ES2355818T7 - Uso de lignina peroxidasa en el aclaramiento de la piel y el pelo - Google Patents

Abstract

Un método no terapéutico para aclarar una región de piel o pelo de un sujeto, el método que comprende aplicar a la región de la piel o pelo por lo menos un tipo de una enzima de lignina peroxidasa de una forma apropiada para oxidar un pigmento contenido dentro de las células de la región de la piel o pelo.

Description

Uso de lignina peroxidasa en el aclaramiento de la piel y el pelo

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención está relacionada con métodos para producir lignina peroxidasa y su uso en el aclaramiento de la piel y el pelo.

Melanina

El color de la piel y del pelo humano está gobernado por la cantidad, calidad y distribución de la melanina, un pigmento que también está presente en plantas y microorganismos.

La síntesis de melanina es iniciada por el precursor L-tirosina que es transformado en un segundo precursor dopaquinona por medio de la acción de la tirosinasa. En la biosíntesis de la melanina de los mamíferos, este intermediario puede ser polimerizado por medio de dos rutas principales (Figura 1). La adición intramolecular nucleofílica del grupo amino da lugar al derivado de indol leucodopacromo que, después de la polimerización, produce el pigmento marrón oscuro a negro eumelanina. En presencia de compuestos tiol se forman derivados de tioéster de dopa; la reacción con cisteína produce cisteinildopa, que después de oxidación adicional y polimerización produce el pigmento amarillo a rojizo marrón faeomelanina. Como consecuencia, la eumelanina está principalmente compuesta de unidades de 5,6-dihidroxiindol (DHI) y 5,6-dihidroxiindol-2-ácido carboxílico (DHICA), mientras que faeomelanina contiene principalmente unidades de benzotiacina (Alaluf et al., 2001). La disponibilidad y proporción mutua de estos dos pigmentos influencia la composición química del pigmento polimérico.

La síntesis de melanina tiene lugar en gránulos, que se denominan melanosomas (Cooksey et al., 1997) que están presentes en células de melanocitos presentes en las capas basales de la epidermis; la síntesis de melanina en estas células es inducida por luz ultravioleta (UV). Después de la síntesis, la melanina migra a las células de la epidermis y allí es dispersada, donde la melanina es decolorada después del metabolismo de la dermis y después es descamada en forma de suciedad durante la renovación de la piel. La melanina tiene una importancia clínica ya que protege la piel de efectos adversos causados por la luz UV. Sin embargo, altos niveles de melanina pueden resultar en oscurecimiento no deseado de la piel y el pelo, mientras que la distribución heterogénea del mismo puede llevar a cloasma y aparición de pecas que pueden ser desagradables estéticamente.

Productos Aclaradores

Los productos aclaradores de la piel se han vuelto cada vez más populares en los últimos años. El principal propósito de los productos aclaradores de la piel es aclarar o blanquear la piel o para tratar problemas de pigmentación tales como cloasma, pecas, marcas del embarazo y manchas de la edad. Diversos tipos de productos aclaradores de la piel están disponibles actualmente.

Productos basados en la degeneración y muerte de las células de pigmento normalmente incluyen productos químicos fuertes, tales como hidroquinona, 4-isopropilcatecol, e hidroquinona monobencil éter, que promueven el blanqueado de la piel y el aclaramiento de la piel o el desvanecimiento de la pigmentación de la piel. Tales productos son normalmente ineficientes y pueden ser dañinos para la piel ya que una aplicación externa continua de estos productos puede llevar a leucoderma permanente y efectos secundarios tales como discromatosis y sarpullido.

Otros productos aclaradores se basan en la inhibición de la tirosinasa, la enzima que transforma el precursor Ltirosina en un segundo precursor dopaquinona. Este grupo de productos incluye Arbutin, un compuesto de glucosa hidroquinona que es capaz de inhibir la tirosinasa quelatando iones de cobre de esta forma suprimiendo la tautomerización de Dopacromo a DHICA.

El melanostato es otro producto aclarador que actúa a través de la tirosinasa. El melanostato es un péptido sintético que funciona desactivando la melanogénesis en melanocitos.

Varios compuestos antioxidantes que pueden inhibir la producción de melanina también son utilizados en los productos aclaradores. Ya que la síntesis de melanina involucra una reacción de oxidación, bloqueando la oxidación en varios puntos desde tirosina/DOPA a melanina a la larga inhibe la síntesis de melanina.

Un antioxidante que es utilizado para bloquear la síntesis de melanina es L-Ascórbico (vitamina C) que actúa como agente reductor en los intermediarios de melanina y bloquea reacciones oxidativas; otros antioxidantes utilizados por productos de aclaramiento incluyen bioflavonoides que son normalmente extraídos de mora o regaliz.

Los productos aclaradores del pelo actúan sobre la melanina dentro de la corteza del pelo. Existen varios químicos que pueden aclarar el pelo, entre ellos están incluidos el ácido hidroclórico, hipoclorito de sodio y peróxido de hidrógeno.

El químico más común usado para aclarar el pelo es el peróxido de hidrógeno. Para mantener la efectividad deseada, las soluciones de peróxido de hidrógeno deben ser estabilizadas usando compuestos tales como acetanilida, ácidos diluidos, sílice coloidal, p-hidroxibenzoatos, sulfato de oxiquinolina, fenacetina, y compuestos de estaño (estanato de sodio, hidróxido estánico, octoato estanoso). Antes de que el pelo sea aclarado, se agrega amoniaco a la solución de peróxido de hidrógeno para mejorar la penetración del peróxido de hidrógeno a través de la cutícula, la capa externa del pelo, y por lo tanto acelerar la reacción de oxidación.

JP 2002 012535 A (LION CORP) Enero 15 del 2002 (2002-01-15) divulga un método para aclarar una región de la piel o el pelo de un sujeto, el método comprende la aplicación de peroxidasa.

Mientras la presente invención se redujo a la práctica, los presentes inventores han descubierto que la isoenzima H1 lignina peroxidasa puede oxidar la melanina in vitro y puede adicionalmente aclarar la piel y el pelo in vivo.

Por lo tanto, la presente invención proporciona composiciones cosméticas y métodos que son altamente adecuados para la aclaración de piel y pelo.

Resumen de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método no-terapéutico de aclarar una región de la piel o pelo de un sujeto, que comprende aplicar a la región de la piel o al pelo por lo menos un tipo de enzima modificadora de lignina de una forma apropiada para oxidar un pigmento contenido dentro de las células de la región de la piel o del pelo.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición cosmética para aclarar una región de la piel o el pelo de un sujeto que comprende por lo menos un tipo de una enzima modificadora de lignina y un vehículo cosméticamente aceptable de acuerdo con la reivindicación 11.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona un kit para aclarar una región de la piel o eñ pelo que comprende un primer recipiente que incluye una enzima modificadora de lignina, y un segundo recipiente que incluye un aceptor de electrones.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona un artículo de manufactura que comprende un material de envasado y una composición cosmética identificada para aclarar una región de la piel o el pelo de un sujeto que está contenido dentro del material de envasado, la composición cosmética incluye, como principio activo, una enzima modificadora de lignina, y un vehículo cosméticamente aceptable.

De acuerdo con características adicionales en modalidades preferidas de la invención descrita más adelante, el método se lleva a cabo por medio de una aplicación tópica de una preparación que incluye por lo menos un tipo de enzima modificadora de lignina.

De acuerdo con otras características adicionales más en las modalidades preferidas descritas el método se lleva a cabo por medio de la administración por vía intradérmica o subcutánea de una preparación que incluye por lo menos un tipo de enzima modificadora de lignina.

De acuerdo con más características en las modalidades preferidas descritas la enzima modificadora de lignina está incluida en una composición formulada para la aplicación en la piel o el pelo. La enzima modificadora de lignina es lignina peroxidasa.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas la lignina peroxidasa es isoenzima H1 o una forma modificada de isoenzima H2.

De acuerdo con características adicionales en las modalidades preferidas descritas la composición cosmética comprende adicionalmente un aceptor de electrones.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el aceptor de electrones es peróxido de hidrógeno.

De acuerdo con características adicionales en las modalidades preferidas descritas la composición cosmética comprende adicionalmente alcohol veratrílico.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas la composición comprende por lo menos un tipo de agente de penetración epidérmico.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas la composición comprende por lo menos un tipo de agente de penetración de pelo.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el método se lleva a cabo durante un periodo de tiempo seleccionado de acuerdo con un nivel de aclarado deseado.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el vehículo cosméticamente aceptable incluye transcutol y/o butilenglicol.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el vehículo cosméticamente aceptable incluye alcanolaminas.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas la lignina peroxidasa en la composición cosmética se proporciona a una concentración de por lo menos 1U/g.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el peróxido de hidrógeno en la composición cosmética se proporciona a una concentración de por lo menos el 0,005 %.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el alcohol veratrílico en la composición cosmética se proporciona a una concentración de por lo menos el 0,05 %.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el primer recipiente del kit para aclarar una región de piel o el pelo comprende adicionalmente alcohol veratrílico.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el primer y/o segundo recipiente(s) del kit para aclarar una región de piel o el pelo incluye adicionalmente un vehículo cosméticamente aceptable para la penetración epidérmica.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el primero y/o segundo recipiente(s) del kit para aclarar una región de la piel o el pelo incluye adicionalmente un vehículo cosméticamente aceptable adecuado para la penetración del pelo.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el uso de un polinucleótido que codifica una enzima de lignina peroxidasa para aclarar una región de la piel de un sujeto, el método que comprende, expresar dentro de las células de la región de la piel una enzima de lignina peroxidasa de una forma adecuada para oxidar un pigmento contenido dentro de las células de la región de la piel.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el método comprende adicionalmente un paso para proporcionar a las células de la región de la piel un aceptor de electrones.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el aceptor de electrones es peróxido de hidrógeno.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el método comprende adicionalmente un paso para proporcionar a las células de la región de la piel alcohol veratrílico. La expresión se realiza introduciendo en las células un vector de expresión capaz de expresar la enzima modificadora de lignina.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el vector es un vector viral.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el vector comprende un promotor enlazado funcionalmente a una secuencia codificadora de enzima modificadora de lignina. La enzima modificadora de lignina es lignina peroxidasa.

La lignina peroxidasa es codificada por la secuencia polinucleotídica expuesta en NO:1.

La lignina peroxidasa se puede obtener mediante un proceso que comprende: (a) cultivar el hongo Phanerochaete chrysosporium sobre una matriz porosa en un medio de cultivo agitado y aireado que contiene glicerol durante un periodo de tiempo predeterminado; (b) después del periodo de tiempo predeterminado se extrae una fracción soluble del hongo Phanerochaete chrysosporium para de esta forma producir la lignina peroxidasa.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el medio de cultivo carece de iones de manganeso.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el cultivo aireado se obtiene sometiendo el medio de cultivo a una velocidad de aireación en el intervalo de 0,1-1 litro por litro por minuto.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el cultivo se realiza a una temperatura de 37 °C .

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el medio de cultivo agitado se obtiene agitando el medio de cultivo a una velocidad en el intervalo de 50-300 rpm.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el medio de cultivo agitado se obtiene agitando el medio de cultivo a una velocidad de 100 rpm.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el periodo de tiempo predeterminado se selecciona del intervalo de 3-10 días.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el periodo de tiempo predeterminado es 7 días.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el glicerol se proporciona a un intervalo de concentración de 3-20 gramos por litro.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el glicerol se proporciona a una concentración de 6 gramos por litro.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el medio de cultivo incluye adicionalmente alcohol veratrílico.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el alcohol veratrílico se proporciona a un intervalo de concentración de 0,5-4 mM.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el alcohol veratrílico se proporciona a una concentración de 2 mM.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas la lignina peroxidasa es la isoenzima H1 o una forma modificada de la isoenzima H2.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas la matriz porosa es una espuma de poliuretano.

Mediante este proceso se puede obtener un extracto acuoso del hongo Phanerochaete chrysosporium que exhibe actividad enzimática de lignina peroxidasa en el intervalo de 500-2000 unidades por litro.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas la actividad de la lignina peroxidasa es de 1500 unidades por litro.

De acuerdo con más características adicionales en las modalidades preferidas descritas la actividad enzimática de la lignina peroxidasa es isoenzima H1 o una forma modificada de isoenzima H2.

La presente invención trata con éxito los defectos de las configuraciones conocidas actualmente al proporcionar métodos eficientes y composiciones para aclarar una región de la piel o el pelo de un sujeto.

A menos que sea definido de otra forma, todos los términos científicos y técnicos usados aquí tienen el mismo significado como comúnmente entiende alguien con habilidades ordinarias en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí se pueden usar en la práctica o en las pruebas de la presente invención, más adelante se describen métodos y materiales aceptables. En caso de conflicto prevalecerá la especificación de la patente, incluyendo definiciones. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describe aquí solamente mediante ejemplos con referencia a los dibujos acompañantes. Haciendo ahora referencia específica a los dibujos en detalle, se hace hincapié en que los casos particulares mostrados son a modo de ejemplo y solo para fines de discusión ilustrativa de las modalidades preferidas de la presente invención, y se presentan con edl fin de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácilmente entendida de los principios y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto, no se pretende mostrar detalles estructurales de la invención en más detalle de lo necesario para un entendimiento fundamental de la invención, y la descripción tomada junto con los dibujos revela a los expertos en la técnica cómo se pueden realizar en la práctica varias formas de la invención.

En los dibujos:

La FIG. 1 es una ilustración esquemática de la técnica anterior de la biosíntesis de la melanina de mamífero adoptada de Alauf et al., 2001.

La FIG. 2 ilustra el tanque de reactor por agitación (STR) para la producción de lignina peroxidasa por Phanerochaete chrysosporium inmovilizado en espuma de poliuretano.

La FIG. 3 ilustra la actividad de LIP en un cultivo fermentador de P. Chrysosporium en función de la edad del cultivo.

P. Chrysosporium se cultivó en un fermentador STR tal como se describe en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos y la actividad LIP se sometió a ensayo en el fluido extracelular siguiendo la oxidación de alcohol veratrílico a aldehído veratrílico tal como se describe en los Ejemplos. Las barras de error representan desviaciones estándar de las 3 ráplicas de los experimentos.

La FIG. 4 ilustra la oxidación de melanina, a una concentración inicial de 70,5 µg/ml, por LIP (0,48 µM) en función de las concentraciones crecientes de peróxido de hidrógeno en presencia de 1,5 mM de alcohol veratrílico en 50 mM de tampón de tartrato, a un pH de 3,5. La oxidación de melanina se determinó midiendo su absorbancia a 460 nm, al principio de la reacción enzimática y después de 160 segundos, y se calcularon los porcentajes de melanina oxidada. Las barras de error representan las desviaciones estándar de las 3 réplicas de losexperimentos.

La FIG. 5 ilustra el efecto de las concentraciones crecientes de peróxido de hidrógeno sobre la oxidación de melanina por LIP. El grado de oxidación de melanina se visualiza mediante la disminución de la intensidad del color en comparación con la reacción enzimática sin la inclusión de peróxido de hidrógeno (0 µM). Los números debajo de la foto indican las concentraciones de H2O2 expresados en µM.

La FIG. 6 ilustra el grado de oxidación de diferentes concentraciones de melanina por LIP (0,48 µM) en 50 mM de tampón de tartrato a un pH de 3,5 en presencia de alcohol veratrílico (1,5 mM) y peróxido de hidrógeno (600 µM). Las barras de error representan las desviaciones estándar de 3 réplicas de los experimentos.

La FIG. 7 ilustra el grado de oxidación de melanina en función de las concentraciones de LIP. La oxidación de melanina (70 µg/ml) se realizó aumentando las concentraciones de LIP en presencia de alcohol veratrílico (1,5 mM) y peróxido de hidrógeno (700 µM) en 50 mM de tampón de tartrato a un pH de 3,5. Las barras de error representan las desviaciones estándar de 3 réplicas del experimento.

Las FIGs. 8a-b ilustran la visualización de la oxidación de melanina por LIP cuando se usa en la formulación de una crema. La decoloración de la melanina se observa después de agregar la crema activadora a la crema LIP (Figura 8b) pero no solo en presencia de la crema LIP (Figura 8a).

Las FIGs. 9a-b ilustran el efecto de la crema LIP en el blanqueamiento de la piel. Se muestra una fotografía de la mano de una mujer tomada una semana después de la aplicación de LIP (dos veces al día) en una formulación de crema. El área tratada con LIP (la Figura 9a, en un circulo negro) es mucho más clara que el resto de la piel de la mano (Figura 9b).

La FIG. 10 ilustra el efecto de LIP en el blanqueamiento del pelo in vivo. Se remojó el pelo de una mujer durante 1 hora en 50 mM de tampón de carbonato con un pH de 11,5. El pelo se pre-incubó durante 10 segundos con 25 U de LIP y se sumergió durante 1 hora en tampón de tartrato con un pH de 3,5 con alcohol veratrílico (1,5 mM) y peróxido de hidrógeno (8.8 mM). Un efecto aclarador significativo se observó en el pelo tratado con LIP (la Figura 10, tubo derecho) comparado con el pelo tratado con la misma solución sin LIP (la Figura 10, tubo izquierdo).

Las FIGs. 11a-b son fotografías a color del antebrazo derecho del sujeto de estudio No. 1 que ilustra el efecto de la crema blanqueadora LIP en la pigmentación de la piel. La Figura 11a – una fotografía tomada el día 0; La Figura 11b- una fotografía tomada el día 21.

Las FIGs. 12a-c ilustran el efecto de LIP o cremas de hidroquinona en el blanqueamiento de la piel en el sujeto de estudio No. 1. Las cremas de LIP o hidroquinona se aplicaron en las partes superiores del antebrazo derecho e izquierdo en intervalos de 7 días usando Derma Spectrometer. La Figura 12a- aplicación de crema LIP; La Figura 12b- aplicación de crema de hidroquinona; columnas azules = parte superior del antebrazo derecho tratado con la crema LIP; columnas azul claro = parte inferior den antebrazo derecho no tratado; columnas rosadas = parte superior del antebrazo izquierdo tratado con Hidroquinona; columnas blancas = parte inferior no tratada del antebrazo izquierdo; La Figura 12c es una gráfica lineal que compara la disminución en la pigmentación de la piel en los antebrazos superiores después de 21 días de tratamiento usando la crema LIP (la Figura 12c, línea azul) o la crema de hidroquinona (la Figura 12c, línea rosada). Nótese la drástica disminución en la pigmentación de la piel después de 21 días de tratamiento usando la crema LIP como se compara con la disminución moderada usando la crema de hidroquinona.

Las FIGs. 13a-b son fotografías a color del antebrazo derecho del sujeto No. 10 del estudio que ilustran el efecto de la crema blanqueadora de LIP en la pigmentación de la piel. La Figura 13a – una fotografía tomada el día 0; la Figura 13b – una fotografía tomada el día 21.

Las FIGs. 14a-c ilustran el efecto de las cremas de LIP o hidroquinona en el blanqueamiento de la piel en el sujeto No. 10 del estudio. Las cremas de LIP o hidroquinona se aplicaron en las partes superiores de los antebrazos derecho e izquierdo mientras que las partes inferiores no fueron tratadas. El grado de pigmentación de la piel se midió en ambos antebrazos en intervalos de 7 días usando el Derma Spectrometer. La Figura 14a- aplicación de la crema de LIP; La Figura 14b- aplicación de crema de hidroquinona; columnas azules = parte superior del antebrazo derecho tratado con la crema de LIP; columnas azul claro = parte inferior no tratada del antebrazo derecho, columnas rosadas = parte superior del antebrazo izquierdo tratado con hidroquinona; columnas blancas = parte inferior no tratada del antebrazo izquierdo; La Figura 14c es una gráfica lineal que compara la disminución en la pigmentación de la piel de los antebrazos superiores después de 21 días de tratamiento usando la crema de LIP (Figura 14c, línea azul) o la crema de hidroquinona (Figura 14c, línea rosada). Nótese la disminución drástica en la pigmentación de la piel después de 21 días de tratamiento usando la crema de LIP comparado con la disminución moderada usando la crema de hidroquinona.

Las FIGs. 15a-b son gráficas lineales que ilustran el efecto promedio de las cremas de LIP e hidroquinona en el blanqueamiento de la piel en los 12 sujetos del estudio. La Figura 15a – las puntuaciones promedio de pigmentación; la Figura 15b – la disminución promedio en la pigmentación como una fracción de la puntuación inicial de pigmentación.

Descripción de las modalidades preferidas

La presente invención es de métodos no terapéuticos y composiciones cosméticas que se pueden usar para aclarar una región de la piel o el pelo de un sujeto.

Particularmente, los métodos de la presente invención se pueden usar para tratar complexiones de piel no uniformes que resultan alteraciones medicas relacionadas con hiperpigmentación tales como melasma, cloasma, manchas por la edad, pecas, ocronosis y lentigo.

Los principios y el funcionamiento de la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y las descripciones que les acompañan.

Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados en los Ejemplos. La invención es susceptible de otras modalidades o de practicarse o realizarse de varias formas. También, debe entenderse que la fraseología y terminología usadas aquí son para fines de la descripción y no debe ser vistas como limitantes.

El grado de pigmentación de la piel es una fuente de preocupación entre la población general. Algunas personas sufren de manchas de edad y marcas de embarazo y desean que los puntos pigmentados sean menos pronunciados. Otras personas tienen pecas, cloasma, melasma, ocronosis y lentigo que usualmente se tratan con productos aclaradores de la piel que aclaran y suavizan la pigmentación de la piel. Sin embargo, los productos actuales para aclarar la piel son químicos fuertes tales como hidroquinona que pueden conducir a leucoderma permanente y efectos secundarios tales como discromatosis y sarpullido, o no son lo suficientemente eficientes en el aclaramiento de la piel. Entre ellos hay productos basados en la inhibición de la tirosinasa, la enzima que transforma el precursor L-tirosina en un segundo precursor dopaquinona y por lo tanto inhibe la biosíntesis de melanina. Otros productos son diseñados para bloquear las reacciones de oxidación en varios puntos de tirosina/DOPA a melanina y a la larga inhiben la síntesis de melanina. El último grupo de productos incluye antioxidantes tales como L-Ascórbico (Vitamina C) y bioflavonoides.

Los productos aclaradores del pelo utilizan altas concentraciones de peróxido de hidrógeno en conjunción con amoniaco. Estos productos pueden ser una fuente de molestia para el sujeto tratado.

Como se ilustra claramente en la sección de Ejemplos que sigue a continuación, los presentes inventores han descubierto que la lignina peroxidasa, y en particular su isoforma H1, puede oxidar eficientemente la melanina y por lo tanto puede ser utilizada para aclarar la piel o el pelo de un sujeto.

Aunque la Pat. U.S. No. 5,578,296 identificó la capacidad de descomposición de la melanina en el hongo Basidiomycetes y sugirió el uso de este hongo para tratar cloasma y pecas, hasta la fecha, la enzima específica responsable por la descomposición de melanina en el hongo no ha sido descubierta.

Por lo tanto de acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método de aclarar una región de la piel o el pelo de un sujeto.

El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención se realiza aplicando a la región de la piel o el pelo del sujeto por lo menos un tipo de una enzima de lignina peroxidasa de una forma apropiada para oxidar un pigmento (por ejemplo, melanina) contenido dentro de las células de la región de la piel o del pelo.

Como es usado aquí, la frase “aclarar una región de la piel o el pelo” hace referencia a reducir el tono o color de la piel o del pelo reduciendo la cualidad de pigmentación o la concentración de pigmento de melanina contenido.

Como es usado aquí, la frase “sujeto” hace referencia a mamíferos, normalmente humanos, y preferiblemente aquellos que tienen exceso de pigmentación en la piel o el pelo, o imperfecciones de la piel tales como pecas etc.

La enzima modificadora de lignina utilizada por la presente invención es lignina peroxidasa, que desempeña un papel importante en la degradación de la lignina. La secuencia amino de sitio activo de ésta peroxidasa modificadora de lignina y el mecanismo por el cual oxida sustratos es similar a aquella de la peroxidasa del rábano (HRP) y la peroxidasa de la soja (SBP). Las peroxidasas modificadoras de lignina son capaces de catalizar la oxidación de sustratos con alto potencial de reducción. Esta habilidad única es consistente con un sitio activo sehemo de baja densidad de electrones, que se indica por el alto potencial de reducción [Cai y Tien (1993). J Biotechnol 30: 79-90].

Aunque cualquier isoforma de lignina peroxidasa conocida en la técnica puede ser utilizada por la presente invención (Rothschild et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 857-861), la presente invención preferiblemente utiliza la isoforma H1 ya que, como se explica en la sección de Ejemplos que sigue a continuación, esta isoforma exhibió actividades de oxidación de melanina tanto in vitro como in vivo.

Se pueden usar varios enfoques para preparar la enzima modificadora de lignina utilizada por la presente invención.

Por ejemplo, la isoenzima H1 de lignina peroxidasa se puede preparada a partir del hongo Phanerochaete chrysosporium. Se pueden producir altos niveles de actividad enzimática de lignina peroxidasa del hongo mencionado cuando se cultiva en un tanque reactor fermentador por agitación (STR) mientras que es inmovilizado en espuma de poliuretano o en suspensión (Dosoretz et al., 1993, Appl Environ Microbiol. 59: 1919-26).

De acuerdo con las modalidades preferidas de la presente invención el fermentador se conecta a un sistema de enfriamiento para mantener una temperatura de cultivo de 37 °C y se agita a una velocidad de 50-300 rpm, más preferiblemente a 100-200 rpm, más preferiblemente a 160 rpm. Para aumentar el rendimiento de la actividad de la lignina peroxidasa el fermentador es aireado a una velocidad de aireación de 0,1-1 litro de aire por litro de medio de cultivo por minuto. De acuerdo con las configuraciones presentemente preferidas el fermentador es aireado a una velocidad de aireación de 0,2 litros de aire por litro de medio de cultivo por minuto.

Como se describe en Materiales y Métodos Experimentales de la sección de Ejemplos que sigue, el Planerochaete chrysosporium se cultiva bajo condiciones de cultivo desprovistas de iones de manganeso y que contienen glicerol como fuente de carbono. Preferiblemente, el glicerol de la presente invención se proporciona a un intervalo de concentración de 3-20 gramos por litro. De acuerdo con configuraciones preferidas actualmente el glicerol se proporciona a una concentración de 6 gramos por litro.

Durante el proceso de purificación de la isoenzima H1 de lignina peroxidasa del hongo arriba mencionado la actividad enzimática de la proteína purificada se analizó adicionalmente mediante el cambio de la absorbancia a 310 nm que se produce debido a la oxidación del alcohol veratrílico a aldehído veratrílico.

Ya que la isoenzima H1 de lignina peroxidasa puede resultar de una desfosforilación post-translacional de la isoenzima H2 (Kuan y Tien, 1989), la lignina peroxidasa usada por la presente invención puede ser preparada defosforilando la isoenzima H2 de lignina peroxidasa.

Enzimas modificadoras de lignina usadas por la presente invención también pueden extraerse de células bacterianas modificadas para expresar la enzima modificadora de lignina como se divulga en la patente US 5,200,338. Por ejemplo, una célula bacteriana, tal como, E.coli, puede ser transformada con un vector de expresión que incluye la secuencia codificadora de LIP (SEQ ID NO:1) posicionado bajo el control regulatorio de un fuerte promotor constitutivo (por ejemplo, SP6). Después de la expresión, las células bacterianas se pueden lisar y el LIP se puede recolectar usando técnicas cromatográficas (véase, Billman-Jacobe, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:500-4; Harris y Emtage, 1986, Microbiol, Sci. 3: 28-31, para más detalles).

Enzimas modificadoras de lignina usadas en la presente invención también pueden ser extraídas de líneas celulares de mamífero tales como células HeLa. En este caso la secuencia codificadora de LIP esta ubicada bajo un fuerte promotor de mamífero (por ejemplo, CMV) en un vector de expresión apropiado (por ejemplo, pCDNA3.1, Invitrogen Life Technologies, Frederick, MD, USA). Después de la transfección de células HeLa con el vector de expresión, el producto de expresión LIP se puede extraer de las células o del medio (por ejemplo, modificando la secuencia de LIP para incluir una señal de secreción) por purificación convencional y técnicas cromatográficas (véase Cunha y Aires-Barros, 2002. Mol. Biotechnol. 20: 29-40 para más detalles).

Aunque la enzima modificadora de lignina puede ser aplicada a la piel o el pelo sin necesitar la co-aplicación de compuestos adicionales, la capacidad de aclarado de la enzima modificadora de lignina LIP es mejorada cuando se aplica en presencia de un aceptor de electrones (es decir una molécula capaz de oxidar un sustrato), que sirve como un activador de oxidación, y/o en presencia de compuestos fenolicos, tales como alcohol veratrílico (Harvey et al., 1992, Biochem Soc Trans 20: 345-9), y veratrol que sirven como los mediadores de oxidación (Ward et al., Enzyme and Microbial Technology (2002), 30: 490-498).

Por lo tanto, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la enzima modificadora de lignina es aplicada previamente, concomitante o subsecuente a la aplicación de un activador de oxidación, tal como peróxido de hidrógeno un mediador de oxidación, tal como alcohol veratrílico.

La enzima modificadora de lignina puede ser aplicada a la piel o el pelo per se, sin embargo, para lograr un aumento en la eficiencia del aclarado, la enzima modificadora de lignina se incluye preferiblemente en una composición cosmética que está formulada para uso un específico, tal como, por ejemplo, aclaramiento general de la piel, aclaramiento de pecas o aclaramiento del pelo. Estas composiciones cosméticas pueden incluir agentes de penetración epidérmicos tales como butilenglicol y transcutol, y agentes de penetración del pelo tales como alcanolaminas.

Como es usado aquí una “composición cosmética” hace referencia a una preparación que incluye los principios activos descritos anteriormente (por ejemplo, LIP) y componentes químicos adicionales tales como vehículos fisiológicamente apropiados y excipientes, un activador oxidativo y/o un mediador oxidativo. El propósito de una composición cosmética es facilitar la administración del principio activo a un organismo.

Más adelante, las frases “vehículo adecuado” usadas para hacer referencia a un vehículo o un diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y que no anula la actividad biológica y propiedades de la enzima modificadora de lignina.

Aquí el término “excipiente” hace referencia a una sustancia inerte agregada a una composición cosmética para facilitar la administración del principio activo. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicol.

La composición cosmética puede ser aplicada de forma local, por ejemplo, por medio de administración de la composición cosmética directamente en una región del tejido de un paciente. Rutas aceptables de administración pueden, por ejemplo, incluir inyecciones tópicas, subcutáneas e intradérmicas.

Composiciones cosméticas de la presente invención pueden fabricarse mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos de mezclado, disolución, granulación, levigación, emulsificación, encapsulación, aprisionado o liofilización.

Composiciones cosméticas para uso de acuerdo con la presente invención por lo tanto pueden formularse de forma convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente activos que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los principios activos en las preparaciones. La formulación apropiada depende de la propuesta de administración elegida.

Para inyección, los principios activos de la composición cosmética pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o tampón de sal fisiológico.

Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constituir con un vehículo adecuado, antes de usar, por ejemplo, una solución estéril, libre de pirógenos de base acuosa.

La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está fácilmente dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la divulgación detallada que se proporciona aquí.

Para cualquier preparación usada en los métodos de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva o dosis puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos in vitro. Como se muestra aquí en la sección de Ejemplos las concentraciones de LIP y peróxido de hidrógeno podrían ser optimizadas a partir de ensayos in vitro y pueden ser posteriormente adaptadas para un uso in vivo. Adicionalmente, una dosis puede formularse en sistemas de cultivo de tejido o en modelos de animales para lograr una concentración deseada o una valoración. Tal información puede ser usada para determinar con mayor exactitud dosis útiles en seres humanos.

Dependiendo en la severidad del problema de pigmentación de la piel (por ejemplo, cloasma, melasma, ocronosis y lentigo) y la respuesta de la piel, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones, con una duración del curso de tratamiento que va desde varios días a varias semanas o hasta que se produzca la curación o se logre la disminución del problema de la piel.

La cantidad de composición que debe administrarse será, por supuesto, dependiente del sujeto tratado, de la severidad de la afección, de la forma de administración, del juicio del médico que la prescribe, etc.

La enzima modificadora de lignina incluida en la composición cosmética de la presente invención también se puede proporcionar a concentraciones más altas y prescribirla un médico como composición farmacéutica para tratar problemas de pigmentación de la piel tales como melasma, cloasma, ocronosis, y lentigo.

A continuación se da una descripción de formulaciones que incorporan una enzima modificadora de lignina y están formuladas para el aclaramiento de la piel o del pelo.

Aclaramiento de la Piel

Para optimizar y controlar el aclaramiento de la piel, la enzima modificadora de lignina se incluye preferiblemente en una composición cosmética que está formulada con fines de aclaramiento de la piel.

Ya que la composición cosmética aclaradora de la piel de la presente invención es utilizada in vivo, la composición es preferiblemente de alta pureza y está sustancialmente libre de contaminantes potencialmente peligrosos, por ejemplo, por lo menos con grado Nacional de Alimentos (NF), generalmente por lo menos de grado analítico, y preferiblemente por lo menos de grado farmacéutico. En la medida en que un compuesto dado deba ser sintetizado antes de su uso, tal síntesis o purificación subsiguiente debe dar como resultado preferiblemente un producto que esté sustancialmente libre de cualquier potencial agente tóxico contaminante que pueda usarse durante la síntesis o procedimientos de purificación.

Principio Activo

La lignina peroxidasa, es incluida en la composición cosmética de la presente invención a una concentración seleccionada de un intervalo de 1-100 U/g. De acuerdo con las configuraciones actualmente conocidas la enzima modificadora de lignina incluida en la composición cosmética de la presente invención se proporciona a una concentración seleccionada de un intervalo de 5-100 U/g. Se apreciará, que una concentración preferida de la enzima modificadora de lignina se selecciona de acuerdo al uso específico de la composición, por lo tanto, para el aclaramiento general de la piel, se utiliza una concentración preferida de 5-20 U/g, mientras que para aclaramiento de pecas, se utiliza un intervalo más amplio de concentración de 5-100 U/g.

El aceptor de electrones (activador de oxidación), usado por la composición cosmética de aclaramiento es preferiblemente peróxido de hidrógeno proporcionado a una concentración de por lo menos el 0,005 %. El peróxido de hidrógeno es estable, pero se descompone bajo condiciones neutras o alcalinas para formar agua y una especie activa de oxígeno. Las especies activas de oxígeno son muy reactivas.

La composición cosmética preferiblemente se tampona a un pH de 4 o menos ya que la lignina peroxidasa es solo activa a un pH menor de 4, preferiblemente a un pH 2,5-3,5 y el peróxido de hidrógeno es estable a tales pH..

Se puede emplear cualquier tampón capaz de mantener un pH de 4 o menos. Por lo tanto, los tampones que usan ácido acético, ácido tartárico, ácido fosfórico o ácido cítrico se pueden usar por la composición cosmética aclaradora de la piel.

Como se muestra en la sección de Ejemplos más adelante, el peróxido de hidrógeno de la presente invención es estabilizado a un pH de 3,5 con ácido fosfórico.

Los mediadores de oxidación usados por la presente invención son pequeñas moléculas aromáticas o más específicamente compuestos metoxilados que aumentan el potencial oxidativo y la estabilidad de la enzima modificadora de lignina. Los mediadores preferidos de oxidación usados por la presente invención son alcohol veratrílico y veratrol.

Como se muestra en la sección de Ejemplos, el alcohol veratrílico incluido en la composición cosmética de la presente invención se diluye preferiblemente en agua a una concentración de por lo menos el 0,05 %.

Agentes de penetración epidérmicos

Para mejorar la absorción percutánea de los principios activos (por ejemplo, LIP), uno o más de diversos agentes puede ser agregado a la composición cosmética incluyendo, pero no limitado a, dimetilsulfóxido, dimetilacetamida, dimetilformamida, surfactantes, azono, alcohol, acetona, propilenglicol y polietilenglicol.

Como es ilustrado en la sección de Ejemplos que sigue a continuación, la enzima modificadora de lignina, LIP, y el activador, peróxido de hidrógeno, preferiblemente sed mezclan con agentes de penetración epidérmicos tales como butilenglicol y transcutol, respectivamente, de una forma y concentración optimizada para mejorar la penetración de LIP en la piel. El butilenglicol usado por la presente invención se proporciona a una concentración de por lo menos el 1 % y el transcutol se proporciona a una concentración de por lo menos el 3 %.

Vehículos

Además de la cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente divulgado aquí, la composición cosmética de este aspecto de la presente invención también incluye un vehículo dermatológicamente aceptable.

La frase “vehículo dermatológicamente aceptable”, hace referencia a un vehículo que sea apropiado para la aplicación tópica sobre la piel, es decir, tejido queratinoso, tiene buenas propiedades estéticas, es compatible con los agentes activos de la presente invención y cualquier otro componente, y es seguro y no-tóxico para su uso en mamíferos. Una cantidad efectiva de vehículo es seleccionada de un intervalo de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 99,99 %, preferiblemente desde aproximadamente el 80 % a aproximadamente 99,9 %, más preferiblemente desde aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 98 %, y más preferiblemente desde aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 95 %, por peso, de la composición.

Emulsiones

El vehículo utilizado en las composiciones de la invención puede encontrarse en una gran variedad de formas. Estas incluyen vehículos en emulsión, que incluyen, pero no están limitados a, emulsiones de aceite-en-agua, agua-enaceite, agua-en-aceite-en-agua, y aceite-en-agua-en-silicona, una crema, una pomada, una loción o un aerosol. Como ha de entenderse por el técnico diestro, un componente dado va a distribuirse principalmente en la fase de agua o de aceite/silicona, dependiendo en la solubilidad/dispersabilidad del agua del componente en la composición.

Las emulsiones de acuerdo con la presente invención generalmente contienen una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente divulgado aquí y un lípido o aceite. Los lípidos y aceites pueden ser derivados de animales, plantas, o petróleo y pueden ser naturales o sintéticos (es decir, hechos por el hombre). Emulsiones preferidas también contienen un humectante, como glicerina. Las emulsiones preferiblemente contienen adicionalmente desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 %, más preferiblemente desde aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 5 %, de un emulsificador, basado en el peso del vehículo. Los emulsificadores pueden ser noiónicos, aniónicos o catiónicos. Emulsificadores adecuados se describen en, por ejemplo, la Pat. U.S. No. 3,755,560, concedida a Dickert, et al. Agosto. 28, 1973; Pat. U.S. No. 4,421,769, concedido a Dixon, et al., Dic. 20, 1983; y McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers, North American Edition, páginas 317-324(1986).

La emulsión también puede contener un agente anti-espumante para minimizar la formación de espuma al aplicar en el tejido queratinoso. Los agentes anti-espumantes incluyen siliconas de alto peso molecular y otros materiales bien conocidos en la técnica para ese uso.

Emulsiones adecuadas pueden tener un amplio intervalo de viscosidades, dependiendo de la forma del producto deseada. Emulsiones a modo de ejemplo de baja viscosidad, que son preferidas, tienen una viscosidad de aproximadamente 50 centistokes o menos. La emulsión puede también contener un agente anti-espumante para minimizar la formación de espuma durante la aplicación al tejido queratinoso. Agentes anti-espumantes incluyen siliconas de alto peso molecular y otros materiales bien conocidos en la técnica para tal uso.

Un tipo de emulsión es una emulsión de agua-en-silicona. Las emulsiones de agua-en-silicona contienen una fase continua de silicona y una fase acuosa dispersa. Emulsiones preferidas de agua-en-silicona de la presente invención comprenden desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 60 %, preferiblemente desde aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 40 %, más preferiblemente desde aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 20 %, por peso de una fase de silicona continua. La fase continua de silicona existe como una fase externa que contiene o rodea la fase acuosa discontinua descrita más adelante.

La fase continua de silicona puede contener aceite de poliorganosiloxano. Un sistema de una emulsión preferida de agua-en-silicona se formula para proporcionar un vehículo oxidativamente estable para la entrega de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente revelado aquí. La fase continua de silicona de estas emulsiones preferidas comprende entre aproximadamente el 50 % y aproximadamente el 99,9 % por peso de aceite de organopolisiloxano y menos de aproximadamente el 50 % por peso de un aceite de no-silicona. En una modalidad especialmente preferida, la fase continua de silicona comprende por lo menos aproximadamente el 50 %, preferiblemente desde aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 99,9 %, más preferiblemente desde aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 99,9 %, y aún más preferiblemente desde aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 99,9 %, el aceite de poliorganosiloxano por peso de la fase continua de silicona, y hasta aproximadamente 50 % de aceites de no silicona, preferiblemente menos de aproximadamente el 40 %, más preferiblemente menos de aproximadamente el 30 %, aún más preferiblemente menos de aproximadamente el 10 %, y más preferiblemente menos de aproximadamente el 2 %, por peso de la fase continua de silicona. Estos sistemas útiles de emulsión pueden proporcionar más estabilidad oxidativa sobre periodos extensos de tiempo que comparado con emulsiones de agua-en-aceite que contienen concentraciones más bajas de aceite poliorganosiloxano. Las concentraciones de los aceites de no silicona en la fase de silicona continua se minimizan o evitan del todo para de esta forma posiblemente mejorar aún más la estabilidad oxidativa del compuesto activo de la invención en las composiciones. Emulsiones de agua-en-silicona de este tipo se describen en la Pat. U.S. No. 5,691,380 para Mason et al., edición de Nov. 25, 1997.

El aceite organopolisiloxano para ser usado en la composición puede ser volátil, no-volátil, o una mezcla de siliconas volátiles y no-volátiles. El término “no volátil” como es usado en este contexto hace referencia a aquellas siliconas que son líquidas bajo condiciones ambientales y tienen un punto de inflamación (bajo una atmósfera de presión) de

o superior a aproximadamente 100 grados centígrados. El término “volátil” como es usado en este contexto hace referencia a todos los otros aceites de silicona. Organopolisiloxanos adecuados pueden ser seleccionados de una amplia variedad de siliconas que cubren un amplio intervalo de volatilidades y viscosidades. Ejemplos de aceites organopolisiloxanos apropiados incluyen polialquilsiloxanos, polialquilsiloxanos cíclicos, y polialquilsiloxanos, que son conocidos para los expertos en la técnica y están comercialmente disponibles.

La fase continua de silicona puede contener uno o más aceites de no silicona. Concentraciones de aceites de nosilicona en la fase continua de silicona son preferiblemente minimizados o evitados por completo para mejorar aún más la estabilidad oxidativa del agente farmacéuticamente efectivo en las composiciones. Aceites de no silicona adecuados tienen un punto de fusión de aproximadamente 25 °C o menos bajo aproximadamente una atmosfera de presión. Ejemplos de aceites de no silicona adecuados para el uso en la fase continua de silicona son aquellos bien conocidos en las técnicas químicas en productos del cuidado personal tópicos en la forma de emulsiones agua-enaceite, por ejemplo, aceite mineral, aceites vegetales, aceites sintéticos, aceites semi-sintéticos, etc.

Composiciones tópicas útiles de la presente invención comprende desde aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 90 %, más preferiblemente desde aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 85 %, y más preferiblemente desde aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 % de una fase acuosa dispersa. El término “fase dispersa” es bien conocido a alguien diestro en la técnica e implica que la fase existe como partículas pequeñas o gotas que se suspenden en una fase continua o están rodeadas por ella. La fase dispersa también es conocida como la fase interna o discontinua. La fase acuosa dispersa es una dispersión de pequeñas partículas acuosas o gotas suspendidas en y rodeadas por la fase continua de silicona descrita anteriormente. La fase acuosa puede ser agua, o una combinación de agua o uno o más principios solubles en agua o dispersables. Ejemplos no limitantes de tales principios opcionales incluyen espesantes, ácidos, bases, sales, quelantes, gomas, alcoholes solubles en agua o dispersables y polioles, tampones, preservativos, agentes bloqueadores solares, colorantes, y similares.

Las composiciones tópicas de la presente invención normalmente comprenden desde aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 90 %, preferiblemente desde aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 80 %, más preferiblemente desde aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 80 %, agua de la composición en la fase acuosa dispersada por peso.

Las emulsiones de agua-en-silicona de la presente invención preferiblemente comprenden un emulsificante. En una modalidad preferida, la composición contiene desde aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 % de emulsificante, más preferiblemente desde aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 7,5 %, más preferiblemente desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 %, emulsificante por peso de la composición. El emulsificante ayuda a dispersar y suspender la fase acuosa dentro de la fase de silicona continua.

Una amplia variedad de agentes emulsionantes se pueden usar aquí para formar la emulsión de agua-en-silicona preferida. Agentes emulsionantes conocidos o convencionales se pueden usar en la composición, siempre que el agente emulsificante elegido sea compatible química y físicamente con los componentes esenciales de la composición, y proporcione las características de dispersión deseadas. Emulsionantes apropiados incluyen emulsionantes de silicona, por ejemplo, organopolisiloxanos modificados orgánicamente, también conocido para los expertos en la técnica como surfactantes de silicona, los emulsionantes que no contienen silicona, y mezclas de los mismos, conocidas para los expertos en la técnica para uso en productos tópicos de cuidado personal.

Los emulsionantes útiles incluyen una amplia variedad de emulsionantes de silicona. Estos emulsionantes de silicona son normalmente organopolisiloxanos modificados orgánicamente, también conocidos para los expertos en la técnica como surfactantes de silicona. Los emulsionantes apropiados se describen, por ejemplo, en McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers, Edición Norte Americana (1986), publicado por Allured Publishing Corporation; Pat. U.S. No. 5,011,681 a Ciotti et al., publicado Abr. 30, 1991; Pat. U.S. No. 4,421,769 a Dixon et al., publicado Dic. 20, 1983; y Pat. U.S. No. 3,755,560 a Dickert et al., publicado Ago. 28, 1973.

Otros vehículos tópicos preferidos incluyen emulsiones de aceite-en-agua, que tienen una fase acuosa continua y una fase hidrofóbica, insoluble en agua (“fase de aceite”) dispersada en ella. Ejemplos de vehículos apropiados que comprenden emulsiones de agua-en-aceite se describen en la Pat. U.S. No. 5,073,371 a Turner, D.J. et al., expedido Dic. 17, 1991, y Pat. U.S. No. 5,073,372, a Turner, D.J. et al. Expedido Dic. 17, 1991. Una emulsión de aceite-enagua especialmente preferida, que contiene un agente estructurante, surfactante hidrofílico y agua, se describe en detalle más adelante.

Una emulsión preferida de aceite-en-agua comprende un agente estructurante para asistir en la formación de una red de estructuras de gel cristalina líquida. Sin estar limitados por ninguna teoría, se cree que el agente estructurante ayuda a proporcionar características reológicas a la composición que contribuyen a la estabilidad de la composición. El agente estructurante puede también actuar como un emulsionante o surfactante. Composiciones preferidas de esta invención comprenden desde aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 20 %, más preferiblemente desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 %, más preferiblemente desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 %, por peso de la composición, de un agente estructurante. Los agentes estructurantes preferidos de la presente invención son seleccionados del grupo que consiste de ácido esteárico, ácido palmítico, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol behenílico, ácido esteárico, ácido palmítico, el éter de polietilenglicol de alcohol estearílico que tiene un promedio de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 unidades de óxido de etileno, el éter de polietilenglicol de alcohol cetílico que tiene un promedio de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de óxido de etileno, y mezclas del mismo.

Una amplia variedad de surfactantes aniónicos también son útiles aquí. Véase, por ejemplo, la Pat. U.S. No. 3,929,678, para Laughlin et al., expedido Dic. 30, 1975. Adicionalmente, surfactantes amfotéricos y zwiteriónicos son también útiles aquí.

Las emulsiones de aceite-en-agua preferidas comprenden desde aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 10 %, preferiblemente desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 6 %, y más preferiblemente desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 3 % de por lo menos un surfactante hidrofílico que puede dispersar los materiales hidrofóbicos en la fase de agua (porcentajes por peso del vehículo tópico). El surfactante, como mínimo, puede ser suficientemente hidrofílico para dispersar en agua. Surfactantes adecuados incluyen cualquiera de una amplia variedad de surfactantes conocidos catiónicos, aniónicos, zwiteriónicos, y amfotéricos. Véase, McCutcheon’s. Detergents and Emulsifiers, Edición Norte Americana (1986), publicado por Allured Publishing Corporation; Pat. U.S. No. 5,011,681 para Ciotti et al., expedido Abr. 30, 1991; Pat. U.S. No. 4,421,769 para Dixon et al. expedido Dic. 20, 1983; y Pat. U.S. No. 3,755,560, El surfactante exacto elegido depende del pH de la composición y de los otros componentes presentes. Se prefieren surfactantes catiónicos, especialmente compuestos de amonio cuaternario dialquil, ejemplos del cual se describen en la U.S. Pat. No. 5,151,209 para McCall et al. expedido Sep. 29, 1992; Pat. U.S. No. 5,151,210 para Steuri et al., expedido Sep. 29, 1992; Pat. U.S. Nos.

5,120,532; Pat. U.S. No. 4,387,090; Pat. U.S. No. 3,155,591; Pat. U.S. No. 3,929,678; Pat. U.S. No. 3,959,461; McCutcheon’s, Detergents & Emulsifiers (Edición Norte Americana 1979) M.C. Publishing Co.; y Schwartz, et al., Surface Active Agents, Their chemistry and Technology, Nueva York: Interscience Publishers, 1949.

Alternativamente, otros emulsionantes catiónicos útiles incluyen amino-amidas. Ejemplos no limitantes de estos emulsionantes catiónicos incluyen estearamidopropilPG-dimonio fosfato de cloruro, behenamidopropil PG dimonio cloruro, estearamidopropil etildimonio etosulfato, estearamidopropil dimetil (miristil acetato) cloruro de amonio, estearamidopropil dimetil cetearil amonio tosilato, estearamidopropil dimetil amonio cloruro, estearamidopropil dimetil amonio lactato, y mezclas del mismo.

La emulsión de aceite-en-agua preferida comprende desde aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 98 %, preferiblemente desde aproximadamente el 65 % a aproximadamente el 95 %, más preferiblemente desde aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 90 % de agua por peso del vehículo tópico.

Composiciones Tópicas

La composición cosmética puede ser formulada en cualquiera de una variedad de formas utilizadas por la industria cosmética para aplicación en la piel que incluye, lociones, aerosoles, cremas, ungüentos, salvias, geles, etc., como es descrito más abajo.

Preferiblemente, la composición cosmética es formulada lo suficientemente viscosa para que permanezca en el área de la piel tratada, no se evapore fácilmente, y/o no se elimine fácilmente al enjuagar con agua, pero que se pueda eliminar con la ayuda de jabones, limpiadores y/o champú.

Los métodos para preparar las composiciones que tengan estas propiedades son bien conocidas para los expertos en la técnica, y se describen en detalle en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1990 (supra); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6ta edición, Williams & Wilkins (1995).

Vehículos

Las composiciones tópicas de la invención, incluyendo pero no limitado a lociones y cremas, puede comprender un emoliente dermatológicamente aceptable. Tales composiciones preferiblemente contienen desde aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 50 % del emoliente. Como es usado aquí. “emoliente” hace referencia a un material útil para la prevención o alivio de sequedad, como también para la protección de la piel. Una amplia variedad de emolientes adecuados son conocidos y se pueden usar aquí. Véase, por ejemplo, Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2da Edición, Vol. 1, pp. 3243 (1972), que contiene numerosos ejemplos de materiales adecuados como emoliente. Un emoliente preferido es la glicerina. La glicerina es preferiblemente usada en una cantidad desde o de aproximadamente el 0,001 a o de aproximadamente el 20 %, más preferiblemente desde o de aproximadamente el 0,01 a o de aproximadamente el 10 %, más preferiblemente desde o aproximadamente el 0,1 a o de aproximadamente el 5 %, por ejemplo, 3 %.

Lociones y cremas de acuerdo con la presente invención generalmente comprenden una solución con un sistema de vehículo y uno o más emolientes. Las lociones normalmente comprenden desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 20 %, preferiblemente desde aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 % de emoliente; desde aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 90 %, preferiblemente desde aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 80 % de agua; y una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente descrito aquí. Una crema normalmente comprende desde aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 50 %, preferiblemente desde aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 20 % de emoliente; desde aproximadamente el 45 % a aproximadamente el 85 %, preferiblemente desde aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 75 % de agua; y una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente descrito aquí.

La composición cosmética para aplicación tópica de la presente invención puede también incluir componentes adicionales que son agregados, por ejemplo, para enriquecer las composiciones cosméticas con fragancia y factores de nutrición para la piel.

Tales componentes se seleccionan por ser apropiados para uso en tejido queratinoso humano sin inducir toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica, y similares dentro del alcance del buen juicio médico sólido. Adicionalmente, tales componentes opcionales son útiles siempre que no alteren inaceptablemente los beneficios de los compuestos activos de la invención.

El CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Segunda Edición (1992) describe una amplia variedad de principios cosméticos no limitantes comúnmente usados en la industria del cuidado de la piel, que son adecuados para uso en las composiciones de la presente invención. Ejemplos de estas clases de principios incluyen: abrasivos, absorbentes, componentes estéticos tales como fragancias, pigmentos, colores/colorantes, aceites esenciales, sensibilizadores para la piel, astringentes, etc. (por ejemplo, aceite de clavo, mentol, alcanfor, aceite de eucalipto, eugenol, lactato de mentilo, destilado de hamamelis), agentes anti acné, agentes anti aglutinantes, agentes antiespumantes, agentes antimicrobiales (por ejemplo, yodopropil butilcarbamato), antioxidantes, enlazadores, aditivos biológicos, agentes tampones, principio para carga, agentes quelantes, aditivos químicos, colorantes, astringentes cosméticos, biocidas cosméticos, desnaturalizantes, astringentes farmacológicos, analgésicos externos, formadores de película o materiales, por ejemplo, polímetros, para ayudar con las propiedades de formación de película y estabilidad de la composición (por ejemplo, copolímero de eicoseno y vinilo pirrolidona), agentes opacificadores, ajustadores de pH, propulsores, agentes reductores, secuestrantes, agentes acondicionadores de la piel (por ejemplo, humectantes, incluyendo misceláneos y oclusivos), agentes calmantes y/o agentes curativos (por ejemplo, pantenol y derivados (por ejemplo, etil pantenol), aloe vera, ácido pantoténico y sus derivados, alantoína, bisabolol, y dipotasio glicirricinato), agentes que tratan la piel, espesantes, y vitaminas y derivados de las mismas.

La composición cosmética puede ser aplicada directamente sobre la piel. Alternativamente, puede ser administrada a través de la aplicación normal a la piel por varios sistemas de administración de fármacos transdérmicos que son conocidos en la técnica, tales como parches transdérmicos que liberan la composición en la piel de forma de liberación con el tiempo. Otros sistemas de administración de fármacos conocidos en la técnica incluyen botellas en aerosol presurizadas, iontoforesis o sonoforesis. La oontoforesis es utilizada para aumentar la permeabilidad de la piel y facilitar la administración transdérmica. Las Pat. U.S. Nos. 5,667,487 y 5,658,247 divulgan un aparato ionosónico adecuado para el transporte ultrasónico-iontoforéticamente mediado de los agentes terapéuticos a través de la piel. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden usar también liposomas o micelos como vehículos de administración.

Los principios activos incluidos en las composiciones cosméticas de la presente invención son apropiados para el aclarado de la piel a través de la oxidación de melanina. Sin embargo, la reacción de oxidación puede ser controlada y detenida cuando se desee por la adición de agentes reductores. Estos reactivos se pueden formular en una composición cosmética separada y pueden ser aplicados sobre la piel cuando se desee.

Aclaramiento del Pelo

Principios Activos

Composiciones aclaradoras del pelo formuladas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen el agente oxidativo y el mediador descritos anteriormente.

Como se muestra en la sección de Ejemplos más adelante, el aclarado del pelo puede lograrse en presencia de 1,5 mM de alcohol veratrílico y 8.8 mM de peróxido de hidrógeno en tampón de tartrato a un pH de 3,5.

Emolientes

Los emolientes incluyen, pero no están limitados a, aceites de hidrocarbonos y ceras, tales como aceite mineral, petrolato, y similares, aceites vegetales y animales y grasas, tales como aceite de oliva, aceite de palma, aceite de castor, aceite de maíz, aceite de soja, y similares, y lanolina y sus derivados, tales como lanolina, aceite de lanolina, cera de lanolina, alcoholes de lanolina, y similares. Otros emolientes incluyen ésteres de ácidos grasos que tienen 10 a 20 átomos de carbono, tales como incluyendo mirístico, esteárico, isoesteárico, palmítico, y similares, tales como metil miristato, propil miristato, butil miristato, propil estearato, propil isoestearato, propil palmitato, y similares. Otros emolientes incluyen ácidos grasos que tienen 10 a 20 átomos de carbono, incluyendo esteárico, mirístico, láurico, isoesteárico, palmítico, y similares. Los emolientes también incluyen alcoholes grasos que tienen diez a veinte átomos de carbono, tales como cetil, miristil, lauril, isoestearil, estearil y similares.

Aunque algunos son solubles en agua, los alcoholes polihídricos y derivados de poliéter son incluidos como emolientes, incluyendo glicoles, glicerol, sorbitol, glicoles de polialquileno y similares, tales como propilenglicol, dipropilenglicol, polietilenglicol 200-500, y similares. Los ejemplos solubles en agua son preferidos.

Surfactantes

Preferiblemente se usa también un emulsionante/surfactante en la composición aclaradora de pelo de la presente invención.

Ejemplos de surfactantes incluyen, pero no están limitados a, productos de condensación de óxido de espolioxialquileno de alquil hidrofóbico, alqueno, o grupos funcionales aromáticos alquil que tienen un hidrógeno libre reactivo disponible para condensación con óxido alquileno hidrofílico, óxido de polietileno, óxido de propileno, óxido de butileno, óxido de polietileno o polietilenglicol. Son particularmente efectivos los productos de condensación de octilfenol con aproximadamente 7 a aproximadamente 13 moles de óxido de etileno, vendido por la Compañía de Rohm & Haas bajo la marca de las series de productos TRITON 100®.

Otros principios tales como, fragancias, agentes estabilizantes, tinciones, agentes antimicrobiales, agentes antibacterianos, antiaglomerantes, absorbentes de radiación ultravioleta, y similares también son incluidos en la composición aclaradora de pelo de la presente invención.

Acondicionadores

Preferiblemente también se usa un agente acondicionador estable a la hidrólisis ácida, tal como un compuesto de silicona que tiene por lo menos una fracción de amonio cuaternario junto con un monoquat etoxilado, para estabilizar y opcionalmente espesar la composición aclaradora de pelo de la presente invención.

Un espesante opcional también se puede incluir para mejorar la estética de la composición y facilitar la aplicación de la composición al pelo. Espesantes no iónicos en una cantidad del 0 % a aproximadamente el 3 % en peso son preferidos. Espesantes a modo de ejemplo son metilcelulosa, hidroxibutil metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, hidroxietil etilcelulosa e hidroxietilcelulosa, ácido di (sebo hidrogenado) ftálico amida, copolímero entrecruzado maleico anhídrido-metil vinil éter, goma guar, goma de xantano y goma arábica.

El vehículo de la composición acondicionadora es predominantemente agua, pero también pueden ser incluidos solventes orgánicos para lograr facilitar la fabricación de la composición o para proporcionar propiedades estéticas, tales como control de viscosidad. Solventes adecuados incluyen los alcoholes bajos como alcohol etílico y alcohol isopropílico; éteres de glicol, como 2-butoxietanol, etilenglicol monoetil éter, propilenglicol y dietilenglicol, monoetil éter o monometil éter; y mezclas de los mismos. Solventes no acuosos pueden estar presentes en la composición acondicionadora de la presente invención en una cantidad de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 50 %, y en particular de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 25 %, por peso del peso total del vehículo en la composición.

Agentes acondicionadores no limitantes que se pueden usar en acondicionadores opacos incluyen: cloruro de trimetilamonio estearil; cloruro de trimetilamonio beheno; bromuro de cetrimonio; cloruro de triamonio de soja; cloruro de triamonio de sebo; cloruro de dimetilamonio dihidrogenado de sebo; metosulfato de behentrimetilamonio; cloruro de Peg-2 Oleamonio; bromuro de dimetilamonio dihidrogenado de sebo; metosulfato de dimetilamonio dihidrogenado de sebo; cloruro de trimetilamonio palmitil; cloruro de dicetiidimetilamonio; cloruro de distearildimetilamonio; cloruro de dimetilamonio dipalmito; metosulfato de trimetilamonio de sebo; tosilato de cetrimonio; cloruro de eicosiltrimetilamonio y cloruro de dimetilamonio de sebo.

Materiales que se pueden usar para opacificar composiciones de la invención incluyen ésteres grasos, polímeros opacificantes, tales como polímeros de estireno, como OPACIFIER 653 de Morton, International, Inc.; y alcoholes grasos. Lo siguiente es una lista no limitante de alcoholes grasos: alcohol cetílico; alcohol estearílico, alcohol cetearílico; alcohol behenílico, y alcohol araquidílico. Composiciones acondicionadoras de la invención que no son claras también pueden incluir Lexamina S-13, cloruro de dicetilamonio, y ceteareto-20,

Composiciones de la presente invención se pueden prersentar, si se desea, en un aparato dispensador o un kit, junto con instrucciones apropiadas para uso y etiquetas que indican la aprobación de la FDA para uso en el aclarado de la piel o del pelo.

El kit para aclarar una región de la piel o el pelo puede incluir, por ejemplo, un recipiente que incluye una enzima modificadora de lignina provista con tampones adecuados, vehículos, agentes de penetración etc., y recipientes adicionales que incluyen un agente oxidante y mediador descrito anteriormente.

Enzimas modificadoras de lignina pueden también ser introducidas en las células de la región de la piel empleando enfoques de biología molecular conocidos en la técnica.

Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona un método no terapéutico de aclaramiento de una región de la piel de un sujeto. El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención se realiza expresando dentro de las células de la región de la piel, una enzima modificadora de lignina de una forma apropiada para oxidar un pigmento contenido dentro de las células de la región de la piel.

Tal expresión se puede realizar transformando las células de la piel con un vector de expresión que incluye una enzima modificadora de lignina que codifica una secuencia enlazada funcionalmente a una secuencia promotora.

Para generar tal vector de expresión, un segmento polinucleótido que codifica una enzima modificadora de lignina (la isoforma H1 LIP, SEQ ID NO:1), puede ser ligada a un sistema de vector de expresión comercialmente disponible apropiado para transformar células de mamífero y para dirigir la expresión de la enzima modificadora de lignina dentro de las células transformadas. Se observará que tales sistemas de vector comercialmente disponibles pueden fácilmente ser modificados a través de técnicas recombinantes comúnmente usadas para remplazar, duplicar o mutar secuencias promotoras existentes o secuencias mejoradoras y/o introducir cualesquiera secuencias adicionales polinucleotídicas tales como por ejemplo, secuencias que codifican marcadores de selección adicionales

o secuencias que codifican polipéptidos reporteros.

Vectores de expresión de mamífero apropiados para uso con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, que están disponibles en Invitrogen, pCI que está disponible en Promega, pBK-RSV y pBK-CMV que están disponibles en Stratagene, pTRES que está disponible en Clontech, y sus derivados.

Un vector de expresión adecuado para uso con este aspecto de la presente invención es un vector basado en adenovirus. Vectores de adenovirus han sido ampliamente usados para aplicaciones farmacéuticas que incluyen terapia genética cutánea (Ghazizadeh S, Taichman LB. (2000) Hum Gene Ther 11: 2247-51; Carter PJ, Samulski RJ. (2000). Int J Mol Med 6; 17-27).

El vector de expresión descrito anteriormente se puede introducir en las células empleando diversos enfoques, incluyendo, pero no limitado a, liposomas, parches epidérmicos, iontoforesis o endocitosis mediada por aceptor.

En este último enfoque, un anticuerpo o ligante a un receptor de superficie celular que es conocido por experimentar endocitosis, forma un complejo con una secuencia de ADN que codifica la enzima modificadora de lignina a través de un adjunto policatiónico enlazado covalentemente (por ejemplo, polilisina, protaminas). Tales complejos retienen su especificidad de enlace a la superficie celular y son absorbidos en la célula, donde penetran en el compartimento endosómico por medio de procesos endocitóticos normales. Adicionalmente, deben tomarse pasos para evitar la degradación del ADN dentro del endosoma-lisosoma. Las células puede ser tratadas con el agente lisosomatrópico cloroquina durante el procedimiento de transfección. Alternativamente, se pueden usar los componentes de virus que entran a las células por endocísis y poseen una capacidad de “brote” endosómico. Adenovirus de replicación defectivos emparejados con los complejos de ligadura ADN dan eficiencias de transfección de virtualmente el 100 % en células de cultivo de tejido in vitro. Estudios preliminares han demostrado el potencial de este método para dirigir el ADN específicamente al tipo de célula de elección in vivo (Guy J, Drabek D, Antoniou M. (1995). Mol Biotechnol 1995 3:237-48).

Siguiendo la expresión dentro de las células diana, el aceptor de electrones y el mediador descritos se aplican preferiblemente a la región tratada para facilitar el aclarado.

Expresar la enzima modificadora de lignina dentro de las células diana es particularmente ventajoso ya que supera la necesidad de entrega intracelular de la enzima misma, por lo tanto potencialmente mejorando la eficiencia del aclarado.

Objetos adicionales, ventajas, y características novedosas de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica al examinar los siguientes ejemplos, que no se pretende sean limitantes. Adicionalmente, cada una de las varias modalidades y aspectos de la presente invención tal como se ha delineado anteriormente y como es reivindicado en la sección de reivindicaciones más adelante encuentran soporte experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriormente, ilustran la invención de una forma no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada aquí y los procedimientos de laboratorio usados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y recombinantes de ADN. Tales técnicas son explicadas extensamente en la literatura. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons,

New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías como son expuestas en las Pat. U.S. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles son extensamente descritos en la literatura de pantentes y científica, véase, por ejemplo, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney,

R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos son bien conocidos en la técnica y se facilitan solo para la conveniencia del lector.

Antecedentes

Peroxidasas de lignina en el hongo P. chrysosporium

Hay más de 12 proteínas hemo que muestran actividad ligninolítica en el fluido extracelular de cultivos de P. chrysosporium BKM-F-1767. Se pueden clasificar en dos tipos de peroxidasas hemo glicosiladas, lignina peroxidasa (LIP) y peroxidasa de manganeso (MNP). Se ha informado que las isoenzimas H1, H2, H6, H7, H8 y H10 son LIP y H3, H4, H5, y H9 han sido identificadas como MNP (Farrell et al., 1989). Las isoenzimas LIP de P. chrysosporium son codificadas por una familia de genes estructuralmente relacionados y son diferentes en sus características físicas, especificidad de sustrato y estabilidad (Farrell et al., 1989; Stewart et al., 1992). Como parte del proceso que lleva a su secreción, las isoenzimas LIP se rompen proteolíticamente y se glicosilan (Ghose, 1987; Ritch et al., 1991; Tien y Kirk, 1984). Adicionalmente, se ha informado que las isoenzimas LIP H2, H6, H8 y H10 son fosforiladas en una fracción de manosa 6-fosfato, contenido en oligosacáridos enlazado con asparigina. El análisis de fluido extracelular madurado ha llevado a la sugerencia que la isoenzima H1 probablemente se deriva a partir de defosforilación post-translacional de H2 (Kuan y Tien, 1989).

La expresión de las enzimas ligninolíticas por P. Chrysosporium es un evento idiofásico desencadenado por limitación de nitrógeno o carbono y es altamente dependiente de las condiciones de cultivo y de la composición del medio (Dosoretz y Grethlein, 1991; Faison y Kirk, 1985; Stewart et al., 1992; van der Woude et al., 1993). La formación de LIP es particularmente dependiente de la exposición de los cultivos a altas tensiones de oxígeno (Dosoretz et al., 1990; Faison y Kirk, 1985). Se ha propuesto que la transferencia de oxígeno en cultivos estacionarios es restringida, y consecuentemente una alta presión parcial de oxígeno en el espacio frontal del cultivo es necesaria para hacer que suficiente oxígeno esté disponible para las hifas sumergidas (Leisola et al., 1983; Michel et al., 1992). La formación de LIP se observó en un cultivo que fue expuesto al aire inmovilizando el hongo sobre un soporte poroso en un cultivo líquido no-sumergido, que mejoró la disponibilidad de oxígeno para el hongo (Dosoretz et al., 1990; Popp et al., 1990). La concentración de Mn2+ en el medio afecta adversamente la formación de LIP y MNP. Mientras la formación de MNP es dependiente en Mn, que mejora la transcripción de MNP, la formación de LIP es inhibida por Mn. Rothschild et al., (1999) demostraron que en los cultivos de P. chrysosporium con límite de nitrógeno y en los cultivos con exceso de nitrógeno, el alto nivel de oxígeno requerido para la formación de LIP podría remplazar la deficiencia de Mn.

Materiales y métodos experimentales

Crecimiento del hongo Phanerochaete chrysosporium para la producción de lignina peroxidasa – Se mantuvo el hongo Phanerochaete chrysosporium BKMF-1767 (ATCC 24725) a 4 °C en 2 % de agar extracto de malta en cultivos inclinados (Difco, Detroit, MI, USA).

Preparación de suspensión de esporas-Las esporas del hongo se obtuvieron inoculando plugs de los cultivos inclinados en placas de Petri que contienen Agar de Dextrosa de patata esterilizada (PDA) a una concentración de 39 g/litro. Las placas de PDA se incubaron entonces durante hasta 2 semanas a 37 °C. Para la preparación de la suspensión de esporas, las placas de PDA se incubaron después durante hasta 2 semanas a 37 °C. Para la preparación de la suspensión de esporas, las placas de PDA se recubrieron con un 0,9 % de NaCl, se filtró la suspensión de conidios a través de lana de vidrio estéril y se recolectó la suspensión de esporas. La suspensión de esporas se congeló a continuación a -80 °C.

Preparacion del Inoculo- Las esporas se inocularon en un medio de inoculación estéril (véase la formulación más abajo) a una concentración final de 7,5 x 105 esporas/ml. Noventa ml de la mezcla se agregaron a cada lote de fermentación (Tien y Kirk, 1988. Meth. Enzymol. 161: 238-490; Dosoretz et al., 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 131-7), y los lotes fueron entonces sellados con tapones de algodón. Los cultivos se cultivaron estáticamente durante 48 h a 37 °C como cultivos someros. Para la inoculación de cultivos los contenidos del lote de fermentación se mezclaron durante 2 min con una mezcladora (Waring, Inglaterra).

Crecimiento del hongo en un reactor de tanque agitado (STR) fermentador- Previo al crecimiento del hongo, la espuma de poliuretano se asentó alrededor de los tubos de enfriamiento del fermentador y todo el fermentador STR fue esterilizado. Diez litros de un medio fermentador (véase la formulación aquí más abajo) se virtieron entonces en el fermentador STR y se añadieron 900 ml de inoculo mezclado (el contenido de 10 lotes de fermentación). El fermentador se conectó a un sistema de enfriamiento para mantener una temperatura de 37 °C y se mezcló a 100 rpm. Se introdujo en el fermentador aire esterilizado a razón de 2 ml/min. El flujo se cambió a 4 ml/min después de 2 días de crecimiento. Se continuó el crecimiento durante 3-5 días.

El medio de Inoculación se preparó mezclando las siguientes soluciones y se esterilizói con un filtro de membrana de 0,45 µm (MSI, Westborough, MA, USA). Para la preparación de 1 litro de medio líquido, se combinaron los siguientes componentes:

100 ml de Medio Básico para crecimiento de P. chrysosporium x 10 (véase la formulación más abajo) 10 ml de solución de reserva de CaCl2 (13.2 g/l) (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO, USA). La concentración final 0,132 g/L. 12 ml de solución de reserva de glicerol (50 g/100-ml) (Frutarom, Israel). La concentración final 6 g/L. Se añade agua de doble destilación hasta 1 litro.

El Medio Fermentador se preparó de la siguiente forma y se esterilizó con un filtro de membrana de 0,45 µm (MSI, Westborough, MA, USA). Para la preparación de 10 litros de medio líquido, se combinaron los siguientes componentes: 100 ml de solución de reserva de CaCl2 (13.2 g/l) (Sigma, USA). Concentración final 0,0132 g/l

120 ml de solución de reserva de glicerol (50 g/100-ml) (Frutarom, Israel). Concentración final 6 g/l. 50 ml de solución de reserva Tween-80 (10,8 ml/100 ml) (Sigma, USA). Concentración final 0,54 ml/l 1000 ml de Medio Básico para crecimiento de P. chrysosporium x 10 (véase la formulación más abajo) 3,36 g de alcohol veratrílico (Sigma, USA). Concentración final 2 mM. 7.740 litros de agua doble destilada (DDW) a un volumen final de 10 litros.

Medio Básico para el crecimiento de P. chrysosporium x 10 – El medio básico para el crecimiento de P. chrysosporium x 10 se preparó del siguiente modo: se disolvieron 7,07 g de ácido Nitrilotriacético (sal trisódica) en 4 litros de DDW. Se añadieron después los siguientes reactivos: 100 g KH2PO4 anhídrido, 72.7 g MgSO4·7H2O (o 67,39 g MgSO4·6H2O), 3,5 g NaCl, 0,35 g FeSO4·7H2O, 0,63 g CoCl2·6H2O, 0,35 g ZnSO4·7H2O, 0,055 g CuSO4·5H2O, 0,035 g AlK(SO4)2·12H2O, 0,035 g H3BO3, 0,035 g Na2MoO4·2H2O, 500 ml 2M tampón de acetato pH 4,5, 10 g tartrato de amonio y 50 mg Tiamina. Todo suminiistrado por Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA. El pH era el del medio y se ajustó a 4,4-4,45, añadiéndose NaOH y DDW a un volumen final de 5 litros. El medio fue almacenado a 4 °C.

Aislamiento y purificación de LIP de un medio extracelular de Phanerochaete chrysosporium – El medio extracelular se filtró al vacío a través de una fibra de vidrio. El filtrado fue después esterilizado con un filtro de membrana de 0,45 µM (MSI, Westborough, MA, USA). El fluido extracelular concentrado fue entonces reconcentrado 25 veces por ultrafiltración usando una membrana tipo 10-kDa-corte PM-10 (Amicon, Danvers, MA), y purificado con una columna Mono Q (HR5/5, Pharmacia, Piscataway, NJ) por cromatografía de intercambio de aniones-HPLC usando dos gradients de 0,01 – 1,00 M de acetato de sodio. El primer gradiente fue a un pH de 6,0 y el segundo gradiente fue a un pH de 4,7, lo que es equivalente al valor de punto isoeléctrico (pl) de la isoenzima H1 de LIP. Se recolectaron los picos de la proteína y se analizó su actividad usando la isoenzima H1 de LIP purificada de un lote anterior como estándar. La absorbancia de la fracción H1 de LIP se midió a : 280 nm, y 409 nm (Hewlett Packard, Waldbronn, Alemania). El grado de pureza (RZ), calculado de la proporción entre la absorbancia a 409 nm (A409) y absorbancia a 280 nm (A280) de la isoenzima H1 de LIP purificada fue mayor de 4,0, La concentración de LIP se determinó a 409 nm usando un coeficiente de extinción de 169 M-1 cm-1.

Ensayo de actividad LIP – La actividad de LIP se midió mediante el cambio en la absorbancia a 310 durante la oxidación del alcohol veratrílico a aldehído veratrílico como se describe en Tien y Kirk (1988). El reactivo del ensayo se compone de 4 mM de alcohol veratrílico y 0,88 mM de H2O2 en 100 mM de tampón de Tartrato a un pH de 2,5. Para el ensayo, 0,5 ml de medio extracelular de P chrysosporium se mezclaron con 0,5 ml del reactivo y el aumento en la absorbancia a 310 nm se midió durante 40 segundos. Una unidad de LIP se define como 1 µmol de alcohol veratrílico oxidado a aldehído veratrílico por minuto.

Determinación de oxidación de melanina por LIP – Se preparó Melanina Sintética (Sigma, Cat # M8631, St Louis MO, USA) a varias concentraciones en 50 mM de tampón Tris a un pH de 8,00, La oxidación de melanina por LIP se realizó en tampón de Tartrato a un pH de 3,5 que contenía alcohol veratrílico, y se inició la reacción enzimática añadiendo peróxido de hidrógeno. El grado de oxidación de melanina se determinó usando la disminución de la absorbancia a 460 nm.

Preparación de la crema – La crema de LIP en las modalidades preferidas está compuesta de dos tipos de cremas: la crema de enzimas y la crema activadora. Cada crema se preparó a partir de dos fases, es decir, la fase de agua y la fase de aceite.

Crema Enzimática Fase de agua para la crema enzimática:

0,35 % (p/p) DMDM hidantoína (Sharon Lab, Israel);

2 % (p/p) glicerina (Cognis, Alemania);

0,1 % (p/p) alcohol veratrílico (3-dimethoxybenzyl alcohol, Sigma, USA);

81,65 % (p/p) DDW (RO Water, Israel);

0,2 % (p/p) Rhodicare D (goma de xantan, Rhodia, Francia);

4 % (p/p) transcutol (PEG-400, etoxidiglicol, Gattefosse, Francia);

Fase de aceite para la crema enzimática:

5 % aceite mineral ligero;

2,5 % (p/p) dragorina 100 SEP (GMS & PEG-100 estearato, Dragoco, Alemania);

3 % (p/p) alcohol cetílico (Cognis, Alemania);

0,2 % (p/p) sorbato de potasio (Chisso Corp., Japón);

1 % (p/p) brij 721 (Uniqema, Italia).

Preparación de la crema enzimática: Las fases de aceite y de agua de la crema enzimática se calentaron a 80 °C y después se mezclaron. La mezcla fue homogenizada durante 10 minutos y enfriada a 55 °C . Después se ajustó el pH a 3,5 con ácido láctico.

Cuando la mezcla se enfrió a 40 °C, se añadió la lignina peroxidasa (20-50 unidades/g). La mezcla enzimática fue homogenizada durante 1 min.

Crema Activadora

Fase de agua para la crema activadora:

82.888 (p/p) DDW (RO Waster, Israel);

0,1 % (p/p) disodio EDTA (Merck, Alemania); 4 % (p/p) transcutol (PEG-400, etoxidiglicol, Gattefosse, Francia); 0,1 % (p/p) sorbato de potasio (Chisso Corp., Japón):

Fase de aceite para la crema activadora:

3,5 % (p/p) brij 72 (Steareth-2, Uniqema, Italia); 2,5 % (p/p) brij 721 (Steareth-20, Uniqema, Italia); 5 % (p/p) aceite mineral; 1,3 % (p/p) alcohol cetílico (Cognis, Alemania); 0,5 % (p/p) silicona 350 (Dimethicon, Dow Coming, USA); 0,1 % (p/p) sorbato de potasio (Chisso Corp., Japón).

Preparación de la crema activadora – Se calentaron las fases de agua y de aceite de la crema activadora a 80 °C y se mezclaron. La mezcla fue homogenizada durante 10 min, enfriada a 45 °C y ajustada a un pH de 3,5 con ácido fosfórico.

Cuando la mezcla se enfrió a 40 °C se añadió el peróxido de hidrógeno (Riedel-de Haen, Alemania) (0,012 % (p/p)) con suave agitación, el pH correcto fue verificado y la mezcla activadora fue homogenizada durante 1 min.

Determinación del efecto aclarador de la piel in vivo – Para poder cuantificar el efecto de LIP en la aclaración de la piel, se comprobó el color de la piel de la mano tratada usando tres longitudes de onda del cromámetro Minolta (CR-200 Japón): Minolta L mide oscuridad y brillo, la Minolta A mide los tonos rojos y la Minolta B mide los tonos amarillos. El aumento en los valores de Minolta L refleja el grado de brillo de la piel, es decir, valores más altos corresponden a una piel más brillante.

Resultados experimentales

Ejemplo 1

Purificación de lip de P. chrysosporium

Preparación de LIP H1 altamente purificado de P. Chrysosporium – Para purificar la isoenzima LIP H1 de P. chrysosporium se cultivó el hongo en un fermentador STR (Figura 2) como se ha descrito en detalle en la sección de Métodos anterior. La actividad inicial de LIP fue detectada después de 48 horas de crecimiento y aumentos significativos en la actividad se detectaron cuando el crecimiento se mantuvo hasta 120 hr (Figura 3). Para la purificación de la isoenzima LIP H1 se recogió el fluido extracelular del hongo con una actividad de LIP pico (120 hr). A continuación se purificó la proteína de la isoenzima H1 de LIP y se determinó su concentración como como se describe en Métodos. Por lo tanto, usando el aparato arriba mencionado y las condiciones, LIP puede ser producida con seguridad y su isoenzima H1 puede ser purificada mediante HPLC.

Ejemplo 2

Optimización de la melanina en una fase acuosa de oxidación usando lip purificada

Para lograr optimizar las condiciones necesarias para la oxidación de melanina por LIP, se determinó de manera independiente la concentración óptima para cada uno de los componentes críticos de la reacción de oxidación.

Oxidación LIP de melanina en una fase acuosa, es una función de la concentración de peróxido de hidrógeno – Se analizó primero la oxidación de melanina por LIP en una fase acuosa para encontrar la correlación con las concentraciones de peróxido de hidrógeno. Una concentración constante de melanina (70,5 µg/ml) fue oxidada por 0,48 µM de LIP purificada H1 en presencia de 1,5 mM de alcohol veratrílico y con concentraciones crecientes de peróxido de hidrógeno. El grado de oxidación se determinó midiendo la absorbancia de melanina a 460 nm, antes de agregar el peróxido de hidrógeno y 160 segundos después de eso, calculándose en porcentajes. Generalmente, la oxidación de melanina aumentó con las concentraciones crecientes de peróxido de hidrógeno hasta una meseta para 700-900 µM de peróxido de hidrógeno (Figuras 4). El efecto de la concentración de peróxido en la oxidación de melanina se demostró adicionalmente comparando mezclas de reacción en la Figura 5, donde la reacción de la mezcla se aclara significativamente con concentraciones crecientes de peróxido de hidrógeno. Por lo tanto, estos resultados demuestran que la oxidación LIP de melanina en una fase acuosa es claramente dependiente de las concentraciones de peróxido de hidrógeno, estando las concentraciones óptimas de peróxido de hidrógeno

para la oxidación de melanina en el intervalo de 600 µM a 700 µM.

La oxidación LIP de melanina es una función de la concentración inicial de melanina en una fase acuosa – Para determinar la concentración óptima de melanina requerida para la oxidación de melanina en una fase acuosa por LIP, se ensayó adicionalmente la reacción de oxidación con concentraciones crecientes de melanina. La oxidación de melanina se produjo con 0,48 µM de H1 LIP purificado en presencia de 1,5 mM de alcohol veratrílico y 600 µM de peróxido de hidrógeno. A concentraciones iniciales de melanina entre 15 a 45 µ g/ml, la oxidación de melanina por LIP dependía de las concentraciones iniciales de melanina. La oxidación máxima de melanina (60 %) se alcanzó a concentraciones iniciales de melania entre 45 a 85 µg/ml (Figura 6). Por lo tanto la oxidación de melanina por LIP es claramente independiente de las concentraciones iniciales de melanina, más allá de 45 µg/ml.

La oxidación melánica de LIP es parcialmente dependiente en la concentración de LIP en una fase acuosa – Para optimizar adicionalmente las condiciones para la oxidación de melanina, se ensayó el efecto de la concentración de LIP en la oxidación de melanina con concentraciones óptimas de melanina (70 µg/ml), peróxido de hidrógeno (700 µM) y alcohol veratrílico (1,5 mM). La oxidación de melanina aumentó drásticamente desde 10 a 60 % cuando se aumentó la concentración de LIP desde 0,25 µM a 0,40 µM. Sin embargo, más allá de la concentración de LIP de 0,50 µM no se observaron cambios en la oxidación de melanina (Figura 7). Por lo tanto, el intervalo óptimo de las concentraciones de LIP para la oxidación de melanina in vitro es 0,40 -0,50 µM.

Ejemplo 3

Oxidación de melanina usando LIP en una crema de la formulación

Para corroborar aún más la habilidad de la isoenzima LIP H1 para oxidar melanina y como un paso intermedio hacia el aclarado de la piel in vivo, la actividad de LIP fue probada en una formulación de una crema solubilizada en una fase acuosa.

La melanina en una fase acuosa es oxidada por LIP en una formulación en crema- Se prepararon dos tipos de crema: la crema enzimática que comprende la fracción H1 de la isoenzima LIP (25 unidades/g de crema) y alcohol veratrílico (6 mmol/Kg de crema), y la crema activadora que comprende peróxido de hidrógeno (3,52 mmol/Kg de crema). Para la determinación de la actividad de LIP en una formulación de crema se mezcló primero la crema enzimática (0,3 gr) con melanina (140 µg/ml) y se observó un color gris negro (Figura 8a). Cuando se añadió la crema activadora (0,3 gr) a la crema enzimática que ya contenía melanina, el color fue cambiado inmediatamente a beige (Figura 8b). Estos resultados demuestran que LIP en una formulación de crema es altamente eficiente en la decoloración de la melanina y se puede probar también en la piel humana.

Ejemplo 4

Aclaramiento de la piel y el pelo in vivo por lip h1 purificado en una formulación en crema

Para probar la habilidad de LIP para aclarar la piel y el pelo in vivo se añadió la enzima en una crema y en formulaciones acuosas a la piel y al pelo, respectivamente.

LIP en una formulación en crema aclara la piel in vivo – Para probar la habilidad de LIP en una formulación en crema para aclarar la piel in vivo, se aplicó la crema enzimática, que fue absorbida por la piel, y después se aplicó la crema activadora cuatro veces a intervalos de 5 min. Cuando se repitió dos veces al día durante una semana se observó un aclarado significativo de las áreas de piel tratadas (Figura 9). Cuando se cuantificó el color de la piel de dos áreas de la mano tratada usando un cromámetro de Minolta, se observó un claro efecto aclarador de la piel durante las dos semanas de aplicación de la crema de LIP (Tabla 1, % cambio). Por lo tanto, estos resultados demuestran que LIP, preparada en una formulación de crema de fácil aplicación, puede aclarar de modo sencillo y eficiente la piel in vivo, y que la LIP preparada como se detalla aquí puede adaptarse adicionalmente para otras aplicaciones aclaradoras in vivo.

TABLA 1

CUANTIFICACIÓN DEL ACLARAMIENTO DE LA PIEL IN VIVO

Minolta L (brillo)

Minolta A (rojo) Minolta B (amarillo)

Área I

Línea base 44,8 10,5 16,34

Área I

2 semanas 48,8 10,6 17,93

Área I

% cambio 8,9 9,7

Área II

Línea base 49,91 10,38 19,28

Área II

2 semanas 53,8 9,39 20,63

Área II

% cambio 7,79 7,0

La Tabla 1 ilustra tres juegos de lecturas m de números absolutos tomados del cromámetro Minolta de dos áreas enla mano tratada. El Área I corresponde al área en un círculo en la Figura 9, el Área II corresponde a datos no mostrados.

LIP en una formulación acuosa aclara el pelo in vivo – El aclaramiento de la pigmentación suele necesitarse en

5 tejidos ricos en melanina diferentes a la piel. Para probar aún más sus efectos aclaradores in vivo, se aplicó LIP en pelo humano. Antes de la aplicación de LIP, el pelo se sumergió primero durante 1 hora en 50 mM de tampón de carbonato a un pH de 11,5 y después se transfirió a otro tubo que contiene LIP (25 U/20 µl en agua). Se incubó el pelo con LIP durante 10 segundos y después se transfirió a tampón de tartrato a un pH de 3.4 en presencia de alcohol veratrílico (1,5 mM) y peróxido de hidrógeno (8.8 mM). Se observó un efecto aclarador significativo en el

10 plazo de 1 hr en presencia de LIP (Figura 10, tubo derecho) comparado con el pelo tratado en la misma solución pero sin LIP (Figura 10, tubo izquierdo). Por lo tanto, estos resultados demuestran que en presencia de muy bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno, LIP en una formulación acuosa puede aclarar eficientemente el pelo in vivo.

Ejemplo 5

15 Ampliación del proceso de preparación de LIP

Para producir grandes cantidades de lignina peroxidasa (LIP) útil para propósitos comerciales la LIP fue purificada a partir del hongo P. chrysosporium usando un protocolo ampliado.

Alta actividad de LIP obtenida usando un protocolo de fermentación ampliado – Se realizó la fermentación en un fermentador de 100 L usando 90 L de medio de fermentación como se ha descrito anteriormente en la sección de

20 Métodos . Las condiciones de fermentación incluyen agitación de 160 rpm y flujo de aire de 0,2 vvm. La inoculación fue realizada de la misma forma que como en el fermentador de 10 L que se ha descrito anteriormente en la sección de Métodos. Después de 7 días de crecimiento la actividad medida de LIP fue 1600 unidades/litro.

Estos resultados demuestran que se pueden producir grandes cantidades y altas actividades catalíticas de LIP a partir del hongo P. chrysosporium usando fermentadores grandes y el protocolo ampliado de la presente invención.

25 Ejemplo 6

Pruebas dermatológicas para la crema de LIP: piel sensible hipoalergénica y pruebas de estrés y sensibilización en piel normal

Para caracterizar las propiedades dermatológicas de la crema LIP y como pre-requisito para uso como producto cosmético la crema de LIP fue sometida a varias pruebas dermatológicas: una prueba hipoalergénica, una prueba

30 sensibilizante y de estrés en piel normal, y una prueba sensibilizante y de estrés en piel sensible.

Métodos

Sujetos del estudio para pruebas dermatológicas en piel normal: El estudio incluyó 50 voluntarios, 9 hombres y 41 mujeres, en un espectro de edades desde 18 a 64 años. Los voluntarios estaban en buena salud general y libres de cualquier enfermedad de la piel visible o anomalía en el área en la que había que colocar los parches. A cada

35 sujeto del estudio se le pidió que leyera, entendiera y firmara una declaración de consentimiento informado. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: mujeres embarazadas o lactando, sujetos afectados de enfermedades graves o progresivas y/o patologías en la zona tratada, sujetos recibiendo un tratamiento (por ejemplo, retinoides, esteroides) y/o modificadores de la hidratación cutánea, sujetos con peso inestable o excesivo uso de alcohol o tabaco.

40 Un resumen de las características de los sujetos del estudio se presenta en la Tabla 2 a continuación.

35 Tabla 2

LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS SUJETOS DEL ESTUDIO

Sexo

Edad promedio (años) Historia médica con probable influencia sobre el estudio

M

40,36 Ninguna

H

34,33 Ninguna

Sujetos del estudio para la prueba dermatológica en la piel sensible – Un total de 50 sujetos, 6 hombres y 44 mujeres completaron la prueba: 22 sujetos estaban en el intervalo de 18 a 35, 11 sujetos estaban en el intervalo de 36 a 45, y 17 sujetos estaban en el intervalo de 46 a 65.

Tratamiento asociado durante el estudio – No se aplicó agua al sitio de prueba durante la aplicación del parche; no se permitió ningún tratamiento sistémico o tópico que probablemente modificara la piel; no se permitió el uso de productos dermofarmacéuticos o cosméticos, incluyendo productos limpiadores, en las zonas en evaluación.

Preparación del parche – Para las pruebas hipoalergénicas, se pusieron 2 mg de la crema LIP de la presente invención en una tira adhesiva Curatest® F (Lohmann & Rauscher International GMBH & Co. KG, Rengsdort). Para las pruebas dermatológicas y las pruebas de piel sensible cada parche incluyó 0,07 – 0,1 gramos de la crema LIP en la tira adhesiva Curatest® F.

La prueba de parche de Insulto Repetido de Draize se realizó esencialmente como se describe en "Appraisal of the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics" de J.H. Draize (publicada por la Association of Food and Drug Officials of the United States).

Fase de Inducción – El parche se aplicó en los lugares de contacto designados y se mantuvo en su lugar durante 24 horas. Al final de este periodo el parche fue retirado y se observó la zona en busca de una respuesta dérmica. Los sujetos del estudio descansaron durante 24 horas, después de las cuales se examinó de nuevo la piel. Se aplicó a continuación un parche en el mismo lugar que anteriormente. La segunda aplicación fue idéntica a la primera y permaneció durante 24 horas. El procedimiento se repitió nueve veces. Se examinó a los sujetos de estudio en busca de cualquier respuesta dérmica y se informó de las observaciones antes de la siguiente aplicación. El mismo sitio se usó a lo largo de todo el estudio. Cada aplicación fue realizada y retirada por el personal del Instituto de Investigación de la Piel (Tel Aviv, Israel). Una persona de control de calidad controló el cumplimiento del protocolo del estudio.

Fase de estrés – Después de la 9a aplicación, transcurrió un periodo de descanso de 2 semanas después del cual una aplicación de estrés se aplicó de la misma forma y al mismo sitio usado durante la fase de inducción. La aplicación de estrés se retiró después de 24 horas y el sitio fue examinado y calificado por la presencia de signos de irritación o sensibilización. Un examen de seguimiento fue realizado 48 horas después de la aplicación de estrés (24 horas después de quitar el parche), como también 48 y 72 horas después de la retirada.

Escala de Calificación – Los resultados de las pruebas de inducción y estrés se calificaron usando la siguiente escala: “0” = no hay reacción visible; “?” = reacción dudosa, es decir, tenue, eritema mínimo, no hay infiltración; “1” = reacción débil positiva, es decir, eritema, infiltración, pápulas no discretas; “2” = reacción positiva fuerte, es decir, eritema, infiltración, pápulas, vesículas discretas; “3” = reacción extra positiva, es decir, eritema intenso, infiltración, reacción de vesículas/bullas fusionadas; “IR” = reacción de irritación, es decir, eritema discreto sin infiltración/ eritema folicular irregular/ pústulas hemorrágicas y foliculares; “NT” = no probado.

Resultados de las pruebas dermatológicas

Prueba hipoalergénica – En esta prueba la reacción a la aplicación de un parche que contiene crema LIP fue documentada después de 20 minutos, 24 horas y 48 horas de retirada del parche. Como se muestra en la Tabla 3 a continuación, en ninguno de los 50 sujetos se produjo una reacción visible de la piel a la crema LIP.

Tabla 3

Resultados de la prueba hipoalergénica

Nº

Sujeto Sexo Edad 20 minutos 24 horas 48 horas

1

DP M 37 0 0 0

2

GB M 62 0 0 0

3

ZA M 58 0 0 0

4

SE M 64 0 0 0

ER

M 61 0 0 0

6

GC M 35 0 0 0

7

SS M 26 0 0 0

8

DP M 65 0 0 0

9

ET M 46 0 0 0

IM

M 58 0 0 0

11

MI M 40 0 0 0

12

GO M 30 0 0 0

13

ML M 49 0 0 0

14

SA H 22 0 0 0

CB

M 38 0 0 0

16

BA M 34 0 0 0

17

SI M 45 0 0 0

18

KS M 35 0 0 0

19

SS M 28 0 0 0

FH

M 26 0 0 0

21

RS M 44 0 0 0

22

AA M 25 0 0 0

23

ST H 21 0 0 0

24

FA H 38 0 0 0

SS

M 42 0 0 0

26

SR H 49 0 0 0

27

SI H 19 0 0 0

28

CT M 32 0 0 0

29

CJ H 35 0 0 0

HP

M 30 0 0 0

31

FS M 36 0 0 0

Resultados de la prueba hipoalergénica

Nº

Sujeto Sexo Edad 20 minutos 24 horas 48 horas

32

PA M 45 0 0 0

33

PN H 51 0 0 0

34

MR M 30 0 0 0

35

SL M 31 0 0 0

36

YI M 23 0 0 0

37

VI M 30 0 0 0

38

LA M 45 0 0 0

39

TR M 43 0 0 0

40

CD M 38 0 0 0

41

SS M 36 0 0 0

42

LB M 36 0 0 0

43

ML M 31 0 0 0

44

AT H 37 0 0 0

45

GK M 42 0 0 0

46

BP M 51 0 0 0

47

LT M 56 0 0 0

48

IV M 35 0 0 0

49

PO M 43 0 0 0

50

CP M 31 0 0 0

Tabla 3: Los resultados de una prueba hipoalergénica tal como se calificaron después de 20 minutos, 24 horas o 48 horas de retirar la aplicación.

La sensibilización y el sometimiento a estrés de la piel normal con la crema LIP dio como resultado la

5 ausencia de cualquier reacción de la piel –Se introdujo la crema LIP en los parches y se realizó la prueba del parche del Insulto Repetido de Draize en 50 voluntarios saludables. Después de cada aplicación del parche, se registró la reacción de la piel usando la escala de calificación descrita en la sección de Métodos más adelante. Como se muestra en la Tabla 4 siguiente, ninguno de los 50 voluntarios presentó reacción de la piel visible durante las 9 aplicaciones de la fase de inducción ni tampoco después de la ultima aplicación de la fase de desafío.

10 Tabla 4

Resultados de las pruebas de inducción y de estrés de la crema LIP

Nº

Sujeto Sexo Edad Resultados de acuerdo con la escala de puntuación

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10

1

DP M 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2

GB M 62 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3

ZA M 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Resultados de las pruebas de inducción y de estrés de la crema LIP

Nº

Sujeto Sexo Edad Resultados de acuerdo con la escala de puntuación

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10

4

SE M 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ER

M 61 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6

GC M 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7

SS M 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

8

DP M 65 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

9

ET M 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

IM

M 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11

MI M 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12

GO M 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13

ML M 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14

SA H 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

CB

M 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

16

BA M 34 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17

SI M 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18

KS M 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19

SS M 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

FH

M 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

21

RS M 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

22

AA M 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

23

ST H 21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

24

FA H 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

SS

M 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

26

SR H 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

27

SI H 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

28

CT M 32 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

29

CJ H 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

HP

M 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

31

FS M 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

32

PA M 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

33

PN H 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

34

MR M 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

SL

M 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Resultados de las pruebas de inducción y de estrés de la crema LIP

Nº

Sujeto Sexo Edad Resultados de acuerdo con la escala de puntuación

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10

36

YI M 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

37

VI M 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

38

LA M 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

39

TR M 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

40

CD M 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

41

SS M 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2

LB M 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

43

ML M 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

44

AT H 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

45

GK M 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

46

BP M 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

47

LT M 56 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

48

IV M 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

49

PO M 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

50

CP M 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabla 4: Puntuaciones de calificación después de cada aplicación del parche en la fase de inducción (resultados de puntuación Nº 1-9) y la fase de estrés (resultados de puntuación N1 10). M = hombre; F = mujer.

Prueba dermatológica en la piel sensible – Para caracterizar aún más las propiedades sensibilizantes de la crema

5 LIP se realizó una prueba de parche de irritación en 50 voluntarios sanos con piel sensible. En la pre-prueba, se encontró que 11 sujetos tenían varios grados de escozor: 2 con piel sensible severa, 8 con piel moderadamente sensible y 1 con piel ligeramente sensible. El parche irritante que incluye la crema LIP fue colocado en la espalda de los voluntarios durante 48 horas. El área probada se inspeccionó después de 1 hora, 24 horas y 48 horas y se encontró que no hubo reacción de la piel en ninguno de los 50 voluntarios.

10 Estos resultados descartan reacciones hipoalergénicas e irritantes a la crema de LIP en piel normal y sensible. Además, los resultados de la prueba del parche de Insulto Repetido sugieren adicionalmente el uso de la crema de LIP como una composición cosmética segura.

Ejemplo 7

La crema de LIP es altamente eficiente al blanquear la pigmentación de la piel

15 Se comparó el efecto de la crema de LIP en el blanqueamiento de la piel con cremas en la técnica anterior en un estudio doble ciego.

Diseño del estudio

Sujetos del estudio – El estudio incluyó 12 hombres y mujeres sanos con edades de 18 – 65 de origen asiático que estaban libres de enfermedad, sin historia de enfermedades de la piel o enfermedades atópicas (asma, fiebre del 20 heno, rinitis alérgica) y sin sensibilidad conocida a cualquiera de las sustancias probadas y a cualquiera de los componentes de la preparación cosmética. El estudio excluyó candidatos que estaban sometidos a tratamiento con fármacos anti-inflamatorios, antihistamínicos o corticosteroides para tratamiento sistémico o local, a no ser que el tratamiento se hubiera interrumpido dos semanas en el caso del tratamiento sistémico y tres días en el caso del tratamiento local antes de inscribirse en el estudio. También se excluyeron del estudio candidatos con cáncer, 25 enfermedad renal o enfermedad hepática en cualquier etapa de diagnóstico o tratamiento, como también mujeres

embarazadas o lactando.

Protocolo del estudio – El estudio incluyó dos tipos de cremas que se aplicaron de forma doble ciega cada una en el antebrazo superior; la crema blanqueadora de la presente invención que incluye LIP como el principio activo, y un producto comercializado, hidroquinona al 2 % (Esomed Medibrands, Israel). Las cremas se aplicaron dos veces al día (es decir, mañana y noche). Las partes inferiores de los antebrazos permanecieron sin tratamiento. Los sujetos del estudio fueron examinados por el personal del Instituto de Investigación de la Piel (Tel Aviv, Israel), al principio del estudio (semana 0), y después de una, dos y tres semanas de la aplicación de la crema. En cada examen se documentó la pigmentación de la piel y los efectos secundarios.

Evaluación de la pigmentación de la piel – La pigmentación de la piel fue evaluada usando un Derma Spectrometer (Cortex Technology, Dinamarca), fotografías a color que fueron tomadas usando la misma distancia y exposición a la luz e inspección visual hecha por el Prof. Brenner (Cabeza del Departamento de Dermatología, Centro Médico Souraski, Tel Aviv, Israel) y su equipo.

Resultados del estudio

La crema de LIP redujo la pigmentación de la piel después de 3 semanas de aplicación – Para evaluar el efecto de la crema LIP en el blanqueamiento de la piel, se aplicó la crema de LIP dos veces al día en la parte superior del brazo derecho de 12 voluntarios sanos. Tal como se muestra en las Figuras 11a-b y 13a-b que incluyen fotografías representativas de dos sujetos del estudio, después de tres semanas de aplicación de la crema la parte superior del antebrazo derecho parecen más blancas que antes de la aplicación de la crema.

La crema de LIP es más eficiente en el blanqueamiento de la piel que la crema de hidroquinona – El efecto de la crema de LIP para reducir la pigmentación de la piel se comparó con el de la hidroquinona al 2 %. Después de 21 días de aplicación de la crema, la pigmentación del área tratada con LIP del sujeto Nº 1 del estudio se redujo en 3,33 unidades (La Figura 12a columnas azules y la Figura 12c curva azul). Por otro lado, la pigmentación del área no tratada en el mismo antebrazo se redujo en 1,13 unidades (Figura 12a, columnas azul claro). Por otro lado, después de 21 días de tratamiento usando la crema de hidroquinona, la pigmentación del área tratada se redujo solo en 1 unidad (Figura 12b columnas rosadas y Figura 12c curva rosada). Efectos similares se observaron en otros sujetos del estudio como se muestra en las Figuras 14a-c. Cuando se resumieron los resultados de los 12 sujetos del estudio se encontró que las reducciones promedio en la pigmentación de la piel fueron de 1,57 unidades (Figura 15a, curva azul) y 1,49 (Figura 15a, curva rosada) unidades en antebrazos tratados con LIP y con hidroquinona, respectivamente. Además, cuando las reducciones en las pigmentaciones de la piel fueron se normalizaron a la pigmentación inicial de la piel, el promedio de disminución de las pigmentaciones de la piel fue del 4,3 % (Figura 15b, curva azul) y del 3,8 % (Figura 15b, curva rosada) para los antebrazos tratados con LIP e hidroquinona, respectivamente.

En general, estos resultados demuestran que la crema de LIP es altamente eficiente reduciendo la pigmentación de la piel. Además, estos resultados sugieren que el efecto blanqueador relativo de la crema de LIP es más alto que el efecto de blanqueamiento relativo observado usando la crema de hidroquinona al 2 %.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que por claridad se describen en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una sola modalidad. En cambio, varias características de la invención, que por brevedad se describen en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier sub-combinación adecuada.

Aunque la invención ha sido descrita en conjunción con modalidades especificas de la misma, es evidente que varias alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Como corresponde, se pretende abarcar todas aquellas alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes, aplicaciones de patente y secuencias se divulgan identificadas por sus números de adquisición mencionados en esta especificación. Adicionalmente, la citación o identificación de cualquier referencia en esta aplicación no debe ser interpretada como una admisión de que tal referencia es disponible como técnica previa a la presente invención.

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13.

Leisola, M., Ulmer, D., Fiechter, A. (1983). Problem of oxygen transfer during degragation of lignin by Phanerochaete chrysosporium. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 113-116.

14.

Michel, F.C., Grulcke, E.A., Reddy, C.A. (1992). Determination of the respiration kinetics for mycelial pellets of Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 58: 1740-1745.

15.

Popp, J.L., Kalyanaraman, B., Kirk, T.K. (1990). Lignin peroxidase oxidation of Mn2+ in the presence of veratryl alcohol, malonic or oxalic acid, and oxygen. Biochemistry 29: 10475-10480,

16.

Rothschild, N., Levkowitz, A., Hadar, Y., Dosoretz, C. (1999). Manganese deficiency can replace high oxygen levles needed for lignin peroxidase formation by Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 65: 483-8.

<110> R.B.T (Rakuto Bio Technologies) Ltd.

<120> METHODS OF PRODUCING LIGNIN PEROXIDASE AND ITS USE IN SKIN AND HAIR LIGHTENING

<130> FSS-12882-EP

<140> 03777155.7

<141> 11-Diciembre-2003

<150> US 60/432,678

<151> 12-Diciembre-2002

<160> 1

<170> Patent In version 3.1

<210> 1

<211> 1119

<212> DNA

<213> Phanerochaete chrysosporium

<400> 1 Listado de secuencias

<110> R.B.T (Rakuto Bio Technologies) Ltd.

<120> METHODS OF PRODUCING LIGNIN PEROXIDASE AND ITS USE IN SKIN AND HAIR LIGHTENING 5 <130> FSS-12882-EP

<140> 03777155.7

<141> 11-December-2003

<150> US 60/432,678

<151> 12-December-2002 10 <160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1119

<212> DNA 15 <213> Phanerochaete chrysosporium

<400> 1

Claims (48)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método no terapéutico para aclarar una región de piel o el pelo de un sujeto, comprendiendo el método aplicar a la región de la piel o al pelo por lo menos un tipo de una enzima de lignina peroxidasa incluida en una composición cosmética a una concentración de 1-100 U/g de una forma apropiada para oxidar un pigmento contenido dentro de las células de la región de la piel o del pelo.

2. 2.

   El método no terapéutico de la reivindicación 1, donde dicha lignina peroxidasa es isoenzima H1 o una forma modificada de isoenzima H2.

3. 3.

   El método no terapéutico de la reivindicación 1, donde dicha aplicación se realiza por medio de una aplicación tópica de una preparación que incluye dicho por lo menos un tipo de enzima de lignina peroxidasa.

4. 4.

   El método no terapéutico de la reivindicación 1, donde dicha aplicación se realiza por medio de la administración intradérmica o subcutánea de una preparación que incluye dicho por lo menos un tipo de enzima de lignina peroxidasa.

5. 5.

   El método no terapéutico de la reivindicación 1, donde dicho por lo menos un tipo de enzima de lignina peroxidasa está incluido en una composición formulada para aplicación a la piel o el pelo.

6. 6.

   El método no terapéutico de la reivindicación 5, donde dicha composición comprende además un aceptor de electrones.

7. 7.

   El método no terapéutico de la reivindicación 5, donde dicha composición comprende además alcohol veratrílico.

8. 8.

   El método no terapéutico de la reivindicación 5, donde dicha composición comprende por lo menos un tipo de un agente de penetración epidérmico.

9. 9.

   El método no terapéutico de la reivindicación 5, donde dicha composición comprende por lo menos un tipo de agente de penetración del pelo.

10. 10.

    El método no terapéutico de la reivindicación 1, donde dicha aplicación se realiza durante un periodo de tiempo seleccionado de acuerdo a un nivel de aclaramiento deseado.

11. 11.

    Una composición cosmética para aclarar una región de la piel o el pelo de un sujeto, que comprende una enzima de lignina peroxidada a una concentración de 1-100 U/g y un vehículo cosméticamente aceptable, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable está en una formulación seleccionada de un grupo que consiste de una emulsión de aceite-en-agua, una emulsión de agua-en-aceite, una emulsión de agua-en-aceite-en-agua, una emulsión de aceite-en-agua-en-silicona, una crema, un ungüento, una loción, un aerosol y un vehículo que comprende un emoliente, un surfactante y un acondicionador.

12. 12.

    La composición cosmética de la reivindicación 11, que comprende además un mediador oxidante.

13. 13.

    La composición cosmética de la reivindicación 11, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable se formula para uso en la piel o el pelo.

14. 14.

    La composición cosmética de la reivindicación 12, donde dicho mediador oxidativo es alcohol veratrílico o veratrol.

15. 15.

    La composición cosmética de la reivindicación 11, 12, 13 o 14, donde dicha lignina peroxidasa es isoenzima H1 o una forma modificada de isoenzima H2.

16. 16.

    La composición cosmética de la reivindicación 11, 12, 13 o 14, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable incluye transcutol y/o butilenglicol.

17. 17.

    La composición cosmética de la reivindicación 11, 12, 13 o 14, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable incluye alcanolaminas.

18. 18.

    La composición cosmética de la reivindicación 14, donde dicho alcohol veratrílico se proporciona a una concentración de por lo menos el 0,05 %.

19. 19.

    Un kit para aclarar una región de la piel o el pelo que comprende un primer recipiente que incluye una enzima de lignina peroxidada incluida en una composición cosmética a una concentración de 1-100 U/g, y un segundo recipiente que incluye un aceptor de electrones.

20. 20.

    El kit de la reivindicación 19, donde dicho primer recipiente comprende además alcohol veratrílico.

21. 21.

    El kit de la reivindicación 19, donde dicha lignina peroxidasa es isoenzima H1 o una forma modificada de isoenzima H2.

22. 22.

    El kit de la reivindicación 19, donde dicho aceptor de electrones incluido es peróxido de hidrógeno.

23. 23.

    El kit de la reivindicación 20, donde dicho alcohol veratrílico se proporciona en una concentración de por lo menos el 0,05 %.

24. 24.

    El kit de la reivindicación 22, donde dicho peróxido de hidrógeno se proporciona a una concentración de por lo menos el 0,005 %.

25. 25.

    El kit de la reivindicación 19, donde dichos primero y/o segundo recipiente(s) incluyen además un vehículo cosméticamente aceptable adecuado para la penetración epidérmica.

26. 26.

    El kit de la reivindicación 19, donde dicho primer y/o segundo recipiente incluye además un vehículo cosméticamente aceptable adecuado para la penetración del pelo.

27. 27.

    El kit de la reivindicación 25, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable incluye transcutol y/o butilenglicol.

28. 28.

    El kit de la reivindicación 26, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable incluye alcanolaminas.

29. 29.

    Un artículo-de-fabricación que comprende material de envasado y una composición cosmética identificada para aclarar una región de piel o el pelo de un sujeto, estando dicha composición cosmética contenida dentro de dicho material de envasado, incluyendo dicha composición cosmética, como principio activo, una enzima de lignina peroxidada a una concentración de 1-100 U/g, y un vehículo cosméticamente aceptable.

30. 30.

    El artículo-de-fabricación de la reivindicación 29, donde dicha lignina peroxidasa es isoenzima H1 o una forma modificada de isoenzima H2.

31. 31.

    El artículo-de-fabricación de la reivindicación 29, donde dicha composición cosmética comprende además alcohol veratrílico.

32. 32.

    El artículo-de-fabricación de la reivindicación 29, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable incluye composiciones adecuadas para penetración epidérmica o del pelo.

33. 33.

    Uso de un vector de expresión que comprende un promotor funcionalmente enlazado a un polinucleótido que codifica una enzima de lignina peroxidasa para la fabricación de una composición cosmética para aclarar una región de la piel de un sujeto, dicho polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO:1, donde la expresión de dicho polinucleótido dentro de células de la región de la piel se realiza de una forma adecuada para oxidar un pigmento contenido dentro de células de la región de la piel.

34. 34.

    El uso de la reivindicación 33, donde la composición cosmética comprende además un aceptor de electrones.

35. 35.

    El uso de la reivindicación 34, donde dicho aceptor de electrones es peróxido de hidrógeno.

36. 36.

    El uso de la reivindicación 33, donde la composición cosmética además comprende alcohol veratrílico.

37. 37.

    El uso de la reivindicación 33, donde dicho vector de expresión es un vector viral.

38. 38.

    El método no-terapéutico de la reivindicación 1, la composición cosmética de la reivindicación 11, 12, 13 o 14, el kit de la reivindicación 19 o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 29, donde dicha lignina peroxidasa se obtiene por:

    (a)

    cultivo durante un periodo predeterminado de tiempo del hongo Phanerochaete chrysosporium sobre una matriz porosa en un medio de cultivo agitado y aireado que contiene glicerol;

    (b)

    después de dicho periodo de tiempo predeterminado, extracción de una fracción soluble de dicho hongo Phaherochaete chrysosporium.

39. 39.

    El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o artículo-de-fabricación de la reivindicación 38, donde dicho medio de cultivo carece de iones de manganeso.

    40, El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 38, donde dicho cultivo aireado se obtiene sometiendo dicho medio de cultivo a una velocidad de aireación en el intervalo de 0,1 – 1 litro por litro por minuto.

40. 41.

    El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 38, donde dicho cultivo se realiza a una temperatura de 37 °C.

41. 42.

    El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 38, donde dicho medio de cultivo agitado se obtiene agitando dicho medio de cultivo a una velocidad en el intervalo de 50-300 rpm.

42. 43.

    El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 38,

    donde dicho medio de cultivo agitado se obtiene agitando dicho medio de cultivo a una velocidad de 160 rpm.
43. 44. El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 38, donde dicho periodo de tiempo predeterminado se selecciona del intervalo de 3-10 días.
44. 45. El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 38, 5 donde dicho periodo de tiempo predeterminado es de 7 días.
45. 46. El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 38, donde dicho glicerol se proporciona a un intervalo de concentración de 3-20 gramos por litro.
46. 47. El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 38, donde dicho glicerol se proporciona a una concentración de 6 gramos por litro.

    10 48. El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 38, donde dicho medio de cultivo incluye además alcohol veratrílico.
47. 49. El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 48, donde dicho alcohol veratrílico se proporciona a un intervalo de concentración de 0,5-4 mM.

    50, El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 48, 15 donde dicho alcohol veratrílico se proporciona a una concentración de 2 mM.
48. 51. El método no terapéutico, la composición cosmética, el kit o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 38, donde dicha matriz porosa es una espuma de poliuretano.

    Dopacromotautomerasa

    Concentración H2O2 Concentración H2O2

    Puntuación de pigmentación

    Puntuación de pigmentación

    Puntuación de pigmentación

    Puntuación de pigmentación

    Puntuación de pigmentación

    Puntuación de pigmentación Puntuaciones medias de pigmentación