KR20010114117A

KR20010114117A - 멜라닌을 탈색시키는 효소

Info

Publication number: KR20010114117A
Application number: KR1020000034295A
Authority: KR
Inventors: 김은기
Original assignee: 이홍대; 주식회사 엠엔비그린어스
Priority date: 2000-06-21
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2001-12-29

Abstract

본 발명은 기능성화장품의 미백원료로 사용될 수 있으며 멜라닌의 과다침착등으로 인해 유발되는 기미, 주근깨등의 병변을 치유하는데 사용될 수 있는 피부 멜라닌 색소를 탈색시키는 효소에 관한 것으로서 퍼옥시다아제중 파네로캐츠 크라이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)으로부터 배양, 정제되는 리그닌퍼옥시다아제와 망간퍼옥시다제, 식물유래효소인 호울스라디쉬퍼옥시다아제와 고구마퍼옥시다아제 및 트라메테스 버시컬러(Trametes versicolor)로부터 배양, 정제되는 락케이즈의 멜라닌을 탈색시키는 효소로서의 용도를 제공한다. 리그닌퍼옥시다아제, 망간퍼옥시다제, 호울스라디쉬퍼옥시다아제, 고구마퍼옥시다아제 및 락케이즈는 기능성 화장품의 미백원료로 사용될 수 있으며 또한 인체에 있어서 멜라닌 색소의 과다로 인해 생기는 기미, 주근깨등의 병변을 개선하는 원료로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

멜라닌을 탈색시키는 효소{Melanin decolorization by Enzyme}

본 발명은 멜라닌을 탈색시키는 효소에 관한 것으로써, 특히 기능성화장품의 미백원료로 사용될 수 있으며 멜라닌의 과다침착등으로 인해 유발되는 기미, 주근깨등의 병변을 치유하는데 사용될 수 있는 리그닌퍼옥시다아제(lignin peroxidase), 망간퍼옥시다아제(manganese peroxidase), 호울스라디쉬퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 고구마퍼옥시다아제(sweet potato peroxidase), 락케이즈(laccase)등의 피부 멜라닌 색소를 탈색시키는 효소에 관한 것이다.

일반적으로 사람의 피부색은 피부내에 존재하는 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈과 같은 색소등에 의해 좌우되며, 이중 멜라닌의 영향이 가장 크다고 알려져 있다. 피부 표피의 기저층에 존재하는 색소형성세포에서 티로신이 도파(dopa)로 히드록실되는 과정을 시작으로 도파퀴논(dopaquinone), 도파크롬(dopachrome)의 과정을 거쳐 멜라닌으로 합성된다. 도파크롬은 자연히 디카르복실이되어 디히드록시인돌(5,6-dihydroxyindole, DHI)이 되며 빠르게 산화되어 인돌-5,6-퀴논(indole-5,6-quinone)이 된다. 그러나 특정한 금속이온과 효소가 있는 경우 카르복실중간체인 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA)이 만들어지며 DHICA 옥시다아제의 작용을 받아 인돌-5, 6-퀴논-2-카르복실산(indol-5,6-quinone-2-carboxylic acid)으로 산화된 후 유멜라닌이 생성된다. 그러나 도파크롬이 시스테인이나 글루타치온과 같은 티올화합물을 만나게 되면 시스테이닐도파(cysteinyldopa)가 만들어지고 결국에는 페오멜라닌이 만들어 진다. 이러한 과정에 관련하는 효소는 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase-related protein-1), TRP-2(tyrosinase-related protein-2) 등이 알려져 있다. 이후 생성된 멜라닌은 멜라노좀의 형태로 각질형성세포로 전달되어 피부색을 나타내게된다.

피부의 멜라닌을 탈색시키는 방법으로 멜라닌 생성에 관여하는 효소의 작용을 억제시키는 방법이 주로 사용되는데 주로 멜라닌 생성에 관여하는 것으로 알려진 티로시나아제의 활성을 억제하는 방법을 사용한다.

구체적인 예로 한국공개특허 제97-074757호에 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 티로시나아제의 활성을 저해하는 포화알킬이소시아나이드 유도체 및 그의 제조방법에 관하여 개시되어 있으며, 한국공개특허 제96-031616호는 티로시나아제 활성및 멜라닌 생성 저해 화합물의 제조방법에 관한 것으로 트리코데르마종 MR-304 균주(KCTC 0123BP)를 배양하고, 배양물로부터 균체를 제거한 후, 여액으로부터 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성 저해 화합물인 MR-304-1 화합물을 제공하는 것에 관하여 개시되어 있다.

그러나 상기한 종래의 방법은 멜라닌 생성에 관여하는 효소가 티로시나아제외에 여러가지 더 존재하므로 완벽한 억제가 어려우며 이미 생성된 멜라닌에 의한 흑화는 치유가 어려운 문제점이 있다.

본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 제안된 것으로써, 본 발명의 목적은 멜라닌의 생산을 저해하는 방법을 사용하는 종래의 방법에 비하여 이미 생성된 멜라닌을 산화시켜 멜라닌을 탈색시킬 수 있는 효소들을 제공하는 것이다.

도 1은 파네로캐츠 크라이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)에 의해서 멜라닌색소가 탈색됨을 나타내는 사진.

도 2는 트라메테스 버시컬러(Trametes versicolor)에 의해서 멜라닌색소가 탈색됨을 나타내는 사진.

상기한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 리그닌퍼옥시다아제, 망간퍼옥시다제, 호울스라디쉬퍼옥시다아제, 고구마퍼옥시다아제, 락케이즈로 구성되는 군으로부터 1종이상 선택되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 멜라닌을 탈색시키는 효소를 제공한다.

상기의 리그닌퍼옥시다아제와 망간퍼옥시다제는 파네로캐츠 크라이소스포리움으로부터 배양, 정제되는 효소이며 락케이즈는 트라메테스 버시컬러로부터 배양, 분리되는 효소임을 특징으로 한다. 또한 상기의 호올스라디쉬퍼옥시다아제, 고구마퍼옥시다아제는 식물체로부터 추출되는 효소임을 특징으로 한다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.

도 1은 배지에 아가를 넣고 멸균한 후 합성멜라닌 또는 자연멜라닌을 200(mg/L)를 섞은 배지에 파네로캐츠 크라이소스포리움 균주를 도말하여 5일간 배양한 후 멜라닌의 탈색여부를 육안으로 관찰한 사진으로서 상기의 배지의 조성은 1L의 배지에 아가 20g, 효모추출물 2g, 맥아추출물 10g, 펩톤 2g, 포도당 10g, 아스파라긴 1g, 인산칼륨 2g, 황산마그네슘 7수화물 1g, 염산-티아민 1mg이 첨가된다. 도 1의 A, B 는 상기 방법으로 만들어진 플래이트로써 A는 균을 접종하지 않은 것으로 대조군이며 B는 균을 접종한지 5일 후에 관찰한 모습으로 처음상태인 A와 육안으로 비교하였을 때 B의 멜라닌 색이 현저히 감소했음을 볼 수 있다. 도 1로부터 파네로캐츠 크라이소스포리움이라는 균주가 멜라닌색소를 탈색시킴을 알 수 있다. 본 발명에서 사용한 파네로캐츠 크라이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium) ATCC 24725는 한국과학기술연구원 유전공학센터 유전자은행에서 제공받았다.

파네로캐츠 크라이소스포리움은 1974년 죽은 나무로부터 처음으로 분리되었고 리그닌 분해에 가장 많은 연구가 이루어진 백색부후균중의 하나이다. 파네로캐츠 크라이소스포리움은 단단한 세포벽을 가진 종속영양 진핵생물로서 세포벽을 통하여 영양물을 흡착하며 흡착될 수 없는 고분자를 분해하기 위하여 세포외 효소를 분비한다. 또한 유성 및 무성생식의 수단으로 포자를 생산한다. 백색부후균은 정체배양을 하는 경우 배지의 상단에서 균사체 형태로 성장하며 교반배양을 하는 경우펠렛 형태로 성장한다. 백색부후균은 탄소, 질소, 황 같은 영양물 제한조건에서 2차 대사기간 중에 리그닌 분해효소를 생산한다. 백색부후균에 의해 리그닌분해효소가 발현되기 위해서는 고농도의 산소조건이 요구되며 배지조성 및 배양조건에 대한 의존성이 높다. 리그닌 분해효소의 생산수율이 낮아서 그 응용에 제한을 받고 있는 실정이며, 이러한 문제점을 해결하기 위해서 제한조건이 아닌 영양풍부조건에서도 리그닌 분해효소를 과량으로 생산할 수 있는 돌연변이 균주가 개발되기도 하였다.

백색부후균에 의한 리그닌 분해시스템에는 리그닌퍼옥시다아제, 망간퍼옥시다아제, 락케이즈, 과산화수소생산효소, 버라트릴알콜, 망간 등이 있으며 백색부후균은 리그닌 분해시스템의 최적 pH인 3.0을 맞추기 위하여 옥살산 및 다른 유기산들을 분비한다. 백색부후균과 그들의 리그닌 분해시스템은 광범위한 기질특이성을 나타내어 리그닌뿐만 아니라 트리니트로톨루엔(TNT)등 다양한 난분해성 유기화합물들을 분해할 수 있으며 특히, 염료의 색도제거용으로 연구되어왔다.

배지의 조건에 따라서 파네로캐츠 크라이소스포리움로부터 리그닌퍼옥시다아제, 망간퍼옥시다아제, 락케이즈등이 생산될 수 있다. 파네로캐츠 크라이소스포리움은 배지의 조성중 미량요소(Trace element)에서 MnSO₄ㆍH₂O를 제외하면 리그닌퍼옥시다아제만 생성되며, 이를 포함시키면 망간퍼옥시다아제가 생산될 수 있다. 이때 탄소원으로 포도당을 사용하는데 이것을 셀룰로오스로 대체하면 락케이즈가 생산될 수 있다.

파네로캐츠 크라이소스포리움으로부터 리그닌퍼옥시다아제를 생산하기 위한배지조건은 다음과 같다. 배지 1L에 인산이수소칼륨(KH₂PO₄) 2g, 황산마그네슘(MgSO₄) 0.5g, 염화칼슘(CaCl₂) 0.1g , 1% 글루코스(Glucose), 암모늄 타르트레이트(Ammonium Tartrate) 0.2g, 티아민-염산(Thiamin-HCl) 1mg, 0.4mM 베라트릴알코올(veratryl alcohol), 10% 트윈 80 (Tween 80) 5ml, 0.1M 디메틸숙신산염 완충용액(Dimethylsuccinate Buffer , DMS) 100ml, 30 mM L-라이신(L-lysine) 10ml, 미량요소용액(Trace element solution) 70ml이 포함된다. 상기와 같이 준비된 배지 100ml를 250ml 플라스크에 넣고 균주를 접종하여 교반속도 200rpm, 37℃에서 12시간 배양한다. 리그닌퍼옥시다아제의 정제는 다음과 같이 같다. 파네로캐츠 크라이소스포리움을 5-7일 배양한 후, 종이여과지를 이용하여 배양액을 균체와 담체로부터 분리하고 0.2㎛막으로 여과하여 포자를 제거한다. 여과한 배양액을 한외여과기와 YM 10막을 이용하여 10배 이상 농축하고 투석막을 이용하여 10mM 아세트산나트륨 완충용액(pH 6.0)에서 24시간 투석한다.

도 2는 배지에 아가를 넣고 멸균한 후 합성멜라닌 또는 자연멜라닌을 200(mg/L)를 섞은 배지에 트라메테스 버시컬러 균주를 도말하여 5일간 배양한 후 멜라닌의 탈색여부를 육안으로 관찰한 사진으로서 상기의 배지는 YM 배지로 조성은 1L의 배지에 아가 20g, 효모추출물 3g, 맥아추출물 3g, 펩톤 5g, 포도당 10g이 첨가된다. 도 2의 A, B는 상기의 방법으로 만들어진 플래이트로써 A는 균을 접종하지 않은 것으로 대조군이며 B는 균을 접종한지 5일 후에 관찰한 모습으로 처음상태인 A와 육안으로 비교하였을 때 B의 멜라닌 색이 현저히 감소했음을 볼 수 있다. 도 2로부터 트라메테스 버시컬러 균주가 멜라닌색소를 탈색시킴을 알 수 있다. 본 발명에 사용된 균주인 트라메테스 버시컬러(Trametes versicolor) KCTC 16781은 한국과학기술연구원 유전공학센터 유전자은행에서 제공받았다.

트라메테스 버시컬러의 균모는 반원형이며 백색을 띄고 있다. 한천 평판상에서 영양균사체의 발육은 양호하고 백색의 원형 집락을 형성하며 배지중의 용해성 색소의 생산은 없으며 융벽부에는 담자균 특유의 만상돌기가 존재한다. 트라메테스 버시컬러로부터 락케이즈를 생산하기 위한 배지조성으로는 1L 배지에 포도당 15g, 멕아추출물 400mg, 염화망간(MnCl₂) 0.3mg, 황산철(FeSO₄ㆍ6H₂O) 4mg, 황산마그네슘(MgSO₄ㆍ7H₂O) 40mg, 2,2-디메틸숙신산(2,2-dimethylsuccinic acid) 20mM이 포함된다. 상기와 같이 준비된 배지 100ml를 500ml 플라스크에 넣고 균주를 5%(v/v)접종한 후 25℃의 진탕회전배양기를 사용하여 배양한다. 락케이즈의 정제는 다음과 같다. 트라메테스 버시컬러를 5-7일 배양한 후, 종이여과지를 이용하여 배양액을 균체와 담체로부터 분리하고 0.2㎛막으로 여과하여 포자를 제거한다. 여과한 배양액을 한외여과기와 YM10막을 이용하여 10배 이상 농축하고 투석막을 이용하여 10mM 아세트산나트륨 완충용액(pH 6.0)에서 24시간 투석한다.

리그닌퍼옥시다아제와 같은 종류에 속하며 식물체에서 추출할 수 있는 호올스라디쉬퍼옥시다아제, 고구마퍼옥시다아제를 멜라닌 탈색 효소로 선정하여 실험한 결과 멜라닌을 탈색시킬 수 있었으며 호올스라디쉬퍼옥시다아제, 고구마퍼옥시다아제는 시약급으로 판매되는 것을 사용하였다.

퍼옥시아다제 효소의 산화에 의한 멜라닌 탈색의 메카니즘은 다음과 같다. 멜라닌은 바이오폴리머로써 헤테로지니어스한 단량체들의 복합체로 구성되어 있기에 아직 그 구조가 명확히 밝혀지지 않은 상태이다. 그러나 니콜라스(Synthetic Metals, 76, 331-335, 1996)는 하기의 반응식 1과 같이 멜라닌의 구조를 제안하였다. 또한 각종 산화제 즉, 과산화수소 또는 과망간산칼륨등에 의해 멜라닌이 탈색되는 논문(Tetrahedron Vol. 52, No. 26, 8775-8780, 1996)에 근거하여 효소에 의한 멜라닌 산화시 생성될 수 있는 산물들을 반응식 1에 나타내었다.

효소의 헴구조속에 철이온이 존재하는데 과산화수소에서의 산소와 철이온이 반응하여 강력한 산화기능을 갖으며 효소의 구조가 변하여 수산화기를 갖게된다. 이 수산화기가 멜라닌을 공격하여 멜라닌을 탈색시킨다.

본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

멜라닌 반응액의 조성은 리그닌퍼옥시다아제 800유니트/ml, 125mM 타르타릭완충용액(tartaric acid) 0.79ml, 40mM 버라트릴알콜 0.05ml, 10000ppm 멜라닌용액 0.01ml, 8mM 과산화수소수 0.05ml로 구성되며 반응액의 총 부피는 1ml이다. 상기의 멜라닌 반응액중에 8mM 과산화수소수 0.05ml를 마지막으로 첨가함으로써 반응을 시작시킨다. 이때 최종적으로 참여하는 과산화수소의 농도는 0.4mM이다. 효소용액, 타르타릭완충용액, 버라트릴알콜, 멜라닌을 혼합하여 부피 0.95ml를 제조한후 초기 흡광도를 측정하고 0.05ml의 과산화수소를 첨가한 후에 시간별로 파장 475nm에서의 흡광도를 측정하여 표 1에 나타내었다.

표 1의 (A)는 대조군으로 희석효과를 배제하기 위해서 만들어졌으며 그 조성은 125mM 타르타릭완충용액 0.89ml, 40mM 버라트릴알콜 0.05ml, 10000 ppm 멜라닌용액 0.01ml, 8 mM 과산화수소수 0.05ml로 구성되며 반응액의 총 부피는 1ml이다. (C)는 대조군(A)값에서 효소를 넣은 (B)의 값을 차감한 값으로, (C)는 효소에 의한 멜라닌의 탈색도를 나타내고 있다.

시간 (분)	대조군의 흡광도(A)	반응액의 흡광도(B)	리그닌퍼옥시다아제에의한 탈색도(C)
0	0.652	0.653	0
1	0.617	0.591	0.026
2	0.617	0.562	0.055
4	0.610	0.544	0.066
8	0.610	0.524	0.086
16	0.609	0.510	0.099
35	0.607	0.503	0.104
55	0.604	0.495	0.109

< 실시예 2>

멜라닌 반응액의 조성으로 망간퍼옥시다제 500유니트/ml를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하며 그 결과를 표 2에 나타내었다.

시간 (분)	대조군의 흡광도(A)	반응액의 흡광도(B)	망간퍼옥시다아제효소에의한 탈색도
0	0.652	0.653	0
1	0.617	0.600	0.017
2	0.617	0.550	0.057
5	0.610	0.544	0.066
10	0.610	0.532	0.079
20	0.609	0.508	0.099
40	0.607	0.498	0.109
60	0.604	0.475	0.129

표 1, 표 2의 결과로부터 리그닌포옥시다아제 및 망간퍼옥시다제가 멜라닌을 탈색시키는 효과가 있음을 알 수 있는데 리그닌포옥시다아제의 경우, 초기 반응을 시작하여 55분후에 흡광도가 0.109변화를 나타내며 망간퍼옥시다제의 경우 초기 반응을 시작하여 60분후에 흡광도가 0.129변화를 나타냄을 알 수 있다. 이는 멜라닌 정량곡선과 비교했을 때 멜라닌 약 10ppm 정도에 해당하는 양으로서 멜라닌탈색의 최적의 조건은 아니지만 리그닌포옥시다아제 및 망간퍼옥시다제가 초기 멜라닌의 10퍼센트에 해당하는 양을 탈색시킴을 알 수 있다.

< 실시예 3 >

멜라닌 반응액은 호올스라디쉬퍼옥시다아제 750유니트/ml, 0.1M 포테시움포스페이트버퍼(Potassium phosphate buffer;pH 7.0) 0.88ml, 100mg/L 멜라닌용액 0.01ml, 0.08 mM 과산화수소수 0.01ml를 첨가하여 제조된다. 본 반응은 호올스라디쉬퍼옥시다아제, 포테시움포스페이트버퍼, 멜라닌을 혼합하여 0.99ml 용액을 제조한 후 초기흡광도를 측정하고 과산화수소용액 0.01ml를 첨가하여 반응을 시작한 후 1분 간격으로 5분간 흡광도의 변화를 측정하여 표 3의 (B)에 나타내었다.

대조군 (A)는 과산화수소용액에 의한 희석효과를 배제하기 위한 것으로 0.1M 포테시움포스페이트버퍼 0.98ml, 100 mg/L의 멜라닌용액 0.01ml, 0.08 mM 과산화수소수 0.01ml를 첨가하여 제조된다. 본 반응은 포테시움포스페이트버퍼, 멜라닌을 혼합하여 0.99ml 용액을 제조한 후 초기흡광도를 측정하고 과산화수소용액 0.01 ml를 첨가하여 반응을 시작한후 1분 간격으로 5분간 흡광도의 변화를 측정하였다.

상기의 측정결과를 표 3에 나타내었으며 표 3에서 초기 반응을 시작하여 5분후에 0.081의 흡광도 변화를 나타내는 것으로부터 호올스라디쉬퍼옥시다아제가 멜라닌을 탈색킴을 알 수 있다.

시간(분)	대조군의 흡광도(A)	반응액의 흡광도(B)	호올스라디쉬퍼옥시다아제에의한 멜라닌 탈색도
0	0.600	0.600	0
1	0.596	0.538	0.058
2	0.595	0.530	0.065
3	0.595	0.523	0.072
4	0.595	0.518	0.077
5	0.595	0.514	0.081

<실시예 4>

멜라닌의 탈색에 대한 호올스라디쉬퍼옥시다아제, 고구마퍼옥시다아제, 락케이즈의 농도의 영향를 평가하기 위하여 호올스라디쉬퍼옥시다아제(시그마사), 고구마퍼옥시다아제(시그마사), 락케이즈의 농도를 각각 100, 200, 750, 1300 유니트/ml로 변화시켜 0.1M 포테시움포스페이트버퍼 0.88ml, 10 mg/ml의 멜라닌 용액 0.01 ml, 8 mM 과산화수소수 0.01ml를 첨가하여 제조한다. 호올스라디쉬퍼옥시다아제, 포테시움포스페이트버퍼, 멜라닌을 혼합하여 0.99ml 용액을 제조한 후 초기흡광도를 측정하고 과산화수소용액 0.01ml를 첨가하여 반응을 시작한후 5분 후 흡광도의 변화를 측정한다. 호올스라디쉬퍼옥시다아제를 고구마퍼옥시다아제, 락케이즈로 변화시켜 각각 측정하였으며 그 결과를 표 4에 나타내었다

효소의 농도(유니트/밀리리터)	흡광도 변화
효소의 농도(유니트/밀리리터)	호울스라디쉬퍼옥다제	고구마퍼옥시다아제	락케이즈
100	0.035	0.02	0.01
200	0.050	0.03	0.03
750	0.086	0.05	0.05
1300	0.121	0.08	0.09

표 4에서 효소를 100 유니트/ml 사용하였을 경우 흡광도의 변화는 0.035, 0.02, 0.01이었으며 효소의 농도를 1300 유니트/ml로 증가시켰을 경우 0.121, 0.08, 0.09의 흡광도 변화를 나타내는 것으로 부터 호올스라디쉬퍼옥시다아제, 고구마퍼옥시다아제 및 락케이즈의 농도를 증가시킴에 따라 멜라닌 탈색능력이 증가함을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 리그닌퍼옥시다아제, 망간퍼옥시다아제, 호올스라디쉬퍼옥시다아제, 고구마퍼옥시다아제 및 락케이즈에 의해서 멜라닌이 탈색됨을 알 수 있으며 상기의 효소는 기능성 화장품의 미백원료로 사용될 수 있고 인체에 있어서 멜라닌 색소의 과다로 인해 생기는 기미, 주근깨등의 병변을 개선하는 원료로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

리그닌퍼옥시다아제, 망간퍼옥시다제, 호울스라디쉬퍼옥시다아제, 고구마퍼옥시다아제, 락케이즈로 구성되는 군으로부터 1종이상 선택되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 멜라닌을 탈색시키는 효소.
제 1 항에 있어서,

상기의 리그닌퍼옥시다아제와 망간퍼옥시다제는 파네로캐츠 크라이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)을 배양하고, 배양물로부터 균체를 제거한 후 정제되는 것을 특징으로 하는 멜라닌을 탈색시키는 효소.
제 1 항에 있어서,

상기의 락케이즈는 트라메테스 버시컬러(Trametes versicolor)을 배양하고, 배양물로부터 균체를 제거한 후 정제되는 특징으로 하는 멜라닌을 탈색시키는 효소.