CN101100667B - 一种转录因子锌指蛋白基因ZxZF及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一个新ZxZF基因。该基因来源于生长在沙漠中的灌木植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum(Bunge)Maxim.)。是一种理想的抗旱基因。该基因编码一种新发现的锌指蛋白。本发明还涉及含ZxZF的载体、宿主细胞，以及ZxZF基因在转化植物获得转基因植物中的应用。

Description

一种转录因子锌指蛋白基因ZxZF及其应用

技术领域

本发明涉及一种转录因子类锌指蛋白基因，具体地说，本发明涉及一种来源于可以生长在沙漠中的灌木植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum(Bunge)Maxim.)的锌指蛋白基因，命名为ZxZF。本发明还涉及该基因编码的蛋白-锌指蛋白，含有ZxZF的植物表达载体，以及利用该基因转化植物。

背景技术

转录因子也称为反式作用因子，它是一种能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。由于其能够调控下游一系列功能基因的表达，因此转录因子类基因的分离正日益受到人们的重视^[i]。近年来，相继从高等植物中分离出一系列调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应及发育等相关基因表达的转录因子^{[ii，iii，iv，v，]}。

由于植物的抗逆反应是一个十分复杂，植物对抗旱性的强弱往往不取决于某个单一因子，其性状受到许多因子影响。因此，要使植物抗旱性得到综合的、根本性的改良，重要的还是从一些关键的调节因子着手。一个转录因子可以调控多个与同类性状有关的基因的表达，在提高作物对环境胁迫抗性的分子育种中，与导入或改良个别功能性基因来提高某种抗性的传统方法相比，从改良或增强一个关键的转录因子的调控能力着手，是提高作物抗旱性的更为有效的方法和途径。增强一个转录因子的作用，就可通过它促进多个功能基因发挥作用，从而使植株性状获得综合改良的效果^[vi]。

转录因子都包含一个DNA结合区(DNA-binding domain)，这是转录因子识别顺式作用元件并与之相结合的一段氨基酸序列，相同类型转录因子DNA结合区的氨基酸序列较为保守。植物转录因子中比较典型的DNA结合区有bZIP结构域、锌指结构域、MADS结构域、MYC结构域、MYB结构域、Homeo结构域以及AP2/EREBP结构域等^[vii]。其中一些结构域又可根据其特征区中保守氨基酸残基的数量和位置划分成几个亚类，例如，锌指结构域^[viii]一般由20～30个氨基酸残基组成，含两个保守的半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基，它们在四级结构上与锌离子结合，根据半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基的数目和位置，可将含锌指结构域的转录因子分为C2H2，C3H，C2C2，C3HC4，C2HC5亚类，本发明所涉及的锌指蛋白基因属于C2H2亚类，目前尚未检索到来自其它植物的编码该锌指蛋白的基因。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有较强耐逆性的基因ZxZF。该基因来源于生长在沙漠中的强旱生植物-霸王(Zygophyllum xanthoxylum(Bunge)Maxim.)，其cDNA核苷酸序列与其编码的氨基酸序列分别示于图1和图2。

本发明的又一个目的是提供一种含ZxZF基因的植物表达载体。可使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括但不限于，双元农杆菌载体，例如pBIN19，pBI121，pBI221，含DRE和/或ABRE元件的启动子以及用于单子叶植物微弹轰击的植物表达载体。

本发明的载体也可含有适当的启动子。在本发明中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)、Ubiqutin、Actin启动子。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。同样，可使用产生通过颜色变化(例如GUS)或发光(例如荧光酶)来识别的化合物的酶。另外，也可不用任何筛选标记。

本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，电穿孔等导入植物细胞。

可使用本发明的方法转化的植物宿主包括单子叶植物和双子叶植物，所述单子叶植物例如小麦、玉米、水稻、禾本科牧草等，所述双子叶植物例如杨树、大豆、棉花、油菜等。

具体实施方式

下面通过参考实施例具体描述本发明，但本领域的普通技术人员可以理解的是，本发明并不局限于下述实施例。

实施例1.霸王ZxZF基因的克隆与序列结构分析

以3年生的霸王为材料，用干旱诱导诱导后，取叶片，提取RNA，RNA的提取按照RNeasyPlant Mini Kit(Cat.NO：74904.Qiagen，Hilden，Germany)的方法进行，总RNA加入DNaseI消化DNA，而后加入氯仿抽提两次，取上清，用异丙醇沉淀总RNA，空气干燥后，溶于DEPC水。

基因的分离采用BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Cat.No.634914)提供的方法进行，略有改动。

1.反转录生成第一链

反转录引物序列

CDS5(for 5′RACE)：5′-(T)25V N-3′

CDS3(for 3′RACE)：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀V N-3′

                   (N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C)

反转录反应条件如下：

DEPC水                      85uL

Rnase抑制剂(40U/uL)         5uL

CDS5/3(10μmol/L)           10uL

RNA                         10ug

于65℃温浴10分钟，立即于冰上淬冷，然后加入

MgCl2                       40uL

10×RNA缓冲液               20uL

dNTP混合物                  20uL

AMV                         10uL

总计                        200uL

然后进行下列操作：

1.30℃    10min

2.42℃    1h

3.99℃    5min

4.5℃     5min

依据差减文库片段测序与检索结果，选取一具有锌指蛋白结构域的片段，在其内部设计了两个基因特异引物(GSP)，GSP1：5′-TGTATCGCGACCTCCAACTCCAAGAAA-3′和GSP2：5′-AAACAAGCCAGGCCGAGACCATATTCA-3′

RACE扩增的PCR体系如下：

PCR条件：

95℃    1min

94℃    30s

60℃    30s

72℃    2min    2    29个循环

72℃    10min

4℃     终止

将PCR产物连接到pGEMT-easy并转化JM109感受态细胞(Promega，Madison，WI)以用于测序，分别获得该基因的5′端和3′端序列，再利用生物学软件SeqMan将此两个序列拼接成contig，以此contig序列为模板设计以下特异性引物用PCR扩增获得全长CDS。

正向引物(含XbaI酶切位点，其识别序列以下划线表示)

5′TCTAGAATTTCAAGCAAGGTAGCAC 3′

反向引物(含Sac I酶切位点，其识别序列以下划线表示)

5′GAGCTCTCGTCTGACAATTCACAAG  3′

PCR程序如下：

95℃    2min

94℃    30s

55℃    30s

72℃    2min    2    29个循环

72℃    10min

4℃     终止

PCR反应后，将PCR产物连接到T载体上测序，获得了ZxZF的全长cDNA。该基因mRNA全长为2122bp，含有1587bp开放阅读框架，编码528个氨基酸组成的多肽，其5′端为153bp，3′端为382bp。该基因所编码的蛋白含有C2H2类锌指结构域。

实施例2、用于转化的植物表达载体的构建

ZxZF植物表达载体的构建按常规分子生物学手段进行(参见“精编分子生物学实验指南”2001，科学出版社，颜子颖，王海林译)。以ZxZF编码区域cDNA为模板，使用上述正向和反向引物进行PCR扩增，通过在正向引物中引入XbaI位点和反向引物中引入Sac I位点，将其插入pBI121双元表达载体^[ix]中的CaMV 35S启动子后面，得到一个双元表达载体。其图谱如图6所示，经XbaI和Sac I酶切、PCR鉴定插入片段无误后，转入农杆菌LBA4404^[x]，再提质粒，酶切、PCR确认。该表达载体可直接用于植物的转化。

实施例3、转化拟南芥及功能验证

1.拟南芥培养

1)将拟南芥种子播于有机培养土中，在22℃/18℃，16hr/8hr光/暗生长室中培养。

2)一周后，第一对真叶长出，移栽至大盆中。

3)3～4周后，摘心。

2.ZxZF基因转化拟南芥

1)挑选生长良好的带有目的基因的农杆菌单菌落，养在5ml含适当抗生素之YEP中，28℃、220r/min振荡培养

2)第二天，将菌养成250ml。

3)取花序15cm左右的拟南芥植株，剪掉果荚及已开的花。

4)剪取适当大小的parafilm，套在土上，以避免土掉落。

5)将菌液离心，去掉上清液，以AIM培养基重新悬浮细胞(OD600＝0.6-0.8)。

6)将植物倒扣，花序插入菌液中。抽气15分钟。

7)让植物平躺，置于黑暗中，隔天再立起。

8)约一个半月后可以收种子(22℃/18℃，16hr/8hr光/暗)。

AIM培养基配方：

1/2MS salt+B5vit.+0.01mg/LBA+500mg/LMES+5％sucrose+0.02％silwet-77

3.筛选：

将收获的种子铺在MS培养基上，培养基中加入了50mg/L卡那霉素以进行初步筛选，将能能进行正常生长的拟南芥植株转入温室中，待成活后，提取其DNA，以此为模板进行PCR检测。

4.ZxZF基因功能验证

本研究利用渗透胁迫对转化的拟南芥幼苗根生长的影响来检测转基因植株的抗旱性。用转基因的T2代种子进行对渗透胁迫的性状观察，用甘露醇进行渗透胁迫处理。将种子用1‰升汞进行表面消毒后种在分别含250mM和400mM甘露醇的高渗培养基中，以未经过转化的野生型拟南芥为对照，4℃春化3天，将培养皿直立放置，拟南芥幼苗倒置生长，测量向下生长的根长，比较两者之间的生长差异。发现转基因的幼苗的根长明显比对照的长，达到极显著水平。

参考文献：

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Claims (5)

1.一种转录因子锌指蛋白基因，其序列是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其特征在于来源于霸王(Zygophyllum xanthoxylum(Bunge)Maxim.)，是一种抗旱基因。

2.权利要求1所述的基因所编码的锌指蛋白，其序列是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.一种载体，是包含权利要求1所述基因的双元农杆菌载体。

4.权利要求1所述的基因在转化植物获得转基因植物中的应用。

5.权利要求1所述的基因在获得抗旱植物品种培育中的应用。