PT1583512E - Utilização de lenhina-peroxidase para clarear a pele e os cabelos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE LENHINA-PEROXIDASE PARA CLAREAR A PELE E OS CABELOS"

CAMPO E ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos de produção de lenhina-peroxidase e à sua utilização na clareação da pele e do cabelo.

Melanina A cor da pele humana e do cabelo é governada pela quantidade, qualidade e distribuição de melanina, um pigmento que também está presente em plantas e microrganismos. A síntese de melanina inicia-se a partir do precursor L-tirosina que é transformado num segundo precursor

dopaquinona através da acção da tirosinase. Na biossíntese da melanina de mamífero este intermediário pode ser polimerizado através de duas vias principais (Figura 1). A adição nucleófila intramolecular do grupo amino dá origem ao derivado de indole leucodopacromo que, após polimerização, produz o pigmento castanho escuro a preto eumelanina. Na presença de compostos de tiol formam-se derivados tioéster de dopa; a reacção cisteína produz cisteínildopa, que após oxidação e polimerização adicionais produz o pigmento amarelo a castanho avermelhado feomelanina. Consequentemente, a eumelanina é principalmente constituída pelas unidades 5,6-di-hidroxi-indole (DHI) e ácido 5,6-di-hidroxi-indole-2-carboxílico (DHICA), enquanto a feomelanina contém principalmente unidades de benzotiazina (Alaluf et al., 2001). A 2 disponibilidade e a relação mútua destes dois pigmentos influenciam a composição quimica do pigmento polimérico. A síntese de melanina ocorre em grânulos, que são referidos como melanossomas (Cooksey et al., 1997) que estão presentes em melanócitos presentes na camada basal da epiderme; a sintese de melanina nestas células é induzida por luz ultravioleta (UV). Após a sintese, a melanina migra para células epidérmicas e é dispersada no seu interior, onde a melanina é descolorada pelo metabolismo dérmico e em seguida eliminada na forma de sujidade no momento da renovação da pele. A melanina tem uma importância clínica visto que protege a pele dos efeitos adversos provocados pela luz UV. No entanto, níveis elevados de melanina podem resultar no escurecimento indesejado da pele e do cabelo, enquanto a sua distribuição heterogénea pode conduzir a cloasma e aparecimento de sardas que podem ser esteticamente desagradáveis.

Produtos de clareação

Os produtos de clareação da pele têm-se tornado cada vez mais populares nos últimos anos. 0 objectivo principal dos produtos de clareação da pele é clarear ou branquear a pele ou tratar doenças da pigmentação, tais como cloasma, sardas, pano da gravidez e manchas de envelhecimento.

Encontram-se presentemente disponíveis vários tipos de produtos de clareação da pele.

Os produtos com base na degeneração e morte de células de pigmentos incluem tipicamente produtos químicos agressivos, tais como hidroquinona, 4-isopropilcatecol e éter monobenzílico de hidroquinona, que promovem o branqueamento da pele e a clareação da pele ou o enfraquecimento da pigmentação da pele. Tais produtos são tipicamente 3 ineficazes e podem ser prejudiciais para a pele, uma vez que uma aplicação externa continua destes produtos pode conduzir a leucoderma permanente e a efeitos secundários tais como discromatose e irritação.

Outros produtos de clareação baseiam-se na inibição da tirosinase, a enzima que transforma o precursor L-tirosina num segundo precursor dopaquinona. Este grupo de produtos inclui a Arbutina, um composto de glicose hidroquinona que é capaz de inibir a tirosinase pela quelação de iões de cobre, suprimindo deste modo a tautomerização da Dopacroma em DHICA. 0 Melanostat é outro produto de clareação que actua através da tirosinase. 0 Melanostat é um péptido sintético que funciona através da desactivação da melanogénese em melanócitos. Vários compostos antioxidantes que podem inibir a produção de melanina são também utilizados em produtos de clareação. Uma vez que a sintese de melanina envolve uma reacção de oxidação, o bloqueamento da oxidação em vários pontos da tirosina/DOPA para melanina, em última análise, inibe a sintese da melanina.

Um antioxidante que é utilizado para bloquear a sintese de melanina é o L-ascórbico (Vitamina C) que actua como um agente de redução em intermediários da melanina e bloqueia reacções oxidativas; outros antioxidantes utilizados em produtos de clareação incluem bioflavonóides que são normalmente extraídos de amoras ou alcaçuz.

Os produtos de clareação do cabelo actuam na melanina dentro do córtex do cabelo. Existem vários produtos 4 químicos que podem clarear o cabelo, entre estes estão incluídos o ácido clorídrico, hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogénio. 0 produto químico mais geralmente utilizado para clarear o cabelo é o peróxido de hidrogénio. Para manter a eficácia desejada, as soluções de peróxido de hidrogénio têm de ser estabilizadas utilizando compostos tais como acetanilida, ácidos diluídos, sílica coloidal, p-hidroxibenzoatos, sulfato de oxiquinolina, fenacetina e compostos de estanho (estanato de sódio, hidróxido de estanho, octoato de estanho). Antes do cabelo ser clareado, adiciona-se amoníaco à solução de peróxido de hidrogénio para aumentar a penetração do peróxido de hidrogénio através da cutícula, a camada exterior do cabelo, e deste modo acelerar a reacção de oxidação. A JP2002 012535 (LION CORP) 15 de Janeiro de 2002 (2002-01-15) descreve um método de clareação de uma região da pele ou do cabelo de um indivíduo, compreendendo o método a aplicação de peroxidase.

Enquanto reduziam a presente invenção à prática, os actuais inventores constataram que a isoenzima Hl da Lenhina-peroxidase pode oxidar a melanina in vitro e pode ainda clarear a pele e o cabelo in vivo.

Assim, a presente invenção proporciona composições cosméticas e métodos que são extremamente adequados para clarear a pele e o cabelo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto da presente invenção é proporcionado um método não terapêutico de clareação de uma 5 região da pele ou cabelo de um indivíduo, que compreende a aplicação à região da pele ou cabelo de pelo menos um tipo de uma enzima modificadora de lenhina de um modo adequado para oxidar um pigmento contido dentro das células da região da pele ou cabelo.

De acordo com outro aspecto da presente invenção é proporcionada uma composição cosmética para clarear uma região da pele ou cabelo de um indivíduo, compreendendo pelo menos um tipo de uma enzima modificadora de lenhina e um veículo cosmeticamente aceitável de acordo com a reivindicação 11.

De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção é proporcionado um estojo para clarear uma região da pele ou cabelo compreendendo um primeiro recipiente incluindo uma enzima modificadora de lenhina, e um segundo recipiente incluindo um aceitador de electrões.

De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção é proporcionado um artigo de fabrico compreendendo material de embalagem e uma composição cosmética identificada para clarear uma região da pele ou cabelo de um indivíduo que está contida no interior do material de embalagem, incluindo a composição cosmética, como um ingrediente activo, uma enzima modificadora de lenhina e um veículo cosmeticamente aceitável.

De acordo com outras características das formas de realização preferidas da invenção descritas abaixo, o método é efectuado por uma aplicação tópica de uma preparação incluindo pelo menos um tipo de enzima modificadora de lenhina. 6

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o método é efectuado via administração intradérmica ou subcutânea de uma preparação incluindo pelo menos um tipo de enzima modificadora de lenhina.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a enzima modificadora de lenhina é incluída numa composição formulada para aplicação na pele ou cabelo. A enzima modificadora de lenhina é a lenhina-peroxidase.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a lenhina-peroxidase é a isoenzima Hl ou uma forma modificada da isoenzima H2.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a composição cosmética compreende ainda um aceitador de electrões.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o aceitador de electrões é peróxido de hidrogénio.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a composição cosmética compreende ainda álcool veratrílico.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a composição compreende pelo menos um tipo de um agente de penetração epidérmico. 7

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a composição compreende pelo menos um tipo de um agente de penetração no cabelo.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o método é efectuado durante um período de tempo seleccionado de acordo com o nivel de clareação desejado.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o veículo cosmeticamente aceitável inclui transcutol e/ou butileno glicol.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o veículo cosmeticamente aceitável inclui alcanolaminas.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a lenhina-peroxidase na composição cosmética é proporcionada a uma concentração de pelo menos 1 U/g.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o peróxido de hidrogénio na composição cosmética é proporcionado a uma concentração de pelo menos 0,005%.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o álcool veratrilico na composição cosmética é proporcionado a uma concentração de pelo menos 0,05%.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o primeiro recipiente do estojo para clarear uma região da pele ou cabelo compreende ainda álcool veratrilico.

Ainda de acordo com outras caracteristicas das formas de realização preferidas descritas, o primeiro e/ou segundo recipiente(s) do estojo para clarear uma região da pele ou o cabelo inclui ainda um veículo cosmeticamente aceitável adequado para penetração epidérmica.

Ainda de acordo com outras caracteristicas das formas de realização preferidas descritas, o primeiro e/ou o segundo recipiente (s) do estojo para clarear uma região da pele ou o cabelo inclui ainda um veículo cosmeticamente aceitável adequado para penetração no cabelo.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção é proporcionada a utilização de um polinucleótido que codifica uma enzima lenhina-peroxidase para clarear uma região da pele de um indivíduo, compreendendo o método a expressão nas células da região da pele de uma enzima lenhina-peroxidase de um modo adequado para oxidar um pigmento contido dentro das células da região da pele.

Ainda de acordo com outras caracteristicas das formas de realização preferidas descritas, o método compreende ainda um passo de proporcionar um aceitador de electrões às células da região da pele.

Ainda de acordo com outras caracteristicas das formas de realização preferidas descritas, o aceitador de electrões é o peróxido de hidrogénio.

Ainda de acordo com outras caracteristicas das formas de realização preferidas descritas, o método compreende ainda 9 um passo de proporcionar álcool veratrílico às células da região da pele. A expressão é efectuada pela introdução nas células de um vector de expressão capaz de expressar a enzima modificadora de lenhina.

Ainda de acordo com outras caracteristicas das formas de realização preferidas descritas, o vector é um vector virai.

Ainda de acordo com outras caracteristicas das formas de realização preferidas descritas, o vector compreende um promotor funcionalmente ligado a uma sequência de codificação da enzima modificadora de lenhina. A enzima modificadora de lenhina é a lenhina-peroxidase. A lenhina-peroxidase é codificada pela sequência polinucleotídica explicitada na N0:1. A lenhina-peroxidase é obtenível por um processo compreendendo: (a) cultivar o fungo Phanerochaete chrysosporium numa matriz porosa num meio de cultura agitado e arejado contendo glicerol durante um período de tempo predeterminado; (b) após o período de tempo predeterminado, extrair uma fracção solúvel do fungo Phanerochaete chrysosporium para desse modo produzir a lenhina-peroxidase.

Ainda de acordo com outras caracteristicas das formas de realização preferidas descritas, o meio de cultura é desprovido de iões de manganês. 10

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a cultura arejada é obtida submetendo o meio de cultura a uma taxa de arejamento na gama de 0,1-1 litro por litro por minuto.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a cultura é efectuada a uma temperatura de 37 °C.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o meio de cultura agitado é obtido agitando o meio de cultura a uma velocidade na gama de 50-300 rpm.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o meio de cultura agitado é obtido por agitação do meio de cultura a uma velocidade de 100 rpm.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o período de tempo predeterminado é seleccionado a partir da gama de 3-10 dias.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o período de tempo predeterminado é de 7 dias.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o glicerol é proporcionado numa gama de concentrações de 3-20 grama por litro. 11

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o glicerol é proporcionado numa concentração de 6 grama por litro.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o meio de cultura inclui ainda álcool veratrílico.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o álcool veratrílico é proporcionado numa gama de concentrações de 0,5-4 mM.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, o álcool veratrílico é proporcionado numa concentração de 2 mM.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a lenhina-peroxidase é a isoenzima Hl ou uma forma modificada de isoenzima H2.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a matriz porosa é uma espuma de poliuretano. É obtenível por este processo um extracto aquoso do fungo Phanerochaete chrysosporium exibindo actividade enzimática de lenhina-peroxidase na gama de 500-2000 unidades por litro.

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a actividade da lenhina-peroxidase é de 1500 unidades por litro. 12

Ainda de acordo com outras características das formas de realização preferidas descritas, a actividade enzimática de lenhina-peroxidase é a isoenzima Hl ou uma forma modificada da isoenzima H2. A presente invenção aborda com sucesso os inconvenientes das configurações presentemente conhecidas, ao proporcionar métodos eficientes e composições para clarear uma região da pele ou o cabelo de um indivíduo. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como vulgarmente entendido por um técnico médio na arte à qual esta invenção pertence. Embora possam ser utilizados métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos na prática ou na avaliação da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos a seguir. Em caso de conflito, sobrepor-se-á a especificação da patente, incluindo as definições. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se pretende que sejam restritivos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção é aqui descrita, apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos que a acompanham. Com referência específica agora aos desenhos em pormenor, sublinha-se que os casos particulares demonstrados são a título de exemplo e apenas para fins de discussão ilustrativa das formas de realização preferidas da presente invenção, e são apresentados com o fim de proporcionar o que se julga que seja a descrição mais útil e facilmente compreensível dos princípios e aspectos conceptuais da invenção. A este respeito, não é feita qualquer tentativa de mostrar os pormenores estruturais da invenção com mais detalhe do que 13 o necessário para um entendimento fundamental da invenção, tornando, a descrição em conjunto com os desenhos, evidente para os especialistas na técnica como as diversas formas da invenção podem ser concretizadas na prática.

Nos desenhos: FIG. 1 é uma ilustração esquemática da técnica anterior da biossintese da melanina de mamífero adoptado de Alaluf et al., 2001. FIG. 2 ilustra o reactor de tanque agitado (STR) para a produção de lenhina-peroxidase pelo Phanerochaete chrysosporium imobilizado em espuma de poliuretano. FIG. 3 ilustra a actividade de LIP numa cultura em fermentador de P. chrysosporium em função da idade da cultura. 0 P. chrysosporium foi cultivado num fermentador de STR como descrito no Exemplo 1 da Secção de Exemplos e a actividade de lip foi avaliada no fluido extracelular seguindo-se a oxidação do álcool veratrílico a aldeído veratrílico como descrito nos Exemplos. As barras de erro representam os desvios padrão de 3 experiências em replicado. FIG. 4 ilustra a oxidação da melanina, numa concentração inicial de 70,5 pg/mL, pela LIP (0,48 μΜ) como uma função de concentrações crescentes de peróxido de hidrogénio na presença de álcool veratrílico 1,5 mM em tampão de tartrato 50 mM, a pH 3,5. A oxidação da melanina foi determinada medindo a sua absorvância a 460 nm, no início da reacção enzimática e após 160 segundos, e foram calculados as percentagens de melanina oxidada. As barras de erro representam os desvios padrão de 3 experiências em replicado. 14 FIG. 5 ilustra o efeito de concentrações crescentes de peróxido de hidrogénio na oxidação da melanina pela LIP. 0 grau de oxidação da melanina é visualizado pela diminuição na intensidade de cor em comparação com a reacção enzimática sem a inclusão de peróxido de hidrogénio (0 μΜ). Os números por baixo da imagem indicam as concentrações de H202 exprimidas em μΜ. FIG. 6 ilustra o grau de oxidação de concentrações diferentes de melanina pela LIP (0,48 μΜ) em tampão de tartarato 50 mM a pH 3,5 na presença de álcool veratrilico (1,5 mM) e peróxido de hidrogénio (600 μΜ) . As barras de erro representam os desvios padrão de 3 experiências em replicado. FIG. 7 ilustra o grau de oxidação da melanina como uma função das concentrações de LIP. A oxidação da melanina (70 pg/mL) foi realizada por concentrações crescentes de LIP na presença de álcool veratrilico (1,5 mM) e peróxido de hidrogénio (700 μΜ) em tampão de tartarato 50 mM a pH 3,5. As barras de erro representam os desvios padrão de 3 experiências em replicado. FIGs. 8a-b ilustram a visualização da oxidação da melanina pela LIP quando utilizada numa formulação em creme. É observada descoloração da melanina após a adição do creme activador ao creme de LIP (Figura 8b) mas não na presença do creme de LIP sozinho (Figura 8a). FIGs. 9a-b ilustram o efeito do creme de LIP no branqueamento da pele. É mostrada uma fotografia da mão de uma mulher tirada uma semana após a aplicação de LIP (duas vezes por dia) numa formulação em creme. A área tratada com 15 LIP (Figura 9a, marcada com círculo a preto) é muito mais clara do que o resto da pele na mão (Figura 9b). FIG. 10 ilustra o efeito da LIP no branqueamento do cabelo in vivo. O cabelo de uma mulher foi embebido durante 1 h em tampão de carbonato 50 mM a pH 11,5. O cabelo foi pré-incubado durante 10 segundos com 25 U de LIP e imerso durante 1 h em tampão de tartarato a pH 3,5 com álcool veratrílico (1,5 mM) e peróxido de hidrogénio (8,8 mM). Foi observado um efeito de clareação significativo no cabelo tratado com LIP (Figura 10, tubo direito) em comparação com o cabelo tratado com a mesma solução sem LIP (Figura 10, tubo esquerdo).

FiGs. 11 a-b são fotografias a cores do antebraço direito do Indivíduo de estudo N° 1 que ilustra o efeito do creme de branqueamento com LIP na pigmentação da pele. Figura 11a- uma fotografia tirada no dia 0; Figura 11b- uma fotografia tirada no dia 21.

FiGs. 12a-c ilustram o efeito dos cremes de LIP ou hidroquinona no branqueamento da pele no Indivíduo de estudo N° 1. Os cremes de LIP ou hidroquinona foram aplicados nas partes superiores dos antebraços direito e esquerdo, enquanto as partes inferiores permaneceram por tratar. O grau da pigmentação da pele foi medido em ambos os antebraços em intervalos de 7 dias, usando o Espectrómetro Derma. Figura 12a - aplicação do creme de LIP; Figura 12b - aplicação do creme de Hidroquinona; colunas a azul = parte superior do antebraço direito tratada com o creme de LIP; colunas a azul claro = parte inferior do antebraço direito não tratada; colunas a cor de rosa = parte superior do antebraço esquerdo tratada com Hidroquinona; colunas a branco = parte inferior do 16 antebraço esquerdo não tratada; Figura 12c é um gráfico de linhas que compara a diminuição da pigmentação da pele nos antebraços superiores após 21 dias de tratamento utilizando o creme de LIP (Figura 12c, linha azul) ou o creme de Hidroquinona (Figura 12c, linha cor de rosa). Note-se a diminuição acentuada na pigmentação pele após 21 dias de tratamento utilizando o creme de LIP em comparação com a diminuição moderada utilizando o creme de Hidroquinona. FIGs. 13a-b são fotografias a cores do antebraço direito do Indivíduo de estudo N° 10 que ilustram o efeito do creme de branqueamento de LIP na pigmentação da pele. Figura 13a-uma fotografia tirada no dia 0; Figura 13b- uma fotografia tirada no dia 21. FIGs. 14a-c ilustram o efeito dos cremes de LIP ou Hidroquinona no branqueamento da pele no Indivíduo de estudo N° 10. Os cremes de LIP ou Hidroquinona foram aplicados nas partes superiores dos antebraços direito e esquerdo, enquanto as partes inferiores permaneceram por tratar. O grau da pigmentação da pele foi medido em ambos os antebraços em intervalos de 7 dias, utilizando o Espectrómetro Derma. Figura 14a - aplicação do creme de LIP; Figura 14b - aplicação do creme de Hidroquinona; colunas a azul = parte superior do antebraço direito tratada com o creme de LIP; colunas a azul de luz = parte inferior do antebraço direito não tratada; colunas a cor de rosa = parte superior do antebraço esquerdo tratada com Hidroquinona; colunas a branco = parte inferior do antebraço esquerdo não tratada; Figura 14c é um gráfico de linhas que compara a diminuição da pigmentação da pele na parte superior dos antebraços após 21 dias de tratamento utilizando o creme de LIP (Figura 14c, linha azul) ou o creme de Hidroquinona (Figura 14c, linha cor de rosa). 17

Note-se a diminuição acentuada da pigmentação da pele após 21 dias de tratamento utilizando o creme de LIP em comparação com a diminuição moderada utilizando o creme de Hidroquinona. FIGs. 15a-b são gráficos de linhas que ilustram o efeito médio dos cremes de LIP e Hidroquinona no branqueamento da pele em todos os 12 Indivíduos de estudo. Figura 15a - as pontuações de pigmentação médias; Figura 15b - a diminuição média na pigmentação como uma fracção da pontuação de pigmentação inicial.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS A presente invenção é de métodos não terapêuticos e composições cosméticas que podem ser utilizados para clarear uma região da pele ou cabelo de um indivíduo.

Em particular, os métodos da presente invenção podem ser utilizados para o tratamento de tonalidades cutâneas desiguais que resultam de condições médicas relacionadas com hiperpigmentação como melasma, cloasma, manchas de envelhecimento, sardas, ocronose e lentigo.

Os princípios e o funcionamento da presente invenção podem ser melhor compreendidos com referência aos desenhos e descrição apensos.

Antes de explicar pelo menos uma forma de realização da invenção em detalhe, deve ser entendido que a invenção não está restringida na sua aplicação aos pormenores apresentados na descrição que se segue ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de ter outras formas de realização e de ser praticada ou realizada de várias maneiras. Também deve ser entendido que a fraseologia e a 18 terminologia aqui empregadas são para a finalidade de descrição e não devem ser consideradas como restritivas. 0 grau da pigmentação da pele é uma fonte de preocupação entre a população em geral. Algumas pessoas sofrem de manchas de envelhecimento e de pano da gravidez e desejam que tais manchas pigmentadas sejam menos pronunciadas. Outras pessoas têm sardas, cloasma, melasma, ocronose e lentigo que são geralmente tratadas com produtos de clareação da pele que clareiam e suavizam a pigmentação da pele. No entanto, os produtos de clareação da pele correntes são produtos químicos agressivos como a hidroquinona que pode conduzir a leucoderma permanente e efeitos secundários como discromatose e irritação da pele, ou não são suficientemente eficazes na clareação da pele. Entre estes encontram-se os produtos com base na inibição da tirosinase, a enzima que transforma o precursor L-tirosina num segundo precursor dopaquinona e inibem, por isso, a biossíntese da melanina. Outros produtos são concebidos para bloquear as reacções de oxidação em vários pontos da tirosina/DOPA em melanina e, em última análise, inibem a síntese da melanina. O último grupo de produtos inclui antioxidantes como o L-Ascórbico (Vitamina C) e os bioflavonóides.

Os produtos de clareação do cabelo utilizam concentrações elevadas de peróxido de hidrogénio em conjunto com amoníaco. Estes produtos podem ser uma fonte de desconforto para o indivíduo tratado.

Como está claramente ilustrado na secção de Exemplos que se segue, os actuais inventores constataram que a lenhina-peroxidase, e em particular a sua isoforma Hl, pode oxidar 19 eficazmente a melanina e pode ser assim utilizada para clarear a pele ou o cabelo de um indivíduo.

Embora a Patente U.S. N° 5 578 296 tenha identificado um potencial de decomposição da melanina no fungo Basidiomicetes e tenha sugerido que a utilização deste fungo para tratar cloasma e o aparecimento de sardas, até à data não foi descoberta a enzima específica responsável pela decomposição da melanina no fungo.

Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção é proporcionado um método de clareação de uma região da pele ou do cabelo de um indivíduo. 0 método de acordo com este aspecto da presente invenção é efectuado por aplicação, à região da pele ou ao cabelo do indivíduo, de pelo menos um tipo de uma enzima lenhina-peroxidase de um modo adequado para oxidar um pigmento (por exemplo, melanina) contido no interior de células da região da pele ou do cabelo.

Como aqui utilizada, a frase "clareação de uma região da pele ou do cabelo" refere-se à redução da tonalidade ou cor de pele ou cabelo reduzindo a qualidade pigmentadora ou a concentração do pigmento melanina ali contido.

Como aqui utilizada, a frase "indivíduo" refere-se a mamíferos, tipicamente a seres humanos, e preferencialmente àqueles que têm um excesso de pigmentação na pele ou cabelo, ou imperfeições cutâneas como sardas etc. A enzima modificadora de lenhina utilizada pela presente invenção é a lenhina-peroxidase, a qual desempenha um papel principal na degradação da lenhina. A sequência de 20 aminoácidos do sítio activo desta enzima modificadora de lenhina e o mecanismo pelo qual oxida substratos é semelhante ao da peroxidase de rábano-silvestre (HRP) e da peroxidase de soja (SBP). As peroxidases modificadoras de lenhina são capazes de catalisar a oxidação de substratos com potencial redox elevado. Esta capacidade única é coerente com um sítio activo do tipo heme de baixa densidade electrónica, o que é indicado por um potencial redox elevado [Cai e Tien (1993). J Biotechnol 30: 79-90].

Embora quaisquer isoformas de lenhina-peroxidase conhecidas na técnica possam ser utilizadas pela presente invenção (Rothschild et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 857-861), a presente invenção utiliza preferivelmente a isoforma Hl, uma vez que, como é ilustrado na secção de Exemplos que se segue, esta isoforma exibiu actividades de oxidação da melanina, tanto in vitro como in vivo.

Podem ser utilizadas várias abordagens para preparar a enzima modificadora de lenhina utilizada pela presente invenção.

Por exemplo, a isoenzima Hl da lenhina-peroxidase pode ser preparada a partir do fungo Phanerochaete chrysosporium. Podem ser produzidos níveis elevados de actividade enzimática de lenhina-peroxidase a partir do fungo acima, quando cultivado num fermentador de reactor de tanque agitado (STR), enquanto está imobilizado em espuma de poliuretano ou em suspensão (Dosoretz et al., 1993, Appl Environ Microbiol. 59: 1919-26).

De acordo com formas de realização preferidas da presente invenção, o fermentador está ligado a um sistema de arrefecimento para manter uma temperatura de cultura de 37 21 °C e é agitado à velocidade de 50-300 rpm, mais preferencialmente, 100-200 rpm, muito preferencialmente a 160 rpm. A fim de aumentar o rendimento de actividade de lenhina-peroxidase o fermentador é arejado a uma taxa de arejamento de 0,1-1 litros de ar por litro de meio de cultura por minuto. De acordo com configurações presentemente preferidas, o fermentador é arejado a uma taxa de arejamento de 0,2 litros de ar por litro de meio de cultura por minuto.

Como se descreve em Materiais e Métodos Experimentais da secção de Exemplos que se segue o Planerochaete chrysosporium é cultivado sob condições de cultura desprovidas de iões de manganês e contendo glicerol como uma fonte de carbono. Preferencialmente, o glicerol da presente invenção é proporcionado a uma gama de concentrações de 3-20 grama por litro. De acordo com configurações presentemente preferidas, o glicerol é fornecido a uma concentração de 6 grama por litro.

Durante o processo de purificação da isoenzima Hl da lenhina-peroxidase a partir do fungo acima, a actividade enzimática da proteína purificada é ainda testada por uma alteração na absorvância a 310 nm que ocorre devido à oxidação do álcool veratrílico em aldeído veratrílico.

Uma vez que a isoenzima Hl da lenhina-peroxidase pode resultar de uma desfosforilação pós-tradução de isoenzima H2 (Kuan e Tien, 1989), a lenhina-peroxidase utilizada pela presente invenção pode ser preparada desfosforilando a isoenzima H2 da lenhina-peroxidase.

As enzimas modificadoras de lenhina utilizadas pela presente invenção também podem ser extraídas de células 22 bacterianas modificadas para expressar a enzima modificadora de lenhina como descrito na patente U.S. 5 200 338. Por exemplo, uma célula bacteriana, como a E. coli, pode ser transformada com um vector de expressão incluindo a sequência de codificação da LIP (SEQ ID NO: 1) posicionada sob o controlo regulador de um promotor constitutivo forte (por exemplo, SP6). Após expressão, as células bacterianas podem ser submetidas a lise e a LIP pode ser recolhida utilizando técnicas cromatográficas (ver, Billman-Jacobe, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 500-4; Harris e Emtage, 1986, Microbiol. Sei. 3: 28-31, para mais detalhes).

As enzimas modificadoras de lenhina utilizadas pela presente invenção também podem ser extraidas de linhas celulares de mamifero, como as células HeLa. Neste caso, a sequência de codificação da LIP é posicionada sob um promotor de mamifero forte (por exemplo, CMV) num vector de expressão adequado (por exemplo, pCDNA3.1, Invitrogen Life Technologies, frederick, MD, EUA). Após a transfecção de células HeLa com o vector de expressão, o produto de expressão da LIP pode ser extraído a partir das células ou do meio (por exemplo, modificando a sequência da LIP de modo a incluir um sinal de secreção) por técnicas de purificação e cromatografia convencionais (ver Cunha e Aires-Barros, 2002. Mol. Biotechnol. 20: 29-40 para mais detalhes).

Embora a enzima modificadora de lenhina possa ser aplicada à pele ou ao cabelo não necessitando da co-aplicação de compostos adicionais, a capacidade de clareação da enzima modificadora de lenhina LIP é incrementada quando esta é aplicada na presença de um aceitador de electrões (isto é, uma molécula capaz de oxidar um substrato), que serve como 23 o activador de oxidação, e/ou na presença de compostos fenólicos, como o álcool de veratrílico (Harvey et al., 1992, Biochem Soc Trans 20: 345-9) e o veratrol que servem de mediadores de oxidação (Ward et al., Enzyme and Microbial Technology (2002), 30: 490-498).

Assim, de acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a enzima modificadora de lenhina é aplicada com aplicação precedente, concomitantemente ou subsequente de um activador de oxidação, como o peróxido de hidrogénio, e de um mediador de oxidação, como o álcool veratrilico. A enzima modificadora de lenhina pode ser aplicada na pele ou no cabelo per se, contudo, a fim de aumentar a eficácia de clareação, a enzima modificadora de lenhina é preferencialmente incluída numa composição cosmética que é formulada para utilização específica, como, por exemplo, clareação geral da pele, clareação de sardas ou clareação do cabelo. Estas composições cosméticas podem incluir agentes de penetração epidérmicos como o butileno glicol e o transcutol, e agentes de penetração no cabelo, como as alcanolaminas.

Como aqui utilizada, uma "composição cosmética" refere-se a uma preparação que inclui os ingredientes activos descritos acima (por exemplo, LIP) e componentes químicos adicionais, como os veículos e excipientes fisiologicamente adequados, um activador de oxidação e/ou um mediador de oxidação. A finalidade de uma composição cosmética é a de facilitar a administração do ingrediente activo a um organismo.

Daqui em diante, a frase "veículo adequado" utilizado refere-se a um veículo ou um diluente que não provoca 24 irritação significativa num organismo e não anula a actividade biológica e propriedades da enzima modificadora de lenhina.

Aqui o termo "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição cosmética para facilitar ainda mais a administração de um ingrediente activo. Exemplos, sem restrição, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicóis. A composição cosmética pode ser aplicada de uma forma local, por exemplo, através da administração da composição cosmética directamente numa região do tecido de um doente. As vias de administração adequadas podem, por exemplo, incluir tópica, e injecções subcutânea e intradérmica.

As composições cosméticas da presente invenção podem ser fabricadas por processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabrico de drageias, levigação, emulsionação, encapsulação, retenção ou liofilização.

As composições cosméticas para utilização de acordo com a presente invenção podem ser assim formuladas de um modo convencional utilizando um ou mais veiculos fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos ingredientes activos em preparações. A formulação apropriada é dependente da abordagem de administração escolhida.

Para injecção, os ingredientes activos da composição cosmética podem ser formulados em soluções aquosas, 25 preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico.

Alternativamente, o ingrediente activo pode estar na forma de um pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, solução à base de água apirogénica, estéril, antes da utilização. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade dos especialistas na técnica, especialmente à luz da descrição detalhada aqui proporcionada.

Para qualquer preparação utilizada nos métodos da invenção, a quantidade ou dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios in vitro. Como se mostra aqui na secção de Exemplos, as concentrações de LIP e peróxido de hidrogénio poderiam ser optimizadas a partir de ensaios in vitro e ser adicionalmente adaptadas para utilização in vivo. Além disso, uma dose pode ser formulada em sistemas de culturas de tecidos ou em modelos animais para conseguir uma concentração ou título desejado. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior exactidão as doses úteis em humanos.

Dependendo da gravidade do distúrbio de pigmentação da pele (por exemplo, cloasma, melasma, ocronose e lentigo) e da capacidade de resposta da pele, a dosagem pode ser de uma única administração ou de uma multiplicidade de administrações, com o decurso de tratamento a durar desde vários dias até várias semanas ou até ser obtida a cura ou conseguida uma diminuição do distúrbio de pele. 26 A quantidade de uma composição a ser administrada dependerá, evidentemente, do indivíduo a ser tratado, da gravidade do distúrbio, do modo de administração, do julgamento do médico que prescreve, etc. A enzima modificadora de lenhina incluída na composição cosmética da presente invenção também pode ser proporcionada a concentrações mais elevadas e ser prescrita por um médico como uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios de pigmentação da pele, como o melasma, cloasma, ocronose e lentigo. 0 que se segue é uma descrição de formulações que incorporam uma enzima modificadora de lenhina e formulada para clarear a pele ou o cabelo.

Clareação da Pele A fim de optimizar e controlar a clareação da pele, a enzima modificadora de lenhina é preferencialmente incluída numa composição cosmética que é formulada para efeitos de clareação da pele.

Uma vez que a composição cosmética de clareação da pele da presente invenção é utilizado in vivo, a composição é, preferencialmente, de pureza elevada e substancialmente isenta de contaminantes potencialmente prejudiciais, por exemplo, pelo menos de qualidade National Food (NF), geralmente pelo menos de qualidade analítica, e preferencialmente pelo menos de qualidade farmacêutica. Na medida em que um dado composto tenha de ser sintetizado antes da utilização, esta síntese ou purificação subsequente deve resultar preferencialmente num produto que está substancialmente isento de quaisquer agentes tóxicos 27 potencialmente contaminantes que possam ter sido utilizados durante a sintese ou procedimentos de purificação.

Ingredientes activos A lenhina-peroxidase é incluída na composição cosmética da presente invenção a uma concentração seleccionada de uma gama de 1-100 U/g. De acordo com configurações presentemente conhecidas, a enzima modificadora de lenhina incluída na composição cosmética da presente invenção é proporcionada a uma concentração seleccionada de uma gama de 5-100 U/g. Entender-se-á que uma concentração preferida da enzima modificadora de lenhina é seleccionada de acordo com a utilização específica da composição, assim, para clareação geral de pele é utilizada uma concentração preferida de 5-20 U/g, enquanto para clareação de sardas é utilizada uma gama de concentração mais ampla de 5-100 U/g. 0 aceitador de electrões (activador de oxidação) utilizado na composição cosmética de clareação de pele é, preferencialmente, peróxido de hidrogénio, proporcionado a uma concentração de pelo menos 0,005%. O peróxido de hidrogénio é estável, mas decompor-se-á em condições neutras ou alcalinas para originar água e uma espécie activa de oxigénio. As espécies activas de oxigénio são muito reactivas. A composição cosmética é preferencialmente tamponada a um pH de 4 ou inferior, uma vez que a lenhina-peroxidase é apenas activa a um pH inferior a 4, preferencialmente a pH 2,5-3,5 e o peróxido de hidrogénio é estável a estes pH.

Pode utilizar-se qualquer tampão capaz de manter um pH de 4 ou menos. Assim, os tampões empregando ácido acético, ácido 28 tartárico, ácido fosfórico ou ácido cítrico podem ser utilizados pela composição cosmética de clareação da pele.

Como se mostra na secção de Exemplos a seguir, o peróxido de hidrogénio da presente invenção é estabilizado a pH 3,5 com ácido fosfórico.

Os mediadores de oxidação utilizados pela presente invenção são moléculas aromáticas pequenas ou mais especificamente compostos metoxilados que aumentam o potencial oxidativo e a estabilidade da enzima modificadora de lenhina. Os mediadores de oxidação preferidos utilizados pela presente invenção são o álcool veratrílico e o veratrol.

Como demonstrado na secção de Exemplos, o álcool veratrílico incluído na composição cosmética da presente invenção é, preferencialmente, diluído em água a uma concentração de pelo menos 0,05%.

Agentes de Penetração Epidérmicos A fim de aumentar a absorção percutânea dos ingredientes activos (por exemplo, LIP) pode adicionar-se um ou mais de um número de agentes à composição cosmética incluindo, mas não se limitando a, dimetilsulfóxido, dimetilacetamida, dimetilformamida, tensioactivos, azona, álcool, acetona, propileno glicol e polietileno glicol.

Como ilustrado na secção de Exemplos que se segue, a enzima modificadora de lenhina, LIP, e o activador, peróxido de hidrogénio, são preferencialmente misturados com agentes de penetração epidérmicos, como o butilenoglicol e o transcutol, respectivamente, de uma maneira e concentração optimizadas para aumentar a penetração da LIP na pele. O butileno glicol utilizado pela presente invenção é 29 proporcionado a uma concentração de pelo menos 1% e o transcutol é proporcionado a uma concentração de pelo menos 3%.

Veículos

Além da quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente aqui descrito, a composição cosmética deste aspecto da presente invenção inclui também um veiculo dermatologicamente aceitável. A frase "veiculo dermatologicamente aceitável" refere-se a um veiculo que é adequado para aplicação tópica na pele, isto é, tecido queratinoso, tem boas propriedades estéticas, é compatível com os agentes activos da presente invenção e com quaisquer outros componentes, e é seguro e não tóxico para utilização em mamíferos. Uma quantidade eficaz do veículo é seleccionada de uma gama de cerca de 50% a cerca de 99,99%, preferencialmente de cerca de 80% a cerca de 99,9%, mais preferencialmente de cerca de 90% a cerca de 98% e muito preferencialmente de cerca de 90% a cerca de 95%, em massa, da composição.

Emulsões O veículo utilizado nas composições de acordo com a invenção pode estar numa grande variedade de formas. Estas incluem veículos de emulsão incluindo, mas não se limitando a, emulsões de óleo em água, água em óleo, água em óleo em água e óleo em água em silicone, um creme, uma pomada, uma loção ou um aerossol. Como será entendido pelo especialista, um dado componente distribuir-se-á principalmente na fase de aquosa ou de óleo/silicone, dependendo da solubilidade em água/dispersabilidade do componente na composição. 30

As emulsões de acordo com a presente invenção contêm geralmente uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente aqui descrito e um lipido ou óleo. Os lipidos e óleos podem ser provenientes de animais, vegetais ou petróleo e podem ser naturais ou sintéticos (isto é, feitos pelo homem). As emulsões preferidas também contêm um humectante, como a glicerina. As emulsões conterão ainda preferencialmente de cerca de 1% a cerca de 10 %, mais preferencialmente de cerca de 2% a cerca de 5%, de um emulsionante, com base na massa do veiculo. Os emulsionantes podem ser não iónicos, aniónicos ou catiónicos. Os emulsionantes adequados são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 3,755,560, concedida a Dickert et al. 28 de Agosto de 1973; Patente U.S. N° 4, 421, 769, concedida a Dixon, et al., 20 de Dezembro de 1983; e Mccutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition, páginas 317-324 (1986). A emulsão também pode conter um agente antiespuma para minimizar a formação de espuma durante a aplicação ao tecido queratinoso. Os agentes antiespuma incluem os silicones de elevado peso molecular e outros materiais bem conhecidos na técnica para esse fim.

As emulsões adequadas podem ter uma grande gama de viscosidades, dependendo da forma de produto desejada. As emulsões de baixa viscosidade ilustrativas, as quais são preferidas, têm uma viscosidade de cerca de 50 centistokes ou menos, mais preferencialmente de cerca de 10 centistokes ou menos, muito preferencialmente de cerca de 5 centistokes ou menos. A emulsão também pode conter um agente antiespuma para minimizar a formação de espuma durante a aplicação ao tecido queratinoso. Os agentes antiespuma incluem silicones 31 de elevado peso molecular e outros materiais bem conhecidos na técnica para esse fim.

Um tipo de emulsão é uma emulsão água em silicone. As emulsões de água em silicone contêm uma fase de silicone continua e uma fase aquosa dispersa. As emulsões de água em silicone preferidas da presente invenção compreendem de cerca de 1% a cerca de 60%, preferencialmente de cerca de 5% a cerca de 40%, mais preferencialmente de cerca de 10% a cerca de 20%, em massa de uma fase de silicone continua. A fase de silicone continua existe como uma fase externa que contém ou rodeia a fase aquosa descontinua descrita a seguir. A fase de silicone continua pode conter um óleo de tipo poliorganossiloxano. Um sistema de emulsão de água em silicone preferido é formulado para proporcionar um veiculo oxidativamente estável para administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente aqui descrito. A fase de silicone continua destas emulsões preferidas compreende entre cerca de 50% e cerca de 99,9% em massa de óleo de tipo organopolissiloxano e menos do que cerca de 50% em massa de um óleo não siliconado. Numa forma de realização especialmente preferida, a fase de silicone continua compreende pelo menos cerca de 50%, preferencialmente de cerca de 60% a cerca de 99,9%, mais preferencialmente de cerca de 70% a cerca de 99,9%, e ainda mais preferencialmente de cerca de 80% a cerca de 99,9%, do óleo de tipo poliorganossiloxano em massa da fase de silicone continua, e até cerca de 50% de óleos não siliconados, preferencialmente menos de cerca de 40%, mais preferencialmente menos do que cerca de 30%, ainda mais preferencialmente menos do que cerca de 10% e muito preferencialmente menos do que cerca de 2%, em massa da 32 fase de silicone contínua. Estes sistemas de emulsão úteis podem proporcionar mais estabilidade oxidativa ao longo de períodos de tempo prolongados do que as emulsões de água em óleo comparáveis contendo concentrações mais baixas do óleo de tipo poliorganossiloxano. As concentrações de óleos não siliconados na fase de silicone contínua são minimizadas ou mesmo evitadas de modo a aumentar possivelmente ainda mais a estabilidade oxidativa do composto activo da invenção nas composições. Emulsões de água em silicone deste tipo são descritas na Patente U.S. N° 5, 691,380 de Mason et al., publicada em 25 de Novembro de 1997. O óleo de tipo organopolissiloxano para utilização na composição pode ser volátil, não volátil ou uma mistura de silicones voláteis e não voláteis. O termo "não volátil" como utilizado neste contexto refere-se àqueles silicones que são líquidos nas condições ambientai e têm um ponto de inflamação (sob uma atmosfera de pressão) de, ou maior do que, cerca de 100 graus Celsius. O termo "volátil" como utilizado neste contexto, refere-se a todos os outros óleos de silicone. Os organopolissiloxanos adequados podem ser seleccionados de uma grande variedade de silicones que se estende por uma gama larga de volatilidades e viscosidades. Exemplos de óleos de tipo organopolissiloxano adequados incluem polialquilsiloxanos, polialquilsiloxanos cíclicos e polialquilarilsiloxanos, que são conhecidos dos especialistas na técnica e estão comercialmente disponíveis. A fase de silicone contínua pode conter um ou mais óleos não siliconados. As concentrações dos óleos não siliconados na fase de silicone contínua são preferencialmente minimizadas ou mesmo evitadas de modo a aumentar ainda mais a estabilidade oxidativa do agente farmaceuticamente eficaz 33 nas composições. Os óleos não siliconados adequados têm um ponto de fusão de cerca de 25 °C ou menos a cerca de uma atmosfera de pressão. Os exemplos de óleos não siliconados adequados para utilização na fase de silicone continua são aqueles bem conhecidos nas técnicas químicas em produtos tópicos de higiene pessoal na forma de emulsões de água em óleo, por exemplo, óleo mineral, óleos vegetais, óleos sintéticos, óleos semi-sintéticos, etc.

As composições tópicas úteis da presente invenção compreendem de cerca de 30% a cerca de 90%, mais preferencialmente de cerca de 50% a cerca de 85% e muito preferencialmente de cerca de 70% a cerca de 80% de uma fase aquosa dispersa. O termo "fase dispersa" é bem conhecido para um especialista na técnica, ele implica que a fase existe sob a forma de pequenas partículas ou gotículas que estão suspensas e envolvidas por uma fase contínua. A fase dispersa é também conhecida como a fase interna ou descontínua. A fase aquosa dispersa é uma dispersão de pequenas partículas ou gotículas aquosas suspensas e envolvidas pela fase de silicone contínua anteriormente descrita. A fase aquosa pode ser água, ou uma combinação de água e um ou mais ingredientes solúveis ou dispersáveis em água. Os exemplos não restritivos de tais ingredientes opcionais incluem os espessantes, ácidos, bases, sais, agentes quelantes, gomas, álcoois e polióis solúveis ou dispersáveis em água, tampões, conservantes, filtros solares, corantes e semelhantes.

As composições tópicas da presente invenção compreendem tipicamente de cerca de 25% a cerca de 90%, preferencialmente de cerca de 40% a cerca de 80%, mais preferencialmente de cerca de 60% a cerca de 80%, de água na fase aquosa dispersa em massa da composição. 34

As emulsões de água em silicone da presente invenção compreendem preferencialmente um emulsionante. Numa forma de realização preferida, a composição contém de cerca de 0,1% a cerca de 10% de emulsionante, mais preferencialmente de cerca de 0,5% a cerca de 7,5%, muito preferencialmente de cerca de 1% a cerca de 5%, de emulsionante em massa da composição. O emulsionante ajuda a dispersar e suspender a fase aquosa na fase de silicone continua.

Pode aqui utilizar-se uma grande variedade de emulsionantes para preparar a emulsão de água em silicone preferida. Pode utilizar-se emulsionantes conhecidos ou convencionais na composição, desde que o emulsionante seleccionado seja química e fisicamente compatível com os componentes essenciais da composição, e proporcione as características de dispersão desejadas. Os emulsionantes adequados incluem os emulsionantes de silicone, por exemplo, organopolissiloxanos modificados organicamente, também conhecidos pelos especialistas na técnica como tensioactivos de silicone, emulsionantes não contendo silicone e suas misturas, conhecidos pelos especialistas na técnica para serem utilizados em produtos tópicos de higiene pessoal.

Os emulsionantes úteis incluem uma grande variedade de emulsionantes de silicone. Estes emulsionantes de silicone são tipicamente organopolissiloxanos modificados organicamente, também conhecidos pelos especialistas na técnica como agentes tensioactivos de silicone. Os emulsionantes adequados são descritos, por exemplo, em

Mccutcheon's, Detergents and Emulsifiers, North American Edition (1986), publicado por Allured Publishing Corporation; Patente U.S. N° 5 011 681 de Ciotti et al., publicada em 30 de Abril de 1991; Patente U.S. N° 4 421 769 35 de Dixon et al., publicada em 20 de Dezembro de 1983; e Patente U.S. N° 3 755 560 de Dickert et al., publicada em 28 de Agosto de 1973.

Outros veículos tópicos preferidos incluem emulsões de óleo em água, possuindo uma fase aquosa continua e uma fase insolúvel na água, hidrófoba ("fase oleosa") dispersa naquela. Exemplos de veículos adequados que compreende emulsões de óleo em água são descritos na Patente U.S. N° 5 073 371 de Turner, D. J. et al., publicada em 17 de Dezembro de 1991 e Patente U.S. N° 5 073 372, de Turner, D. J. et al., publicada em 17 de Dezembro de 1991. Uma emulsão de óleo em água especialmente preferida, contendo um agente estruturante, um tensioactivo hidrófilo e água, é descrita em detalhe a seguir

Uma emulsão de óleo em água preferida compreende um agente estruturante para auxiliar na formação de uma estrutura de rede de gel cristalino líquido. Sem se ficar limitado pela teoria, julga-se que o agente estruturante ajuda a proporcionar características reológicas à composição que contribuem para a estabilidade da composição. O agente estruturante pode também funcionar como um emulsionante ou tensioactivo. As composições preferidas desta invenção compreendem de cerca de 0,5 % a cerca de 20 %, mais preferencialmente de cerca de 1 % a cerca de 10 %, muito preferencialmente de cerca de 1 % a cerca de 5 %, em massa da composição, de um agente estruturante. Os agentes estruturantes preferido da presente invenção são seleccionados do grupo consistindo de ácido esteárico, ácido palmítico, álcool estearílico, álcool cetílico, álcool behenílico, ácido esteárico, ácido palmítico, o éter de polietileno glicol de álcool estearílico possuindo uma média de cerca de 1 a cerca de 21 unidades de óxido de 36 etileno, o éter de polietilenoglicol de álcool cetílico possuindo uma média de cerca de 1 a cerca de 5 unidades de óxido de etileno, e suas misturas.

Uma grande variedade de agentes tensioactivos aniónicos também é aqui útil. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 3 929 678, de Laughlin et al., publicada em 30 de Dezembro de 1975. Além disso, também são aqui úteis agentes tensioactivos anfotéricos e zwitteriónicos.

As emulsões de óleo em água preferidas compreendem de cerca de 0,05% a cerca de 10%, preferencialmente de cerca de 1% a cerca de 6% e mais preferencialmente de cerca de 1% a cerca de 3% de pelo menos um tensioactivo hidrófilo que pode dispersar os materiais hidrofóbicos na fase aquosa (percentagens em massa do veiculo tópico). O tensioactivo tem de ser, no minimo, suficientemente hidrófilo para dispersar em água. Os tensioactivos adequados incluem qualquer um de uma grande variedade de tensioactivos catiónicos, aniónicos, zwitteriónicos e anfotéricos conhecidos. Ver, Mccutcheon's. Detergents and Emulsifiers, North American Edition (1986), publicado por Allured Publishing Corporation; Patente Norte Americana U.S. N° 5 011 681 de Ciotti et al., publicada em 30 de Abril de 1991; Patente U.S. N° 4 421 769 de Dixon et al. Publicada em 20 de Dezembro de 1983; e a Patente U.S. N° 3 755 560. O tensioactivo exacto escolhido depende do pH da composição e dos outros componentes presentes. São preferidos os tensioactivos catiónicos, em especial os compostos de amónio quaternário de dialquilo, dos quais são descritos exemplos na Patente U.S: N° 5 151 209 de Mccall et al., publicada em 29 de Setembro de 1992; Patente U.S. N° 5 151 210 de Steuri et al., publicada em 29 de Setembro de 1992; Patente U.S. N° 5 120 532; Patente U.S. N° 4 387 090; 37

Patente U.S. N° 3 155 591; Patente U.S. N° 3 929 678; Patente U.S. N° 3 959 461; Mccutcheon's, Detergents &

Emulsifiers (North American Edition 1979) M.C. Publishing Co.; e Schwartz, et al., Surface Active Agents, Their chemistry and Technology, New York: Interscience

Publishers, 1949.

Alternativamente, outros emulsionantes catiónicos úteis incluem as amino-amidas. Exemplos não restritivos destes emulsionantes catiónicos incluem cloreto e fosfato de estearamidopropil PG-dimónio, cloreto de behenamidopropil PG dimónio, etossulfato de estearamidopropiletildimónio, cloreto de estearamidopropildimetil(acetato de miristilo) amónio, tosilato de estearamidopropildimetilcetearilamónio, cloreto de estearamidopropildimetilamónio, lactato de estearamidopropildimetilamónio, e suas misturas. A emulsão de óleo em água preferida compreende de cerca de 25% a cerca de 98%, preferencialmente de cerca de 65% a cerca de 95%, mais preferencialmente de cerca de 70% a cerca de 90% de água, em massa do veiculo tópico.

Composições tópicas A composição cosmética pode ser formulada em qualquer uma de uma variedade de formas utilizadas pela indústria de cosméticos para aplicação na pele, incluindo loções, formulações para pulverização, cremes, pomadas, unguentos, geles, etc., como se descreve a seguir.

Preferencialmente, a composição cosmética é formulada suficientemente viscosa para permanecer sobre a área de pele tratada, para não evaporar rapidamente e/ou para não ser facilmente removida por lavagem com água, mas ser 38 removível com o auxílio de sabões, desmaquilhantes e/ou champôs.

Os métodos de preparação de composições que têm tais propriedades são bem conhecidos dos especialistas na técnica, e são descritos em detalhe em Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990 (supra); e Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed., Williams & Wilkins (1995 ) .

Veículos

As composições tópicas da presente invenção, incluindo mas não se limitando a loções e cremes, podem compreender um emoliente dermatologicamente aceitável. Tais composições contêm preferencialmente de cerca de 2% a cerca de 50% do emoliente. Como aqui utilizado, "emoliente" refere-se a um material útil para a prevenção ou alívio de secura, bem como para a protecção da pele. É conhecida uma grande variedade de emolientes apropriados que podem ser aqui utilizados. Ver, por exemplo, Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, p. 3243 (1972), que contém numerosos exemplos de materiais adequados como um emoliente. Um emoliente preferido é a glicerina. A glicerina é, preferencialmente, utilizada numa quantidade de ou de cerca de 0,001 até ou a cerca de 20%, mais preferencialmente de ou de cerca de 0,01 até ou a cerca de 10%, muito preferencialmente de ou de cerca de 0,1 até ou a cerca de 5%, por exemplo, 3%.

As loções e cremes de acordo com a presente invenção compreendem geralmente um sistema veículo em solução e um ou mais emolientes. As loções compreendem tipicamente de cerca de 1% a cerca de 20%, preferencialmente de cerca de 5% a cerca de 10% de emoliente; de cerca de 50% a cerca de 39 90%, preferencialmente de cerca de 60% a cerca de 80% de água; e uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente aqui descrito. Um creme compreende tipicamente de cerca de 5% a cerca de 50%, preferencialmente de cerca de 10% a cerca de 20% de emoliente; de cerca de 45% a cerca de 85%, preferencialmente de cerca de 50% a cerca de 75% de água; e uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente aqui descrito. A composição cosmética aplicada topicamente da presente invenção também pode incluir componentes adicionais que são adicionados, por exemplo, a fim de enriquecer as composições cosméticas com aroma e factores de nutrição da pele.

Tais componentes são seleccionados de modo adequado para serem utilizados no tecido queratinoso humano sem induzir toxicidade, incompatibilidade, instabilidade, resposta alérgica e semelhantes, no âmbito de uma avaliação médica idónea. Além disso, tais componentes opcionais são úteis desde que não alterem inaceitavelmente os benefícios dos compostos activos da invenção. O CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Segunda Edição (1992) descreve uma grande variedade de ingredientes cosméticos não restritivos, geralmente utilizados na indústria de cuidados da pele, que são adequados para serem utilizados nas composições da presente invenção. Exemplos destas classes de ingredientes incluem: abrasivos, absorventes, componentes estéticos tais como aromas, pigmentos, agentes de coloração/corantes, óleos essenciais, sensibilizadores da pele, adstringentes, etc. (por exemplo, óleo de cravo-da-índia, mentol, cânfora, óleo de eucalipto, eugenol, lactato de mentilo, destilado de hamamele), agentes 40 antiacne, agentes antiaglomerantes, agentes antiespuma, agentes antimicrobianos (por exemplo, butilcarbamato de iodopropilo), antioxidantes, aglutinantes, aditivos biológicos, agentes tamponantes, agentes de volume, quelantes, aditivos químicos, corantes, adstringentes cosméticos, biocidas cosméticos, desnaturantes, adstringentes farmacológicos, analgésicos externos, materiais filmogéneos ou formadores de películas, por exemplo, polímeros, para auxiliar nas propriedades de formação de película e na substantividade da composição (por exemplo, copolímero de eicoseno e vinilpirrolidona), agentes opacificantes, ajustadores de pH, propulsores, agentes de redução, sequestrantes, agentes de condicionamento da pele (por exemplo, humectantes, incluindo mistos e oclusivos), agentes calmantes da pele e/ou de cicatrização (por exemplo, pantenol e derivados (por exemplo, etilpantenol), aloé vera, ácido pantoténico e seus derivados, alantoína, bisabolol e glicirrizinato dipotássico), agentes de tratamento da pele, espessantes, e vitaminas e seus derivados. A composição cosmética pode ser aplicada directamente na pele. Alternativamente, pode ser administrada através de aplicação normal na pele por vários sistemas de administração transdérmica de fármacos que são conhecidos na técnica, tais como emplastros transdérmicos que libertam a composição para a pele de um modo controlado. Outros sistemas de libertação de fármacos conhecidos na técnica incluem frasco de aerossol pressurizados, iontoforese ou sonoforese. A iontoforese é utilizada para aumentar a permeabilidade da pele e facilitar a administração transdérmica. As Patentes U.S. N° 5 667 487 e 5 658 247 descrevem um equipamento ionossónico adequado para o transporte mediado por ultra-sons/iontoforeticamente de 41 agentes terapêuticos através da pele. Alternativamente, ou adicionalmente, também podem ser utilizados lipossomas ou micelas como um veiculo de administração.

Os ingredientes activos incluídos nas composições cosméticas da presente invenção são adequados para clareação da pele através da oxidação da melanina. No entanto, a reacção de oxidação pode ser controlada e parada quando desejado através da adição de reagentes de redução. Estes reagentes podem ser formulados numa composição cosmética separada e ser aplicados na pele quando desejado.

Clareação do cabelo Ingredientes activos

As composições de clareação do cabelo formuladas de acordo com os ensinamentos da presente invenção incluem o agente de oxidação e o mediador descritos acima.

Como demonstrado na secção de Exemplos adiante, a clareação do cabelo pode ser conseguida na presença de álcool veratrílico 1,5 mM e peróxido de hidrogénio 8,8 mM em tampão de tartarato a um pH de 3,5.

Emolientes

Os emolientes incluem, mas não se restringem a, óleos de hidrocarbonetos e ceras, como óleo mineral, vaselina, e semelhantes, óleos e gorduras animais e vegetais, como azeite, óleo de palma, óleo de rícino, óleo de milho, óleo de soja e semelhantes, e lanolina e seus derivados, como lanolina, óleo de lanolina, cera de lanolina, álcoois de lanolina, e semelhantes. Outros emolientes incluem ésteres de ácidos gordos possuindo 10 a 20 átomos de carbono, tais como incluindo mirístico, esteárico, isoesteárico, palmítico e semelhantes, como miristato de metilo, 42 miristato de propilo, miristato de butilo, estearato de propilo, isoestearato de propilo, palmitato de propilo e semelhantes. Outros emolientes incluem ácidos gordos possuindo 10 a 20 átomos de carbono, incluindo esteárico, miristico, láurico, isoesteárico, palmitico e semelhantes. Os emolientes também incluem álcoois gordos possuindo dez a vinte átomos de carbono, como cetilico, miristilico, laurilico, isoestearilico, estearilico e semelhantes.

Embora alguns sejam solúveis em água, os álcoois poli-hidricos e derivados de poliéter estão incluídos como emolientes, incluindo glicóis, glicerol, sorbitol, polialquileno glicóis e semelhantes, como propileno glicol, dipropileno glicol, polietileno glicol 200-500, e semelhantes. São preferidos os exemplos solúveis em água.

Tensioactivos

Também é preferencialmente utilizado um emulsionante/tensioactivo na composição de clareação de cabelo da presente invenção.

Os exemplos de tensioactivos incluem, mas não se limitam a, produtos de condensação de óxido de polioxialquileno de grupos funcionais alquilo, alceno ou alquil-aromáticos hidrofóbicos, tendo um hidrogénio reactivos livre disponível para condensação com o óxido de alquileno hidrófilo, óxido de polietileno, óxido de propileno, óxido de butileno, óxido de polietileno ou polietileno glicol. São particularmente eficazes os produtos de condensação de octilfenol com cerca de 7 a cerca de 13 moles de óxido de etileno, vendido pela Rohm & Haas Company sob a sua série de produtos com a marca registada TRITON 100®. 43

Na composição de clareação do cabelo da presente invenção também são incluídos outros ingredientes, tais como, aromas, agentes estabilizantes, corantes, agentes antimicrobianos, agentes antibacterianos, antiaglomerantes, agentes de absorção de radiação ultravioleta e semelhantes.

Condicionadores

Também é preferencialmente utilizado um agente condicionador estável a hidrólise ácida, como um composto de silicone possuindo pelo menos uma unidade de amónio quaternário em conjunto com um monoquat etoxilado, de modo a estabilizar e opcionalmente espessar composição de clareação do cabelo da presente invenção.

Também se pode incluir um espessante opcional para melhorar a estética da composição e facilitar a aplicação da composição ao cabelo. São preferidos os espessantes não iónicos numa quantidade de 0% a cerca de 3% em massa. São exemplos de espessantes a metilcelulose, hidroxibutilmetilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietiletilcelulose e hidroxietilcelulose, amida do ácido di(sebo hidrogenado)ftálico, copolímero reticulado de anidrido maleico-éter metílico e vinílico, goma de guar, goma de xantano e goma-arábica. O veículo da composição de condicionamento é predominantemente água, mas também podem ser incluídos solventes orgânicos para facilitar o fabrico da composição ou para proporcionar propriedades estéticas, como o controlo da viscosidade. Os solventes adequados incluem os álcoois inferiores como o álcool etílico e o álcool isopropílico; éteres de glicol, como o 2-butoxietanol, éter monoetílico de etileno glicol, propileno glicol e éter 44 monoetílico ou éter de monometílico de dietileno glicol; e suas misturas. Os solventes não aquosos podem estar presentes na composição de condicionamento da presente invenção numa quantidade de cerca de 1% a cerca de 50%, e em particular de cerca de 5% a cerca de 25%, em massa da massa total do veiculo na composição.

Agentes de condicionamento não restritivos que podem ser utilizados em condicionadores opacos incluem: cloreto de esteariltrimetilamónio; cloreto de behenotrimetilamónio; brometo de cetrimónio; cloreto de (soja)trimónio; cloreto de (sebo)trimónio; cloreto de (di-sebo hidrogenado)dimetilamónio, metossulfato de behenotrimetilamónio; cloreto de Peg-2 oleamónio; brometo de (di-sebo hidrogenado)dimetilamónio; metossulfato de (di-sebo hidrogenado)dimetilamónio; cloreto de palmitiltrimetilamónio; cloreto de (sebo hidrogenado)trimetilamónio; brometo de (sebo hidrogenado)trimetilamónio; cloreto de dicetildimetilamónio; cloreto de diestearildimetilamónio; cloreto de dipalmitildimetilamónio; metossulfato de (sebo hidrogenado)trimetilamónio; tosilato de cetil-trimetilamónio: cloreto de eicosiltrimetilamónio e cloreto de (di sebo)dimetilamónio.

Os materiais que podem ser utilizados para tornar as composições da invenção opacas incluem ésteres gordos, polímeros opacificantes, como polímeros de estireno, como OPACIFIER 653 de Morton, International, Inc.; e álcoois gordos. O que se segue é uma lista não restritiva de álcoois gordos: álcool cetílico; álcool estearílico; álcool de cetearílico; álcool behenílico; e álcool araquidílico. As composições condicionadoras da invenção que não são 45 transparentes também podem incluir Lexamine S-13, cloreto de dicetilamónio e ceteareto-20.

Se desejado, as composições da presente invenção podem ser apresentadas num dispositivo distribuidor ou num estojo, juntamente com instruções apropriadas para utilização e etiquetas indicando a aprovação pela FDA para uso na clareação da pele ou do cabelo. 0 estojo para clarear uma região da pele ou o cabelo pode incluir, por exemplo, um recipiente incluindo uma enzima modificadora de lenhina proporcionada com tampões, veículos, agentes de penetração, etc, adequados e recipientes adicionais que incluem o agente de oxidação e o mediador acima descritos.

As enzimas modificadoras de lenhina também podem ser introduzidas em células da região da pele utilizando abordagens da biologia molecular que são conhecidos na técnica.

Assim, de acordo com ainda outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método não terapêutico de clareação de uma região da pele de um indivíduo. 0 método de acordo com este aspecto da presente invenção é efectuado através da expressão, nas células da região da pele, de uma enzima modificadora de lenhina de um modo adequado para oxidar um pigmento contido dentro das células da região da pele.

Tal expressão pode ser efectuada transformando as células da pele com um vector de expressão que inclui uma sequência de codificação da enzima modificadora de lenhina funcionalmente ligada a uma sequência promotora. 4 6

Para gerar um tal vector de expressão, um segmento polinucleotídico que codifica uma enzima modificadora de lenhina (a isoforma Hl de LIP, SEQ ID NO: 1), pode ser ligado a um sistema vectorial de expressão comercialmente disponível adequado para transformar células de mamifero e para dirigir a expressão da enzima modificadora de lenhina dentro das células transformadas. Entender-se-á que tais sistemas vectoriais comercialmente disponíveis podem ser facilmente modificados por meio de técnicas recombinantes vulgarmente utilizadas a fim de substituir, duplicar ou mutar as sequências promotoras ou potenciadoras existentes e/ou introduzir quaisquer sequências polinucleotidicas adicionais como, por exemplo, sequências que codificam marcadores de selecção adicionais ou sequências que codificam polipéptidos repórter.

Os vectores de expressão em mamifero adequados para serem utilizados com a presente invenção incluem, mas não se restringem a, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, os quais estão disponíveis de invitrogen, pCl que está disponível de Promega, pBK-RSV e pBK-CMV que estão disponíveis de Stratagene, pTRES que está disponível de Clontech, e os seus derivados.

Um vector de expressão adequado para ser utilizado com este aspecto da presente invenção é um vector com base em adenovírus. Os vectores de adenovírus têm sido muito utilizados para aplicações farmacêuticas incluindo terapia de genes cutânea (Ghazizadeh S, Taichman LB. (2000) Hum Gene Ther 11: 2247-51; Cárter PJ, Samulski RJ. (2000). Int J Mol Med 6: 17-27). 47 0 vector de expressão descrito acima pode ser introduzido nas células utilizando uma variedade de abordagens de administração incluindo, mas não se limitando a, lipossomas, emplastros epidérmicos, iontoforese ou endocitose mediada por receptor.

Na última abordagem, um anticorpo ou ligando para um receptor da superfície celular que se sabe que sofre endocitose é complexado com uma sequência de ADN que codifica a enzima modificadora de lenhina através de um adjuvante policatiónico ligado covalentemente (por exemplo, polilisina, protaminas). Tais complexos retêm a sua especificidade de ligação à superfície da célula e são transferidos para dentro da célula, onde entram no compartimento endossomal através de processos de endocitose normal. Além disso, devem ser tomados passos para evitar a degradação do ADN dentro do endossoma-lisossoma. As células podem ser tratadas com o agente lisossomatrópico cloroquina durante o procedimento de transfecção. Alternativamente, podem ser utilizados componentes de vírus que penetram nas células por endocitose e possuem um capacidade de "evasão" endossomal. Adenovírus de replicação defeituosa acoplados ao complexo ligando-ADN origina eficiências de transfecção de praticamente 100% em células de cultura de tecidos in vitro. Estudos preliminares demonstraram o potencial deste método para direccionar especificamente ADN para o tipo de célula escolhida in vivo (Guy J, Drabek D, Antoniou M. (1995). Mol Biotechnol 1995 3: 237-48).

Após expressão dentro de células alvo, o aceitador de electrões e o mediador descritos são, preferencialmente, aplicados na região tratada de modo a facilitar a clareação. 48 A expressão da enzima modificadora de lenhina no interior de células alvo é particularmente vantajosa uma vez que obvia a necessidade de administração intracelular da própria enzima, aumentando deste modo potencialmente a eficácia da clareação.

Objectos adicionais, vantagens e novas caracteristicas da presente invenção tornar-se-ão evidentes para um técnico médio na matéria após o exame dos exemplos seguintes, que não pretendem ser restritivos. Além disso, cada uma das várias formas de realização e aspectos da presente invenção como delineada acima e como reivindicada na secção de reivindicações abaixo encontra suporte experimental nos exemplos que se seguem.

EXEMPLOS É agora feita referência aos exemplos seguintes, os quais em conjunto com as descrições acima ilustram a invenção de um modo não restritivo.

Em geral, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de ADN recombinante. Tais técnicas são profusamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory 49

Press, New York (1998); as metodologias como descritas nas Patentes U.S. N° 4 666 828; 4 683 202; 4 801 531; 5 192 659 e 5 272 057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinicai Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); os imunoensaios disponíveis são abundantemente descritos na literatura de patentes e científica, ver, por examplo, Patentes U.S. N° 3 791 932; 3 839 153; 3 850 752; 3 850 578; 3 853 987; 3 867 517; 3 879 262; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; 4 098 876; 4 879 219; 5 011 771 e 5 281 521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Ao longo deste documento são proporcionadas outras referências gerais. Os procedimentos aqui são considerados como sendo bem conhecidos na técnica e são proporcionados para conveniência do leitor.

ANTECEDENTES

Lenhina-peroxidases no fungo P. chrysisporium

Existem mais do que 12 proteínas de tipo heme que apresentam actividade lenhinolítica no fluido extracelular 50 de culturas P. chrysosporium bkm-f-1767. Estas podem ser classificadas em dois tipos de peroxidases heme glicosiladas, as lenhina-peroxidase (LIP) e as peroxidase de manganês (MNP) . As isoenzimas Hl, H2, H6, H7, H8 e H10 têm sido descritas como sendo LIP e as H3, H4, H5 e H9 têm sido identificados como MNP (Farrell et ai., 1989). As isoenzimas LIP de P. chrysosporium são codificadas por uma familia de genes estruturalmente relacionados e são diferentes nas suas caracteristicas físicas, especificidade para o substrato e estabilidade (Farrell et ai., 1989; Stewart et ai., 1992). Como parte do processo que conduz à sua secreção, as isoenzimas LIP são dissociadas proteoliticamente e glicosiladas (Ghose, 1987; Ritch et al., 1991; Tien and Kirk, 1984). Além disso, tem sido relatado que as isoenzimas LIP H2, Ηβ, H8 e H10 estão fosforiladas numa unidade de manose 6-fosfato, contida num oligossacárido ligado a asparigina. A análise de fluido extracelular envelhecido conduziu à sugestão de que a isoenzima Hl é provavelmente derivada da desfosforilação pós-tradução da H2 (Kuan and Tien, 1989) . A expressão das enzimas lenhinolíticas pelo P. chrysosporium é um evento idiofásico desencadeado por uma restrição de azoto ou carbono e é extremamente dependente das condições de cultura e composição de meio (Dosoretz and Grethlein, 1991; Faison and Kirk, 1985; Stewart et al., 1992; van der Woude et al., 1993). A formação de LIP é particularmente dependente da exposição das culturas a tensões elevadas de oxigénio (Dosoretz et al., 1990; Faison and Kirk, 1985). Foi proposto que a transferência de oxigénio para culturas estacionárias está restringida e, consequentemente, é necessária uma pressão parcial elevada de oxigénio no espaço de cabeça da cultura para fazer com que haja oxigénio suficiente disponível para as hifas 51 submersas (Leisola et al., 1983; Michel et al., 1992). Observou-se a formação de LIP numa cultura que estava exposta ao ar imobilizando o fungo num suporte poroso em uma cultura liquida não submersa, que melhorou a disponibilidade de oxigénio para o fungo (Dosoretz et al., 1990; Popp et al., 1990). A concentração de Mn2+ no meio afecta de modo adverso a formação do LIP e MNP. Enquanto a formação de MNP é dependente de Mn, o qual aumenta a transcrição de MNP, a formação de LIP é inibida por Mn. Rothschild et al., (1999) mostraram que tanto em culturas de P. chrysosporium restringidas de azoto como com excesso de azoto, o nivel elevado de oxigénio necessário para a formação de LIP podia ser substituído pela deficiência em Mn. MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS Cultura do fungo Phanerochaete chrysosporium para a produção de lenhina-peroxidase - O fungo Phanerochaete chrysosporium BKMF-1767 (ATCC 24725) foi mantido a 4 °C em culturas-mãe inclinadas em agar de extracto de malte a 2% (Difco, Detroit, MI, EUA).

Preparação da suspensão de esporos - Esporos do fungo foram obtidos inoculando tampões da cultura-mãe inclinada em placas de Petri contendo Agar de Dextrose de Batata (PDA) tratado em autoclave, a uma concentração de 39 g/litro. As placas de PDA foram então incubadas durante até 2 semanas a 37 °C. Para a preparação da suspensão de esporos, as placas de PDA foram cobertas com 0,9% de Nacl, a suspensão de conídios foi filtrada através de lã de vidro estéril e a suspensão de esporos recolhida. A suspensão de esporos foi então mantida congelada a -80 °C. 52

Preparação de inóculo - Inoculou-se esporos num meio de inoculo esterilizado (ver formulação a seguir) a uma concentração final de 7,5 x 105 esporos/mL. Adicionou-se noventa mL da mistura a cada caldo de fermentação (Tien and Kirk, 1988. Meth. Enzymol. 161: 238-490; Dosoretz et al., 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 131-7), e os lotes foram então seladas com rolhas de algodão. As culturas foram postas a crescer de modo estático durante 48 h a 37 °C como culturas pouco profundas. Para a inoculação de culturas, o conteúdo do caldo de fermentação foi misturado durante 2 minutos com um misturador (Waring, Inglaterra).

Cultura do fungo em fermentador com reactor de tanque agitado (STR) - Antes de cultivar o fungo, colocou-se espuma de poliuretano em torno dos tubos de refrigeração do fermentador e todo o fermentador de STR foi esterilizado. Em seguida verteu-se dez litros de um meio de fermentação (ver formulação a seguir) para dentro do fermentador de STR e adicionou-se 900 mL de inóculo misturado (o conteúdo de 10 lotes de fermentação). O fermentador foi ligado a um sistema de arrefecimento para manter uma temperatura de 37 °C e foi agitado a 100 rpm. Introduziu-se ar esterilizado no fermentador a 2 mL/min. O caudal foi mudado para 4 mL/min após 2 dias de cultura. A cultura foi prosseguida durante 3-5 dias. O meio de inóculo foi preparado misturando as seguintes soluções e esterilizado com um filtro de membrana de 0,45 pm (MSI, Westborough, MA, EUA). Para a preparação de 1 litro de meio liquido, combinou-se os seguintes componentes: 100 mL de Meio Básico para cultura de P. chrysosporium x 10 (ver formulação a seguir) 53 10 mL de solução-mãe de CaCl2 (13,2 g/L) (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO, EUA). Concentração final de 0,132 g/L 12 mL de solução-mãe de glicerol (50 g/100-mL) (Frutarom, Israel). Concentração final de 6 g/L.

Adiciona-se água bidestilada até 1 litro. O meio de fermentação foi preparado do seguinte modo e foi esterilizado com um filtro de membrana de 0,45 pm (MSI, Westborough, MA, EUA). Para a preparação de 10 litros de meio liquido, combinou-se os seguintes componentes:

100 mL de solução-mãe de CaCl2 (13,2 g/L) (Sigma, EUA). Concentração final de 0,0132 g/L 120 mL de solução-mãe de glicerol (50 g/100-mL) (Frutarom, Israel). Concentração final de 6 g/L.

50 mL de solução-mãe de Tween-80 (10,8 mL/100 mL) (Sigma, EUA). Concentração final de 0,54 mL/L 1000 mL de meio básico para cultura de P. chrysosporium x 10 (ver formulação a seguir) 3,36 g de álcool veratrílico (Sigma, EUA). Concentração final de 2 mM. 7,740 litros de água bidestilada (DDW) para um volume final de 10 litros.

Meio básico para cultura de P. chrysosporium x 10 - O meio básico para a cultura de P. chrysosporium x 10 foi preparado como se segue: dissolveu-se 7,07 g de ácido nitrilotriacético (sal trissódico) em 4 litros de DDW. Adicionou-se então os seguintes reagentes: 100 g de KH2P04 anidro, 72,7 g de MgS04'7H20 (ou 67,39 g de MgS04-6H20), 3,5 g de NaCl, 0,35 g de FeSC>4-7H20, 0, 63 g de CoCl2-6H20, 0,35 g de ZnS04-7H20, 0, 055 g de CuS04-5H20, 0, 035 g A1K(S04)2· 12h20, 0, 035 g de H3B03, 0, 035 g de Na2Mo04·2h20, 500 mL de tampão de acetato 2M, pH 4,5, 10 g de tartarato 54 de amónio e 50 mg de Tiamina. Todos fornecido por Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO, EUA. O pH do meio foi ajustado a 4,4-4,45 com NaOH e foi adicionada DDW até um volume final de 5 litros. O meio foi conservado a 4 °C.

Isolamento e purificação de LIP do meio extracelular de Phanerochaete chrysosporium - O meio extracelular foi filtrado a vácuo através de uma fibra de vidro. O filtrado foi então esterilizado com um filtro de membrana 0,45 pm (MSI, Westborough, MA, EUA) e o fluido foi concentrado através de uma membrana de fibra oca utilizando uma bomba peristáltica (MASTERFLEX, Vernon Hills, IL, EUA). O fluido extracelular concentrado foi depois reconcentrado 25 vezes por ultrafiltração utilizando uma membrana PM-10 de tipo corte de 10 kDa (Amicon, Danvers, MA) e purificado com uma coluna Monop Q (HR5/5, Pharmacia, Piscataway, NJ) por cromatografia de HPLC de troca aniónica utilizando dois gradientes de 0,01-1,00 M de acetato de sódio. O primeiro gradiente foi a pH 6,0 e o segundo gradiente foi a pH 4,7, o qual é equivalente ao valor do ponto isoeléctrico (pi) da isoenzima Hl da LIP. Os picos da proteína foram recolhidos e a sua actividade foi avaliada utilizando isoenzima Hl de LIP purificada de um lote anterior como padrão. A absorvância da fracção de LIP Hl foi medida a 280 nm e 409 nm (Hewlett Packard, Waldbronn, Alemanha). O grau de pureza (RZ), calculado a partir da razão entre a absorvância a 409 nm (A40g) e a absorvância a 280 nm (A2eo) da isoenzima Hl da lip purificada, foi superior a 4,0. A concentração de lip foi determinada a 409 nm, utilizando um coeficiente de extinção de 169M_1cm_1.

Doseamento da actividade da LIP - A actividade da LIP foi medida pela alteração da absorvância a 310 durante a oxidação do álcool veratrilico em aldeído veratrilico como 55 descrita por Tien e Kirk (1988). 0 reagente de ensaio é constituído por álcool veratrílico 4 mM e H202 0, 88 mM em tampão de tartarato 100 mM a pH 2,5. Para o doseamento, 0,5 mL de meio extracelular de P. chrysosporium foram misturados com 0,5 mL do reagente e foi registado o aumento de absorvância a 310 nm durante 40 s. Uma unidade de LIP é definida como 1 pmole de álcool veratrílico oxidada em aldeído veratrílico por minuto.

Determinação da oxidação da melanina pela LIP - Preparou-se melanina sintética (Sigma, Cat # M8631, St Louis MO, EUA) a várias concentrações em tampão de Tris 50 mM, a pH 8,00. A oxidação da melanina pela LIP foi realizada em tampão de tartarato a pH 3,5 contendo álcool veratrílico e a reacção enzimática foi iniciada pela adição de peróxido de hidrogénio. O grau de oxidação da melanina foi determinado medindo a diminuição da absorvância a 460 nm.

Preparação do creme - O creme de lip nas formas de realização preferidas é constituído por dois tipos de cremes: o creme da enzima e o creme activador. Cada creme foi preparado de duas fases, isto é, a fase aquosa e a fase oleosa.

Creme da enzima

Fase aquosa para o creme da enzima: 0,35% (m/m) de hidantoína DMDM (Sharon Lab, Israel); 2 % (m/m) de glicerina (Cognis, Alemanha); 0,1% (m/m) de álcool veratrílico (álcool 3-dimetoxibenzílico, Sigma, EUA); 81,65% (m/m) de DDW (RO Water, Israel); 0,2% (m/m) de Rhodicare D (goma de xantana, Rhodia,

França); 56 4 % (m/m) de transcutol (PEG-400, etoxidiglicol,

Gattefosse, França);

Fase oleosa para o creme da enzima: 5 % de óleo mineral leve; 2,5% (m/m) de dragorin 100 SEP (estearato de GMS & PEG-100, Dragoco, Alemanha); 3 % (m/m) de álcool cetílico (Cognis, Alemanha); 0,2% (m/m) de Sorbato de potássio (Chisso Corp., Japão); 1% (m/m) de Brij 721 (Uniqema, Itália).

Preparação do creme da enzima: As fases aquosa e oleosa do creme da enzima foram aquecidas até 80 °C e depois misturadas. A mistura foi homogeneizada durante 10 min e arrefecida até 55 °C. Em seguida, o pH foi ajustado até 3,5 com ácido láctico.

Quando a mistura arrefeceu até 40 °C, adicionou-se lenhina-peroxidase (20-50 Unidades/g). A mistura enzimática foi homogeneizada durante 1 min.

Creme Activador

Fase aquosa para o creme activador: 82,888 (m/m) de DDW (RO Water, Israel); 0,1% (m/m) de EDTA dissódico (Merck, Alemanha); 4 % (m/m) de transcutol (PEG-400, etoxidiglicol,

Gattefosse, França); 0,1% (m/m) de Sorbato de potássio (Chisso Corp., Japão):

Fase oleosa para o creme activador: 3,5% (m/m) de Brij 72 (Steareth-2, Uniqema, Itália); 2,5% (m/m) de Brij 721 (Steareth-20, Uniqema, Itália); 5 % (m/m) de óleo mineral; 1,3% (m/m) de álcool cetílico (Cognis, Alemanha); 57 0,5% (m/m) de silicone 350 (Dimethicon, Dow Corning, EUA); 0,1% (m/m) de Sorbato de potássio (Chisso Corp., Japão).

Preparação do creme activador - As fases aquosa e oleosa do creme de activador foram aquecidas a 80 °C e misturadas. A mistura foi homogeneizada durante 10 min, arrefecida até 45 °C e ajustada a pH 3,5 com ácido fosfórico.

Quando a mistura tinha arrefecido a 40 °C foi adicionado peróxido de hidrogénio (Riedel-de Haen, Alemanha) (0,012% (m/m)) sob agitação suave, foi verificada a correcção do pH e a mistura activadora foi homogeneizada durante 1 min.

Determinação do efeito de clareação da pele in vivo - A fim de quantificar o efeito da LIP na clareação da pele, a cor da pele da mão tratada foi analisada utilizando três comprimentos de onda do cromâmetro Minolta (CR-200 Japão): o Minolta L mede os tons de preto e o brilho, o Minolta A mede tons de vermelho e o Minolta B mede tons de amarelo. O aumento nos valores de Minolta L reflecte o grau de brilho da pele, isto é, valores mais elevados correspondem a uma pele mais brilhante. RESULTADOS EXPERIMENTAIS EXEMPLO 1 PURIFICAÇÃO DE LIP A PARTIR DE P. CHRYSOSPORIUM Preparação de LIP Hl extremamente purificada de P. Chrysosporium - A fim de purificar a isoenzima Hl de LIP a partir de P. chrysosporium o fungo foi cultivado num fermentador de STR (Figura 2) como descrito em detalhe na Secção de Métodos acima. A actividade inicial de LIP foi detectada após 48 h de cultura e os aumentos significativos na actividade foram detectados quando a cultura foi mantida até 120 h (Figura 3) . Para purificação da isoenzima Hl de 58 lip, o fluido extracelular do fungo foi recolhido no pico da actividade de LIP (120 h) . A proteína isoenzima Hl de LIP foi então purificada e a sua concentração foi determinada como descrito em Métodos. Assim, utilizando o equipamento e as condições mencionados acima, a LIP pode ser produzida com confiança e a sua isoenzima Hl pode ser purificada por HPLC. EXEMPLO 2

OPTIMIZAÇÃO DA MELAMINA NUMA OXIDAÇÃO EM FASE AQUOSA UTILIZANDO LIP PURIFICADA A fim de optimizar as condições necessárias para a oxidação da melanina pela LIP, determinou-se independentemente a concentração óptima de cada um dos componentes críticos da reacção de oxidação.

Oxidação da melanina pela LIP numa fase aquosa é uma função da concentração de peróxido de hidrogénio - A oxidação da melanina pela LIP numa fase aquosa foi inicialmente testada quanto à correlação com as concentrações de peróxido de hidrogénio. Uma concentração constante de melanina (70,5 g/mL) foi oxidada por 0,48 μΜ de LIP Hl purificada na presença de álcool veratrílico 1,5 mM e com concentrações crescentes de peróxido de hidrogénio. 0 grau de oxidação foi determinado medindo a absorvância da melanina a 460 nm, antes da adição de peróxido de hidrogénio e 160 s após a mesma, e calculado em percentagens. Em termos gerais, a oxidação da melanina aumentou com concentrações crescentes de peróxido de hidrogénio até um patamar que foi obtido a 700-900 μΜ de peróxido de hidrogénio (Figuras 4) . O efeito do peróxido na concentração de melanina é ainda demonstrado por comparação das misturas reaccionais na Figura 5, em que a mistura reaccional é significativamente clareada com o aumento das concentrações de peróxido de hidrogénio. Assim, 59 estes resultados demonstram que a oxidação da melanina pela LIP em fase aquosa é claramente dependente das concentrações de peróxido de hidrogénio, estando as concentrações óptimas de peróxido de hidrogénio para a oxidação da melanina na gama 600 μΜ a 700 μΜ. A oxidação da melanina pela LIP é uma função da concentração inicial de melanina numa fase aquosa - A fim de determinar a concentração óptima de melanina necessária para a oxidação da melanina em fase aquosa pela LIP, a reacção de oxidação foi ainda testada com concentrações crescentes de melanina. A oxidação da melanina foi realizada por 0,48 μΜ de LIP Hl purificada na presença de álcool veratrilico 1,5 mM e peróxido de hidrogénio 600 μΜ. A concentrações iniciais de melanina entre 15 a 45 pg/mL, a oxidação de melanina pela LIP foi dependente das concentrações iniciais de melanina. A oxidação máxima de melanina (60%) foi atingida a concentrações iniciais de melanina entre 45 e 85 pg/mL (Figura 6) . Assim, a oxidação de melanina pela LIP é claramente independente das concentrações iniciais de melanina, para lá dos 45 pg/mL. A oxidação de melanina pela LIP é parcialmente dependente da concentração de LIP numa fase aquosa - A fim de optimizar ainda mais as condições para a oxidação da melanina, testou-se o efeito da concentração de LIP na oxidação da melanina com concentrações óptimas de melanina (70 pg/mL), peróxido de hidrogénio (70 μΜ) e álcool veratrilico (1,5 mM). A oxidação da melanina foi drasticamente aumentada de 10 para 60%, quando a concentração de LIP foi aumentada de 0,25 μΜ para 0,40 μΜ. No entanto, acima da concentração de LIP de 0,50 μΜ não se observou qualquer alteração na oxidação da melanina (Figura 60 7) . Assim, a gama óptima de concentrações de lip para oxidação da melanina in vitro é 0,40-0,50 μΜ. EXEMPLO 3

OXIDAÇÃO DE MELANINA UTILIZANDO LIP NUMA FORMULAÇÃO EM

CREME A fim de fundamentar ainda mais a capacidade da isoenzima Hl da LIP para oxidar a melanina e como um passo intermédio para clareação da pele in vivo, a actividade da LIP foi testada numa formulação de creme sobre melanina solubilizada numa fase aquosa. A melanina numa fase aquosa é oxidada pela LIP numa formulação em creme - Foram preparados dois tipos de creme: o creme da enzima compreendendo a fracção da isoenzima Hl da LIP (25 unidades/g de creme) e álcool veratrilico (6 mmole/kg de creme), e o creme activador compreendendo peróxido de hidrogénio (3,52 mmole/kg de creme). Para a determinação da actividade da LIP numa formulação em creme o creme da enzima (0,3 g) foi inicialmente misturado com melanina (140 pg/mL) e foi observada uma cor preto acinzentada (Figura 8a). Quando o creme activador (0,3 g) foi adicionado ao creme da enzima já contendo melanina, a cor foi imediatamente alterada para bege (Figura 8b). Estes resultados demonstram que a LIP numa formulação em creme é altamente eficaz na descoloração da melanina e pode ser adicionalmente testada em pele humana. EXEMPLO 4

CLAREAÇÃO DA PELE E DO CABELO IN VIVO POR LIP Hl PURIFICADA

NUMA FORMULAÇÃO EM CREME A fim de testar a capacidade da LIP para clarear a pele e o cabelo in vivo, a enzima num creme e em formulações aquosas foi adicionada a pele e cabelo, respectivamente. 61

A LIP numa formulação em creme clareia a pele in vivo - A fim de testar a capacidade da LIP numa formulação em creme para clarear a pele in vivo, o creme da enzima foi aplicado e absorvido pela pele e, em seguida, o creme activador foi aplicado quatro vezes em intervalos de 5 min. Quando repetido duas vezes por dia durante uma semana, observou-se uma clareação significativa das áreas de pele tratadas (Figura 9). Quando foi quantificada a cor da pele de duas áreas da mão tratada utilizando um cromâmetro Minolta, observou-se um efeito claro de clareação da pele da aplicação durante duas semanas do creme de LIP (Quadro 1, % de alteração). Assim, estes resultados demonstram que a lip preparada numa formulação em creme fácil de aplicar pode clarear a pele in vivo de forma simples e eficaz, e que a LIP preparada como aqui descrito pode ser ainda adaptada para outras aplicações de clareação in vivo. QUADRO 1

QUANTIFICAÇÃO DA CLAREAÇÃO DA PELE IN VIVO

Minolta L (brilho) Minolta A (vermelho) Minolta B (amarelo) Área I Base 44,8 10,5 16,34 Área I 2 semanas 48,8 10,6 17,93 Área I % alteração 8,9 — 9,7 Área II Base 49, 91 10,38 19,28 Área II 2 semanas 53,8 9, 39 20,63 Área II % alteração 7, 79 — 7,0

Quadro 1 ilustra três conjuntos de leituras em números absolutos tirados do cromâmetro Minolta de duas áreas da mão tratada. A Área I corresponde à área circundada na Figura 9, a Área II corresponde a dados não mostrados. A LIP numa formulação aquosa clareia o cabelo in vivo - É frequentemente necessária uma clareação da pigmentação em tecidos ricos em melanina diferentes da pele. A fim de testar adicionalmente os seus efeitos de clareação in vivo, 62 a LIP foi aplicada em cabelo humano. Antes da aplicação da LIP, o cabelo foi primeiro imerso durante 1 h em tampão carbonato 50 mM a pH 11,5 e depois transferido para outro tubo contendo LIP (25 U/20 pL de água). O cabelo foi incubado com a LIP durante 10 segundos e depois transferido para tampão de tartarato a pH 3,5 na presença de álcool veratrilico (1,5 mM) e peróxido de hidrogénio (8,8 mM) . Observou-se um efeito de clareação significativo em menos de 1 h na presença de LIP (Figura 10, tubo da direita) em comparação com o cabelo tratado na mesma solução mas sem LIP (Figura 10, tudo da esquerda). Assim, estes resultados demonstram que, na presença de concentrações muito baixas de peróxido de hidrogénio, a LIP numa formulação aquosa pode clarear eficazmente o cabelo in vivo. EXEMPLO 5

AUMENTO DE ESCALA DO PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA LIP A fim de produzir grandes quantidades de lenhina-peroxidase (LIP) úteis para fins comerciais, a LIP foi purificada do fungo P. chrysosporium utilizando um protocolo em maior escala.

Actividade elevada de LIP obtida utilizando um protocolo de fermentação em maior escala - A fermentação foi realizada num fermentador de 100 L utilizando 90 L de meio de fermentação como descrito na Secção de Métodos acima. As condições de fermentação incluiram agitação de 160 rpm e um caudal de ar de 0,2 vvm. A inoculação foi realizada da mesma forma como no fermentador de 10 L, a qual foi descrita na Secção de Métodos acima. Após 7 dias de cultura, a actividade LIP medida foi de 1600 unidades/litro. 63

Estes resultados demonstram que podem ser produzidas grandes quantidades e actividades catalíticas elevadas de LIP a partir do fungo P. chrysosporium utilizando fermentadores grandes e o protocolo de grande escala da presente invenção. EXEMPLO 6

TESTES DERMATOLÓGICOS PARA O CREME DE LIP: TESTES HIPOALERGÉNICO, EM PELE SENSÍVEL, E DE SENSIBILIZAÇÃO E

PROVA EM PELE NORMAL A fim de caracterizar as propriedades dermatológicas do creme de LIP e como um pré-requisito para utilização como um produto cosmético, o creme de LIP foi submetido a vários testes dermatológicos: um teste hipoalergénico, um teste de sensibilização e prova em pele normal, e um teste de sensibilização e prova em pele sensível. Métodos

Indivíduos de ensaio para os testes dermatológicos em pele normal: 0 estudo incluiu 50 voluntários, 9 machos e 41 fêmeas, numa gama de idades entre os 18 e os 64 anos. Os voluntários estavam em bom estado de saúde geral e livre de qualquer doença de pele visível ou anomalia na área de aplicação do emplastro. A cada Indivíduo de estudo foi requerido que lessem, compreendessem e assinassem uma declaração de consentimento informado. Os critérios de exclusão foram os seguintes: mulheres grávidas ou em aleitação, indivíduos que sofrem de doenças graves ou progressivas e/ou de patologia na zona tratada, indivíduos submetidos a um tratamento (por exemplo, retinóides, esteróides) e/ou modificadores da hidratação cutânea, indivíduos com peso instável ou utilização excessiva de álcool ou tabaco.

No Quadro 2 é apresentado um resumo das características dos Indivíduos de estudo mais abaixo.

Quadro 2

AS CARACTERÍSTICAS DOS INDIVÍDUOS DE ESTUDO Género Idade média (anos) Passado médico capaz de influenciar o estudo F 40,36 Nenhum M 34, 33 Nenhum

Indivíduos de estudo para o ensaio dermatológico em peles sensíveis - Um total de 50 indivíduos, 6 machos e 44 fêmeas, completaram o ensaio: 22 indivíduos estavam na gama de 18 a 35, 11 indivíduos na gama de 36 a 45, e 17 indivíduos na gama de 46 a 65.

Tratamento associado durante o estudo - Não foi aplicada água ao local de teste durante a aplicação do emplastro; não foi permitido qualquer tratamento sistémico ou tópico que pudesse modificar a pele; não foi permitida a utilização de quaisquer produtos dermofarmacêuticos ou cosméticos, incluindo produtos de limpeza, nas zonas a serem avaliadas.

Preparação do emplastro - Para o teste hipoalergénico, colocou-se 2 mg do creme de LIP da presente invenção numa tira adesiva Curatest® F (Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG, Rengsdort) . Para os testes dermatológicos e testes em pele sensível cada emplastro incluía 0,07-0,1 grama do creme de LIP na tira adesiva Curatest® F. O teste de Insulto Repetido de Draize utilizando emplastro foi realizado essencialmente como descrito em "Appraisal of the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics" de 65 J.H. Draize (publicado pela Association of Food and Drug Officials of the United States).

Fase de indução - 0 emplastro foi aplicado em locais de contacto determinados e permaneceu no local durante 24 horas. No final deste período, o emplastro foi removido e o local foi examinado em relação à presença de qualquer resposta dérmica. Os indivíduos de estudo repousaram durante 24 horas, após o que o local da pele foi examinado de novo. Um emplastro foi então aplicado no mesmo local como anteriormente utilizado. A segunda aplicação foi idêntica à primeira e permaneceu no local 24 horas. Este procedimento foi repetido nove vezes. Os indivíduos de estudo examinaram o local em relação à presença de qualquer resposta dérmica e relataram as suas observações antes da aplicação seguinte. 0 mesmo sítio foi utilizado ao longo de todo o estudo. Cada aplicação foi colocada e removida por pessoal do Institute of Skin Research (Tel Aviv, Israel). Uma técnico do controlo da qualidade seguiu a adesão ao protocolo do estudo.

Fase de prova - Após a 9a aplicação, decorreu um período de repouso de 2 semanas após o qual foi efectuada uma aplicação de prova da mesma maneira e no mesmo local utilizado durante a fase de indução. A aplicação de prova foi removida após 24 horas e o local foi examinado e classificado quanto a sinais de irritação ou sensibilização. Foi realizado um exame de acompanhamento às 48 horas após a aplicação de prova (24 horas após a remoção do emplastro), bem como às 48 e 72 horas após a remoção.

Escala de classificação - Os resultados dos ensaios de indução e prova foram classificadas utilizando a escala seguinte: "0"= nenhuma reacção visível; "?" reacção 66 duvidosa, isto é, eritema minimo, débil, sem infiltração; "1" reacção positiva fraca, isto é, eritema, infiltração, sem pápulas discretas; "2" = reacção positiva forte, isto é, eritema, infiltração, pápulas, vesiculas discretas; "3" reacção positiva extraordinária, isto é, eritema intenso, infiltração, vesiculas coalescentes/reacção bolhosa; "IR" = reacção de irritação, isto é, eritema discreto sem infiltração/eritema folicular parcial/ pústulas hemorrágicas e foliculares; "NT" = não testado.

Resultados dos testes dermatológicos

Teste hipoalergénico - Neste teste a reacção à aplicação de um emplastro contendo o creme de LIP foi registada após 20 minutos, 24 horas e 48 horas da remoção do emplastro. Como se mostra no Quadro 3 abaixo, em todos os 50 indivíduos de estudo não houve nenhuma reacção visível na pele ao creme de LIP.

Quadro 3

Resultados do teste hipoalergénico N2 Indivíduo Género Idade 20 minutos 24 horas 48 horas 1 D.P. M 37 0 0 0 2 G.B. F 62 0 0 0 3 Z.A. F 58 0 0 0 4 S.E. F 64 0 0 0 5 E.R F 61 0 0 0 6 G.C. F 35 0 0 0 7 S.S. F 26 0 0 0 8 D.P. F 65 0 0 0 9 E.T. F 46 0 0 0 10 I.M. F 58 0 0 0 11 M.I. F 40 0 0 0 12 G.O. F 30 0 0 0 13 M.L. F 49 0 0 0 14 S.A. M 22 0 0 0 15 C.B. F 38 0 0 0 16 B.A. F 34 0 0 0 17 S.I. F 45 0 0 0 18 K.S. F 35 0 0 0 19 S.S. F 28 0 0 0 20 F.H. F 26 0 0 0 21 R.S. F 44 0 0 0 22 A.A. F 25 0 0 0 67

Ne Indivíduo Género Idade 20 minutos 24 horas 48 horas 23 S.T. M 21 0 0 0 24 F.A. M 38 0 0 0 25 S.S. F 42 0 0 0 26 S.R. M 49 0 0 0 27 S.I. M 19 0 0 0 28 C.T. F 32 0 0 0 29 C. J. M 35 0 0 0 30 H.P. F 30 0 0 0 31 F.S. F 36 0 0 0 32 P.A. F 45 0 0 0 33 P.N. M 51 0 0 0 34 M.R. F 30 0 0 0 35 S.L. F 31 0 0 0 36 T.I. F 23 0 0 0 37 V.I. F 30 0 0 0 38 L.A. F 45 0 0 0 39 T.R. F 43 0 0 0 40 C.D. F 38 0 0 0 41 S.S. F 36 0 0 0 42 L.B. F 36 0 0 0 43 M.L. F 31 0 0 0 44 A.T. M 37 0 0 0 45 G.K. F 42 0 0 0 46 B.P. F 51 0 0 0 47 L.T. F 56 0 0 0 48 I .V. F 35 0 0 0 49 P.O. F 43 0 0 0 50 C.P. F 31 0 0 0

Quadro 3: Os resultados de um teste hipoalergénico como foi classificado 20 minutos, 24 horas ou 48 horas após a remoção da aplicação. A sensibilização e prova de pele normal com o creme de LIP resultou na ausência de qualquer reacção cutânea - 0 creme de LIP foi inserido nos emplastros e realizado o teste de Insulto Repetido de Draize com emplastro em 50 voluntários saudáveis. A seguir a cada aplicação de emplastro, a reacção da pele foi registada usando a escala de classificação descrita na Secção dos Métodos acima. Como se mostra no Quadro 4 a seguir, em todos os 50 voluntários não houve nenhuma reacção cutânea visivel durante todas as 9 aplicações de creme da fase de indução, bem como após a última aplicação da fase de prova.

Quadro 4

Os resultados dos testes de indução e prova do creme de LIP 68 N2 Indivíduo Género Idade Resultados de acordo com a escala de classificação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 . D.P. M 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 . G.B. F 62 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 . Z .A. F 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4. S.E. F 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5. E.R F 61 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6. G.C. F 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7. S.S. F 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 . D.P. F 65 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9. E.T. F 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10. I.M. F 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11. Μ. I . F 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 . G.O. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13. M.L. F 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14. S.A. M 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15. C.B. F 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 16. B.A. F 34 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17. S. I . F 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 . K.S. F 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19. S.S. F 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20. F.H. F 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 21. R.S. F 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 22 . A.A. F 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 23 . S.T. M 21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24. F.A. M 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25. S.S. F 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 26. S.R. M 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 27. S. I. M 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28. C.T. F 32 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 29. C. J. M 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 30. H.P. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 31. F.S. F 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 32. P.A. F 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 33. P.N. M 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 34. M.R. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 35. S.L. F 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 36. T.I. F 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 37. V. I. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 38. L.A. F 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 39. T.R F 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40. C.D. F 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 41. S.S. F 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 42. L.B. F 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 43. M.L. F 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 44. A.T. M 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 45. G.K. F 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 46. B.P. F 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47. L.T. F 56 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 I.V. F 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 49. P.O. F 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50. C.P. F 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Quadro 4: Pontuações de classificação após cada aplicação de emplastro na fase de indução (resultados de classificação n° 1-9) e a fase de prova (resultados de classificação n° 10). M = masculino, F = feminino. 69

Teste dermatológico em pele sensível - A fim de caracterizar ainda mais as propriedades de sensibilização do creme de LIP realizou-se um teste com emplastro de irritação em 50 voluntários saudáveis com pele sensível. No pré-ensaio, verificou-se que 11 indivíduos tinham vários graus de ardor: 2 com pele muito sensível, 8 com pele moderadamente sensível e 1 com pele ligeiramente sensível. O emplastro de irritação incluindo o creme de LIP foi colocado nas costas dos voluntários durante 48 horas. A área estada foi inspeccionada após 1 h, 24 h e 48 h e constatou-se que não houve qualquer reacção cutânea em qualquer um dos 50 voluntários.

Estes resultados despistam as reacções hipoalergénicas e irritantes ao creme de LIP em pele normal e sensível. Além disso, os resultados do teste de Insulto Repetido com emplastro sugerem ainda a utilização do creme de LIP como uma composição cosmética segura. EXEMPLO 7

CREME DE LIP É EXTREMAMENTE EFICAZ NA CLAREAÇÂO DA PIGMENTAÇÃO DA PELE O efeito do creme de LIP na clareação da pele foi comparado com os cremes da técnica antecedente num estudo duplamente cego.

Concepção do Estudo

Indivíduos de estudo - O estudo incluiu 12 machos e fêmeas saudáveis com 18-65 anos de idade de origem Asiática que estavam isentos de doença, sem nenhum passado de doenças cutâneas ou doenças atópicas (asma, febre dos fenos, rinite alérgica) e sem sensibilidade conhecida a qualquer uma das substâncias a serem testadas e a qualquer um dos componentes da preparação cosmética. O estudo excluiu 70 candidatos que estavam submetidos a tratamento com fármacos anti-inflamatórios, anti-histamínicos ou corticosteróides para tratamento sistémico ou local, a não ser que o tratamento fosse interrompido duas semanas no caso do tratamento sistémico e três dias no caso do tratamento local antes do envolvimento no estudo. Também foram excluídos do estudo candidatos com cancro, doença renal ou doença do figado em qualquer fase de diagnóstico ou de tratamento, bem como as mulheres grávidas e em fase de aleitação.

Protocolo do estudo - O estudo incluiu dois tipos de cremes que foram aplicados num modo duplamente cego, cada um deles em um antebraço superior: o creme de branqueamento da presente invenção que inclui LIP como o ingrediente activo, e um produto comercial, Hidroquinona a 2% (Esomed Medibrands, Israel). Os cremes foram aplicados duas vezes por dia (isto é, de manhã e à noite). As partes inferiores dos antebraços permaneceram por tratar. Os indivíduos de estudo foram examinados pelo pessoal do Institute of Skin Research (Tel Aviv, Israel), no início do estudo (semana 0) e após uma, duas e três semanas de aplicação do creme. Em cada exame foram registados a pigmentação da pele e os efeitos secundários.

Avaliação da pigmentação da pele - A pigmentação da pele foi avaliada utilizando um espectrómetro Derma (Córtex Technology, Dinamarca), fotografias a cores que foram tiradas utilizando a mesma distância e exposição à luz, e inspecção visual efectuada pelo Prof. Brenner (Responsável do Dermatological Department, Souraski Medicai Center, Tel Aviv, Israel) e a sua equipa.

Resultados do Estudo 71 O creme de LIP reduziu a pigmentação da pele após 3 semanas de aplicação - A fim de avaliar o efeito do creme de LIP no branqueamento da pele, o creme de LIP foi aplicado duas vezes por dia na parte superior do braço direito de 12 voluntários saudáveis. Como se mostra nas Figuras lla-b e 13a-b, as quais incluem fotografias representativas de dois indivíduos de estudo, após três semanas de aplicação de creme a parte superior do antebraço direito surgia muito mais branco do que antes da aplicação do creme. O creme de LIP é mais eficaz no branqueamento da pele do que o creme de Hidroquinona - 0 efeito do creme de LIP na redução da pigmentação da pele foi comparado com o da Hidroquinona a 2%. Após 21 dias de aplicação de creme, a pigmentação da área tratada com LIP do indivíduo de estudo n° 1 tinha sido reduzida em 3,33 unidades (Figura 12a colunas a azul e Figura 12c curva a azul). Por outro lado, a pigmentação da área não tratada do mesma antebraço tinha sido reduzida em 1,13 unidades (Figura 12a, colunas a azul claro). Por outro lado, após 21 dias de tratamento utilizando o creme de Hidroquinona, a pigmentação da área tratada tinha sido reduzida em apenas 1 unidade (Figura 12b colunas a cor de rosa e Figura 12c curva a cor de rosa) . Foram observados efeitos semelhantes noutros indivíduos de estudo, como se mostra nas Figuras 14a-c. Quando os resultados de todos os 12 indivíduos de estudo foram resumidos, verificou-se que as reduções médias na pigmentação da pele eram de 1,57 unidades (Figura 15a, curva a azul) e 1,49 (Figura 15a, curva a cor de rosa) unidades nos antebraços tratados com LIP e Hidroquinona, respectivamente. Além disso, quando as reduções das pigmentações cutâneas foram normalizadas à pigmentação inicial da pele, as diminuições médias nas pigmentações cutâneas foram de 4,3% (Figura 15b, curva a azul) e 3,8% 72 (Figura 15b, curva a cor de rosa) para os antebraços tratados com LIP e Hidroquinona, respectivamente.

No seu conjunto, estes resultados demonstram que o creme de LIP é extremamente eficaz na redução da pigmentação da pele. Além disso, estes resultados sugerem que o efeito de branqueamento relativo do creme de LIP é maior do que o efeito de branqueamento relativo observada utilizando um creme de Hidroquinona a 2%.

Deve entender-se que determinadas caracteristicas da invenção que são, por uma questão de clareza, descritas no contexto de formas de realização separadas, também podem ser proporcionadas em associação numa única forma de realização. Inversamente, várias caracteristicas da invenção que são, por uma questão de brevidade, descritas no contexto de uma única forma de realização, também podem ser proporcionadas separadamente ou em qualquer subassociação adequada.

Embora a invenção tenha sido descrito em conjunção com formas de realização especificas desta, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para os especialistas na técnica. Por conseguinte, pretende-se incluir todas as alternativas, modificações e variações que caiam dentro do âmbito lato das reivindicações apensas. São divulgadas todas as publicações, patentes, pedidos de patente e sequências identificadas pelos seus números de acesso mencionados nesta descrição. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deverá ser entendido como um reconhecimento de que essa referência está disponível como técnica antecedente à presente invenção. 73

REFERÊNCIAS 1. Alaluf S, Heath A, Cárter N, Atkins D, Mahalingam H, Barret K, Kolb R, Smit N. (2001) . Variation in melanin content and composition in Type V and VI photoexposed and photoprotected human skin: the dominant role of DHI. Pigment Cell Res. 14: 337-347. 2. Cooksey CJ, Garratt PJ, Land EJ, Pavel S, Ramsden CA,

Riley PA, Smit NPM. (1997) . Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. J. Biol. Chem. 272: 26226-35. 3. Farrell, R. L., Murtagh, K.E., Tien, M., Mozuch, M.D., Kirk, T.K. (1989). Physical and enzymatic properties of lignin peroxidase isoenzymes from Phanerochaete chrysosporium. Enzyme. Microb. Technol. 11: 322-328. 4. Ghose, T.K. (1987). Measurements of cellulase activities. Pure Appl. Chem. 59: 257-268. 5. Ritch, T.G., Nipper, V.J., Akileswaran, L., Smith, A.J., Pribnow, D.G., Gold, M.H. (1991). Lignin peroxidase from the basidiomycetes Phanerochaete chrysosporium is synthesized as a preproenzyme. Gene 107: 119-126. 6. Tien, M., and Kirk, T.K. (1984). Lignin degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium. Purification, characterization and catalytic properties of a unique H202-requiring oxygenase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 81: 2280-2284. 74 7. Kuan, I.C. and Tien, M. (1989). Phosphorylation of lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. J. Biol. Chem. 264: 20350-20355. 8. Dosoretz, C.G. and Grethlein, H.E. (1991). Physiological aspects of the regulation of extracellular enzymes of Phanerochaete chrysosporium. Appl. Biochem. Biotechnol. 28: 253-265. 9. Stewart, P., Kersten, P., Van den Wymelenberg, A.,

Gaskell, J., Cullen, D. (1992). Lignin peroxidase gene family of Phanerochaete chrysosporium: complex regulation by carbon and nitrogen limitation and Identification of a second dimorphic chromosome. J. Bacteriol. 174: 5036-5042. 10. van der Woude, M.W., Boominathan, K., Reddy, C. A. (1993). Nitrogen regulation of lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase production is independent of carbon and manganese regulation in Phanerochaete chrysosporium. Arch. Microbiol. 160: 1-4. 11. Dosoretz, C.G., Chen, H.C., Grethlein, H.E. (1990). Effect of oxygenation conditions on submerged cultures of Phanerochaete chrysosporium. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 131-137. 12. Faison, B.D. and Kirk, T.K. (1985). Factors involved in the regulation of a ligninase activity in Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 49: 251-254. 75 13. Leisola, M., ulmer, D., Fiechter, A. (1983). Problem of oxygen transfer during degragation of lignin by Phanerochaete chrysosporium. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 113-116. 14. Michel, F.C., Grulcke, E.A., Reddy, C.A. (1992). Determination of the respiration kinetics for mycelial pellets of Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 58: 1740-1745. 15. opp, J.L., Kalyanaraman, B., Kirk, T.K. (1990). Lignin peroxidase oxidation of Mn2+ in the presence of veratryl alcohol, malonic or oxalic acid, and oxygen. Biochemistry 29: 10475-10480. 16. Rothschild, N., Levkowitz, A., Hadar, Y., Dosoretz, C. (1999). Manganese deficiency can replace high oxygen levles needed for lignin peroxidase formation by Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 65: 483-8. 76

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> R.B.T (Rakuto Bio Technologies) Ltd.

<120> MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE LENHIMA-PEROXIDASE E SUA UTILIZAÇÃO NA CLAREAÇÃO DA PELE E DO CABELO

<130> FSS-12882-EP <140> 03777155.7 <141> ll-Dezembro-2003 <150> US 60/432,678 <151> 12-Dezembro-2002 <16 0> 1 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 1119 <212> ADN <213> Phanerochaete chrysosporium <400> 1 stgocgttca agcagcfcect egcagecetc tccgtcgccc tgsccctcca ggtcacccaa €0 gctgccccga acciegacaa gcgcgtcgct tgcoccgacg gcgfcgcacac cgcctccaac 120 gcggcgtgct gtgcatggtt cccggtcctc gatgatatcc agcagaaccfc cttccacçgt 180 ggecagtgcg gtgccgaggc ccacgaggcc cttcgtatgg tcttccatga ctccatcçct 240 atctcgccca agcttcagtc gcôgggcaag tttggcggcg gcggcgcgga cggctcgatc 300 actaccttct cctcgatcga gaccacgtac cacccçaaca tcggcetega cgaggtcgte 360 gccatccaga agccgttcat cgcgaagcae ggcgtcacgc gcggcgattt catcgcgfctc 420 gccggtgccg tcggcgfcgag caactgsccg ggcgcgccgc agatgcagtt cttcctcggc 480 cgccccgagg cgacgcaggc cgcccccgac 9gtctcgtgc ccgagccctt ccacaccate 540 gatcaggttc tcgctcgcat gcttgatgct ggtggcttcg acgagatcga çactgtctgg 600 77 ctgctetctg cccactccat cgcggctgcg aâcgacgtcg acecgaccat ctccggcctg 660 ccgttcgact ccacccc.tgg ccagttcgac tcccagttct tcgtcgagac gcagctccgc 720 ggtaccgcat tecetggcaa gactggtatc cagggcaccg tcatgtcccc gctcaagggc 780 gagatgcgtc tgcagacgga ccacttgttc gcgcgcgact cgcgcacggc gtgcgagtgg 840

cagtccfcteg tcaacaacca gacgaagctg caggaggact tccagttcat ettcaoggcg SOO ctctcgaccc tcggccacga catgaacgcc atgaccgact gctccgaggt catccccgcg S60 cccaagcccg tcaacttcgg cccgtcgttc ttccccgccg gtaagacgca cgccgacatc 1020 gagcaggcct gcçcstccae gccgttcccç acgctcatca ccgçecçeçg tccctctgcg 1080

fcccgtcgcfcc gcatcccccc gccgccgccc cccaactaa 11 IS

Lisboa, 20 de Janeiro de 2011

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método não terapêutico de clareação de uma região da pele ou do cabelo de um indivíduo, compreendendo o método a aplicação na região da pele ou do cabelo de pelo menos um tipo de uma enzima lenhina-peroxidase de um modo apropriado para oxidar um pigmento contido nas células da região da pele ou do cabelo.

2/11

Acíivídadé da LíP i'U

2. Método não terapêutico da reivindicação 1, em que a referida lenhina-peroxidase é a isoenzima Hl ou uma forma modificada da isoenzima H2.

3/11

Concentração de H202 (μΜ) 4/11 Meíarrína oxidada <%·) Melanirta oxidada (%

Concentração de rneianina (ng/rnl) 80- 50- 40' 30· 20 10- 0-

—r-i---------7 1,00 125 0,00 0.25 0.50 0,75 1,75 2.00 225 Concentração de UP (μΜ)

3. Método não terapêutico da reivindicação 1, em que a referida aplicação é efectuada através de uma aplicação tópica de uma preparação incluindo o referido pelo menos um tipo de enzima lenhina-peroxidase.

4. Método não terapêutico da reivindicação 1, em que a referida aplicação é efectuada através de administração intradérmica ou subcutânea de uma preparação incluindo o referido pelo menos um tipo de enzima lenhina-peroxidase.

5/11 I i I ! Fig. 8a I Fig. 8b

â: · W- .v-> I s

Fig. 10 6/11

Fig. 11a

Fig. 11b 7/11 Pontuação da Pigmentação; Pontuação da Pigmentação

Fig. 12a 39- 38- 37- 36* 35- 0 37,67 B 37J7 £ 337 mi 56,6 □ 37 7 P 35.67 □ 36 p$ 5,33 *- < -p-J .....I"1""' —j— Dias de tratamento 14 21 8/11

Fig. 13a Fig. 13b 9/11 Pontuação de pigmentação Pontuação de pigmentação

5. Método não terapêutico da reivindicação 1, em que o referido pelo menos um tipo da referida enzima lenhina-peroxidase é incluído numa composição formulada para aplicação na pele ou no cabelo.

6. Método não terapêutico da reivindicação 5, em que a referida composição compreende ainda um aceitador de electrões.

7. Método não terapêutico da reivindicação 5, em que a referida composição compreende ainda álcool veratrílico. 2

8. Método não terapêutico da reivindicação 5, em que a referida composição compreende pelo menos um tipo de um agente de penetração epidérmico.

9. Método não terapêutico da reivindicação 5, em que a referida composição compreende pelo menos um tipo de um agente de penetração para o cabelo.

10/11

0 .. , , . 21

10. Método não terapêutico da reivindicação 1, em que a referida aplicação é efectuada durante um período de tempo seleccionado de acordo com um nivel de clareação desejado.

11. Composição cosmética para clareação de uma região da pele ou do cabelo de um indivíduo compreendendo uma enzima lenhina-peroxidase e um veiculo cosmeticamente aceitável, em que o referido veiculo cosmeticamente aceitável está numa formulação seleccionada do grupo consistindo de uma emulsão de óleo em água, uma emulsão de água em óleo, uma emulsão de água em óleo em água, uma emulsão de óleo em água em silicone, um creme, uma pomada, uma loção, um aerossol, e um veículo compreendendo um emoliente, um tensioactivo ou um condicionador.

12. Composição cosmética da reivindicação 11, compreendendo ainda um mediador de oxidação.

13. Composição cosmética da reivindicação 11, em que o referido veículo cosmeticamente aceitável é formulado para ser utilizado numa pele ou num cabelo.

14. Composição cosmética da reivindicação 12, em que o referido mediador de oxidação é álcool veratrilico ou veratrole. 3

15. Composição cosmética da reivindicação 11, 12, 13 ou 14, em que a referida lenhina-peroxidase é a isoenzima Hl ou uma forma modificada da isoenzima H2.

16. Composição cosmética da reivindicação 11, 12, 13 ou 14, em que o referido veiculo cosmeticamente aceitável inclui transcutol e/ou butileno glicol.

17. Composição cosmética da reivindicação 11, 12, 13 ou 14, em que o referido veiculo cosmeticamente aceitável inclui alcanolaminas.

18. Composição cosmética da reivindicação 11, 12, 13 ou 14, em que a referida lenhina-peroxidase é proporcionada a uma concentração de pelo menos 1 U/q.

19. Composição cosmética da reivindicação 14, em que o referido álcool veratrilico é proporcionado a uma concentração de pelo menos 0,05%.

20. Estojo para clarear uma região da pele ou o cabelo compreendendo um primeiro recipiente incluindo uma enzima lenhina-peroxidase, e um segundo recipiente incluindo um aceitador de electrões.

21. Estojo da reivindicação 20, em que o referido primeiro recipiente compreende ainda álcool veratrilico.

22. Estojo da reivindicação 20, em que a referida lenhina-peroxidase é a isoenzima Hl ou uma forma modificada da isoenzima H2.

23. Estojo da reivindicação 20, em que o referido aceitador de electrões incluido é peróxido de hidrogénio. 4

24. Estojo da reivindicação 21, em que o referido álcool veratrilico é proporcionado numa concentração de pelo menos 0,05%.

25. Estojo da reivindicação 20, em que a referida lenhina-peroxidase é proporcionada a uma concentração de pelo menos 1 U/g.

26. Estojo da reivindicação 23, em que o referido peróxido de hidrogénio é proporcionado a uma concentração de pelo menos 0,005%.

27. Estojo da reivindicação 20, em que o referido primeiro e/ou segundo recipiente(s) inclui ainda um veiculo cosmeticamente aceitável adequado para penetração na epiderme.

28. Estojo da reivindicação 20, em que o referido primeiro e/ou segundo recipiente inclui ainda um veículo cosmeticamente aceitável adequado para penetração no cabelo.

29. Estojo da reivindicação 27, em que o referido veículo cosmeticamente aceitável inclui transcutol e/ou butileno glicol.

30. Estojo da reivindicação 28, em que o referido veículo cosmeticamente aceitável inclui alcanolaminas.

31. Artigo de fabrico compreendendo um material de embalagem e uma composição cosmética identificada para clarear uma região da pele ou o cabelo de um indivíduo, estando a referida composição cosmética contida no referido 5 material de embalagem, incluindo a referida composição cosmética, como um ingrediente activo, uma enzima lenhina-peroxidase, e um veiculo cosmeticamente aceitável.

32. Artigo de fabrico da reivindicação 31, em que a referida lenhina-peroxidase é a isoenzima Hl ou uma forma modificada da isoenzima H2. 33. Artigo de fabrico da reivindicação 31, em que a referida composição cosmética compreende ainda álcool veratrilico. 34. Artigo de fabrico da reivindicação 31, em que 0 referido veiculo cosmeticamente aceitável inclui composições adequadas para penetração na epiderme ou no cabelo.

35. Utilização de um vector de expressão que compreende um promotor funcionalmente ligado a um polinucleótido que codifica uma enzima lenhina-peroxidase para o fabrico de uma composição cosmética para clarear uma região da pele de um indivíduo, compreendendo o referido polinucleótido a sequência de ácido nucleico descrita na SEQ ID N0:1, em que a expressão do referido nucleótido nas células da região da pele é efectuada de uma maneira adequada para oxidar um pigmento contido nas células da região da pele.

36. Utilização da reivindicação 35, em que a composição cosmética compreende ainda um aceitador de electrões.

37. Utilização da reivindicação 36, em que o referido aceitador de electrões é peróxido de hidrogénio. 6

38. Utilização da reivindicação 35, em que a composição cosmética compreende ainda álcool veratrilico.

39. Utilização da reivindicação 35, em que o referido vector de expressão é um vector virai.

40. Método não terapêutico da reivindicação 1, composição cosmética da reivindicação 11, 12, 13 ou 14, estojo da reivindicação 20 ou artigo de fabrico da reivindicação 31, em que a referida lenhina-peroxidase é obtida por: (a) cultura do fungo Phanerochaete chrysosporíum numa matriz porosa, num meio de cultura agitado e arejado, contendo glicerol durante um intervalo de tempo predeterminado; (b) após o referido intervalo de tempo predeterminado, extrair uma fracção solúvel do referido fungo Phanerochaete chrysosporíum.

41. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 40, em que o referido meio de cultura é desprovido de iões de manganês.

42. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 40, em que a referida cultura arejada é obtida submetendo o referido meio de cultura a uma taxa de arejamento na gama de 0,1-1 litro por litro por minuto.

43. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 40, em que a referida cultura é efectuada a uma temperatura de 37 °C.

44. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 40, em que o referido 7 meio de cultura agitado é obtido agitando o referido meio de cultura a uma velocidade na gama de 50-300 rpm.

45. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 40, em que o referido meio de cultura agitado é obtido agitando o referido meio de cultura a uma velocidade de 160 rpm.

46. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 40, em que o referido intervalo de tempo predeterminado é seleccionado da gama de 3-10 dias.

47. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 40, em que o referido intervalo de tempo predeterminado é de 7 dias.

48. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 40, em que o referido glicerol é proporcionado a uma gama de concentração de 3-20 grama por litro.

49. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 40, em que o referido glicerol é proporcionado a uma concentração de 6 grama por litro.

50. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 40, em que o referido meio de cultura inclui ainda álcool veratrilico.

51. Método não terapêutico, composição cosmética, estojo ou artigo de fabrico da reivindicação 50, em que o referido álcool veratrílico é proporcionado concentração de 0,5-4 mM.

52. Método não terapêutico, composição ou artigo de fabrico da reivindicação 50, álcool veratrilico é proporcionado a uma mM.

53. Método não terapêutico, composição ou artigo de fabrico da reivindicação 40, matriz porosa é uma espuma de poliuretano Lisboa, 20 de Janeiro de 2011 a uma gama de cosmética, estojo em que o referido concentração de 2 cosmética, estojo em que a referida 1/11 C02H Tífosinasé

11/11 Diminuição média da Pontuação de pigmentação média

Dias da tratamento