ES2355818T3 - Uso de lignina peroxidasa en el aclaramiento de la piel y el pelo. - Google Patents

Abstract

Un método no terapéutico para aclarar una región de piel o pelo de un sujeto, el método que comprende aplicar a la región de la piel o pelo por lo menos un tipo de una enzima de lignina peroxidasa de una forma apropiada para oxidar un pigmento contenido dentro de las células de la región de la piel o pelo.

Description

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención está relacionada con métodos para producir lignina peroxidasa y su uso en el aclaramiento de la piel y el pelo. 5

Melanina

El color de la piel y pelo humano está gobernado por la cantidad, calidad, y distribución de la melanina, un pigmento que también está presente en plantas y microorganismos.

La síntesis de melanina es iniciada por el precursor L-tirosina que es transformado en un segundo precursor dopaquinona por medio de la acción de la tirosinasa. En la biosíntesis de la melanina de los mamíferos, 10 este intermediario puede ser polimerizado por medio de dos rutas principales (Figura 1). La adición intramolecular nucleofílica del grupo amino da lugar al derivado de indol leucodopacromo que, después de la polimerización, produce el pigmento marrón oscuro a negro eumelanina. En la presencia de compuestos tiol se forman derivados de tioéster de dopa; la reacción con cisteína produce cisteinildopa, que después de oxidación adicional y polimerización produce el pigmento amarillo a rojizo marrón faeomelanina. Como consecuencia, la eumelanina está principalmente 15 compuesta de unidades de 5,6-dihidroxiindol (DHI) y 5,6-dihidroxiindol-2-ácido carboxílico (DHICA), mientras que faeomelanina contiene principalmente unidades de benzotiacina (Alaluf et al., 2001). La disponibilidad y proporción mutua de estos dos pigmentos influencia la composición química del pigmento polimérico.

La síntesis de melanina tiene lugar en gránulos, a los que se les llama melanosomas (Cooksey et al., 1997) que están presentes en células de melanocitos presentes en las capas basales de la epidermis; la síntesis de 20 melanina en estas células es inducida por luz ultravioleta (UV). Después de la síntesis, la melanina migra a las células de la epidermis y allí es dispersada, donde la melanina es decolorada después del metabolismo de la dermis y después es descamada en forma de mugre durante la renovación de la piel. La melanina tiene una importancia clínica ya que protege la piel de efectos adversos causados por la luz UV. Sin embargo, altos niveles de melanina pueden resultar en oscurecimiento no deseado de la piel y el pelo, mientras que la distribución heterogénea del 25 mismo puede llevar a cloasma y aparición de pecas que pueden ser desagradables estéticamente.

Productos Aclaradores

Los productos aclaradores de la piel se han vuelto cada vez mas populares en los últimos años. El principal propósito de los productos aclaradores de la piel es aclarar o blanquear la piel o para tratar problemas de pigmentación tales como cloasma, pecas, marcas del embarazo y manchas de la edad. Diversos tipos de productos 30 aclaradores de la piel están disponibles actualmente.

Productos basados en la degeneración y muerte de las células de pigmento típicamente incluyen productos químicos fuertes, tales como hidroquinona, 4-isopropilcatecol, e hidroquinona monobencil éter, que promueven el blanqueado de la piel y el aclaramiento de la piel o el desvanecimiento de la pigmentación de la piel. Tales productos son típicamente ineficientes y pueden ser dañinos para la piel ya que una aplicación externa continua de estos 35 productos puede llevar a leucoderma permanente y efectos secundarios tales como discromatosis y sarpullido.

Otros productos aclaradores son basados en la inhibición de la tirosinasa, la enzima que transforma el precursor L-tirosina en un segundo precursor dopaquinona. Este grupo de productos incluye Arbutin, un compuesto de glucosa hidroquinona que es capaz de inhibir la tirosinasa quelatando iones de cobre de esta forma suprimiendo la tautomerización de Dopacromo a DHICA. 40

El melanostato es otro producto aclarador que actúa a través de la tirosinasa. El melanostato es un péptido sintético que funciona desactivando la melanogénesis en melanocitos.

Varios compuestos antioxidantes que pueden inhibir la producción de melanina también son utilizados en los productos aclaradores. Ya que la síntesis de melanina involucra una reacción de oxidación, bloqueando la oxidación en varios puntos desde tirosina/DOPA a melanina a la larga inhibe la síntesis de melanina. 45

Un antioxidante que es utilizado para bloquear la síntesis de melanina es L-Ascórbico (vitamina C) que actúa como un agente reductor en los intermediarios de melanina y bloquea reacciones oxidativas; otros antioxidantes utilizados por productos de aclaramiento incluyen bioflavonoides que son típicamente extraídos de mora o regaliz.

Los productos aclaradores del pelo actúan sobre la melanina dentro de la corteza del pelo. Existen varios 50 químicos que pueden aclarar el pelo, entre ellos están incluidos el ácido hidroclórico, hipoclorito de sodio y peróxido de hidrógeno.

El químico más común usado para aclarar el pelo es el peróxido de hidrógeno. Para mantener la efectividad deseada, las soluciones de peróxido de hidrógeno deben ser estabilizadas usando compuestos tales como acetanilida, ácidos diluidos, sílice coloidal, p-hidroxibenzoatos, sulfato de oxiquinolina, fenacetina, y compuestos de 55

estaño ( estanato de sodio, hidróxido estánico, octoato estanoso). Antes de que el pelo sea aclarado, se agrega amoniaco a la solución de peróxido de hidrógeno para mejorar la penetración del peróxido de hidrógeno a través de la cutícula, la capa externa del pelo, y por lo tanto acelerar la reacción de oxidación.

JP 2002 012535 A (LION CORP) Enero 15 del 2002 (2002-01-15) divulga un método para aclarar una región de la piel o el pelo de un sujeto, el método comprende la aplicación de peroxidasa. 5

Mientras la presente invención se redujo a la práctica, los presentes inventores han descubierto que la isoenzima H1 lignina peroxidasa puede oxidar la melanina in vitro y puede adicionalmente aclarar la piel y el pelo in vivo.

Por lo tanto, la presente invención provee composiciones cosméticas y métodos que son altamente adecuados para la aclaración de piel y pelo. 10

Resumen de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se provee un método no-terapéutico de aclarar una región de la piel o pelo de un sujeto, que comprende aplicar a la región de la piel o pelo por lo menos un tipo de enzima modificadora de lignina de una forma apropiada para oxidar un pigmento contenido dentro de las células de la región de la piel o pelo. 15

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se provee una composición cosmética para aclarar una región de la piel o un sujeto que comprende por lo menos un tipo de una enzima modificadora de lignina y un vehículo cosméticamente aceptable de acuerdo con la reivindicación 11.

De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención se provee un equipo para aclarar una región de la piel o pelo que comprende un primer recipiente que incluye una enzima modificadora de lignina, y un segundo 20 recipiente que incluye un receptor de electrones.

De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención se provee un articulo de manufactura que comprende un material de empaque y una composición cosmética identificada para aclarar una región de la piel o pelo de un sujeto que está contenido dentro del material de empaque, la composición cosmética incluye, como un ingrediente activo, una enzima modificadora de lignina, y un vehículo cosméticamente aceptable. 25

De acuerdo con características adicionales en modalidades preferidas de la invención descrita más abajo, el método es efectuado por medio de una aplicación tópica de una preparación que incluye por lo menos un tipo de enzima modificadora de lignina.

De acuerdo con aún otras características adicionales en las modalidades preferidas descritas el método es efectuado por medio de la administración por vía intradérmica o subcutánea de una preparación que incluye por lo 30 menos un tipo de enzima modificadora de lignina.

De acuerdo con aún mas características en las modalidades preferidas descritas la enzima modificadora de lignina está incluida en una composición formulada para la aplicación en la piel o pelo. La enzima modificadora de lignina es lignina peroxidasa.

De acuerdo con aún más características adicionales en las modalidades preferidas descritas la lignina 35 peroxidasa es una isoenzima H1 o una forma modificada de isoenzima H2.

De acuerdo con características adicionales en las modalidades preferidas descritas la composición cosmética comprende adicionalmente un receptor de electrones.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el receptor de electrones es peróxido de hidrógeno. 40

De acuerdo con características adicionales en las modalidades preferidas descritas la composición cosmética comprende adicionalmente alcohol veratrílico.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas la composición comprende por lo menos un tipo de penetrante epidérmico.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas la composición 45 comprende por lo menos un tipo de penetrante de pelo.

De acuerdo con aún más características adicionales en las modalidades preferidas descritas el método es efectuado por un periodo de tiempo seleccionado de acuerdo con un nivel de aclarado deseado.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el vehículo cosméticamente aceptable incluye transcutol y/o glicol de butileno. 50

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el vehículo cosméticamente aceptable incluye aminas de alcanol.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas la lignina peroxidasa en la composición cosmética es provista a una concentración de por lo menos 1U/gr.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el peróxido de hidrógeno en la composición cosmética es provisto a una concentración de por lo menos 0.005%.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el alcohol 5 veratrílico en la composición cosmética es provisto a una concentración de por lo menos 0.05%.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el primer recipiente del equipo para aclarar una región de piel o pelo comprende adicionalmente alcohol veratrílico.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el primer y/o segundo recipiente(s) del equipo para aclarar una región de piel o pelo incluye adicionalmente un vehículo 10 cosméticamente aceptable para la penetración epidérmica.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el primero y/o segundo recipiente(s) del equipo para aclarar una región de la piel o pelo incluye adicionalmente un vehículo cosméticamente aceptable adecuado para la penetración del pelo.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se provee el uso de un polinucleótido que 15 codifica una enzima de lignina peroxidasa para aclarar una región de la piel de un sujeto, el método que comprende, expresar dentro de las células de la región de la piel una enzima de lignina peroxidasa de una forma adecuada para oxidar un pigmento contenido dentro de las células de la región de la piel.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el método comprende adicionalmente un paso para proveer a las células de la región de la piel un receptor de electrones. 20

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el receptor de electrones es peróxido de hidrógeno.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el método comprende adicionalmente un paso para proveer a las células de la región de la piel alcohol veratrílico.

La expresión es efectuada introduciendo en las células un vector de expresión capaz de expresar la enzima 25 modificadora de lignina.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el vector es un vector viral.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el vector comprende un promotor enlazado funcionalmente a una secuencia codificadora de enzima modificadora de lignina. 30

La enzima modificadora de lignina es lignina peroxidasa.

La lignina peroxidasa es codificada por la secuencia polinucleotídica expuesta en NO:1.

La lignina peroxidasa es obtenible por un proceso que comprende: (a) cultivar el hongo Phanerochaete chrysosporium en una matriz porosa en un medio de cultivo agitado y aireado que contiene glicerol por un periodo de tiempo predeterminado; (b) después del periodo de tiempo predeterminado se extrae una fracción soluble del 35 hongo Phanerochaete chrysosporium para de esta forma producir la lignina peroxidasa.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el medio de cultivo carece de iones de manganeso.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el cultivo aireado es obtenido sometiendo el medio de cultivo a un índice de aireación en el rango de 0.1-1 litro por litro por 40 minuto.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el cultivo es efectuado a una temperatura de 37 °C.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el medio de cultivo agitado es obtenido agitando el medio de cultivo a una velocidad en el rango de 50-300 rpm. 45

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el medio de cultivo agitado es obtenido agitando el medio de cultivo a una velocidad de 100 rpm.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el periodo de tiempo predeterminado es seleccionado del rango de 3-10 días.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el periodo de tiempo predeterminado es 7 días.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el glicerol es provisto a un rango de concentración de 3-20 gramos por litro.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el glicerol es 5 provisto a una concentración de 6 gramos por litro.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el medio de cultivo incluye adicionalmente alcohol veratrílico.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el alcohol veratrílico es provisto a un rango de concentración de 0.5-4 mM. 10

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas el alcohol veratrílico es provisto a una concentración de 2 mM.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas la lignina peroxidasa es la isoenzima H1 o una forma modificada de la isoenzima H2.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas la matriz 15 porosa es una espuma de poliuretano.

es obtenible por este proceso un extracto acuoso del hongo Phanerochaete chrysosporium exhibe actividad enzimática de lignina peroxidasa en el rango de 500-2000 unidades por litro.

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas la actividad de la lignina peroxidasa es 1500 unidades por litro. 20

De acuerdo con aún mas características adicionales en las modalidades preferidas descritas la actividad enzimática de la lignina peroxidasa es la isoenzima H1 o una forma modificada de la isoenzima H2.

La presente invención trata con éxito los defectos de las configuraciones conocidas actualmente al proveer métodos eficientes y composiciones para aclarar una región de la piel o pelo de un sujeto.

A menos que sea definido de otra forma, todos los términos científicos y técnicos usados aquí tienen el 25 mismo significado como es comúnmente entendido por alguien de habilidades ordinarias en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí pueden ser usados en la práctica o en las pruebas de la presente invención, se describen métodos y materiales aceptables mas abajo. En caso de conflicto, la especificación de la patente, incluyendo definiciones, va a controlar. Adicionalmente, los materiales, métodos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no se intenciona que sean 30 limitantes.

Breve descripción de los dibujos

La invención es aquí descrita, por medio de ejemplos solamente, con referencia a los dibujos que le acompañan. Ahora con referencia específica a los dibujos en detalle, se estresa que los particulares mostrados son por medio de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de las modalidades preferidas de la presente 35 invención solamente, y son presentadas en la causa para proveer lo que se cree ser la descripción mas útil y fácilmente entendida de los principios y aspectos conceptuales de la invención. En este aspecto, no se hace ningún intento para mostrar detalles estructurales de la invención en mas detalle que lo necesario para un entendimiento fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos hace aparente a aquellos diestros en la técnica como varias formas de la invención pueden ser plasmadas en la practica. 40

En los dibujos:

La FIG. 1 es una ilustración esquemática de la previa técnica de la biosíntesis de melanina de mamífero adoptada de Alauf et al., 2001.

La FIG. 2 ilustra el tanque de reactor por agitación (STR) para la producción de lignina peroxidasa por Phanerochaete chrysosporium inmovilizado en espuma de poliuretano. 45

La FIG. 3 ilustra la actividad de LIP en un cultivo fermentador de P. Chrysosporium como una función de edad de cultivo. P. Chrysosporium fue cultivado en un fermentador STR como es descrito en el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos y la actividad LIP fue ensayada en el fluido extracelular siguiendo la oxidación de alcohol veratrílico a aldehído veratrílico como es descrito en los Ejemplos. Las barras de error representan desviaciones estándar de los 3 experimentos réplica. 50

La FIG. 4 ilustra la oxidación de melanina, a una concentración inicial de 70.5 µg/ml, por LIP (0.48 µM) como una función de las concentraciones en aumento de peróxido de hidrógeno en la presencia de 1.5 mM de alcohol veratrílico en 50 mM de amortiguador de tartrato, a un pH de 3.5. La oxidación de melanina fue determinada

midiendo su absorbancia a 460 nm, al principio de la reacción enzimática y después de 160 segundos, y los porcentajes de melanina oxidada fueron calculados. Las barras de error representan las desviaciones estándar de los 3 experimentos réplica.

La FIG. 5 ilustra el efecto de concentraciones en aumento de peróxido de hidrógeno sobre la oxidación de melanina por LIP. El grado de oxidación de melanina es visualizado por la disminución en la intensidad de color en 5 comparación con la reacción enzimática sin la inclusión de peróxido de hidrógeno (0 µM). Los números debajo de la foto indican las concentraciones de H2O2 expresados en µM.

La FIG. 6 ilustra el grado de oxidación de diferentes concentraciones de melanina por LIP (0.48 µM) en 50 mM de amortiguador de tartrato a un pH de 3.5 en la presencia de alcohol veratrílico (1.5 mM) y peróxido de hidrógeno (600 µM). Las barras de error representan las desviaciones estándar de 3 experimentos réplica. 10

La FIG. 7 ilustra el grado de oxidación de melanina como una función de las concentraciones de LIP. La oxidación de melanina (70 µg/ml) fue realizada aumentando las concentraciones de LIP en la presencia de alcohol veratrílico (1.5 mM) y peróxido de hidrógeno (700 µM) en 50 mM de amortiguador de tartrato a un pH de 3.5. Las barras de error representan las desviaciones estándar de 3 réplicas del experimento.

Las FIGs. 8a-b ilustran la visualización de la oxidación de melanina por LIP cuando son usados en una formulación 15 de una crema. La decoloración de melanina es observada después de agregar la crema activadora a la crema LIP (Figura 8b) pero no en la presencia de la crema LIP solamente (Figura 8a).

Las FIGs. 9a-b ilustran el efecto de la crema LIP en el blanqueamiento de la piel. Se muestra una fotografía de la mano de una mujer tomada una semana después de la aplicación de LIP (dos veces al día) en una formulación de crema. El área tratada con LIP (la Figura 9a, en un circulo negro) es mucho mas clara que el resto de la piel en la 20 mano (Figura 9b).

La FIG. 10 ilustra el efecto de LIP en el blanqueamiento del pelo in vivo. El pelo de una mujer fue remojado por 1 hora en 50 mM de amortiguador de carbonato con un pH de 11.5. El pelo fue pre-incubado por 10 segundos con 25 U de LIP y sumergido por 1 hora en amortiguador de tartarato con un pH de 3.5 con alcohol veratrílico (1.5 mM) y peróxido de hidrógeno (8.8 mM). Un efecto aclarador significativo fue observado en el pelo tratado con LIP (la Figura 25 10, tubo derecho) comparado con el pelo tratado con la misma solución sin LIP (la Figura 10, tubo izquierdo).

Las FIGs. 11a-b son fotografías a color del antebrazo derecho del sujeto de estudio No. 1 que ilustra el efecto de la crema blanqueadora LIP en la pigmentación de la piel. La Figura 11a – una fotografía tomada el día 0; La Figura 11b- una fotografía tomada el día 21.

Las FIGs. 12a-c ilustran el efecto de LIP o cremas de Hidroquinona en el blanqueamiento de la piel en el sujeto de 30 estudio No. 1. Las cremas de LIP o Hidroquinona fueron aplicadas en las partes superiores del antebrazo derecho e izquierdo en intervalos de 7 días usando Derma Spectrometer. La Figura 12a- aplicación de crema LIP; La Figura 12b- aplicación de crema de Hidroquinona; columnas azules = parte superior del antebrazo derecho tratado con la crema LIP; columnas azul claro = parte inferior den antebrazo derecho no tratado; columnas rosadas = parte superior del antebrazo izquierdo tratado con Hidroquinona; columnas blancas = parte inferior no tratada del 35 antebrazo izquierdo; La Figura 12c es una gráfica lineal que compara la disminución en la pigmentación de la piel en los antebrazos superiores después de 21 días de tratamiento usando la crema LIP (la Figura 12c, línea azul) o la crema de Hidroquinona (la Figura 12c, línea rosada). Nótese la drástica disminución en la pigmentación de la piel después de 21 días de tratamiento usando la crema LIP como se compara con la disminución moderada usando la crema de Hidroquinona. 40

Las FIGs. 13a-b son fotografías a color del antebrazo derecho del sujeto No. 10 del estudio que ilustran el efecto de la crema blanqueadora de LIP en la pigmentación de la piel. La Figura 13a – una fotografía tomada el día 0; la Figura 13b – una fotografía tomada el día 21.

Las FIGs. 14a-c ilustran el efecto de las cremas de LIP o hidroquinona en el blanqueamiento de la piel en el sujeto No. 10 del estudio. Las cremas de LIP o hidroquinona fueron aplicadas en las partes superiores de los antebrazos 45 derecho e izquierdo mientras que las partes inferiores no fueron tratadas. El grado de pigmentación de la piel fue medido en ambos antebrazos en intervalos de 7 días usando el Derma Spectrometer. La Figura 14a- aplicación de la crema de LIP; La Figura 14b- aplicación de crema de Hidroquinona; columnas azules = parte superior del antebrazo derecho tratado con la crema de LIP; columnas azul claro = parte inferior no tratada del antebrazo derecho, columnas rosadas = parte superior del antebrazo izquierdo tratado con Hidroquinona; columnas blancas = parte 50 inferior no tratada del antebrazo izquierdo; La Figura 14c es una gráfica lineal que compara la disminución en la pigmentación de la piel de los antebrazos superiores después de 21 días de tratamiento usando la crema de LIP (Figura 14c, línea azul) o la crema de Hidroquinona (Figura 14c, línea rosada). Nótese la disminución drástica en la pigmentación de la piel después de 21 días de tratamiento usando la crema de LIP comparado con la disminución moderada usando la crema de Hidroquinona. 55

Las FIGs. 15a-b son gráficas lineales que ilustran el efecto promedio de las cremas de LIP e Hidroquinona en el blanqueamiento de la piel en los 12 sujetos del estudio. La Figura 15a – las puntuaciones promedio de

pigmentación; la Figura 15b – la disminución promedio en la pigmentación como una fracción de la puntuación inicial de pigmentación.

Descripción de las modalidades preferidas

La presente invención es de métodos no terapéuticos y composiciones cosméticas que pueden ser usados para aclarar una región de la piel o pelo de un sujeto. 5

Particularmente, los métodos de la presente invención pueden ser usados para tratar complexiones de piel no parejas que resultan por condiciones medicas relacionadas con hiperpigmentación tales como melasma, cloasma, manchas por la edad, pecas, ocronosis y lentigo.

Los principios y operación de la presente invención pueden ser mejor entendidos con referencia a los dibujos y las descripciones que les acompañan. 10

Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención en detalle, debe ser entendido que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados en los Ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o de ser practicada o realizada de varias formas. También, debe entenderse que la fraseología y terminología usada aquí es para el propósito de descripción y no debe ser vista como limitante. 15

El grado de pigmentación de la piel es una fuente de preocupación entre la población general. Algunas personas sufren de manchas de edad y marcas de embarazo y desean que los puntos pigmentados sean menos pronunciados. Otras personas tienen pecas, cloasma, melasma, ocronosis y lentigo que son usualmente tratados con productos aclaradores de la piel que aclaran y suavizan la pigmentación de la piel. Sin embargo, los productos actuales para aclarar la piel son químicos fuertes tales como hidroquinona que pueden llevar a leucoderma 20 permanente y efectos secundarios tales como discromatosis y sarpullido, o no son lo suficientemente eficientes en el aclaramiento de la piel. Entre ellos hay productos basados en la inhibición de la tirosinasa, la enzima que transforma el precursor L-tirosina en un segundo precursor dopaquinona y por lo tanto inhibe la biosíntesis de melanina. Otros productos son diseñados para bloquear las reacciones de oxidación en varios puntos de tirosina/DOPA a melanina y a la larga inhiben la síntesis de melanina. El ultimo grupo de productos incluye antioxidantes tales como L-Ascórbico 25 (Vitamina C) y bioflavonoides.

Los productos aclaradores del pelo utilizan altas concentraciones de peróxido de hidrógeno en conjunción con amoniaco. Estos productos pueden ser una fuente de molestia para el sujeto tratado.

Como es claramente ilustrado en la sección de Ejemplos que sigue a continuación, los presentes inventores han descubierto que la lignina peroxidasa, y en particular su isoforma H1, puede eficientemente oxidar la melanina y 30 por lo tanto puede ser utilizada para aclarar la piel o pelo de un sujeto.

Aunque la Pat. U.S. No. 5,578,296 identificó una potencia para descomponer la melanina en el hongo Basidiomycetes y sugirió el uso de este hongo para tratar cloasma y pecas, hasta la fecha, la enzima específica responsable por la descomposición de melanina en el hongo no ha sido descubierta.

Por lo tanto de acuerdo con un aspecto de la presente invención se provee un método de aclarar una región 35 de la piel o pelo de un sujeto.

El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención es efectuado aplicando a la región de la piel o pelo del sujeto por lo menos un tipo de una enzima de lignina peroxidasa de una forma apropiada para oxidar un pigmento (por ejemplo, melanina) contenido dentro de las células de la región de la piel o el pelo.

Como es usado aquí, la frase “aclarar una región de la piel o el pelo” hace referencia a reducir el tono o 40 color de la piel o pelo reduciendo la cualidad pigmentativa o concentración de pigmento de melanina contenido ahí.

Como es usado aquí, la frase “sujeto” hace referencia a mamíferos, típicamente humanos, y preferiblemente aquellos que tienen exceso de pigmentación en la piel o el pelo, o imperfecciones de la piel tales como pecas etc.

La enzima modificadora de lignina utilizada por la presente invención es lignina peroxidasa, que juega un 45 papel importante en la degradación de la lignina. La secuencia amino de sitio activo de ésta peroxidasa modificadora de lignina y el mecanismo por el cual oxida sustratos es similar a aquella de la peroxidasa de rábano (HRP) y peroxidasa de soya (SBP). Las peroxidasas modificadoras de lignina son capaces de catalizar la oxidación de sustratos con alto potencial de reducción. Esta habilidad única es consistente con un sitio activo heme de baja densidad de electrones, que es indicada por alto potencial de reducción [Cai y Tien (1993). J Biotechnol 30: 79-90]. 50

Aunque cualquier isoforma de lignina peroxidasa conocida en el arte puede ser utilizada por la presente invención (Rothschild et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 857-861), la presente invención preferiblemente utiliza la isoforma H1, desde que es ilustrada en la sección de Ejemplos que sigue a continuación, esta isoforma exhibió actividades de oxidación de melanina tanto in vitro como in vivo.

Varios acercamientos pueden ser usados para preparar la enzima modificadora de lignina utilizada por la presente invención.

Por ejemplo, la isoenzima H1 de lignina peroxidasa puede ser preparada del hongo Phanerochaete chrysosporium. Altos niveles de actividad enzimática de lignina peroxidasa pueden ser producidos del hongo arriba mencionado cuando se cultiva en un tanque reactor fermentador por agitación (STR) mientras que es inmovilizado 5 en espuma de poliuretano o en suspensión (Dosoretz et al., 1993, Appl Environ Microbiol. 59: 1919-26).

De acuerdo con las modalidades preferidas de la presente invención el fermentador es conectado a un sistema de enfriamiento para mantener una temperatura de cultivación de 37 °C y es agitado a una velocidad de 50-300 rpm, mas preferible, 100-200 rpm, mas preferible a 160 rpm. Para aumentar el rendimiento de la actividad de la lignina peroxidasa el fermentador es aireado a un índice de aireación de 0.1-1 litro de aire por litro de medio de 10 cultivo por minuto. De acuerdo con las configuraciones presentemente preferidas el fermentador es aireado a un índice de aireación de 0.2 litros de aire por litro de medio de cultivo por minuto.

Como es descrito bajo Materiales y Métodos Experimentales de la sección de Ejemplos que sigue el Planerochaete chrysosporium es cultivado bajo condiciones de cultivo desprovistas de iones de manganeso y que contienen glicerol como una fuente de carbono. Preferiblemente, el glicerol de la presente invención es provisto a un 15 rango de concentración de 3-20 gramos por litro. De acuerdo con configuraciones preferidas actualmente el glicerol es provisto a una concentración de 6 gramos por litro.

Durante el proceso de purificación de la isoenzima H1 de lignina peroxidasa del hongo arriba mencionado la actividad enzimática de la proteína purificada ha sido probada adicionalmente por un cambio en la absorbancia a 310 nm que ocurre debido a la oxidación del alcohol veratrílico a aldehído veratrílico. 20

Ya que la isoenzima H1 de lignina peroxidasa puede resultar de una desfosforilación post-translacional de la isoenzima H2 (Kuan y Tien, 1989), la lignina peroxidasa usada por la presente invención puede ser preparada defosforilando la isoenzima H2 de lignina peroxidasa.

Enzimas modificadoras de lignina usadas por la presente invención también pueden ser extraídas de células bacterianas modificadas para expresar la enzima modificadora de lignina como se divulga en la patente US 25 5,200,338. Por ejemplo, una célula bacteriana, tal como, E.coli, puede ser transformada con un vector de expresión que incluye la secuencia codificadora de LIP (SEQ ID NO:1) posicionado bajo el control regulatorio de un fuerte promotor constitutivo (por ejemplo, SP6). Después de la expresión, las células bacterianas pueden ser lisadas y el LIP puede ser recolectado usando técnicas cromatográficas (véase, Billman-Jacobe, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:500-4; Harris y Emtage, 1986, Microbiol, Sci. 3: 28-31, para mas detalles). 30

Enzimas modificadoras de lignina usadas en la presente invención también pueden ser extraídas de líneas celulares mamíferas tales como células HeLa. En este caso la secuencia codificadora de LIP es ubicada bajo un fuerte promotor mamífero (por ejemplo, CMV) en un vector de expresión apropiado (por ejemplo, pCDNA3.1, Invitrogen Life Technologies, Frederick, MD, USA). Después de la transfección de células HeLa con el vector de expresión, el producto de expresión LIP puede ser extraído de las células o medio (por ejemplo, modificando la 35 secuencia de LIP para incluir una señal de secreción) por purificación convencional y técnicas cromatográficas (véase Cunha y Aires-Barros, 2002. Mol. Biotechnol. 20: 29-40 para mas detalles).

Aunque la enzima modificadora de lignina puede ser aplicada a la piel o pelo sin necesitar la co-aplicación de compuestos adicionales, la capacidad de aclarado de la enzima modificadora de lignina LIP es mejorada cuando es aplicada en la presencia de un receptor de electrones (es decir una molécula capaz de oxidar un sustrato), que 40 sirve como un activador de oxidación, y/o en la presencia de compuestos fenolicos, tales como alcohol veratrílico (Harvey et al., 1992, Biochem Soc Trans 20: 345-9), y veratrole que sirven como los mediadores de oxidación (Ward et al., Enzyme and Microbial Technology (2002), 30: 490-498).

Por lo tanto, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la enzima modificadora de lignina es aplicada previamente, concomitante o subsecuente a la aplicación de un activador de oxidación, tal como 45 peróxido de hidrógeno un mediador de oxidación, tal como alcohol veratrílico.

La enzima modificadora de lignina puede ser aplicada a la piel o pelo per se, sin embargo, para lograr un aumento en la eficiencia del aclarado, la enzima modificadora de lignina es preferiblemente incluida en una composición cosmética que es formulada para uso específico, tal como, por ejemplo, aclaramiento general de la piel, aclaramiento de pecas o aclaramiento de pelo. Estas composiciones cosméticas pueden incluir penetrantes 50 epidérmicos tales como glicol de butileno y transcutol, y penetrantes de pelo tales como aminas de alcanol.

Como es usado aquí una “composición cosmética” hace referencia a una preparación que incluye los ingredientes activos descritos aquí mas arriba (por ejemplo, LIP) y componentes químicos adicionales tales como vehículos fisiológicamente apropiados y excipientes, un activador oxidativo y/o un mediador oxidativo. El propósito de una composición cosmética es facilitar la administración del ingrediente activo a un organismo. 55

Mas adelante, las frases “vehículo adecuado” usadas para hacer referencia a un vehículo o un diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y que no abroga la actividad biológica y propiedades de la enzima modificadora de lignina.

Aquí el termino “excipiente” hace referencia a una sustancia inerte agregada a una composición cosmética para facilitar la administración de un ingrediente activo. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato 5 de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y glicol de polietileno.

La composición cosmética puede ser aplicada de forma local, por ejemplo, por medio de administración de la composición cosmética directamente en una región del tejido de un paciente. Rutas aceptables de administración pueden, por ejemplo, incluir inyecciones tópicas, subcutáneas e intradérmicas. 10

Composiciones cosméticas de la presente invención pueden ser fabricadas por procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos de mezclado, disolución, granulación, gragea, levigación, emulsificación, encapsulación, aprisionado o liofilización.

Composiciones cosméticas para uso de acuerdo con la presente invención por lo tanto pueden ser formuladas de forma convencional usando uno o mas vehículos fisiológicamente activos que comprenden 15 excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en las preparaciones. La formulación apropiada depende de la propuesta de administración elegida.

Para inyección, los ingredientes activos de la composición cosmética pueden ser formulados en soluciones acuosas, preferiblemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o amortiguador de sal fisiológico. 20

Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constituir con un vehículo adecuado, antes de usar, por ejemplo, una solución estéril, libre de pirógeno con base de agua.

La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está fácilmente dentro de la capacidad de aquellos diestros en la técnica, especialmente en luz de la divulgación detallada aquí provista.

Para cualquier preparación usada en los métodos de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva o 25 dosis puede ser estimada inicialmente de ensayos in vitro. Como se muestra aquí en la sección de Ejemplos las concentraciones de LIP y peróxido de hidrógeno podrían ser optimizadas de ensayos in vitro y pueden ser posteriormente adaptadas para un uso in vivo. Adicionalmente, una dosis puede ser formulada en sistemas de cultivo de tejido o en modelos de animales para lograr una concentración deseada o valoración. Tal información puede ser usada para determinar con mayor exactitud dosis útiles en humanos. 30

Dependiendo en la severidad del problema de pigmentación de la piel (por ejemplo, cloasma, melasma, ocronosis y lentigo) y la respuesta de la piel, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones, con una duración del curso de tratamiento que va desde varios días a varias semanas o hasta que se efectúe la curación o se logre la disminución del problema de la piel.

La cantidad de una composición a ser administrada será, por supuesto, dependiente del sujeto siendo 35 tratado, la severidad de la aflicción, la forma de administración, el juicio del doctor que prescribe, etc.

La enzima modificadora de lignina incluida en la composición cosmética de la presente invención puede también ser provista a concentraciones mas altas y ser prescrita por un doctor como una composición farmacéutica para tratar los problemas de pigmentación de la piel tales como melasma, cloasma, ocronosis, y lentigo.

A continuación se encuentra una descripción de formulaciones que incorporan una enzima modificadora de 40 lignina y formulada para el aclaramiento de la piel o el pelo.

Aclaramiento de la Piel

Para optimizar y controlar el aclaramiento de la piel, la enzima modificadora de lignina es preferiblemente incluida en una composición cosmética que es formulada para propósitos de aclaramiento de piel.

Ya que la composición cosmética aclaradora de la piel de la presente invención es utilizada in vivo, la 45 composición es preferiblemente de alta pureza y sustancialmente libre de contaminantes potencialmente peligrosos, por ejemplo, por lo menos con grado de Comida Nacional (NF), generalmente por lo menos de grado analítico, y preferiblemente por lo menos de grado farmacéutico. Hasta el punto que un compuesto dado debe ser sintetizado antes de su uso, tal síntesis o purificación subsecuente debe resultar preferiblemente en un producto que es sustancialmente libre de cualquier potencial agente tóxico contaminante que puede ser usado durante la síntesis o 50 procedimientos de purificación.

Ingrediente Activo

La lignina peroxidasa, es incluida en la composición cosmética de la presente invención a una concentración seleccionada de un rango de 1-100 U/gr. De acuerdo con las configuraciones presentemente

conocidas la enzima modificadora de lignina incluida en la composición cosmética de la presente invención es provista a una concentración seleccionada de un rango de 5-100 U/gr. Será apreciado, que una concentración preferida de la enzima modificadora de lignina es seleccionada de acuerdo al uso específico de la composición, por lo tanto, para el aclaramiento general de la piel, se utiliza una concentración preferida de 5-20 U/gr, mientras que para aclaramiento de pecas, se utiliza un rango mas amplio de concentración de 5-100 U/gr. 5

El receptor de electrones (activador de oxidación), usado por la composición cosmética de aclaramiento es preferiblemente peróxido de hidrógeno provisto a una concentración de por lo menos 0.005%. El peróxido de hidrógeno es estable, pero se descompone bajo condiciones neutrales o alcalinas para formar agua y una especie activa de oxígeno. Las especies activas de oxígeno son muy reactivas.

La composición cosmética es preferiblemente amortiguada a un pH de 4 o menos ya que la lignina 10 peroxidasa es solo activa a un pH menor de 4, preferiblemente a un pH 2.5-3.5 y el peróxido de hidrógeno es estable a tales pHs.

Cualquier amortiguador capaz de mantener un pH de 4 o menos puede ser utilizado. Por lo tanto, los amortiguadores que usan ácido acético, ácido tartárico, ácido fosfórico o ácido cítrico pueden ser usados por la composición cosmética aclaradora de la piel. 15

Como se muestra en la sección de Ejemplos mas abajo, el peróxido de hidrógeno de la presente invención es estabilizado a un pH de 3.5 con ácido fosfórico.

Los mediadores de oxidación usados por la presente invención son pequeñas moléculas aromáticas o mas específicamente compuestos metoxilados que aumentan el potencial oxidativo y la estabilidad de la enzima modificadora de lignina. Los mediadores preferidos de oxidación usados por la presente invención son alcohol 20 veratrílico y veratrol.

Como es demostrado en la sección de Ejemplos, el alcohol veratrílico incluido en la composición cosmética de la presente invención es preferiblemente diluido en agua a una concentración de por lo menos 0.05%.

Penetrantes epidérmicos

Para mejorar la absorción percutánea de los ingredientes activos (por ejemplo, LIP), uno o mas de un 25 numero de agentes puede ser agregado a la composición cosmética incluyendo, pero no limitado a, dimetilsulfóxido, dimetilacetamida, dimetilformamida, surfactantes, azono, alcohol, acetona, glicol de propileno y glicol de polietileno.

Como es ilustrado en la sección de Ejemplos que sigue a continuación, la enzima modificadora de lignina, LIP, y activador, peróxido de hidrógeno, son preferiblemente mezclados con penetrantes epidérmicos tales como glicol de butileno y transcutol, respectivamente, de una forma y concentración optimizada para mejorar la 30 penetración de LIP en la piel. El glicol de butileno usado por la presente invención es provisto a una concentración de por lo menos 1% y el transcutol es provisto a una concentración de por lo menos 3%.

Vehículos

Además de la cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente divulgado aquí, la composición cosmética 35 de este aspecto de la presente invención también incluye un vehículo dermatológicamente aceptable.

La frase “vehículo dermatológicamente aceptable”, hace referencia a un vehículo que sea apropiado para la aplicación tópica sobre la piel, es decir, tejido queratinoso, tiene buenas propiedades estéticas, es compatible con los agentes activos de la presente invención y cualquier otro componente, y es seguro y no-tóxico para su uso en mamíferos. Una cantidad efectiva de vehículo es seleccionada de un rango de aproximadamente 50% a 40 aproximadamente 99.99%, preferible desde aproximadamente 80% a aproximadamente 99.9%, mas preferible desde aproximadamente 90% a aproximadamente 98%, y mas preferible desde aproximadamente 90% a aproximadamente 95%, por peso, de la composición.

Emulsiones

El vehículo utilizado en las composiciones de la invención puede encontrarse en una gran variedad de 45 formas. Estas incluyen vehículos en emulsión, que incluyen, pero no están limitados a, emulsiones de aceite-en-agua, agua-en-aceite, agua-en-aceite-en-agua, y aceite-en-agua-en-silicona, una crema, una pomada, una loción o un aerosol. Como ha de entenderse por el técnico diestro, un componente dado va a distribuirse principalmente en la fase de agua o de aceite/silicona, dependiendo en la solubilidad/dispersabilidad del agua del componente en la composición. 50

Las emulsiones de acuerdo con la presente invención generalmente contienen una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente divulgado aquí y un lípido o aceite. Los lípidos y aceites pueden ser derivados de animales, plantas, o petróleo y puede ser natural o sintético (es decir, hecho por el hombre). Emulsiones preferidas también contienen un humectante, como glicerina. Las emulsiones preferiblemente contienen adicionalmente desde aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, mas preferible desde aproximadamente 2% a 55

aproximadamente 5%, de un emulsificador, basado en el peso del vehículo. Los emulsificadores pueden ser no-iónicos, aniónicos o catiónicos. Emulsificadores adecuados son descritos en, por ejemplo, la Pat. U.S. No. 3,755,560, concedida a Dickert, et al. Agosto. 28, 1973; Pat. U.S. No. 4,421,769, concedido a Dixon, et al., Dic. 20, 1983; y McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers, North American Edition, paginas 317-324(1986).

La emulsión también puede contener un agente anti espumante para minimizar la formación de espuma al 5 aplicar en el tejido queratinoso. Los agentes anti espumantes incluyen siliconas de alto peso molecular y otros materiales bien conocidos en la técnica para ese uso.

Emulsiones adecuadas pueden tener un amplio rango de viscosidades, dependiendo de la forma del producto deseada. Emulsiones ejemplares de baja viscosidad, que son preferidas, tienen una viscosidad de aproximadamente 50 centistokes o menos. La emulsión puede también contener un agente anti espumante para 10 minimizar la formación de espuma durante la aplicación al tejido queratinoso. Agentes anti espumantes incluyen siliconas de alto peso molecular y otros materiales bien conocidos en la técnica para tal uso.

Un tipo de emulsión es una emulsión de agua-en-silicona. Las emulsiones de agua-en-silicona contienen una fase continua de silicona y una fase acuosa dispersa. Emulsiones preferidas de agua-en-silicona de la presente invención comprenden desde aproximadamente 1% a aproximadamente 60%, preferiblemente desde 15 aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, mas preferible desde aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, por peso de una fase de silicona continua. La fase continua de silicona existe como una fase externa que contiene o rodea la fase acuosa discontinua descrita mas adelante.

La fase continua de silicona puede contener aceite de poliorganosiloxano. Un sistema de una emulsión preferida de agua-en-silicona es formulado para proveer un vehículo oxidativamente estable para la entrega de una 20 cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente revelado aquí. La fase continua de silicona de estas emulsiones preferidas comprende entre aproximadamente 50% a aproximadamente 99.9% por peso de aceite de organopolisiloxano y menos de aproximadamente 50% por peso de un aceite de no-silicona. En una modalidad especialmente preferida, la fase continua de silicona comprende por lo menos aproximadamente 50%, preferiblemente desde aproximadamente 60% a aproximadamente 99.9%, mas preferible desde aproximadamente 25 70% a aproximadamente 99.9%, y aún mas preferible desde aproximadamente 80% a aproximadamente 99.9%, el aceite de poliorganosiloxano por peso de la fase continua de silicona, y hasta aproximadamente 50% de aceites de no silicona, preferiblemente menos de aproximadamente 40%, mas preferible menos que aproximadamente 30%, aún mas preferible menos que aproximadamente 10%, y mas preferible menos que aproximadamente 2%, por peso de la fase continua de silicona. Estos sistemas útiles de emulsión pueden proveer mas estabilidad oxidativa sobre 30 periodos extensos de tiempo que comparado con emulsiones de agua-en-aceite que contienen concentraciones mas bajas de aceite poliorganosiloxano. Las concentraciones de los aceites de no silicona en la fase de silicona continua son minimizados o evitados del todo para de esta forma posiblemente mejorar aún más la estabilidad oxidativa del compuesto activo de la invención en las composiciones. Emulsiones de agua-en-silicona de este tipo son descritas en la Pat. U.S. No. 5,691,380 para Mason et al., edición de Nov. 25, 1997. 35

El aceite organopolisiloxano para ser usado en la composición puede ser volátil, no-volátil, o una mezcla de siliconas volátiles y no-volátiles. El término “no volátil” como es usado en este contexto hace referencia a aquellas siliconas que son líquidas bajo condiciones ambientales y tienen un punto de inflamación (bajo una atmósfera de presión) de o mayor que aproximadamente 100 grados Centígrados. El término “volátil” como es usado en este contexto hace referencia a todos los otros aceites de silicona. Organopolisiloxanos adecuados pueden ser 40 seleccionados de una amplia variedad de siliconas que cubren un amplio rango de volatilidades y viscosidades. Ejemplos de aceites organopolisiloxanos apropiados incluyen polialquilsiloxanos, polialquilsiloxanos cíclicos, y polialquilsiloxanos, que son conocidos para aquellos diestros en la técnica y están comercialmente disponibles.

La fase continua de silicona puede contener uno o mas aceites de no silicona. Concentraciones de aceites de no-silicona en la fase continua de silicona son preferiblemente minimizados o evitados por completo para mejorar 45 aún mas la estabilidad oxidativa del agente farmacéuticamente efectivo en las composiciones. Aceites de no silicona adecuados tienen un punto de fusión de aproximadamente 25 °C o menos bajo aproximadamente una atmosfera de presión. Ejemplos de aceites de no silicona adecuados para el uso en la fase continua de silicona son aquellos bien conocidos en las técnicas químicas en productos de cuidado personal tópicos en la forma de emulsiones agua-en-aceite, por ejemplo, aceite mineral, aceites vegetales, aceites sintéticos, aceites semi-sintéticos, etc. 50

Composiciones tópicas útiles de la presente invención comprende desde aproximadamente 30% a aproximadamente 90%, mas preferible desde aproximadamente 50% a aproximadamente 85%, y mas preferible desde aproximadamente 70% a aproximadamente 80% de una fase acuosa dispersa. El término “fase dispersa” es bien conocido a alguien diestro en la técnica e implica que la fase existe como partículas pequeñas o gotas que son suspendidas en y rodeadas por una fase continua. La fase dispersa también es conocida como la fase interna o 55 discontinua. La fase acuosa dispersa es una dispersión de pequeñas partículas acuosas o gotas suspendidas en y rodeadas por la fase continua de silicona descrita mas atrás. La fase acuosa puede ser agua, o una combinación de agua o uno o mas ingredientes solubles en agua o dispersables. Ejemplos no limitantes de tales ingredientes opcionales incluyen espesantes, ácidos, bases, sales, quelantes, gomas, alcoholes solubles en agua o dispersables y polioles, amortiguadores, preservativos, agentes bloqueadores solares, colorantes, y similares. 60

Las composiciones tópicas de la presente invención típicamente comprenden desde aproximadamente 25% a aproximadamente 90%, preferible desde aproximadamente 40% a aproximadamente 80%, mas preferible desde aproximadamente 60% a aproximadamente 80%, agua de la composición en la fase acuosa dispersada por peso.

Las emulsiones de agua-en-silicona de la presente invención preferiblemente comprenden un emulsificante. En una modalidad preferida, la composición contiene desde aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10% de 5 emulsificante, mas preferible desde aproximadamente 0.5% a aproximadamente 7.5%, mas preferible desde aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, emulsificante por peso de la composición. El emulsificante ayuda a dispersar y suspender la fase acuosa dentro de la fase de silicona continua.

Una amplia variedad de agentes emulsionantes pueden ser usados aquí para formar la emulsión de agua-en-silicona preferida. Agentes emulsionantes conocidos o convencionales pueden ser usados en la composición, 10 provisto que el agente emulsificante elegido sea compatible química y físicamente con los componentes esenciales de la composición, y provea las características de dispersión deseadas. Emulsionantes apropiados incluyen emulsionantes de silicona, por ejemplo, organopolisiloxanos modificados orgánicamente, también conocido para aquellos en la técnica como surfactantes de silicona, los emulsionantes que no contienen silicona, y mezclas de los mismos, conocidas para aquellos diestros en la técnica para uso en productos tópicos de cuidado personal. 15

Los emulsionantes útiles incluyen una amplia variedad de emulsionantes de silicona. Estos emulsionantes de silicona son típicamente organopolisiloxanos modificados orgánicamente, también conocidos para aquellos diestros en la técnica como surfactantes de silicona. Los emulsionantes apropiados son descritos, por ejemplo, en McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers, Edición Norte Americana (1986), publicado por Allured Publishing Corporation; Pat. U.S. No. 5,011,681 a Ciotti et al., publicado Abr. 30, 1991; Pat. U.S. No. 4,421,769 a Dixon et al., 20 publicado Dic. 20, 1983; y Pat. U.S. No. 3,755,560 a Dickert et al., publicado Ago. 28, 1973.

Otros vehículos tópicos preferidos incluyen emulsiones de aceite-en-agua, que tienen una fase acuosa continua y una fase hidrofóbica, insoluble en agua (“fase de aceite”) dispersada en ella. Ejemplos de vehículos apropiados que comprenden emulsiones de agua-en-aceite son descritas en la Pat. U.S. No. 5,073,371 a Turner, D.J. et al., expedido Dic. 17, 1991, y Pat. U.S. No. 5,073,372, a Turner, D.J. et al. Expedido Dic. 17, 1991. Una 25 emulsión de aceite-en-agua especialmente preferida, que contiene un agente estructurante, surfactante hidrofílico y agua, es descrito en detalle mas adelante.

Una emulsión preferida de aceite-en-agua comprende un agente estructurante para asistir en la formación de una red de estructuras de gel cristalina líquida. Sin estar limitado por teoría, se cree que el agente estructurante asiste en proveer características reológicas a la composición que contribuye a la estabilidad de la composición. El 30 agente estructurante puede también funcionar como un emulsionante o surfactante. Composiciones preferidas de esta invención comprenden desde aproximadamente 0.5% a aproximadamente 20%, mas preferible desde aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, mas preferible desde aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, por peso de la composición, de un agente estructurante. Los agentes estructurantes preferidos de la presente invención son seleccionados del grupo que consiste de ácido esteárico, ácido palmítico, alcohol estearílico, alcohol 35 cetílico, alcohol behenílico, ácido esteárico, ácido palmítico, el éter de glicol de polietileno de alcohol estearílico que tienen un promedio de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 unidades de óxido de etileno, el éter de glicol de polietileno de alcohol cetílico que tiene un promedio de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de óxido de etileno, y mezclas del mismo.

Una amplia variedad de surfactantes aniónicos también son útiles aquí. Véase, por ejemplo, la Pat. U.S. No. 40 3,929,678, para Laughlin et al., expedido Dic. 30, 1975. Adicionalmente, surfactantes amfotéricos y zwiteriónicos son también útiles aquí.

Las emulsiones de aceite-en-agua preferidas comprenden desde aproximadamente 0.05% a aproximadamente 10%, preferible desde aproximadamente 1% a aproximadamente 6%, y mas preferible desde aproximadamente 1% a aproximadamente 3% de por lo menos un surfactante hidrofílico que puede dispersar los 45 materiales hidrofóbicos en la fase de agua (porcentajes por peso del vehículo tópico). El surfactante, como mínimo, puede ser suficientemente hidrofílico para dispersar en agua. Surfactantes adecuados incluyen cualquiera de una amplia variedad de surfactantes conocidos catiónicos, aniónicos, zwiteriónicos, y amfotéricos. Véase, McCutcheon’s. Detergents and Emulsifiers, Edición Norte Americana (1986), publicado por Allured Publishing Corporation; Pat. U.S. No. 5,011,681 para Ciotti et al., expedido Abr. 30, 1991; Pat. U.S. No. 4,421,769 para Dixon et al. expedido Dic. 20, 50 1983; y Pat. U.S. No. 3,755,560. El surfactante exacto elegido depende del pH de la composición y de los otros componentes presentes. Se prefieren surfactantes catiónicos, especialmente compuestos de amonio cuaternario dialquil, ejemplos del cual son descritos en la U.S. Pat. No. 5,151,209 para McCall et al. expedido Sep. 29, 1992; Pat. U.S. No. 5,151,210 para Steuri et al., expedido Sep. 29, 1992; Pat. U.S. Nos. 5,120,532; Pat. U.S. No. 4,387,090; Pat. U.S. No. 3,155,591; Pat. U.S. No. 3,929,678; Pat. U.S. No. 3,959,461; Mc-Cutcheon’s, Detergents & 55 Emulsifiers (Edición Norte Americana 1979) M.C. Publishing Co.; y Schwartz, et al., Surface Active Agents, Their chemistry and Technology, Nueva York: Interscience Publishers, 1949.

Alternativamente, otros emulsionantes catiónicos útiles incluyen amino-amidas. Ejemplos no limitantes de estos emulsionantes catiónicos incluyen estearamidopropilPG-dimonio fosfato de cloruro, behenamidopropil PG dimonio cloruro, estearamidopropil etildimonio etosulfato, estearamidopropil dimetil (miristil acetato) cloruro de 60

amonio, estearamidopropil dimetil cetearil amonio tosilato, estearamidopropil dimetil amonio cloruro, estearamidopropil dimetil amonio lactato, y mezclas del mismo.

La emulsión de aceite-en-agua preferida comprende desde aproximadamente 25% a aproximadamente 98%, preferible desde aproximadamente 65% a aproximadamente 95%, mas preferible desde aproximadamente 70% a aproximadamente 90% de agua por peso del vehículo tópico. 5

Composiciones Tópicas

La composición cosmética puede ser formulada en cualquiera de una variedad de formas utilizadas por la industria cosmética para aplicación en la piel que incluye, lociones, aerosoles, cremas, ungüentos, salvias, geles, etc., como es descrito mas abajo.

Preferiblemente, la composición cosmética es formulada lo suficientemente viscosa para que permanezca 10 en el área de la piel tratada, no se evapora fácilmente, y/o no se remueve fácilmente al enjuagar con agua, si no que es removible con la ayuda de jabones, limpiadores y/o champú.

Los métodos para preparar las composiciones que tengan estas propiedades son bien conocidas para aquellos diestros en la técnica, y son descritos en detalle en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1990 (supra); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6ta edición, Williams & Wilkins (1995). 15

Vehículos

Las composiciones tópicas de la invención, incluyendo pero no limitado a lociones y cremas, puede comprender un emoliente dermatológicamente aceptable. Tales composiciones preferiblemente contienen desde aproximadamente 2% a aproximadamente 50% del emoliente. Como es usado aquí. “emoliente” hace referencia a un material útil para la prevención o alivio de resequedad, como también para la protección de la piel. Una amplia variedad de emolientes 20 adecuados son conocidos y pueden ser usados aquí. Véase, por ejemplo, Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2da Edición, Vol. 1, pp. 3243 (1972), que contiene numerosos ejemplos de materiales adecuados como emoliente. Un emoliente preferido es la glicerina. La glicerina es preferiblemente usada en una cantidad desde o de aproximadamente 0.001 a o de aproximadamente 20%, mas preferible desde o de aproximadamente 0.01 a o de aproximadamente 10%, mas preferible desde o aproximadamente 0.1 a o de aproximadamente 5%, por ejemplo, 25 3%.

Lociones y cremas de acuerdo con la presente invención generalmente comprende una solución con un sistema de vehículo y uno o mas emolientes. Las lociones típicamente comprenden desde aproximadamente 1% a aproximadamente 20%, preferible desde aproximadamente 5% a aproximadamente 10% de emoliente; desde aproximadamente 50% a aproximadamente 90%, preferible desde aproximadamente 60% a aproximadamente 80% 30 de agua; y una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente descrito aquí. Una crema típicamente comprende desde aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, preferible desde aproximadamente 10% a aproximadamente 20% de emoliente; desde aproximadamente 45% a aproximadamente 85%, preferible desde aproximadamente 50% a aproximadamente 75% de agua; y una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente descrito aquí.

La composición cosmética para aplicación tópica de la presente invención puede también incluir 35 componentes adicionales que son agregados, por ejemplo, para enriquecer las composiciones cosméticas con fragancia y factores de nutrición para la piel.

Tales componentes son seleccionados por ser apropiados para uso en tejido queratinoso humano sin inducir toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica, y similares dentro del alcance de juicio médico sólido. Adicionalmente, tales componentes opcionales son útiles provisto que no alteren inaceptablemente los 40 beneficios de los compuestos activos de la invención.

El CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Segunda Edición (1992) describe una amplia variedad de ingredientes cosméticos no limitantes comúnmente usados en la industria del cuidado de la piel, que son adecuados para uso en las composiciones de la presente invención. Ejemplos de estas clases de ingredientes incluyen: abrasivos, absorbentes, componentes estéticos tales como fragancias, pigmentos, colores/colorantes, aceites 45 esenciales, sensibilizadores para la piel, astringentes, etc. (por ejemplo, aceite de clavo, mentol, alcanfor, aceite de eucalipto, eugenol, lactato de mentilo, destilado de hamamelis), agentes anti acne, agentes anti aglutinantes, agentes anti espumantes, agentes antimicrobiales (por ejemplo, yodopropil butilcarbamato), antioxidantes, enlazadores, aditivos biológicos, agentes amortiguadores, ingrediente para carga, agentes quelantes, aditivos químicos, colorantes, astringentes cosméticos, biocidas cosméticos, desnaturalizantes, astringentes farmacológicos, 50 analgésicos externos, formadores de película o materiales, por ejemplo, polímetros, para ayudar con las propiedades de formación de película y sustantividad de la composición (por ejemplo, copolímero de eicoseno y vinilo pirrolidona), agentes opacificadores, ajustadores de pH, propulsores, agentes reductores, secuestrantes, agentes acondicionadores de la piel (por ejemplo, humectantes, incluyendo misceláneos y oclusivos), agentes calmantes y/o agentes curativos (por ejemplo, pantenol y derivados (por ejemplo, etil pantenol), aloe vera, ácido 55 pantoténico y sus derivados, alantoína, bisabolol, y dipotasio glicirricinato), agentes que tratan la piel, espesantes, y vitaminas y derivados de las mismas.

La composición cosmética puede ser aplicada directamente sobre la piel. Alternativamente, puede ser administrada a través de la aplicación normal a la piel por varios sistemas de administración de fármacos transdérmicos que son conocidos en la técnica, tales como parches transdérmicos que liberan la composición en la piel de forma de liberación con el tiempo. Otros sistemas de administración de fármacos conocidos en la técnica incluyen botellas en aerosol presurizadas, iontoforesis o sonoforesis. La oontoforesis es utilizada para aumentar la 5 permeabilidad de la piel y facilitar la administración transdérmica. Las Pat. U.S. Nos. 5,667,487 y 5,658,247 divulgan un aparato ionosónico adecuado para el transporte ultrasónico-iontoforéticamente mediado de los agentes terapéuticos a través de la piel. Alternativamente, o adicionalmente, liposomas o micelos también pueden ser utilizados como vehículos de administración.

Los ingredientes activos incluidos en las composiciones cosméticas de la presente invención son 10 apropiados para el aclarado de la piel a través de la oxidación de melanina. Sin embargo, la reacción de oxidación puede ser controlada y detenida cuando se desee por la adición de agentes reductores. Estos reactivos pueden ser formulados en una composición cosmética separada y pueden ser aplicados sobre la piel cuando se desee.

Aclaramiento del Pelo

Ingredientes Activos 15

Composiciones aclaradoras del pelo formuladas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen el agente oxidativo y el mediador descritos mas arriba.

Como es demostrado en la sección de Ejemplos mas abajo, el aclarado del pelo puede lograrse en la presencia de 1.5 mM de alcohol veratrílico y 8.8 mM de peróxido de hidrógeno en amortiguador de tartrato a un pH de 3.5. 20

Emolientes

Los emolientes incluyen, pero no están limitados a, aceites de hidrocarbonos y ceras, tales como aceite mineral, petrolato, y similares, aceites vegetales y animales y grasas, tales como aceite de oliva, aceite de palma, aceite de castor, aceite de maíz, aceite de soya, y similares, y lanolina y sus derivados, tales como lanolina, aceite de lanolina, cera de lanolina, alcoholes de lanolina, y similares. Otros emolientes incluyen ésteres de ácidos grasos 25 que tienen 10 a 20 átomos de carbono, tales como incluyendo mirístico, esteárico, isoesteárico, palmítico, y similares, tales como metil miristato, propil miristato, butil miristato, propil estearato, propil isoestearato, propil palmitato, y similares. Otros emolientes incluyen ácidos grasos que tienen 10 a 20 átomos de carbono, incluyendo esteárico, mirístico, láurico, isoesteárico, palmítico, y similares. Los emolientes también incluyen alcoholes grasos que tienen diez a veinte átomos de carbono, tales como cetil, miristil, lauril, isoestearil, estearil y similares. 30

Aunque algunos son solubles en agua, los alcoholes polihídricos y derivados de poliéter son incluidos como emolientes, incluyendo glicoles, glicerol, sorbitol, glicoles de polialquileno y similares, tales como glicol de propileno, glicol de dipropileno, glicol de polietileno 200-500, y similares. Los ejemplos solubles en agua son preferidos.

Surfactantes

Un emulsionante/surfactante, preferiblemente es también utilizado por la composición aclaradora de pelo de 35 la presente invención.

Ejemplos de surfactantes incluyen, pero no están limitados a, productos de condensación de óxido de espolioxialquileno de alquil hidrofóbico, alqueno, o grupos funcionales aromáticos alquil que tienen un hidrógeno libre reactivo disponible para condensación con óxido alquileno hidrofílico, óxido de polietileno, óxido de propileno, óxido de butileno, óxido de polietileno o glicol de polietileno. Son particularmente efectivos los productos de 40 condensación de octilfenol con aproximadamente 7 a aproximadamente 13 moles de óxido de etileno, vendido por la Compañía de Rohm & Haas bajo la marca de las series de productos TRITON 100®.

Otros ingredientes tales como, fragancias, agentes estabilizantes, tinciones, agentes antimicrobiales, agentes antibacterianos, antiaglomerantes, absorbentes de radiación ultravioleta, y similares también son incluidos en la composición aclaradora de pelo de la presente invención. 45

Acondicionadores

Un agente acondicionador estable a la hidrólisis ácida, tal como un compuesto de silicona que tiene por lo menos una fracción de amonio cuaternario junto con un monoquat etoxilado es preferiblemente también usado para estabilizar y opcionalmente espesar la composición aclaradora de pelo de la presente invención.

Un espesante opcional también puede ser incluido para mejorar la estética de la composición y facilitar la 50 aplicación de la composición al pelo. Espesantes no iónicos en una cantidad de 0% a aproximadamente 3% por peso son preferidos. Espesantes ejemplares son metilcelulosa, hidroxibutil metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, hidroxietil etilcelulosa e hidroxietilcelulosa, ácido di (sebo hidrogenado) ftálico amida, copolímero entrecruzado maleico anhídrido-metil vinil éter, goma guar, goma de xantano y goma arábica.

El vehículo de la composición acondicionadora es predominantemente agua, pero también pueden ser incluidos solventes orgánicos para lograr facilitar la fabricación de la composición o para proveer propiedades estéticas, tales como control de viscosidad. Solventes adecuados incluyen los alcoholes bajos como alcohol etílico y alcohol isopropílico; éteres de glicol, como 2-butoxietanol, glicol de etileno monoetil éter, glicol de propileno y glicol de dietileno, monoetil éter o monometil éter; y mezclas de los mismos. Solventes no acuosos pueden estar 5 presentes en la composición acondicionadora de la presente invención en una cantidad de aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, y en particular aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, por peso del peso total del vehículo en la composición.

Agentes acondicionadores no limitantes que pueden ser usados en acondicionadores opacos incluyen: cloruro de trimetilamonio estearil; cloruro de trimetilamonio beheno; bromuro de cetrimonio; cloruro de triamonio 10 soya; cloruro de triamonio sebo; cloruro de dimetilamonio dihidrogenado sebo; metosulfato de behentrimetilamonio; cloruro de Peg-2 Oleamonio; bromuro de dimetilamonio dihidrogenado sebo; metosulfato de dimetilamonio dihidrogenado sebo; cloruro de trimetilamonio palmitil; cloruro de dicetiidimetilamonio; cloruro de distearildimetilamonio; cloruro de dimetilamonio dipalmito; metosulfato de trimetilamonio sebo; tosilato de cetrimonio; cloruro de eicosiltrimetilamonio y cloruro de dimetilamonio di sebo. 15

Materiales que pueden ser usados para opacificar composiciones de la invención incluyen ésteres grasos, polímeros opacificantes, tales como polímeros de estireno, como OPACIFIER 653 de Morton, International, Inc.; y alcoholes grasos. Lo siguiente es una lista no limitante de alcoholes grasos: alcohol cetílico; alcohol estearílico, alcohol cetearílico; alcohol behenílico, y alcohol araquidílico. Composiciones acondicionadoras de la invención que no son claras también pueden incluir Lexamina S-13, cloruro de dicetilamonio, y ceteareto-20. 20

Composiciones de la presente invención pueden, si es deseado, ser presentados en un aparato dispensador o un equipo, junto con instrucciones apropiadas para uso y etiquetas que indican la aprobación de la FDA para uso en el aclarado de la piel o pelo.

El equipo para aclarar una región de la piel o pelo puede incluir, por ejemplo, un recipiente que incluye una enzima modificadora de lignina provista con amortiguadores adecuados, vehículos, penetrantes etc, y recipientes 25 adicionales que incluyen un agente oxidante y mediador descrito arriba.

Enzimas modificadoras de lignina pueden también ser introducidas en las células de la región de la piel usando acercamientos de biología molecular que son conocidas en la técnica.

Por lo tanto, de acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención se provee un método no terapéutico de aclaramiento de una región de la piel de un sujeto. El método de acuerdo con este aspecto de la presente 30 invención es efectuado expresando dentro de las células de la región de la piel, una enzima modificadora de lignina de una forma apropiada para oxidar un pigmento contenido dentro de las células de la región de la piel.

Tal expresión puede ser efectuada transformando las células de la piel con un vector de expresión que incluye una enzima modificadora de lignina que codifica una secuencia enlazada funcionalmente a una secuencia promotora. 35

Para generar tal vector de expresión, un segmento polinucleótido que codifica una enzima modificadora de lignina (la isoforma H1 LIP, SEQ ID NO:1), puede ser ligada a un sistema de vector de expresión comercialmente disponible apropiado para transformar células de mamífero y para dirigir la expresión de la enzima modificadora de lignina dentro de las células transformadas. Será apreciado que tales sistemas de vector comercialmente disponibles pueden fácilmente ser modificados a través de técnicas recombinantes comúnmente usadas para remplazar, 40 duplicar o mutar secuencias promotoras existentes o secuencias mejoradoras y/o introducir cualesquiera secuencias adicionales polinucleotídicas tales como por ejemplo, secuencias que codifican marcadores de selección adicionales o secuencias que codifican polipéptidos reporteros.

Vectores de expresión de mamífero apropiados para uso con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, 45 que son disponibles de Invitrogen, pCI que es disponible de Promega, pBK-RSV y pBK-CMV que son disponibles de Stratagene, pTRES que es disponible de Clontech, y sus derivados.

Un vector de expresión adecuado para uso con este aspecto de la presente invención es un vector basado en adenovirus. Vectores de adenovirus han sido ampliamente usados para aplicaciones farmacéuticas que incluyen terapia genética cutánea (Ghazizadeh S, Taichman LB. (2000) Hum Gene Ther 11: 2247-51; Carter PJ, Samulski 50 RJ. (2000). Int J Mol Med 6; 17-27).

El vector de expresión descrito arriba puede ser entregado dentro de las células usando una variedad de acercamientos de entrega, incluyendo, pero no limitado a, liposomas, parches epidérmicos, iontoforesis o endocitosis mediada por receptor.

En el último acercamiento, un anticuerpo o ligante a un receptor de superficie celular que es conocido por 55 sufrir endocitosis, forma un complejo con una secuencia de ADN que codifica la enzima modificadora de lignina a través de un adjunto policatiónico enlazado covalentemente (por ejemplo, polilisina, protaminas). Tales complejos

retienen su especificidad de enlace a la superficie celular y son tomadas dentro de la célula donde entran el compartimento endosómico por medio de procesos endocitóticos normales. Adicionalmente, deben tomarse pasos para evitar la degradación del ADN dentro del endosoma-lisosoma. Las células puede ser tratadas con el agente lisosomatrópico cloroquina durante el procedimiento de transfección. Alternativamente, pueden ser usados los componentes de virus que entran a las células por endocísis y poseen una capacidad de “brote” endosómico. 5 Adenovirus de replicación defectivos emparejados con los complejos de ligadura ADN dan eficiencias de transfección de virtualmente 100% en células de cultivo de tejido in vitro. Estudios preliminares han demostrado el potencial de este método para dirigir el ADN específicamente al tipo de célula de elección in vivo (Guy J, Drabek D, Antoniou M. (1995). Mol Biotechnol 1995 3:237-48).

Siguiendo la expresión dentro de las células objetivo, el receptor de electrones y mediador descrito son 10 preferiblemente aplicados a la región tratada para facilitar el aclarado.

Expresar la enzima modificadora de lignina dentro de las células objetivo es particularmente ventajoso ya que supera la necesidad de entrega intracelular de la enzima misma, por lo tanto potencialmente mejorando la eficiencia del aclarado.

Objetos adicionales, ventajas, y características novedosas de la presente invención van a ser aparentes 15 para alguien normalmente diestro en la técnica al examinar los siguientes ejemplos, que no se pretende sean limitantes. Adicionalmente, cada una de las varias modalidades y aspectos de la presente invención como es delineado aquí mas arriba y como es reivindicado en la sección de reivindicaciones más abajo encuentra soporte experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos 20

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones mas arriba, ilustran la invención de una forma no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada aquí y los procedimientos de laboratorio usados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y recombinantes de ADN. Tales técnicas son explicadas extensamente en la literatura. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et 25 al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons,

New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 30 metodologías como son expuestas en las Pat. U.S. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles son extensamente descritos en la literatura de pantentes y 35 científica, véase, por ejemplo, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" 40 Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Otras referencias generales son provistas a través de este documento. Los procedimientos en ese respecto se cree que son bien conocidas en la técnica y son provistas para la conveniencia del lector. 45

ANTECEDENTES

Peroxidasas de lignina en el hongo P. chrysosporium

Hay mas de 12 proteínas heme que muestran actividad ligninolítica en el fluido extracelular de cultivos de P. chrysosporium BKM-F-1767. Estas pueden ser clasificadas en dos tipos de peroxidasas heme glicosiladas, lignina peroxidasa (LIP) y peroxidasa de manganeso (MNP). Se ha reportado que las isoenzimas H1, H2, H6, H7, H8 y H10 50 son LIP y H3, H4, H5, y H9 han sido identificadas como MNP (Farrell et al., 1989). Las isoenzimas LIP de P. chrysosporium son codificadas por una familia de genes estructuralmente relacionados y son diferentes en sus características físicas, especificidad de sustrato y estabilidad (Farrell et al., 1989; Stewart et al., 1992). Como parte del proceso que lleva a su secreción, las isoenzimas LIP son rotas proteolíticamente y glicosiladas (Ghose, 1987; Ritch et al., 1991; Tien y Kirk, 1984). Adicionalmente, ha sido reportado que las isoenzimas LIP H2, H6, H8 y H10 55 son fosforiladas en una fracción de manosa 6-fosfato, contenido en oligosacáridos enlazado con asparigina. El análisis de fluido extracelular madurado ha llevado a la sugerencia que la isoenzima H1 es probablemente derivada de defosforilación post-translacional de H2 (Kuan y Tien, 1989).

La expresión de las enzimas ligninolíticas por P. Chrysosporium es un evento idiofásico desencadenado por limitación de nitrógeno o carbono y es altamente dependiente en las condiciones de cultivo y la composición del medio (Dosoretz y Grethlein, 1991; Faison y Kirk, 1985; Stewart et al., 1992; van der Woude et al., 1993). La formación de LIP es particularmente dependiente de la exposición de cultivos a altas tensiones de oxígeno (Dosoretz et al., 1990; Faison y Kirk, 1985). Se ha propuesto que la transferencia de oxígeno en cultivos estacionarios es 5 restringido, y consecuentemente una alta presión parcial de oxígeno en el espacio frontal del cultivo es necesario para hacer que suficiente oxígeno este disponible para las hifas sumergidas (Leisola et al., 1983; Michel et al., 1992). La formación de LIP fue observada en un cultivo que fue expuesto al aire inmovilizando el hongo en un soporte poroso en un cultivo líquido no-sumergido, que mejoró la disponibilidad de oxígeno al hongo (Dosoretz et al., 1990; Popp et al., 1990). La concentración de Mn2+ en el medio afecta adversamente la formación de LIP y MNP. 10 Mientras la formación de MNP es dependiente en Mn, que mejora la transcripción de MNP, la formación de LIP es inhibida por Mn. Rothschild et al., (1999) mostró que en los cultivos de P. chrysosporium con limite de nitrógeno y en los cultivos con exceso de nitrógeno, el alto nivel de oxígeno requerido para la formación de LIP podría remplazar la deficiencia de Mn.

Materiales y métodos experimentales 15

Crecimiento del hongo Phanerochaete chrysosporium para la producción de lignina peroxidasa – El hongo Phanerochaete chrysosporium BKMF-1767 (ATCC 24725) fue mantenido a 4 °C en 2% de agar de extracto de malta en stock slants (Difco, Detroit, MI, USA).

Preparación de suspensión de esporas- Las esporas del hongo fueron obtenidas inoculando plugs de los stock slants en platos de Petri que contienen Agar de Dextrosa de Papa esterilizada (PDA) a una concentración de 20 39 g/litro. Los platos de PDA fueron entonces incubados por hasta 2 semanas a 37 °C. Para la preparación de suspensión de esporas, las placas de PDA fueron entonces incubadas por hasta 2 semanas a 37 °C. Para la preparación de la suspensión de esporas, las placas de PDA fueron recubiertas con 0.9% de NaCl, la suspensión de conidia fue filtrada a través de lana de vidrio estéril y la suspensión de esporas fue recolectada. La suspensión de esporas fue entonces congelada a -80 °C. 25

Preparacion del Inoculo- Las esporas fueron inoculadas en un medio de inoculación estéril (véase la formulación aquí mas abajo) a una concentración final de 7.5 x 105 esporas/ml. Noventa ml de la mezcla fueron agregados a cada lote de fermentación (Tien y Kirk, 1988. Meth. Enzymol. 161: 238-490; Dosoretz et al., 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 131-7), y los lotes fueron entonces sellados con tapones de algodón. Los cultivos fueron cultivados estáticamente por 48 h a 37 °C como cultivos superficiales. Para la inoculación de cultivos los contenidos 30 del lote de fermentación fueron mezclados por 2 min con una mezcladora (Waring, Inglaterra).

Crecimiento del hongo en un reactor de tanque agitado (STR) fermentador- Previo al crecimiento del hongo, la espuma de poliuretano fue asentada alrededor de los tubos de enfriamiento del fermentador y todo el fermentador STR fue esterilizado. Diez litros de un medio fermentador (véase la formulación aquí mas abajo) fueron entonces vertidos en el fermentador STR y 900 ml de inoculo mezclado (el contenido de 10 lotes de fermentación) fueron 35 agregados. El fermentador fue conectado a un sistema de enfriamiento para mantener una temperatura de 37 °C y fue mezclado a 100 rpm. Aire esterilizado fue introducido en el fermentador a 2 ml/min. El flujo fue cambiado a 4 ml/min después de 2 días de crecimiento. El crecimiento fue continuado por 3-5 días.

El medio de Inoculación fue preparado mezclando las siguientes soluciones y fue esterilizado con un filtro de membrana de 0.45 µm (MSI, Westborough, MA, USA). Para la preparación de 1 litro de medio líquido, los 40 siguientes componentes fueron combinados:

100 ml de Medio Básico para crecimiento de P. chrysosporium x 10 (véase la formulación mas abajo)

10 ml de solución de reserva de CaCl2 (13.2 g/l) (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO, USA). La concentración final 0.132 g/L.

12 ml de solución de reserva de glicerol (50 g/100-ml) (Frutarom, Israel). La concentración final 6 g/L. 45

Doble agua destilada es agregada a 1 litro.

El Medio Fermentador fue preparado de la siguiente forma y fue esterilizado con un filtro de membrana de 0.45 µm (MSI, Westborough, MA, USA). Para la preparación de 10 litros de medio líquido, los siguientes componentes fueron combinados:

100 ml de solución de reserva de CaCl2 (13.2 g/l) (Sigma, USA). Concentración final 0.0132 g/l 50

120 ml de solución de reserva de glicerol (50 g/100-ml) (Frutarom, Israel). Concentración final 6 g/l.

50 ml de solución de reserva Tween-80 (10.8 ml/100 ml) (Sigma, USA). Concentración final 0.54 ml/l

1000 ml de Medio Básico para crecimiento de P. chrysosporium x 10 (véase la formulación mas abajo)

3.36 g de alcohol veratrílico (Sigma, USA). Concentración final 2 mM.

7.740 litros de agua doble destilada (DDW) a un volumen final de 10 litros.

Medio Básico para el crecimiento de P. chrysosporium x 10 – El medio básico para el crecimiento de P. chrysosporium x 10 fue preparado como sigue: 7.07 gr de ácido Nitrilotriacético (sal trisódica) fueron disueltos en 4 litros de DDW. Los siguientes reactivos fueron entonces agregados: 100 gr KH2PO4 anhídrido, 72.7 gr MgSO4·7H2O (o 67.39 gr MgSO4·6H2O), 3.5 gr NaCl, 0.35 gr FeSO4·7H2O, 0.63 gr CoCl2·6H2O, 0.35 gr ZnSO4·7H2O, 0.055 gr 5 CuSO4·5H2O, 0.035 gr AlK(SO4)2·12H2O, 0.035 gr H3BO3, 0.035 gr Na2MoO4·2H2O, 500 ml 2M amortiguador de acetato pH 4.5, 10 gr tartrato de amonio y 50 mg Tiamina. Todo suplido por Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA. El pH era el del medio fue ajustado a 4.4-4.45 con NaOH y DDW fue agregado a un volumen final de 5 litros. El medio fue almacenado a 4 °C.

Aislamiento y purificación de LIP de un medio extracelular de Phanerochaete chrysosporium – El medio 10 extracelular fue filtrado al vacío a través de una fibra de vidrio. El filtrado fue después esterilizado con un filtro de membrana de 0.45 µM (MSI, Westborough, MA, USA). El fluido extracelular concentrado fue entonces re-concentrado 25 veces por ultrafiltración usando una membrana tipo 10-kDa-corte PM-10 (Amicon, Danvers, MA), y purificado con una columna Mono Q (HR5/5, Pharmacia, Piscataway, NJ) por cromatografía de intercambio HPLC-anion usando dos gradients de 0.01 – 1.00 M de acetato de sodio. El primer gradiente fue a un pH de 6.0 y el 15 segundo gradiente fue a un pH de 4.7, lo que es equivalente al valor de punto isoeléctrico (pl) de la isoenzima H1 de LIP. Los picos de la proteína fueron recolectados y su actividad fue ensayada usando la isoenzima H1 de LIP purificada de un lote anterior como estándar. La absorbancia de la fracción H1 de LIP fue medida a : 280 nm, y 409 nm (Hewlett Packard, Waldbronn, Alemania). El grado de pureza (RZ), calculado de la proporción entre la absorbancia a 409 nm (A409) y absorbancia a 280 nm (A280) de la isoenzima H1 de LIP purificada fue mayor que 4.0. 20 La concentración de LIP fue determinada a 409 nm usando un coeficiente de extinción de 169 M-1 cm-1.

Ensayo de actividad LIP – La actividad de LIP fue medida por el cambio en la absorbancia a 310 durante la oxidación del alcohol veratrílico a aldehído veratrílico como es descrito por Tien y Kirk (1988). El reactivo del ensayo es compuesto de 4 mM de alcohol veratrílico y 0.88 mM de H2O2 en 100 mM de amortiguador de Tartarato a un pH de 2.5. Para el ensayo, 0.5 ml de medio extracelular de P chrysosporium fueron mezclados con 0.5 ml del reactivo y 25 el aumento en la absorbancia a 310 nm fue medido por 40 segundos. Una unidad de LIP es definida como 1 µmol de alcohol veratrílico oxidado a aldehído veratrílico por minuto.

Determinación de oxidación de melanina por LIP – La Melanina Sintética (Sigma, Cat # M8631, St Louis MO, USA) fue preparado a varias concentraciones en 50 mM de amortiguador Tris a un pH de 8.00. La oxidación de melanina por LIP fue realizada en amortiguador de Tartarato a un pH de 3.5 que contenía alcohol veratrílico, y la 30 reacción enzimática fue iniciada por la adición de peróxido de hidrógeno. El grado de oxidación de melanina fue determinado usando la disminución en la absorbancia a 460 nm.

Preparación de la crema – La crema de LIP en las modalidades preferidas esta compuesta de dos tipos de cremas: la crema de enzimas y la crema activadora. Cada crema fue preparada de dos fases, es decir, la fase de agua y la fase de aceite. 35

Crema Enzimática

Fase de agua para la crema enzimática:

0.35 % (p/p) DMDM hidantoina (Sharon Lab, Israel);

2 % (p/p) glicerina (Cognis, Alemania);

0.1 % (p/p) alcohol veratrílico (3-dimethoxybenzyl alcohol, Sigma, USA); 40

81.65 % (p/p) DDW (RO Water, Israel);

0.2 % (p/p) Rhodicare D (goma de xantan, Rhodia, Francia);

4 % (p/p) transcutol (PEG-400, etoxidiglicol, Gattefosse, Francia);

Fase de aceite para la crema enzimática:

5 % aceite mineral ligero; 45

2.5 % (p/p) dragorina 100 SEP (GMS & PEG-100 estearato, Dragoco, Alemania);

3 % (p/p) alcohol cetílico (Cognis, Alemania);

0.2 % (p/p) sorbato de Potasio (Chisso Corp., Japón);

1 % (p/p) brij 721 (Uniqema, Italia).

Preparación de la crema enzimática: Las fases de aceite y agua de la crema enzimática fueron calentadas 50 a 80 °C y después mezcladas. La mezcla fue homogenizada por 10 minutos y enfriada a 55 °C. Después el pH fue ajustado a 3.5 con ácido láctico.

Cuando la mezcla fue enfriada a 40 °C, la lignina peroxidasa fue agregada (20-50 unidades/gr). La mezcla enzimática fue homogenizada por 1 min.

Crema Activadora

Fase de agua para la crema activadora:

82.888 (p/p) DDW (RO Waster, Israel); 5

0.1 % (p/p) disodio EDTA (Merck, Alemania);

4 % (p/p) transcutol (PEG-400, etoxidiglicol, Gattefosse, Francia);

0.1 % (p/p) sorbato de Potasio (Chisso Corp., Japón):

Fase de aceite para la crema activadora:

3.5 % (p/p) brij 72 (Steareth-2, Uniqema, Italia); 10

2.5 % (p/p) brij 721 (Steareth-20, Uniqema, Italia);

5 % (p/p) aceite mineral;

1.3 % (p/p) alcohol cetílico (Cognis, Alemania);

0.5 % (p/p) silicona 350 (Dimethicon, Dow Coming, USA);

0.1 % (p/p) sorbato de Potasio (Chisso Corp., Japón). 15

Preparación de la crema activadora – Las fases de agua y aceite de la crema activadora fueron calentadas a 80 °C y mezcladas. La mezcla fue homogenizada por 10 min, enfriada a 45 °C y ajustada a un pH de 3.5 con ácido fosfórico.

Cuando la mezcla fue enfriada a 40 °C el peróxido de hidrógeno (Riedel-de Haen, Alemania) fue agregado (0.012 % (p/p)) con suave agitación, el pH correcto fue verificado y la mezcla activadora fue homogenizada por 1 20 min.

Determinación del efecto aclarador de la piel in vivo – Para poder cuantificar el efecto de LIP en la aclaración de la piel, el color de la piel de la mano tratada fue probado usando tres longitudes de honda del cromámetro Minolta (CR-200 Japón): Minolta L mide oscuridad y brillo, la Minolta A mide los tonos rojos y la Minolta B mide los tonos amarillos. El aumento en los valores de Minolta L refleja el grado de brillo de la piel, es decir, 25 valores más altos corresponden a una piel más brillante.

Resultados experimentales

Ejemplo 1

Purificación de lip de p chrysosporium

Preparación de LIP H1 altamente purificado de P. Chrysosporium – Para purificar la isoenzima LIP H1 de P. 30 Chrysosporium el hongo fue cultivado en un fermentador STR (Figura 2) como es descrito en detalle en la sección de Métodos aquí mas arriba. La actividad inicial de LIP fue detectada después de 48 horas de crecimiento y aumentos significativos en la actividad fueron detectados cuando el crecimiento fue mantenido hasta 120 hr (Figura 3). Para la purificación de la isoenzima LIP H1 el fluido extracelular del hongo fue recolectado a una actividad de LIP pico (120 hr). La proteína de la isoenzima H1 de LIP fue entonces purificada y su concentración fue determinada 35 como es descrito bajo Métodos. Por lo tanto, usando el aparato arriba mencionado y las condiciones, LIP puede ser producida con seguridad y su isoenzima H1 puede ser purificada por HPLC.

Ejemplo 2

Optimización de la melanina en una fase acuosa de oxidación usando lip purificada

Para lograr optimizar las condiciones necesarias para la oxidación de melanina por LIP, la concentración 40 óptima para cada uno de los componentes críticos de la reacción de oxidación fue determinado independientemente.

Oxidación LIP de melanina en una fase acuosa, es una función de la concentración de peróxido de hidrógeno – La oxidación de melanina por LIP en una fase acuosa fue probada por primera vez para correlación a las concentraciones de peróxido de hidrógeno. Una concentración constante de melanina (70.5 µg/ml) fue oxidado por 0.48 µM de LIP purificada H1 en la presencia de 1.5 mM de alcohol veratrílico y con concentraciones crecientes 45 de peróxido de hidrógeno. El grado de oxidación fue determinado midiendo la absorbancia de melanina a 460 nm, antes de agregar el peróxido de hidrógeno y 160 segundos después de eso, y fue calculada en porcentajes. Generalmente, la oxidación de melanina aumentó con las concentraciones crecientes de peróxido de hidrógeno hasta un plano que fue obtenido a 700-900 µM de peróxido de hidrógeno (Figuras 4). El efecto de la concentración

de peróxido en la oxidación de melanina es adicionalmente demostrada por comparación de mezclas de reacción en la Figura 5, donde la reacción de la mezcla es significativamente aclarada con crecientes concentraciones de peróxido de hidrógeno. Por lo tanto, estos resultados demuestran que la oxidación LIP de melanina en una fase acuosa es claramente dependiente de las concentraciones de peróxido de hidrógeno, concentraciones optimas de peróxido de hidrógeno para la oxidación de melanina están en el rango de 600 µM a 700 µM. 5

La oxidación LIP de melanina es una función de la concentración inicial de melanina en una fase acuosa – Para determinar la concentración óptima de melanina requerida para la oxidación de melanina en una fase acuosa por LIP la reacción de oxidación fue adicionalmente probada con concentraciones crecientes de melanina. La oxidación de melanina tomó lugar por 0.48 µM de H1 LIP purificado en la presencia de 1.5 mM de alcohol veratrílico y 600 µM de peróxido de hidrógeno. A concentraciones iniciales de melanina entre 15 a 45 µ g/ml, 10 la oxidación de melanina por LIP fue dependiente de las concentraciones iniciales de melanina. La oxidación máxima de melanina (60%) fue alcanzada a concentraciones iniciales de Melania entre 45 a 85 µg/ml (Figura 6). Por lo tanto la oxidación de melanina por LIP es claramente independiente de las concentraciones iniciales de melanina, mas allá de 45 µg/ml.

La oxidación melánica de LIP es parcialmente dependiente en la concentración de LIP en una fase acuosa 15 – Para optimizar adicionalmente las condiciones para la oxidación de melanina, el efecto de la concentración de LIP en la oxidación de melanina fue probado con concentraciones óptimas de melanina (70 µg/ml), peróxido de hidrógeno (700 µM) y alcohol veratrílico (1.5 mM). La oxidación de melanina aumentó drásticamente desde 10 a 60% cuando la concentración de LIP fue aumentada desde 0.25 µM a 0.40 µM. Sin embargo, mas allá de la concentración de LIP de 0.50 µM no se observaron cambios en la oxidación de melanina (Figura 7). Por lo tanto, el 20 rango óptimo de las concentraciones de LIP para la oxidación de melanina in vitro es 0.40 -0.50 µM.

Ejemplo 3

Oxidación de melanina usando lip en una crema de la formulación

Para corroborar aún más la habilidad de la isoenzima LIP H1 para oxidar melanina y como un paso intermedio hacia el aclarado de la piel in vivo, la actividad de LIP fue probada en una formulación de una crema 25 solubilizada en una fase acuosa.

La melanina en una fase acuosa es oxidada por LIP en una formulación en crema- Dos tipos de crema fueron preparados: la crema enzimática que comprende la fracción H1 de la isoenzima LIP (25 unidades/gr de crema) y alcohol veratrílico (6 mmol/Kg de crema), y la crema activadora que comprende peróxido de hidrógeno (3.52 mmol/Kg de crema). Para la determinación de la actividad de LIP en una formulación de crema la crema 30 enzimática (0.3 gr) fue primero mezclada con melanina (140 µg/ml) y se observó un color gris negro (Figura 8a). Cuando la crema activadora (0.3 gr) fue agregada a la crema enzimática que ya contenía melanina, el color fue cambiado inmediatamente a beige (Figura 8b). Estos resultados demuestran que LIP en una formulación de crema es altamente eficiente en la decoloración de melanina y puede ser adicionalmente probada en la piel humana.

Ejemplo 4 35

Aclaramiento de la piel y el pelo in vivo por lip h1 purificado en una formulación en crema

Para probar la habilidad de LIP para aclarar la piel y el pelo in vivo la enzima en formulaciones en crema y acuosa fue agregada a la piel y el pelo, respectivamente.

LIP en una formulación en crema aclara la piel in vivo – Para probar la habilidad de LIP en una formulación en crema para aclarar la piel in vivo, la crema enzimática fue aplicada y absorbida por la piel y después la crema 40 activadora fue aplicada cuatro veces a intervalos de 5 min. Cuando fue repetido dos veces al día por una semana se observó un aclarado significativo de las áreas de piel tratadas (Figura 9). Cuando el color de la piel de dos áreas de la mano tratada fueron cuantificadas usando un cromámetro de Minolta, se observó un claro efecto aclarador de la piel por las dos semanas de aplicación de la crema de LIP (Tabla 1, % cambio). Por lo tanto, estos resultados demuestran que LIP, preparado en una formulación de crema de fácil aplicación puede simple y eficientemente 45 aclarar la piel in vivo, y que la LIP preparada como es detallado aquí puede ser adicionalmente adaptada para otras aplicaciones aclaradoras in vivo.

TABLA 1

CUANTIFICACIÓN DEL ACLARAMIENTO DE LA PIEL IN VIVO

Minolta L (brillo) Minolta A (rojo) Minolta B (amarillo)

Área I

Línea base 44,8 10,5 16,34

Área I

2 semanas 48,8 10,6 17,93

Área I

% cambio 8,9 ---- 9,7

Área II

Línea base 49,91 10,38 19,28

Área II

2 semanas 53,8 9,39 20,63

Área II

% cambio 7,79 ---- 7,0

La Tabla 1 ilustra tres juegos de lecturas m de números absolutos tomados del cromámetro Minolta de dos áreas en la mano tratada. El Área I corresponde al área en un circulo en la Figura 9, el Área II corresponde a datos no mostrados. 5

LIP en una formulación acuosa aclara el pelo in vivo – El aclaramiento de la pigmentación es usualmente requerido en tejidos ricos en melanina diferentes a la piel. Para probar aún más sus efectos aclaradores in vivo, se aplicó LIP en pelo humano. Antes de la aplicación de LIP, el pelo fue primero sumergido por 1 hora en 50 mM de amortiguador de carbonato a un pH de 11.5 y fue después transferido a otro tubo que contiene LIP (25 U/20 µl en agua). El pelo fue incubado con LIP por 10 segundos y después transferido en amortiguador de tartrato a un pH de 10 3.4 en la presencia de alcohol veratrílico (1.5 mM) y peróxido de hidrógeno (8.8 mM). Un efecto aclarador significativo fue observado dentro de 1 hr en la presencia de LIP (Figura 10, tubo derecho) comparado con el pelo tratado en la misma solución pero sin LIP (Figura 10, tubo izquierdo). Por lo tanto, estos resultados demuestran que en la presencia de muy bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno LIP en una formulación acuosa puede eficientemente aclarar el pelo in vivo. 15

Ejemplo 5

Ampliación del proceso de preparación de lip

Para producir grandes cantidades de lignina peroxidasa (LIP) útil para propósitos comerciales la LIP fue purificada del hongo P. chrysosporium usando un protocolo ampliado.

Alta actividad de LIP obtenida usando un protocolo de fermentación ampliado – Se realizó la fermentación 20 en un fermentador de 100 L usando 90 L de medio de fermentación como descrito en la sección de Métodos aquí mas arriba. Condiciones de fermentación incluyen agitación de 160 rpm y flujo de aire de 0.2 vvm. La inoculación fue realizada de la misma forma que como en el fermentador de 10 L que es descrito en la sección de Métodos aquí mas arriba. Después de 7 días de crecimiento la actividad medida de LIP fue 1600 unidades/litro.

Estos resultados demuestran que grandes cantidades y altas actividades catalíticas de LIP pueden ser 25 producidas del hongo P. chrysosporium usando fermentadores grandes y el protocolo ampliado de la presente invención.

Ejemplo 6

Pruebas dermatológicas para la crema lip: hipoalergénica, piel sensible, y sensibilizantes y pruebas desafiantes en la piel normal 30

Para caracterizar las propiedades dermatológicas de la crema LIP y como pre-requisito para uso como un producto cosmético la crema LIP fue sometida a varias pruebas dermatológicas: una prueba hipoalergénica, una prueba sensibilizante y desafiante en la piel normal, y una prueba sensibilizante y desafiante en la piel sensible.

Métodos 35

Sujetos del estudio para pruebas dermatológicas en la piel normal: El estudio incluyó 50 voluntarios, 9 hombres y 41 mujeres, en un rango de edades desde 18 a 64 años. Los voluntarios estaban en buena salud general y libres de cualquier enfermedad de la piel visible o anomalía en el área a ser parchada. A cada sujeto del estudio le

fue requerido leer, entender y firmar una declaración de consentimiento informado. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: mujeres embarazadas o lactando, sujetos sufriendo de enfermedades serias o progresivas y/o patologías en la zona tratada, sujetos usando un tratamiento ( por ejemplo, retinoides, esteroides) y/o modificadores de la hidratación cutánea, sujetos con peso inestable o excesivo uso de alcohol o tabaco.

Un resumen de las características de los sujetos del estudio es presentado en la Tabla 2 aquí mas abajo. 5

Tabla 2

LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS SUJETOS DEL ESTUDIO

Sexo

Edad promedio (años) Historia médica que probablemente influencie el estudio

M

40.36 Ninguna

H

34.33 Ninguna

Sujetos del estudio para la prueba dermatológica en la piel sensible – Un total de 50 sujetos, 6 hombres y 44 mujeres completaron la prueba: 22 sujetos estaban en el rango de 18 a 35, 11 sujetos estaban en el rango de 36 a 45, y 17 sujetos estaban en el rango de 46 a 65. 10

Tratamiento asociado durante el estudio – No se aplicó agua al sitio de prueba durante la aplicación del parche; no se permitió ningún tratamiento sistémico o tópico que probablemente modificara la piel; no se permitió el uso de productos dermofarmacéuticos o cosméticos, incluyendo productos limpiadores, en las zonas siendo evaluadas.

Preparación del parche – Para las pruebas hipoalergénicas, 2 mg de la crema LIP de la presente invención 15 fueron colocados en una tira adhesiva Curatest® F (Lohmann & Rauscher International GMBH & Co. KG, Rengsdort). Para las pruebas dermatológicas y pruebas de piel sensible cada parche incluyó 0.07 – 0.1 gramos de la crema LIP en la tira adhesiva Curatest® F.

La prueba de parche de Insulto Repetido de Draize fue realizada esencialmente como es descrita en "Appraisal of the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics" por J.H. Draize (publicada por la Asociación 20 de Oficiales de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos).

Fase de Inducción – El parche fue aplicado en los sitios de contacto designados y permaneció en su lugar por 24 horas. Al final de este periodo el parche fue removido y el sitio fue examinado por cualquier respuesta dérmica. Los sujetos del estudio descansaron por 24 horas, después de las cuales el sitio de la piel fue examinado nuevamente. Un parche fue después aplicado al mismo sitio como usado previamente. La segunda aplicación fue 25 idéntica a la primera por cualquier respuesta dérmica y las observaciones reportadas antes de la siguiente aplicación. El mismo sitio fue usado a lo largo del estudio. Cada aplicación fue puesta y removida por el personal del Instituto de Investigación de la Piel (Tel Aviv, Israel). Una persona de control de calidad monitoreó la adherencia al protocolo del estudio.

Fase del Desafío – Después de la 9na aplicación, transcurrió un periodo de descanso de 2 semanas 30 después del cual una aplicación desafío fue aplicada de la misma forma y al mismo sitio usado durante la fase de inducción. La aplicación desafío fue removida después de 24 horas y el sitio fue examinado y calificado por signos de irritación o sensibilización. Un examen de seguimiento fue realizado 48 horas después de la aplicación desafío (24 horas después de quitar el parche), como también a 48 y 72 horas después de removerlo.

Escala de Calificación – Los resultados de las pruebas de inducción y desafío fueron calificados usando la 35 siguiente escala: “0” = no reacción visible; “?” = reacción dudosa, es decir, tenue, eritema mínimo, no infiltración; “1” = reacción débil positiva, es decir, eritema, infiltración, pápulas no discretas; “2” = reacción positiva fuerte, es decir, eritema, infiltración, pápulas, vesículas discretas; “3” = reacción extra positiva, es decir, eritema intenso, infiltración, reacción de vesículas/bullas fusionadas; “IR” = reacción de irritación, es decir, eritema discreto sin infiltración/ eritema folicular irregular/ pústulas hemorrágicas y foliculares; “NT” = no probado. 40

Resultados de las pruebas dermatológicas

Prueba hipoalergénica – En esta prueba la reacción a la aplicación de un parche que contiene crema LIP fue documentado después de 20 minutos, 24 horas y 48 horas del retiro del parche. Como se muestra en la Tabla 3 aquí mas abajo, en todos los 50 sujetos no hubo reacción visible de la piel a la crema LIP.

Tabla 3

Resultados de prueba Hipoalergénica

No

Sujeto Sexo Edad 20 minutos 24 horas 48 horas

1

DP M 37 0 0 0

2

GB M 62 0 0 0

3

ZA M 58 0 0 0

4

SE M 64 0 0 0

5

ER M 61 0 0 0

6

GC M 35 0 0 0

7

SS M 26 0 0 0

8

DP M 65 0 0 0

9

ET M 46 0 0 0

10

IM M 58 0 0 0

11

MI M 40 0 0 0

12

GO M 30 0 0 0

13

ML M 49 0 0 0

14

SA H 22 0 0 0

15

CB M 38 0 0 0

16

BA M 34 0 0 0

17

SI M 45 0 0 0

18

KS M 35 0 0 0

19

SS M 28 0 0 0

20

FH M 26 0 0 0

21

RS M 44 0 0 0

22

AA M 25 0 0 0

23

ST H 21 0 0 0

24

FA H 38 0 0 0

25

SS M 42 0 0 0

26

SR H 49 0 0 0

27

SI H 19 0 0 0

28

CT M 32 0 0 0

29

CJ H 35 0 0 0

30

HP M 30 0 0 0

31

FS M 36 0 0 0

32

PA M 45 0 0 0

33

PN H 51 0 0 0

34

MR M 30 0 0 0

35

SL M 31 0 0 0

36

YI M 23 0 0 0

37

VI M 30 0 0 0

38

LA M 45 0 0 0

39

TR M 43 0 0 0

40

CD M 38 0 0 0

41

SS M 36 0 0 0

42

LB M 36 0 0 0

43

ML M 31 0 0 0

44

AT H 37 0 0 0

45

GK M 42 0 0 0

46

BP M 51 0 0 0

47

LT M 56 0 0 0

48

IV M 35 0 0 0

49

PO M 43 0 0 0

50

CP M 31 0 0 0

Tabla 3: los resultados de una prueba hipoalergénica como fue calificado después de 20 minutos, 24 horas o 48 horas de remover la aplicación.

Sensibilizar y desafiar la piel normal con la crema LIP resultó en la ausencia de cualquier reacción de la piel – La crema LIP fue insertada en los parches y la prueba del parche del Insulto Repetido de Draize fue realizada en 5 50 voluntarios saludables. Después de cada aplicación del parche, la reacción de la piel fue grabada usando la escala de calificación descrita en la sección de Métodos aquí mas abajo. Como es mostrado en la Tabla 4 aquí mas abajo, en todos los 50 voluntarios no hubo reacción de la piel visible durante todas las 9 aplicaciones de la fase de inducción como también después de la ultima aplicación de la fase de desafío.

Tabla 4 10

Resultados de prueba Hipoalergénica

No

Sujeto Sexo Edad Resultados de acuerdo con la escala de puntuación

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10

1

DP M 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2

GB M 62 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3

ZA M 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4

SE M 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

5

ER M 61 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6

GC M 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7

SS M 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

8

DP M 65 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

9

ET M 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

10

IM M 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11

MI M 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12

GO M 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13

ML M 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14

SA H 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15

CB M 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

16

BA M 34 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17

SI M 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18

KS M 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19

SS M 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

20

FH M 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

21

RS M 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

22

AA M 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

23

ST H 21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

24

FA H 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

25

SS M 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

26

SR H 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

27

SI H 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

28

CT M 32 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

29

CJ H 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

30

HP M 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

31

FS M 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

32

PA M 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

33

PN H 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

34

MR M 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

35

SL M 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

36

YI M 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

37

VI M 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

38

LA M 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

39

TR M 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

40

CD M 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

41

SS M 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

42

LB M 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

43

ML M 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

44

AT H 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

45

GK M 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

46

BP M 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

47

LT M 56 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

48

IV M 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

49

PO M 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

50

CP M 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Los resultados de las pruebas de inducción y desafío de la crema LIP

No.

Sujeto

Sexo 5

Edad

Resultados de acuerdo con la escala de puntuación

Tabla 4: Puntajes de calificación después de cada aplicación del parche en la fase de inducción (resultados de puntuación Nos. 1-9) y la fase de desafío (resultados de puntuación No. 10). M = hombre; F = mujer.

Prueba dermatológica en la piel sensible – Para caracterizar aún más las propiedades sensibilizantes de la 10 crema LIP una prueba de parche de irritación fue realizada en 50 voluntarios sanos con piel sensible. En la pre-prueba, se encontró que 11 sujetos tenían varios grados de escozor: 2 con piel sensible severa, 8 con piel moderadamente sensible y 1 con piel ligeramente sensible. El parche irritante que incluye la crema LIP fue colocado en la espalda de los voluntarios por 48 horas. El área probada fue inspeccionada después de 1 hora, 24 horas y 48 horas y se encontró que no hubo reacción de la piel en ninguno de los 50 voluntarios. 15

Estos resultados descartan reacciones hipoalergénicas e irritantes a la crema de LIP en piel normal y sensible. Además, los resultados de la prueba del parche de Insulto Repetido sugieren adicionalmente el uso de la crema de LIP como una composición cosmética segura.

Ejemplo 7

La crema de LIP es altamente eficiente en blanquear la pigmentación de la piel 20

El efecto de la crema de LIP en el blanqueamiento de la piel fue comparado a cremas en la técnica previa en un estudio doble ciego.

Diseño del estudio

Sujetos del estudio – El estudio incluyó 12 hombres saludables y mujeres con edades de 18 – 65 de origen Asiático que estaban libres de enfermedad, sin historia de enfermedades de la piel o enfermedades atópicas (asma, 25 fiebre del heno, rinitis alérgica) y sin sensibilidad conocida a cualquiera de las sustancias siendo probadas y cualquiera de los componentes de la preparación cosmética. El estudio excluyó candidatos que estaban sometidos a tratamiento con fármacos anti-inflamatorios, antihistamínicos o corticosteroides para tratamiento sistémico o local, a no ser que el tratamiento fuera interrumpido dos semanas en el caso de tratamiento sistémico y tres días en el caso de tratamiento local antes de inscribirse en el estudio. También se excluyeron del estudio candidatos con cáncer, 30 enfermedad renal o enfermedad hepática en cualquier etapa de diagnóstico o tratamiento, como también mujeres embarazadas o lactando.

Protocolo del estudio – El estudio incluyó dos tipos de cremas que fueron aplicadas de forma doble ciega cada una en un antebrazo superior; la crema blanqueadora de la presente invención que incluye LIP como el ingrediente activo, y un producto comercializado, Hidroquinona al 2% (Esomed Medibrands, Israel). Las cremas 35 fueron aplicadas dos veces al día (es decir, mañana y noche). Las partes inferiores de los antebrazos permanecieron sin tratamiento. Los sujetos del estudio fueron examinados por el personal del Instituto de Investigación de la Piel (Tel Aviv, Israel), al principio del estudio (semana 0), y después de una, dos y tres semanas de la aplicación de la crema. En cada examinación se documentó la pigmentación de la piel y efectos secundarios.

Evaluación de la pigmentación de la piel – La pigmentación de la piel fue evaluada usando un Derma 40 Espectrometro (Cortex Technology, Dinamarca), fotografías a color que fueron tomadas usando la misma distancia y exposición a la luz e inspección visual hecha por el Prof. Brenner (Cabeza del Departamento de Dermatología, Centro Medico Souraski, Tel Aviv, Israel) y su equipo.

Resultados del estudio

La crema de LIP redujo la pigmentación de la piel después de 3 semanas de aplicación – Para evaluar el efecto de la crema LIP en el blanqueamiento de la piel la crema de LIP fue aplicada dos veces al día en la parte superior del brazo derecho de 12 voluntarios saludables. También se muestra en las Figuras 11a-b y 13a-b que incluyen fotografías representativas de dos sujetos del estudio, después de tres semanas de aplicación de la crema 5 la parte superior del antebrazo derecho parecen mas blancas que antes de la aplicación de la crema.

La crema de LIP es más eficiente en el blanqueamiento de la piel que la crema de Hidroquinona – El efecto de la crema de LIP en reducir la pigmentación de la piel fue comparado con esa de la Hidroquinona al 2%. Después de 21 días de aplicación de la crema la pigmentación del área tratada con LIP del sujeto No.1 del estudio fue reducido por 3.33 unidades (La Figura 12a columnas azules y la Figura 12c curva azul). De otro lado la pigmentación 10 del área no tratada en el mismo antebrazo fue reducida por 1.13 unidades (Figura 12a, columnas azul claro). Por otro lado, después de 21 días de tratamiento usando la crema de Hidroquinona la pigmentación del área tratada fue reducida por solo 1 unidad (Figura 12b columnas rosadas y Figura 12c curva rosada). Efectos similares fueron observados en otros sujetos del estudio como es mostrado en las Figuras 14a-c. Cuando los resultados de todos los 12 sujetos del estudio fueron resumidos se encontró que las reducciones promedio en la pigmentación de la piel 15 fueron 1.57 unidades (Figura 15a, curva azul) y 1.49 (Figura 15a, curva rosada) unidades en antebrazos tratados con LIP y con Hidroquinona, respectivamente. Además, cuando las reducciones en las pigmentaciones de la piel fueron normalizadas a la pigmentación inicial de la piel el promedio de disminución en las pigmentaciones de la piel fue de 4.3% (Figura 15b, curva azul) y 3.8% (Figura 15b, curva rosada) para los antebrazos tratados con LIP e Hidroquinona, respectivamente. 20

En general, estos resultados demuestran que la crema de LIP es altamente eficiente en reducir la pigmentación de la piel. Además, estos resultados sugieren que el efecto blanqueador relativo de la crema de LIP es más alto que el efecto de blanqueamiento relativo observado usando la crema de Hidroquinona al 2%.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que son, por claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, también pueden ser provistas en combinación en una sola modalidad. En cambio, varias 25 características de la invención, que son, por brevedad, descritas en el contexto de una sola modalidad, también pueden ser provistas por separado o en cualquier sub-combinación adecuada.

Aunque la invención ha sido descrita en conjunción con modalidades especificas de la misma, es evidente que varias alternativas, modificaciones y variaciones serán aparentes a aquellos diestros en la técnica. Como corresponde, se pretende abarcar todas aquellas alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del 30 amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes, aplicaciones de patente y secuencias identificadas por sus números de adquisición mencionados en esta especificación son divulgados. Adicionalmente, la citación o identificación de cualquier referencia en esta aplicación no debe ser interpretada como una admisión de que tal referencia es disponible como técnica previa a la presente invención.

REFERENCIAS 35

1. Alaluf S, Heath A, Carter N, Atkins D, Mahalingam H, Barret K, Kolb R, Smit N. (2001). Variation in melanin content and composition in Type V and VI photoexposed and photoprotected human skin: the dominant role of DHI. Pigment Cell Res. 14: 337-347.

2. Cooksey CJ, Garratt PJ, Land EJ, Pavel S, Ramsden CA, Riley PA, Smit NPM. (1997). Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. J. Biol. 40 Chem. 272: 26226-35.

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9. Stewart, P., Kersten, P., Van den Wymelenberg, A., Gaskell, J., Cullen, D. (1992). Lignin peroxidase gene family of Phanerochaete chrysosporium: complex regulation by carbon and nitrogen limitation and identification of a second dimorphic chromosome. J. Bacteriol. 174: 5036-5042.

10. van der Woude, M.W., Boominathan, K., Reddy, C. A. (1993). Nitrogen regulation of lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase production is independent of carbon and manganese regulation in Phanerochaete 5 chrysosporium. Arch. Microbiol. 160: 1-4.

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12. Faison, B.D. and Kirk, T.K. (1985). Factors involved in the regulation of a ligninase activity in Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 49: 251-254. 10

13. Leisola, M., Ulmer, D., Fiechter, A. (1983). Problem of oxygen transfer during degragation of lignin by Phanerochaete chrysosporium. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 113-116.

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15. Popp, J.L., Kalyanaraman, B., Kirk, T.K. (1990). Lignin peroxidase oxidation of Mn2+ in the presence of veratryl 15 alcohol, malonic or oxalic acid, and oxygen. Biochemistry 29: 10475-10480.

16. Rothschild, N., Levkowitz, A., Hadar, Y., Dosoretz, C. (1999). Manganese deficiency can replace high oxygen levles needed for lignin peroxidase formation by Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 65: 483-8.

<110> R.B.T (Rakuto Bio Technologies) Ltd.

<120> METHODS OF PRODUCING LIGNIN PEROXIDASE AND ITS USE IN SKIN AND HAIR LIGHTENING 20

<130> FSS-12882-EP

<140> 03777155.7

<141> 11-Diciembre-2003

<150> US 60/432,678

<151> 12-Diciembre-2002 25

<160> 1

<170> Patent In version 3.1

<210> 1

<211> 1119

<212> DNA 30

<213> Phanerochaete chrysosporium

<400> 1

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> R.B.T (Rakuto Bio Technologies) Ltd.

<120> METHODS OF PRODUCING LIGNIN PEROXIDASE AND ITS USE IN SKIN AND HAIR LIGHTENING 35

<130> FSS-12882-EP

<140> 03777155.7

<141> 11-December-2003

<150> US 60/432,678

<151> 12-December-2002 40

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1119

<212> DNA

<213> Phanerochaete chrysosporium

<400> 1

Claims (54)

1. REIVINDICACIONES
2. 1. Un método no terapéutico para aclarar una región de piel o pelo de un sujeto, el método que comprende aplicar a la región de la piel o pelo por lo menos un tipo de una enzima de lignina peroxidasa de una forma apropiada para oxidar un pigmento contenido dentro de las células de la región de la piel o pelo. 5
3. 2. El método no terapéutico de la reivindicación 1, donde dicha lignina peroxidasa es una isoenzima H1 o una forma modificada de isoenzima H2.
4. 3. El método no terapéutico de la reivindicación 1, donde dicha aplicación es efectuada por medio de una aplicación tópica de una preparación que incluye dicho por lo menos un tipo de enzima de lignina peroxidasa. 10
5. 4. El método no terapéutico de la reivindicación 1, donde dicha aplicación es efectuada por medio de la administración intradérmica o subcutánea de una preparación que incluye por lo menos un tipo de dicha enzima de lignina peroxidasa.
6. 5. El método no terapéutico de la reivindicación 1, donde dicho por lo menos un tipo de enzima de lignina peroxidasa está incluida en una composición formulada para aplicación a la piel o pelo. 15
7. 6. El método no terapéutico de la reivindicación 5, donde dicha composición comprende además un aceptador de electrones.
8. 7. El método no terapéutico de la reivindicación 5, donde dicha composición comprende además alcohol veratrílico.
9. 8. El método no terapéutico de la reivindicación 5, donde dicha composición comprende por 20 lo menos un tipo de un penetrante epidérmico.
10. 9. El método no terapéutico de la reivindicación 5, donde dicha composición comprende por lo menos un tipo de penetrante de pelo.
11. 10. El método no terapéutico de la reivindicación 1, donde dicha aplicación es efectuada por un periodo de tiempo seleccionado de acuerdo al nivel de aclaramiento deseado. 25
12. 11. Una composición cosmética para aclarar una región de la piel o pelo de un sujeto que comprende una enzima de lignina peroxidasa y un vehículo cosméticamente aceptable, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable está en una formulación seleccionada de un grupo que consiste de una emulsión de aceite-en-agua, una emulsión de agua-en-aceite, una emulsión de agua-en-aceite-en-agua, una emulsión de aceite-en-agua-en-silicona, una crema, un ungüento, una loción, un aerosol, un vehículo 30 que comprende un emoliente, un surfactante o un acondicionador.
13. 12. La composición cosmética de la reivindicación 11, que comprende además un mediador oxidante.
14. 13. La composición cosmética de la reivindicación 11, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable es formulado para uso en una piel o un pelo. 35
15. 14. La composición cosmética de la reivindicación 12, donde dicho mediador oxidativo es alcohol veratrílico o veratrole.
16. 15. La composición cosmética de la reivindicación 11, 12, 13 o 14, donde dicha lignina peroxidasa es la isoenzima H1 o una forma modificada de la isoenzima H2.
17. 16. La composición cosmética de la reivindicación 11, 12, 13 o 14, donde dicho vehículo 40 cosméticamente aceptable incluye transcutol y/o glicol de butileno.
18. 17. La composición cosmética de la reivindicación 11, 12, 13 o 14, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable incluye aminas de alcanol.
19. 18. La composición cosmética de la reivindicación 11, 12, 13 o 14, donde dicha lignina peroxidasa es provista a una concentración de por lo menos 1 U/gr. 45
20. 19. La composición cosmética de la reivindicación 14, donde dicho alcohol veratrílico es provisto a una concentración de por lo menos 0.05%.
21. 20. Un equipo para aclarar una región de la piel o pelo que comprende un primer recipiente que incluye una enzima de lignina peroxidasa, un segundo recipiente que incluye un receptor de electrones,
22. 21. El equipo de la reivindicación 20, donde dicho primer recipiente comprende además alcohol veratrílico.
23. 22. El equipo de la reivindicación 20, donde dicha lignina peroxidasa es la isoenzima H1 o una forma modificada de la isoenzima H2.
24. 23. El equipo de la reivindicación 20, donde dicho aceptador de electrones incluido es 5 peróxido de hidrógeno.
25. 24. El equipo de la reivindicación 21, donde dicho alcohol veratrílico es provisto en una concentración de por lo menos 0.05%.
26. 25. El equipo de la reivindicación 20, donde dicha lignina peroxidasa es provista a una concentración de por lo menos 1 U/gr. 10
27. 26. El equipo de la reivindicación 23, donde dicho peróxido de hidrógeno es provisto a una concentración de por lo menos 0.005%.
28. 27. El equipo de la reivindicación 20, donde dicho primero y/o segundo recipiente(s) incluye además un vehículo cosméticamente aceptable adecuado para la penetración epidérmica.
29. 28. El equipo de la reivindicación 20, donde dicho primero y/o segundo recipiente incluye 15 además un vehículo cosméticamente aceptable adecuado para la penetración del pelo.
30. 29. El equipo de la reivindicación 27, donde dichos vehículos cosméticamente aceptables incluyen transcutol y/o glicol de butileno.
31. 30. El equipo de la reivindicación 28, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable incluye aminas de alcanol. 20
32. 31. Un artículo-de-fabricación que comprende material de empacado y una composición cosmética identificada para aclarar una región de piel o pelo de un sujeto, dicha composición cosmética siendo contenida dentro de dicho material de empaque, dicha composición cosmética que incluye, como un ingrediente activo, una enzima de lignina peroxidasa, y un vehículo cosméticamente aceptable.
33. 32. El artículo-de-fabricación de la reivindicación 31, donde dicha lignina peroxidasa es la 25 isoenzima H1 o una forma modificada de la isoenzima H2.
34. 33. El artículo-de-fabricación de la reivindicación 31, donde dicha composición cosmética comprende además alcohol veratrílico.
35. 34. El artículo-de-fabricación de la reivindicación 31, donde dicho vehículo cosméticamente aceptable incluye composiciones adecuadas para penetración epidérmica o del pelo. 30
36. 35. El uso de un vector de expresión que comprende un promotor funcionalmente enlazado a un polinucleótido que codifica una enzima de lignina peroxidasa para la fabricación de una composición cosmética para aclarar una región de la piel de un sujeto, dicho polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO:1, donde la expresión de dicho polinucleótido dentro de células de la región de la piel es efectuada de una forma adecuada para oxidar un pigmento contenido dentro de 35 las células de la región de la piel.
37. 36. El uso de la reivindicación 35, donde la composición cosmética comprende además un receptor de electrones.
38. 37. El uso de la reivindicación 36, donde dicho receptor de electrones es el peróxido de hidrógeno. 40
39. 38. El uso de la reivindicación 35, donde la composición cosmética además comprende alcohol veratrílico.
40. 39. El uso de la reivindicación 35, donde dicho vector de expresión es un vector viral.
41. 40. El método no-terapéutico de la reivindicación 1, la composición cosmética de la reivindicación 11, 12, 13 o 14, el equipo de la reivindicación 20 o el artículo-de-fabricación de la 45 reivindicación 31, donde dicha lignina peroxidasa es obtenida por:

    (a) cultivo del el hongo Phanerochaete chrysosporium en una matriz porosa en un medio de cultivo agitado y aireado que contiene glicerol por un periodo predeterminado de tiempo;

    (b) después de dicho periodo de tiempo predeterminado, extracción de una fracción soluble de dicho hongo Phaherochaete chrysosporium. 50
42. 41. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicho medio de cultivo carece de iones de manganesio.
43. 42. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicho cultivo aireado es obtenido sometiendo dicho medio de cultivo a un índice de aireación en el rango de 0.1 – 1 litro por litro por minuto. 5
44. 43. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicho cultivo es efectuado a una temperatura de 37 °C.
45. 44. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicho medio de cultivo es obtenido agitando dicho medio de cultivo a una velocidad en el rango de 50-300 rpm. 10
46. 45. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicho medio de cultivo agitado es obtenido agitando dicho medio de cultivo a una velocidad de 160 rpm.
47. 46. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicho periodo de tiempo predeterminado es seleccionado del rango de 3-10 15 días.
48. 47. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicho periodo de tiempo predeterminado es de 7 días.
49. 48. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicho glicerol es provisto a un rango de concentración de 3-20 gramos por 20 litro.
50. 49. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicho glicerol es provisto a una concentración de 6 gramos por litro.
51. 50. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicho medio de cultivo incluye además alcohol veratrílico. 25
52. 51. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 50, donde dicho alcohol veratrílico es provisto a un rango de concentración de 0.5-4 mM.
53. 52. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 50, donde dicho alcohol veratrílico es provisto a una concentración de 2 mM. 30
54. 53. El método no terapéutico, la composición cosmética, el equipo o el artículo-de-fabricación de la reivindicación 40, donde dicha matriz porosa es una espuma de poliuretano.