CN106459921A

CN106459921A - 浮萍的转化及其用途

Info

Publication number: CN106459921A
Application number: CN201480056092.3A
Authority: CN
Inventors: R·马缇伊森; A·穆亚-穆拉雷斯; C·P·亚里克斯; E·伊恩斯特; J·杉克林; Y·颜
Original assignee: Cold Spring Harbor Laboratory; Brookhaven Science Associates LLC
Current assignee: Cold Spring Harbor Laboratory; Brookhaven Science Associates LLC
Priority date: 2013-08-21
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2017-02-22
Also published as: US20160201069A1; WO2015027109A1; IL244198A0; AU2014308688A1; MX2016002276A; IL244198B; EP3036322A4; EP3036322A1; MX366208B; US9957514B2

Abstract

本公开内容提供了用于浮萍科物种的遗传转化的方法和组合物。

Description

浮萍的转化及其用途

政府资金

本发明是在美国能源部授予的合同号DE-EE0003298和DE-AC02-98CH10886下由政府支持进行的。政府具有本发明的某些权利。

背景

石油可用性已成为当今时代的主要问题之一。在过去的十年中，石油消费量呈指数增加，而仅仅发现了少数的新油田和其它来源。事实上，根据美国中央情报局(CIA，2013年)的年度评估，预计在现有资源的情况下，社会将在不到50年内耗尽石油。此已知的稀缺性已产生了开发可再生能源的需要。

概述

浮萍科(Lemnaceae)物种(例如，膨胀浮萍(Lemna gibba)、青萍(Lemna minor)和紫萍(Spirodela polyrhiza))通常被称为浮萍或水扁豆(water lentils)，其是世界上最小的水生有花植物。虽然它们是真正的单子叶被子植物，但它们具有非常退化的形态，包括生长的叶、简单的根和分生组织干细胞的两个“袋”。在最佳条件下浮萍具有指数生长速率，其可在30小时内使叶的数量加倍并且在一周内产生64克生物质/克起始重量，这远远超过了最快生长的玉米速率(2.3g/g/周)，并且不受次级产物例如木质素的阻碍。由于它们在边缘水生环境中的强健生长和优秀的代谢特征，浮萍科植物是生物燃料原料的有吸引力的选项。

如本文所述，本公开的方法用于调节几种不同类别基因的表达，所述基因包括各种酶(例如，CH42，PDS，PDAT1和DGAT1)和转录因子(例如，WRI1b)。本公开的方法还用于在浮萍中稳定表达几种不同的外源启动子(例如，来自玉米的泛素启动子和来自CaMV的35S启动子)和内源启动子(例如，来自浮萍的肌动蛋白启动子)。

因此，本公开的多个方面和实施方案提供了用于利用核酸稳定转化浮萍的方法，该方法包括下列顺序的步骤：(a)在包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮的液体感染培养基中，使用包含目标核酸、可选择标记基因和可视报告基因的工程改造的农杆菌(Agrobacterium)接种活跃生长的浮萍愈伤组织，从而产生接种的愈伤组织，(b)在包含乙酰丁香酮的半固体根瘤生产培养基上培养接种的愈伤组织，随后在包含选择物质和抗生素的半固体选择培养基上培养接种的愈伤组织，从而产生经培养的接种的愈伤组织；(c)从(b)的经培养的接种的愈伤组织选择表达可视报告基因的经转化的愈伤组织；(d)在包含所述选择物质和抗生素的液体选择培养基中培养(c)中选出的愈伤组织；和(e)在半固体培养基上培养(d)中培养的愈伤组织，从而产生包含目标核酸的遗传改造的子代浮萍。在一些实施方案中，(d)的半固体培养基是包含选择物质和抗生素的半固体选择培养基。

在一些实施方案中，农杆菌是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。例如，在一些实施方案中，根癌农杆菌是根癌农杆菌GV3101(在美国临时申请号61/868527中称为CV3101)。

在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织是活跃生长的青萍(Lemna minor)愈伤组织。例如，在一些实施方案中，活跃生长的青萍愈伤组织是活跃生长的青萍8627愈伤组织。

在一些实施方案中，步骤(a)的活跃生长的浮萍愈伤组织的直径为3至5mm。在一些实施方案中，步骤(a)包括使浮萍愈伤组织与根癌农杆菌接触5分钟。

在一些实施方案中，液体感染培养基包含硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮。在其它实施方案中，液体感染培养基由硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮组成。例如，在一些实施方案中，液体感染培养基由10mM硫酸镁、10g/L蔗糖和100μΜ至200μΜ乙酰丁香酮组成。

在一些实施方案中，选择物质是DL-草胺膦。

在一些实施方案中，可视报告基因是绿色荧光蛋白。

在一些实施方案中，步骤(b)的接种的愈伤组织在半固体根瘤生产培养基上培养2-4天。在一些实施方案中，步骤(b)的半固体根瘤生产培养基包含乙酰丁香酮、Murashige和Skoog基础盐、蔗糖、2,4-二氯苯氧乙酸和6-苄氨基嘌呤。在其它实施方案中，步骤(b)的半固体根瘤生产培养基包含100μΜ乙酰丁香酮、4.4g/L Murashige和Skoog基础盐、30g/L蔗糖、1μΜ2,4-二氯苯氧乙酸和2μΜ6-苄氨基嘌呤或由其组成。

在一些实施方案中，步骤(b)的接种的愈伤组织在半固体选择培养基上培养4至7天。在一些实施方案中，步骤(b)的半固体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。在一些实施方案中，步骤(b)的半固体选择培养基包含DL-草胺膦、基础盐、蔗糖、羧苄青霉素和cefotaxamin。在其它实施方案中，步骤(b)的半固体选择培养基由10mg/L DL-草胺膦、3.2g/L Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐、10g/L蔗糖、200mg/L羧苄青霉素和500mg/Lcefotaxamin组成。

在一些实施方案中，步骤(c)包括使用荧光显微镜选择荧光细胞。

在一些实施方案中，将步骤(c)中选出的愈伤组织在液体选择培养基中培养约3至4周。在一些实施方案中，步骤(d)的液体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。在一些实施方案中，步骤(d)的液体选择培养基包含DL-草胺膦、基础盐、蔗糖、羧苄青霉素和cefotaxamin。在其它实施方案中，步骤(d)的液体选择培养基包含10mg/L DL-草胺膦、3.2g/L Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐、10g/L蔗糖、200mg/L羧苄青霉素和500mg/Lcefotaxamin或由其组成。

在一些实施方案中，步骤(e)包括在半固体选择培养基上培养(d)中培养的愈伤组织直到遗传改造的子代浮萍是可视的。在一些实施方案中，步骤(e)的半固体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。在一些实施方案中，步骤(e)的半固体选择培养基包含DL-草胺膦、基础盐、蔗糖、羧苄青霉素和cefotaxamin。在其它实施方案中，步骤(e)的半固体选择培养基包含10mg/L DL-草胺膦、3.2g/L Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐、10g/L蔗糖、200mg/L羧苄青霉素和500mg/L cefotaxamin或由其组成。

在一些实施方案中，目标核酸包含可操作地连接至编码目标蛋白质的核酸的启动子。在其它实施方案中，目标核酸包含可操作地连接至编码人工微小RNA的核酸的启动子。

本公开的多个其它方面和实施方案提供了使用核酸瞬时转化浮萍的方法，该方法包括以下顺序的步骤：(a)在浮萍的分生组织中引入切口；(b)用(i)包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮的感染培养基和(ii)工程改造的根癌农杆菌渗透所述切口，其中所述工程改造的根癌农杆菌包含目标核酸、可选择标记基因和可视报告基因，从而产生经渗透的浮萍；(c)在包含选择物质和抗生素的液体选择培养基中培养经渗透的浮萍，从而产生经培养的渗透的浮萍；和(d)鉴定(c)中表达可视报告基因的经培养的渗透的浮萍。

在一些实施方案中，根癌农杆菌为根癌农杆菌GV3101。

在一些实施方案中，浮萍是紫萍(Spirodela polyrhiza)。例如，在一些实施方案中，紫萍是紫萍6581。

在一些实施方案中，感染培养基包含硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮或由其组成。在一些实施方案中，感染培养基包含10mM硫酸镁、10g/L蔗糖和100μΜ乙酰丁香酮或由其组成。

在一些实施方案中，选择物质是DL-草胺膦。

在一些实施方案中，可视报告基因是绿色荧光蛋白。

在一些实施方案中，步骤(c)的液体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。在一些实施方案中，步骤(c)的液体选择培养基包含DL-草胺膦、基础盐、蔗糖、羧苄青霉素和cefotaxamin。在其它实施方案中，步骤(c)的液体选择培养基由10mg/L DL-草胺膦、3.2g/L Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐、10g/L蔗糖、200mg/L羧苄青霉素和500mg/Lcefotaxamin组成。

在一些实施方案中，步骤(c)包括在液体选择培养基上培养经渗透的浮萍2至4天。

在一些实施方案中，步骤(d)包括使用荧光显微镜鉴定步骤(c)中表达可视报告基因的经培养的渗透的浮萍。

附图简述

图1显示膨胀浮萍(L.gibba)的开花的图像。每个母叶(M)已从袋之一产生子代叶(D)，并且一些已从袋之另一产生花(箭头)。

图2A和2B显示膨胀浮萍叶绿体的透射电子显微镜(TEM)图像。图2A显示在对照条件下的淀粉累积(箭头)。图2B显示在剥夺氮的情况下转移至脂质体(箭头)中的淀粉累积。

图3显示了在植物中通过人工构建体的转录后RNA沉默途径的示意图。Dicer样(DCL)4可以是用于从shRNA产生21-nt siRNA的优选酶。对于pre-amiRNA，DCL1、偏下叶(Hyponastic-leaves)(HYL)1和HUA-增强子(HEN)1的组合细胞核作用产生成熟的甲基化的amiRNA。一条siRNA或amiRNA链掺入到装载了Argonaut 1(AGO1)的RNA诱导的沉默复合物(RISC)中以引导同源RNA的切割，从而导致其降解。

图4显示pB7FWG的载体图。

图5显示35S:GFP(绿色荧光蛋白)在转化后40天在紫萍(S.polyrhiza)叶中的表达的图像。显示了由柄连接的母叶(MF)和两个子代叶(DF)。细胞中的镶嵌式表达在叶中簇集。

图6显示了用H₂O注射的叶的图像。在几个世代之后，一些叶仍然继承了病态的表型(例如，相较于较下面的叶，较上面的叶中可见永久浸渍)。

图7A-7E显示表达LgACTp:GFP的稳定转化的青萍的同时选择和再生的图像。(A)表达GFP的单个细胞，共培养后5天。(B)中表达GFP的细胞簇，共培养后2周。(C)表达GFP的愈伤组织的整个区域，共培养后4周。(D和E)从愈伤组织萌发的经转化的叶，共培养后5周。

图8A-8D显示来自表达35S:GFP的青萍的转基因株系的图像。(A和B)来自一片单叶的所有后代表达GFP。(C)转化分生组织，从而从袋产生的子代叶表达GFP。在具有发光物的所有细胞上的均一表达指示组织的某些区域内的累积(D)。

图9A-9D显示GFP在表皮和叶肉细胞中的定位的图像。(A)重叠图像显示GFP在表皮和叶肉细胞中的广泛存在。(B)较高的放大倍数显示来自核的更强的荧光信号，如通过(C)DAPI染色所显示的。(D)叶肉细胞中叶绿素信号的存在排除了GFP图像中任何微量的自发荧光。

图10显示了pB7WG2D的载体图。虚拟图使用ApE-质粒编辑器v2。

图11显示青萍sRNA的Northern印迹(I)。一个野生型株系和三个过表达不同的微小RNA预测前体的株系，使用miR166探针。用溴化乙锭染色来显示凝胶装载对照；条带对应于rRNA和mRNA(上图)。

图12显示青萍sRNA的Northern印迹(II)。一个野生型株系和三个过表达不同的微小RNA预测前体的株系，使用miR319探针。用溴化乙锭染色来显示凝胶装载对照；条带对应于rRNA和mRNA(上图)。

图13A和13B显示使用Imn-0697前体作为支架对靶向八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的amiRNA进行设计的原理图。(A)从内源前体取代的序列保留正确加工所需的所有特性。(B)最终的二级结构在内源和amiRNA前体中保持相同。通过rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi折叠RNA。

图14A-14E显示用不同的载体转化的和在与根癌农杆菌共培养2周后表达GFP的愈伤组织的图像。愈伤组织用下列转化：pOXAC4，其包含LgSSU5Ap(A)；pOXAC1，其包含CaMV35Sp(B)；pOXAC2，其包含ZmUBIp(C)；pOXAC5，其包含LgSSU5Bp(D)；以及pOXAC3，其包含LgACTp(E)。

图15显示在转基因愈伤组织(白色，具有GFP)中通过RNAi抑制PDS的图像。

图16A显示了内源的和经修饰的前体的二级结构之间的比较。图16B显示amiRNA与CH42mRNA的预测的结合位点。圆圈表示G:U摆动配对。图16C显示了设计来表达amiRNA前体的构建体的示意图。该构建体含有赋予对DL-草胺膦(PPT)的抗性的选择性标记以及独立的GFP表达盒以跟踪愈伤组织的再生。amiRNA前体的转录由CaMV 35S启动子驱动。

图17A-17C显示用GFP表达构建体对青萍的稳定转化和再生。在液体培养基中在选择的不同阶段检测绿色荧光蛋白(A-C)。转化五周后，转基因叶开始从愈伤组织再生(D，G)。表达GFP的转化叶再生而无表型异常(E，H)，转基因在世代间稳定保持(F，I)。dat＝转化后的天数；wat＝转化后的周数。比例尺：1mm。

图18A-18C显示通过热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)对T-DNA整合的验证。通过箭头描绘用于对侧接T-DNA插入片段的基因组序列进行作图的引物位置(A)。在两个独立回收的株系和青萍野生型中的整合通过PCR验证(B)。转基因青萍的TAIL-PCR右接合序列与从头组装的全基因组鸟枪重叠群的比对(C)。

图19A-19C显示表达靶向CH42的amiRNA的青萍的表型。在亮视野(A)和荧光(B)条件下观察野生型青萍转化的amiR_CH42叶。青萍和amiR_CH42中的叶绿素含量的定量(C)。显示了标准偏差值，n＝3。星号表示在双尾z检验中的显著性，＊＊＊P<0.0001。比例尺：1mm。

图20A-20B显示了amiR_CH42的表达和CH42的下调。miRNA的茎-环终点实时PCR(RT-PCR)扩增(使用内源miRNA(miR156))用作内部对照(A)。通过定量RT-PCR(qRT-PCR)测量CH42mRNA的相对表达水平的变化并标准化至微管蛋白αmRNA(B)。显示了qRT-PCR的标准偏差值，n＝9。星号表示在双尾学生t检验中的统计显著性，＊＊P<0.002

图21显示amiR引导的mRNA切割的5'-RACE(针对基因表达的远程分析计算)分析。青萍基因组中存在的两个CH42序列与从3条不同带的克隆获得的序列的比对。来自每条带的10个克隆中的十个存在此处描述的序列。突出显示了对应于amiRCH42靶(阴影的TAACAAGAAGGTACAGACCAA(SEQ ID NO：42))和终止密码子(阴影的TCA)的序列。星号表示两个不同的基因拷贝之间的多态性。

图22A-22C显示在转化的浮萍中的GFP表达(右边为亮视野图像，左边为荧光图像)。图22A显示了在prolD启动子控制下的GFP表达，指示在浮萍叶中在35S启动子控制下的Wrinkled 1(WRIlb)表达。还显示了表达构建体的示意图。图22B显示了在35S启动子控制下的GFP表达，作为对照。图22C显示了在prolD启动子控制下的GFP表达，指示在35S启动子控制下的LgPDAT1表达。

详述

浮萍科是广泛存在的小水生植物的科。遗传改造浮萍科(例如，浮萍)植物的努力受到限于容易地稳定转化成熟植物和与从愈伤组织再生(例如，活跃的生长)有关的困难的阻碍。本公开内容提供了，除其它外，浮萍科物种的稳定遗传转化的高效和成本效益的方法。本公开内容部分地基于如下发现：浮萍转化效率通过将可视报告基因引入活跃生长的浮萍而极大增加，所述可视报告基因用于在液体选择培养基中培养转化的浮萍之前，帮助在细胞培养板上体外地“预选择”转化的浮萍愈伤组织。本公开内容的此两部分选择步骤相较于现有的浮萍转化方案，使遗传转化效率增加10倍。另外，在一些实施方案中，本文提供的转化方法缩短了整个浮萍转化和再生/生长过程至约4至5周，相较于现有的稳定浮萍转化方案所典型的12至16周。

浮萍科包括37种自由漂浮单子叶植物，其分为五个不同的属：紫萍属(Spirodela)，少根紫萍属(Landoltia)，浮萍属(Lemna)，芜萍属(Wolffia)和Wolffiella(Les等人，2002)。除少数例外，浮萍包括漂浮的光合器官，形成被称为叶(frond)的单叶状结构。相比于较大的单子叶植物，它们因形态和解剖学特征的改变和简单化而呈现高度改良的结构组织。这些组织块缺乏复杂的支撑性和脉管结构，并且虽然它们呈现出根，但这些根的功能仅仅是将植物稳定在水的表面(Landolt,1986)。浮萍的主体类似于漂浮的盘，或者在更加退化的种类中，类似于圆柱体或球体。它们往往具有一至几层突出的气室(通气组织)和一至几个叶脉(神经)。营养素直接通过叶的腹侧部同化。

关于繁殖，浮萍几乎唯一地通过无性分裂增殖，形成覆盖静淡水水库的表面的致密均匀的克隆群。这种生长模式包括遗传上相同的子代叶从位于基端或沿亲代植物的两个侧缘的凹陷分生组织(也称为袋)的营养出芽(图1)。这些子代植物常常通过短柄保持连接至亲代植物，并且当它们脱离后，成为具有与母体相同的形式和结构和产生它们自己的子代叶的能力的独立的叶(Landolt and Kandeler，1987)。这种策略体现在此物种的一个有趣的特性中：它的生长速率。在最佳条件下，浮萍科具有指数生长速率，这可以在30小时内使叶的数量加倍并且在一周内产生高达64克生物量/克起始重量。此生长速率远远胜过任何陆地作物，包括玉米(2.3克/克/周)。另一个有趣的特性是次级产物例如木质素的含量相对于陆地单子叶植物物种保持相对较低。

如本文所用，“浮萍”是指浮萍科的成员。存在四种已知的属和37种浮萍，包括：浮萍属(细脉浮萍(L.aequinoctialis),L.disperma,L.ecuadoriensis,膨胀浮萍(L.gibba),L.japonica,青萍(L.minor),L.miniscula,L.obscura,稀脉浮萍(L.perpusilla),L.tenera,品藻(L.trisulca),L.turionifera,L.valdiviana)；紫萍属(S.intermedia,紫萍,少根紫萍(S.punctata))；芜萍属(无根萍(Wa.angusta),芜萍(Wa.Arrhiza),Wa.australina,Wa.borealis,Wa.brasiliensis,Wa.columbiana,Wa.elongata,Wa.globosa,Wa.microscopica,Wa.neglecta)以及Wolfiella(Wl.caudata,Wl.denticulata,Wl.gladiata,Wl.hyalina,Wl.lingulata,Wl.repunda,Wl.rotunda,和Wl.neotropica)。本文还考虑了浮萍科的其它属或种类。在一些实施方案中，浮萍科植物是膨胀浮萍(L.gibba)植物，而在其它实施方案中，浮萍科植物是青萍(L.minor)植物。在一些实施方案中，浮萍科植物是紫萍(S.polyrhiza)植物。

稳定转化

在一些方面，本文提供了用于使用核酸稳定转化浮萍(例如，青萍)的方法。如本文所用的“稳定转化”是指工程改造的(例如，重组的或合成的)核酸插入到细胞的染色体中，所述核酸将在有丝分裂期间被传递至所有的后续子代细胞。用于根据本公开内容使用核酸稳定转化浮萍(例如，浮萍的愈伤组织细胞和/或分生组织干细胞)的方法可包括在包含镁(例如，硫酸镁)、植物可代谢糖(例如，蔗糖)和乙酰丁香酮的液体感染培养基中，使用包含目标核酸、可选择标记基因和可视报告基因的工程改造的细菌(例如，工程改造的农杆菌例如根癌农杆菌)接种活跃生长的浮萍愈伤组织，从而产生接种的愈伤组织。

如本文所用的术语“工程改造的细菌”或“工程改造的农杆菌”指的是包含工程改造的(例如，重组的或合成的)核酸的细菌(例如，感受态细菌)。细菌转化的任何合适的方法可用于根据本公开内容转化细菌细胞。

如本文所使用的“愈伤组织”是从浮萍衍生的一群无组织的薄壁细胞。通常，愈伤组织形成从浮萍组织在表面灭菌和平铺在体外组织培养基(例如，包含基础盐和生长营养物的培养基)上之后诱导。可以根据本公开内容使用的愈伤组织诱导方法描述于Yamamoto等人(2001)和Moon and Stomp(1997)，其每一个在此通过引用整体并入本文。在本公开内容的一个实施方案中，将来自约1周龄至3周龄(例如2周龄)培养物的活跃生长的浮萍(例如，浮萍叶)置于愈伤组织诱导培养基平板(例如，含有基础盐，蔗糖，2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和噻苯隆)上，其中叶的近轴部分与培养基接触。在置于愈伤组织诱导培养基平板后约3至4周，选择无组织的细胞的浅绿色群体并转移到含有根瘤生产培养基(NPM)(例如，含有Murashige和Skoog(MS)基础盐、蔗糖、2,4-D和6-苄氨基嘌呤(BAP))的平板。约1周后从NPM板获得的组织被用于转化或转移到新鲜培养基中。

在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织是浮萍属物种。例如，在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织是活跃生长的膨胀浮萍愈伤组织，而在其它实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织是活跃生长的青萍愈伤组织。在一些实施方案中，活跃生长的青萍愈伤组织是活跃生长的青萍8627愈伤组织。可如本文所提供地使用其它活跃生长的浮萍愈伤组织。

在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织的直径为约1mm至约5mm。例如，在一些实施方案中，愈伤组织的直径为1mm，2mm，3mm，4mm或5mm。在一些实施方案中，愈伤组织为3mm。

如本文所用的术语“接种”指的是将细菌(例如，工程改造的细菌)引入植物(例如，浮萍叶愈伤组织)或培养物(例如，液体或半固体培养物)中。在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织(例如，具有3mm的直径)通过使用工程改造的细菌(例如，工程各自的根癌农杆菌)将活跃生长的浮萍愈伤组织与含有工程改造的细菌的感染培养基接触来接种。在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织浸没或部分浸没在感染培养基中。

在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织与含有工程改造的细菌(例如，工程改造的根癌农杆菌)的感染培养基接触(例如，浸没或部分地浸没在其中)约3分钟至约15分钟，或约5分钟至约10分钟。例如，在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织与含有工程改造的细菌(例如，工程改造的根癌农杆菌)的感染培养基接触3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15分钟。在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织与含有工程改造的细菌(例如，工程改造的根癌农杆菌)的感染培养基接触5分钟约5分钟。

“感染培养基”是指包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮的培养基。

可用于感染培养基的镁的实例包括，但不限于，硫酸镁和氯化镁。本文考虑的镁的其它形式包括但不限于，氧化镁，柠檬酸镁，乳清酸镁，乳酸镁，碳酸镁和甘氨酸镁。

可用于感染培养基的植物可代谢糖的实例包括，但不限于，蔗糖，松二糖，帕拉金糖和fluoro-Suc。本文考虑了其它可代谢糖。

在一些实施方案中，感染培养基包含硫酸镁(MgSO₄)、蔗糖和乙酰丁香酮。在一些实施方案中，感染培养基由硫酸镁(MgSO₄)、蔗糖和乙酰丁香酮组成。

在一些实施方案中，感染培养基包含(1)硫酸镁、氯化镁、氧化镁、柠檬酸镁、乳清酸镁、乳酸镁、碳酸镁或甘氨酸镁，(2)蔗糖、松二糖、帕拉金糖或fluoro-Suc，和(3)乙酰丁香酮，或由其组成。

在一些实施方案中，感染培养基包含(1)硫酸镁、氯化镁、氧化镁、柠檬酸镁、乳清酸镁、乳酸镁、碳酸镁或甘氨酸镁中两个或更多个的组合，(2)蔗糖、松二糖、帕拉金糖或fluoro-Suc中两个或更多个的组合，和(3)乙酰丁香酮，或由其组成。

在一些实施方案中，感染培养基包含约5mM至约15mM镁(例如，MgSO₄)。例如，在一些实施方案中，感染培养基包含5mM,6mM,7mM,8mM,9mM,10mM,11mM,12mM,13mM,14mM或15mM镁(例如，MgSO₄)。在一些实施方案中，感染培养基包含10mM或约10mM镁(例如，MgSO₄)。

在一些实施方案中，感染培养基包含约5g/L-约10g/L的植物可代谢糖(例如，蔗糖)。例如，在一些实施方案中，感染培养基包含5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L，10g/L，11g/L，12g/L，13g/L，14g/L或15g/L的植物可代谢糖(例如，蔗糖)。在一些实施方案中，感染培养基包含10g/L或约10g/L的植物可代谢糖(例如，蔗糖)。

在一些实施方案中，感染培养基包含约50μΜ至约300μΜ，或约100μΜ至约200μΜ乙酰丁香酮。例如，在一些实施方案中，感染培养基包含50μΜ，75μΜ，100μΜ，125μΜ，150μΜ，175μΜ，200μΜ，225μΜ，250μΜ，275μΜ或300μΜ乙酰丁香酮。在一些实施方案中，感染培养基含有100μΜ乙酰丁香酮。在一些实施方案中，感染培养基包含200μΜ乙酰丁香酮。

在一些实施方案中，感染培养基包含10mM镁(例如，MgSO₄)，10g/L植物可代谢糖(例如，蔗糖)和100μΜ或200μΜ乙酰丁香酮，或由其组成。

乙酰丁香酮(C₁₀H₁₂O₄)是酚的天然产物，并且是与苯乙酮和2,6-二甲氧基苯酚相关的化学化合物。乙酰丁香酮参与植物-病原体识别，特别是参与转化细菌例如农杆菌。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒上的virA基因由这些土壤细菌用来通过其编码针对乙酰丁香酮和由植物伤口渗出的其它酚类植物化学物质的受体感染植物。

在用工程改造的细菌(例如，工程改造的农杆菌例如根癌农杆菌)接种活跃生长的浮萍愈伤组织后，将浮萍愈伤组织在包含乙酰丁香酮的半固体根瘤生产培养基(NPM)上培养。“根瘤生产培养基”指的是包含乙酰丁香酮、Murashige和Skoog基础盐、植物可代谢糖(例如，蔗糖)、2,4-二氯苯氧乙酸和6-苄氨基嘌呤(BAP)的培养基。在一些实施方案中，根瘤生产培养基可被修改。例如，在一些实施方案中，NPM可以包括(代替或附加于Murashige和Skoog基础盐)通常用于植物细胞培养的其它盐和/或大量元素养分(例如，硝酸盐和/或有机添加剂，例如琼脂，糖，维生素和生长调节剂，诸如IAA(生长素/形态发生素)和激动素(细胞分裂素/细胞分裂启动子))(在本文中称为Murashige和Skoog基础盐等价物)。在一些实施方案中，修改的NPM可以包括除2,4-二氯苯氧乙酸之外的除草剂。在一些实施方案中，修改的NPM可以包括除6-苄基氨基嘌呤之外的植物生长激素。

在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含约50μΜ至约300μΜ，或约100μΜ至约200μΜ乙酰丁香酮或其它相关化合物。例如，在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含50μΜ，75μΜ，100μΜ，125μΜ，150μΜ，175μΜ，200μΜ，225μΜ，250μΜ，275μΜ或300μΜ乙酰丁香酮或其它相关化合物。在一些实施方案中，NPM或修改的NPM含有100μΜ乙酰丁香酮。在一些实施方案中，NPM包含200μΜ乙酰丁香酮或其它相关化合物。

Murashige和Skoog培养基是一种广泛使用的植物组织培养生长培养基。Murashige和Skoog基础培养基包含大量元素养分，包括高水平的硝酸盐和有机添加剂，例如琼脂，糖，维生素和生长调节剂。经常被添加至M&S的生长调节剂包括IAA(生长素/形态发生素)和激动素(细胞分裂素/细胞分裂启动子)。在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含约2g/L至约6g/L的Murashige和Skoog基础盐或其等价物。例如，在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含2g/L，2.5g/L，3g/L，3.5g/L，4g/L，4.5g/L，5g/L，5.5g/L或6g/L Murashige和Skoog基础盐或其等价物。在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含4.4g/L Murashige和Skoog基础盐或其等价物。

在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含约20g/L至约40g/L的植物可代谢糖(例如，蔗糖)。例如，在一些实施方案中，NPM或修改的NPM含有20g/L，25g/L，30g/L，35g/L或40g/L的植物可代谢糖(例如，蔗糖)。在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含30g/L的植物可代谢糖(例如，蔗糖)。

在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含约0.5μΜ至约3μΜ2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)或其它除草剂。例如，在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含0.5μΜ，1μΜ，1.5μΜ，2μΜ，2.5μΜ或3μΜ2,4-D。在一些实施方案中，NPM包含1μΜ2,4-D或其它除草剂。

6-苄氨基嘌呤、苄腺嘌呤或BAP是第一代合成细胞分裂素，其引起植物生长和发育反应，通过刺激细胞分裂设置开花和刺激水果丰富度。在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含约1μΜ至约4μΜ6-苄氨基嘌呤(BAP)或其它植物生长激素。例如，在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含1μΜ，1.5μΜ，2μΜ，2.5μΜ，3μΜ，3.5μΜ或4μΜBAP或其它植物生长激素。在一些实施方案中，NPM或修改的NPM包含2μΜBAP或其它植物生长激素或由其组成。

在一些实施方案中，NPM包含100μΜ或200μΜ乙酰丁香酮、4.4g/L Murashige和Skoog基础盐、30g/L蔗糖、1μΜ2,4-D和2μΜBAP或由其组成。

在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织在半固体NPM(例如，NPM的平板)上培养约1至5天或更久。例如，在一些实施方案中，接种的活跃生长的浮萍愈伤组织在半固体NPM上培养1天，2天，3天，4天或5天。在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织在半固体NPM上培养2天。

在活跃生长的浮萍愈伤组织在半固体NPM上培养后，使它们经历两部分选择步骤。在第一个“预选择”部分中，将愈伤组织转移至半固体选择培养基，其中选择(例如，使用荧光显微镜)表达可视报告基因的经转化的愈伤组织(或愈伤组织细胞)。在选择步骤的第二部分，在“预选择”后，将表达可视报告基因的经转化的愈伤组织培养并经历进一步的选择条件。

“选择培养基”指的是包含选择物质、抗生素、基础盐和植物可代谢糖(例如，蔗糖)的培养基。选择培养基可以是半固体(例如，体外培养板)或液体。

如本文中所使用的“可选择标记基因”指的是赋予对“选择物质”的抗性并用于在未转化的愈伤组织之间鉴定经转化的浮萍愈伤组织的基因。选择物质可以是除草剂或抗生素。在一些实施方案中，选择物质为DL-草胺膦(PPT)。因此，在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织使用赋予对PPT的抗性的基因(例如，草胺膦乙酰转移酶)转化。用于根据本公开内容使用的其它选择物质的实例包括，但不限于，卡那霉素，潮霉素，庆大霉素，博来霉素，腐草霉素，甲氨喋呤，链霉素和大观霉素(Ziemienowicz,A.Acta PhysiologiaePlantarum,2001,23(3):363-374，通过引用将其整体并入本文)。可以如本文所提供地使用其它选择物质。

在一些实施方案中，选择培养基(例如，半固体和/或液体)以足以防止未转化的浮萍/愈伤组织的生长的量包含选择物质。在一些实施方案中，选择培养基(例如，半固体或液体选择培养基)包含约5g/L至约15g/L的PPT。例如，在实施方案中，选择培养基(例如，半固体或液体选择培养基)包含约5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L，10g/L，11g/L，12g/L，13g/L，14g/L或15g/L PPT或其它选择物质。在一些实施方案中，选择培养基(例如，半固体或液体选择培养基)包含10g/L PPT或其它选择物质。

在一些实施方案中，选择培养基(例如，半固体和/或液体)包含一种或多种抗生素(例如，羧苄青霉素和/或cefotaxamin)。在一些实施方案中，选择培养基含有约100mg/L至约1000mg/L的一种或多种抗生素。在一些实施方案中，选择培养基含有100mg/L，150mg/L，200mg/L，250mg/L，300mg/L，350mg/L，400mg/L，450mg/L，500mg/L，550mg/L，600mg/L，650mg/L，700mg/L，750mg/L，800mg/L，850mg/L，900mg/L，950mg/L或1000mg/L的一种或多种抗生素。在一些实施方案中，选择培养基含有约100mg/L至约300mg/L的羧苄青霉素。例如，在一些实施方案中，选择培养基含有100mg/L，150mg/L，200mg/L，250mg/L或300mg/L羧苄青霉素。在一些实施方案中，选择培养基含有200mg/L羧苄青霉素。在一些实施方案中，选择培养基含有约400mg/L至约600mg/L的cefotaxamin。在一些实施方案中，选择培养基含有400mg/L，450mg/L，500mg/L，550mg/L或600mg/L cefotaxamin。在一些实施方案中，选择培养基含有500mg/L cefotaxamin。可以如本文所提供地使用其它抗生素。

在一些实施方案中，选择培养基(例如，半固体和/或液体)包含基础盐(例如，Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐)，或通常用于植物细胞培养和微体繁殖的其它盐混合物。在一些实施方案中，选择培养基含有约2g/L至约5g/L的基础盐或其它盐混合物。例如，在一些实施方案中，选择培养基包含2g/L，2.5g/L，3g/L，3.5g/L，4g/L，4.5g/L或5g/L的SH盐或其它盐混合物。在一些实施方案中，选择培养基含有3.2g/L盐或其它盐混合物。

在一些实施方案中，选择培养基(例如，半固体和/或液体)包含约5g/L至约15g/L的植物可代谢糖(例如，蔗糖)。例如，在实施方案中，选择培养基包含约5g/L,6g/L,7g/L,8g/L,9g/L,10g/L,11g/L,12g/L,13g/L,14g/L或15g/L的植物可代谢糖(例如，蔗糖)。在一些实施方案中，选择培养基含有10g/L的植物可代谢糖(例如，蔗糖)。

在一些实施方案中，选择培养基包含DL-草胺膦、羧苄青霉素、cefotaxamin、Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐和蔗糖。在一些实施方案中，选择培养基由DL-草胺膦、羧苄青霉素、cefotaxamin、Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐和蔗糖组成。在一些实施方案中，选择培养基(例如，半固体和/或液体)包含10mg/L DL-草胺膦、200mg/L羧苄青霉素、500mg/Lcefotaxamin、3.2g/L SH基础盐和10g/L蔗糖或由其组成。

在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织在半固体选择培养基(例如，选择培养基的平板)上培养约1至5天或更久。例如，在一些实施方案中，接种的活跃生长的浮萍愈伤组织在半固体选择培养基上再培养1天，2天，3天，4天或5天。在一些实施方案中，接种的活跃生长的浮萍愈伤组织在半固体选择培养基上培养2天。

如上所述，在活跃生长的浮萍愈伤组织在半固体选择培养基上培养后，随后使包括无组织细胞的转化的和未转化的群体的愈伤组织经历“预选择”步骤，其中选择表达可视报告基因的愈伤组织细胞。因此，基于可视检测的信号才存在选择转化的愈伤组织(或愈伤组织细胞)。可视报告基因可以是编码可以在不杀死愈伤组织的情况下可视化的可视标记蛋白的基因。可视报告蛋白的实例包括但不限于，荧光蛋白及其变体(参见，例如，Patterson,G.H.等人.Biophys.J.,1997,73,2782-2790，通过引用将其整体并入本文)。用于本文的荧光蛋白的具体实例包括但不限于，TagBFP,mTagBFP2,Azurite,EBFP2,mKalama1,Sirius,Sapphire,T-Sapphire,eCFP,Cerulean,SCFP3A,mTurquoise,mTurquoise2,单体Midoriishi-Cyan,TagCFP,mTFP1,eGFP,Emerald,Superfolder GFP,Monomeric Azami Green,TagGFP2,mUKG,mWasabi,Clover,mNeonGreen,eYFP,Citrine,Venus,SYFP2,TagYFP,Monomeric Kusabira-Orange,mKOκ,mKO2,mOrange,mOrange2,mRaspberry,mCherry,mStrawberry,mTangerine,tdTomato,TagRFP,TagRFP-T,mApple,mRuby,mRuby2,mPlum,HcRed-Tandem,mKate2,mNeptune,NirFP,TagRFP657,IFP1.4,iRFP,mKeima Red,LSS-mKate1,LSS-mKate2,mBeRFP,PA-GFP,PAmCherry1,PATagRFP,Kaede(绿色),Kaede(红色),KikGR1(绿色),KikGR1(红色),PS-CFP2,PS-CFP2,mEos2(绿色),mEos2(红色),mEos3.2(绿色),mEos3.2(红色),PSmOrange,PSmOrange,以及Dronpa。在一些实施方案中，荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)或增强型绿色荧光蛋白(eGFP)。

在一个实施方案中，含有转化的和未转化的愈伤组织的半固体选择培养基的平板被置于荧光显微镜下，并且选择针对可视报告基因为阳性(例如，表达荧光蛋白)的愈伤组织用于转移至液体选择培养基。在一些实施方案中，至少三分之一的愈伤组织(或愈伤组织细胞)被转化和选择用于转移至液体选择培养基。在一些实施方案中，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％或更多的愈伤组织(或愈伤组织细胞)被转化和选择用于转移至液体选择培养基。

在选择步骤的此第二部分(其允许同时选择和再生/生长)中，液体选择培养基含有富集转化细胞的愈伤组织。相较于半固体培养基，液体选择培养基允许选择物质(例如，PPT)和抗生素(例如，羧苄青霉素和cefotaxamin)接触愈伤组织的整个表面，这相较于仅半固体选择，导致了更可靠的选择过程。在一些实施方案中，液体选择培养基不含有愈伤组织产生激素。

在一些实施方案中，将所选择的转化的愈伤组织在液体选择培养基(例如，选择培养基的平板)中培养约2至约5周，或更久。例如，在一些实施方案中，将所选择的转化的愈伤组织在液体选择培养基中培养2周、2.5周、3周、3.5周、4周、4.5周或5周。在一些实施方案中，将所选择的转化的愈伤组织是在液体选择培养基中培养3至4周。

在一些实施方案中，将培养物(例如，愈伤组织诱导培养基，NPM和/或选择培养基)维持在约23℃(例如，23℃+/-5℃)处于最佳的光物理条件(例如，16小时光周期)下。

完成最终选择步骤后，将转化的愈伤组织转移到半固体培养基(例如，选择培养基)，以促进再生/增长。此时，可以培养转化的愈伤组织直到遗传改造的子代浮萍式可视的。在一些实施方案中，将转化的愈伤组织培养约4至10天或更久以产生工程改造的子代浮萍。例如，在一些实施方案中，将转化的愈伤组织在半固体选择培养基上培养4、5、6、7、8、9或10天。在一些实施方案中，将转化的愈伤组织在半固体选择培养基上培养不到一周(例如，约2-6天)。

瞬时转化

在其它方面，本文提供了使用核酸瞬时转化浮萍的方法。如本文所用的“瞬时转化”指的是将工程改造的核酸引入细胞而不插入细胞的染色体中。用于根据本公开内容使用核酸瞬时转化浮萍(例如，浮萍叶)的方法可包括在浮萍的分生组织(含有未分化的分生组织细胞)中引入切口。在本公开内容的一个实施方案中，将来自1周龄至3周龄(例如，2-周龄)的纯净培养物的叶倒置在体外细胞培养板上。使用针(例如，20G x 1¹/₂英寸的针)制造靠近分生组织区域的小切口，然后通过使用注射器将感染培养基递送至切口中。

在一些实施方案中，浮萍是紫萍。例如，在一些实施方案中，紫萍是紫萍6581。

制作切口后，用(i)包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮的感染培养基和(ii)工程改造的根癌农杆菌渗透所述切口，其中所述工程改造的根癌农杆菌包含目标核酸、可选择标记基因和可视报告基因，从而产生经渗透的浮萍。如本文所用的术语“渗透”是指使细菌(例如，工程改造的细菌)通过在植物(例如，浮萍叶)中的小开口强迫引入植物中。

在本公开内容的瞬时转化方法中使用的“感染培养基”类似于如上所述的用于稳定转化方法的感染培养基。因此，瞬时转化方法的感染培养基包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮。在一些实施方案中，感染培养基包含硫酸镁(MgSO₄)、蔗糖和乙酰丁香酮。在一些实施方案中，感染培养基由硫酸镁(MgSO₄)、蔗糖和乙酰丁香酮组成。在一些实施方案中，感染培养基包含10mM MgSO₄、10g/L蔗糖和100μΜ或200μΜ乙酰丁香酮或由其组成。

在浮萍的渗透后，将浮萍在包含选择物质和抗生素的液体选择培养基中培养，从而产生经培养的渗透的浮萍。

在本公开内容的瞬时转化方法中使用的“选择培养基”类似于如上所述的用于稳定转化方法的选择培养基。因此，瞬时转化方法的液体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和植物可代谢糖(例如，蔗糖)。在一些实施方案中，选择培养基包含DL-草胺膦、羧苄青霉素cefotaxamin、Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐和蔗糖。在一些实施方案中，选择培养基由DL-草胺膦、羧苄青霉素、cefotaxamin、Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐和蔗糖组成。在一些实施方案中，选择培养基包含10mg/L DL-草胺膦、200mg/L羧苄青霉素、500mg/Lcefotaxamin、3.2g/L SH基础盐和10g/L蔗糖或由其组成。

已成功渗透和转化的浮萍表达可视报告基因，并且从而可以基于浮萍细胞中的可视检测信号(例如，荧光信号)的存在来鉴定。如上关于稳定转化方法所讨论的，可视报告基因可以是编码可以在不杀死浮萍的情况下可视化的可视标记蛋白的基因。可视报告蛋白的实例如上所述。

核酸

如本文所用，“目标核酸”是指可被引入农杆菌中的任何核酸(例如，amiRNA和/或编码蛋白质的基因)。如本文所用，术语“核酸”指至少两个共价连接在一起的核苷酸，并且在一些情况下，可含有磷酸二酯键(例如，磷酸二酯“主链”)。在一些实施方案中，本公开内容的核酸可以被认为是核酸类似物，其可含有其它的主链，包括，例如，磷酰胺，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，O-甲基亚磷酰胺连接，和/或肽核酸。本公开内容的核酸(例如，核酸的组分或部分)可以是天然存在的或工程改造的。“工程改造的核酸”包括重组核酸和合成的核酸。工程改造的核酸不是天然存在的核酸，通过其应当理解，它们可以含有天然存在的核酸部分。“重组核酸”指的是通过连接核酸分子(天然存在或非天然存在的)构建的，并且在一些实施方案中可以在活细胞中复制的分子。作为一个整体，重组的核酸不是天然存在的。“合成的核酸”指的是化学地或通过其它手段合成或扩增的分子，包括化学地或以其它方式修饰但可以与天然存在的核酸分子(但非它们自身)碱基配对的分子。重组和合成的核酸还包括从任一前述的复制产生的分子。

核酸可以是单链的(ss)或双链的(ds)，如所指定的，或可包含单链和双链序列两者的部分(并因此可以被认为是部分单链的或部分双链的)。核酸可以是DNA(基因组的和cDNA)、RNA或杂合体，其中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任意组合，包括尿嘧啶，腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，鸟嘌呤，肌苷，黄嘌呤，次黄嘌呤，异胞嘧啶和异鸟嘌呤。

如本文所使用的，“启动子”是指核酸序列的控制区域，在其上控制核酸序列的其余部分的转录的起始和速率。启动子还可以含有在其上可结合调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其它转录因子)的子区域。启动子可以是组成型的，诱导型的，可活化的，可抑制的，组织特异性的，或它们的任意组合。

启动子驱动其调节的核酸的表达或驱动其转录。在本文中，启动子被认为是“可操作地连接的”，当它是在相对于它调节来控制(“驱动”)核酸的转录起始和/或表达的核酸的正确功能位置和取向中时。

靶基因

本公开内容的多个方面涉及在浮萍中调节基因表达。例如，目标靶基因可以使用方法如本文所提供的方法被下调(表达降低)，上调(表达增加)或错表达(在不通常表达该基因的地方表达)。在一些实施方案中，本公开内容考虑了使用基因沉默构建体转化浮萍，所述基因沉默构建体包括但不限于，微小RNA构建体例如人工微小RNA(amiRNA)构建体。在一些实施方案中，本公开内容考虑了使用基因表达构建体转化浮萍，所述基因表达构建体包括但不限于，包含调节序列例如启动子、增强子的那些，编码转录因子(例如，激活子和/或抑制子)的那些，等。“激活子”指的是激活(例如，促进)基因转录的基因，并且“抑制子”是指抑制(例如，阻止)基因转录的基因。其它调节序列是本领域已知的，并且考虑在本文中。

可以根据本公开内容使用的转录因子的实例包括，但不限于，AP2,ARF,ARR-B,B3,BBR-BPC,BES1,C2H2,C3H,CAMTA,CO样,CPP,DBB,Dof,E2F/DP,EIL,ERF,FAR1,G2样,GATA,GRAS,GRF,GeBP,HB-PHD,HB-other,HD-ZIP,HRT样,HSF,LBD,LFY,LSD,M型,MIKC,MYB,MYB_相关的,NAC,NF-X1,NF-YA,NF-YB,NF-YC,NZZ/SPL,Nin样,RAV,S1Fa样,SAP,SBP,SRS,STAT,TALE,TCP,Trihelix,VOZ,WOX,WRKY,Whirly,YABBY,ZF-HD,bHLH和bZIP。其它转录因子是本领域中已知的，并且考虑在本文中。

调节酶、转运蛋白和代谢蛋白的表达也考虑在本文中。

可以根据本公开内容使用的酶的实例包括但不限于，氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶和连接酶。在一些实施方案中，调节一种或多种下列酶的表达：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)，单酰基甘油酰基转移酶1(MGAT1)，MGAT2，MGAT3，二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)，DGAT2，G-3-P甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，LPA酰基转移酶(LPAAT)，磷脂酸磷酸酶(PAP)，乙酰辅酶A羧化酶，二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(diaglycerolcholinephosphotransferase)(CPT)，磷脂酰胆碱：二酰甘油胆碱磷酸转移酶(PDCT)，脂肪酸脱氢酶1(FAD1)，或脂肪酸去脱氢酶2(FAD2)。其它酶是本领域中已知的，并且考虑在本文中。

可以根据本公开内容使用的转运蛋白的实例包括但不限于，过氧化物酶体ABC转运蛋白1(PXA1)，三半乳糖基二酰基甘油1(TGD1)，以及糖依赖性蛋白1(SDP1)。其它转运蛋白是本领域已知的，并且考虑在本文中。

作为用于生物燃料生产的系统的浮萍

因为它们在开放的培养和边缘水生环境中的强健增长，以及相对容易收获干物质，浮萍是用于生物燃料生产的理想候选物。当在开放池塘中的城市废水上生长时，浮萍的干重生物量产生每天每平方米12-15克，其中淀粉含量高达31％，或在某些组织中为75％。高淀粉浮萍已被证明在酶解和酵母发酵之后的乙醇生产中比玉米50％更加有效(Xu等人，2011)。

在本公开内容的多个方面和实施方案中，本文提供了使用工程改造的浮萍(例如，包含工程改造的核酸的浮萍)的低成本的生物燃料生产方法。本公开内容的稳定遗传转化方法可以用于产生工程干重的浮萍，其可用于人工控制(例如，修改)基因(例如参与代谢途径(例如，脂肪酸合成)的基因)的表达。在一些实施方案中，工程改造的浮萍可用于鉴定和/或修改用于产生三酰基甘油酯的关键基因。本公开内容考虑了通过例如使用本文提供的稳定转化方法操作代谢基因的表达来将浮萍淀粉累积代谢重定向至三酰基甘油(TAG)合成。

如本文中所使用的，术语“工程改造的浮萍”指的是被修饰以含有核酸(例如，外源和/或工程改造的核酸)的浮萍及其任何后代，所述后代不经修饰并且遗传自通过本公开内容的方法(例如，遗传转化方法)产生的经修饰的浮萍。

TAG的天然合成和封存到胞质脂质体中(图2)似乎是浮萍应对胁迫条件的保护机制，因而在这些途径中触发的基因可以被靶向并使它们的表达改变以增加TAG产量。在一些实施方案中，增加的TAG累积可通过阻断淀粉生物合成和由此改变碳分配来实现。例如，TAG累积可通过抑制催化该过程的第一个关键步骤的基因和异位表达参与油生物合成的调控的基因来实现。

用于遗传操作的人工微小RNA(amiRNA)

微小RNA(miRNAi)是在植物和动物中发现的小的非编码RNA并且在基因表达的转录和翻译后调控中发挥功能。人工微小RNA(amiRNA)通过从天然miRNA前体取代天然miRNA双链来衍生。人工前体微小RNA(pre-amiRNA)通常被处理以使得优先产生一个单一的稳定小RNA(图3)，其有利于预测amiRNA靶的完整谱(Ossowski等人，2008)。已成功地开发amiRNA技术并适应于几个植物模型系统(Warthmann等人,2008a,Schwab等人,2006,Molnar等人,2009)，并且是用于在不同的植物物种间高度特异地基因沉默的高效和可重复性的工具。

因此，本公开内容的不同方面和实施方案提供了通过表达靶向目标基因(例如，参与TAG生物合成的基因)的amiRNA来沉默浮萍中的基因表达的方法。

实施例

下面的实施例描述与在本公开内容和在Canto-Pastor,等人Plant Biol.,July2,2014(doi:10.1111/plb.12215,电子优先出版)中描述的稳定和瞬时转染方法相关的实验。

实施例1-浮萍转化方法

用于浮萍转化的表达载体的构建

分离和扩增膨胀浮萍(L.gibba)推定的启动子序列，然后使用克隆系统将它们克隆到pENTR221中。随后通过用M13Fw和Rv寡核苷酸引物测序来确认序列。

还测试了存在于许多广泛使用的表达载体中的共同外源启动子的效率。外源性玉米泛素启动子(ZmUB1p)和花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35Sp)被选择用于此目的。从现有的载体扩增两个启动子并如对于内源启动子所描述的进行克隆。将寡核苷酸ZmUBlpFw和ZmUBIpRv用于扩增玉米UB1p启动子，并将寡核苷酸35S Fw和35S Rv用于扩增CaMV 35Sp启动子。

在所有的序列被引入克隆系统中之后，进行第二反应以将序列引入目标载体pB7FWG(图4)(Hajdukiewicz等人，1994)。在正确地组装构建体后，将其各自引入并瞬时表达在根癌农杆菌(A.tumefaciens)菌株GV3101中。所有启动子在转化测定法成功地使用，表示在胚胎发生组织中的表达水平的明显差异(图14A-14E)。

紫萍的瞬时遗传转化

农杆菌渗透方法被开发并用于瞬时表达。含有目标载体的农杆菌细胞使用来自甘油原液的等份物在具有选择性抗生素的5mL YEB培养基中生长过夜。使用相同的抗生素，添加100μM终浓度的乙酰丁香酮和100μL的新鲜农杆菌培养物作为起始培养物，来制备新的50mL YEB培养物。然后将培养物在28℃生长，伴随250rpm的摇动，直到其OD₆₀₀达到大约1.0。接着，将溶液以5000rpm在4℃离心15分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬浮于具有200μM终浓度乙酰丁香酮的感染培养基中，并在室温下孵育约一个小时。

从两周龄的纯净培养物获取紫萍(S.polyrhiza)叶并倒置在平板上。使用20G x1¹/₂英寸的针制造靠近位于袋(例如，凹陷分生组织)中的分生组织(包含产生的克隆后代的分生组织干细胞)的小切口。含有感染性农杆菌细胞的感染培养基(10mM硫酸镁MgSO₄和10g/L蔗糖)通过使用将多叶结构内的液体加压通过先前制作的切口来渗透在紫萍叶中。渗透后，用蒸馏水洗涤叶一次，然后传递至半强度SH培养基持续两天，以允许转化。最后，将叶转移到含有200mg/L羧苄青霉素和/或500mg/L cefotaxamin以抑制农杆菌的不期望过度生长并且具有10mg/L DL-草胺膦(PPT)以阻断未转化叶的生长速率的SH培养基。荧光在3至5天的选择后是可视的。

对于每一个表达载体，GFP表达在接种后3-4天是可检测的，并且在5-6天在转化的叶的超过80％中达到峰值。GFP表达的水平在不同的启动子之间的一致变化。荧光信号从母叶传递至子代叶并且在高达18个连续世代中检测到(图5)。尽管转化的初步成功，一些意想不到的特性在此过程中产生。GFP在整个叶中不是同等分布的而是局部化的。此外，可能由于在农杆菌渗透过程中的损伤，叶表现出一些发育表型例如细胞损伤和/或细胞间区域的永久浸渍。这些特征被令人惊讶地遗传并传递至后代。由于这种受损的表型，荧光信号没有完全传递至后续世代，并且表达GFP的后代叶的百分比在连续世代中减少。3个月后，GFP信号是检测不到的或者叶的生长停滞。

如上所述，为了抑制农杆菌的非期望的过度生长，转化后两天，将叶转移至含有抗生素的Shenk和Hilderbrandt(SH)培养基。偶然地，在培养几周后在培养物中发生严重污染，尽管是在GFP信号损失或叶生长停滞之前。在被污染的培养基的等分试样上进行的几个PCR显示，在补充有抗生素的培养基中生长的至少一种细菌是用于转化测定的农杆菌，表明选择培养基不能够完全消除细菌。

为了鉴定在转化后发生的发育表型的原因，仅使用无菌水进行渗透测定(图6)。结果显示以相同比率遗传的叶永久浸渍的相同模式，这表明该表型的原因不是农杆菌的存在，而是表型可能是渗透测定过沉重导致的物理损伤的结果。较不侵略性的渗透减少对叶的损伤，但转化效率因此减少。

青萍的愈伤组织诱导和产生

即使经过多次尝试，愈伤组织仍不能从膨胀浮萍获得。然而，从青萍产生了旺盛的愈伤组织并维持数周，将其丢弃并取代为新鲜的培养基，仅为了避免在再生时急性体细胞克隆变异的风险。

将来自约2-周龄培养物的9个青萍叶置于愈伤组织诱导培养基(CIM)平板上，其中叶的近轴部分与培养基接触。当必要时更换培养基。3至4周后，选择无组织细胞的浅绿色群体并转移至含有根瘤生产培养基(NPM)的平板。将1周后从NPM获得的组织用于转化或部分转移到新鲜培养基。所有组织培养物维持在25℃在约30μmol/m²/秒白荧光的16小时光周期下。青萍愈伤组织容易生长，这可允许减少在诱导阶段花费的时间，例如使该过程缩短至4周，而非使用其它方法通常所需的6周。

转基因青萍的稳定愈伤组织转化和选择

使用含有目标载体的根癌农杆菌(A.tumefaciens)GV3101稳定转化青萍(L.minor)愈伤组织。含有目标载体的农杆菌细胞通过使用来自甘油原液的等份试样在具有选择性抗生素的5mL YEB培养基上生长过夜。使用相同的抗生素，添加100μM终浓度的乙酰丁香酮和100μL的新鲜农杆菌培养物作为起始培养物，来制备新的50mL YEB培养物。然后将培养物在28℃生长，伴随250rpm的摇动，直到其OD₆₀₀达到大约1.0。接着，将溶液以5000rpm在4℃离心15分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬浮于具有200μM终浓度乙酰丁香酮的感染培养基中，并在室温下孵育约一个小时。

将直径约3mm的愈伤组织浸没在具有含有农杆菌细胞的感染培养基(10mM硫酸镁MgSO₄和10g/L蔗糖)中5分钟。不进行洗涤，随后将愈伤组织置于含有100μΜ乙酰丁香酮的根瘤生产培养基(NPM)(4.4g/L Murashige和Skoog(MS)基础盐，30g/L蔗糖，1μΜ2,4-二氯苯氧乙酸和2-μΜ6-苄氨基嘌呤)平板上，共培养两天，然后转移到具有10g/L蔗糖、200mg/L羧苄青霉素、500mg/L cefotaxamin和10mg/L DL-草胺膦(PPT)的Shenk和Hilderbrandt(SH)(3.2g/L SH基础盐)平板再进行2天。两个培养均在23℃和16小时光照条件下进行。

与农杆菌共培养四天之后，选择呈现最大数量转化细胞的愈伤组织并单独转移到具有通气帽的75cm²细胞培养瓶，其含有不具有任何愈伤组织生产激素的液体选择培养基(50mL SH培养基，10g/L蔗糖，200mg/L羧苄青霉素，500mg/L cefotaxamin和10mg/L PPT)，并在23℃和16小时光照条件下以100rpm搅拌培养。这个选择过程持续约3至4周，每周更换培养基。选择结束后，收回液体培养基并将愈伤组织放回相同种类的SH板以促进再生。在不到一周中，第一再生叶从愈伤组织产生(图7A-7E)。转化的叶被挑出并转移至正常生长培养基。一般来说，在未完全转化的愈伤组织之间，未转化的叶在找回任何转基因材料之前出现。从含有快速生长的愈伤组织根瘤的每个烧瓶中产生代表个体克隆系的几个转基因植物。

转基因株系的表征和基因组DNA的分析

为了可视地帮助选择过程，将eGFP包括在内，作为体内报告基因。转基因浮萍属植株维持在正常生长条件下，并定期筛选以确认GFP表达在来自个体克隆系的所有后代中的稳定维持(图8A-8D)。斑点的存在促使研究细胞内蛋白质累积的模式。为此目的，将样品用共焦显微镜观察。这些研究揭示，虽然有GFP的普遍细胞内存在，但在一些细胞中观察到在某些区域例如细胞壁和核中的累积(图9A-9D)。呈现最大数量的表达GFP的细胞的转基因愈伤组织在与根癌农杆菌共培养后被转移至选择性液体培养基(图17A)。观察到GFP阳性细胞的进行性生长(图17A-17C)。在选择培养基中5周后，转基因叶开始从转化的愈伤组织再生(图17D)。将从愈伤组织再生的个体叶转移至标准生长培养基，并且在第一叶产生后观察到正常的形态学特征(图17E)。转基因株系具有GFP的普遍表达，这在世代间稳定地保持(图17F)。

使用热不对称交错PCR(Tail PCR)测定来检测T-DNA在青萍基因组中的整合。TailPCR允许鉴定侧接T-DNA的未知序列，从而揭示插入位点。用于Tail PCR的转基因浮萍培养物从不同的叶(4至7)在新鲜SH培养基在最佳条件下产生，并允许在基因组DNA提取之前生长两周。利用随机简并和T-DNA特异的引物，筛选个体转化事件(图18A)。检测几个不同的边界序列，然后使用来自T-DNA的引物和来自侧翼基因组区域的另一个引物来进行验证。内部盒引物被用作独特T-DNA插入的对照(图18B)。来自测序的结果显示，所测试的50％的株系在其基因组中包含至少两个插入事件，而其它对应于单个事件。序列通过不同的叶保持，表明整合是稳定的，并且之后没有发生新的整合事件。然后将回收的青萍序列进行更详细的检查。通过使用这种技术回收了几个单一插入位点并将其有效地映射至青萍基因组的初步序列重叠群(图18C)。插入序列的定位是可能的，因为已知的膨胀浮萍基因组序列与回收的青萍序列之间存在同一性。

农杆菌接种后四天，76个新鲜愈伤组织中的45个具有表达GFP的转化细胞簇(59％)。相对于基于原始方案(Yamamoto等人，2001)的其它研究(Chhabra等人,2011)(其中所获得的效率为10％(与农杆菌共培养的338个中的34个转化的愈伤组织))，这样的转化效率是显著更高的。总体的转化持续时间(愈伤组织诱导后)也从6-7周减少到5周。

实施例2–膨胀浮萍中的人工miRNA(amiRNA)

开发了amiRNA用于特异性下调浮萍科物种中的基因的用途，以开发高特异性翻译后基因沉默(PTGS)的功能平台。

预测和扩增内源膨胀浮萍微小RNA前体。

将先前获得的转录和基因组测序数据(Ernst and Martienssen,2012)用来预测膨胀浮萍微小RNA(miRNA)序列及其测序的前体。使用针对大豆中的研究所开发的技术(Joshi等人,2010)进行预测的miRNA序列的检索。基于在所预测的前体中的发夹二级结构特征，组合的测序和生物信息学分析最初鉴定出114个miRNA前体，随后鉴定出另外38个miRNA前体，总共152个miRNA前体。在这些候选物中，9个miRNA匹配在拟南芥中的已知miRNA，而基于用于注释植物miRNA的一般标准(Meyers等人，2008)鉴定出105个新的miRNA。与其它物种中先前验证的前体共有的特征使预测更为可靠。因此，拟南芥miR166a和miR319a的同源基因被选择用于进一步的研究。MiR166是存在于种子植物和苔藓中的少数miRNA之一，因此，它的加工的保真度应是更稳健保守的，这是设计miRNA/amiRNA取代的决定性因素。预测的前体的序列产生的138nt的短发夹，其中在3个不同位置中存在过客序列(＊miR166)的不完美互补。还选择膨胀浮萍(Lg)pre-miR319，主要是因为多年来由于其广泛的表征而是开发amiRNA文库的所选主链(Schwab等人，2006)。然而，在小立碗藓(Physcomitrella patens)中发现pre-miR319包含随后被显示编码第二miRNA的长环(Axtell等人，2007)。因此将Lg miR319保持为备用支架，以防备Lg miR166的适应失败。

对于每个成熟的miRNA从基因组分离几个预测前体的序列(miR166为Imn-0450,Imn-0631和Imn-0697；miR319为Imn-0748)；特异性寡核苷酸被设计来从基因组DNA扩增序列。

为了评估miR166amiRNA主链的可用性，执行靶向拟南芥CHLORINA 42(CH42)的浮萍同源物的沉默测定。CH42编码镁螯合酶亚基(CHLI)，这是叶绿素生物合成所需的(Apchelimov等人，2007)。其在拟南芥中的失活导致黄-浅绿色组织(Koncz等人,1990)。在拟南芥中的amiRNA敲低法由于此可容易识别的漂白表型而已通过靶向此基因来评估((Felippes等人,2011；Felippes and Weigel,2009；Werner等人,2010)。对于浮萍属，将具有膨胀浮萍转录物组织数据库的WMD3用于选择会潜在地导致CH42的PTGS的候选amiRNA。miRNA前体Lg-miR166的二级结构通过RNAfold(ViennaRNA包2)预测。来自miR166前体的miRNA和＊miRNA用amiRNA/＊amiRNA取代。对于＊amiRNA，考虑了内源性配对的结构和能量特征(被认为对于正确加工是重要的(图16A))。所得的amiR_CH42靶向膨胀浮萍CH42的3'UTR。然而，青萍具有两个拷贝的CH42，其具有几个单核苷酸多态性(SNP)。这些之一特异性地位于结合区中，在小RNA的位置13的对面(图16B)。使用重叠PCR来生成含amiRNA的前体，然后使用辅助的克隆引入pB7WG2D中(图16C)。

还使用表达PDAT1、DGAT1(图22C和22B(对照))和WRI1b(图22A)的构建体转化浮萍。此外，使用几种不同的启动子包括泛素启动子、肌动蛋白启动子和35S启动子转化转化浮萍(图22A-22C)。

表达载体的构建和植物转化。

实现膨胀浮萍的预测miRNA前体的正确分离和扩增后，将类似于用于克隆启动子的策略用于克隆miRNA前体。将序列引入到目标载体pB7WG2D中(图10)。该载体中的报告基因(GFP)在表达盒中的位置不同于插入的目标序列的位置。因此，前体的折叠和二级结构的任何干扰得以避免同时在转化的细胞中维持可视报告基因的表达。

将正确组装的构建体转化到根癌农杆菌GV3101中并转化到青萍愈伤组织中以产生含有各所述miRNA前体的转基因植物。

在转基因株系中miRNA累积的检测。

两种miRNA的同源物在拟南芥中是公知的。Ath_miR166及其靶调节大量发育过程，包括茎尖和横向分生组织形成、叶极性、花发育和脉管形成(Kidner and Martienssen,2004,Jung and Park,2007)。Ath_miR319特别地调节TCP转录因子，其在叶和花瓣生长和发育中发挥作用(Nath等人,2003,Nag等人,2009)。在具有增加表达的预测同源前体的植物中没有观察到异常表型。因此，为了测试它们的功能性，进行分析以确定所产生的构建体的表达增加是否导致相应的成熟miRNA的更高的累积。为了有效的miRNA检测，进行Northern印迹分析。从在最佳条件下生长两周的无性系的组织中提取总RNA。

在miR166的情况下，与野生型相比时，所有的三个株系显示差异累积。此外，表达水平在它们之间也发生变化，其中在Imn-0450和Imn-0697中观察到最高的表达(图11)。因此，Imn-0697前体被选择为用于人工miRNA前体的设计的第一个选项。针对miR319的预测前体也表现出比野生型更高的累积，从而验证它为功能性pre-miRNA(图12)。然而，因为它可能从不同的环产生第二成熟miRNA，故研究集中于miR166方法。

人工微小RNA的设计

旨在沉默任何代谢基因之前，有必要检查经修饰的前体的功能性。设计测定来靶向膨胀浮萍八氢番茄红素脱氢酶(PDS)同源物。PDS催化类胡萝卜素生物合成途径中的早期步骤。保护性类胡萝卜素的不存在导致通过叶绿素的光氧化作用的漂白，从而使之成为用于原理证明应用的便利的基因。这一策略先前已在水稻中因其白化表型而使用(Warthmann等人,2008a)。

amiRNA设计过程使用下面描述的参数，并在初步研究中进行了验证(Schwab等人,2006)。第一步是寻找在选择的基因中匹配amiRNA位置偏倚的候选目标区域。将DetlefWeigel博士及其合作者Max Plank Institute开发的WMD平台(Web MicroRNA Designer；wmd3.weigelworld.org)用于此目的。该工具自动化amiRNA设计，并且只需要根据一小组标准选择候选物。WMD最初实施用于拟南芥，但现在已经扩展到其基因组或广泛的EST信息是可用的一些额外的物种(Ossowski等人,2008)。它被设计来优化固有的小RNA特性以及在给定转录组内的特异性。

对于LgPDS选择最高的amiRNA候选物设计来工程改造到Imn-0697主链中。设计互补序列(＊amiRNA)需要研究miRNA加工的共有特性和前体的二级结构，以确保正确的切割(图13A和13B)。整个经修饰的前体通过SGI-DNA(Integrated DNA Technologies的子公司)合成。

在浮萍中八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的转化和沉默

如对于内源性前体是描述的，将合成的pre-amiRNA插入pB7WG2D载体中。在将最终的构建体引入根癌农杆菌中后，将其用于转化浮萍(图15)。图15显示在转基因愈伤组织(白色，具有绿色荧光蛋白)中RNAi对八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的抑制的图像。

测试amiRNA的功能性

为了评估人工前体的沉默效力，产生了包含上文对于靶向CH42所述的amiRNA构建体的转基因株系(图19A-19C)。amiRNA的表达导致降低的叶色素沉着(图19A-19B)，类似于在拟南芥敲低株系中所观察到的(Felippes等人，2011)。为了确认漂白表型是由于叶绿素含量的减少，从野生型和转化的再生物中使用3个生物学重复提取叶绿素。观察到叶绿素含量约40％的显著下降(图19C)，与先前报道的在CH42缺陷的拟南芥突变体中的观察一致(Apchelimov等人,2007；Soldatova等人,2005))。

为了评估基因沉默的程度，对amiRNA的累积水平和CH42的表达变化进行定量。使用茎-环终点RT-PCR扩增，证实了转基因株系以显著水平累积amiRNA(图20A)。在确认amiRNA的存在后，使用定量逆转录PCR(qRT-PCR)分析进一步表征基因沉默的程度。观察到转录物丰度的约60％的显著降低(图20B)。相对于α-微管蛋白mRNA，CH42的表达水平减少了超过一半；这与表型观察结果一致。

许多因素影响amiRNA介导的沉默的程度((Alvarez等人,2006；Schwab等人,2006)，包括在amiRNA的结合位点上的不匹配，这可减少或消除mRNA靶通过Argonaute-miRNA内切核糖核酸酶的内切核苷酸切割(Molnar等人,2009)。为了确认amiRNA表达导致基因下调，进行cDNA末端的5'快速扩增(RACE)分析，以检测切割的mRNA。RACE产物仅映射到CH42基因拷贝中的一个(CH42A)，非常接近所预测的切割位点(图21)。所有20个切割产物映射amiRNA的核苷酸位置10/11(Argonaute通常切割其靶的位置)下游的几个核苷酸，这可能表明切割的RNA的次级降解。

第二拷贝CH42B中的靶位点的位置14上的不匹配似乎对amiRNA介导的沉默具有强烈的负面影响，因为RACE-PCR没有检测到CH42B切割产物(图21)。类似的错配已显示减少水稻中的沉默效率(Warthmann等人,2008)。这些数据确认了amiRNA沉默平台的高特异性，因为amiRNA可能仅特异性指导该基因的两个拷贝中的一个的切割。

材料和方法

下面的材料和方法在上述实施例中描述的实验中使用。

生物材料

在本研究中使用的克隆是膨胀浮萍G3DWC131和青萍8627。细菌菌株包括用于克隆目的的大肠杆菌TOP10(Invitrogen)和具有携带用于紫萍和青萍的愈伤组织转化的不同插入载体的pSOUP的化学感受态根癌农杆菌GV3101。化学感受态大肠杆菌菌株ONEMACH1^TM T1^R和ONETOP10被用于质粒扩增(INVITROGEN^TM LIFE TECHNOLOGIES^TM)。为了评估转化效率，引入携带CaMV 35S启动子的pB7FWG,0载体，并用于沉默测定，引入携带amiRNA前体的pB7WG2D。

植物和组织培养条件

所有浮萍物种，包括两种浮萍科物种的叶，在具有10g/L蔗糖的50mL液体Shenk和Hildebrandt(SH)培养基中在pH 5.6培养2-3周(Schenk and Hildebrandt,1972)。在一些情况下，叶和愈伤组织在23℃在约30μmol/m²/秒的白荧光的16小时光周期下保持。当达到汇合生长时，更换纯净培养物。

使用改良的现有方案(Moon and Stomp,1997)从青萍叶诱导组织培养物。在pH5.6的含有4.4g/L Murashige和Skoog(MS)基础盐、30g/L蔗糖、5μΜ2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和0.5μΜ噻苯隆(TDZ)以及5g/L细菌学琼脂(FISCHER)的诱导培养基(IM)中孵育叶。每周更换培养基。3至4周后，选择无组织细胞的浅绿色群体并转移至pH5.6的含有4.4g/L Murashige和Skoog(MS)基础盐、30g/L的蔗糖、1μΜ2,4-D和2μΜ6-苄氨基嘌呤(BAP)以及5g/L琼脂的固体繁殖培养基(PM)。7至10天后，将生长最快的愈伤组织在新鲜PM培养基中增殖，并用于转化实验。

细菌培养基

本文使用的所有培养基在使用前高压灭菌。pH用氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)和盐酸(HCl)调节至7.2。对于选择培养基或农杆菌转化培养基的制备，由于化合物的热敏稳定性，在温度在55℃以下时将1/1000体积的抗生素或乙酰丁香酮原液分别加入培养基。对于平板的制备，加入15g/L Agar Bacteriological(Affimetrix(D))。

Luria肉汤(LB-Lennox)：25g/L颗粒LB-Lennox(FISCHER)

YEB培养基：1g/L酵母提取物(FISCHER)，5g/L牛肉提取物5g/L蔗糖，5g/L蛋白胨，和0.5g/L氯化镁MgCl₂。

感染培养基：10mM硫酸镁MgSO₄和10g/L蔗糖(加入100μΜ或200μΜ乙酰丁香酮)。

植物培养基

所有植物培养基在使用前高压灭菌。pH用氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)和盐酸(HCl)调节至5.6。对于选择培养基或农杆菌共培养培养基的制备，由于化合物的热敏稳定性，在温度在55℃以下时将1/1000的抗生素、除草剂、乙酰丁香酮和/或一些植物激素原液分别加入培养基。对于平板的制备，加入4.5g/L至5g/L Agar Bacteriological和任选1.5g/L PHITAGEL^TM

Shenk和Hilderbrandt(SH):3.2g/L SH基础盐(GOLD)

根瘤生产培养基(NPM)：4.4g/L Murashige和Skoog(MS)基础盐30g/L蔗糖，1μΜ2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和2μΜ6-苄氨基嘌呤(BAP)(高压灭菌后加入)。

愈伤组织诱导培养基(CIM)：4.4g/L MS基础盐，30g/L蔗糖，5μΜ2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和0.5μΜ噻苯隆(TDZ)。

质粒

本文开发的所有构建体使用克隆系统获得。因此，所有的序列首先克隆在pDONR^TM221载体中，随后转移至不同的目标载体。

寡核苷酸

本文所提供的寡核苷酸(参见，例如，表2)通过Integrated DNA合成并溶解在UltraPure^TM蒸馏水(Life)中至100mM浓度用于原液储存。然后，将它们进一步稀释至10mM用于在聚合酶链式反应(PCR)测定中使用。用于BP重组反应的额外寡核苷酸通过向相应的序列加入各自的attB 1/2位点来设计用于克隆到pDONR^TM载体中。

聚合酶链式反应(PCR)

PCR基于使用热稳定聚合酶和寡核苷酸对作为DNA序列的后续扩增的引物。此测定，在其不同的变型中，允许用于检测、表征和复制DNA的灵敏、快速且定量的方法。

从膨胀浮萍基因组的核酸分离

为了将膨胀浮萍核酸序列克隆到表达载体中，从基因组提取物的预先扩增是必要的。由于基因组的复杂性，进行两步PCR反应。

基因组DNA提取。对于膨胀浮萍的基因组DNA提取，使用来自CTAB提取的现有方案(Murray and Thompson,1980)的稍微改良的方法。混合缓冲液用10mL提取缓冲液、10mL核裂解液、4mL十二烷基肌氨酸钠和0.038克亚硫酸氢钠(Sigma)进行制备并保持在连续搅拌中。2小时后，将200μL混合缓冲加入到收集的植物组织，然后用研杵研磨。加入500μL更多的混合缓冲液后，将溶液在65℃孵育15分钟。随后，加入700μL氯仿/异戊醇(24:1)，并轻轻地倒置10次。将混合物离心下来(13000rpm 1分钟)，并且将上清液转移到新的管中。然后加入2/3体积的异丙醇并混合。将混合物再次离心(13000rpm 5分钟)，并弃去上清液。将沉淀物用70％的乙醇洗涤，然后在加热块(65℃)上干燥直至乙醇完全蒸发。最后，将沉淀重悬于30μL超纯H₂O中。

对于从青萍提取总RNA，使用按照制造商的说明使用DIRECT-ZOL^TM RNA MiniPrep试剂盒(Zymo Research)。

第一PCR反应。进行目标序列的起始扩增。使用1ng基因组DNA作为模板和一组设计的引物(所需序列上游的各约50bp)制备50μL反应物。按照New England针对其High-Fidelity DNA聚合酶提供的具体说明执行反应。反应的退火温度使用网页的TM计算器(neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator)来设置。

琼脂糖凝胶电泳和提取。对于扩增的DNA片段的分离，进行琼脂糖凝胶电泳。将含有TAE缓冲液中1％w/v LE琼脂糖的凝胶用于此测定。为了在紫外光下使DNA片段可视化，在聚合凝胶之前加入溴化乙锭将DNA样品与6×Loading Dye Solution(Thermo Fisher)混合，并在约80至100V/cm的电压下进行电泳。

由于膨胀浮萍基因组的复杂性，第一PCR反应通常导致几个片段的扩增。这可能是引物与基因组周围高度相似的序列的非特异性退火的结果。随后，将大小对应于PCR所预期的条带从凝胶切出，并用凝胶提取试剂盒提取。

第二PCR反应。最终的扩增反应使用用来添加attB位点用于将序列引入克隆系统的区域的特异性引物来进行。第二反应类似于上面所讨论的第一反应，所不同的是将1ng的凝胶提取产物用作模板。反应的退火温度使用不具有attB位点的引物序列来建立。

第二扩增反应之后，扩增的PCR产物使用PCR纯化试剂盒)进行清洗试剂，并储存在-20℃。

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)

PCR的此变型的目的是分离侧接已知序列的未知序列。使用这种技术，有可能鉴定青萍基因组内T-DNA的插入位点。为了鉴定T-DNA的插入位点，如所述进行TAIL-PCR(Liu等人,1995)，不同之处在于在第一扩增中使用Ex Taq聚合酶(Takara)以提高灵敏度。

首先，在聚合酶链式反应(上文)中描述的步骤之后进行青萍基因组DNA的提取。然后，使用插入的T-DNA的特异性引物和将随机退火在基因组内的简并引物(AD)对不同的样品进行一系列的三个连续不同的PCR反应。

之后如在上文标题为“聚合酶链式反应”的小节中所述的进行琼脂糖凝胶电泳来分析第二和第三扩增的产物，并且将第三扩增中获得的不同的条带与第二扩增的条带进行比较。使用凝胶提取试剂盒仅从凝胶中回收根据构建体内T-DNA引物2和4之间的距离改变尺寸的条带并使用来自第三扩增的T-DNA寡核苷酸(SB3-41SB5-4)作为引物来测序。

用于检测小RNA的Northern印迹

对于来自膨胀浮萍和青萍的成熟微小RNA的检测，使用已有的方案(Várallyay等人,2008)的稍微改良的版本。

从青萍和膨胀浮萍的RNA提取：如在上文标题为“定量逆转录PCR(qRT-PCR)”的小节中所述的从所需样品提取RNA。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：将聚丙烯酰胺凝胶用于将RNA序列关于其尺寸分离。对于凝胶的制备，制备含有在0.5×TBE中的15％(19：1)丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺(acryl:bisacryl)和7M脲的溶液。将溶液置于65℃，直到脲完全溶解，然后将该溶液倒入到一个新的容器以除去溶解的空气。

对于凝胶的聚合，将250μL 10％过硫酸铵(APS)和20μL四甲基乙二胺(TEMED)加入到50mL先前溶液中，并且将其倾倒于用于凝胶的垂直板组件内。1小时后，凝胶完全聚合。然后除去梳子(用于制备孔)，并且用0.5×TBE洗涤孔，以减少脲渗入孔中。将凝胶在0.5×TBE中在300V下预电泳超过30分钟。

将RNA样品调整为用UltraPure^TM蒸馏水装载所需的最终量(例如，μg)，然后添加等体积的RNA Gel Loading Dye II。将混合物在65℃加热5分钟以破坏二级结构，然后置于冰上。

在凝胶的预电泳后，再次洗涤各孔。然后，装载RNA样品并在100-300V电泳直到上样缓冲液较下面的染料(溴酚蓝(BPB))接近底部。在此凝胶中，BPB在10个核苷酸处电泳，而二甲苯蓝(XC)(其应在中间)在约40个核苷酸处电泳。切出含有高重量RNA的凝胶较上面部分，用溴化乙锭染色，并用作上样对照。

印迹：对于此步骤，切取六片3MM Chr吸水纸和一片GeneScreen杂交转移膜(Perkin)以适应凝胶。使用SD Semi-DryTransfer Cell将RNA转移至尼龙膜。将浸湿的纸置于转移块上，接着放置浸湿的膜、凝胶，以及剩下的浸湿的纸在顶部。然后除去所有的气泡以确保完美的转移。设置装置后，在最大功率下转移45分钟。最后，使用来自CL-1000Crosslinker(UVP，LLC)的短波254nm UV光将RNA共价键合至膜。

杂交：将尼龙膜用水冲洗以除去盐及脲，然后用20mLULTRAhybO-Oligo缓冲液(Invitrogen^TM)在40℃预杂交至少1小时。对于检测miRNA，将互补的寡核苷酸设计为探针。对于探针制备，将1μL 10μΜ寡核苷酸、16.5μL UltraPure TM蒸馏水、2.5μL 10X T4多核苷酸激酶缓冲液3μL ATP N-32P1-3000Ci/mmol 5mCi/ml(Perkin)和2μL T4多核苷酸激酶混合，并使标记反应在37℃进行1小时。随后，将200μL杂交缓冲液加入至探针并加热至95℃持续5分钟。孵育后，将探头在冰中冷却20秒，然后直接加入至预杂交印迹物。将印迹物在40℃放置过夜。

洗涤和显示：用具有0.2％SDS(Sigma)的2×SSC缓冲液15分钟洗涤尼龙印迹膜两次，然后包裹在保鲜膜中以避免曝光时膜的干燥。将Northern印迹想成像板BAS-MS2040上曝光过夜，并用FLA-5100荧光图像分析仪分析信号。

序列至表达载体的GATEWAY^TM克隆

所有的表达载体使用由Invitrogen^TM设计的GATEWAY^TM克隆系统进行加工。

BP反应：第一步是通过生成入门克隆来将目标序列引入系统内。使用如上所述的侧翼attB位点通过PCR扩增序列后，使用BP将产物重组在pENTR221中，按照制造商的说明进行操作。重组后，如本文其它地方所述的将产物克隆到大肠杆菌中。

第一质粒DNA提取和测序：在将抵抗物孵育过夜后，使用SpinMiniprep试剂盒在培养物上进行总质粒DNA的提取，按照制造商的说明进行操作。提取后，使用NanoDrop分光光度计对样品进行定量，将样品的等分试样送于使用M13Fw/Rv引物的测序以确认序列已被扩增并被正确地引入载体中。

LR反应：确认序列是正确的之后，通过使用LR的重组将序列引入所需的目标载体(pB7FWG,O/pBWG2D)中，按照制造商的说明进行操作。重组后，如本文其它地方所述的将产物克隆到大肠杆菌中。

第二质粒DNA提取和检查：如本文其它地方所述的对培养物再次进行总质粒DNA提取和定量。确认正确的重组通过测序或通过PCR来实现。将特异于目标载体(对于pB7FWG为eGFP5'Rv，对于pBWG2D为0/35S3'Fw)和特异于引入的序列的寡核苷酸序列用作引物。质粒贮存于-20℃。

大肠杆菌的转化

将大肠杆菌用于扩增所需的DNA构建体是良好建立的工具，它允许快速和容易地扩增特定质粒用于进一步的实验。通过利用质粒赋予细菌的特定抗性，唯一地选择转化的细胞。

ONETOP10和MATCH1^TMT1^R化学感受态大肠杆菌菌株按照制造商的说明进行转化。转化后，将细胞铺板在含有用于选择的适当抗生素的LB培养基中，并在37℃孵育过夜。选择在抗生素存在下生长出的菌落并分别在37℃下在5mL的具有相应抗生素的LB中培养过夜。将最终的培养物用于执行进一步的实验。

根癌农杆菌感受态细胞的产生

将化学感受态根癌农杆菌细胞在具有利福平和庆大霉素(用于根癌农杆菌菌株-具有pSoup的GV3101的选择抗生素)的5mL YEB中在28℃生长过夜，伴随250rpm摇动。将此培养物在100mL的LB中稀释，并培养直到OD₆₀₀为0.5和1之间。然后将培养物在冰上冷却，并在4℃以5000rpm离心5分钟。将沉淀用1mL的20mM CaCl₂和20％甘油重悬。最后，制备100μL等分试样并在液氮中解冻。样品储存在-80℃。

根癌农杆菌的转化

为了在化学感受态根癌农杆菌菌株中引入目标基因，将感受态细胞在冰上解冻10分钟。接着，将1μL目标质粒DNA加入到细胞中，并在冰上孵育30分钟。然后将细胞在液氮中冷冻1分钟。然后将细胞在37℃下热休克5分钟，伴随偶尔的混合。接着，将1mLYEB培养基加入到细胞中，并将细胞培养物在28℃孵育至少1小时，伴随250rpm的摇动。然后将细胞沉淀，重悬于100μL，并在28℃下铺板于具有选择性抗生素的YEB中直至菌落可见。对于大肠杆菌转化，选择在抗生素存在下生长出的菌落并分别在具有特定抗生素的5mL YEB中在28℃培养过夜。将最终培养物用于执行进一步的实验。

青萍的转化和再生

将携带目标载体的根瘤农杆菌GV3101在具有选择性抗生素和100μΜ乙酰丁香酮的LB中在28℃下培养至1.0的OD600。将细胞重悬于10mM硫酸镁、10g/L蔗糖和200μΜ乙酰丁香酮中，并在室温下孵育1小时。将直径为约3mm的愈伤组织浸没在细菌悬浮液中5分钟。然后将愈伤组织置于具有100μΜ乙酰丁香酮的NPM上并共培养两天。将转化的愈伤组织转移到pH 5.6的含有10g/L蔗糖、200mg/L羧苄青霉素、500mg/L cefotaxamin、10mg/L草胺膦(PPT)和5g/L细菌学琼脂的固体再生培养基(RM)持续另外两天。

在本研究中进行的所有转化使用eGFP作为报告基因，通过pB7WG,0中的CaMV 35S启动子和通过农杆菌rolD启动子(存在于根癌农杆菌T-DNA中的用于致癌基因在宿主中的高表达的启动子)驱动。将具有最大数量的GFP表达细胞的愈伤组织跟别转移至含有50mL液体RM的具有通气帽的75cm²细胞培养烧瓶并在振荡培养箱中于100rpm下培养。4周后，每周更换培养基，将愈伤组织放回在固体再生培养基上。将从愈伤组织产生的再生的叶转移至液体标准生长培养基并针对荧光进行筛选。

膨胀浮萍miRNA前体预测

如制造商推荐的，通过在液氮下在研钵和研杵中研磨随后通过TRIzol(Invitrogen)试剂提取来从冷冻的膨胀浮萍G3组织中分离总RNA。通过Fasteris制备和测序小RNA文库。简言之，在RNA衔接子连接之前和之后，通过丙烯酰胺凝胶电泳对10μg总RNA按尺寸选择两次。随后将短语30bp的衔接子标记的RNA片段进行反转录，PCR扩增，和凝胶纯化。从单个HiSeq 2000 1x100bp允许获得74M读取。从原始读数修剪3'衔接子。接着，将膨胀浮萍小RNA序列映射至L.gibba v0.1组装体(http://www.lemna.org)的基因组支架，并进行过滤以除去t/r/sn/snoRNA、冗余的和高拷贝读数。对通过此过滤器的sRNA用miREAP就其前体结构进行测试。前体通过从任一侧上的潜在miRNA延伸多至200nt来确定。在此之后，将两个额外的过滤器(链偏倚和top1+top2比率)应用于从siRNA位点区分miRNA。链偏倚是正义链上的sRNA丰度的总和除以两条链上的总丰度。top1+top2是最高的两个丰富标签的丰度的比例，也被称为“分配过滤器”。基于来自拟南芥和水稻的已知miRNA挑选截断值。在每个步骤中，将已知Ath-miRNA(miRBase v17)的剩余数跟踪作为过滤效率的指标。此处描述的miRNA的预测流水线可在先前公布的方案中找到，其中解释了过滤器的进一步细节(Zhai等人,2011)。

人工微小RNA构建体设计

为了自动化amiRNA设计过程，将WMD3网络服务安装在lemna.org服务器上用于与膨胀浮萍从头转录组装配体一起使用。通过与拟南芥的同源性鉴定靶基因的转录物后，将WMD3用于生成候选21nt成熟amiRNA序列，其类似于天然的miRNA，同时最小化对其它转录物的可能的脱靶效应(Ossowski等人，2008)。

如所述的(Schwab等人，2006)将21nt候选物引入膨胀浮萍pre-miR166a主链，然后使用Gateway系统(Invitrogen)克隆到pB7WG2D载体(Karimi等人,2002)中。

定量RT-PCR分析

通过定量PCR使用iQ SYBR-Green(Bio Rad)分析基因表达。将青萍α-微管蛋白基因用作标准对照。测试引物以确保PCR效率的等值。从三个独立生物重复使用各自三个技术重复获得PCR反应的循环阈(Ct)值。使用比较Ct方法(Livak and Schmittgen,2001)进行表达水平的相对定量。

微小RNA的RT-PCR检测

miRNA和amiRNA的RT-PCR分析如所述的进行((Varkonyi-Gasic等人,2007)。

叶绿素定量

将叶绿素在乙醇中提取并使用三个生物学重复通过分光光度法(Ritchie,2006)定量。

5'-RACE PCR

使用无帽RNA的标准方案进行RACE PCR。将2-5μg总RNA用于5'RACE衔接子连接反应(来自Ambion的T4RNA连接酶5U/μl)。连接后使用III First-StrandSynthesis SuperMix(Invitrogen^TM)按照制造商的说明进行RT PCR。使用Taq DNA聚合酶(NEB)进行两轮嵌套PCR。按照生产商的说明，将得到的条带凝胶提取(QIAquick凝胶提取试剂盒–)，使用TA克隆试剂盒(INVITROGEN^TM)克隆并转化到TOP10感受态细胞(INVITROGEN^TM)中。选择白色菌落用于在液体培养基中扩增并用QIAprep Spin Miniprep试剂盒提取质粒。使用基因特异性引物对质粒DNA进行测序。

表1：本文所用的不同的质粒

表2：寡核苷酸

试剂盒，化学品，缓冲液和酶

表3：试剂盒和酶

表4：其它试剂和标记物

表5：用于生物培养物的化学品

表6：缓冲液以及其在使用浓度下的组成

表7：消耗品

表8：设备

表9：用于不同Tail-PCR阶段的反应混合物组成

表10：用于不同Tail-PCR阶段的反应程序

附加的序列

如本文所述分离的每个内源启动子和微小RNA前体的测序结果呈现于下文中。

SEQ ID NO:34

Lg ACTp

TATTTAATATATGTTTGCGATTTTATTTATTTGTTTTAATAGAATTATTTGAGTCCTTAATTATTTAAGTGGGAAGACGTTTTTTCTTGTAGTAGAAAATTGAAATTTGGTTTTCTAGAAATTTGTATTGTATTGGTGTTCCATTTCACTCGGTGACAGCTCGCTTATGCTCACGCATAAGACATAAGCTACGTGGAGATCGTGGGTTGTTTTTTCCAGCGAACTTTTTCGCTCGATCCATGGAAAATATCAAAATATACAACATATTTGCAGGAAATTGCATGATCATCAACAGTGTTAAATTCTTTTTCTTCTGTTTACAATTTGTTTTAAAGTAAAAACAAAACTATTTTTATCATCCGGAAACGAGAAAATAAAAGATAGTGAATTTCTTCGGTTTTTCAACTTCTTATATAAATAATTTAAATATTCACGTGAGAATGGATGACCCGGTCCATTGACCGACCAATGGGTTGAGTCAGCAAAGGGGAAAAATATGGGCCTCATATTTGACACGGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCTCACTCCCCATCATCTCTCCTCTCACAAACAGGTCTATCTGTCTATCTCTCTCCTCCGCCAGCCACAGGTCTGAATGAATTAGCTTTAAATTTTGAGAAGGGAGTGAGTGGTTGTGTAGCCACCTCATTTGACCACTACCATGAGACTTTATGTAGAATAAAATTAGTTTTATTTTTTAATATAATTATTCCGTTTCCATTTAGGATTTAGAATAAAAGTGGGAGGGGTTTATTTATTGGAGAATATTGTAATTTGTTATTTTTGGAGTGAATGGAAGTTTCATTTGTGTTTCATTTGTGTTTCATTTCGTGCGGTGACAGCTCGCTTATGCTGACGCATCCTAGCTTTAAAAGGAAAGGCTGAGCCAGCGGCTGCTTTGTTGGACGCCCTCAGACCGCTGCTCTTCTTCCACGCTACTTTTCTTCCGGCGGAGAAGAGGTAAAGCTCGACCGCGGCATCCTCGGAATCTCGGAGAGCAGGTAGAGATCTATGCTGGTTTTCTCATAGATCGGTCTTCTCGAAACCTGTAAAATCTTCTGATTGCTTGTCTGATACCATTTTCTTCCCGATCGTAGCATTTCGCATGCTGTTTATTCGTGTTTTTTGTTTTCTCGGCTTGCAATCTTTGAGATGTTCAGATCTTATGTCTTCTCGTGTCGCATCTTGTAGATCTGGTTTCTTTTTGTGCGCCGATCTGTTCACTCGATCCTCTTTTCTCGTCAATCGCCAGCGATCTTTATTAACTTGTTCTCCGAGGAGGATTCCCTGCTTTCCATGGCGATTATCAACATCTCGGGTGCTTGCGTGAAGTTCTTTTTCTGATTTCCCGTTGTAGAACATAAGTTACCATTTCTTTCATTATCTGTATTTTTCTTTCGTATCAGATGCATTTCCTCTACTGTTTCTGCTGCTTTCTGTACTTCTCCGATTGGAGGCTCGATTTCCTGATATTTGGAGACAACTACAGGAAGCATTACGTATTTCCAACTGTAGATTAACATTTCTTTTTGGTTCATCGATCTGTCATCCTCATTTTTCATCATTTTTCGTGGAAAGTACTAAAAGATTAACTGGTCTAGGTCCTGGCGAATAACTGTGATGGAAAAAATGACATTACTAATATAATTTAACCTAATTTCGTTGACACGATCATTTATGGTTTTTTATTTAAACAAATACTACGAGACTTCGGAGTCTATATTGTCATTTTTTTATATGGGAGGTAAACTGGTCAATTTCCAGTTTCTTTTGTCATGTCTTCTATCTAAATATGTAACATCTATCGGAATTATTCCCCTGAATTATCATCCCTTTCTACTTATCTTAATTTCATTTTCTGTCCTCTCTAGCTATCTTAATTAACTCATCTTTGCAGAACTGCGCACA

SEQ ID NO:35

Lg SSU5Ap

CAATCGCCAGAAATGTCAGAAGAGGCTGGCCTCTAGAGGCCCCGCAAGGCCTCACCCAGAGTTGGCGCAGCCTCGCCGCGTCCGAGGCATGTGCAGCTCACTAAACGGGAAATTTCCAACAGTCAACCCGCAGACAAGGGCCAAACCCCAAAGAACAATTCTTTGTCCATGAAGTAAAATAACGTTTTATCTTGAAACAAGAGTTCAAGGCCAAATGTGGCCAAGCGATTCGGATGGGGGGGCATGAACACCTTGCAATCATTTCCTGACTCATTTCTGAACAGTGCCCTTGGCACACGTGTAGACCTGCCAACATAATTAAAATATAATATTAGAAAAAAAATCTCCCATAGTATTTAGTATTTACCAAAAGTCACACGACCACTAGACTTCCAATTTACCCAAATCACTAACCAATTTTAGGTTGAATGGAAAATAGAACGCAATAATGTCCGACATATTTCCTATATTTCCGTTTTTCGAGAGAAGGCCTGTCGATAAGGATGTAATCCATGGGGCGACGCAGTGTGTGGAGGAGCAGGCTCAGTCTCCTTCTCGTGAGGGATCGAACGATGGCAGCCGTAGAATGCTCAGAGCAATGACCCAGCCAGCTGTGGGGACCTATTTAAGCGGGTTATGACGAGTCTCAGACTCGCAAGTGGAGAGAGGATCCGAGCGTCCAGTGAGAGGAAGAGAGAGGGAGGC

SEQ ID NO:36

Lg SSU5Bp

TTAGGGTGCAAAATAATTACACATCCTAAGAATTATTTATCTACAATTTAGCTCCGGACAAAATTAGTTCATTATTCAATCACTTTAATGTTTTCAATGGCCACAAAATGTTTTGATCCAGATGCACTTTTGATTCAGTCACCCTAGATGCACTTTTTGATCCCCGGCAAAACTTTAGGACTAGTGTCCGTTCACTCACCTTCTAATAATCTGTGTGACGAAAATATAAAGAAAAACAGTGACAATTATCCTATTTGAACAAGACCTGAGTTGCTCGTTTTACTCACTAGATATGCCACTAAAAAGGTGAGAATAGTTTTCTTACTACTTTGGCATTTGCCACCTAATTTCAGTGTCAGAGTCGACTAGCCTTCCATTCCTTGTAAATCAATGAAAATTTGATGAAAACTAAGAACCTTCAATAAGCGACAAATCGCTTCGTTTCTCCTTTGCGGATAGATGGCAGACGATAAGAATGTAATCCAGAAGATGAGGCCATTGTGGAGGAGAAGATGCAGTGTCCCCCTCTGTAGAGATCGAACAATGGCAGCCATAGAATCCCCGGAGCACTGAGACAGGGACAGACGCCAATTTAAGTGGCCCGAGAACGGTTTTAGAAACTCCCGAGGTGAGCAAGGATCCGGATCGAGCGCGAAGAAGAGA

SEQ ID NO:37

Imn-0450

TTACTGTTGAGGGGAATGCTGTCTGGCTCGAGGTCACCGTTCTCTTCTTCTCAATCTCCTACTTCCATCTATCTGAATGGAGAAGGGAATGGAAGGAGAGATCTGCCTCGGACCAGGCTTCATTCCCCCCAATCAAAG

SEQ ID NO:38

Imn-0631

CCGTTGGGAAGCTTTTCCTTTGAGGGGAATGTTGTCTGGCTCGAGGTTTCTCCTTTCTCTCTCTGGAGAAATTGCGATGGAGAGGAGAGAATGCCCTCGGACCAGGCTTCATTCCCCTCAATCGCAGCTTCCACAAACCTTC

SEQ ID NO:39

Imn-0697

GTCGCATGTTGAGGCTGGCTTGTGGGGAATGTTGTCTGGCCTGAGGTCAAGCAATGGAGATATTGTGGGTATAAGGTCTCTAGATCTCGGACCAGGCTTCATTCCCCTCAGCCGGCATCCACATTTTCTCTC

SEQ ID NO:40

Imn-0748

GCTTCGTCGGTGATATGGGAGGAAGAGAGCTTCCTTCTGTCCACTCTCTGGTGGCCGCAGGACTACGCCATCTGCCGACTCATTCATCCAAATCCCAAGCCGCGGAGGATTTTCAGGTTTGGGAGATGCGTGAATGGCGCGGGAGATAGCCCGGGTTCTGCGCCGGCTGTGTTTGGACTGAAGGGAGCTCCCTCTTCTTCATCTCTCTCTCTCTACCG

SEQ ID NO:41–本文设计和合成的人工微小RNA前体的序列

pre-amiPDS

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGTTGGGAAGCTTTTCCTTTGACAGTTCATTGCTACATCTTAAGGTTTCTCCTTTCTCTCTCTGGAGAAATTGCGATGGAGAGGAGAGAATGCCCTTAGAATGTAGGTATGAACTGTCAATCGCAGCTTCCACAAACCTTCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCC

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缩写

Claims

1.利用核酸稳定转化浮萍的方法，该方法包括：

(a)在包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮的液体感染培养基中，使用包含目标核酸、可选择标记基因和可视报告基因的工程改造的农杆菌接种活跃生长的浮萍愈伤组织，从而产生接种的愈伤组织；

(b)在包含乙酰丁香酮的半固体根瘤生产培养基上培养接种的愈伤组织，随后在包含选择物质和抗生素的半固体选择培养基上培养接种的愈伤组织，从而产生经培养的接种的愈伤组织；

(c)从(b)的经培养的接种的愈伤组织选择表达所述可视报告基因的经转化的愈伤组织；

(d)在包含所述选择物质和抗生素的液体选择培养基中培养(c)中选出的愈伤组织；和

(e)在包含所述选择物质和抗生素的半固体选择培养基上培养(d)中培养的愈伤组织，从而产生包含所述目标核酸的遗传改造的子代浮萍。

2.权利要求1的方法，其中所述农杆菌是根癌农杆菌。

3.权利要求2的方法，其中所述根癌农杆菌是根癌农杆菌GV3101。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述活跃生长的浮萍愈伤组织是活跃生长的青萍愈伤组织。

5.权利要求4的方法，其中所述活跃生长的青萍愈伤组织是活跃生长的青萍8627愈伤组织。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中(a)的活跃生长的浮萍愈伤组织的直径为约3至5mm。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中(a)包括使所述浮萍愈伤组织与根癌农杆菌接触5分钟。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述液体感染培养基包含硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮。

9.权利要求8的方法，其中所述液体感染培养基由硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮组成。

10.权利要求9的方法，其中所述液体感染培养基由10mM硫酸镁、10g/L蔗糖和100μΜ至200μΜ乙酰丁香酮组成。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述选择物质是DL-草胺膦。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述可视报告基因是绿色荧光蛋白。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中(b)的经培养的接种的愈伤组织在半固体根瘤生产培养基上培养约2-4天。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中(b)的半固体根瘤生产培养基包含乙酰丁香酮、Murashige和Skoog基础盐、蔗糖、2,4-二氯苯氧乙酸和6-苄氨基嘌呤。

15.权利要求14的方法，其中(b)的半固体根瘤生产培养基由100μΜ乙酰丁香酮、4.4g/L Murashige和Skoog基础盐、30g/L蔗糖、1μΜ2,4-二氯苯氧乙酸和2μΜ6-苄氨基嘌呤组成。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中(b)的经培养的接种的愈伤组织在半固体选择培养基上培养约4至7天。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中(b)的半固体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。

18.权利要求17的方法，其中(b)的半固体选择培养基包含DL-草胺膦、羧苄青霉素、cefotaxamin基础盐和蔗糖。

19.权利要求18的方法，其中(b)的半固体选择培养基由10mg/L DL-草胺膦、200mg/L羧苄青霉素、500mg/L cefotaxamin、3.2g/L Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐和10g/L蔗糖组成。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中(c)包括使用荧光显微镜选择荧光细胞。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中将(c)中选出的愈伤组织在液体选择培养基中培养约3至4周。

22.权利要求1-21中任一项的方法，其中(d)的液体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。

23.权利要求22的方法，其中(d)的液体选择培养基包含DL-草胺膦、羧苄青霉素、cefotaxamin、基础盐和蔗糖。

24.权利要求23的方法，其中(d)的液体选择培养基由10mg/L DL-草胺膦、200mg/L羧苄青霉素、500mg/L cefotaxamin、3.2g/L Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐和10g/L蔗糖组成。

25.权利要求1-24中任一项的方法，其中(e)包括在半固体选择培养基上培养(d)中培养的愈伤组织直到遗传改造的子代浮萍是可视的。

26.权利要求1-25中任一项的方法，其中(e)的半固体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。

27.权利要求26的方法，其中(e)的半固体选择培养基包含DL-草胺膦、羧苄青霉素、cefotaxamin、基础盐和蔗糖。

28.权利要求27的方法，其中(e)的半固体选择培养基由10mg/L DL-草胺膦、200mg/L羧苄青霉素、500mg/L cefotaxamin、3.2g/L Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐和10g/L蔗糖组成。

29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述目标核酸包含可操作地连接至编码目标蛋白质的核酸的启动子。

30.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述目标核酸包含可操作地连接至编码人工微小RNA的核酸的启动子。

31.使用核酸瞬时转化浮萍的方法，该方法包括：

(a)在浮萍的分生组织中引入切口；

(b)用(i)包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮的感染培养基和(ii)工程改造的根癌农杆菌渗透所述切口，其中所述工程改造的根癌农杆菌包含目标核酸、可选择标记基因和可视报告基因，从而产生经渗透的浮萍；

(c)在包含选择物质和抗生素的液体选择培养基中培养经渗透的浮萍，从而产生经培养的渗透的浮萍；和

(d)鉴定(c)中表达所述可视报告基因的经培养的渗透的浮萍。

32.权利要求31的方法，其中所述根癌农杆菌是根癌农杆菌GV3101。

33.权利要求31或32的方法，其中所述浮萍是紫萍。

34.权利要求33的方法，其中所述紫萍是紫萍6581。

35.如权利要求31-34中任一项的方法，其中所述液体感染培养基包含硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮。

36.权利要求35的方法，其中所述感染培养基由硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮组成。

37.权利要求36的方法，其中所述感染培养基由10mM硫酸镁、10g/L蔗糖和100μΜ乙酰丁香酮组成。

38.权利要求31-37中任一项的方法，其中所述选择物质是DL-草胺膦。

39.权利要求31-38中任一项的方法，其中所述可视报告基因是绿色荧光蛋白。

40.权利要求31-39中任一项的方法，其中(c)的液体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。

41.权利要求40的方法，其中(c)的液体选择培养基包含DL-草胺膦、羧苄青霉素、cefotaxamin、基础盐和蔗糖。

42.权利要求41的方法，其中(c)的液体选择培养基由10mg/L DL-草胺膦、200mg/L羧苄青霉素、500mg/L cefotaxamin、3.2g/L Shenk和Hilderbrandt(SH)基础盐和10g/L蔗糖组成。

43.权利要求31-42中任一项的方法，其中(c)包括在液体选择培养基上培养经渗透的浮萍约2至4天。

44.权利要求31-43中任一项的方法，其中(d)包括使用荧光显微镜鉴定(c)中表达所述可视报告基因的经培养的渗透的浮萍。

45.权利要求31-44中任一项的方法，其中所述目标核酸包含可操作地连接至编码目标蛋白质的核酸的启动子。

46.权利要求31-44中任一项的方法，其中所述目标核酸包含可操作地连接至编码人工微小RNA的核酸的启动子。