JP2010042026A - 微生物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】過酸化水素を必須の補助因子とし、マンガンを必要とすることなくメラニンを分解する酵素であって、最適pHが6以下であり、pH4.5における人毛又は合成メラニンの分解活性(比活性U/mg)が西洋わさび由来ペルオキシダーゼの2倍以上である酵素を産生する微生物、及びメラニンに対し当該微生物を作用させるメラニン分解方法。
【選択図】なし
Description
ぺトリ皿上で0.5mmの厚さに調製した2.0%(w/v)寒天を含む麦芽エキス培地から、滅菌したカッターナイフを用いて約10mm四方の培地片を切り出し、滅菌したスライドガラス上に置いた。麦芽エキス斜面培地で30℃、2日間培養したMD-1株の菌糸を1白金耳接種し、カバーグラスをかけ、その三方をワセリンで固定した。30℃で培養しながら24時間ごとに検鏡した。
以下の9種の培地上にMD-1株を植菌し、各培地上の生育状態についての形態学的性質、コロニーの表面の形状・色調、コロニー裏面の色調を調べた(各培地ともpH6.0に調整した)。
ii.ポテト・グルコース寒天培地
iii.ツァペック寒天培地
iv.サブロー寒天培地
v.オートミール寒天培地
vi.合成ムコール寒天培地
vii.YpSs寒天培地
viii.グルコース・ドライイースト寒天培地
ix.コーンミール寒天培地
麦芽エキス培地を用い、MD-1株を液体培養した。pH2.0〜11.0の範囲で変化させ、30℃、200rpmの培養条件でpHを検討し、10〜50℃の範囲で変化させ、pH6.0、200rpmの培養条件で温度を検討した。
没食子酸及びタンニン酸をそれぞれ0.5%加えた麦芽エキス寒天培地上に、MD-1株を植菌し、フェノールオキシダーゼ反応を示すハローの形成について調べた。MD-1株は、培養開始2日目にハローを形成した。
精製DNA溶液20μL(210μg/mL)をマイクロチューブにとり、100℃において10分間保ち、直ちに氷水中で急冷しDNAを熱変性させた。20μLのヌクレアーゼP1溶液(ヤマサ醤油社)を加え、ウォーターバスを用いて50℃において1時間インキュベートした。これを試料とし、ヌクレオチドとしてHPLC分析に供した。標準ヌクレオチドも同様にHPLC分析に供した。HPLCの条件を以下に示す。
カラム:Inertsil ODS-2(4.6×150mm,5μm)
溶出液:NH4H2PO4溶液(0.02M)-アセトニトリル(60:1,v/v)
流速:0.5mL/min
検出波長:270nm
この結果、MD-1株のゲノムDNAにおけるGC含量は、55.96mol%であった。
MD-1株の18SrRNA遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、他の菌株の18SrRNA遺伝子のヌクレオチド配列と比較することにより同定を行った。
まず、サンズーらにより報告されている方法〔Gurpreet S. Sandhu, Bruce C. Kline, Leslie Stockman, and Glenn D. Roberts. Molecular probes for diagnosis of fungal infections. J. Clin. Microbiol., 33, 2913-2919 (1995)〕に従って、MD-1株の18SrRNA遺伝子のインナー配列560bp(配列番号1)と3'-末端配列434bp(配列番号2)を決定した。これらの塩基配列について、DNA Data Bank of JapanのデータベースをFASTA programを用いて解析した。その結果、登録データには、どの遺伝子領域についても、塩基配列の一致する登録菌株は存在しないことが分かった。そこで相同性の比較を行い、最も近い菌株を検索した。本菌のヌクレオチド配列と高い相同性を示した菌株を下に示す。
菌株 相同性(%)
Ceriporiopsis subvermispora 99.643
Termitomyces catilagineus 99.107
Gloeoporus taxicola 98.930
Ceriporia purpurea 98.930
菌株 相同性(%)
Ceraceomyces serpens 99.539
Phanerochaete chrysosporium 99.309
Phanerochaete subceracea 99.309
Ceriporiopsis subvermispora 99.078
1.塩酸処理による毛髪メラニン(塩酸処理メラニン)の調製
約1cmの長さに切断したヒト毛髪(中国人毛髪)10gに40重量倍の6規定塩酸を加え、窒素雰囲気下で加熱・撹拌し、還流条件下(内温:約107℃)で4時間処理することによりメラニン顆粒を抽出する。メンブレンフィルター(孔径:0.22μm)による濾過・洗浄(脱塩水、アセトン)を行い、減圧乾燥したものを人毛メラニン顆粒とする〔参考文献:S. Ito & K. Fujita, Analytical Biochemistry, 144, p.527(1985)〕。
(1)分離源
分離源として、兵庫県、大阪府下の山中より、腐植した木材周辺の土壌サンプル525種を採取し、メラニン分解酵素生産菌の分離源として用いた。
分離培地として、メラニン-麦芽エキス培地(麦芽エキス2.0g、グルコース2.0g、ポリペプトン0.1g、寒天2.0g、メラニン0.05g、水100g)を用いた。
土壌1gを0.8%(w/v)NaCl溶液5mLに懸濁し、ボルテクスにかけて10分間静置し、白金耳を用いて上清を各分離培地上に塗抹した。30℃で培養し、ハローを形成する微生物をメラニン分解酵素生産菌とした。
毛髪メラニン分解酵素生産菌MD-1株を分離した。MD-1株は塩酸処理メラニン、合成メラニン(シグマ社)をともに分解した。図1にMD-1株がメラニン-麦芽エキス培地に含まれる人毛メラニンを脱色分解した結果を示す。
分離した菌株は、麦芽エキス寒天培地(麦芽エキス2.0g、グルコース2.0g、ポリペプトン0.1g、寒天2.0g、水100g)(日水製薬社)を用いて調製したスラント(寒天斜面)に植菌し、これを25℃で培養した。菌体の増殖を確認した後、該スラントを4℃にて保存した。このようにして良好な脱色成績を示す菌株MD-1株を単離した。この菌株は、同寒天平板培地にて、25℃で5〜10日培養することにより、白色の綿状の集落を形成する。
(1)培地及び培養方法
麦芽エキス-グルコース培地(麦芽エキス2.0g、グルコース2.0g、水100mL、pH6.0)を用いて、MD-1株の培養を行った。前培養は、培地7mLにMD-1株を植菌し、30℃で2日間振とうすることによって行った。得られた培養液7mLを、500mLコルベン中の培地60mLに植菌した後、30℃、105rpmの条件下で振とう培養した。培養開始後24時間ごとに2mLの培養液を無菌的にサンプリングした。培養液を遠心分離(27,000×g,15分,4℃)した後、得られた上清中のメラニン分解酵素活性を測定した。
メラニン分解酵素活性は、合成メラニン(シグマ社)及び毛髪メラニン(塩酸処理メラニン)を基質として用い、酵素反応後に残存するメラニンを540nmにおける吸光度に基づいて定量することにより測定した。標準活性測定反応液の組成は、0.05%(w/v)メラニン懸濁液100μL、酵素液250μL、50mM乳酸−コハク酸緩衝液(pH4.5)900μL、9mM過酸化水素14μL(合計1.27mL)であった。酵素反応は30℃で行い、14μLのH2O2を添加することによって反応を開始した。反応開始後経時的に540nmにおける吸光度を測定した。酵素単位1unitは、1時間にメラニン由来の540nmにおける吸光度を0.001減少させる酵素量と定義した。また、比活性はタンパク質1mgあたりの酵素活性で示した。タンパク質はLowly法(Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., and Randall, R.J. J. Biol. Chem. 193巻, 265-275頁、1951年)により定量した。標準タンパク質はウシ血清アルブミンを使用した。
培養液中のメラニン分解活性の経時的変化を図2に示す。メラニン分解酵素活性は、培養開始3日後から増加し、6日後に最大活性を示した。
(1)酵素精製のための培養液の調製
MD-1株の培養は、上で述べた方法により行った。培養液は合計2620mL得た。得られた培養液を吸引ろ過した後、ろ液を遠心分離(27,000×g,15分,4℃)し、その上清を酵素精製に用いた。
酵素精製における全ての操作は4℃下で行った。
上で得た上清に、粉末状に砕いた硫安を55%飽和になるように攪拌しながら加えた。30分間攪拌した後、遠心分離(27,000×g,20分,4℃)して得た上清に、さらに硫安を85%飽和となるように加えた。12時間攪拌した後、遠心分離(27,000×g,20分,4℃)した。沈殿したタンパク質を40mLの10mMリン酸ナトリウム-カリウム緩衝液(pH6.0)(以下緩衝液A)に溶解し、1Lの同緩衝液に対して1,2回目は3時間、3回目は12時間透析した(画分1,40mL)。
画分1を緩衝液Aで平衡化したDE52 cellulose(Whatman Chemical Separation,Clifton,USA)を充填したカラム(1.5×17cm)にアプライした。120mLの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、0〜0.3M塩化ナトリウムを含む600mLの緩衝液Aを用いてリニアグラジエント法により、流速45mL/hrで酵素を溶出した。各フラクション(3.0mL/tube)の酵素活性及びタンパク質を測定した。高活性画分を集め1Lの緩衝液Aに対して3時間透析を行った(画分2,30mL)。
画分2を緩衝液Aで平衡化したDEAE-Toyopearl 650S(東ソー社)を充填したカラム(1.5×17cm)にアプライした。120mLの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、0〜0.2M塩化ナトリウムを含む450mLの緩衝液Aを用いてリニアグラジエント法により、流速45mL/hrで酵素を溶出した。各フラクション(3.0mL/tube)の酵素活性及びタンパク質を測定し、高活性画分を集めた(画分3,15mL)。
画分3を1Mの硫安を含む緩衝液Aで平衡化したPhenyl-Toyoperl(東ソー社)を充填したカラム(1.0×5.0cm)にアプライした後、1Mの硫安を含む20mLの緩衝液Aを用いて流速45mL/hrで酵素を溶出し、酵素活性及びタンパク質を測定し、高活性画分を集めた(画分4,57mL)。
・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
Davisらの方法により、7.5%(w/v)ポリアクリルアミドゲル(pH8.0)、Tris-glycine(pH8.3)の泳動用緩衝液を用いて、2.5mA/tubeの条件で3.0時間泳動した。タンパク質の染色は0.25%(w/v)Coomassie brilliant blue R-250/エタノール-酢酸-水(9:2:9)溶液で1時間行い、エタノール-酢酸-水(25:8:65)溶液に3時間浸漬して脱色後、エタノール-酢酸-水(10:15:175)溶液中に保存した。
WeberとOsbornの方法により、7.5%(w/v)ポリアクリルアミドゲル及び0.1%(w/v)SDS-0.1Mリン酸ナトリウム(pH7.2)の泳動緩衝液を用いて、6mA/tubeの条件で3.5時間泳動した。染色及び脱色は、上で述べた方法によった。
本酵素の各精製段階における酵素活性及びタンパク質量を表1に示す。
得られた最終精製酵素標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動及びSDS-PAGE電気泳動に供したところ、タンパク質を示す単一のバンドが現れ(図3)、得られた酵素が単一のタンパク質からなることを示した。電気泳動の結果から、本酵素の分子量は、SDS-PAGEで約72,000であった。
(1)酵素活性に与えるpHの影響
50mM乳酸-コハク酸緩衝液(pH2.5〜5.0)、50mM 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0〜6.0)、50mMリン酸カリウム-ナトリウム緩衝液(pH6.0〜7.5)、50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5〜9.5)を用いて酵素活性(2.3μg使用)を測定したところ、本酵素は、弱アルカリ〜中性〜酸性領域で活性を示し、pH3.5〜4.0において最大活性を示した(図4)。
標準条件下(pH4.5)で25〜95℃の各温度で酵素活性(2.3μg使用)を測定した結果、本酵素は、約70℃までメラニン分解活性を有しており、50℃付近において最大活性を示した。
酵素液(2.3μg)を100mM乳酸-コハク酸緩衝液(pH2.5〜5.0)、100mMリン酸カリウム-ナトリウム緩衝液(pH5.0〜7.5)、100mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5〜9.5)、100mM Na2CO3-NaHCO3緩衝液(pH9.5〜11.0)で、4℃、24時間処理した後、残存する酵素活性を測定した。
本酵素は、pH2.5〜8付近まで4℃で24時間安定であり、pH3〜4付近では4℃、24時間処理で80%以上の残存活性を示し、pH3.5付近において最も安定であった。
50mM乳酸-コハク酸緩衝液(pH4.5)を用いて、25〜95℃の各温度で10分間加熱処理した。残存するメラニン分解活性を測定した結果、本酵素は、50℃までは80%以上の活性を維持し、60℃まで酵素活性を有していた。
(1)酵素活性に与えるH2O2、金属イオン、各種化合物の影響
H2O2の濃度を変化させ、酵素活性を測定した結果、本酵素は、H2O2の無添加ではメラニン分解活性を全く示さず、過酸化水素はメラニン分解反応に必須の因子であった。調べたH2O2濃度の範囲(0〜2mM)では、添加系で活性を示し、0. mMにおいて最大活性を示した。
各種の金属イオン(1mM)を加えて処理(25℃、10分間)を行い、20倍希釈後の酵素活性を測定した結果、本酵素は、Mn2+のほか、Mg2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Ca2+、Zn2+等の存在下で活性を示し、これら金属にはあまり影響を受けなかった(無添加系の活性に比較して100〜50%)。本酵素は、0〜2.0mMのMn2+濃度ではメラニン分解活性はほとんど増加せず、本酵素はマンガンペルオキシダーゼではないと判断した。また、Fe2+、Ag+、Cu2+で処理した本酵素は著しく阻害された(無添加系の活性に比較して0〜30%)。また、Fe3+で処理した本酵素はメラニンに対する活性を著しく増大させた。
本酵素に対する各種化合物(1mM)の影響について検討した結果、ヨード酢酸(CH2ICOOH)、PCMB(p-クロロメルクリ安息香酸;p-chloromercuribenzoic acid)、DTNB(5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸);5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid))、α,α'-ジピリジル(α,α'-Dipyridyl)、N-エチルマレイミド(N-Ethylmaleimide)、EDTA、o-フェナントロリン(o-Phenanthroline)等では無添加の50%以上の活性を示したが、アジ化ナトリウムは本酵素を著しく阻害した(無添加系の20%以下)。
本酵素の基質特異性を、ペルオキシダーゼの基質として報告のある物質(2,6-ジメトキシフェノール、グアヤコール、シリングアルダジン)及び各種の色素化合物を対象として調べた。
2,6-ジメトキシフェノール、グアヤコール及びシリングアルダジンに対する酵素活性は、標準活性測定法においてメラニンの代わりにこれら化合物を用い、それぞれの化合物由来反応生産物の極大吸収波長における吸光度の増加を測定することにより酵素活性を求めた。グアヤコール由来の生産物である3,3'-ジメトキシ4,4'-ビフェノキノンの分子吸光係数として5,580(470nm)、2,6-ジメトキシフェノールからの生産物である3,3',5,5'-テトラメトキシ-4,4'-ビフェノキノンの分子吸光係数として49,000(469nm)、シリングアルダジンからの生産物であるテトラメトキシゾ-p-メチレンキノンの分子吸光係数として65,000(525nm)を用いた。酵素活性(単位)は、酵素が1分間に変化させる基質濃度とした。この結果、これらの化合物に対する酵素活性は、2,6-ジメトキシフェノールに対しては7単位、グアヤコールに対しては29単位、シリングアルダジンに対しては47単位と、比較的高い活性を示した。
色素化合物であるローダミン6G、メチルオレンジに対する本酵素の脱色活性は、標準活性測定法においてメラニンの代わりにこれらの色素を用い、それぞれの色素の極大吸収波長における吸光度の減少を測定した。ローダミン6G、メチルオレンジの分子吸光係数はそれぞれ、75,000(527nm)、25,000(470nm)を用いた。この結果、本酵素はこれらの色素化合物に対して脱色活性を示した。
標準活性測定反応液中のメラニンの濃度を変化させ、酵素活性測定を行うことにより、各種メラニンに対する本酵素のKm値をラインウイーバーバークプロット(Lineweaver-Burk plot)から算出した。MD-1株のメラニン分解酵素のKm値を測定した結果、Km〔%(w/v)〕は、合成メラニンに対して6.5×10-4、人毛メラニンに対して1.5×10-3であった。
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ(シグマ社)のメラニンに対する比活性とMD-1株由来のメラニン分解酵素の比活性を比較した。西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼのメラニンに対する活性は、標準活性測定法においてMD-1株由来のメラニン分解酵素の代わりに同酵素を用いて測定した。西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼは、10μg、30μg、100μgを使用し、MD-1株由来のメラニン分解酵素は10μgを使用した。
Claims (5)
- 過酸化水素を必須の補助因子とし、マンガンを必要とすることなくメラニンを分解する酵素であって、最適pHが6以下であり、pH4.5における人毛又は合成メラニンの分解活性(比活性U/mg)が西洋わさび由来ペルオキシダーゼの2倍以上である酵素を産生する微生物。
- 担子菌である請求項1記載の微生物。
- セリポリオプシス エスピー.(Ceriporiopsis sp.)MD-1株(FERM P-19507)。
- メラニンに対し、請求項1〜3のいずれかに記載の微生物を作用させるメラニン分解方法。
- メラニンが、人毛メラニン又はカビメラニンである請求項4記載のメラニン分解方法。
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