CN117683103B - 一种小肽miPEP166i及其在植物组织培养中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小肽miPEP166i及其在植物组织培养中的应用，涉及植物基因工程技术领域，本发明通过一个完整的肽原组学流程，系统地鉴定了84K杨树的三个组织中的miP EP，并以识别到的miRNA166i的初级转录本中的序列进一步翻译得到根特异性表达的小肽miPEP166i，所述miPEP166i的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；经验证，人工合成miPEP166i的外源应用能够促进84K杨不定根的形成和伸长，本发明针对84K杨树miPEP的综合注释和功能分析为其在杨树等林木中的应用提供了宝贵的遗传资源。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种小肽miPEP166i及其在植物组织培养中的应用。
背景技术
肽是植物蛋白质组中的小生物分子。自1991年首次报道植物中的信号肽以来，已经鉴定出数百种由小开放阅读框(sORF)编码的短肽(sPEP，2-100个氨基酸残基)，它们涉及植物生长发育、信号转导、生物反应，和非生物反应。然而，与经典基因编码的蛋白质相比，sPEP的多样性和功能仍不太清楚。
最近，质谱技术的进步加上各种生物信息学工具的开发，促进了一些模式植物(如拟南芥、玉米和葡萄)在全基因组范围内的sPEP鉴定。这些研究表明，约44.04-91.20％的sPEP由位于“非编码”区域的sORF编码，如基因间和内含子DNA、非编码RNA和假基因。当随机选择的sORF在拟南芥中过表达时，约10％(49/473)的编码sORF诱导了可见的表型效应，这是随机选择的已知基因的7倍。sPEP也可以由微小RNA基因座的转录物产生，这些基因座被命名为微小RNA编码肽(miPEP)，由于其在改善农艺性状方面的关键功能而受到相当大的关注。
微小RNA(miRNA)是内源性小的非编码RNA，通过切割靶mRNA在转录后水平调节基因表达。成熟的miRNA是其初级转录物(pri-miRNA)的加工产物，同时，pri-mi RNA具有编码miPEP的潜力。miPEP与其ORF物理相互作用，并积极调节相关miRNA的积累。大多数保守的miRNA在植物生长、发育和胁迫反应中发挥着重要作用，因此，miPEP是操纵植物表型的生物分子工具的有力候选者。例如，据报道，大豆中的miPEP172c、拟南芥中的miPE858a和葡萄中的mipe164c分别调节结瘤、根系生长和花青素积累。外源应用miPEP不仅可以避免转基因过程的技术挑战，而且可以最大限度地减少环境污染，因为miPEP具有高度的生物降解性。然而，miPEP尚未在大多数高等植物中进行大规模鉴定，其功能需要深入探索，尤其是对森林树木。
作为一种木本模式植物，杨属物种拥有大量可供公众使用的基因组资源，可用于功能基因组研究。此外，杨树miRNA的鉴定、起源、进化和生物学功能也得到了深入研究。例如，miR165/166可以通过抑制PtrHB7的表达，以剂量依赖的方式控制毛果次生生长过程中次生木质部和韧皮部组织之间的平衡分化；miR167a能够通过抑制靶转录物(PeARF)来改善杂交杨(P.deltoides×P.euramericana)的侧根发育。miRNA在杨树中的功能多样性为通过应用miPEP干扰杨树的发育和生长提供了可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小肽miPEP166i及其在植物组织培养中的应用，旨在通过研究miPEP166i的生物学功能和潜在的调控机制，为其在杨树等林木中的应用提供了宝贵的遗传资源。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明的第一目的在于，提供了一种小肽miPEP166i，所述小肽miPEP166i的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步改进在于，所述小肽miPEP166i是通过对miRNA166i的初级转录本序列的第236位至第307位翻译获得，所述miRNA166i的初级转录本序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二目的在于，还提供了一种如上述任一所述的小肽miPEP166i在植物组织培养中的应用。
进一步改进在于，所述植物为84K杨树。
进一步改进在于，所述应用具体为，在84K杨树组织培养过程中，将miPEP166i外源添加至生长培养基中，以促进84K杨不定根的形成和伸长。
进一步改进在于，所述miPEP166i的添加浓度为5μM。
进一步改进在于，所述miPEP166i通过增强miR166i的表达或降低miR166i的靶标基因的表达以促进84K杨不定根的形成和伸长。
进一步改进在于，所述miR166i的靶标基因包括PagHB8和PagREV。
本发明提具有如下有益效果：
本发明通过一个完整的肽原组学流程，系统地鉴定了84K杨树的三个组织中的miPEP，并以识别到的miRNA166i的初级转录本中的序列进一步翻译得到根特异性表达的miPEP166i，经验证，外源应用miPEP166i能够以序列特异性的方式促进84K杨不定根的形成和伸长，本发明针对84K杨树miPEP的综合注释和功能分析为其在杨树等林木中的应用提供了宝贵的遗传资源。
附图说明
图1为miPEP166i特异性调节功能的表征(图中，a为已鉴定的MIR166家族成员编码的miPEP在84K杨染色体上的位置；b为三种合成肽的原始结构和外源处理的示意图(NSP，非特异性肽；IP，干扰肽；miPEP166i，由pri-miRNA166i编码的肽；CK，空白对照))；
图2为外源应用人工合成的miPEP166i对84K杨不定根再生的影响(图中，(a-b)为在处理的MS上生长24小时的茎外植体中pri-miR166i和miR166i的表达情况；(c-f)依次为CK、NSP、IP和miPEP处理下2周龄植株的代表性图像。(g-h)为不定根长度和2周龄植株的数量(n＝15)，条形图表示平均值±SD。星号(*)表示显著差异，使用双尾Student t检验计算得出(定义为*P<0.05，**P<0.01)；
图3为miPEP166i处理对miR166i及其靶基因表达的时间过程影响(图中，a为在不同的生长阶段采集根系样品，框出的部分表示采样位置，T1：培养后第6天(DAC)第一阶段具有不定根(～5mm)的底部茎(1～2mm)的样品；T2：在9个DAC的第二阶段具有不定根(～1cm)的底部茎的样品；以及在12DAC的第三阶段T3的～1cm的根尖样本；(b-c)分别通过RT-qPCR和RNA-seq测定不同生长阶段样品中miR166i和靶基因的表达，条形图表示平均值±SD(n＝3)；星号(*)表示显著差异，使用双尾Student t检验计算得出(定义为**P<0.05，**P<0.01)；(d)miR166i在PagHB8和PagREV基因互补序列上的切割位点。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料与试剂
本实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
2、方法
对于84K杨，我们在银白杨和腺毛杨(由中国林业科学研究院引入)亚基因组中发现了15个MIR165/166家族成员，它们在植物物种中高度保守。MIR166家族成员共产生73个miPEP，其中来自银白杨的Pal-miR166i含有最多的6个编码miPEP的ORF(图1a)。
2.1、miRNA166i的鉴定
随机采集40天龄幼苗的叶片样本进行小RNA测序，三次生物学重复。TruSeq小RNA样品制备试剂盒(Illumina，San Diego，USA)用于构建小RNA文库，使用IlluminaHiseq2000/2500平台将其测序为50bp单端读数。从NCBI SRA数据库下载84K杨的公开可用sRNA数据集，包括木质部(SRR10483424)、韧皮部(SRR1483425)和叶片(SRR10481426)的样本。
根据先前的描述，通过整合基于从头和同源物的方法对84K杨树基因组中的miRNA基因座进行了注释。Cutadapt(2.10版)用于删除18-33nt的原始读取和屏幕读取的3'适配器。Bowtie(1.3.0版)软件用于通过将修剪后的读数映射到Rfam数据库(11.0版)来去除已知的非编码RNA(rRNA、tRNA、snRNA、scRNA和snoRNA)。处理后的sRNA读数被进一步定位到84K杨树参考基因组上(https://db.cngb.org/search/project/CNP0000339/)并使用ShortStack程序(3.3.3版)申请miRNA鉴定。在基于同源物的miRNA鉴定方法中，通过Bowtie软件将P.deltoides，P.euphratica，P.tremula，P.trichocarpa的已知miRNA序列定位到84K杨树的参考基因组上，提取错配小于2的比对区域的基因组序列并应用于ShortStack软件。miRNA166i序列如SEQ ID NO.1所示。
2.2、miPEP166i的获得
对鉴定获得的miRNA166i进行扩增获得其初级转录本序列pri-miRNA166i，序列如SEQ ID NO.2所示，对pri-miRNA166i序列进行翻译，并通过LC-MS/MS多肽组学鉴定获得MiPEP166i，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.3、miPEP166i的特异性调节功能
为了表征miPEP166i的特异性调节功能，依据多肽氨基酸序列结构，委托生工生物工程(上海)股份有限公司另外合成了一种具有15个氨基酸的非特异性肽(NSP)和一种具有相同氨基酸但不同序列的干扰肽(IP)作为对照(图1b)；
非特异性肽(NSP)的序列为CLLNCPIYWQQLREX；
干扰肽(IP)的序列为MSDFGGQPTLPFCLSSLNPKSTLK。
将三种合成肽分别以5μM的浓度添加到MS培养基中作为外源处理，而选择无菌水作为空白对照(CK)处理(图1b)。
为了研究miPEP166i在其相应的miRNA生物发生中的可能作用，首先，使用RT-qPCR分析了84K杨在外源处理24小时后pri-miR166i和miR166i的丰度变化。与在对照处理的其他培养基中生长的样品相比，我们发现在生长培养基中添加miPEP166i不会导致pri-miR166i的表达发生显著变化(图2a)。
然而，与三种对照处理相比，miPEP166i样品中miR166i的表达显著增强(图2b)。尽管观察到IP处理后miR166i的表达略高于其在NSP样品中的表达，但差异并不显著。也许是由于外源肽作为生物刺激剂和渗透剂广泛诱导miRNA表达，在CK样品中观察到表达最低的miR166i。此外，对培养两周的植株的观察表明(图2c-f)，与三个对照处理相比(图2g和2h)，施用合成的miPEP166i导致不定根的长度和数量显著增加。三个对照处理的样品之间没有显著差异，表明miPEP166i能够以序列特异性的方式促进84K杨不定根的形成和伸长。
2.4、miPEP166i外源处理的动态调控模式
在不定根伸长过程中，在培养后6、9和12天(DAC、T1、T2和T3阶段)的样品中检测miR166i及其靶标的表达，以探索miPEP166i外源处理的动态调控模式(图3a)。由于NSP和IP处理的等效性(图2g和2h)，仅用CK、NSP和miPEP处理的样品和对照样品用于定量miRNA表达和转录组测序分析。与两种对照处理相比，我们观察到miR166i的表达在miPEP166i处理后的所有三个阶段都显著增强(图3b)。
已知miR166主要靶向HD-ZIP III转录因子，该转录因子在促进细胞分化和调节根长方面发挥重要作用。在84K杨的两个亚基因组中鉴定出16个编码HD-ZIP III转录因子的基因，所有这些基因都被预测为miR166i的靶标。
构建84K杨树根系的RNA-seq文库，以探索miPEP166i诱导对miR166i靶点的影响。其中，两个靶基因(PagHB8和PagREV，P<0.05)的表达在miPEP166治疗的T1阶段显著降低(图3c)，并且它们的START结构域的一个区域与miR166i序列几乎完全互补(图3d)。然而，与miPEP诱导的miRNA的持续有效性不同，在T2和T3阶段没有观察到PagHB8和PagREV的基因表达显著降低，推测这两个基因的表达受到多水平控制。
2.5、探讨外源应用miPEP166i可能产生的下游基因的表达反应
利用84K杨树根系的时程转录组数据，探讨外源应用miPEP166i可能产生的下游基因的表达反应。将miPEP治疗与空白对照治疗以及miPEP处理与NSP治疗的比较进行交叉，在T1、T2和T3阶段分别发现114、130和547个差异表达基因(DEG)(|log2FC|>1和FDR<0.05)。三个阶段共有552个上调基因和139个下调基因。在miPEP处理的样品中，参与纤维素和木质素生物合成的多个基因被上调，如PagCSLD4(Pag_G_013528)、PagCAD7(Pag_G_012180)、PagCOBL1(Pag_G_028682)和PagPAL2(Pag_G_003126)，它们由HD-ZIP III转录因子的主开关控制。
激素信号传导和HD-ZIP III活性之间的多重交叉发生在根伸长过程中。在DEG集合中发现了许多植物激素相关基因，包括生长素和细胞分裂素合成、(De)结合、转运和信号传导相关基因(表1)。
我们发现介导的细胞分裂素合成基因(PagLOG)和生长素合成基因(PagTAA1)在miPEP处理的样品中分别显著下调和上调。参与细胞分裂素信号传导和生长素结合的PagCKI1和PagGH3基因的表达也分别上调和下调。引人注目的是，编码生长素转运蛋白的多个基因的表达在T3阶段显著增加，如PIN-FORMED(PIN)、ATP结合盒家族B(ABCB)和PIN-LIKES生长素转运蛋白，它们可以引导生长素从根尖运输到根伸长区，以确定根伸长。
表1.miPEP166i诱导或抑制的激素代谢和信号通路中的基因
3、结论
本发明通过一个完整的肽原组学流程，系统地鉴定了84K杨树的三个组织中的miPEP，并以识别到的miRNA166i的初级转录本中的序列进一步翻译得到根特异性表达miPEP166i，经验证，外源应用miPEP166i能够以序列特异性的方式促进84K杨不定根的形成和伸长，本发明针对84K杨树miPEP的综合注释和功能分析为其在杨树等林木中的应用提供了宝贵的遗传资源。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种小肽miPEP166i，其特征在于，所述小肽miPEP166i的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的小肽miPEP166i，其特征在于，所述小肽miPEP166i是通过对miRNA166i的初级转录本序列的第236位至第307位翻译获得，所述miRNA166i的初级转录本序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种如权利要求1-2任一所述的小肽miPEP166i在植物组织培养中的应用，其特征在于，所述应用具体为，在84K杨树组织培养过程中，将miPEP166i外源添加至生长培养基中，以促进84K杨不定根的形成和伸长。
4.根据权利要求3所述的一种小肽miPEP166i在植物组织培养中的应用，其特征在于，所述miPEP166i的添加浓度为5μM。
5.根据权利要求3所述的一种小肽miPEP166i在植物组织培养中的应用，其特征在于，所述miPEP166i通过增强miRNA166i的表达或降低miRNA166i的靶标基因的表达以促进84K杨不定根的形成和伸长。
6.根据权利要求5所述的一种小肽miPEP166i在植物组织培养中的应用，其特征在于，所述miRNA166i的靶标基因包括PagHB8和PagREV。
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