UA68421C2 - Multi-component system for enzymatic oxidation of substrates and method of enzymatic oxidation - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується багатокомпонентної системи для опосередковуваного медіатором 2 ферментативного окиснювання субстратів, а також способу ферментативного окиснювання.

Багатокомпонентні системи для опосередковуваного медіатором ферментативного окиснювання субстратів, а також відповідні способи загалом відомі. У даному випадку як медіатори здебільшого застосовують такі сполуки, що їх можна окиснити оксидоредуктазами, тобто насамперед субстрати ферментативних каталізаторів окиснення. Основна відмінність таких медіаторів полягає в тому, що окиснена форма медіатора (активований медіатор, наприклад, радикал медіатора чи катіон медіатора) має досить тривалий час життя для того, щоб після взаємодії з оксидоредуктазою дифундувати в субстрат власне окисної системи і вступити у взаємодію з ним. При взаємодії активованого медіатора із субстратом останній окиснюється медіатором. У результаті окиснювання субстрату медіатор може або регенеруватися (каталітична окисна система), або інактивуватися (стехіометрична окисна система). Якщо медіатор регенерується, то його можна використати в новому циклі 19 каталізу. Електрони, які медіатор переносить від субстрату на оксидоредуктазу, передаються, як і в прямому ферментативному методі окиснювання, на кінцеві акцептори електронів, такі як кисень чи пероксид.

У методах, у яких кінцевим акцептором електронів виступає пероксид (ввідний безпосередньо чи вивільнюваний з попередників), як оксидоредуктази можуть використовуватися тільки пероксидази. Незважаючи на популярність цілого ряду таких методів, усім їм притаманні численні вади.

Технологія одержання пероксидаз надто дорога для того, щоб їх можна було б використовувати в різних процесах, таких як вибілювання паперу або в мийних засобах. Крім того, збільшення кількості пероксидаз є проблематичним, оскільки в концентраціях, потрібних для ефективного здійснення процесу, пероксид діє як інактиватор на пероксидазу. Багато описаних як медіатори пероксидаз є не придатними з технічного погляду, оскільки вони мають інтенсивне забарвлення, не безпечні в токсикологічному чи екотоксикологічному плані, не с 29 піддаються зовсім або лише слабко піддаються біологічному розкладанню і їх не можна одержати в достатніх Ге) кількостях чи досить дешевим методом. Тому методи, у яких як кінцевий акцептор електронів виступає пероксид, дотепер були не придатні для рентабельного промислового застосування.

У методах, у яких як кінцевий акцептор електронів, що надходять з окисненого субстрату, виступає кисень, як оксидоредуктази використовуються оксидази. Описано дві групи оксидаз, що можуть застосовуватися в -- опосередковуваному медіатором ферментативному методі окиснювання, а саме лакази (Вопироппаїз і Раїсе, с

ЕРЕВ5 ГЕТТЕК5, том 267(1), стор.99-102 (1990), МУМО 94/29510) і тирозинази (МУО 94/29510). На відміну від пероксидаз, у яких як активний окиснювально-відновний центр виступає простетична гемовмісна група, у М випадку лаказ і тирозиназ перенос електронів каталізується за допомогою чотирьох іонів міді, що містяться у с відповідних чотирьох єднальних для міді доменах цих оксидаз (оксидази "голубої міді"). При цьому від

Зо медіатора відбираються один за іншим загалом чотири електрони, які потім переносяться за допомогою о чотирьохелектронного переносу на молекули кисню. При цьому кисень відновлюється з утворенням води, а оксидаза регенерується і може використовуватися в новому реакційному циклі. Ряд медіаторів, які каталізують перенос електронів від окиснюваного субстрату на оксидази, описано наприклад, у УУО 94/29510, УМО 97/06244, «

УМО 96/10079 або УМО 95/01426. З 50 Відомо, що такі опосередковувані медіатором ферментативні методи окиснювання з використанням оксидаз і с кисню застосовують для зрідження вугілля (МУО 94/29510), для вибілювання целюлози (МО 94/29510), при

Із» органічному синтезі (РокНаві і ін., У. Огд. Спет,, том 60, стор.4320-4321 (1995)), як систему вибілювання в мийних засобах і засобах для миття посуду (МО 97/06244), для вибілювання джинсової тканини (УУО 96/12846), для запобігання повторному фарбуванню при пранні (М/О 98/23716) або для розкладання поліциклічних ароматичних вуглеводнів (опаппевз і ін., Аррі. Місгобіої!, Віогеснпої., том 46, стор.313-317 (1996)). б Оскільки, однак, медіатори мають властивості, що суперечать умовами технічного застосування, о ферментативні методи окиснювання, які базуються на застосуванні оксидаз, мають ряд серйозних вад, а саме: - гідроксибензотриазол (ГБТ), описаний у МО 94/29510 як найбільш ефективний медіатор, не є біологічно шк розкладаними (Атапп, 9-й Міжнародний симпозіум з хімії лісоматеріалів і технічної целюлози (Іпі. Зутр, оп

Ма 70 М/оодй апа Риїр. Спет.), Е4-1 - Е4-5 (1997); - багато медіаторів, такі як ГБТ і віолурова кислота, у своїй активній формі інактивуют застосовувані та оксидази (Атапп, 9-й Міжнародний симпозіум з хімії лісоматеріалів і технічної целюлози (Іпі. Зутр. оп Ууосй апа Риїр. Спет.)5 4-1 -Р4-5 (1997)), і тому при використанні відповідного методу має місце велика витрата ферменту; 29 - одна з груп медіаторів, що володіють дуже високою активністю, відрізняється наявністю групи М-О- і при

ГФ) цьому містить принаймні один атом М на молекулу медіатора (МО 94/29510). Тому при застосуванні сполук, що юю містять групу М-О-, виникають відомі проблеми, пов'язані з токсичністю і біологічною розкладаністю. Крім того, біологічні системи очищення стічних вод у целюлозній промисловості часто не пристосовані для переробки додаткових М-вмісних продуктів; бо - деякі медіатори, такі, наприклад, як АВТ5, утворюють радикали інтенсивного забарвлення, що спричиняє небажане забарвлення окиснюваного субстрату; - більшість медіаторів містять М- чи 5-атоми, і тому їх одержання є відносно дорогим.

Ці вади в даний час обмежують широке промислове застосування таких систем для окиснювання субстратів.

В Агспіраїй і Коу (Агспіраій і Коу, Аррі. Епмігоп. Місгоріої, том 58, стор, 1496-1499 (1992)) описаний бо метод, відповідно до якого як медіатор для взаємодії оксидази із субстратом, що окиснюється, виступає окиснювально-відновний каскад, що складається з фенолів і Мп хАМпО-ж, Як кінцевий акцептор електронів використовується система кисню. Як оксидаза використовується лаказа. Спочатку лаказа окиснює феноли, такі як мета-гідроксибензойна чи кислота мета-крезол, які виступають первинним субстратом. Потім у присутності Комплексоутворювальної речовини, такої як іони пірофосфату, за участю окиснених фенолів може відбуватися вторинне окиснювання Мп о?" до Мп". Однак при цьому не говориться, що для такої системи можуть використовуватися і нефенольні субстрати. Крім цього не існує ніяких підтверджень, що за допомогою системи, у якій для окиснювання лігніну використовуються тільки лаказа, Мп 2" і комплексоутворювальна речовина, можна здійснювати делігніфікацію. Ця опосередковувана медіатором система ферментативного окиснювання не має 70 істотної технічної переваги стосовно інших згаданих систем, оскільки як медіатори використовуються тільки комбінації з фенолів, комплексоутворювальних речовин і іонів Мп, а потреба застосовувати фенольні медіатори перешкоджає застосуванню цього методу з токсикологічних причин. Крім того, практичне застосування цієї системи утруднено також тривалим часом реакції, що становить понад 15год.

Виходячи з вищевикладеного, в основу даного винаходу було покладено завдання розробити багатокомпонентну систему для опосередковуваного медіатором ферментативного окиснювання субстратів, що не мала б вад, властивих відомим багатокомпонентним системам, і яка, крім того, допускала б просту і дешеву переробку окиснюваного субстрату.

Це завдання вирішується за допомогою багатокомпонентної системи, що включає каталізатор окиснювання, окиснювач і медіатор, який відрізняється тим, що а) каталізатор окиснювання вибирають із групи марганцевих оксидаз, б) окиснювач вибирають із групи, що включає кисень і кисневмісні сполуки, в) медіатор вибирають із групи сполук, що містять іони марганцю.

Багатокомпонентна система за винаходом оптимально включає комплексоутворювальну речовину, вибрану з групи комплексоутворювальних речовин, що можуть утворювати комплекси з іонами Мп. с

У контексті даного винаходу під марганцевими оксидазами розуміють такі оксидази, які безпосередньо о окиснюють Мп або іони Мп і акцептовані при цьому електрони переносять на кисень. Оптимально застосовують такі оксидази, що мають здатність у присутності кисню і комплексоутворювальних речовин окисняти Мп?" до

Мп», Кращими є марганцеві оксидази, що як окиснювально-відновну каталітичну групу містять іони міді.

Марганцеві оксидази можна одержати, наприклад, з відомих мікроорганізмів. Для цього такі мікроорганізми - культивують в умовах, у яких вони продукують марганцеві оксидази. У композиції за винаходом як марганцеві Ге! оксидази в найпростішому випадку можуть застосовуватися клітинні препарати, отримані механічним, ферментативним чи хімічним шляхом з повних мікроорганізмів, які містять марганцеві оксидази. Однак можна т також застосовувати вмисну марганцеву оксидазу надосадову рідину культури або виділені марганцеві с оксидази.

Зо Марганцеві оксидази можуть продукуватися, наприклад, такими мікроорганізмами, як І еріоїйгіх аізсорпога, іш

Васійнв 5О-1 і Рвепдотопаз зр. (Меаізоп і ін., МейаіІ іопв апа бБасіегіа, стор.383-341, за ред. Вемегідде і

Боуїе, вид-во Ддопп УМПеу апа Бопв, Іпс., Мем/ ХогКк (1989)). Гени, що кодують марганцеві оксидази з І еріоїйгіх дівсорпога і Васій5 505-1, було клоновано і секвеновано (СогеЦепе і ін., СеотісгобріоЇ. доцгпаЇї, том 14, « стор.91-108 (1997) і мап МУаазрегдеп і ін., доигпа! ої Васіегіоїоду, тім 178(12), стор. 3517-3530 (1996). З7З 70 Обидва гени кодують протеїни, що містять присутню в оксидазах "голубої міді" єднальну для міді послідовність с мотиву, і їхня активність як марганцевих оксидаз підсилюють додаванням міді. "з Поряд зі згаданими мікроорганізмами-продуцентами марганцевих оксидаз, як джерело марганцевих оксидаз також можуть застосовуватися й інші мікроорганізми. Так, наприклад, як джерело ферментів у способі за винаходом можуть застосовуватися мікроорганізми, у яких марганцеві оксидази відкладаються в спори, такі як, наприклад, Васійив 50-1, а також виділені спори.

Ф Крім того, можуть застосовуватися марганцеві оксидази, одержувані рекомбінантним методом. Під (ос рекомбінантним методом одержання слід розуміти будь-які методи, за допомогою яких гени, що кодують марганцеві оксидази, виділяють із природних продуцентів і потім за допомогою відомих методів умонтовують у т відповідні продукувальні штами, що, зокрема, можуть являти собою також і вихідні продуценти ферментів. ко 50 У композиції за винаходом медіатором виступають іони марганцю. їх можна використовувати в процесі з щк будь-яким ступенем окиснювання.

Оптимально застосовують іони марганцю зі ступенем окиснювання 2 чи 3.

Марганець зі ступенем окиснювання 42 оптимально застосовують у вигляді сульфату марганцю чи хлориду марганцю. 59 Марганець зі ступенем окиснювання 3 оптимально застосовують у формі розчинного марганцевмісного

ГФ) комплексу. Прикладами такого марганцевмісного комплексу є марганець/форміат, марганець/лактат, юю марганець/оксалат або марганець/малонат.

Медіатор (наприклад, іон Мп") акцептує електрон в окиснюваній субстанції. У результаті цього субстанція бо окиснюється, а сам іон МН відновлюється (наприклад, до іона Мп 27). У цій формі іон Мп переносить акцептований електрон на марганцеву оксидазу, віддає його і знову окиснюється до вихідного ступеня окиснення (наприклад, до іона Мп"). Для марганцевої оксидази окиснювачем виступає кисень, який водночас є кінцевим акцептором електронів.

Кисень може утворюватися безпосередньо в ході реакції за допомогою відомих хімічних чи ферментативної бБ систем, які виробляють кисень. Він може утворитися також у результаті електрогідролізу води або його можна додавати в середовище безпосередньо в газоподібній чи рідкій формі. Оптимально кисень використовують або безпосередньо в газоподібній формі, або в зрідженому стані, або у вигляді кисневмісної газової суміші, наприклад повітря. Особливо бажано вводити кисень у формі кисневмісної газової суміші, такої як повітря.

Безпосереднє окиснювання марганцевою оксидазою Мп" до Мп?" оптимально здійснюють у присутності Комплексоутворювальної речовини.

Як комплексоутворювальні речовини оптимально застосовують такі сполуки, що утворюють комплекси з МпУ" і в результаті цього набувають стабільності. Оптимально застосовують комплексоутворювальні речовини, що не містять азоту, легко піддаються біологічному розкладанню і токсикологічно безпечні. Такими комплексоутворювальними речовинами є, наприклад, форміат, лактат, малонат чи оксалат.

Система за винаходом володіє в порівнянні з відомими системами такими перевагами: - при використанні композиції за винаходом не виникає проблема, пов'язана з інактивацією оксидоредуктаз, як це має місце, наприклад, при використанні пероксиду як акцептора електронів, оскільки в даному випадку окиснювачем і кінцевим акцептором електронів є кисень; - додавання кисню в достатніх кількостях є технологічно простою операцією; - марганцеві оксидази на відміну від пероксидаз, а також марганцевих пероксидаз не вимагають для своєї активації присутності простетичних груп, таких як гемовмісні групи. Тому марганцеві оксидази можна одержати без труднощів у промисловому масштабі за допомогою звичайних промислових систем; - система за винаходом не вимагає використання М- чи 5-вмісних чи пофарбованих або погано піддаваних біологічному розкладанню, або токсично не безпечних медіаторів. Окиснювально-відновним медіатором виступають лише іони марганцю, що змінюють два ступені окиснювання, оптимально ступені окиснювання 12 і т-3. На відміну від інактивації відомих медіаторів, наприклад, у результаті хімічної реакції, не відбувається інактивації цього марганцевого медіатора.

Композиція за винаходом дозволяє здійснювати окиснювання різних субстратів. Оптимально її слід застосовувати для окиснювання таких субстратів, які можуть окиснятися іонами Мп. Особливо бажано її слід Га застосовувати для окиснювання таких субстратів, що можуть окиснятися іонами Мп". о

Багатокомпонентна система за винаходом може використовуватися, наприклад, як вибілювальна система в мийних засобах і засобах для миття посуду, для вибілювання целюлози, для вибілювання джинсової тканини, для обробки стічних вод, в органічному синтезі, для запобігання повторному забарвлення при пранні або для розкладання поліциклічних ароматичних вуглеводнів. Ще однією можливістю застосування є, наприклад, «- Зрідження вугілля. Відповідні методи описано в рівні техніки для опосередковуваних медіаторами ферментативних методів окиснювання з використанням оксидаз і кисню. с

Фахівець лего може модифікувати відомий метод з використанням поданих у даному описі компонентів і Й умов здійснення процесу, щоб пропоновану композицію можна було застосовувати в зазначених вище цілях.

Крім того, даний винахід стосується способу окиснювання субстрату, який відрізняється тим, що марганцева со оксидаза в присутності кисню і в разі потреби комплексоутворювальної речовини, здатної утворювати комплексз «(о іонами Мп, утворює Мп?" шляхом безпосереднього окиснювання Мп 2", іон Мп?" окиснює субстрат, при цьому він сам відновлюється до Мп?" і знову може використовуватися для безпосереднього окиснювання марганцевою оксидазою. «

У способі за винаходом субстрат оптимально застосовують у формі водного розчину, суміші або суспензії.

У способі за винаходом оптимально застосовують від 0,001 до 5Омг активної марганцевої оксидази на літр о) с об'єму реакційної суміші "» Марганцеву оксидазу оптимально вносять у реакційну суміш у формі гранул, у формі розчину, у формі " суспензії або в поєднанні з носієм.

Особливо бажано марганцеву оксидазу вносити в реакційну суміш у формі суспензії, що містить від 0,5 до БОмас.95 ферменту в неіоногенній поверхнево-активній речовині. іа У способі за винаходом як оксинювально-відновний медіатор оптимально застосовують марганець зі (ее) ступенями окиснювання Мп?" чи Мп". Іони марганцю зі ступенем окиснювання 2-- чи З можна застосовувати безпосередньо у формі іонів з таким ступенем окиснювання, або їх можна одержати в процесі реакції з іонів ь марганцю з іншими ступенями окиснювання, такими як Мп?" чи Мп". ко 20 Марганець зі ступенем окиснювання ї-3 оптимально додають у реакційну суміш у формі розчинного щк марганцевмісного комплексу, такого як марганець/форміат, марганець/лактат, марганець/оксалат або марганець/малонат.

У способі за винаходом оптимально застосовують марганець зі ступенем окиснювання 2. Особливо бажано застосовувати сульфат марганцю або хлорид марганцю.

У способі за винаходом застосовують іони марганцю в концентраціях від О0005ММ до 50мММ. Оптимально

ГФ) застосовують іони марганцю в концентраціях від 0,05мММ до 5мМ і найоптимальніше в концентраціях від О01ММ 7 до 1ММ

Залежно від конкретного застосування потрібний марганець може вже міститися в окиснюваному субстраті. во Прикладом можливого застосування способу за винаходом, у якому, як правило, не потрібно додавати іонів марганцю ззовні, є вибілювання целюлози. Деревина й одержувана з неї целюлоза часто вже в природному стані містять іони марганцю в кількості, достатній для здійснення способу окиснювання за винаходом.

У способі за винаходом кисець оптимально додають при парціальному тиску 0,05-5бар. Особливо бажано кисень додавати при парціальному тиску 0,1-2,5бар. Найоптимальніше кисень додають при парціальному тиску 0,2-1бар. 65 У способі за винаходом зазначені комплексоутворювальні речовини оптимально застосовують у концентраціях від ММ до 500мММ. Оптимальніше відповідні комплексоутворювальні речовини застосовують у концентраціях від 5мММ до 100мМ і особливо бажано в Концентраціях від 10мММ до 50мММ.

Спосіб окиснювання за винаходом може застосовуватися для окиснювання всіх сполук, що можуть окиснятися іонами Мп". Пропонований спосіб може застосовуватися, наприклад, для окиснювання лігніну при виробництві паперу і целюлози, як окисні системи в мийних засобах і засобах для миття посуду, для ферментативного вибілювання пофарбованих тканин, для ферментативного вибілювання текстилю, як систему запобігання повторному фарбуванню при пранні, для специфічного окиснювання органічних молекул-мішеней в органічному синтезі, для окисного очищення стічних вод, для розкладання хлорованих вуглеводнів, для 70 розщеплення поліциклічних ароматичних вуглеводнів і для зрідження вугілля.

Нижче винахід проілюстровано на прикладах.

Приклад 1

Виділення мікроорганізмів-продуцентів марганцевої оксидази 1.а. Виділення мікроорганізмів-окиснювачів марганцю

Мікроорганізми-окиснювачі марганцю, насамперед гриби і бактерії, виділяли на індикаторних пластинах відповідно до методу Кгтитреїп і Айтапп (Кттбреїп і Айтапп, НеїЇдоМпадег м/івв. Меегезипіегв., том 25, стор.347-356 (1973)).

У присутності іонів марганцю зі ступенем окиснювання Мп?"-Мп/" бербеліновий синій при рН4-7 являє собою барвник, що має інтенсивне синє забарвлення. При підвищених концентраціях на бербеліновому синьому в присутності відповідних іонів МН утвориться забарвлений у синій колір продукт окиснювання зі значенням рН до 10.

Для скринінгу на планшетах живильне середовище доповнювали безбарвним бербеліновим синім (М,М'-диметиламіно-М,М'-трифенилметан-о"-сульфоновая кислота). При концентраціях 10 7-1079г бербелінового синього на 100мл живильного середовища ще не відбувається інгібування росту бактерій. с

Для виділення гетеротрофних бактерій-окиснювачів марганцю, використовували таке середовище: о

З,бг/л бакто-пептону Осо,

О,вг/л МазО,0НоО, 100мг/л РевО)П17Н2»0О, 15г/л бакто-агару Оіїсо, -- 75Омл морської води, сч 245мл дистильованої води, 10мл маткового розчину бербелінового синього (4г/л), « рнт,в. со

На такі індикаторні пластини наносили бактерієвмісні зразки, такі як зразки морської води, зразки осадових відкладів, зразки грунту, зразки з відвалів руди і т.ін. у відповідних розведеннях або концентраціях (Се) таким чином, щоб на одній індикаторній пластині росло 100-300 окремих колоній.

Бактерії, що після інкубації протягом 5-10 днів на таких індикаторних пластинах утворювали колонії синього кольору (тобто активність щодо окиснювання марганцю пов'язана з клітинами) або навколо колоній яких « у надосадовій рідині утворювалися сині ореоли (тобто ферменти, що окисняють марганець, виділялися в надосадову рідину культури), піддавали подальшому аналізу. т с 1.а. Підтвердження присутності марганцевих оксидаз у мікроорганізмах, що окисняють бербеліновий синій ч» Мікроорганізми, що виділяли відповідно до описаного в 1.а методу, можуть продукувати марганцеві окаидази, " однак синє забарвлення також може викликатися марганцевими пероксидазами чи окиснюванням Бе 27.

Активність марганцевих оксидаз виявляли відповідно до методу, описаного Воодега і де Мгіпа (Воодега і де

Мппа, у. Васіегіої!., том 169(2), стор. 489-494 (1987));

Ме. Спочатку досліджувані мікроорганізми вирощували протягом 10 днів щоразу в 1л використовуваного для

Го! виділення середовища, яке не містить агару і бербелінового синього. Потім клітини відокремлювали шляхом центрифугування (15хв, 10000хао, 4"С) Клітинний дебрис, отриманий із клітин, які утворювали колонії синього о кольору на описаних в 1.а індикаторних пластинах, піддавали гель-електррфорезу відповідно до описаного

ГІ 20 нижче методу. Для клітин, які на індикаторних пластинах утворювали ореоли синього кольору, надосадову рідину, яка не містить клітин, концентрували до однієї п'ятдесятої первісного об'єму шляхом ультрафільтрації -6ь з використанням УФ-мембрани, що містить частки з молекулярною масою понад 10000Да. Концентрат або клітинний дебрис змішували з рівним об'ємом буфера (0,125М Трис/С1, рНб,8, 20905 гліцерину, 295 ДСН, 1095 2-меркаптоетанолу, 0,0195 бромфенолового синього). Аліквоти по 5Омкл таких сумішей розділяли шляхом електрофорезу на 1095-му поліакриламідному гелі. Після електрофорезу гель промивали чотири рази протягом

ГФ) 15 хв деіонізованою водою. Потім гель інкубували протягом 2год у 100мкМ МпС15 у 10мМ Нерез-буфері, рнН7,5.

У результаті цієї процедури в зразках, що містять марганцеві оксидази, в ділянці, де після електрофорезу в о гелі були локалізовані марганцеві оксидази, утворювався осад оксиду марганцю коричневого кольору. Виявлене таким шляхом утворення оксиду марганцю було зумовлене безпосередньо марганцевими 60 оксидазами-окиснювачами Мп", оскільки пероксиду не було і в зразку не були присутні інші іони, відмінні від

Мп2гя

Приклад 2

Одержання і виділення марганцевих оксидаз

Відповідно до описаного в прикладі 1 методу можна виділити Ізоляти Васіїйи5, що у своїх спорах мають 65 відклади марганцевої оксидази. Для технічних застосувань такі спори з умістом марганцевої оксидази використовували безпосередньо або оболонки спор, які містять марганцеву оксидазу, спочатку піддавали обробці, після чого використовували. Такі спори або оболонки спор одержували в такий спосіб:

Культивування:

Для одержання спор, які містять марганцеву оксидазу, відповідний штам Васіїїиз культивували в аеробних умовах при 25"С в такому середовищі: 2г/л пептону (фірма Оіїсо), О0,5г/л дріжджового екстракту (фірма Осо), 1Омкг/л Бе-ЕДТК, 100 мкг/л стерилізованого фільтрацією МпСІ»214Н20О у 5ОмММ Трис у 8095-ій природній морській воді, рРН7,О.

Після культивування протягом 10 днів понад 9595 усіх клітин утворюють спори. 70 Обробка спор

Спори збирали шляхом центрифугування (ЗОхв, 10000Охо, 4"С), промивали деіонізованою водою і суспендоваіїш в 10мММ Трис/С1, рН7,0 (0,1г/мл). Для одержання оболонок спор цей продукт піддавали подальшій обробці відповідно до описаного нижче методу. Якщо у способі за винаходом використовувалися безпосередньо спори, то їх піддавали подальшій обробці в такий спосіб:

До суспензії додавали 5Омкг/мл лізоциму, продукт інкубовали протягом ЗОхв при 37"С, після чого спори промивали 1М Масі, 0,15М Масі, 0,195-им ДСН і п'ять разів деіонізованою водою. Очищені в такий спосіб спори зберігали в деіонізованій воді при 4"7С до застосування відповідно до винаходу.

Одержання оболонок спор

Усю процедуру, якщо не зазначено іншого, проводили при кімнатній температурі. За винятком 195-го розчину

ДСН і використовуваної для промивання деіїонізованою водою всі розчини містили 10ММ ЕДТК, рнН7,5 і фетилметилсульфонілфторид (ФМФ) (0,Змасоою) Очищені спори суспендували відповідно до описаного вище методу в 10мМ Трис, рН7,О (0,1г/мл) і до них додавали рівні об'єми скляних бусинок (діаметром 10-50 мкм).

Потім суспензію протягом 15хв із З0О-секундними інтервалами при 0"С опромінювали ультразвуком з максимальною амплітудою в ультразвуковому пристрої для руйнування клітин (фірма Зопійег). Після обробки сч суспензію інкубували протягом бхв на льоду і потім надосадову рідину відокремлювали від доданих до неї скляних бусинок. Після цього скляні бусинки двічі промивали 10мММ Трис із рН7,О в об'ємі, якій дорівнює і) їхньому об'єму. Поєднували першу надосадову рідину і надосадові рідини, отримані після процедури промивання, і центрифугували протягом 15хв при 15000х9. Потім відокремлювали надосадову рідину, осад суспендували в 10мМ Трис, рН7,5 і протягом ЗОхв обробляли при 37"С, лізоцимом (10Омкг/мл). Продукт ще раз «- зо Чентрифугували протягом 15хв при 15000х9 Осад, що містить оболонки спор, промивали 1ІМ масі, 0,14М масі, 196-им ДСН і 5 разів деіонізованою водою. с 2.6. Марганцева оксидаза з І ерісійнгіх аіїзвсорпога «г

Відповідно до описаного в прикладі 1 методу можна одержати ізоляти мікроорганізмів, які утворюють чохол (піхву), таких як І еріоїйгіх дізсорпога, що продукують марганцеві оксидази. Такі ізоляти можна одержати також со зв З комерційних колекцій штамів (І еріоїйгіх дізсорпога АТСС 51168, І еріоїнгіх дізсорпога АТСС 51169). Особливо «о придатними для одержання марганцевих оксидаз є штами Іеріоїйгіх дізсорпога; що втратили здатність утворювати чохол.

Такі штами виникають спонтанно, якщо штами, які утворюють чохол, безперервно протягом тривалого часу культивують у лабораторних умовах (Адатзез і ОСПіогзе, Агсй. МісгобіоІ., том 145, стор.126-135 (1986)). Такі « похідні, що втратили здатність утворювати чохол, секретують марганцеві оксидази в культуральне середовище в с У наступному прикладі описано одержання в надосадовій рідині культури і виділення з її марганцевих оксидаз з використанням штаму І еріоїйгіх дізсорпога, що втратив здатність утворювати чохол, депонованого ;» відповідно до Будапештського договору в німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (05М2 сть, 0О-38124, Брауншвейг) під реєстраційним номером ОМА 12667

Культивування

Ге» Для одержання марганцевої оксидази І еріоїйгіх дізсорпога культивували в середовищі, що включає такі компоненти на літр деіонізованої води бо О,25г/л пептону Осо, їх О0,25г/л дріжджового екстракту Оіїсо, 0,25г/л глюкози, о О,бг/л Ма5О;О7Н»О,

Кк 0,07г/л Сас1502Но»О0, 0,015г/л МаЗО,02Н50

Перед автоклавуваням середовища значення рН доводили до 7,6 за допомогою 1М розчину МаОН

Для одержання марганцевої оксидази 45л описаного середовища інфікували двома літрами попередньої культури Г еріоїйгіх дізсорпога у такому ж середовищі Культивування здійснювали протягом 40год при 267С при

Ф) пропущенні повітря (0,2 об'єму повітрі/об'єм середовища/хв) ка Одержання ферменту з надосадойої рідини культури

Через 40год культивування припиняли. Клітки І! еріоїйгіх дізсорпога відокремлювали від надосадової рідини бо Культури шляхом центрифугування Надосадову рідину, яка містить марганцеву оксидазу, у якій були відсутні клітини, концентрували до об'єму О,бл шляхом ультрафільтрації з використанням УФ-мембрани, яка містить частки з молекулярною масою понад 10000Да Сконцентровану над осадову рідину використовували як джерело марганцевих оксидаз у наведених нижче прикладах.

Приклад З 65 Кількісна оцінка активності марганцевих оксидаз за допомогою М,М,М',М'-тетраметил-пара-фенідендіаміну (тМФд)

Іони Мп" мають здатність окиснювати безбарвну сполуку ТМФД. Продукт окиснювання, "вустерський синій", має інтенсивне синє забарвлення, посилення цього забарвлення можна оцінити фотометричним шляхом при довжині хвилі б1Онм

Процедура вимірювань:

Для кожного вимірювання готували свіжий матковий розчин ТМФД, що являє собою 2,1мММ розчин ТМФД у дистильованій воді. Призначені для оцінки препарати ферментів розводили в 10мМ НЕРЕ5З (М-2-гідроксиетилпіперазин-М'-2-етансульфонова кислота) (рН7,5) таким чином, щоб оптична густина (ОГ610), вимірювана при довжині хвилі б1Онм протягом 10-хвилинного періоду за допомогою описаної нижче процедури 70 оцінки активності, була в інтервалі 0,5-1,5.

Джерелом марганцю виступав 10мММ розчин МпзО, у дистильованій воді.

Для визначення активності марганцевої оксидази в зразках ферментів паралельно щоразу змішували Змл розведені розчини ферменту в НЕРЕ5З (див. вище) з О0,Змл маткові розчини ТМФД До одного з паралельних зразків у момент часу 0 додавали їОмкл маткового розчину Мпи5О). Обидва зразки змішували й інкубували 75 протягом 1Охв при 40"С. Через 10хв зразки центрифугували протягом короткого проміжку часу (15Х, 500Опро/хв), після чого визначали ОГ610 у зразку надосарової рідини об'ємом мл, який містить Мпи5О у Для контролю було взято порівняльний зразок, що не містить Мп5О у Посилення абсорбції при 61Онм на 1,0 відповідає утворенню 10О0мкм "вустерського синього". За 1 одиницю (Тод.) марганцевої оксидази приймали таку кількість ферменту, що приводить протягом 1хв до утворення 1мкм "вустерського синього" із ТМФД.

Для проведення вимірювань, описаних нижче, застосовували щоразу концентровану надосадову рідину, яка містить марганцеву оксидазу, культури з прикладу 2.6 і 5Омкл суспензії оболонок спор з прикладу 2.а. Було одержано такі результати: о зв о

Приклад 4

Окиснювання субстрату, який перебуває в гомогенному стані, що являє собою вератриловий спирт, залежно «-

Від різних концентрацій марганцю і комплексоутворювальної речовини

Процедура: с

Із субстрату, що являє собою вератриловий спирт (3,4-диметоксибензиловий спирт (фірма Аїагісп)) готували « матковий розчин в етанолі (0,25г/мл).

Реакцію окиснювання проводили при 45"С, слабо перемішуючи. Для цього щоразу в 22,2З3мл розчину, що с включає комплексоутворювальну речовину (50ММ форміат, лактат, малат чи офалат; у всіх випадках при с значенні рН7,5), змішували з Мп5О) (0,00, 0,05, 0,50ММ Мп5О5)). Потім щоразу додавали по 0,268мл маткового розчину вератрилового спирту. Суміші давали прийти в рівноважний стан протягом 1Охв при 457С, потім починали реакцію шляхом додавання 2,5мл розчину ферменту (марганцева оксидаза з І еріоїйгіх аізсорпога, 1бод./мл). « 20 Через в8год реакційну суміш аналізували за допомогою РХВР щодо утворення вератрилового альдегіду. Для -о цього О,вмл тестованої суміші змішували з О04мл розчину НьЗО,) (0,5моля/л). 20мкл цього зразка вносили в с розділовий стовпчик І іСпозрНпег 60 КР зЗеїесі В (Мегск 50940) і елюювали сумішшю НоьО/Меон (65:35). Швидкість :з» потоку при цьому становила мл/хв. Продукт в елюаті виявляли за допомогою УФ-детектора при довжині хвилі 275Ннм.

У наведеній нижче таблиці порано кількості (у 96) вератрилового спирту, які відповідно до способу за о Винаходом в зазначених нижче умовах окиснювалися протягом 8 год до вератрилового альдегіду з речовина ЇММІ альдегід (905) І(Івератриловий альдегід (95)1 2 о вммфемат 10100800 юю оовоммформато/ 06 11110011 з о вммлаю 01010000 Роб

С ммлают (005) воо0110100111111100359 мм мают | 0.011110 о іме)

С вммоюатт | 0. Рою1110101111111000ю о вммоюашт 005) 06111016 7

Приклад 5

Вибілювання целюлози

Піддану делігніфікації за допомогою кисню крафтцелюлозу з деревини 10 м'яких порід зі вмістом лігніну, щр бо характеризується значенням каппа 16,5, промивали і за допомогою ЗОмММ Ма-оксалатного буфера (рнт7,5)

доводили до концентрації целюлози 595. Після цього додавали МизО ; (0,5ММ). Суспензію гомогенізували протягом бос за допомогою відповідної мішалки. Потім у два паралельних зразки додавали щоразу по 5од. марганцевої оксидази (І еріоїйгіх, Васіййв5) на 1г целюлози. Третій зразок, у який не додавали ферменту, було

Взято для контролю. Зразки ще раз гомогенізували протягом бос і поміщали в сталевий автоклав, у якому можна підтримувати певну температуру і який можна продувати газом. Автоклав закривали, установлювали тиск кисню на рівні З бар і проводили інкубацію в автоклаві протягом 4год при 45"С Потім вивантажували реакційну суміш.

Целюлозу промивали 10 об'ємами проточної води з температурою 50"С, після ч(ого з целюлози при 707С з допомогою водяного лужного розчину Маон екстрагували фрагменти лігніну Для екстракції використовували 20г 7/0. Маон на кг целюлози Після екстракції целюлозу знову промивали 10 об'ємами проточної води з температурою 50"С Потім відповідно до стандартного методу ЗСАМ-С 1 77 "Скандинавської ради з деревної маси і паперу" визначали; вміст лігніну в зразках целюлози, що характеризується так званим значенням каппа (96) й

У порівнянні з контрольним зразком застосування способу окиснювання за винаходом дозволяє додатково збільшити ступінь делігніфікації на 10,9-27,296

Приклад 6

Запобігання повторному забарвленню

Досліди для підтвердження можливості запобігання повторному забарвленню за допомогою окисної системи за винаходом проводили в скляних обігріваних склянках (об'ємом 100мл) Як контроль використовували суміш, с 29 що являє собою розчин 0,25г наявного в продажу мийного засобу в 5Омл води Досліди з марганцевою Ге) оксидазою Проводили в ХОмл ЗОММ Ма-малонатного буфера (рН7,5), що містить О0,5ММ Ми5О,) Суміші об'ємом

БОмл спочатку нагрівали до 45"С, а потім у ці суміші, що містять буфер, додавали в разі потреби щоразу по

О,Бод/мл марганцевої оксидази. У суміш помещали зразки тканини з бавовни (кожний по 5г), а потім до кожної суміші додавали 1Омл попередньо нагрітого до 452С розчину, що містить 15мМкМ Сірасгоп Магіпе С-В (фірма (787

Сіра) як тестованого барвника Після витримання протягфм год при 457С зразки тканини витягали із сумішей і с промивали щоразу 1 л проточної води при температурі 50"С

Потім зразки тканини промивали і сушили. Після цього спектроскопічним методом оцінювали світлість - вихідних зразків і оброблених зразків. со

У таблиці наведено порівнянні світлості оброблених зразків бавовняної тканини і необроблених зразків: (Се) « іероттхавсорюв веж с 10 Васйшв ва З "» Наведені в таблиці дані свідчать про те, що окисна система за винаходом дозволяє запобігати переносу " внесених часток барвника на зразки бавовняної тканини Цей ефект своєю якістю зіставимо з дією наявних у продажу мийних засобів.

Приклад 7 (22) Виведення плям (застосування у мийного засобу) оо Для демонстрації ефективності пропонованого способу виведення плям проводили досліди пранням. Для цього на зразках бавовняної тканини білого кольору (7,5-7,5см) створювали стандартні (нормовані) забруднення ве шляхом нанесення крапель об'ємом по 0,3 мі водні розчини, що містять 100част/млн барвника Еванса синього г) 20 (отриманого від компанії У/ако Риге Спетіса! Іпдивігу Со., Осака). Потім ці зразки тканини в склянках (об'ємом 10О0мл), що мають підігрів, при перемішуванні (магнітна мішалка) обробляли відповідно до винаходу -З марганцевою оксидазою, МпзО, і відповідним комплексоутворювальною речовиною в присутності кисню. Для контролю брали розчини, у яких а) використовувався тільки малонатний буфер або які б) не містили МизоО /, або в який в) не додавали марганцеву оксидазу 52 Досліди проводили в Хомл ЗОмММ Ма-малонатного буфера (рН7,5) з додаванням О,5МмМ МпзоО, і відповідно о без додавання Мп5О у Розчини об'ємом 5О0мл спочатку нагрівали до 45"С, потім у розчини, що повинні були містити марганцеву оксидазу, додавали щцразу по ЛТод/мл марганцевої оксидази з Васійи5, відповідно з ю І еріоїйгіх. У розчини вносили забруднені зразки бавовняної тканини. Після втримання протягом год при 457 зразки текстильної тканини витягали з розчинів і кожний промивали 1л проточної води при температурі 507С. 60 Потім зразки текстильної тканини сушили.

Для визначення розходжень у забарвленні зразків у порівнянні з контрольним зразком, тестованим без додавання марганцевої оксидази і Мпи5О), за допомогою диференціального колориметра (типу СК-200, фірма

Міпоїа) вимірювали значення М, у і х висушених на повітрі зразків. Щоб оцінити ефект вибілення, що досягається способом за винаходом, обчислювали значення коефіцієнта 2 (2-(1-х-у)м/у) б5 У таблиці подано характеристики ступеня білизни тестованих зразків у порівнянні з характеристиками атупеня білизни контрольних зразків без використання ферменту і Мпи5О,

7 вмеодвюмто, (безферменту| 02 00

З поданих у таблиці даних видно, що ступінь білизни зразків з використанням марганцевих оксидаз і Ми5О утома 1,6 і 2,7 пункту вище, ніж зразків без використання ферменту 1 без використання Мпи5О,у

Приклад 8

Органічний синтез

У поданому нижче прикладі розглянуто можливість використання способу за винаходом для спрямованого синтезу органічних сполук. а) Окиснювання спиртових груп до (альдегідів

У 22мл ЗОММ розчину малонату, рН7,5, що містить О0,5ММ Мпи5О), додавали при 4572 269мг (1,бммоля) 3,4-диметоксибензилового спирту в їмл етанолу. Після витримання протягом 1О0хв додавали марганцеву оксидазу (40од,). Після проведення реакції протягом 24год реакційний розчин екстрагували хлороформом і досліджували за допомогою ЯМР-спектроскопії. У тому випадку, коли була присутня марганцева оксидаза з

І еріоїйгіх, вихід 3,4-диметоксибензальдегіду становив 3295, а в тому випадку, коли була присутня марганцева оксидаза з Васів5, вихід З3,4-диметоксибензальдегида становив 2795. б) Окиснювання спиртів до кетонів

У 22мл ЗОММ розчину малонату, рН7,5, що містить О0,5ММ Мпи5О), додавали при 4573 196бмг (1,бммоля) 1-фенілетанолу. Після витримання протягом 10хв додавали марганцеву оксидазу (40од.), Після проведення сч реакції протягом 24год реакційний розчин досліджували за допомогою РХВР. У тому випадку, коли була присутня марганцева оксидаза з І еріоїйгіх, вихід ацетофенона становив 1795, а в тому випадку, коли була о присутня марганцева оксидаза з Васій5, вихід ацетофенону становив 19905.

В обох прикладах установлено можливість успішного застосування способу окиснювання за винаходом для синтезу певних сполук. Використані субстрати в даному випадку взято тільки як приклади для демонстрації «- зр окисних можливостей способу і ними не обмежено діапазону можливих синтезованих продуктів.

Приклад 9 с

Вибілювання джинсової тканини «

Вирізаний квадратний клапоть Дофарбованої джинсової тканини (9г/160см?) витримували при 45С в закрифій склянці об'ємом 500Омл у загальному об'ємі рідини 11,5мл з марганцевою оксидазою, 0,2ММ Мпизо /1 со 15мМ розчину комплексоутворювальної речовини (оксалат). Значення рН суміші становило 7,0 (15мм оксалат) «о

На 1г тканини додавали 1О0од марганцевої оксидази Після витримання протягом 4год клапті тканини промивали проточною водою доти, доки промивна вода не ставала безбарвною Клапті тканини сушили в плоскій сушарці, потім розгладжували ,й оцінювали за допомогою оптичного спектрофотометра

Ступінь вибілення визначали за допомогою спектрофотометра типу СМ 37004 (фірма Міпока) відповіднр до « інструкцій виробника Вимірювання проводили без глянцю і без УФ. Світлість зразків оцінювали у вигляді з с відсотка загальної відбивної здатності в порівнянні зі стандартом білизни (К 457) Величина І" являє собою міру світлості (білий - 100, чорний - 0) ;» Дані для обробленої тканині порівнювали з даними для необробленої контрольної тканини Зміна світлості (АГ зразків у порівнянні з необробленими контролями розраховували за допомогою програмного забезпечення

РР2О00 (фірма Оріїсапігої) (22)

Ак со зонтоль 0 г м) шк Зміну світлості ЛІ", що становить приблизно 5, уже можна визначити візуально, тобто використання обох марганцевих оксидаз дозволяє досягти значного ефекту вибілення

Claims (10)

1. 99 Формула винаходу Ф) ко 1. Багатокомпонентна система для опосередковуваного медіатором ферментативного окиснювання, що включає каталізатор окиснювання, окисник і медіатор, яка відрізняється тим, що во а) каталізатор окиснювання вибрано із групи марганцевих оксидаз, б) окисник вибрано із групи, куди входять кисень і кисневмісні сполуки, в) медіатор вибрано із групи сполук, що містять іони Мп.
2. 2. Багатокомпонентна система за п. 1, яка відрізняється тим, що вона додатково містить комплексоутворювальну речовину, вибрану з групи речовин, здатних утворювати комплекси з іонами Мп. 65
3. 3. Багатокомпонентна система за будь-яким із пп. 1 чи 2, яка відрізняється тим, що медіатором виступають іони Мп?" чи Мп",
4. 4. Багатокомпонентна система за будь-яким із пп. 2 чи 3, яка відрізняється тим, що комплексоутворювальна речовина не містить азоту, легко піддається біологічному розкладанню і є токсикологічно безпечною.
5. 5. Багатокомпонентна система за будь-яким із пп. 1-4, яка відрізняється тим, що кисень присутній або безпосередньо в газоподібному стані, або у формі рідкого кисню, або в складі кисневмісної газової суміші.
6. 6. Спосіб окиснювання субстрату, який відрізняється тим, що марганцева оксидаза в присутності кисню і, в разі потреби, комплексоутворювальної речовини, здатної утворювати комплекс з іонами Мп, утворює Мп" шляхом безпосереднього окиснювання Мп", а іон Мп3" окиснює субстрат, при цьому він сам відновлюється до Маг" і знову використовується для безпосереднього окиснювання марганцевої оксидази. 70
7. 7. Спосіб за п. б, який відрізняється тим, що субстрат застосовують у формі водного розчину, суміші або суспензії.
8. 8. Спосіб за будь-яким із пп. 6 чи 7, який відрізняється тим, що іони марганцю застосовують у концентрації від 0,005 мМ до 50 мМ.
9. 9. Спосіб за будь-яким із пп. 6-8, який відрізняється тим, що кисень додають при парціальному тиску 0,05-5 75 бар.
10. 10. Спосіб за будь-яким із пп. 6-9, який відрізняється тим, що комплексоутворювальні речовини застосовують у концентрації від 1 мМ до 500 мМ. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 8, 15.08.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) «- с « (ее) (Се)

    - . и? (о) (ее) щ» іме) - іме) 60 б5