CN103483436B - 甜荞dreb转录因子 - Google Patents

Abstract

本发明甜荞DREB转录因子涉及一种来自于植物且具有多于20个氨基酸的肽。所述的甜荞DREB转录因子，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明运用同源克隆技术（Race技术）从甜荞中分离到甜荞FeDREB1，通过农杆菌转化拟南芥，使之在拟南芥中过表达，证实所分离的甜荞FeDREB1可以增加植物的抗寒性和耐旱性。甜荞FeDREB1在植物抗寒性和耐旱性状改良具有重要的理论及实际意义，将在植物的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

甜荞DREB转录因子

技术领域

本发明涉及一种来自于植物且具有多于20个氨基酸的肽。 

背景技术

非生物胁迫(如干旱、高盐、低温)是植物的生长发育、生物量形成和经济产量提高的主要限制因子。近20年来，大量受非逆境胁迫的诱导的基因被分离与功能鉴定，根据胁迫诱导基因表达产物的作用，可将这些胁迫诱导表达的基因分为两大类，第一类基因的编码产物在抗逆性中直接发挥功能，包括:l)直接保护细胞免受水份胁迫伤害的功能蛋白，如LEA蛋白(胚胎发生后期丰富蛋白)、渗透蛋白、抗冻蛋白、水通道蛋自、离子通道蛋白、伴侣蛋白和mRNA结合蛋白等渗透调节因子，如脯氨酸、甜菜碱、一些糖类等的合成。在胁迫条件下，水通道蛋白，糖运输蛋自，脯氨酸运输蛋白通过质膜和液泡膜运输水分，糖类和脯氨酸，以调节内外渗透压；2)毒性降解酶，如谷肤甘肤S转移酶、可溶性环氧化物水解酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶等可以保护细胞，免受活性氧的伤害。第二类基因编码的产物参与调控下游基因的表达以及信号的传导，包括: l)感应和传一导胁迫信号的蛋白激酶，如活化分裂素的蛋白激酶、依赖钙的蛋白激酶、受体蛋白激酶、核糖体蛋白激酶、转录调控蛋白激酶等；2)传导信号和调控基因表达的转录因子，如AP2/ERF转录因子(乙烯反应结合因子)、bZIP转录因子(带有亮氨酸拉链的转录因子家族)、MYC转录因子(带有基本螺旋串的螺旋转录因子家族)、MYB转录因子(带有色氨酸串基元的转录因子家族)、WRKY转录因子（N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列）、NAC转录因子（N端含有高度保守的NAC结构域）和DELLA转录因子；3)以及在信号传导中起重要作用的蛋自酶，如磷酸醋酶、磷酸酶c等。 

植物的抗逆性往往是由多基因控制的数量性状。植物对干早、低温抗性的强弱往往不取决于某一单一基因，而是受许多基因的共同调控。一个关键因子可以调控许多相关功能基因的表达，因此，通过增强一些关键的转录调控因子的作用可能使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良。这与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方法相比，将是提高作物抗逆性的更为有效的方法和途径。研究表明DREB转录调控因子在调控非生物胁迫相关基因的转录表达中起着重要的作用。DREB转录因子属于AP2/ER家族转录因子，它结合DRE或CRT脱水反应元件，激活下游启动子区具有该元件的抗逆相关基因的表达。近年来，拟南芥、水稻、大麦、小麦、大豆、玉米、棉花和等大量植物中的DREB转录因子功能相继被鉴定，证明它参与植物调控干旱、高盐、低温、病害和细胞发育相关的基因表达，提高植物耐低温和干旱能力，是植物基因工程改良植物耐非生物胁迫的重要有效基因。如A.htalinaa的DREB1A/CBF3基因的超量表达能提高植株对低温胁迫的耐性；Yamaguchi-Shinozaki等人(2006)的研究结果表明DREB1A能有效的用，来提高作物的干旱、低温的抗性。Dubuozet等人(2003)也证明水稻的OsDREBIA基因能明显提高单子叶植物对干旱、低温胁迫的耐性。甄伟等将CBF1基因转入烟草和油菜基因组中，对转化的烟草和油菜抗寒性的检测结果显示，转基因油菜的抗寒性有明显提高，转基因烟草的抗寒性也有一定提高。Hsieh等将拟南芥的CBF1转入番茄，转基因番茄叶片中的过氧化氢酶的活性比对照显著提高，H2O2含量比对照明显降低，转基因植株的抗寒性得到显著改善。韦善君等将玉米泛素启动子(Pubi)调控的CBF1基因转化烟草，发现CBF1组成型表达增强了转基因烟草的抗寒性。金建凤等将CBF1基因转入水稻中，发现低温处理后转基因植株体内脯氨酸含量比野生型明显增加，植株的抗寒性也明显增强。金万梅等利用根癌农杆菌介导的方法将拟南芥CBF1基因导入草莓中，提高了草莓对低温胁迫的抵抗力。DREB转录因子在植物非生物抗逆的作用明显，是目前被用来提高农作物的耐逆功能的重要基因之一。 

发明内容

本发明旨在提供一种能有效提高植物耐逆性的甜荞DREB转录因子。本发明还提供了该转录因子的编码基因。 

本发明还提供了一种提高植物耐逆性的方法。 

本发明所述的转录因子命名为甜荞FeDREB1。 

本发明所述的甜荞DREB转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

本发明所述的甜荞DREB转录因子的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

本发明还提供了含有上述编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌。 

本发明所述的提高植物耐逆性的方法，将含有上述编码基因导入植物中即可。其中所述的耐逆性为抗寒性和耐旱性。 

本发明运用同源克隆技术（Race技术）从甜荞中分离到甜荞FeDREB1 ，通过农杆菌转化拟南芥，使之在拟南芥中过表达，证实所分离的甜荞FeDREB1可以增加植物的抗寒性和耐旱性。甜荞FeDREB1在植物耐寒性状改良具有重要的理论及实际意义，将在植物的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。 

附图说明

图1为转化FeDREB1拟南芥T3代植株和野生型植株耐寒效果比较。 

图2为转化FeDREB1拟南芥T3代植株和野生型植株耐旱效果比较。 

具体实施方式

  实施1：甜荞FeDREB1基因的制备一

（1）将甜荞“西农9976”种子在MS培养基上萌发，在光照条件为8000LUX，温度为25℃条件下生长3周成苗，将整个植株放入－6℃低温培养箱中，冷胁迫6小时 ，取植株叶片，锡箔纸包裹后，迅速放入液氮，于－80℃低温冰箱永久保存，采用Takara公司RNA提取试剂盒，提取RNA，反转录成cDNA。最终用PCR方法扩增FeDREB1基因序列。其扩增引物如下，其上游引物中引入Xbal酶切位点，下游引物中引入SacⅠ酶切位点：

上游引物：5'- CGTCTAGAGCGATCATGGATTCTTTCTC -3'

下游引物：5'- AGGAGCTCGGTTCAAAATTTACCAAG -3'

PCR反应体系

PCR反应程序：94 ℃变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，29个循环；72℃ 10 min，4℃保温。

用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。 

（2）目的DNA 片段的回收和克隆 

①目的基因DNA 片段的回收。

目的基因DNA 片段从琼脂糖凝胶上的回收用天根生化科技有限公司DNA回收试剂盒回收，操作按照试剂盒说明进行。 

②回收片段与克隆载体（Pmd19-T Simple Vector）的连接反应 

连接反应按照takara公司Pmd19-T Simple Vector载体试剂盒说明进行操作，连接反应体系如下：

混匀反应物，短暂离心，4 ℃过夜。

③转化和阳性克隆的鉴定 

用于转化的大肠杆菌为DH5ａ（购于天根生化科技有限公司）。感受态细胞的制备和连接产物的转化均在无菌条件下操作。挑取转化平板上的白色菌落，采用质粒少量提取试剂盒提取质粒（购于天根生化科技有限公司）作为模板，按照前面所述的PCR引物和扩增条件进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生698bp基因的阳性克隆。

  ④测序验证 

经过鉴定的阳性克隆，送Sangon(上海生工生物技术有限公司)进行DNA测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施2：甜荞FeDREB1基因的制备二

（1）将甜荞“西农9976”种子在MS培养基上萌发成苗，光照条件为8000LUX，温度为25℃条件下生长3周成苗，取植株叶片，锡箔纸包裹后，迅速放入液氮，于－80℃低温冰箱永久保存，采用北京艾德莱生物科技有限公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（目录号DN15）提取植株叶片的DNA。以提取的DNA为模板，用PCR方法扩增FeDREB1基因序列。其扩增引物如下，其上游引物中引入Xbal酶切位点，下游引物中引入SacⅠ酶切位点：

上游引物：5'- CGTCTAGAGCGATCATGGATTCTTTCTC -3'

下游引物：5'- AGGAGCTCGGTTCAAAATTTACCAAG -3'

PCR反应体系

PCR反应程序：94℃变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，29个循环；72℃ 10 min，4℃保温。

用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。 

（2）目的DNA 片段的回收和克隆 

①目的基因DNA 片段的回收

目的基因DNA 片段从琼脂糖凝胶上的回收用天根生化科技有限公司DNA回收试剂盒回收，操作按照试剂盒说明进行。

②回收片段与克隆载体（Pmd19-T Simple Vector）的连接反应 

连接反应按照Takara公司Pmd19-T Simple Vector载体试剂盒说明进行操作，连接反应体系如下：

混匀反应物，短暂离心，4 ℃过夜。

③转化和阳性克隆的鉴定 

用于转化的大肠杆菌为DH5ａ（购于天根生化科技有限公司）。感受态细胞的制备和连接产物的转化均在无菌条件下操作。挑取转化平板上的白色菌落，采用质粒少量提取试剂盒提取质粒（购于天根生化科技有限公司）作为模板，按照前面所述的PCR引物和扩增条件进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生698bp基因的阳性克隆。

④测序验证 

经过鉴定的阳性克隆，送Sangon(上海生工生物技术有限公司)进行DNA测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例3：构建“35S+FeDREB1”的植物PBI121表达载体

（1）用Xbal和 SacⅠ酶切载体质粒PBI121和含有FeDREB1的T载体质粒，回收相应的DNA片段。

（2）将上述两片段在连接酶催化下于16℃过夜连接。 

连接体系： 

（3）转化和阳性克隆的鉴定

用于转化的大肠杆菌为DH5ａ（购于天根生化科技有限公司）。感受态细胞的制备和连接产物的转化均在无菌条件下操作。挑取转化平板上的白色菌落，采用质粒少量提取试剂盒提取质粒（购于天根生化科技有限公司）作为模板，按照前面所述的PCR引物和扩增条件进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生698bp基因的阳性克隆。

（4）从阳性克隆中提取质粒，采用冻融法方法转化农杆菌GV3101，获得工程化农杆菌，用于植物转化。 

实施例4：转化拟南芥和阳性植株筛选

（1）种子处理:取适量种子于1.5ml离心管中用70%的乙醇洗2min，无菌水洗1次，2.0%次氯酸钠(NaCIO)洗15min，无菌水洗4次，均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用Vortxe充分混匀；播种后MS平板于4℃培养3天；将MS平板放置于25℃光照培养箱培养；待小苗长出四片真叶后移栽至用MS液体培养基浇灌过的营养土中生长，保湿3天后，继续培养至现蕾开花。

（2）拟南芥转化。 

挑实施例3获得的工程化农杆菌单菌落，接种于5m1LB液体培养基中，28℃，250prm培养24h，按l:50（V/V）转接到含有100mlLB液体培养的250ml三角瓶中，28℃，250prm，继续培养至OD600为1.6左右；室温离心8000rpm，离心5min，收集菌液；用液体悬浮液悬浮菌体（5%蔗糖+0.5%Silwelt-77），调OD600值至0.8-1.0作为侵染液；选取初花期且生长健壮的植株，将整个花序浸泡于侵染液中，1min中取出；取出转化后的拟南芥植株平放，盖好保鲜膜，黑暗保湿培养24h后，正常光照培养；过一周后再侵染一次，等种子变黄成熟后受获种子，在34℃干燥2天，用1.5ml离心管装袋密封保存。 

（3）转基因拟南芥的筛选。 

 将收获的拟南芥种子消毒灭菌后，用牙签均匀点播于MS固体培养基上（含50mg/L卡那霉素），在25℃培养3周后，通过观察表型进行阳性植株筛选。阳性植株再筛选两代，得到稳定的T3代转基因种子后，进行基因功能（耐低温和耐干旱）评价实验。 

实施例5：转基因植株的耐低温和耐干旱评价

（1）耐低温评价。

将生长在MS培养基上2个星期的转基因拟南芥植株和对照植株（非转基因植株），放于-6℃的低温培养箱中冻害胁迫30小时后，再放回正常条件下生长，3天后照相，并计数植株存活率。结果如图1所示。结果表明转FeDREB1基因植株明显抗冻性强于对照，经统计分析，转基因植株50.6%存活，而对照存活率为0.0%，证明了FeDREB1具有提高植物耐低温功能。 

（2）耐干旱评价。 

转基因拟南芥种子和非转基因种子经灭菌后，同时播种于浓度分别为0%、4%、6%和8%的PEG6000的MS固体培养基中，7天后统计萌发率，结果如图2所示。结果表明转FeDREB1基因种子在0%、4%、6%和8%的PEG6000中萌发率没有区别，均为98-99%之间；与0% PEG6000中萌发率99%相比，非转基因种子萌发率在6% PEG6000中开始显著下降为83%，8%PEG6000培养基中萌发率将为45%，这证明了FeDREB1基因在高度渗透胁迫下，可以提供植物种子的萌发率，提高植物耐干旱性。  

Claims (6)

1.甜荞DREB转录因子，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种如权利要求1所述的甜荞DREB转录因子的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.含有权利要求2所述编码基因的表达载体。

4.含有权利要求2所述编码基因的细胞系。

5.含有权利要求2所述编码基因的宿主菌。

6.一种提高转基因拟南芥抗寒性和耐旱性的方法，其特征在于将含有权利要求2所述编码基因导入植物中即可。