KR20010103040A - 기질의 효소촉매산화용 다성분계 및 그 효소촉매산화방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산화촉매, 산화제 및 매개체로 이루어진 매개체종속효과산화를 시행하는 다성분계에 관한 것이며, a) 산화촉매는 망간산화효소로 이루어진 그룹에서 선정되며, b) 산화제는 산소 및 산소함유화합물로 이루어진 그룹에 선정되며, c) 매개체는 Mn이온을 함유한 화합물로 이루어진 그룹에서 선정됨을 특징으로 한다.

Description

기질의 효소촉매산화용 다성분계 및 그 효소촉매산화방법{MULTI-COMPONENT SYSTEM FOR THE ENZYME-CATALYSED OXIDATION OF SUBSTRATES AND METHOD FOR CARRYING OUT ENZYME-CATALYSED OXIDATION}

기질의 매개체종속효소촉매용 다성분계 및 그 대응방법은 대체로 공지되어 있다. 이 관계의 매개체는 일반적으로 산화환원효소에 의해 산화되는 그 혼합물이며, 그것은 첫째로 효소산화촉매의 기질이다. 특히, 매개체는 산화환원효소에서 산화계의 실제 기질로 확산하여 상호작용 하기 위해 충분히 긴 수명을 가진 매개체 (활성매개체, 예로써 매개체라디칼 또 매개체양이온)의 산화형상을 특징으로 한다. 활성매개체와 기질간의 상호작용시 기질은 매개체에 의해 산화된다. 기질의 산화에 의해 매개체는 재생되며(촉매산화계) 또, 비활성화 된다(화학양론산화계).

매개체가 재생되는 경우에는 새로운 촉매순환이 가능하다. 매개체에 의해 기질에서 산화환원효소에 이동된 전자는 직접 효소적 산화처리에서 산소 또 과산화물 등의 말단전자억셉터로 이동된다.

과산화물이 말단전자억셉터로서 사용되는(직접 또는 전구물질에서 방출된) 방법의 경우에는, 다만 과산화효소가 산화환원효소로서 사용된다. 얼마간의 그러한 방법이 공지되어 있으나, 그것들은 다수의 단점을 가지고 있다 : 과산화효소는 종이표백이나 세탁제에서와 같은 산업적 방법에서 사용하기 위하여는 제조비가 과대하다. 또한, 과산화효소는 효과적 처리에 필요한 농도에 있어서 과산화물은 과산화효소를 비활성화 시킴으로 문제가 있다. 과산화효소용 매개체로서 설명한 많은 화합물은 너무 강하게 채색되어 동물학상으로 또는 생태동물학상으로 유해하며, 생분해성이 없고, 있다하여도 다만 불충분하게 생분해성이 있으며, 또 충분한 양으로 또는 충분히 저가로 이용할 수 없으므로, 산업적으로 사용할 수가 없다. 그러므로, 과산화물이 말단전자억셉터로 이용되는 방법은 경제적으로 편리한 산업용으로는 오늘날까지 적합하지 않다.

산소가 산화되기 위해 기질에서 생긴 전자에 대한 말단전자억셉터로서 작용하는 경우에는, 산화효소는 산화환원효소로서 사용된다. 매개체종속효소산화처리에 사용될 수 있는 2그룹의 산화효소가 설명된다. :

라케이스(laccases)(Boubonnais & paice(1990) FEBS LETTERS 권 267(1), 페이지 99 ~ 102, WO 94 / 29510) 및 티로시나제(tyrosinases)(WO 94/29510), 보결헴분자단(prosthetic heme group)이 산화환원활성중심부로 작용하는 과산화효소의 경우에 비하여, 라케이스 및 티로시나제의 경우의 전자이동은 이들 산화효소('청동'산화효소)의 4개의 대응 동결합영역에 의해 촉매화된다. 4개의 모든 전자는 그 후4-전자이동에서 산소분자로 이동한 매개체에서 연속하여 들어오게 된다. 산소는 물로 환원되며, 산화효소는 새로운 반응순환을 위해 재생된다. 산화될 기질에서 산화효소로 전자이동을 촉매작용하는 얼마간의 매개체가 예로써 특허문헌 WO 94/ 29510, WO 97/06244, WO 96/10079 또는 WO 95/01427에 기재되어 있다.

세탁세제 및 식기세척세제의 표백계로서 석탄액화를 위해(WO 94/29510), 목재펄프표백을 위해(WO 94/29510), 유기합성을 위해(Potthast 외,(1995) J. Org, Chem., 권 60, 페이지 4320 ~ 4321), 데님(denim)표백(WO 96/12846)을 위해, 세척시 염료이동을 방지하기 위해(WO 98/23716) 또는 폴리시클릭 아로마틱 히드로카본을 분류하기 위해(Johannes 외,(1996) Appli Microbiol. Biotechnol., 권 46, 페이지 313 ~ 317), 산화효소 및 산소를 포함한 이들 매개체종속효소산화방법을 사용하는 것은 공지되어 있다.

그러나, 매개체는 산업용 사용에 방해되는 특성을 가지므로, 산화효소를 사용하는 효소산화방법은 중대한 결점을 가진다 :

- WO 94/29510 에 특히 효과적인것으로 기재된 매개체 HBT는 생분해성이 아니다(Amann (1997) 목재 및 펄프화학에 대한 9차 심포지움, F4-1 ~ F4-5).

- 활성형태에 있는 HBT 및 비올루린산(violuric acid) 같은 많은 매개체는 사용한 산화효소를 비활성화한다(Amann (1997) 목재 및 펄프화학에 대한 9차 심포지움). 그러므로, 각 방법에서 많은 효소의 사용이 필요하다.

- 참다운 활성매개체의 그룹은 N-O그룹이 특징이므로 최소한 매개체분자당 1개의 N원자를 함유한다(WO 94/29510). 이에 따라, 유독성 및 생분해성에 관하여N-O 함유화합물의 사용으로 공지된 문제가 생겼다. 또한, 종이제조펄프산업에서 생물학적 폐수정수시스템은 자주 추가 N부하를 처리하지 않는다.

- 예로써, ABTS 등의 얼마의 매개체는 강하게 채색자유래디칼을 형성하므로, 산화될 기질의 바람직하지 않은 탈색을 유도하게 된다.

- 대부분의 매개체는 N 또는 S원자를 함유함에 따라, 제조업자에게는 비교적 비용이 많이 든다.

이와 같은 단점 때문에 오늘날 기질을 산화하는 이러한 시스템의 광범위한 산업적 사용은 제한되고 있다.

Archibald씨와 Roy씨는(Archibald & Roy (1992) Appl. Environ. Microbiol. 권 58, 페이지 1496 ~ 1499) 페놀과 Mn²⁺/Mn³⁺로 구성한 산화환원캐스케이드(redox cascade)는 산화된 산화효소와 기질간의 매개체로서 작용하는 방법을 기재하였다. 말단전자억셉터로서, 시스템은 산소를 사용하며, 사용된 산화효소는 라케이스 (laccase)이다.

라케이스에 의해 산화한 제 1위의 기질은 초기에는 m-히드록시벤존산 또는 m-크레솔 같은 페놀이었다. 피로포스페이트이온 같은 착화제(complexing agents)의 존재하에, Mn²⁺/Mn³⁺의 제 2산화는 산화페놀의 첨가로 일어났다. 이 시스템에서는 비페놀기질이 산화되는 것은 나타나지 않았다. 단지, 라케이스, Mn²⁺및 착화제가 리그닌(lignin)산화에 대해 사용된 시스템에서는, 비목화(delignification)는 발견되지 않았다. 이 매개체종속효소산화시스템은 매개체 대신에 페놀, 착화제 및Mn이온의 혼합물을 사용하여, 페놀매개체의 의무적 사용은 동물학적 이유로 그 방법의 사용을 방해하므로 기타 상기 시스템에 비하여 기술상의 큰 발전을 나타내지 않았다. 또한, >15시간의 긴 반응시간이 이 시스템의 실제적 사용을 방해하였다.

본 발명은 공지의 다성분계의 단점을 갖지 않은 기질의 매개체종속효소산화용 다성분계를 제공하므로 산화될 기질의 전환을 간소화하고, 저비용으로 가능케 하는 것을 목적으로 하였다.

본 발명은 기질의 매개체종속효소촉매산화용 당성분계 및 그 효소촉매산화방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 산화촉매, 산화제 및 매개체의 의해 달성되며, 다음 사항에 의한 것을 특징으로 한다.

a) 산화촉매는 망간산화효소의 그룹에서 선정된다.

b) 산화제는 산소 및 산소화합물로 구성한 그룹에서 선정된다.

c) 매개체는 Mn이온을 함유한 화합물그룹에서 선정된다.

바람직하게, 본 발명의 다성분계는 Mn이온을 복합하는 착화제 그룹에서 선정되는 착화제로 이루어진다.

본 발명에 있어서, 망간산화효소는 망간 또는 망간이온을 직접 산화하며 또, 결과에서 얻은 전자를 산소로 이동하는 망간산화효소로서 이해되는 것이다. 바람직하게 그러한 산화효소는 산소 및 착화제의 존재하에 Mn²⁺를 Mn³⁺로 산화할 수 있다. 산화환원활성촉매그룹으로서 동이온을 함유한 망간산화효소가 바람직하다.

망간산화효소는 예로서 공지된 미생물에서 분리되며, 이를 위해 미생물이 망간산화효소를 형성하는 상태하에서 성장된다.

발명의 조성물에 있어서, 사용한 망간산화효소는 가장 간단한 경우, 완전한 망간산화효소함유 미생물의 세포제조를 효소적으로 또는 화학적으로 분쇄된다. 그러나 또한 망간산화효소함유 배양상징액(culture supernatants) 또는 분리된 망간산화효소를 사용하는 것이 가능하다.

망간산화효소는 예로써, Leptothrix discophora, Bacillus SG-1 및 Pseudomonas sp.(Nealson씨 외, (1989) Beveridge & Doyle(eds.) 금속이온 및 박테리아, John Wiley and sons, Inc., New York, 페이지 383 ~ 411)에 의해 형성되었다. Leptothrix discophora and Bacillus SG-1에서의 망간산화효소를 코딩한 유전자는 유전적으로 동일한 개체군을 이루고, 또 반복되었다(Corstjens씨 외, (1997) Geomicrobiol, 간행물. 권 14, 페이지 91 ~ 108 및 Van Waasbergen 씨 외,(1996)세균한 간행물, 권 178(12), 페이지 3517 ~ 3530). "청동"으로 공지된 동결합시퀀스 및 그들의 망간산화효소활동도를 함유한 단백질의 양 유전자코드는 동의첨가에 의해 증가되었다.

상기 망간산화효소생성미생물 외에, 다른 미생물이 망간산화효소의 소스로서 사용되었다. 그리하여, 망간산화효소가 포자, 예로써 Bacillus SG-1에 모아진 미생물의 경우에는, 분리된 포자가 효소소스로서 본 발명의 방법에 사용되었다.

또, 재조합생산방법에 의해 제조되는 망간산화효소를 사용할 수 있다. 재조합생산방법은 이 경우, 망간산화효소의 유전자코딩을 그 천연생산물에서 분리시킨후, 공지의 방법에 의해 원 효소생산물로서 적합한 생산균주에 도입시키는 모든 방법을 의미한다.

망간이온은 본 발명의 조성물의 매개체로서 작용하며, 이 망간이온은 어떤 산화상태의 방법에도 첨가된다.

산화상태 +2 또는 +3의 망간이온을 사용하는 것이 바람직하다.

산화상태 +2의 망간이 망간황산염 또는 망간염화물의 형태에서 사용되는 것이 바람직하다.

산화상태 +3의 망간은 가용성 망간복합체의 형태에서 사용되는 것이 바람직하며, 이와 같은 망간복합체의 예는 망간/개미산염, 망간/유산염, 망간/수산염 또는 망간/말론산염이 있다.

매개체(예로써, Mn³⁺이온)는 산화될 물질로부터 1개의 전자를 흡수한다. 이것은 물질을 산화하며, Mn이온 자체는 환원된다(예로써, Mn²⁺이온으로). 이 형태에서 Mn이온은 망간산화효소에 흡수된 전자를 운반하여 그것을 그곳에 방출하고, 초기의 산화상태로 재산화시킨다(예로써, Mn³⁺이온으로). 산소는 망간산화효소에 대한 산화제로서 작용하며, 그리하여 말단전자억셉터로 작용하게 된다.

산소는 공지의 화학적 또는 효소적 산소발생시스템에 의해 직접 반응하여 제조되며, 또한 물의 가수분해에 의해 제조되며, 또는 가스상태에서 또는 액체상태에서 직접 사용된다.

바람직하게, 산소는 가스상태에서 또는 액체산소의 형태에서 직접 사용되며,또는 산소함유 가스혼합물, 예로써 공기 등이 사용된다. 특히 바람직하게 산소는 산소함유 가스혼합물, 예로써 공기 등이 도입된다.

바람직하게, 망간산화효소에 의해 Mn²⁺의 직접산화로 형성된 Mn³⁺는 착화제 (complexing agent)의 존재 하에서 작용한다.

적합한 착화제는 Mn³⁺를 복합하므로 안정화 하는 화합물이 바람직하다.

바람직하게, 질소를 함유하지 않은 착화제는 쉽게 생분해성으로 되어 동물학상으로 유해하며, 그와 같은 착화제는 예로써, 개미산염, 유산염, 말론산염, 수산염 등이 있다.

본 발명에 의한 시스템은 공지의 시스템에 비하여 다음과 같은 장점을 가진다 :

- 산화환원효소의 불활성화의 문제는, 산소는 산화제로서 작용하여 말단전자억셉터로서 작용하므로, 예로써 과산화물이 전자억셉터로서 사용될 때 발생하며, 본 발명의 조성물의 경우에는 발생하지 않는다.

- 산화는 기술적으로 간단한 방법으로 또, 충분한 양으로 부가된다.

- 공지된 망간산화효소는 과산화효소 및 망간과산화효소에 비하여 그의 활성도에 대하여 보결분자 단, 예로써 헴그룹(heme group)을 필요로 하지 않는다. 그리하여, 망간산화효소는 문제 없이 산업적 규모로 통상의 제조시스템에서 제조된다.

- 본 발명의 시스템은 N함유 또는 S함유 매개체 또는 채색한 또는 빈약하게생분해성 또는 중독성 매개체를 필요로 하지 않는다. 산화환원활성매개체로서 2개의 산화상태사이에서 바람직하게 산화상태²⁺와³⁺를 교대하는 망간이온만이 작용한다. 이 망간매개체의 불활성화는 예로써, 공지의 매개체의 불활성화에 비하여 화학적 변형에 의하여 일어나지 않는다.

본 발명의 조성물은 가장 변화된 기질을 산화하기 위해 사용되며, Mn이온에 의해 산화되는 기질을 산화하기 위해 사용되는 것이 바람직하다. 특히, 바람직한 것은 Mn³⁺이온에 의해 산화되는 기질을 산화시키기 위해 사용되는 것이다.

본 발명의 다성분계는 목재펄프표백을 위해, 데님(denim)표백을 위해, 폐수처리를 위해, 유기합성을 위해, 세척시 연료이동을 방지하기 위해 또는 폴리사이클릭 아로마틱 히드로카본을 분류하기 위해 세탁세제 및 식기세척세제의 표백계로서 적합하다.

또 다른 가능한 사용은 예로써, 석탄액화이다.

대응방법은 산화효소 및 산소를 사용하여 매개체종속효소산화방법에 대해 종래 방법에 기재되어 있다.

통상의 기술자가 본 명세서에 기재한 구성성분 및 방법의 사용으로 각 공지의 방법을 변경하여 상기 목적을 위해 본 발명의 조성물을 사용하는 것은 용이하다.

또한, 본 발명은 기질을 산화하는 방법에 관한 것이며, 망간산화효소는 산소 및 경우에 따라서는 Mn 이온용 착화제의 존재하에 직접 Mn²⁺산화에 의해 Mn³⁺를 형성하고, 그 Mn³⁺는 기질을 산화한다. 동시에 그 자체는 Mn²⁺로 환원되고, 다시금 망간산화효소에 의해 직접 산화를 위해 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에 있어서, 기질은 수용액, 혼합물 또는 현탁액의 형태로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 반응용략은 리터당 0.001 ~ 50㎎의 활성망간산화효소가 사용되는 것이 바람직하다.

망간산화효소는 용액으로서, 현탁액으로서 또는 지지물로 입상형태(granular form)에서 반응혼합물에 삽입되는 것이 바람직하다.

특히, 바람직한 것은 망간산화효소가 비이온세제에서 효소 0.5 ~ 50wt%으로 이루어진 현탁액의 형태에서 반응혼합물에 삽입되는 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, 산환상태 Mn²⁺또 Mn³⁺의 망간이 산화환원매개체로서 사용되는 것이 바람직하며, 산화상태 2+ 또는 3+의 망간이온은 그 산화상태에서 직접 사용되며, 또는 Mn⁴⁺또 Mn⁷⁺등의 기타 산화상태의 망간이온에서 생성된다.

산화상태 +3의 망간은 망간/개미산염, 망간/유산염, 망간/수산염 또는 망간/말론산 등의 가용성 망간복합체의 형태에서 첨가되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 산화상태 +2의 망간을 사용하는 것이 바람직하며,망간황산염 또는 망간염화물을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 망간이온은 0.005mM ~ 50mM간의 농도에서 사용되며, 망간이온은 0.05mM ~ 5mM간의 농도에서 사용되는 것이 바람직하며, 0.1mM ~ 1mM간의 농도에서 사용되는 것이 특히 바람직하다.

소정의 사용에 따라서는 필요한 망간은 산화될 기질에 이미 존재한다. 일반적으로 외부 망간이온을 첨가할 필요가 없는 본 발명의 방법의 1예는 목재펄프표백이며, 이미 자연적으로 얻어진 목재 및 펄프는 본 발명의 산화방법에 대해 충분히 많은 양의 망간이온을 함유하고 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 산소는 0.05 ~ 5bar의 부분압력에서 사용되는 것이 바람직하며, 0.1 ~ 2.5bar의 부분압력에서 사용되는 것이 특히 바람직하며, 특히 바람직하게는 0.2 ~ 1bar의 부분압력에서 산소가 사용되는 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 착화제는 1mM ~ 500mM의 농도에서 사용되는 것이 바람직하며, 또 바람직하게는 적절한 착화제가 5mM ~ 100mM의 농도에서 사용되는 것이며, 특히 바람직한 것은 10mM ~ 50mM의 농도에서 사용되는 것이다.

본 발명에 의한 산화방법은 Mn³⁺이온에 의해 산화되는 모든 화합물을 산화하기 위해 사용된다. 예로써, 본 발명에 의한 방법은 세택제 및 식기세척제의 산화계로서 종이제조 및 목재펄프생산에서 리그닌(lignin)의 산화를 위해, 세척시 염료이동을 방지하는 시스템으로서 효소염료표백을 위해, 효소직물표백을 위해, 유기합성에서 유기표적분자의 소정 산화를 위해, 산화성 폐기물처리를 위해, 염소화히드로카본을 열화시키기 위해, 폴리시클릭 아로마틱 히드로카본을 분할하기 위해 그리고 석탄을 액화하기 위해 사용된다.

다음의 실시예는 본 발명의 다른 예를 나타낸다.

실시예 1 :

망간산화효소생성 미생물의 분리

1a. 망간산화미생물의 분리 :

망간산화미생물, 특히 곰팡이와 박테리아는 Krumbein & Altmann방법에 의해 인디케이터판(indicator Plate) 위에서 분리되었다(Krumbein & Altmann (1973) Helgolander Wiss. Meeresunters., 권 25, 페이지 347 ~ 356).

산화상태 Mn³⁺~ Mn⁷⁺의 망간이온의 존재 하에, 베르벨린청색(Berbelin blue)은 PH 4 ~7에서 강한 청색을 형성하였으며, 베르벨린청색의 고농도에서 적절한 Mn이온의 존재 하에 청색산화제품을 PH10까지 형성하였다.

판스크리닝을 위하여, 무색의 베르벨린청색(N, N'- 디메틸아미노-P, P'-트리페닐메탄-0' '-설폰산)을 배양기(nutrient media)에 부가하였다. 배양기 100ml 당 베르벨린청색 10^-4~ 10^-5의 밀도에서 박테리아성장의 저해는 발생하지 않았다.

종속영양성 망간산화박테리아를 분리하기 위해, 다음의 매질을 사용하였다 :

3.5g/l 디프코(Difco)-백토(Bacto)-페프톤(Peptone)

0.8 g/l MnSO₄ㆍH₂O

100 mg/l FeSO₄ㆍ7H₂O

15 g/l 디프코-백토-아가(Agar)

750 ml 해수

245 ml 증류수

10 ml 베르벨린청색모액(4g/l)

PH 7.6

해수시료, 침강물시료, 토양시료, 광상의 통양 등의 박테리아함유 시료를 인디케이터판당 100 ~ 300의 각개 군체(colony)가 성장되도록 적절한 희석 또는 농도로 인디케이터판에 사용하였다.

이와 같은 인디케이터판에 5 ~ 10일간 배양후, 청색군체를 형성한 박테리아(즉, 망간산화활동은 세포결합되었음) 또는 군체주위에 청색무리(bloe halo)를 가진 박테리아(즉, 망간산화효소는 배양상징액에 숨겨졌음)를 계속 분석하였다.

1b. 베르벨린(Berbelin)청색산화미생물에서 망간산화효소의 검출

1a에 기재된 것 같이 분리된 미생물은 망간산화효소를 생성하였다. 그러나, 청색채색은 망간과산화효소에 의해 또는 Fe²⁺의 산화에 의해 이루어졌다. 망간산화효소활동의 소정 검출을 Boogerd와 de Vrind씨(Boogerd & de Vrind(1987) J. Bacteriol, 권 169(2), 페이지 489 ~ 494)에 의해 기재된 것 같이 시행하였다 :

먼저, 시험중의 미생물이 한천(agar)이나 베르벨린청색 첨가 없이 분리하기 위해 사용된 1리터의 매질에서 10일간 각각 성장되었다. 그 후, 세포(cell)들을원심분리(15분, 10,000 ×g, 4℃)에 의해 제거하였다. 실시에 1a에서 기재된 것 같이 인디케이터판에 청색군체를 형성한 세포의 경우에는, 세포펠릿(cell pellet)을 다음에 기재된 것 같이 겔전기이동(gel electrophoresis)을 위해 사용하였다. 인디케이트판에 청색무리를 형성한 세포의 경우에는, 세포없는 배양상징액을 입자 > 10000 D의 잔류 용량을 가진 UF막에 그의 초기용량의로 초여과에 의해 농축하였다. 농축물 또는 세포펠릿을 완충제의 동일 용량으로 혼합하였다(0.125M Tris/Cl PH 6.8, 20% 글리세롤, 2% SDS, 10% 2-메르캅토에타놀, 0.01% 브로모페놀청색). 이와 같은 혼합물의 50㎕분취량이 10%폴리아크릴아미드겔에 전기이동적으로 분리되었으며, 전기분리후 겔을 탈이온수로 15분간 4회에 걸쳐서 세척하였다. 그 다음, 겔을 10mM Hepes PH 7.5의 100μM MnCl₂에서 2시간 배양하였다. 전기이동후 망간산화효소가 겔에 국지화 되는 시점의 절차중에 망간산화효소를 함유한 시료에서 망간산화물의 갈색침전물을 형성하였다. 그리하여, 과산화물은 존재하지 않고, Mn²⁺이외의 이온은 혼합물에 존재하지 않으므로, 관찰된 망간산화물의 형성은 매번 Mn²⁺를 직접 산화하는 망간산화효소에 의해 이루어졌다.

실시예 2 :

망간산화효소의 생산 및 분리

2a. 간균으로 된 망간산화효소함유포자

실시예 1에 기재된 방법에 의해 망간산화효소를 그의 포자에 결합한 간균분리균을 분리하였다. 산업적 사용을 위해 이와 같은 망간산화효소함유포자가 직접 사용되거나, 망간산화효소함유포자각(spore coat)이 제조되어 사용되었다. 이와 같은 포자 또는 포자각은 다음과 같이 생성되었다 :

성장 : 망간산화효소함유포자를 생성하기 위해, 적절한 간균스트레인이 다음 매질에서 25℃로 호기성있게 성장되었다 :

2 g/l 페프톤(Difco)

0.5g/l 효모추출물

10㎍/l 세균여과한 MnCl₂×4H₂O, 80% 자연해수의 50mM Tris에서, PH 7.0

10일간의 성장후, >95%의 모든 세포가 포자형성되었다.

포자생성 :

포자는 원심분리(30분, 10 000 ×g, 4℃)에 의해 얻어지고, 탈염수로 세척되고 10mM Tris/Cl PH 7.0에서 현탁되었다. 포자각의 제조를 위해 이 물질을 다음과 같이 계속 처리하였다. 포자를 본 발명의 방법에서 직접 사용되었을 때, 이들 포자를 다음과 같이 계속 처리하였다 :

50㎍/ml의 리소지임(lysozyme)을 현탁액에 첨가하고, 그 혼합물을 37℃에서 30분간 배양한 다음, 포자를 1M NaCl, 0.15M NaCl, 0.1% SDS로 세척하고, 탈염수로 5회 세척하였다. 이와 같은 방법으로 정화된 포자를 본 발명에 의한 방법에 사용될 때까지 탈염수에서 4℃의 온도로 저장하였다.

포자각(spore coat)의 제조 :

모든 절차는 특별한 설명이 없는 한 실온에서 이루어졌다.

1% SDS용액 및 세척에 사용된 탈염수 이외에는, 모든 용액은 10mM EDTA, PH 7.5 및 PMSF(3wt%)를 함유한다.

정화포자를 앞에서 기재한 것 같이 10mM Tris PH 7.0(0.1 g/ml)에서 현탁하였으며 동일 용량의 유리구슬(직경 10 ~ 50㎛)을 첨가하였다. 그 다음, 현탁액을 최대진폭의 초음파세포파열기(Sontifier)로 0℃의 온도에서 30초 간격으로 15분간 처리하였다. 처리후 현탁액을 5분간 얼음에 배양하였다; 그 후, 상징액 (supernatant)을 설정 유리구슬에서 제거하였다. 이어서, 유리구슬을 그 자체의 용량에 대응한 10mM Tris PH 7.0의 용량으로 2회 세척하였다. 첫 상징액과 세척절차에 의한 상징액을 결합하여 15000g에서 15분간 원심분리하였다. 그 다음, 상징액을 제거하였으며, 침전물을 10mM Tris PH 7.5에서 현탁되고 37℃에서 30분간 리소지임(100㎍/ml)(lysozyme)으로 처리하였다. 혼합물을 다시 15000g에서 15분간 원심분리하였으며, 포자각을 함유한 침전물을 1M NaCl, 0.14M NaCl, 1% SDS로 세척하고 탈온수로 5회 세척하였다.

2b. "렙토트릭스 디스코포라"(Leptothrix discophora)로 된 망간산화효소

"렙토트릭스 디스코포라" 같은 껍질형성 유기체(망간산화효소를 생성하는 분리균)는 실시예 1에 기재된 방법에 의해 얻어졌다. 또한, 이와 같은 분리균은 사용스트레인수집(Leptothrix discophora ATCC 51168, Leptothrix discophora ATCC 51169)에서 얻어졌으며, 특히 망간산화효소를 생성하기에 적합한 것은 껍질을 형성하는 능력을 상실한 "렙토트릭스 디스코포라"의 유도체였다. 이와 같은 유도체는 껍질형성 스트레인이 계속적으로 또, 실험실 상태하에서 비교적 장시간에 걸쳐 배양되었을때 동시에 발생하였다(Adams 와 Ghiorse (1986) Arch. Microbiol., 권 145, 페이지 126 ~ 135). 장기간 껍질을 형성하지 않은 그러한 유도체는 배양매질속에 망간산화효소를 숨겨놓았다.

다음의 실시예에는 더이상 껍질을 형성하지 않았으며, 번호 DSMZ 12667하에 (Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Brunswick, 독일) DSMZ 독일집회의 부다베스트 계약에 따라 맞겨진 "렙토트릭스 디스코포라" 유도체의 배양상징액(culture supernatant)의 내외에서 망간산화효소의 생성 및 분리에 대한 것을 기재하였다 :

배양 :

망간산화효소를 생성하기 위해 "렙토트릭스 디스코포라"를 다음 성분을 함유한 매질에 배양하였다 :

0.25 g/l Difco-Peptone

0.25 g/l Difco 효모추출물

0.25 g/l 글루코스

0.6 g/l MgSO₄ㆍ7H₂O

0.07 g/l CaCl₂ㆍ2H₂O

0.015 MgSO₄ㆍH₂0

탈이온수의 리터당.

매질을 고압살균전에 1M NaOH의 PH치를 PH7.6로 설정하였다.

망간산화효소를 생산하기 위해, 상기 매질 45리터를 "렙토트릭스 디스코포라" 예비배양 2리터와 동일 매질에 접종하였으며, 배양을 26℃의 온도에서 40시간동안 공기혼입(단위용량매질 및 분당 0.2용량)으로 실시하였다.

배양상징액으로 효소생성 :

40시간후에 배양을 완료하였으며, "렙토트릭스 디스코포라"의 세포를 원심분리에 의해 배양상징액에서 분리하였다. 무세포의 망간산화효소함유 배양상징액을 입자 > 10000의 잔류 용량을 가진 UF막에 원심분리에 의해 0.5리터로 농축하였다. 농축배양상징액을 다음 실시예의 망간산화효소원으로 사용하였다.

실시예 3 :

N, N, N', n'-테트라메틸-p-페닐네디아민을 사용한 망간산화효소의 활성도의 양적결정

Mn³⁺이온으로 무색화합물 TMPD를 산화할 수 있었으며, 산화제품 'Wuster blue'는 강한 청색을 가졌으며, 이 색채의 증가로 광도 측정에 따라 파장 610nm이 달성되었다.

절차 :

증류수에서 2.1mM의 TMPD모액을 각 측정전에 새로이 제조하였다. 분석될 효소제조품을 다음에 설명될 활동성의 분석에서 0.5 ~ 1.5간의 OD 610이 분석 10분 후에 측정되도록 10mM HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2에탄설폰산 PH 7.5)에서 희석하였다.

사용된 망간소스는 증류수에 있는 10mM MnSO₄의 용액이었다.

효소시료의 망간산화효소활동성을 결정하기 위해, 동시에 HEPES(상기 참조)에 있는 효소희석물의 분취량 3ml를 TMPD모액 0.3ml와 혼합하였다. 각각의 동시평가용액에 0분 시점에서 MnSO₄모액을 첨가하였다. 양 시료를 혼합하고 40℃에서 10분간 배양하였다. 10분후에 시료는 간단히 원심분리되고(15초 ; 5000rpm), 이어서 OD 610가 각 MnSO₄함유 상징액 1ml로 결정되었으며, 사용된 기준은 MnSO₄없는 비교시료였다. 1.0만큼 610nm로 흡수의 증가는 'Wuster blue' 100㎛의 형성과 일치하였다. 망간산화효소의 1단위(1U)는 1분의 TMPD에서 1μM의 'Wuster blue'의 형성으로 유소하는 효소의 양으로서 구성된다.

그후의 평가에 대해, 매번 실시예 2b에서의 농축망간산화효소함유 배양상징액과 실시예 2a에서의 포자각현탁액 50㎕를 사용하였으며, 다음과 같은 결과를 얻었다 :

으로 된 효소	OD 610
렙토트릭스디스코포라간균	1.030.85

실시예 4 :

망간농도와 착화제를 변화시키는 작용으로써 균질하게 사용가능한 기질베라트릴알코올의 산화에타놀에서 기질베라트릴알코올 0.25 g/ml(3,4-디메톡시벤질알코올(Aldrich))의 모액을 제조하였다.

산화반응은 45℃의 온도에서 온건한 교반에 의해 실시되었으며, 이 반응을 위해 MnSO₄가 착화제(50mM개미산염, 유산염, 말린산염 또는 수산염 각각의 경우 PH 7.5)를 함유한 용액 22.23ml에 각각의 경우 첨가되었으며, 이어서, 베라트릴알코올모액 0.268ml를 각각의 경우 첨가하였다.

혼합물은 45℃에서 10분간 평형되었으며, 그 다음 반응은 효소용액 2.5ml(렙토트릭스 디스코포라로 된 망간산화효소, 10U/ml)를 첨가하여 개시되었다. 8시간후에 반응은 베라트릴알데히드의 형성에 대한 HPLC분석에 의해 조사되었으며, 이것을 위해 H₂SO₄용액 0.4ml(0.5mol/l)를 분석용액 0.8ml에 첨가하였다. 이 시료 20㎕가 리코스퍼(Lichosper) 60RP 선택 B분리컬럼(Merck 50940)에 사용되고, H₂O/MeOH 혼합물(65:35)로 용리(elute)되었으며, 흐름속도는 1ml/분 이었다. 요출액 (eluate)에 있는 생성물을 UV검출기에 의해 275nm에서 검출하였다.

다음 표는 본 발명의 방법에 기재한 상태에서 8시간에 베라트릴알데히드에 산화베라트릴알코올의 양을 %로 나타내고 있다.

착화제	MnSO4[mM]	Mn산화효소없음[% 베라트릴알데히드]	렙토트릭스 디스코포라로 된 Mn산화효소있음[% 베라트릴알데히드]
50mM 개미산염	0	0.00	0.00
50mM 개미산염	0.05	0.01	7.24
50mM 개미산염	0.5	0.00	12.46
50mM 유산염	0	0.00	0.00
50mM 유산염	0.05	0.00	3.32
50mM 유산염	0.5	0.02	2.79
50mM 말린산염	0	0.00	0.00
50mM 말린산염	0.05	0.03	14.23
50mM 말린산염	0.5	0.02	22.96
50mM 수산염	0	0.00	0.00
50mM 수산염	0.05	0.06	17.30
50mM 수산염	0.5	0.07	21.44

실시예 5 :

목재펄프표백

카파(kappa) 16.5의 리그닌함량을 가진 산소-비목질화(oxygen-delignified)된 연한나무 크라프트펄프를 세척하고 Na수산염완충제 30mM(PH 7.5)를 가진 5%의 펄프밀도로 하였으며, 이어서, MgSO₄(0.5mM)를 첨가하였다. 현탁액을 적절한 교반기를 사용하여 60초간 동질화하였다. 그 다음, 2개의 별렬용액에 각각의 경우 펄프 g당 망간산화효소 5U(렙토트릭스, 간균)를 첨가하였으며, 효소 없는 제 3용액을 조절용으로 사용하였다. 용액은 다시 60초간 동질화되고, 가스삽입을 허용한 조절온도강철가압용기에 삽입하였다. 가압용기를 밀봉하고 3bar의 산소압력을 인가하고, 그 가압용기를 4시간 항온처리하였다. 이어서, 반응액을 방출하고, 펄프를 5-%에서 45℃에서 10Vol. 의 유수로 세척하고, 이어서 리그닌조각을 70℃에서 NaOH수용액을 사용하여 알칼리성 상태하에 펄프에서 추출하였다. NaOH 20g를 추출하기 위해 펄프 kg마다 사용하였으며, 추출후에는 펄프를 다시 50℃에서 10 Vol. 의 유수로 세척하였다. 펄프시료의 리그닌함량은 "스칸디나이바의 펄프ㆍ지류청"의 표준화시험방법 SCAN-C 1:77에 의해 카파치를 통하여 최종으로 결정되었다 :

효소	카파치	비목질화 %
효소없이 조절	15.2	7.9
렙토트릭스 디스코포라	13.4	18.8
간균 포자각	10.7	35.1

조절시료와 비교하여 본 발명의 산화방법이 사용될 때에는 10.9 ~ 27.2%의 추가비목질화를 달성하였다.

실시예 6 :

염료이동의 억제

본 발명의 산화계에 의한 염료이동의 억제를 나타내기 위한 실험을 가열가능한 글라스비커(100ml 용량)로 실시하였다. 상용세제 0.25g이 물 50ml에 용해된 용액이 조절용으로 사용되었다. 망간산화효소의 실험이 0.5mM MnSO₄를 함유한 30mM Na 말론산염 완충제의 50ml로 실시되었다. 먼저, 50ml 평가액을 45℃로 가열한 다음에, 0.5U/ml의 망간산화효소를 각각의 경우 완충제액에 적절하게 첨가하였다.

면직물시료(매번 5g)를 분석액에 첨가하였으며, 그 다음에 45℃로 사전 가열된 15μM Cibacron Marine C-B의 용액 10ml를 각 분석액에 시험염료로서 첨가하였다.

45℃에서 1시간 배양후, 직물시료를 분석액에서 제거하고 55℃에서 1리터의 유수로 세척하였다. 이어서, 직물시료를 세척하고 건조시켰다. 다음에는, 초기시료 및 처리시료의 밝기를 분광학적으로 결정하였다 :

표에서 처리면시료를 비처리시료와 비교하였다.

효소	말론산염 완충제/MnCl2	물/세제
없음	73.3%	89%
렙토트릭스 디스코포라	89.2%	-
간균	92%	-

표에 나타낸 치는 본 발명의 산화계는 면시료에 첨가염료의 이동을 방지하기에 적합한 것을 나타내고 있다. 그 효과는 질적으로 상용세제로 얻을 수 있는 효과에 비교되었다.

실시예 7 :

오염표백(세탁세제사용)

본 발명의 방법에 의한 오염표백작용을 나타내기 위하여, 세척실험을 행하였으며, 이것을 위하여 표준화 소일링(standardized soiling)을 백면시료(7.5㎝ ×7.5㎝)에 각각의 경우 100ppm의 이반청색(Evan's blue)(일본, 오사카게 있는 Wako Pure Chemical 시료에서 얻을 수 있음)의 0.3ml 수용액을 적가하여 생성하였다. 그 다음에, 이 직물시료를 본 발명에 따라 망간산화효소, MnSO₄및 적절한 착화제로 가열글라스비커(100ml 용량)에서 산소 존재하에 교반하여(자석교반기) 처리하였다.

a) 다만 말론산염완충제를 사용않은, b) MnSO₄를 첨가않은, 또는 c) 망간산화효소를 첨가 않은 분석액을 조절용으로 사용하였다 :

실험을 0.5mM MnSO₄가 있는 또는 없는 30mM Na 말론산염완충제(PH 7.5) 50ml에서 실시하였다. 먼저, 50ml 시험액을 45℃에 가열한 다음에 간균(Bacillus) 또는 렙토트릭스(Leptothrix)로 된 망간산화효소 1U/ml를 망간산화효소를 함유한 각 시험액에 첨가하였다. 소일링면시료를 시험액에 첨가하였다. 45℃에서 1시간 배양 후, 직물시료를 시험액에서 제거하고, 각각의 경우 50℃에서 1리터의 유수로 세척하였다. 그 다음에, 직물시료를 건조하였다.

망간산화효소와 MnSO₄가 없는 조절시료와 비교하여 시료의 색차이를 결정하기 위해, 공기건조된 면시료의 x, y 및 z치를 색차계(CR-200, 미놀타)를 사용하여 측정하였다. 본 발명의 방법의 표백효과를 평가하기 위해 Z치(Z=(1-x-y)Y/y)를 그 결과치에서 결정하였다.

표에는 효소 및 MnSO₄를 함유않은 조절용 백색과 비교하여 측정시료의 백색이 표시되어 있다 :

	+ MnSO4	-MnSO4
간균	2.7	-0.3
렙토트릭스	1.6	0.1
무효소	0.2	0.0

표에서 알 수 있는 것은 망간산화효소와 MnSO₄를 함유한 시료의 백색이 효소와 MnSO₄를 함유않은 시료와 비교하여 1.6 ~ 2.7점 간에서 증가된 것이다.

실시예 8 :

유기합성

다음의 실시예는 본 발명의 방법이 유기물질의 표적합성에 적합함을 나타낸다.

a) 알데히드에로의 알코올기의 산화

에타놀 1ml에 있는 3,4-디메톡시벤젤알코올 269mg(1.6mmol)를 0.5mM MnSO₄를 함유한 30mM 말론산염용액 22ml(PH 7.5)에 45℃에서 첨가하였다. 10분간 배양후에 망간산화효소(40U)를 첨가하고, 24시간의 반응후 반응액을 클로로포름(chloroform)으로 석출하고, NMR분광법에 의해 조사하였다.

렙토트릭스로 된 망간산화효소의 경우에, 수율은 3,4-디메톡시벤즈알데히드 32%였으며, 간균으로 된 망간산화효소의 경우에는 수율은 2,4-디메톡시벤즈알데히드 27%였다.

b) 케토에로의 알코올의 산화

1-페닐에타놀 196mg(1.6mmol)를 45℃에서 MnSO₄를 함유한 30mM 말론산염용액 (PH 7.5) 22ml에 첨가하고, 10분간의 배양후 망간산화효소(40U)를 첨가하였다. 24시간의 반응후에 반응액은 HPLC에 의해 조사되었다. 렙토트릭스로 된 망간산화효소의 경우에 수율은 아세토페논 17%였으며, 간균으로 된 망간산화효소의 경우에는 수율은 아세토페논 19%였다.

양 실시예에 있어서, 본 발명에 의한 산화방법이 구성물질의 합성에 대해 계속하여 사용되었으며, 사용된 물질은 다만 모범적 방법으로 그 방법의 산화용량을 나타내기 위한 것이며, 합성제품의 영역을 제한하는 것이 아니다.

실시예 9 :

데님(Denim)표백

정4각형으로 절삭된 염색데님구조물의 조각을 망간산화효소, 0.2mM MnSO₄및 15mM 착화제(수산염)와 함께 45℃에서 11.5ml의 총유체용량에 있는 밀폐된 500ml비커에서 배양하였다. 시험액의 PH는 7.0(15mM 유산염)였으며, 10U의 망간산호효소를 직물 g당 첨가하였다.

4시간의 배양후, 직물조각을 세척수가 무색으로 될 때까지 유수로 세척하였다. 이어서, 직물조각을 시트드라이어로 건조하고 압축한 후 적절한 분광측정기를 사용하여 광학적으로 평가하였다.

표백도는 제조업자의 지시에 따라 CM3700d 분광측정기를 사용하여 결정되었으며, 측정은 광택없이 또, UV없이 이루어졌다. 시료의 밝기는 백색표준(R 457)과 비교하여 총반사의 %로서 결정되었으며, L*은 밝기의 측도이다(백색 = 100 ; 흑색 = 0).

처리직물의 명도를 비처리기준직물의 명도와 비교하였으며, 비처리제어물과 비교하여 시료의 밝기변화(△L*)를 소프트웨어 PP2000(Opticontrol)을 사용하여 계산하였다.

	△L*
제어물	0
렙토트릭스	23.14
간균	28.72

밝기(△L*) 5의 변화는 육안으로 볼 수 있었으며, 즉 중요한 표백작용이 양 망간산화효소로 달성되었다고 말할수 있다.

본 방법을 이용하므로 공지의 다성분계의 단점을 극복하여 산화될 기질의 변환을 간소하게 하며 저비용으로 다성분계를 달성할 수가 있다.

Claims (10)

1. 산화촉매, 산화제 및 매개체로 이루어진 매개체종속효소산화용 다성분계에 있어서,

   a) 산화촉매는 망간산화효소의 그룹에서 선정되며,

   b) 산화제는 산소 및 산소화합물로 이루어진 그룹에서 선정되며,

   c) 매개체는 Mn이온을 함유한 화합물의 그룹에서 선정됨을 특징으로 하는 다성분계.
2. 제 1항에 있어서, Mn이온을 복합한 착화제의 그룹에서 선정된 착화제를 추가적으로 함유함을 특징으로 하는 다성분계.
3. 제 1항에 있어서, 매개체는 Mn²⁺또는 Mn³⁺이온임을 특징으로 하는 다성분계.
4. 제 2항에 있어서, 착화제는 질소를 함유하지 않으며, 쉽게 미생물로 분해 가능하며 동물학적으로 무해임을 특징으로 하는 다성분계.
5. 제 1항에 있어서, 산소는 직접가스형태에서 또는 액체산소형태에서 또는 산소함유가스혼합물로서 존재함을 특징으로 하는 다성분계.
6. 기질을 산화하는 방법에 있어서, 산소존재하의 망간산화효소 및 필요할 경우, Mn이온의 착화제는 직접 Mn²⁺산화에 의해 Mn³⁺를 형성하며, M³⁺이온은 기질을 산화하여 그 자신은 Mn²⁺로 환원되어 다시금, 망간산화효소에 의해 직접산화에 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 기질산화방법.
7. 제 6항에 있어서, 기질은 수용액의 형태, 혼합물 또는 현탁액의 형태에서 사용되는 것을 특징으로 하는 기질산화방법.
8. 제 6항에 있어서, 망간이온은 0.005mM ~ 50mM간의 농도에서 사용되는 것을 특징으로 하는 기질산화방법.
9. 제 6항에 있어서, 0.05 ~ 5bar의 부분압력을 가진 산소가 사용되는 것을 특징으로 하는 기질산화방법.
10. 제 6항에 있어서, 착화제는 1mM ~ 500mM간의 농도에서 사용되는 것을 특징으로 하는 기질산화방법.