ES2657552T3

ES2657552T3 - Nuevos biomarcadores de riesgo para el cáncer de pulmón

Info

Publication number: ES2657552T3
Application number: ES12830701.4T
Authority: ES
Inventors: Zvi Livneh; Tamar Paz-Elizur
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2011-09-08
Filing date: 2012-09-06
Publication date: 2018-03-05
Anticipated expiration: 2032-09-06
Also published as: CN103890195A; EP2753716B1; US20180119227A1; EP2753716A4; EP2753716A1; WO2013035071A1; US20140248293A1

Abstract

Un método para determinar un riesgo de un sujeto humano de desarrollar cáncer de pulmón, comprendiendo el método determinar un nivel de actividad catalítica de N-metilpurina ADN glicosilasa (MPG) en una muestra biológica del sujeto, y, según dicho nivel, determinar el riesgo del sujeto de desarrollar cáncer de pulmón, en el que un nivel de dicha actividad catalítica de MPG por encima de un primer valor predeterminado es indicativo de un riesgo incrementado de dicho sujeto de desarrollar cáncer de pulmón.

Description

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Las FIGs. 5A-5E muestran un ensayo para la actividad catalítica de MPG usando un sustrato de ADN que contiene una lesión 1, N6-etenoadenina. La FIG. 5A ilustra la estructura de 1, N6-etenoadenina (eA); La FIG. 5B es una indicación esquemática del ensayo. Un ADN sintético radiomarcado corto bicatenario que porta una eA específica de sitio (marcada con una X) se incuba con una muestra de extracto de proteína para la determinación de MPG. La actividad de MPG-eA libera la eA, resultando en un sitio abásico, que se escinde por APE presente en la muestra y posterior tratamiento con álcali, que a su vez convierte el oligonucleótido de 32 bases radiomarcado en un oligonucleótido de 15 bases. Los productos de escisión se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de urea. Los asteriscos representan el extremo de ADN radiomarcado. La FIG. 5C es un gel de poliacrilamida que muestra un curso de tiempo y titulación de proteína de actividad de MPG-eA en una muestra preparada a partir de células mononucleares de sangre periférica. El sustrato que contiene la lesión eA se escinde para rendir el 15-mer. La cantidad de radiactividad en los fragmentos de 15 y 32 bases se cuantificó usando formación de imágenes con fósforo y se expresó como una función de la cantidad de ADN escindido (en femtomoles) frente al tiempo (FIG. 5D) o concentración de proteína de la muestra (FIG. 5E). Obsérvese la correlación lineal. Se muestran los resultados de experimentos representativos;

La FIG. 6 es un gráfico que ilustra la correlación de actividad de reparación del ADN de MPG con cáncer de pulmón. La actividad de MPG, se evaluó en células mononucleares de sangre periférica como en las FIGs. 5A-5E, y se expresó en términos de densidad, en 100 pacientes con cáncer de pulmón (línea negra) y 100 sujetos control concordantes (línea gris). Obsérvese el desplazamiento a valores mayores de MPG entre los pacientes con cáncer de pulmón;

FIG. 7 es un gráfico que ilustra la correlación de actividad de reparación del ADN OGG-1 con cáncer de pulmón. La actividad de OGG-1, se evaluó por ensayo de un sustrato de ADN corto fluorescente (OGG-F) en células mononucleares de sangre periférica, y se expresó en términos de Unidades/µg de proteína, en 100 pacientes con cáncer de pulmón (línea negra) y 100 sujetos control concordantes (línea gris). Obsérvese el desplazamiento a valores menores de OGG-1 entre los pacientes con cáncer de pulmón;

Las FIGs. 8A-8E muestran el ensayo para actividad de reparación del ADN APE, usando un sustrato de ADN que contiene un sitio abásico furanilo. La FIG. 8A ilustra la estructura del sitio abásico furanilo; FIG. 8B: Indicación esquemática del ensayo. Un ADN sintético radiomarcado corto bicatenario que porta un sitio abásico furanilo específico de sitio (marcado con una X) se incuba con una muestra de extracto de proteína para la determinación de APE1. Los asteriscos representan el extremo de ADN radiomarcado. La actividad de APE mella el sustrato, resultando en la conversión del oligonucleótido de 30 bases radiomarcado en un oligonucleótido de 15 bases radiomarcado. La FIG. 8C es un gel de poliacrilamida que muestra una titulación de proteína de actividad de APE1 en un extracto de proteína preparado a partir de células mononucleares de sangre periférica, ensayado en cantidades crecientes de los extractos. El sustrato que contiene la lesión de sitio abásico furanilo se escinde para rendir el 15-mer. La cantidad de radiactividad en los fragmentos de 15 y 30 bases se cuantificó usando formación de imágenes con fósforo y se expresó como una función de la cantidad de ADN escindido (en femtomoles) frente al tiempo (FIG. 8D) o concentración de proteína de la muestra (FIG. 8E). Obsérvese la correlación lineal. Se muestran los resultados de experimentos representativos;

La FIG. 9 es un gráfico que ilustra la correlación de actividad de reparación del ADN APE con cáncer de pulmón. La actividad de APE-1, se ensayó en células mononucleares de sangre periférica como en las FIGs. 8A-8E, y se expresó como Unidades/ng de proteína, en 100 pacientes con cáncer de pulmón (línea negra) y 100 sujetos control concordantes (línea gris). Obsérvese el desplazamiento a valores menores de APE1 entre los pacientes con cáncer de pulmón;

La FIG. 10 es un gráfico que ilustra la correlación de puntuación de reparación del ADN integrada (OMA) con cáncer de pulmón. La actividad de OGG1, MPG y APE, ensayada en células mononucleares de sangre periférica de 100 pacientes con cáncer de pulmón (línea llena) y 100 sujetos control concordantes (línea discontinua) como se describe, se analizó y combinó para proporcionar la puntuación de reparación del ADN integrada (OMA). La distribución de las puntuaciones de reparación de ADN integrada (OMA) en las dos poblaciones (según frecuencia relativa en %) muestra claramente un desplazamiento a valores menores de puntuación de reparación del ADN integrada (OMA) entre los pacientes con cáncer de pulmón.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente descripción, en algunas realizaciones de ésta, se refiere a evaluación del riesgo del cáncer y, más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos, composiciones y kits usando marcadores bioquímicos para cribar sujetos para riesgo de cáncer. En algunas realizaciones, los individuos con un riesgo incrementado pueden derivarse a ensayos de diagnóstico de cáncer de pulmón adicionales. En otras realizaciones más, se realizan ensayos de diagnóstico adicionales de cáncer de pulmón en dichos individuos.

El cáncer de pulmón es la segunda forma de cáncer más común tanto para hombres como para mujeres, pero la ausencia de métodos sensibles y exactos para la evaluación del riesgo y detección temprana frustran el desarrollo efectivo y eficiente de métodos de diagnóstico sofisticados, tales como CT de dosis baja (CT espiral, LDCT), en poblaciones de alto riesgo. Sin embargo, la demanda para la implementación de protocolos de cribado para

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diagnóstico por LDCT incrementará probablemente al ser cada vez más ampliamente reconocida la eficacia de LDCT en la detección temprana del cáncer de pulmón.

Los biomarcadores para la evaluación del riesgo de cáncer son útiles para la detección temprana y prevención del cáncer, y tienen el potencial para uso en protocolos de cribado a gran escala. Los presentes inventores han descubierto recientemente que la actividad enzimática reducida de la enzima de reparación del ADN 8-oxoguanina ADN glicosilasa (OGG1), medida en linfocitos, es un factor de riesgo valioso para cáncer de pulmón (Paz-Elizur et al. J Natl. Canc. Inst. 2003;95: 1312-19, Paz-Elizur et al., Can. Res. 2006; 66: 11683-9, US2004-0096863).

Los presentes inventores han descubierto que la actividad catalítica elevada, en lugar de disminuida, de otra enzima de reparación del ADN, N-metilguanina ADN glicosilasa (MPG) (N-metilpurina ADN glicosilasa, ADN 3-metil adeninaglicosilasa, MPG; EC 3.2.2.21), cuando se ensaya en una muestra biológica de un sujeto, es indicativa de riesgo incrementado de desarrollar cáncer de pulmón. La actividad de MPG en linfocitos de pacientes con cáncer de pulmón fue consistentemente mayor que la de los controles sanos concordantes para edad, sexo, área de residencia y etnicidad, y ajustado para estado de tabaquismo.

Así, según algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para determinar un riesgo de un sujeto humano de desarrollar cáncer de pulmón, comprendiendo el método determinar un nivel de actividad catalítica de N-metilpurina ADN glicosilasa (MPG) en una muestra biológica del sujeto, y, según el nivel, determinar el riesgo del sujeto de desarrollar cáncer de pulmón, en el que un nivel de la actividad catalítica por encima de un valor predeterminado es indicativo de un riesgo incrementado del sujeto de desarrollar cáncer de pulmón.

Los presentes inventores también han descubierto que la actividad catalítica de enzimas de reparación del ADN adicionales están correlacionadas con riesgo incrementado de desarrollar cáncer de pulmón en un sujeto. Como se muestra en los Ejemplos IV y V en la presente memoria, los niveles reducidos de APE1 [endonucleasa de sitio apurínico-apirimidínico, APEX1, EC 4.2.99.18], cuando se ensaya en una muestra biológica de un sujeto, son indicativos de riesgo incrementado de desarrollar cáncer de pulmón. Aún además, los inventores han mostrado que valores elevados de actividad catalítica de MPG, combinados con actividad catalítica reducida de APE1, o OGG1 se correlacionaban con una indicación aún mayor de riesgo de cáncer de pulmón que cualquiera de los ensayos individuales (véase el Ejemplo V en la presente memoria). Los sujetos que tienen valores elevados de actividad catalítica de MPG, combinado con actividad catalítica reducida tanto de APE1 como OGG1 se correlacionaban con la mayor indicación de riesgo de cáncer de pulmón.

Así, según algunas realizaciones de la presente invención, la determinación del riesgo de un sujeto humano de desarrollar cáncer de pulmón, comprende determinar un nivel de actividad catalítica de N-metilpurina ADN glicosilasa (MPG) y APE1 en una muestra biológica del sujeto, y, según el nivel, determinar el riesgo del sujeto de desarrollar cáncer de pulmón, en el que un nivel de la actividad catalítica de MPG por encima de un primer valor predeterminado y nivel de APE1 por debajo de un segundo nivel predeterminado es indicativo de un riesgo incrementado del sujeto de desarrollar cáncer de pulmón. En algunas realizaciones, la determinación del riesgo de un sujeto humano de desarrollar cáncer de pulmón, comprende determinar un nivel de actividad catalítica de Nmetilpurina ADN glicosilasa (MPG) y OGG1 en una muestra biológica del sujeto, y, según el nivel, determinar el riesgo del sujeto de desarrollar cáncer de pulmón, en el que un nivel de la actividad catalítica de MPG por encima de un primer valor predeterminado y nivel de OGG1 por debajo de un segundo nivel predeterminado es indicativo de un riesgo incrementado del sujeto de desarrollar cáncer de pulmón. En una realización específica, la determinación del riesgo de un sujeto humano de desarrollar cáncer de pulmón, comprende determinar un nivel de actividad catalítica de N-metilpurina ADN glicosilasa (MPG), APE1 y OGG1 en una muestra biológica del sujeto, y, según el nivel, determinar el riesgo del sujeto de desarrollar cáncer de pulmón, en el que un nivel de la actividad catalítica de MPG por encima de un primer valor predeterminado, un nivel de la actividad catalítica de APE1 por debajo de un segundo valor predeterminado y nivel de OGG1 por debajo de un tercer nivel predeterminado es indicativo de un riesgo incrementado del sujeto de desarrollar cáncer de pulmón. La determinación de actividad catalítica de MPG, APE1 y/o OGG1 se efectúa en muestras biológicas representativas del sujeto, y o controles, o puede efectuarse en alicuotas separadas de la misma muestra. Los métodos para ensayar la actividad catalítica de MPG, APE1 y OGG1 se detallan en la presente memoria más adelante.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "valor predeterminado" se refiere a un nivel de referencia de actividad catalítica por encima (como en el caso de MPG) o por debajo (como en el caso de OGG1 o APE1) del que puede inferirse estadísticamente un riesgo incrementado de cáncer de pulmón.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "riesgo" se refiere a la probabilidad de aparición de una afección o enfermedad, o recurrencia de la enfermedad, síntomas, marcadores u otros indicadores de ésta. Así, en algunas realizaciones, el riesgo es un riesgo de desarrollar cáncer de pulmón. En otras realizaciones, el riesgo es el riesgo de recurrencia de cáncer de pulmón diagnosticado previamente. En otras realizaciones más, el riesgo puede ser un riesgo de desarrollar un tipo específico de cáncer de pulmón. En otras realizaciones, el riesgo puede ser un riesgo de mortalidad de cáncer de pulmón, o la probabilidad de supervivencia del cáncer de pulmón. El riesgo según la presente invención puede expresarse en una de una pluralidad de maneras. En un ejemplo, el riesgo se expresa como veces de incremento del riesgo para desarrollar cáncer de pulmón, respecto al de una población normal, aparentemente sana, o un grupo control de referencia. En otras realizaciones más, el riesgo se expresa en unidades

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de actividad enzimática específica. En otra realización, se genera una escala de riesgo lineal o logarítmica bien para "veces de incremento del riesgo" o las "unidades de actividad" y el riesgo se expresa como una magnitud de la escala. En algunas realizaciones, el riesgo se expresa como una razón de probabilidades ajustada, respecto a un valor o intervalo de valores de referencia seleccionados de actividad enzimática, en el que una razón de probabilidades de 1,0 indica ausencia de diferencia en el riesgo del de la población de referencia, una razón de probabilidades de <1,0 indica un riesgo menor que el de la población de referencia, y una razón de probabilidades de >1,0 indica un riesgo mayor que el de la población de referencia. En otras realizaciones, el riesgo se expresa como una razón de probabilidades ajustada, respecto a la desviación estándar en el intervalo de valores de actividad enzimática de la población referenciada. En otra realización más, el riesgo se expresa como una razón de probabilidades ajustada, calculada a partir de una puntuación de reparación de ADN integrada de dos o más valores de actividad enzimática. En algunas realizaciones, un valor o intervalo de referencia predeterminado se deriva de individuos normales sanos. En otras realizaciones, el valor o intervalo de referencia se deriva de individuos que concuerdan con el sujeto o sujetos según uno cualquiera o más parámetros incluyendo, pero no limitado a, edad, sexo, etnicidad, religión, localización geográfica, estado de tabaquismo, historial familiar, historial sanitario, perfil genético, exposición a carcinógenos, ocupación, y semejantes. En determinadas realizaciones, el intervalo de referencia se ajusta según uno o más parámetros incluyendo, pero no limitado a, edad, sexo, etnicidad, religión, localización geográfica, estado de tabaquismo, historial familiar, historial sanitario, perfil genético, exposición a carcinógenos, ocupación, y semejantes.

El método de la presente invención puede usarse con el fin de determinar la capacidad de respuesta a un tratamiento de cáncer de pulmón dañino para el ADN, ya que el uso de agentes dañinos para el ADN en el tratamiento del cáncer está extendido y es común. Dichos agentes incluyen, pero no están limitados a, quimioterapia, radiación, terapia génica y semejantes.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "régimen de tratamiento" se refiere a un plan de tratamiento que especifica el tipo de tratamiento, dosificación, esquema y/o duración de un tratamiento proporcionado a un sujeto que lo necesita (por ejemplo, un sujeto diagnosticado con una patología). El régimen de tratamiento seleccionado puede ser uno agresivo que se espera que resulte en el mejor resultado clínico (por ejemplo, cura completa de la patología) o uno más moderado que puede aliviar los síntomas de la patología y resulta en la cura incompleta de la patología. Se apreciará que, en determinados casos, el régimen de tratamiento más agresivo puede estar asociado con alguna molestia para el sujeto o efectos secundarios adversos (por ejemplo, daño en células o tejidos sanos). El tipo de tratamiento puede incluir una intervención quirúrgica (por ejemplo, eliminación de la lesión, células, tejido u órgano enfermos), laparoscopia, una terapia de reemplazo celular, una administración de un fármaco terapéutico (por ejemplo, agonistas de receptores, antagonistas, anticuerpos, hormonas, agentes quimioterapéuticos) de un modo local o sistémico, una exposición a terapia de radiación usando una fuente externa (por ejemplo, haz externo) y/o una fuente interna (por ejemplo, braquiterapia) y/o cualquier combinación de éstos. La dosificación, esquema y duración del tratamiento puede variar, dependiendo de la gravedad de la patología y el tipo de tratamiento seleccionado, y los expertos en la técnica son capaces de ajustar el tipo de tratamiento con la dosificación, esquema y duración del tratamiento.

En aún otras realizaciones, el valor o intervalo de referencia predeterminado se deriva de un nivel previo o pluralidad de niveles de actividad enzimática medido en el sujeto, antes de un tratamiento o exposición a factor de riesgo (por ejemplo, carcinógenos). En todavía otra realización, el sujeto es un candidato para, o está sometido a un tratamiento de cáncer de pulmón (por ejemplo, quimioterapia, radiación, cirugía y semejantes), el valor o intervalo de referencia se deriva del nivel o niveles enzimáticos del sujeto antes del tratamiento, o a mitad del tratamiento.

En algunas realizaciones, el riesgo se asigna según la desviación de los niveles enzimáticos de los valores medianos de actividad enzimática, por ejemplo, mediana de los valores de la población control de referencia. En otras realizaciones, el riesgo se asigna según la desviación de los niveles enzimáticos de los de terciles, cuartilos, quintilos, sextilos, septilos, octilos, nonilos, decilos, percentiles de referencia o cualquier otra división de los valores de actividad enzimática referenciados. En aún otras realizaciones, el riesgo se asigna según los incrementos de actividad enzimática, por ejemplo, incremento del riesgo por 0,1, 0,5, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 102, 103, 104 o más unidades enzimáticas sobre el valor o intervalo de referencia. Así, en algunas realizaciones de los métodos de la presente invención, la razón de probabilidades para la actividad catalítica de MPG, cuando se determina por el ensayo de MPG-Hx, es 1,18 por cada 10 unidades de actividad catalítica por encima del valor de referencia predeterminado. En otras realizaciones de los métodos de la presente invención, el riesgo se asigna según la desviación estándar de la distribución de los valores de la actividad enzimática en la población referenciada, la razón de probabilidades para la actividad catalítica de MPG, cuando se determina por el ensayo de MPG-Hx, es 1,8 para cada desviación estándar.

Según algunas realizaciones, la "razón de probabilidades", o riesgo relativo de un individuo o población de individuos de desarrollar cáncer de pulmón se determina usando modelos de regresión logística condicional con el estado de tabaquismo como una variable de ajuste. En algunas realizaciones, el estado de tabaquismo se adjudica como bien fumadores o no fumadores. En otras realizaciones, el estado de tabaquismo puede incluir fumadores actuales, fumadores previos, y no fumadores. Adicionalmente y opcionalmente, el estado de tabaquismo puede incluir la cuantificación de la cantidad de tabaco (por ejemplo, número de cigarrillos, paquetes, puros, etc) fumados al día, al año, etc, edad de tabaquismo, tiempo desde el abandono, y semejantes.

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En algunas realizaciones específicas, la puntuación de reparación de ADN integrada (OMA) se calcula como 0,00425XAPE + 0,5419XOGG -0,2541XMPG. En algunas realizaciones, una puntuación de reparación de ADN integrada (OMA) de al menos 2,8 o menor es indicativa de un riesgo incrementado de cualquier cáncer de pulmón. En otras realizaciones, una puntuación de reparación de ADN integrada (OMA) de 2,5 o menos es indicativa de un riesgo incrementado de cáncer de pulmón de carcinoma de células escamosas. En aún otras realizaciones, una puntuación de reparación de ADN integrada (OMA) de 2,9 o menos es indicativa de un riesgo incrementado adenocarcinoma de pulmón.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a cualquier ser humano sometido a ensayo por los métodos o kits de la presente invención. El sujeto puede ser un sujeto que está en riesgo de tener cáncer de pulmón [por ejemplo, un sujeto genéticamente predispuesto, un sujeto de edad avanzada, un sujeto con historial médico y/o familiar de cáncer, un sujeto que padece COPD, un sujeto que se ha expuesto a humo y/o otros carcinógenos, peligros ocupacionales, peligros medioambientales] y/o un sujeto que presenta signos clínicos sospechosos de cáncer de pulmón o cáncer en general [por ejemplo, tos persistente, hemoptisis, dolor de pecho, dificultad para respirar, efusión pleural, silbidos, ronquera, bronquitis o neumonía recurrente, dolor óseo, síndromes paraneoplásicos, dolor inexplicable, sudoración, fiebre inexplicable, pérdida de peso inexplicable hasta anorexia, anemia y/o debilidad general]. Adicionalmente o alternativamente, el sujeto puede ser un sujeto humano sano que se está sometiendo a un chequeo de salud rutinario o cribado rutinario de una población aleatoria o representativa. El sujeto también puede ser un paciente o sujeto que participa en una investigación o ensayo.

La detección temprana efectiva del cáncer de pulmón puede en gran medida aumentar su éxito y reducir la gravedad del tratamiento para el cáncer de pulmón. Recientemente, los métodos de diagnóstico sofisticados tal como LDCT se han mostrado efectivos para la detección temprana del cáncer de pulmón, pero presentan una alta incidencia de falsos positivos (96%), y tienen un coste prohibitivo y son complejos para el cribado de poblaciones. La presente invención puede usarse para seleccionar de manera efectiva individuos, o grupos de individuos, para derivación a ensayos de diagnóstico adicionales, mediante el ensayo de la actividad catalítica de MPG o APE1 sólo, o MPG y bien APE1 o OGG1 en combinación por pares, o las tres de MPG, APE1 y OGG1 en una combinación de ensayos de tres vías.

Así, según algunos aspectos de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para seleccionar sujetos candidatos para un ensayo de diagnóstico de cáncer de pulmón, que comprende determinar un nivel de actividad catalítica de MPG, o APE1, o MPG y APE1, o MPG y OGG1, o todas de MPG y APE1 y OGG1 en una muestra biológica del sujeto. El sujeto o sujetos candidatos son derivados para al menos un ensayo de diagnóstico de cáncer de pulmón si el nivel de actividad catalítica de MPG está por encima de un valor de referencia predeterminado, si el nivel de actividad catalítica de APE1 está por debajo de un valor de referencia predeterminado, o, en ensayos combinados, si el nivel de actividad catalítica de MPG está por encima de un valor de referencia predeterminado y el nivel de actividad catalítica de APE1 y/o OGG1 está por debajo de un valor de referencia predeterminado. En otras realizaciones, la selección se efectúa mediante la determinación de un nivel de actividad catalítica de MPG y al menos uno de OGG1 y APE1 en las muestras, determinación de una puntuación de reparación de ADN integrada para el sujeto, y derivación del sujeto para diagnóstico adicional si la puntuación de reparación de ADN integrada es menor de un valor predeterminado.

Los métodos de la presente invención pueden usarse para seleccionar subpoblaciones candidatas de sujetos a partir de una población, para derivación a ensayo o ensayos de diagnóstico de cáncer de pulmón. En algunas realizaciones, la población es una población aleatoria definida, por ejemplo, según proximidad geográfica (por ejemplo, presencia en o alrededor de un centro o instalación para el cribado de cáncer de pulmón), o una población muestra seleccionada aleatoriamente para el cribado a partir de una población de empleados, estudiantes, docentes universitarios, etc, o la población puede ser una población definida por parámetros específicos, incluyendo, pero no limitado a edad, sexo, etnicidad, y semejantes, u, opcionalmente o adicionalmente, incluyendo factores de riesgo de cáncer de pulmón, [por ejemplo, predisposición genética, edad avanzada, historial médico y/o familiar de cáncer, COPD, exposición a humo y/o otros carcinógenos, peligros ocupacionales, peligros medioambientales] y/o una población que comprende sujetos que presentan signos clínicos sospechosos de cáncer de pulmón o cáncer en general. Así, según algunas realizaciones de la presente invención se proporciona un método para seleccionar una subpoblación de sujetos para un ensayo de diagnóstico de cáncer de pulmón, que comprende determinar un nivel de actividad catalítica de MPG o APE1 o ambas, o MPG y OGG1 o todas de MPG y APE1 y OGG1 en una muestra biológica de cada uno de los sujetos, identificar una subpoblación de sujetos que tiene un nivel de actividad catalítica de MPG mayor que un valor predeterminado, y/o un nivel de APE1 o OGG1 menor que un valor predeterminado en las muestras, y derivar la subpoblación para al menos un ensayo de diagnóstico de cáncer de pulmón. En determinadas realizaciones, el método incluye además recoger una muestra biológica de cada una de la población de sujetos. En otras realizaciones, la selección se efectúa mediante la determinación de un nivel de actividad catalítica de MPG y al menos una de OGG1 y APE1 en cada una de las muestras, determinación de una puntuación

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de reparación de ADN integrada para cada uno de los sujetos, e identificación de una subpoblación que tiene una puntuación de reparación de ADN integrada menor que un valor predeterminado.

El sujeto o sujetos candidatos, o subpoblaciones candidatas pueden derivarse, por ejemplo, para repetir las mediciones de actividad catalítica según la presente invención en uno o más tiempos posteriores, o para ser sometidos a ensayos específicos adicionales tales como mediastinoscopia, broncoscopia, tomografía computerizada (CT), tomografía computerizada espiral (dosis baja) (LDCT), tomografía de emisión de positrones (PET), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), rayos X, análisis de citología de células del esputo, biopsia de pulmón, perfilado genético y análisis de biomarcadores de cáncer de pulmón. En determinadas realizaciones, el ensayo de diagnóstico adicional para cáncer de pulmón es LDCT.

En determinadas realizaciones, se puede aconsejar a los sujetos o sub-poblaciones que tienen riesgo incrementado de desarrollar cáncer de pulmón, según se determina por los métodos que emplean el ensayo de enzimas de reparación del ADN de la presente invención, que alteren su estilo de vida y/o comportamiento para reducir la exposición a factores de riesgo de cáncer de pulmón, por ejemplo, reducción o cese de tabaquismo, reducción o eliminación de exposición a radiación, reducción o eliminación de exposición a polución particulada (talco, asbestos) y semejantes.

Un papel potencial del método de la presente invención en un entorno clínico en el que están disponibles técnicas altamente sensibles y específicas para la formación de imágenes de cáncer de pulmón, tales como barrido CT espiral (LDCT) es un complemento a dicho barrido. Brevemente, los pacientes con alto riesgo o elegidos aleatoriamente podrían cribarse potencialmente para cáncer de pulmón en un programa racional y rentable, como sigue: cribado primario de MPG, APE1, OGG1 o combinaciones de niveles de actividad de enzimas de reparación del ADN según los métodos de la presente invención (coste bajo); si los resultados son positivos, ir a un cribado secundario con barrido CT espiral del pecho (coste intermedio); si esto tiene un resultado positivo, ir a ensayo final con broncoscopia y biopsia (coste alto). Por ejemplo, sería directo implementar un nivel de actividad de enzima de reparación del ADN según la presente invención como un programa de cribado para poblaciones en riesgo porque cada sitio sólo requeriría un aparato de recogida de sangre u otra muestra biológica. Las muestras pueden enviarse entonces a un laboratorio central para ensayo de actividad enzimática.

En una realización de algunos aspectos de la presente invención, el sujeto es un fumador actual, tiene un historial de tabaquismo (fumador previo), o no ha fumado nunca (no fumador), ha estado expuesto a (inhalado) humo pasivo, ha estado expuesto a (inhalado) asbestos, particulados transportados por el aire (por ejemplo, talco) o ha estado expuesto a (inhalado) carcinógenos. En otras realizaciones de la presente invención, el sujeto ha estado expuesto a radiación ionizante, radón u otro gas radiactivo, y semejantes.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cáncer de pulmón" se refiere a cualquier crecimiento canceroso en el pulmón. En algunas realizaciones, el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), caracterizado por el tamaño de las células cuando se observa al microscopio. En otras realizaciones, NSCLC primario comprende mayormente adenocarcinoma (incluyendo carcinoma de células bronco alveolares), carcinoma de células escamosas y carcinoma de células grandes. Tal y como se usa en la presente memoria, el término cáncer de pulmón también incluye cánceres de pulmón de tipos celulares raros, tal como tumores carcinoides y linfoma. En algunas realizaciones, un paciente con cáncer de pulmón es un paciente diagnosticado con cáncer de pulmón sobre la base de formación de imágenes, biopsia, estadificación, etc.

Los presentes inventores han descubierto que la actividad catalítica de MPG incrementada se correlaciona con riesgo incrementado de desarrollar cáncer de pulmón. Así, según algunos aspectos de determinadas realizaciones de la presente invención, el método comprende determinar un nivel de actividad catalítica de MPG en una muestra biológica de un sujeto. Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "muestra biológica" se refiere a, pero no está limitado a, una muestra de un tejido, una célula o células, fluido del sujeto y semejantes. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de células raspada, una muestra de sangre, o una muestra de biopsia. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre, por ejemplo, una muestra de sangre completa, una muestra de células sanguíneas o una muestra de suero. En aún otras realizaciones, la muestra es una muestra de células de sangre periférica. Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "muestra de células de sangre periférica" se refiere a una muestra tomada de sangre circulante a diferencia de células sanguíneas en el sistema linfático, bazo, hígado, o médula ósea. La sangre periférica comprende eritrocitos, leucocitos y plaquetas. En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende células sanguíneas aisladas, por ejemplo, células mononucleares aisladas. En algunas realizaciones, la muestra de sangre periférica es una muestra de células mononucleares de sangre periférica, preparada a partir de sangre periférica completa.

Las muestras de células de sangre periférica se extraen típicamente con una jeringa con una aguja, y/o con un contenedor al vacío (por ejemplo, Vacutainer ®) y una aguja. Las muestras también pueden extraerse de bolsas de recogida de sangre.

Los métodos para procesar muestras de células de sangre periférica son conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en la sección de Ejemplos de la presente memoria más adelante.

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En algunas realizaciones de la presente invención, la actividad catalítica se determina a partir de una muestra biológica fresca. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "fresca" se refiere a una muestra que no se ha conservado antes del ensayo de actividad catalítica. En algunas realizaciones, la muestra fresca se ensaya <1 hora desde su retirada del sujeto. En otra realización más, la muestra fresca se ensaya aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 8, aproximadamente 10, aproximadamente 12 aproximadamente 18, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días o más desde la retirada del sujeto. En otras realizaciones de la presente invención, la muestra es una muestra procesada. Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "muestra procesada" se refiere a una muestra que se ha tratado, después de la retirada del sujeto, con el fin de aislar, purificar, alterar y/o conservar un componente o componentes de la muestra. Por ejemplo, en algunos aspectos de algunas realizaciones de la presente invención, la muestra es un extracto de células de sangre periférica. En más realizaciones adicionales, la actividad catalítica se determina en un extracto de células completas o extracto de proteína de las células de sangre periférica, por ejemplo, en un extracto de proteína de células mononucleares de sangre periférica, como se describe adicionalmente en la sección de Ejemplos de la presente memoria.

En algunos aspectos de realizaciones de la presente invención, la muestra es una muestra conservada, tal como, pero no limitado a, una muestra refrigerada o un extracto de proteína crioconservado de células mononucleares de sangre periférica. Los métodos para la conservación de muestras, sin deterioro significativo de su actividad enzimática son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe con detalle en la sección de Ejemplos de la presente memoria.

Según algunos aspectos de realizaciones de la presente invención, la actividad enzimática de las enzimas de reparación del ADN puede ensayarse usando uno cualquiera o más de sustratos de oligo o polinucleótido que portan una lesión reconocida por la enzima de reparación del ADN. En algunos aspectos de algunas realizaciones de la presente invención, la enzima es una ADN glicosilasa, que elimina una única base alterada del núcleo de azúcar, tal como metilpurina ADN glicosilasa (N-metilpurina ADN glicosilasa, ADN 3-metil adenina glicosilasa II, MPG; EC 3.2.2.21) u 8-oxoguanina ADN glicosilasa (OGG 1; EC 3.2.2-) y el sustrato es un oligonucleótido o polinucleótido con al menos una base alterada. Los sustratos ejemplares para MPG incluyen, pero no están limitados a, ADN bicatenario con al menos una cadena que porta una lesión hipoxantina (Hx, véase la Figura 2B, 3A), por ejemplo, SEQ ID NO: 1, o que porta una lesión 1, N6-etenoadenina (eA, véase la Figura 2C, 5A), por ejemplo, SEQ ID NO: 3. Los sustratos ejemplares para OGG1 incluyen, pero no están limitados a, ADN bicatenario con al menos una cadena que porta una lesión 8oxoguanina (8oxog, véase la Figura 2A), por ejemplo, SEQ ID NO: 11 (sustrato de OGG1).

En otros aspectos de algunas realizaciones de la presente invención, la enzima es una AP endonucleasa, que hidroliza el enlace fosfodiéster en el azúcar sin base, tal como APE1 [endonucleasa de sitio apurínico-apirimidínico (AP), APEX1, EC 4.2.99.18] y el sustrato es un oligonucleótido o polinucleótido con al menos un sito abásico. Los sustratos ejemplares para APE1 incluyen, pero no están limitados a, ADN bicatenario con al menos una cadena que porta un sito abásico nativo, o un sitio abásico modificado, tal como un sitio abásico furanilo (véanse las Figuras 2E y 8A), por ejemplo, SEQ ID NO: 8).

Los métodos para la preparación de sustratos oligonucleótidos para ensayar enzimas de reparación de ADN son muy conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos diseñados según las enseñanzas de la presente invención pueden generarse según cualquier método de síntesis de oligonucleótidos conocido en la técnica tal como síntesis enzimática o síntesis en fase sólida. El equipamiento y reactivos para ejecutar la síntesis en fase sólida están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Applied Biosystems. Cualquier otro medio para dicha síntesis también puede emplearse; la síntesis final de los oligonucleótidos está dentro de las capacidades de un experto en la técnica y puede conseguirse mediante metodologías establecidas como se detalla, por ejemplo, en "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988) y "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984) utilizando química de fase sólida, por ejemplo, cianoetil fosforamidita seguido de desprotección, desalación y purificación, por ejemplo, con un método con tritilo automatizado o HPLC.

El sustrato de ADN puede ser una sección corta de ADN bicatenario, que comprende aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 32, aproximadamente 35, aproximadamente 37, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100 o más pares de bases y al menos una de las lesiones reconocidas por la actividad enzimática que se va a ensayar. En una realización particular, los sustratos de ADN portan lesiones únicas y tienen una longitud de 30-40 pares de bases. Alternativamente, o adicionalmente, el sustrato de ADN puede ser una sección larga de ADN, tal como un plásmido, que comprende miles o más pares de bases y que porta la o las lesiones del sustrato. Los sustratos de ADN que portan múltiples lesiones incluyen, pero no están limitados a, sustratos que tienen múltiples lesiones de tipo idéntico (por ejemplo, Hx o εΑ o 8oxoG), o sustratos complejos que tienen una o más lesiones de al menos dos tipos diferentes (por ejemplo, Hx y eA, o Hx y 8oxoG, o eA y 8oxoG).

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Los productos de la reacción pueden detectarse usando una variedad de métodos de detección del ADN, tales como análisis de transferencia Southern, PCR, fluorometría, secuenciación y semejantes. En realizaciones específicas, la detección de productos de reacción de ADN radiactivos se efectúa después de la desnaturalización, por PAGE desnaturalizante (por ejemplo, urea) y visualización de los fragmentos desnaturalizados por formación de imágenes con fósforo, como en los Ejemplos II-V. En algunas realizaciones, la detección de los productos de la reacción fluorescentes se efectúa por la monitorización automatizada de la fluorescencia de los fragmentos desnaturalizados de la mezcla de reacción usando electroforesis en gel capilar, por ejemplo, en el analizador genético ABI3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Alternativamente y opcionalmente, la proteína enzimática de reparación del ADN puede cuantificarse en la muestra,

o extracto de muestra. La cuantificación de la presencia de enzima de reparación del ADN en la muestra puede efectuarse mediante anticuerpos específicos (policlonales y/o monoclonales) usando técnicas inmunológicas tales como transferencia Western, ELISA, y semejantes.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un kit de ensayo para determinar un riesgo de un sujeto humano de desarrollar cáncer de pulmón, que comprende reactivos para determinar un nivel de al menos una de actividad de MPG y/o APE1 de una enzima de reparación/que previene el daño del ADN en una muestra biológica de un sujeto. En determinadas realizaciones, el kit incluye, un envase que incluye, contenido en contenedores sellable, un sustrato de ADN para MPG y/o APE1 que tiene al menos una lesión en él y un tampón de reacción seleccionado adecuado para soportar la actividad de reparación del ADN. Opcionalmente y adicionalmente, el kit comprende un sustrato de ADN para OGG1. En realizaciones específicas, los sustratos de ADN comprenden, por ejemplo, SEQ ID NOs: 1, 7 y 2, ó 3 y 4, para ensayar MPG, SEQ ID NOs: 8, 9 y 10 para ensayar APE1, y SEQ ID NOs. 5 y 6 para ensayar OGG1. En determinadas realizaciones, los sustratos de ADN son ADNds que comprende los sustratos mencionados anteriormente hibridados en pares, por ejemplo, SEQ ID NOs: 1+2, 3+4, 5 (u 11)+6, 7+2, 8+9 y 10+9.

En una realización específica, el kit también puede incluir contenedores para recoger muestras, por ejemplo, muestras de raspados de tejido, muestras de sangre, o biopsias, y puede contener además conservantes, por ejemplo, inhibidores de proteasas. El kit también puede incluir tubos de ensayo para separar células sanguíneas, por ejemplo, linfocitos, PBMC, etc. En algunas realizaciones, los tubos de ensayo están preenvasados con un anticoagulante, tal como, pero no limitado a, heparina, ACD o CPDA-1. En algunas realizaciones, el kit incluye además un líquido que tiene una gravedad específica seleccionada efectiva para separar linfocitos de células sanguíneas rojas mediante centrifugación, por ejemplo, Ficoll contenido en tubos de aislamiento de linfocitos. En realizaciones específicas, el kit incluye una disolución que tiene una osmolaridad seleccionada efectiva para lisar células sanguíneas rojas.

En algunas realizaciones, el kit incluye instrucciones para uso en un método para determinar un riesgo de cáncer de pulmón en un sujeto. Dichas instrucciones pueden incluir, pero no están limitadas a, intervalos de valores de referencia para evaluar los resultados de los ensayos de actividad de enzima de reparación de ADN en las muestras, o tablas para asignar intervalos de valores de referencia específicos según categorías tales como sexo, edad, estado de tabaquismo y semejantes. Las instrucciones pueden incluir además protocolos para alertar a los médicos sobre los resultados, para derivar al sujeto, o sujetos, a ensayos de diagnóstico y/o tratamiento adicional, tal como, pero no limitado a, LDCT, biopsia, ensayos de citología de esputo y semejantes, y sugerencias para alterar el estilo de vida del sujeto y comportamiento para reducir la exposición a factores de riesgo de cáncer de pulmón, por ejemplo, reducción o cese de tabaquismo. Las instrucciones pueden proporcionarse en un formato de papel, o pueden ser accesibles por ordenador, por ejemplo, en CD-ROM y/o otros medios legibles por ordenador. Dichas instrucciones también pueden proporcionar acceso a bases de datos estadísticas relevantes.

El kit también puede estar acompañado de una nota asociada con el contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, nota que refleja la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o la administración humana o veterinaria. Dicha nota, por ejemplo, puede ser una etiqueta aprobada por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos para ensayos de diagnóstico o un prospecto aprobado. Los contenedores que comprenden los reactivos para efectuar el método de la invención también pueden prepararse, y marcarse para el diagnóstico de riesgo de cáncer de pulmón, o selección de individuos para ensayos de diagnóstico de cáncer de pulmón adicionales, como se detalla adicionalmente anteriormente.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10%.

Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no limitado a".

El término "que consiste en" significa "que incluye y limitado a".

El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero sólo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y nuevas de la composición, método o estructura reivindicada.

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de pulmón. Los participantes proporcionaron un consentimiento informado escrito en el momento de la inclusión y se entrevistaron en persona para obtener información acerca de su historial personal y familiar de cáncer, historial de tabaquismo detallado activo y pasivo. Los diagnósticos de cáncer de pulmón se hicieron independientemente por los hospitales de diagnóstico e incluyeron información sobre el tipo histológico, estadificación TNM y grado tumoral. Todos los procedimientos se revisaron y aprobaron por un panel de revisión institucional del hospital. Los casos y sus controles sanos concordantes se seleccionaron sobre la base de la disponibilidad de una muestra se sangre extraída antes del procedimiento operativo o cualquier intervención de tratamiento (quimioterapia o radioterapia) y se envió inmediatamente al laboratorio para procesamiento.

Aislamiento de linfocitos periféricos: Las muestras de sangre se procesaron 18-24 horas después de la recogida. Una alicuota de 100 µl de cada muestra de sangre completa se analizó usando un contador de sangre Cobas Micros (Roche Diagnostic System). La muestra de sangre completa se centrifugó a 400xg durante 10 minutos a 20°C, y el plasma rico con plaquetas contaminantes se retiró. Se añadió PBS (disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, Sigma) suplementado con 2 mM EDTA a la parte de sangre completa remanente hasta un volumen final de 30 ml (cuando se usan tubos de recogida de 10 ml con anticoagulante CPDA-1) ó 35 ml (cuando se usan tubos de recogida con vacío con anticoagulante ACD), y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad de la sangre completa diluida en un medio polisacarosametrizoato de sodio en un tubo UNI-SEP (NOVAmed, Jerusalén, Israel) a 1.000 x g durante 30 minutos a 20°C.

Después de la centrifugación, la fracción de PBMC se lavó con tampón PBS + 2 mM EDTA. Las células sanguíneas rojas se eliminaron por lisis en 5 ml de 155 mM NH4Cl; 10 mM KHCO3; 0,1 mM EDTA durante 4 minutos a temperatura ambiente. Los linfocitos se lavaron con PBS + 2mM EDTA, y se suspendieron en 1 ml de PBS. El número de células sanguíneas blancas en esta suspensión se determinó usando un contador de células sanguíneas Cobas Micros (Roche Diagnostic System).

Las muestras que contenían 2,5-10 x 106 células se precipitaron por centrifugación a 5.000 rpm, durante 4 minutos a temperatura ambiente. El sedimento se resuspendió entonces hasta una concentración de 50.000 células/μl en 50 mM Tris HCl (pH 7,1), 1 mM EDTA, 0,5 mM espermidina, 0,1 mM espermina, y una mezcla de inhibidores de proteasas (Sigma). Las células se incubaron en hielo durante 30 minutos, después de lo cual se congelaron en nitrógeno líquido. Los linfocitos congelados se almacenaron a -80°C.

Preparación de un extracto de proteína: Los linfocitos congelados se descongelaron a 30°C, después de lo cual su contenido de proteínas se extrajo con 220 mM KCl, durante 30 minutos en hielo. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 13.200 rpm durante 15 minutos a 4°C. Se añadió glicerol al extracto de proteína hasta una concentración final de 10%, y el extracto se congeló en nitrógeno líquido. La determinación de la concentración de proteína se adaptó a una plataforma robótica usando el kit de ensayo BCA (Pierce) y γ-globulina bovina como un estándar. El manejo del líquido se realizó por un robot Freedom EVO 200 (Tecan) y la absorbancia a 562 nM se midió por un lector de placas Infinite M200 (Tecan).

Sustratos de ADN: Los sustratos de ADN se prepararon hibridando dos oligonucleótidos sintéticos complementarios como se detalla más adelante.

Sustratos de ADN radiactivos: El oligonucleótido que contiene la lesión específica de sitio se marcó en 5' con 32P usando γ-32P ATP y T4 polinucleótido quinasa, y se hibridó con el oligonucleótido complementario. El dúplex radiomarcado se purificó por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en un gel nativo al 10%. Su concentración se determinó por el Espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000.

Sustratos de ADN fluorescentes: El oligonucleótido que contiene la lesión específica de sitio se marcó en 3' con un fluoróforo Amarillo Yakima (Glen 205921), y se hibridó con el oligonucleótido complementario. El dúplex fluorescente se purificó por PAGE en un gel nativo al 10%. Su concentración se determinó por el Espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000.

Oligonucleótidos: Los oligonucleótidos se sintetizaron usando un Sintetizador de ADN Expedite 8909 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y los bloques de construcción de la lesión especial se adquirieron en Glen Research (Sterling, VA). Los oligonucleótidos también se adquirieron de varias fuentes comerciales incluyendo Sigma, IDT (Coralville, Iowa), Proligo (Boulder, CO) y Metabion (Martinsried, GmBH). A continuación, están los oligonucleótidos usados para cada uno de los ensayos de reparación de ADN:

Ensayo de MPG-Hx: el oligonucleótido 34-mer que contenía hipoxantina (Figura 2B) tenía la secuencia 5'-GT CCG GTG CAT GAC ACT GTX ACC TAT CCT CAG CG -3' (SEQ ID NO: 1) (X = hipoxantina). El oligonucleótido complementario tenía la secuencia 5'-CG CTG AGG ATA GGT TAC AGT GTC ATG CAC CGG AC -3' (SEQ ID NO:2).

Ensayo de MPG-eA: el oligonucleótido 32-mer que contenía 1, N6-etenoadenina (eA) (Figura 2C) tenía la secuencia 5'-CCT ACC TAG CGA CCT XCG ACT GTC CCA CTG CT -3' (SEQ ID NO:3) (X = eA). El oligonucleótido complementario tenía la secuencia 5'-AGC AGT GGG ACA GTC GTA GGT CGC TAG GTA GG -3' (SEQ ID NO:4).

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De alguna manera sorprendentemente, las PBMC humanas contienen una actividad enzimática de APE1 muy alta, aproximadamente 100.000 veces mayor que las actividades de OGG o MPG-eA.

La actividad de APE-1 en PBMC es un predictor fiable del riesgo de cáncer de pulmón

La Figura 9 muestra las distribuciones de la actividad enzimática de APE1 en los extractos de proteína de PBMC de

5 los mismos 100 pares de pacientes y controles que se ensayaron previamente para OGG y MPG. La actividad de APE1 en los extractos de proteína de casos se desplazó a valores menores que los controles. Consistentemente, la actividad específica promedio fue menor en casos (692 unidades/ng de proteína; 95% IC 656-728), que en los controles (793 unidades/ng de proteína, 95% IC 751-835, P<0,0001).

Tabla 6. Análisis de regresión logística condicional del valor de la actividad enzimática de APE1 en pacientes con 10 cáncer de pulmón y sujetos control*

Variable: Número de pacientes (%) Número de sujetos control (%) OR ajustada† (95% IC)

APE (por disminución de 100 U)‡: 96 (100,0) 96 (100,0) 1,4 (1,1 a 1,7) P=0,002

APE (por disminución de 1 SD): 96 (100,0) 96 (100,0) 2,0 (1,3 a 3,1) P=0,002

APE (por mediana)§ > 785 U ≤ 785 U: 27 (28,1) 69 (71,9) 48 (50,0) 48 (50,0) 1,0 (referente) 2,6 (1,2 a 5,4) P=0,01

APE (por terciles)# > 847 U 718-847 U ≤ 718 U: 19 (19,8) 17 (17,7) 60 (62,5) 32 (33,3) 32 (33,3) 32 (33,3) 1,0 (referente) 0,9 (0,3 a 2,2) P=0,77 3,3 (1,4 a 8,1) P=0,008 Ensayo de tendencia P=0,004

*OR = razón de probabilidades; IC = intervalo de confianza. †Regresión logística condicional para conjuntos concordantes ajustados para estado de tabaquismo (fumador, ex-fumador, no fumador). ‡La actividad de APE se midió como se describe en la sección "Materiales y Métodos" y se ajustó en el modelo de regresión logística condicional como una variable continua. La razón de probabilidades para tabaquismo, obtenida con este modelo, fue: ex-fumador frente a no fumador: 3,4 (95% IC= 1,4 a 8,2); fumador actual frente a no fumador: 2,6 (1,1 a 6,1). La actividad de APE expresada en unidades de desviación estándar (SD) para permitir una comparación con sentido. 211 U representan 1 SD en el grupo control. §Mediana de los valores de los sujetos control. #Terciles de los valores de los sujetos control. El tercil superior se eligió como el referente. Ajustado para la misma variable como se ha descrito anteriormente.

Materiales y Métodos

El análisis de regresión logística condicional se realizó para conjuntos concordantes ajustado para estado de tabaquismo para calcular el riesgo relativo estimado asociado con actividad disminuida de APE1. Como puede observarse en la Tabla 6 anterior, los individuos en el tercil más bajo de actividad de APE1 tenían un riesgo 15 incrementado de cáncer de pulmón comparado con individuos en el tercil más alto (OR = 3,3, 95% IC 1,4-8,1; P=0,008). Cuando la actividad de APE1 se usó como una variable continua, la razón de probabilidades ajustada para cáncer de pulmón asociada con una disminución de 100 unidades en la actividad de APE1 se incrementó estadísticamente significativamente (OR = 1,4, 95% IC 1,1-1,7; P=0,002). De forma similar, la razón de probabilidades ajustada para cáncer de pulmón asociada con una disminución de una unidad en la desviación 20 estándar (SD) en la actividad de APE1 fue significativamente mayor de 1 (OR=2,0; 95% IC=1,3 a 3,1; P=0,002). Para el sujeto con la actividad de APE1 más baja en este estudio (348 unidades/ng de proteína) esto representa un riesgo relativo estimado disminuido de 9,5 veces respecto al percentil 90% de los sujetos sanos. Estos resultados indican que la actividad de APE1 reducida es un biomarcador fiable para el riesgo de cáncer de pulmón. Así, hemos identificado 3 biomarcadores de riesgo para cáncer de pulmón: actividad reducida de OGG, actividad reducida de

25 APE, y actividad incrementada de MPG.

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entre casos y controles. La distribución de las puntuaciones de reparación de ADN integrada (OMA) entre los casos (pacientes) está desplazada claramente a valores más bajos de puntuación de reparación del ADN (OMA), comparado con el intervalo de puntuación de reparación del ADN (OMA) de los controles sanos entre controles fue 1,40-10,42 unidades, mientras entre los casos fue 0,53-7,01). La puntuación de reparación de ADN integrada (OMA) 5 media entre los casos fue 2,8 (95 IC 2,6 a 3,0), significativamente menor que la media (3,6 (95 IC 3,4 a 3,8)) entre los controles (P<0,0001) (Tabla 9). Cuando se analizó adicionalmente para cánceres específicos, se encontró que la puntuación de reparación de ADN integrada (OMA) en casos de adenocarcinoma fue 2,9 (95 IC 2,7 a 3,2), mayor que la 2,5 observada en casos de carcinoma de células escamosas (SQCC) (95 IC 2,2 a 2,7), P=0,04. No hubo una diferencia apreciable en la puntuación de reparación de ADN integrada (OMA) entre hombres y mujeres, y entre

10 sujetos de >65 y ≤ 65 años de edad. Además, no hubo una diferencia apreciable entre no fumadores, fumadores previos y actuales, y no se observó interacción entre la puntuación de reparación de ADN integrada (OMA) y el estado de tabaquismo.

Tabla 9. Distribución de características seleccionadas y puntuación de reparación de ADN integrada (OMA) en pacientes con cáncer de pulmón y sujetos control*

Variable: Participantes control (n=100) media de la puntuación OMA No. (95% IC) Participantes caso (n=100) media de la puntuación OMA No. (95% IC) P†

Todos~ SQCC Adenocarcinoma: 99 3,6 (3,4, 3,8) 99 2,8 (2,6, 3,0) 30 2,5 (2,2, 2,7) 45 2,9 (2,7, 3,2) §P=0,04 <0,0001 #P=0,35

Edad, años ≤ 65 > 65: 40 3,6 (3,3, 3,9) 59 3,6 (3,2, 3,9) ^P=0,67 40 2,8 (2,5, 3,1) 59 2,8 (2,5, 3,1) #P=0,91

Sexo Hombre Mujer: 59 3,5 (3,3, 3,8) 40 3,7 (3,3, 4,2) ^P=0,33 59 2,7 (2,5, 3,0) 40 2,9 (2,5, 3,2) #P=0,62

Estado de tabaquismo No fumador Fumador pasado Fumador actual: 50 3,7 (3,4, 4,1) 27 3,6 (3,2, 4,1) 22 3,3 (2,9, 3,7) ^P=0,39 24 2,8 (2,4, 3,2) 36 2,8 (2,4, 3,1) 36 2,8 (2,5, 3,1) #P=0,52

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