CN112724218B

CN112724218B - 一种分离的莴苣Tr基因及其在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用

Info

Publication number: CN112724218B
Application number: CN202110116744.XA
Authority: CN
Inventors: 匡汉晖; 安光辉; 陈炯炯; 张维奕; 余长春
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2041-01-28
Also published as: CN112724218A

Abstract

本发明属于植物工程技术领域，公开了一种分离的莴苣Tr基因及其在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过农杆菌介导转化Tr基因到不敏感莴苣，其结果表明，Tr能够使不敏感莴苣转变为对嗪胺灵敏感。通过CRISPR‑Cas9技术在敏感莴苣中敲除Tr基因的结果表明，Tr能够使敏感莴苣变为不敏感。Tr是莴苣中鉴定到的第一个控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因，为植物过敏反应和抗病生物学途径的研究提供了新的实验材料和研究方法。同时Tr基因可作为载体选择标记，也可应用于转基因后代marker‑free个体的大规模高效筛选。

Description

一种分离的莴苣Tr基因及其在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用

技术领域

本发明属于植物工程技术领域，具体涉及一种分离的莴苣Tr基因及其在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用。

背景技术

莴苣(Lactuca sativaL.)是菊科莴苣属植物，原产于地中海地区，是我国重要的蔬菜作物。依据其不同的形态及食用部位，莴苣可以进一步划分为叶用莴苣(即生菜，Lactuca sativaLinn.var.ramosa Hort.)、茎用莴苣(即莴笋，Lactuca sativaLinn.var.angustata Irish ex Bremer)。生菜可进一步分为罗马生菜(Romaine)、结球生菜(Crisphead)、散叶生菜(Looseleaf)、奶油生菜(Butterhead)等(Zhang et al.2017)。部分莴苣种质，尤其是罗马莴苣(Romaine)种质，表现为对杀菌剂嗪胺灵过敏，在喷施嗪胺灵溶液或含有嗪胺灵的农药之后，过敏莴苣在24小时内产生坏死斑点并失水萎蔫(Maxon1979)。因此，对莴苣的种植和生产产生了不便。世界范围内，莴苣尤其是罗马莴苣被大量种植，因而具有非常重要的经济价值。2017年，莴苣基因组测序完成，为莴苣各种遗传性状的控制基因的克隆及其功能研究提供了便利。

申请人发现，控制莴苣对嗪胺灵的过敏反应是由一个编码TIR-NBS-LRR类的抗病基因控制的。到目前为止，控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因的类型及其分子机理均未被报道。因此，对控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因的克隆及对其分子机理的解析具有重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种分离的莴苣Tr基因，所述基因编码的蛋白质为SEQID NO.3所示，对应的CDS序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供了莴苣Tr基因在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

莴苣对嗪胺灵过敏反应的相关基因Tr的获得：

本发明通过利用对嗪胺灵过敏的罗马生菜(Romaine)与对嗪胺灵不过敏的结球生菜(Crisphead)进行杂交获得F₁杂种，F₁进一步自交获得F₂代。利用F₂代群体，联合BSR-seq和传统的遗传定位的方法，对控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因进行图位克隆。对定位区间内参考基因组上的基因进行功能注释及序列分析，对F₂代分离群体中的交换单株的单倍型分析之后，确定了候选基因，并通过转基因互补实验以及基因编辑实验验证了候选基因Tr编码对嗪胺灵的敏感性。该基因编码一个TIR-NBS-LRR类的抗病基因，属于TNL家族，Tr基因编码的白质为SEQ ID NO.3所示，其CDS为SEQ ID NO.2所示，Tr基因的全长为SEQ IDNO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了莴苣Tr基因在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用；包括利用本领域的常规方式，将SEQ ID NO.3所示蛋白质对应的核苷酸在不敏感莴苣中表达，获得的转基因植株的表型变为嗪胺灵敏感；或者利用突变、敲除或基因沉默等方式，将Tr在敏感莴苣中敲除，获得的纯合敲除的转基因植株的表型为嗪胺灵不敏感。

以上所述的应用中，优选的，所述的嗪胺灵不敏感转基因植株包括SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9中的任一一个序列。

本发明的保护内容还包括：检测SEQ ID NO.3所示蛋白质对应的核苷酸，或SEQ IDNO.1所示基因的试剂用于莴苣嗪胺灵敏感性的筛选或育种；

SEQ ID NO.3所示蛋白质对应的核苷酸或SEQ ID NO.1所示基因制备嗪胺灵不敏感或嗪胺灵敏感的转基因莴苣；

以上所述的莴苣，优选的，为罗马生菜(Romaine)或结球生菜(Crisphead)。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次提出了一个控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因，对莴苣对嗪胺灵过敏反应的分子机理以及植物抗病生物学途径的研究具有重要的理论意义。

作为首个克隆的控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因。到目前为止，Tr基因从未被报道过参与任何植物对嗪胺灵的过敏反应。该基因在植物过敏反应和抗病生物学途径研究中有重要应用潜力，也可用于对转基因后代的marker-free个体的高通量选择。

附图说明

图1为敏感莴苣和不敏感莴苣在嗪胺灵溶液处理前(左)和处理24小时后(右)的表型示意图。

图2为莴苣一号染色体的约120Mb处有一个控制莴苣对嗪胺灵过敏反应性状的遗传位点示意图。

图3在不敏感莴苣中互补Tr基因可以使不敏感莴苣的表型变为敏感，在敏感莴苣中敲除Tr基因可以使敏感莴苣的表型变为不敏感。

其中：(a)在不敏感莴苣中互补Tr基因，得到阳性互补转基因植株Tr-COM#1，Tr-COM#1的表型由不敏感变为敏感(左一、左二)；在敏感莴苣中敲除Tr基因，得到纯合敲除Tr基因的植株Tr-CR#1，Tr-CR#1的表型由敏感变为不敏感(右二、右一)；标尺为1cm；

(b)转基因植株Tr-COM#1的T1代单株基因型与表型分析；S代表敏感表型；I代表不敏感表型；扩增出条带的孔道代表含有Tr转基因插入的植株；无扩增条带的孔道代表无Tr转基因插入的植株。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

在本发明实施例中，不敏感莴苣为对嗪胺灵不敏感的结球生菜(Crisphead，PI536839)；敏感莴苣为对嗪胺灵敏感的罗马生菜(Romaine，PI344074)。

实施例1：

控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因Tr的获得：

1.莴苣对嗪胺灵过敏反应的遗传分析

为分析控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因的遗传规律，本发明采用对嗪胺灵敏感的罗马生菜(Romaine，PI344074)与对嗪胺灵不敏感的结球生菜(Crisphead，PI536839)作为亲本(图1)，进行杂交获得F₁，进一步自交获得F₂代群体(Yu et al.2020)。对F₂代个体进行嗪胺灵溶液处理并对24小时之后的表型进行评估、记录及统计分析。在179株个体的F₂群体中敏感表型的个体数量为134个，不敏感表型的个体数量为45个，敏感个体：不敏感个体＝134：45≈3:1(χ²＝0.0128<χ²(0.05,1)＝3.84,P>0.05)。显示控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的表型是由单基因控制的质量性状。

2.Tr基因的图位克隆

为克隆上述F₂代分离群体中控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因，本研究采用了BSR-seq的分析方法。从F₂群体中选取敏感性状单株20株和不敏感性状单株20株，取相同生长部位及大小的叶片混合后磨样，提取两个混池的总RNA，并进一步采用IlluminaHiseq2500平台对总RNA进行测序。将RNA测序数据比对到莴苣参考基因组(https://genomevolution.org/coge/GenomeInfo.pl？gid＝28333)上，采用SAMtools软件对两个混池进行SNP分析，并计算Δ(SNP-index)平均值，采用perl脚本对Δ(SNP-index)平均值进行图形展示。结果表明，在莴苣一号染色体的约120Mb处有一个明显的效应位点，即此位置存在一个控制莴苣对嗪胺灵过敏反应性状的遗传位点(图2)。借助分子标记，对该遗传基因进行图位克隆，最终筛选出一个基因与嗪胺灵敏感性状共分离。该基因只存在与敏感的个体中，不存在于不敏感的个体中，所述基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.3所示，对应的CDS序列为SEQ ID NO.2所示，基因全长为SEQ ID NO.1所示。

实施例2：

控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因Tr在莴苣中的应用：

(1)以敏感罗马生菜(Romaine，PI344074)DNA为模板，用引物：AGHP544F:GATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTAATTAAAGGGTTTGGAATTGAAA和AGHP544F:TTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACACATAAGACATGACAA，扩增出的目的片段包含SEQ ID NO.1所示序列，通过同源重组的方法将其插入到pRI101植物表达载体中(载体经SacI/ScaI线性化)，并在农杆菌介导下(Curtis et al.1994)转化不敏感莴苣(tr/tr)。使用转基因检测引物：AGHP538F:CTTCTGTAAAAGGATCATGCC；AGHP538R:CTTGACATCTTCTTCACTTG检测转基因植株，共获得了4株转基因植株，并且每个株系均表现为对嗪胺灵敏感的表型(图3中(a)左二显示其中的一株转基因植株Tr-COM#1对嗪胺灵敏感的表型)。对其中一个转基因株系的T₁代敏感表型及基因型分析发现，具有转基因插入的单株均表现为敏感表型，而无转基因插入的单株表现为不敏感表型(图3中(b))，表明转基因植株的敏感表型与转基因插入片段共分离，进一步验证了Tr具有控制莴苣对嗪胺灵过敏反应性状的功能。

(2)利用CRISPR-Cas9技术，对敏感亲本中的Tr基因进行敲除，gRNA序列是：CTTGACATCTTCTTCACTT，通过同源重组的方法将gRNA和U6启动子序列插入到经BsaI线性化的CRISPR-Cas9敲除载体pKSE401中(Tang et al.2018)，并在农杆菌介导下(Curtisetal.1994)，转化敏感莴苣(Tr/Tr)，使用转基因检测引物：U26F:TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC；U29R:AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC检测转基因植株，共获得了6株纯合敲除的转基因植株，并且对每个株系的敲除事件进行Sanger测序分析(图3中(c)，测序获得的突变序列具体为：

Tr-CR#1：CCAATTATCAATAGAATCGTTAGCTTGGGTTGAACGATTACGAAATTGAAGGTGTGATCAAAATCCAAGAAATGATGAGTGT

Tr-CR#2：CCAATTATCAATAGAATCGTTAGACTTGACATCTTCTCTTGGGTTGAACGATTACGAAATTGAAGGTGTGATCAAAATCCAAGAAATGATGAGTGT

Tr-CR#3：CCAATTATCAATAGAATCGTTAGACTTGACATCTTCTTGGGTTGAACGATTACGAAATTGAAGGTGTGATCAAAATCCAAGAAATGATGAGTGT

Tr-CR#4：CCAATTATCAATAGAATCGTTAGACTTGACATCTTCTTCAAGAAATGATGAGTGT

Tr-CR#5：CCAATTATCAATAGAATCGTTAGACTTGACATCTTCTTCCTTGGGTTGAACGATTACGAAATTGAAGGTGTGATCAAAATCCAAGAAATGATGAGTGT

Tr-CR#6：CCAATTATCAATAGAATCGTTAGACTTGACATCTTCTTCATCTTGGGTTGAACGATTACGAAATTGAAGGTGTGATCAAAATCCAAGAAATGATGAGTGT

对所有6个转基因株系的T₁代表型及基因型分析发现，具有Tr基因纯合敲除的单株均表现为不敏感表型，而Tr基因无敲除或是杂合敲除的单株表现为敏感表型(图3中(a)右一显示其中的一株转基因植株Tr-CR#1对嗪胺灵不敏感的表型)，表明Tr基因敲除事件与不敏感表型共分离，进一步验证了Tr具有控制莴苣对嗪胺灵过敏反应性状的功能。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种分离的莴苣Tr基因及其在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7270

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aattaaaggg tttggaattg aaattgttgt tgcaaccggt tgaccgtttg atggaaacaa 60

tttttatggt taacatcggg ataacataaa agctttcaat ccataagttc gttctattta 120

aaaaatatat acatgcttac tcttactcaa aattctatct aagatataat aataatatat 180

ttaggtatcg aactctttat atgtatatat aactatattc cggtgaattg taaaagaaat 240

gtcaaacata tattataatg gtacgtggta ttaatttcag cccaatatat atttttctca 300

agcaaaaccc agcccaaaga tatcttcttc catttaaaag agcaaacaca acccgcacaa 360

acattcattc ggaaaaaaaa aataataaaa aaaatagaga aattaaatat ccttttactt 420

ttgttcctat aaatcctcct accaaattaa atgatgatat ttgtcatttt aatatatata 480

aatatcatta aatgaacatt aaatgtgaca tatgtcttta tttaattggg taggaagatt 540

catagtaaca aatagaagaa gaatatttaa tttctcaaaa aaataacacg gaatatatag 600

aagccatgtc gaaataccga ccacaaaaca cccactacac gctagaatct tagtatcact 660

ggttgtaaca tttgcacttt cgttgaattt gcgtaataaa tatctgcatt ttcttggaat 720

ttaccttctc cttataaata aatattaata atacttataa agtaaaaaga aaaggagcac 780

ccctaaccca tcatcctcgt tcactctcct ctatatatgg ccgcctccct tcatccttaa 840

ctcgccgttt acctgccgac ttaccgtttt cagtcgtctt tctcagcctc gtcactgttg 900

gttcatcctc tttcatccct gcttcagatc tctaggttag tttcagatat tgtttgacaa 960

tttttcttat taatcataag tcaacgtcat aatcaattgt ttatttcgcg aacatgtgat 1020

tggatttatt ttctatttca gttactttta tttaatatta tatatcaatt aggatagcag 1080

acactctttt tagagtcaag tccactactc cagaatcatg aacagaaatt cgtgcaattg 1140

ggaaattttt cagcgctaca aaattgcttc ctcaattcct ttatattttc aaggaaattt 1200

gaggatctgt gtgtcaagaa gcttcttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260

ttttttcctg tttggatctt taaattactc atttttgata tctagcgaac gcttgaaaat 1320

gccaaattgc caatattata ggcgattcct ttcatgggag gcaatcgtgg atcttgtagt 1380

tgtacccaga atggtatttg gtgttgattt gtggattttt aaaattaaaa tgttgacttt 1440

aaaggttaaa tgaataaatt gcttcgatat ttttttttgc acctgaactt aattagctgg 1500

aaaaaatagg ttaaccagtt caattagtgg agtaactgtt ttctaaataa ttcccatggc 1560

aatgtaattg ttactctgta tcaatactta gctatacctt tttccatttg aaataagagc 1620

aatctctctt tgcttgattc acatacgtcc tttgcacaca aaacaaccaa ggttagcacc 1680

aattaagcta tgaatcacct ttgagcttga aaattaaatc gagggttaaa acacacatat 1740

acatattatg caatgtatag ctccaatatc aactctaaac tcaaagtctg ggggtaaata 1800

tttccaaatt aacacaatta gagttcatat aatgaaattt aaacattttc taggcatgtt 1860

agttcacatg gcaaagttca gagatgcata tgtattgtat tttaattact taaaagtttt 1920

attttttagg aattcaaagt tattattaat attattattg aggtttaatt tgtttgatga 1980

gatttacgtt gcatattgta aatactaata atttgaattc ttttgtagag gcattatgta 2040

ctggatcctg acattgaagc acaagtgagg aaaactggtg aaaccaactt acattattga 2100

taacctgtgg agtttcagag cttacttagg tacacctgca tttaagaaga acctttaaat 2160

aaatactcaa aaaggtggga agggtgacga gtcatcaaca cacaactcat aatggttgtt 2220

ctatctgaaa ttccagaagg atcttcatct tcttcatcaa ctcatggccc tagttcatca 2280

acttgtggtc ctagttcatc aactcaagat catagatatg atgtattttt aagttttaga 2340

ggtgttgaca ctcgtcttag ttttactaat tatctgtatg aggcccttct agatgccaat 2400

atcaatacct tcttggacaa tgaagagatt gaaacagggg aagatctaaa acctgaatta 2460

gagagtgcaa ttaaggcatc tcgggcttct attattgtgt tgtctaaaaa ttacgcttct 2520

tcaacatggt gtctggatga attggtgctg atccttgagc agcgtatcac atccaaccac 2580

attgtcatcc ccatatttta tcatgtggag cccacccatg tcaggaagca acaaagtagc 2640

tttggagatg caatggctga gcataagcag aagatggaga gggagacaaa tgcaaataag 2700

agaagtcaat gggctcaaaa gatggatagg tggaataaag cacttacaga agttgctgat 2760

ttaaaaggga aggacgttac tggcaggtaa ccacatattc ccccatatga aaattttcta 2820

tattatcttc accatatgca tttcagcaag tttttttttt tttttttcct ttcctttttt 2880

ttttttaatt atcattgaat agacgtatat tcatatggta ggataacaaa gatgcacaaa 2940

gttgaatcca tgttatctga tctcattaat aaaattatat agatagatta attattctga 3000

taatttttac atgtttgtta tgcatttatt tatttatttt aaacaactct taatctaatc 3060

ctaaaccaca ccaatgtctc gagcgagact tgaaccctca accccttgga cgagaaacac 3120

gttttccaac ccctgatact gctaggtgat aagccctttg gtttatgcat attgtattta 3180

aaataggaag acacaacaat tagaaaagaa gagatcatgc cacatcatat attagcggtt 3240

ttaggttaac tagctgcatt atttggccct tatttaaaat gtcattgtat attttgtata 3300

aatataacat tgttgcataa ccggtaaaaa ggcgaaatgt tgttgcataa ataaccaatt 3360

aaccctttta ttaaaaacca gatacgttgc tgtacatcta ctattagtta taccatacta 3420

ccttcaaatc atagtgtctt ttatgataaa taacttctgt tgtaagtagt aaaggataac 3480

ctacaggcat tcttttgaga ctcaccacat tgctggttga gttttacggt cttgtagaaa 3540

catagtgaag ttacaaggcc cattagtgaa aacttgtatt acattggtag ttttggtctt 3600

attatacata aatatttgtg accttacaca ttagatatgt atatggttag aatgaaaaga 3660

caatatggtt tgatgtgaag aacttaatta aaagtttaaa actaatagtt gttgtgaagg 3720

aatcatattt ttggaatatt atcttgtcat tgataaagag gttaaaccct catttataaa 3780

tcaactagta cctaaaacag gaaaatagaa attaagtaac ctaaaatcaa ataaacccta 3840

ctttacatat atctaacact aacactcgtg atataatttt gatttggatc tttatataaa 3900

ataaaatcac caaatttgtt ttgttagttt tgtgcattgt gttttgtaat tcttattaaa 3960

tcatgtttca ggctagagat ggagtttatt gaagaaattg tgaaggacat ccatcgtaga 4020

ttacatgcac cattaagaag tgttcaacag ctatatattg ggatggacta ccatattaac 4080

tttgtgactt catggttgaa agatggatca tcacatacgg tagacatact cactattaca 4140

ggtataggcg ggatcgggaa gacatcttta gccaaacatg tctatgggct atattctcat 4200

gaattccaca aaagcagcta tattgaagat atcactagga gatgtgatgg gaagtatact 4260

gggctgcttg atatacaaaa acaattgtgc ggtgacattg caaaaacaag ttcaattcaa 4320

gtttatgatg tttcaaaata cacatcaatg atagagaatg caatagctcg taaaagggtg 4380

tttcttgttc ttgatgacat cagtagtatt gatcagttcg atgcattact tggaagtaaa 4440

ggttttcatc ctggaagcaa ggttataata acgacaaagg acagatgctt gacagagagt 4500

tgtgcactat tcaaaacaaa cattaaaccc aagcatgtag aacactttct tcatggctta 4560

cgtgagactg aatcacgaca acttttgtgc tcccatgcat tcatgtgcaa ccatcccaag 4620

gaaggttatg aagaggtgtc aaataagatt ttggagtatt gtcaaggaca tccattggct 4680

cttgaagttt tgggcaagct tcttcataat cgaggtgtgg cgtattggga agggtgcatg 4740

gaaggcctaa agaaagaaac aaatgatcgt ataaataatg tcttgagaat gagcttcgaa 4800

tctttgccat ccaaaaacga taaggaactg tttaagcata ttgcttgttt ttttgttgga 4860

atagacagag atgttagcga aacaatatta gaggcgtgtg atataaacac gagatctgga 4920

atcacgaatc tcgttgacaa atgtcttctt agtattggat ggaataatga attgaagatg 4980

catcagttgg ttcaagagat gggaagattc gaagtacatc aagaatcacc tgataagcca 5040

tggaaacgaa gtcgattatg gtgtcataag gattcattca aagtgctgaa acaaaaaaag 5100

gtaagaagcc attatgcttt tagtagtgtg catgtccaaa atactttgta ttgcctaatt 5160

tgtttatttg cattctgttt cttcttaggg taagggaaat cttctaggcc tttcccttga 5220

catgcacatg cttgagaaag agaagttagg agcatcgtat gaactgaaaa cagaagcatt 5280

aagtaacatg gataatttga tgctactgaa actcaattat gtgtacatga atgggtctta 5340

tgagaacttt ccagaagaaa taaaatggtt gtgtatgaat gggtttcgtt taaagtctat 5400

acctttagac ttacctatgc agaatctggt tgcccttgac atgtcatata gcaatattga 5460

atcattttcc ggttgttata gcaatccaca gcgacttgag aaaaggcaaa aggtaaagtt 5520

atcttcattc attagtcatg catgtgagtt gatgaaattc aatacgatac taacttattt 5580

ccattttgta gttggatggc tcgtgcttta aagagaaaag gttgtttgct tcactgaaga 5640

ttcttaattt aagtttctgc gaacaacttc atagtgttgg tgactttgac caactccctg 5700

cacttgagag gttaatactt aggaattgca ttggattggt tgacgtttgt gaatcaattc 5760

ggcaatgtgt tgagcttatc ctcatcgatc tgagttactg catgaaactt gaaaaacttc 5820

caagaaatat aggcatgtta aacaaggttg aaacaatgtt gttagatggt tgtaatcttg 5880

gtgaatctgg aatcaagaat atggatatgg attcactgga aatgtgcacg gttaccaaca 5940

ttgacataaa cagagccttt atgggttgta taccacgtga tttgaagtac tctgcaatgt 6000

ctttaccgag gtctttagta atgttgtcac ttacagagaa caagttgtcc aatgaatcct 6060

ttcccatgga ctttagttgt ctatccatgt taaaggaatt atatttagat ggcaatcttt 6120

tcaattccat gcctagttgt gtgagaacgc ttcctagact tgaaatactt agtatggatg 6180

attgtgaaaa attgaagtca gtcgagtatc ctccacgtac actaaagaag ttgtttcttg 6240

atgttgctgg tgattatcat acaaacaaag ttgtatttgt tccagacatg tccccactcc 6300

aattatcaat agaatcgtta gacttgacat cttcttcact tgggttgaac gattacgaaa 6360

ttgaaggtgt gatcaaaatc caagaaatga tgagtgttga tgaaaaggtg ttacgtagct 6420

tgggctggac taatttagac ttcctcaaca aaaggcgcgt gggaactaat tcttcagaat 6480

ctaaaatcca ggttttgtct agttaactta cctgtctgtg tttatgtgaa gacatataat 6540

gttaattatt atggtggttt gtatttggca gaggatgttt tatgaatttg gaatattcag 6600

cacaaggtat gaggctgagg agatgccgag ttggtttatg catagaagtg tggggccagt 6660

gatatcattt accatcccat catcatctcc aaacaacctc cttacagggc tcaacttctg 6720

ctctctgcac acattaaacc ctcttgatga ggagttggat ttatcagatc atgaactttt 6780

ccctttgacg ccaatgatga caattagtaa tataacaaaa aaacgtatgt ggatatatga 6840

acgttttgtg gccagattta atgaaactct ggatctttgg gtgatattaa gtcattggat 6900

gtttgggaag aatgagatgg aggccggtga ccacattact atcactgtta caccgcagtg 6960

gcatgatcct tttacagaag catattatga agttgtaaag gagtgtgggg tgagtcttgt 7020

gtatgaagat ggagagaaga aggatgaaga agaagatgtg ttgggttatt acaagtcatg 7080

gaatcacata attggtggag atctctctcc ttttcaagca acaacaggac aatacatcct 7140

agacagcgaa cgactttttg aggctggcat taatttttgg ccatatcatc gtaaattcat 7200

tccagacggg cccgactatc aaggtagatg tcatttatta aaatatttta ttgtcatgtc 7260

ttatgtgtaa 7270

<210> 2

<211> 3627

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggttgttc tatctgaaat tccagaagga tcttcatctt cttcatcaac tcatggccct 60

agttcatcaa cttgtggtcc tagttcatca actcaagatc atagatatga tgtattttta 120

agttttagag gtgttgacac tcgtcttagt tttactaatt atctgtatga ggcccttcta 180

gatgccaata tcaatacctt cttggacaat gaagagattg aaacagggga agatctaaaa 240

cctgaattag agagtgcaat taaggcatct cgggcttcta ttattgtgtt gtctaaaaat 300

tacgcttctt caacatggtg tctggatgaa ttggtgctga tccttgagca gcgtatcaca 360

tccaaccaca ttgtcatccc catattttat catgtggagc ccacccatgt caggaagcaa 420

caaagtagct ttggagatgc aatggctgag cataagcaga agatggagag ggagacaaat 480

gcaaataaga gaagtcaatg ggctcaaaag atggataggt ggaataaagc acttacagaa 540

gttgctgatt taaaagggaa ggacgttact ggcaggctag agatggagtt tattgaagaa 600

attgtgaagg acatccatcg tagattacat gcaccattaa gaagtgttca acagctatat 660

attgggatgg actaccatat taactttgtg acttcatggt tgaaagatgg atcatcacat 720

acggtagaca tactcactat tacaggtata ggcgggatcg ggaagacatc tttagccaaa 780

catgtctatg ggctatattc tcatgaattc cacaaaagca gctatattga agatatcact 840

aggagatgtg atgggaagta tactgggctg cttgatatac aaaaacaatt gtgcggtgac 900

attgcaaaaa caagttcaat tcaagtttat gatgtttcaa aatacacatc aatgatagag 960

aatgcaatag ctcgtaaaag ggtgtttctt gttcttgatg acatcagtag tattgatcag 1020

ttcgatgcat tacttggaag taaaggtttt catcctggaa gcaaggttat aataacgaca 1080

aaggacagat gcttgacaga gagttgtgca ctattcaaaa caaacattaa acccaagcat 1140

gtagaacact ttcttcatgg cttacgtgag actgaatcac gacaactttt gtgctcccat 1200

gcattcatgt gcaaccatcc caaggaaggt tatgaagagg tgtcaaataa gattttggag 1260

tattgtcaag gacatccatt ggctcttgaa gttttgggca agcttcttca taatcgaggt 1320

gtggcgtatt gggaagggtg catggaaggc ctaaagaaag aaacaaatga tcgtataaat 1380

aatgtcttga gaatgagctt cgaatctttg ccatccaaaa acgataagga actgtttaag 1440

catattgctt gtttttttgt tggaatagac agagatgtta gcgaaacaat attagaggcg 1500

tgtgatataa acacgagatc tggaatcacg aatctcgttg acaaatgtct tcttagtatt 1560

ggatggaata atgaattgaa gatgcatcag ttggttcaag agatgggaag attcgaagta 1620

catcaagaat cacctgataa gccatggaaa cgaagtcgat tatggtgtca taaggattca 1680

ttcaaagtgc tgaaacaaaa aaagggtaag ggaaatcttc taggcctttc ccttgacatg 1740

cacatgcttg agaaagagaa gttaggagca tcgtatgaac tgaaaacaga agcattaagt 1800

aacatggata atttgatgct actgaaactc aattatgtgt acatgaatgg gtcttatgag 1860

aactttccag aagaaataaa atggttgtgt atgaatgggt ttcgtttaaa gtctatacct 1920

ttagacttac ctatgcagaa tctggttgcc cttgacatgt catatagcaa tattgaatca 1980

ttttccggtt gttatagcaa tccacagcga cttgagaaaa ggcaaaagtt ggatggctcg 2040

tgctttaaag agaaaaggtt gtttgcttca ctgaagattc ttaatttaag tttctgcgaa 2100

caacttcata gtgttggtga ctttgaccaa ctccctgcac ttgagaggtt aatacttagg 2160

aattgcattg gattggttga cgtttgtgaa tcaattcggc aatgtgttga gcttatcctc 2220

atcgatctga gttactgcat gaaacttgaa aaacttccaa gaaatatagg catgttaaac 2280

aaggttgaaa caatgttgtt agatggttgt aatcttggtg aatctggaat caagaatatg 2340

gatatggatt cactggaaat gtgcacggtt accaacattg acataaacag agcctttatg 2400

ggttgtatac cacgtgattt gaagtactct gcaatgtctt taccgaggtc tttagtaatg 2460

ttgtcactta cagagaacaa gttgtccaat gaatcctttc ccatggactt tagttgtcta 2520

tccatgttaa aggaattata tttagatggc aatcttttca attccatgcc tagttgtgtg 2580

agaacgcttc ctagacttga aatacttagt atggatgatt gtgaaaaatt gaagtcagtc 2640

gagtatcctc cacgtacact aaagaagttg tttcttgatg ttgctggtga ttatcataca 2700

aacaaagttg tatttgttcc agacatgtcc ccactccaat tatcaataga atcgttagac 2760

ttgacatctt cttcacttgg gttgaacgat tacgaaattg aaggtgtgat caaaatccaa 2820

gaaatgatga gtgttgatga aaaggtgtta cgtagcttgg gctggactaa tttagacttc 2880

ctcaacaaaa ggcgcgtggg aactaattct tcagaatcta aaatccagag gatgttttat 2940

gaatttggaa tattcagcac aaggtatgag gctgaggaga tgccgagttg gtttatgcat 3000

agaagtgtgg ggccagtgat atcatttacc atcccatcat catctccaaa caacctcctt 3060

acagggctca acttctgctc tctgcacaca ttaaaccctc ttgatgagga gttggattta 3120

tcagatcatg aacttttccc tttgacgcca atgatgacaa ttagtaatat aacaaaaaaa 3180

cgtatgtgga tatatgaacg ttttgtggcc agatttaatg aaactctgga tctttgggtg 3240

atattaagtc attggatgtt tgggaagaat gagatggagg ccggtgacca cattactatc 3300

actgttacac cgcagtggca tgatcctttt acagaagcat attatgaagt tgtaaaggag 3360

tgtggggtga gtcttgtgta tgaagatgga gagaagaagg atgaagaaga agatgtgttg 3420

ggttattaca agtcatggaa tcacataatt ggtggagatc tctctccttt tcaagcaaca 3480

acaggacaat acatcctaga cagcgaacga ctttttgagg ctggcattaa tttttggcca 3540

tatcatcgta aattcattcc agacgggccc gactatcaag gtagatgtca tttattaaaa 3600

tattttattg tcatgtctta tgtgtaa 3627

<210> 3

<211> 1208

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Val Val Leu Ser Glu Ile Pro Glu Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Thr His Gly Pro Ser Ser Ser Thr Cys Gly Pro Ser Ser Ser Thr Gln

20 25 30

Asp His Arg Tyr Asp Val Phe Leu Ser Phe Arg Gly Val Asp Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Phe Thr Asn Tyr Leu Tyr Glu Ala Leu Leu Asp Ala Asn Ile

50 55 60

Asn Thr Phe Leu Asp Asn Glu Glu Ile Glu Thr Gly Glu Asp Leu Lys

65 70 75 80

Pro Glu Leu Glu Ser Ala Ile Lys Ala Ser Arg Ala Ser Ile Ile Val

85 90 95

Leu Ser Lys Asn Tyr Ala Ser Ser Thr Trp Cys Leu Asp Glu Leu Val

100 105 110

Leu Ile Leu Glu Gln Arg Ile Thr Ser Asn His Ile Val Ile Pro Ile

115 120 125

Phe Tyr His Val Glu Pro Thr His Val Arg Lys Gln Gln Ser Ser Phe

130 135 140

Gly Asp Ala Met Ala Glu His Lys Gln Lys Met Glu Arg Glu Thr Asn

145 150 155 160

Ala Asn Lys Arg Ser Gln Trp Ala Gln Lys Met Asp Arg Trp Asn Lys

165 170 175

Ala Leu Thr Glu Val Ala Asp Leu Lys Gly Lys Asp Val Thr Gly Arg

180 185 190

Leu Glu Met Glu Phe Ile Glu Glu Ile Val Lys Asp Ile His Arg Arg

195 200 205

Leu His Ala Pro Leu Arg Ser Val Gln Gln Leu Tyr Ile Gly Met Asp

210 215 220

Tyr His Ile Asn Phe Val Thr Ser Trp Leu Lys Asp Gly Ser Ser His

225 230 235 240

Thr Val Asp Ile Leu Thr Ile Thr Gly Ile Gly Gly Ile Gly Lys Thr

245 250 255

Ser Leu Ala Lys His Val Tyr Gly Leu Tyr Ser His Glu Phe His Lys

260 265 270

Ser Ser Tyr Ile Glu Asp Ile Thr Arg Arg Cys Asp Gly Lys Tyr Thr

275 280 285

Gly Leu Leu Asp Ile Gln Lys Gln Leu Cys Gly Asp Ile Ala Lys Thr

290 295 300

Ser Ser Ile Gln Val Tyr Asp Val Ser Lys Tyr Thr Ser Met Ile Glu

305 310 315 320

Asn Ala Ile Ala Arg Lys Arg Val Phe Leu Val Leu Asp Asp Ile Ser

325 330 335

Ser Ile Asp Gln Phe Asp Ala Leu Leu Gly Ser Lys Gly Phe His Pro

340 345 350

Gly Ser Lys Val Ile Ile Thr Thr Lys Asp Arg Cys Leu Thr Glu Ser

355 360 365

Cys Ala Leu Phe Lys Thr Asn Ile Lys Pro Lys His Val Glu His Phe

370 375 380

Leu His Gly Leu Arg Glu Thr Glu Ser Arg Gln Leu Leu Cys Ser His

385 390 395 400

Ala Phe Met Cys Asn His Pro Lys Glu Gly Tyr Glu Glu Val Ser Asn

405 410 415

Lys Ile Leu Glu Tyr Cys Gln Gly His Pro Leu Ala Leu Glu Val Leu

420 425 430

Gly Lys Leu Leu His Asn Arg Gly Val Ala Tyr Trp Glu Gly Cys Met

435 440 445

Glu Gly Leu Lys Lys Glu Thr Asn Asp Arg Ile Asn Asn Val Leu Arg

450 455 460

Met Ser Phe Glu Ser Leu Pro Ser Lys Asn Asp Lys Glu Leu Phe Lys

465 470 475 480

His Ile Ala Cys Phe Phe Val Gly Ile Asp Arg Asp Val Ser Glu Thr

485 490 495

Ile Leu Glu Ala Cys Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Ile Thr Asn Leu

500 505 510

Val Asp Lys Cys Leu Leu Ser Ile Gly Trp Asn Asn Glu Leu Lys Met

515 520 525

His Gln Leu Val Gln Glu Met Gly Arg Phe Glu Val His Gln Glu Ser

530 535 540

Pro Asp Lys Pro Trp Lys Arg Ser Arg Leu Trp Cys His Lys Asp Ser

545 550 555 560

Phe Lys Val Leu Lys Gln Lys Lys Gly Lys Gly Asn Leu Leu Gly Leu

565 570 575

Ser Leu Asp Met His Met Leu Glu Lys Glu Lys Leu Gly Ala Ser Tyr

580 585 590

Glu Leu Lys Thr Glu Ala Leu Ser Asn Met Asp Asn Leu Met Leu Leu

595 600 605

Lys Leu Asn Tyr Val Tyr Met Asn Gly Ser Tyr Glu Asn Phe Pro Glu

610 615 620

Glu Ile Lys Trp Leu Cys Met Asn Gly Phe Arg Leu Lys Ser Ile Pro

625 630 635 640

Leu Asp Leu Pro Met Gln Asn Leu Val Ala Leu Asp Met Ser Tyr Ser

645 650 655

Asn Ile Glu Ser Phe Ser Gly Cys Tyr Ser Asn Pro Gln Arg Leu Glu

660 665 670

Lys Arg Gln Lys Leu Asp Gly Ser Cys Phe Lys Glu Lys Arg Leu Phe

675 680 685

Ala Ser Leu Lys Ile Leu Asn Leu Ser Phe Cys Glu Gln Leu His Ser

690 695 700

Val Gly Asp Phe Asp Gln Leu Pro Ala Leu Glu Arg Leu Ile Leu Arg

705 710 715 720

Asn Cys Ile Gly Leu Val Asp Val Cys Glu Ser Ile Arg Gln Cys Val

725 730 735

Glu Leu Ile Leu Ile Asp Leu Ser Tyr Cys Met Lys Leu Glu Lys Leu

740 745 750

Pro Arg Asn Ile Gly Met Leu Asn Lys Val Glu Thr Met Leu Leu Asp

755 760 765

Gly Cys Asn Leu Gly Glu Ser Gly Ile Lys Asn Met Asp Met Asp Ser

770 775 780

Leu Glu Met Cys Thr Val Thr Asn Ile Asp Ile Asn Arg Ala Phe Met

785 790 795 800

Gly Cys Ile Pro Arg Asp Leu Lys Tyr Ser Ala Met Ser Leu Pro Arg

805 810 815

Ser Leu Val Met Leu Ser Leu Thr Glu Asn Lys Leu Ser Asn Glu Ser

820 825 830

Phe Pro Met Asp Phe Ser Cys Leu Ser Met Leu Lys Glu Leu Tyr Leu

835 840 845

Asp Gly Asn Leu Phe Asn Ser Met Pro Ser Cys Val Arg Thr Leu Pro

850 855 860

Arg Leu Glu Ile Leu Ser Met Asp Asp Cys Glu Lys Leu Lys Ser Val

865 870 875 880

Glu Tyr Pro Pro Arg Thr Leu Lys Lys Leu Phe Leu Asp Val Ala Gly

885 890 895

Asp Tyr His Thr Asn Lys Val Val Phe Val Pro Asp Met Ser Pro Leu

900 905 910

Gln Leu Ser Ile Glu Ser Leu Asp Leu Thr Ser Ser Ser Leu Gly Leu

915 920 925

Asn Asp Tyr Glu Ile Glu Gly Val Ile Lys Ile Gln Glu Met Met Ser

930 935 940

Val Asp Glu Lys Val Leu Arg Ser Leu Gly Trp Thr Asn Leu Asp Phe

945 950 955 960

Leu Asn Lys Arg Arg Val Gly Thr Asn Ser Ser Glu Ser Lys Ile Gln

965 970 975

Arg Met Phe Tyr Glu Phe Gly Ile Phe Ser Thr Arg Tyr Glu Ala Glu

980 985 990

Glu Met Pro Ser Trp Phe Met His Arg Ser Val Gly Pro Val Ile Ser

995 1000 1005

Phe Thr Ile Pro Ser Ser Ser Pro Asn Asn Leu Leu Thr Gly Leu Asn

1010 1015 1020

Phe Cys Ser Leu His Thr Leu Asn Pro Leu Asp Glu Glu Leu Asp Leu

1025 1030 1035 1040

Ser Asp His Glu Leu Phe Pro Leu Thr Pro Met Met Thr Ile Ser Asn

1045 1050 1055

Ile Thr Lys Lys Arg Met Trp Ile Tyr Glu Arg Phe Val Ala Arg Phe

1060 1065 1070

Asn Glu Thr Leu Asp Leu Trp Val Ile Leu Ser His Trp Met Phe Gly

1075 1080 1085

Lys Asn Glu Met Glu Ala Gly Asp His Ile Thr Ile Thr Val Thr Pro

1090 1095 1100

Gln Trp His Asp Pro Phe Thr Glu Ala Tyr Tyr Glu Val Val Lys Glu

1105 1110 1115 1120

Cys Gly Val Ser Leu Val Tyr Glu Asp Gly Glu Lys Lys Asp Glu Glu

1125 1130 1135

Glu Asp Val Leu Gly Tyr Tyr Lys Ser Trp Asn His Ile Ile Gly Gly

1140 1145 1150

Asp Leu Ser Pro Phe Gln Ala Thr Thr Gly Gln Tyr Ile Leu Asp Ser

1155 1160 1165

Glu Arg Leu Phe Glu Ala Gly Ile Asn Phe Trp Pro Tyr His Arg Lys

1170 1175 1180

Phe Ile Pro Asp Gly Pro Asp Tyr Gln Gly Arg Cys His Leu Leu Lys

1185 1190 1195 1200

Tyr Phe Ile Val Met Ser Tyr Val

1205

<210> 4

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaattatca atagaatcgt tagcttgggt tgaacgatta cgaaattgaa ggtgtgatca 60

aaatccaaga aatgatgagt gt 82

<210> 5

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaattatca atagaatcgt tagacttgac atcttctctt gggttgaacg attacgaaat 60

tgaaggtgtg atcaaaatcc aagaaatgat gagtgt 96

<210> 6

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaattatca atagaatcgt tagacttgac atcttcttgg gttgaacgat tacgaaattg 60

aaggtgtgat caaaatccaa gaaatgatga gtgt 94

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccaattatca atagaatcgt tagacttgac atcttcttca agaaatgatg agtgt 55

<210> 8

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaattatca atagaatcgt tagacttgac atcttcttcc ttgggttgaa cgattacgaa 60

attgaaggtg tgatcaaaat ccaagaaatg atgagtgt 98

<210> 9

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccaattatca atagaatcgt tagacttgac atcttcttca tcttgggttg aacgattacg 60

aaattgaagg tgtgatcaaa atccaagaaa tgatgagtgt 100

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatatatttc tcaagatcag aagtactaat taaagggttt ggaattgaaa 50

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgaacgatc ggggaaattc gagctcttac acataagaca tgacaa 46

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttctgtaaa aggatcatgc c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttgacatct tcttcacttg 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttgacatct tcttcactt 19

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgtcccagga ttagaatgat taggc 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agccctcttc tttcgatcca tcaac 25

Claims

1.一种分离的控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的蛋白，所述的蛋白为SEQ ID NO.3所示。

2.编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，所述的基因为SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求2所述的基因，所述的基因为SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用。

6.检测权利要求2所述基因的试剂在莴苣嗪胺灵敏感性的筛选中的应用。

7.检测权利要求2所述基因的试剂在莴苣嗪胺灵敏感性育种中的应用。

8.权利要求2所述基因在制备嗪胺灵不敏感或嗪胺灵敏感的转基因莴苣中的应用，所述的嗪胺灵不敏感转基因莴苣为将所述基因纯合敲除的单株，其对应的突变基因序列为SEQ ID NO.2第2736-2834位碱基替换为SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.9中的任一一个序列。

9.权利要求5~8中的任意一个应用，所述的莴苣为罗马生菜（Romaine）。