子机制研究及植物耐盐耐旱性状改良中发挥重要作用。

Description

一种调控植物耐盐和抗旱性的转运蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种转运蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及沙冬青的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

盐害和干旱是限制农作物生长的两大限制因子。中国的干旱区面积占全国总面积的1/3，盐碱土广泛分布于其中，干旱与盐渍并存严重限制了我国农作物产量的提高和农业发展。因此，了解和研究植物耐盐碱抗干旱胁迫的机制；从我国特有的资源生物中克隆抗盐耐干旱基因，获得宝贵的基因资源；培育耐干旱耐盐碱农作物具有重要的现实和战略意义。

植物在长期进化过程中，形成了一系列抵抗干旱和盐渍胁迫的适应机制。如在细胞中积累无害的可溶性小分子物质；通过Na⁺外排途径将Na⁺排出细胞以及提高下游抵抗氧化伤害的抗氧化酶的活性等等。其中通过Na⁺/H⁺反向转运蛋白在液泡中积累Na⁺一方面可以降低Na+在细胞质的含量，降低Na+的毒害性；另一方面还可以降低细胞水势，能够让植物在高盐溶液中获得和保持更多的水分(Cixin He等，Plant Cell Physiol.46(11)：1848-1854(2005))。

NHX基因家族是植物中Na⁺区隔化至液泡的关键基因，自1985年Blumwald和Poole首先在甜菜根部贮藏组织的液泡膜上发现Na⁺/H⁺逆向转运活性以来，人们相继发现在盐生植物，如滨藜(Atriplex gmelini)，兼性CAM植物冰叶日中花(Messembryanthemumcrystallinum)、甜菜(Red beet)等和甜土植物，如大麦、车前(Plantago maritima)、长春花、棉花、水稻、向日葵等的液泡膜上普遍存在着Na⁺/H⁺逆向转运活性，并且克隆到了它们的Na⁺/H⁺反向转运蛋白编码基因(安静，张荃，生命科学，第18卷第3期，2006年6月)。AtNHX1的结构功能已研究得较为详细。目前，研究人员已经对AtNHX1进行了亚细胞定位、蛋白活性测定、插入突变、酵母突变体的功能互补以及过量表达等多方面的研究。AtNHX1对于植物的耐盐性、体内离子动态平衡以及整个的植物发育过程，都起到非常重要的作用(安静，张荃，生命科学，第18卷第3期，2006年6月)。

AtNHX1是迄今为止，单个基因改良植物耐盐性状最有效的基因之一。在拟南芥，番茄，油菜，水稻，小麦，黑麦草，高羊茅，棉花，烟草等植物中过量表达拟南芥AtNHX1基因均能够有效提高植物耐盐性能。最近Brini和Moez Hanin等在拟南芥中过量表达小麦TNHX1发现不仅能够显著提高转基因植株的耐盐性而且能够显著提高转基因植株的耐干旱性状。(Journal of Experimental Botany，Vol.58，No.2，pp.301-308，2007)。

沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maximl)Cheng F1)又名蒙古沙冬青、蒙古黄花木，是古老的第三纪残遗种，也是迄今为止我国温带荒漠的惟一珍贵常绿灌木，是阿拉善荒漠区所特有的建群植物(郭生祥，甘肃林业科技，第30卷第4期，2005年12月)。沙冬青不仅具有极强的抗干旱性，抗高温，耐低温以及抗风蚀沙埋还具有很强的抗盐性，种子能够在含有200mm NaCL的MS培养平板上正常生长。目前对沙冬青的耐逆性研究仅停留在生理生化阶段，从遗传上阐述沙冬青的抗逆性机制是一片空白。因此借助拟南芥模式生物，挖掘沙冬青重要的抗逆性基因资源，并应用到农作物抗逆性状改良上具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因，以及该基因在调控植物耐盐和抗寒性方面的应用。

本发明所提供的沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，是具有SEQ ID NO.2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将该序列的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与该序列的氨基酸残基序列相同活性的由该序列衍生的蛋白质。记为AmNHX1。

沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因，是下列核苷酸之一：

1)SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

2)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多核苷酸。

序列表中SEQ ID NO.1由1986个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第80位至1711位碱基；序列表中SEQ ID NO.2由553个氨基酸残基组成。

本发明还包括含有本发明基因的表达载体和细胞系。本发明的基因可用于沙冬青耐盐耐旱分子机制研究，并且本发明基因可用于植物耐盐和耐旱性状改良。

附图说明

图1为AmNHX1中间片断扩增产物凝胶电泳图谱。

图2为AmNHX13’端扩增产物凝胶电泳图谱。

图3为AmNHX15’端扩增产物凝胶电泳图谱。

图4为沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白系统发生树。

图5为沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白疏水性分析。

图6为沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与其他植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白同源性分析。

图7为盐胁迫下野生型拟南芥和转基因植株表型。

图8为干旱胁迫十六天野生型拟南芥和转基因植株表型(A)和回复浇水16小时之后野生型拟南芥和转基因植株表型(B)。

具体实施方式

实施例1、沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白编码基因的获得

1.1沙冬青盐胁迫处理

沙冬青种子用0.01％HgCl2表面灭菌15分钟，无菌水冲洗5次，37℃无菌水浸泡过夜后移至1/2MS+1.5％蔗糖+1.0％琼脂+200mmNaCl盐胁迫培养基上。在16h L/8h D光照，24℃条件下培养一周.

1.2RNA提取

取经过盐胁迫处理的沙冬青幼根材料约0.1g。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管，加1ml(invitrogen公司)，混匀后，室温放置15分钟，加0.2ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm，4℃离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm，4℃离心15分钟。70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经0.1％DEPC处理过的ddH2O水中，贮存于-80℃备用。

1.3cDNA第一链合成和反转录PCR

采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为：2ug制备的总RNA，0.5ul Rnaseinhibitor，加DEPC处理过的去离子水至8.5ul，2ul的Oligo(dT)18primer.65℃，5min，室温放置10min，13000rpm简短离心5s。再依次加入4μl 5×First-Strand buffer，0.5μl RNase Inhibitor，2μl 100mM DTT，2μl dNTP，1μl MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37℃反转录1小时，90℃5分钟；冰上冷却；13000rpm短暂离心5秒钟，存放于-20℃待用

1.4RT-PCR扩增AmNHX1基因中间片断

根据以往在其他植物中克隆到的Na⁺/H⁺转运蛋白基因的保守序列，设计了两条同源兼并引物AmNHX1CF(5’GCCTATAATATTCAATGCAGGGTTTCA 3’，记为SEQ ID NO.3)和AmNHX1CR：(5’GTCCAGGGCATCCATACCAACATA 3’，SEQ ID NO.4)作为PCR反应的引物。PCR反应体系为50ul，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，58℃复性40s，72℃延伸60s，循环35次。72℃充分延伸10min。将所得的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离获得一段约700bp的片断。回收并且通过TA克隆至TAKARA pMD-19-T载体后，由上海英骏公司测序，获得AmNHX1的中间序列。

1.5AmNHX1全序列的获得

1.5.1AmNHX1的3’末端序列的扩增

AmNHX1基因的3’末端序列扩增使用Clontech公司的BD-SMARTTMRACE试剂盒。根据已经获得的保守序列设计了两个特异性引物进行巢式PCR反应。

AmNHX13’RACE F：5’CTGAGTGGCATTCTAACTGTATTCTTTTCT 3’，记为SEQ ID NO.5。

AmNHX13’RACE NF：5’ACTTGGCATAATGTGACTGAGAGC 3’，记为SEQ ID NO.6。

反应条件分别为：

第一轮PCR反应：94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃复性40s，72℃延伸90s，循环35次。72℃充分延伸10min。

第二轮PCR反应：94℃预变性5min，94℃变性40s，58℃复性40s，72℃延伸90s，循环35次。72℃充分延伸10min。

第二轮PCR反应结束后，1％电泳检测，获得约1000bp的片段，割胶回收并克隆至克隆载体进行测序，获得3’末端序列。

1.65’RACE法扩增AmNHX1基因的末端序列

按照Takara5’FULL-RACE(Code：D6122)方法自行合成以下5个引物：

AmNHX15’末端P标记反转录引物：5’TGCTCCAGGTCAAAG 3’(SEQ ID NO.7)

1st PCR A1：5’GCAGGTGCTAAATCAGGATGA 3’(SEQ ID NO.8)

1st PCR S1：5’TGACACCCAAAGTTATGACGG 3’(SEQ ID NO.9)

2nd PCR A2：5’GGGAGGGTGTTGTGAATGA 3’(SEQID NO.10)

2nd PCR S2：5’AATGTACCAACAGCACCAAAC 3’(SEQ ID NO.11)

按照Takara5’FULL-RACE(Code：D6122)方法，依次经过cDNA第一链的合成，HybridRNA的分解，连接反应(单链cDNA环化或形成首尾连接物)，以及两轮PCR反应，再经琼脂糖凝胶电泳分离获得约500bp的PCR片断。最后经割胶回收，克隆至克隆载体，测序，最终获得AmNHX1基因的5’末端序列。

第一轮PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，55℃复性40s，72℃延伸60s，循环35次。72℃充分延伸10min。

第二轮PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，52℃复性40s，72℃延伸60s，循环35次。72℃充分延伸10min。

根据已经获得的AmNHX13’末端序列和5’末端序列以及中间序列拼接获得了AmNXH1的全长序列，见SEQ ID NO.1。

实施例2：沙冬青Na+/H+逆向转运蛋白功能分析

2.1序列比较分析

分别用TMpred软件和Genedoc软件分别分析了AmNHX1的二级结构和跟其他物种的同源性。分析结果表明AmNHX1有12个跨膜结构域，如图5所示；并且跟其他物种的Na+/H+反向转运蛋白具有极大的同源性，具有氨氯吡嗪脒结合序列“FFIYLLPPI”，这一段序列在其他植物和哺乳动物NHE中均高度保守，如图6所示，图中加黑部分是一致性的氨基酸序列，框起来部分为氨氯吡嗪脒结合序列。拟南芥，大豆，水稻，大麦，盐芥的基因登录号分别为：NP_198067，AAY43006，NP_001060571，BAC56698，ABJ97691。

为了分析AmNHX1同其他物种Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的亲缘关系，用MEGA软件建立了AmNHX1同其他物种Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的系统进化树。结果表明AmNHX1同同属豆科的大豆的亲缘关系最近，同属一簇。

2.2拟南芥转基因分析

2.2.1植物表达载体构建

利用引物AmNHX1ELF和AmNHX1ELR扩增出全长cDNA，并克隆至pMD19-Tvector(Takara)，测序无误之后。使用BamH1和Sal1双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶的酶切和纯化的pCHF3载体上。

AmNHX1ELF：5’TGCTTATTGGTTGGAGAGTGGAC 3’(SEQ ID NO.12)

AmNHX1ELR：5’CACAGCCTTCTCAGTTCGCAC 3’(SEQ ID NO.13)

2.2.2农杆菌转化

2.2.2.1LBA4404农杆菌感受态细胞制备

1)在含利福霉素40ug/ml，链霉素100ug/ml的YEB固体培养基上划线，28℃培养48h-72h；

2)挑单菌落到含利福霉素40ug/ml，链霉素100ug/ml的YEB液体培养基中28℃培养至OD₆₀₀0.5；

3)冰上冷却菌液，5000rpm，4℃10分钟收集菌体；

4)1mM Hepes pH 7.0洗涤3次，再用10％甘油洗涤一次；

5)悬浮菌体于3ml 10％甘油中，分装到1.5ml离心管中，每管40ul。

2.2.2.2农杆菌转化

1)200ng质粒DNA，加40ul农杆菌感受态细胞混匀后按以下条件进行电转化。

U    1.8KV

R    200Ω

C    25uF

2)电击后添加800ul SOC液体培养基，28℃培养1h

3)4000rpm，10分钟收集菌体，悬浮于200ul SOC中，涂在含100ug/ml壮观霉素，利福平40ug/ml，链霉素100ug/ml LB固体培养基上，28℃倒置培养48h-72h。

2.2.3农杆菌介导的拟南芥转化

2.2.3.1拟南芥基质培养

基质组分：蛭石∶黑土∶珍珠岩9∶3∶0.5

营养液组分：

基质浸透营养液后，将种子播于钵子中，用保鲜膜覆盖，置于4℃黑暗条件下，2天后转入(16h L/8h D)光照，23℃条件下进行培养。拟南芥生长到抽苔开花即可供转化。

2.2.3.2农杆菌准备

1)接种携带目的表达载体的农杆菌到含适量抗生素的YEB培养基中，28℃，220rpm摇菌培养至OD₆₀₀1.2；

2)5000rpm，4℃10分钟离心收集菌体；

3)菌体重新悬浮于5％的蔗糖溶液中，并调至OD₆₀₀0.8；

4)加入Silwet L-77至终浓度为0.03％。

2.2.3.3拟南芥转化

取拟南芥材料，倒置浸泡地上部分于预备好的农杆菌溶液中，晃动约3秒，取出，放置到荫蔽条件下，保湿24h，转入正常条件培养。

2.2.3.4拟南芥转化子筛选

收集转化后拟南芥的种子。种子用0.01％HgCl₂表面灭菌5分钟，无菌水冲洗5次，悬浮在0.1％的琼脂糖中，然后按每平板(直径15cm)2000粒种子(约40mg)，铺在卡那霉素50mg/L，1/2MS培养基上。将平板置于4℃黑暗冰箱中2天，转移到(16h L/8h D)光照，23℃条件下进行培养。约10天左右可筛选出具卡那霉素抗性的转基因植株。将具抗性的植株转移到基质培养，并收获T₂代种子。

2.2.4转基因植株耐旱性鉴定

收获的T₂代转基因植株种子经表面灭菌后铺在含50mg/L卡那霉素的MS培养基上，4℃黑暗冰箱中2天，转移到(16h L/8h D)光照，23℃条件下培养。七天之后移出根生长良好的转基因苗至基质，覆膜三天，正常培养。正常培养时每隔四天浇水一次，第20天浇水之后，进行干旱胁迫处理16天。结果表明，转基因植株抗旱性明显强于野生型植株。干旱胁迫后，野生型植株基本上全部枯萎，并且恢复浇水后不能够恢复生长。而转基因植株干旱胁迫后，只有轻度萎焉，并且恢复浇水后能够全部恢复生长(图7)。

2.2.5转基因植株耐盐性鉴定

收获的T₂代转基因植株种子经表面灭菌后铺在含50mg/L卡那霉素的MS培养基上，4℃黑暗冰箱中2天，转移到(16h L/8h D)光照，23℃条件下培养。七天之后移出根生长良好的转基因苗至基质，覆膜三天后正常培养。正常培养时每隔四天浇水一次，第20天开始，每隔四天依次浇灌50mmNaCL，100mmNaCL，150mmNaCL，200mmNaCL盐水，每次浸泡2个小时。盐水浓度达到200mmNaCL之后，不再提高浇灌盐水浓度，以后每隔四天浇灌200mmNaCL盐水一次，每次浸泡2个小时，处理十天。结果表明，转基因植株耐盐性明显强于野生型对照植株。盐胁迫后，野生型植株表现出发黄、萎焉等症状，而转基因植株生长相对健壮(图8)。

抗旱耐盐性试验表明：AmNHX1可以用于植物抗旱耐盐性状的改良。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1986

<212>DNA

<213>沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)

<400>1

taactttgca actcatcaat aatctgactt tgtgcacaac ctgattctgc aattgcttat 60

tggttggaga gtggacaaaa tggccttcga tttaatttct gtagtttcaa aattgcaaaa 120

tctatccact tcggatcatg cctcagtagt ctcaatgaac ctatttgtgg cacttctgtg 180

tgcttgtatt gtccttggcc atctgcttga ggagaatcgt tggatgaatg agtctataac 240

tgcccttttg attggtcttt gcactggcgt agtcattttg ctgcttagtg gcggtacaag 300

ctcacatatt cttgttttca gtgaagatct tttctttata taccttcttc cacctataat 360

atttaatgcc gggtttcagg tgaaaaagaa gcagtttttt gttaacttca tgactattgt 420

gttgtttggt gctgttggta cattaatatc ttgtaccgtc ataactttgg gtgtcacact 480

agttctaaag aggatggata tcggtccatt ggaaatagga gatcttctag caattggtgc 540

aatatttgct gcgacagatt ctgtgtgcac attgcaggtg ctaaatcagg atgagacacc 600

cctactgtat agtcttgtat ttggggaggg tgttgtgaat gatgctacat cagtggtact 660

tttcaatgca atccaaagct ttgacctgga gcaaattgac ccctcaattg ccttgcaatt 720

tattgccaac ttcttatatc tgttcatcac aagcacactg cttggggttt tggcaggtct 780

actcagtgct tacattatta aaaagctgta tattggcagg cactctacag atcgtgaggt 840

tgctcttatg atgctaatgg catacctctc ctacatgctg gctgaattat tctatctgag 900

tggcattcta actgtattct tttctgggat tgttatgtct cattatactt ggcataatgt 960

gactgagagc tcaagaatca ctaccaagca tgcttttgca accttgtcgt ttgttgctga 1020

gatctttatc ttcctttatg ttggtatgga tgccatggac attgaaaaat ggaggtttgt 1080

cagtgatagc cctggaacat cagtagcagt gagttcagta ttgttgggtc tggtacttgc 1140

tggaagagca gcttttgttt tccccttatc cttcttatcc aacttattta aaaaatcacc 1200

aaatgagaag ctctccttca gacagcaagt gatcatctgg tgggctggtc ttatgagagg 1260

tgctgtttca atggcacttg cttataatca gttcaccatg tgggggcata ctcaactgcg 1320

aaccaatgca atcatgatca ctagcaccat cactgttgtg cttttcagca caatggtgtt 1380

tggtttgatg actaagccac tgataaggct tttgctgcct catggccctc ctaaaggcac 1440

aagcagcatg ataagcacag atccatctac tccaaaatca ttcactgtcc cacttctagg 1500

aagtgcccaa gattctgaag ctgatattgg tggccatgaa attcctcgtc catccagcat 1560

tcgtgcctta ctatccactc caacacacac tgttcaccga ttatggcgta agtttgatga 1620

ttcattcatg cgtcccgttt ttggtggcag gggttttgtt cctgtagagc ctggctcacc 1680

atctgaacgc aatggtcatc aatggcgttg agaggaaagc caagaaacgt gtaaaatgta 1740

ttgtaaacta cgtacattct ttggaccttg gagaccaaac aatgcatgta tgtattagag 1800

ccacataatg taattttgtt aagctttttg ggtagtgcga actgagaagg ctgtgtacca 1860

taagtcatct tattagattt tttgacccgt tatcataata ttttgtgcaa ctcgtgtgcc 1920

ttttttttag tgagccaata atgaattcag tgcaccagaa aatgtctcac atttttaaaa 1980

aaaaaa                                                            1986

<210>2

<211>553

<212>PRT

<213>沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)

<400>2

Met Ala Phe Asp Leu Ile Ser Val Val Leu Lys Leu Gln Asn Leu

1               5                   10                  15

Ser Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Met Asn Leu Phe Val

                20                  25                  30

Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val Leu Gly His Leu Leu Glu Glu

                35                  40                  45

Asn Arg Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Leu Ile Gly Leu

                50                  55                  60

Cys Thr Gly Val Val Ile Leu Leu Leu Ser Gly Gly Thr Ser Ser

                65                  70                  75

His Ile Leu Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu

                80                  85                  90

Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln

                95                  100                 105

Phe Phe Val Asn Phe Met Thr Ile Val Leu Phe Gly Ala Val Gly

                110                 115                 120

Thr Leu Ile Ser Cys Thr Val Ile Thr Leu Gly Val Thr Leu Val

                125                 130                 135

Leu Lys Arg Met Asp Ile Gly Pro Leu Glu Ile Gly Asp Leu Leu

                140                 145                 150

Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr Leu

                155                 160                 175

Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Val

                180                 185                 190

Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu Phe

                195                 200                 205

Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Glu Gln Ile Asp Pro Ser Ile

                210                 215                 220

Ala Leu Gln Phe Ile Ala Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Ile Thr Ser

                225                 230                 235

Thr Leu Leu Gly Val Leu Ala Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Ile Ile

                240                 245                 250

Lys Lys Leu Tyr Ile Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala

                255                 260                 265

Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu

                270                 275                 280

Phe Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Ser Gly Ile Val

                285                 290                 295

Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Ile

                300                 305                 310

Thr Thr Lys His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu Ile

                315                 320                 325

Phe Ile Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Met Asp Ile Glu Lys

                330                 335                 340

Trp Arg Phe Val Ser Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val Ala Val Ser

                345                 350                 355

Ser Val Leu Leu Gly Leu Val Leu Ala Gly Arg Ala Ala Phe Val

                360                 365                 370

Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Phe Lys Lys Ser Pro Asn

                375                 380                 385

Glu Lys Leu Ser Phe Arg Gln Gln Val Ile Ile Trp Trp Ala Gly

                390                 395                 400

Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu Ala Tyr Asn Gln Phe

                405                 410                 415

Thr Met Trp Gly His Thr Gln Leu Arg Thr Asn Ala Ile Met Ile

                420                 425                 430

Thr Ser Thr Ile Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Met Val Phe Gly

                435                 440                 445

Leu Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Leu Leu Leu Pro His Gly Pro

                450                 455                 460

Pro Lys Gly Thr Ser Ser Met Ile Ser Thr Asp Pro Ser Thr Pro

                465                 470                 475

Lys Ser Phe Thr Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Gln Asp Ser Glu

                480                 485                 490

Ala Asp Ile Gly Gly His Glu Ile Pro Arg Pro Ser Ser Ile Arg

                495                 500                 505

Ala Leu Leu Ser Thr Pro Thr His Thr Val His Arg Leu Trp Arg

                510                 515                 520

Lys Phe Asp Asp Ser Phe Met Arg Pro Val Phe Gly Gly Arg Gly

                525                 530                 535

Phe Val Pro Val Glu Pro Gly Ser Pro Ser Glu Arg Asn Gly His

                540                 545                 550

Gln Trp Arg

        553

SEQ ID NO.3

5’GCCTATAATATTCAATGCAGGGTTTCA 3’

SEQ ID NO.4

5’GTCCAGGGCATCCATACCAACATA 3’

SEQ ID NO.5

5’CTGAGTGGCATTCTAACTGTATTCTTTTCT 3’

SEQ ID NO.6

5’ACTTGGCATAATGTGACTGAGAGC 3’

SEQ ID NO.7

5’TGCTCCAGGTCAAAG 3’

SEQ ID NO.8

5’GCAGGTGCTAAATCAGGATGA 3’

SEQ ID NO.9

5’TGACACCCAAAGTTATGACGG 3’

SEQ ID NO.10

5’GGGAGGGTGTTGTGAATGA 3’

SEQ ID NO.11

5’AATGTACCAACAGCACCAAAC 3’

SEQ ID NO.12

5’TGCTTATTGGTTGGAGAGTGGAC 3’

SEQ ID NO.13

5’CACAGCCTTCTCAGTTCGCAC 3’

Claims (6)

1.一种沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，其特征在于是具有SEQ ID NO.2所示氨基酸残基序列的蛋白质。

2.沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白编码基因，其特征在于具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：该基因的编码框为自5’端第80位到第1711位碱基的DNA序列。

4.含有权利要求2或3所述沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因的表达载体。

5.含有权利要求2或3所述沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因的细胞系。

6.权利要求2或3所述沙冬青Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因在植物耐盐耐旱性状改良中的应用。

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