ES2702674T3 - Inhibidores selectivos de la isoforma alfa2 de Na,K-ATPasa y el uso para la reducción de la presión intraocular - Google Patents

Abstract

Un compuesto representado por la estructura de fórmula general (I): **(Ver fórmula)** en donde R se selecciona del grupo que consiste en -CH2C(=O)-NH2 (compuesto 1), -CH3 (compuesto 2), -(CH2)2- C(=O)-NH2 (compuesto 3), -NHC(=O)-NH2 (compuesto 4), -OH (compuesto 6), -CH(CH3)CONH2 (compuesto 8), - CH(CH2OH)COOH (compuesto 9), -CH(CH2OH)CONH2 (compuesto 10), -CH2CH3 (compuesto 12), -(CH2)2CH3 (compuesto 13), -CH2CH(CH3)2 (compuesto 14), -CH2CF3 (compuesto 15), -CH2C(=O)-NHOH (compuesto 17), - NHCSNH2 (compuesto 18), -CH2CH2F (compuesto 19); y X es OH, incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos y mezclas de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores selectivos de la isoterma a2 de Na,K-ATPasa y el uso para la reducción de la presión intraocular

Campo de la invención

La presente invención se refiere a derivados de digoxina que son inhibidores selectivos de la isoterma a2 de Na,K-ATpasa, y que reducen la presión intraocular. La invención se refiere además a usos de estos derivados para tratar trastornos asociados con la elevada presión intraocular, tal como glaucomas, y/o como agentes cardiotónicos.

Antecedentes de la invención

El glaucoma es una enfermedad que lleva a la ceguera irreversible. El control de presión intraocular (PIO) es el pilar de la actual terapia de glaucoma, y se consigue mediante varios fármacos, tales como p-bloqueantes, análogos de prostaglandina, agonistas del receptor a2 adrenérgico, agonistas colinérgicos e inhibidores de anhidrasa carbónica dados tópicamente o sistémicamente. La ruta óptica es preferible, con tal que el fármaco permee de forma eficaz la córnea, porque esto minimiza los efectos secundarios sistémicos. A pesar de la selección de fármacos disponibles, la PIO no controlada en muchos pacientes hace necesaria eventualmente la intervención quirúrgica. Por consiguiente, nuevas estrategias de tratamiento del glaucoma con fármacos son altamente deseables.

La Na,K-ATPasa es el motor para la producción del humor acuoso en el epitelio del cuerpo ciliar y, en principio, la inhibición de la Na,K-ATPasa suprimiría la producción de humor acuoso, y controlaría la PIO. El control de la PlO es el pilar de la terapia del glaucoma, pero a pesar de la selección de fármacos disponibles, nuevas estrategias de tratamientos con fármacos son altamente deseables. Anteriormente, la digoxina intra-venosa, un inhibidor clásico de la bomba Na,K, usada principalmente para tratar el fallo cardiaco congestivo, se consideró para este papel pero se descartó debido a la toxicidad sistémica (1, 2).

La Na,K-ATPasa consiste en subunidades a y p (ap) y subunidades reguladoras FXYD accesorias. Hay cuatro isoformas de la subunidad a l (a1-4) y tres isoformas de la subunidad p (p1-3) expresadas en un modo específico del tejido. a l es la isoforma común que mantiene los gradientes de Na y K en todos los tejidos, mientras que a2 se expresa principalmente en el músculo y los astrocitos, y a3 en las células nerviosas. El corazón humano expresa a l (c.70%) y las isoformas tanto a2 como a3 (c.30%) y p1. El epitelio ciliar en el ojo es un sincitio funcional que consiste en células pigmentadas (PE) apicales orientadas hacia la sangre y células no pigmentadas (NPE) baso-laterales orientadas hacia la cámara interior del ojo.

Se sabe que la isoforma de Na,K-ATPasa principal de las PE es a lp l mientras que de las NPE es a2p3 (3). Por consiguiente, en principio, los glucósidos cardiacos selectivos de a2 aplicados tópicamente que penetran en el ojo intacto y alcanzan el epitelio ciliar podría reducir de forma efectiva la PIO, y siempre que penetren en el ojo intacto y alcancen el epitelio ciliar, podrían aplicarse tópicamente. Una ventaja potencial de la aplicación tópica podría ser que los efectos tóxicos sistémicos típicos de los glucósidos cardiacos serían mínimos.

Otra posible aplicación de un glucósido cardiaco selectivo de a2 podría ser como un fármaco cardiotónico efectivo, con cardiotoxicidad reducida, en comparación con los fármacos conocidos tal como digoxina. Fármacos de digital tal como digoxina se han usado para tratar el fallo cardiaco durante más de doscientos años pero son fármacos peligrosos con múltiples efectos secundarios. Hay ahora buena evidencia de que la inhibición selectiva de a2 es especialmente efectiva en la mejora del acoplamiento excitación-contracción cardiaca y la mediación de inotropía positiva mediada por glucósidos cardiacos (4). La inhibición de a2, que es una isoforma menor, puede no provocar la sobrecarga de Ca celular, el distintivo de la toxicidad cardiaca (5).

La selectividad de isoforma de un gran número de glucósidos cardiacos conocidos se ha estudiado previamente (6), usando la levadura P. pastori que expresa las isoformas de Na,K-ATPasa (a1p1, a2p1, a3p1), y complejos de isoformas solubles en detergente purificados de Na,K-ATPasa (7-11). Las constantes de disociación, Kd, para glucósidos de digital, digoxina y digitoxina, medidos en ensayos de desplazamiento de 3H-ouabaína en membranas, mostraron una selectividad moderada (3-4 veces) para a2/a3 sobre a1. En contraste, las agliconas tales como digoxigenina y digitoxigenina no mostraron selectividad por las isoformas. En ensayos de inhibición de la actividad de Na,K-ATPasa, medida con los complejos de proteína de isoforma purificada, la digoxina y la digitoxina mostraron valores Ki 3-4 veces menores para a2 en comparación con a1, con a3 más similar a a1. De nuevo, ninguna aglicona de ningún glucósido cardiaco probada mostró selectividad por isoforma. Para los derivados de digoxina, con uno a cuatro restos de digitoxosa la selectividad a2/a1 máxima se encontró para la propia digoxina, con tres azúcares de digitoxosa. En contraste con los glucósidos de digital, la Kd de ouabaína mostró alguna preferencia por a l sobre a2 y valores Ki similares para las tres isoformas.

En base a estos estudios, se determinó que el resto de azúcar de digoxina probablemente determina la selectividad de la isoforma, que es generalmente coherente con las recientes estructuras de Na,K-ATPasa con ouabaína unida (12-14). El anillo de lactona insaturado y la parte esteroidea de la ouabaína se unen entre segmentos trans-membrana, M1, M4, M5 de la subunidad a, en la que no hay diferencias de aminoácidos entre isoformas. Asumiendo que las agliconas de todos los glucósidos cardiacos se unen de forma similar, la implicación es que las isoformas no pueden discriminar entre ninguna de las agliconas, como se encuentra experimentalmente. En contraste, el azúcar se une cerca de los bucles extracelulares, donde hay un número de diferencias de aminoácidos entre las isoformas. Estos residuos interactuarían con los azúcares de digoxina unida en una forma selectiva con la isoforma.

Hay una necesidad no cubierta de nuevas terapias para tratar los trastornos oculares asociados con la elevada presión intraocular, tal como glaucomas, y de nuevos agentes cardiotónicos, que sean efectivos por un lado, y que demuestren un perfil de seguridad aceptable por el otro.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a derivados de digoxina que son inhibidores selectivos de la isoforma a2 de Na,K-ATPasa sobre otras isoformas de esta enzima. Los compuestos de la invención reducen de forma efectiva la presión intraocular, y son útiles en el tratamiento de trastornos asociados con la elevada presión intraocular, tal como glaucomas, y/o como agentes cardiotónicos.

Se ha mostrado anteriormente, usando isoformas a ip i, a2pi y a3p1 humanas recombinantes, que el inhibidor clásico digoxina es parcialmente selectivo de a2 y que el resto tri-digitoxosa es responsable de la selectividad de la isoforma. La presente invención se basa en el descubrimiento de que la modificación de la tercera digitoxosa aumenta la selectividad por a2 sobre a l. Por consiguiente, la tercera digitoxosa de digoxina se ha modificado químicamente por oxidación con peryodato y aminación reductora usando una variedad de sustituyentes R-NH² , llevando a una serie de derivados de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina. Como se demuestra en esta memoria por primera vez, varios derivados muestran selectividad aumentada para a2 sobre a1, hasta aproximadamente 8 veces. Además, un modelo molecular de digoxina unida a la Na,K-ATPasa sugiere que los derivados de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina con diferentes sustituciones alifáticas podrían ser relativamente selectivas por el complejo a2p3. De hecho, una serie de derivados alifáticos muestran selectividad mejorada para a2p3 sobre a ip i - hasta aproximadamente 16 veces. Los efectos de glucósidos cardiacos aplicados tópicamente en la presión intraocular en conejos se han evaluado por su capacidad para evitar o invertir un aumento de presión intraocular agudo inducido por 4-aminopiridina o un agonista selectivo del receptor de adenosina A3. Los derivados de digoxina selectivos de a2 evitan o invierten la hipertensión ocular de forma más eficiente en comparación con la propia digoxina, digoxigenina o ouabaína. Los derivados de digoxina de la presente invención por consiguiente tienen la utilidad en el tratamiento de trastornos asociados con la elevada presión intraocular, tal como glaucomas. Como se demuestra en esta memoria, el derivado más selectivo de a2p3 es especialmente efectivo. Estas observaciones son coherentes con un papel principal de a2p3 en la producción de humor acuoso y sugieren que, potencialmente, los derivados de digoxina selectivos de a2 y especialmente selectivos de a2p3, podrían se de interés como nuevos fármacos para el control de la presión intraocular.

Además, los derivados de digoxina selectivos de a2 de la presente invención muestran toxicidad reducida, especialmente cuando se aplican de forma tópica. Primero, el hinchado de la córnea y la lente sería mínimo ya que solo a1 y una cantidad menor de a3 pero no a2 se expresa en el epitelio de la córnea y solo a1 se expresa en el epitelio de la lente. Segundo, un derivado de digoxina selectivo de a2 que alcanza la circulación general desde el ojo sería solo mínimamente cardiotóxico. Por consiguiente, la presente invención proporciona compuestos que no son solo potentes como agente reductor de PIO, sino que tienen el potencial de ser significativamente menos tóxicos que los compuestos parentales digoxina o digitoxina.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto representado por la estructura de la fórmula general (I):

en donde

R se selecciona del grupo que consiste en -C H ²-C(=O)-NH² (compuesto 1), -CH³ (compuesto 2), -(CH²)²-C(=O)-NH² (compuesto 3), -NH(C=O)-NH² (compuesto 4), -Oh (compuesto 6), -CH(CH³)-CONH² (compuesto 8), -CH(CH²OH)COOH (compuesto 9), -CH(CH²OH)CONH² (compuesto 10), -CH²CH³ (compuesto 12), -(CH²)²-CH³ (compuesto 13), -CH²CH(CH³)² (compuesto 14), -CH²CF³ (compuesto 15), -CH²(C=O)-NHOH (compuesto 17), -NHCSNH² (compuesto 18), -CH²CH²F (compuesto 19); y X es OH;

Que incluyen sales, hidratos, solvato, polimorfos y mezclas de los mismos.

Los compuestos de la invención son derivados de digoxina, es decir, X es OH en la Fórmula I. En una realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -C H ²-C(=O)-NH² (designado en esta memoria “DGlyN” o “compuesto 1”). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -C H ³ (designado en esta memoria “DMe” o “compuesto 2”). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -(CH ²)²-C(=O)-NH² (designado en esta memoria “DPrN” o “compuesto 3”). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -NHC(=O)-NH² (designado en esta memoria “DSCar” o “compuesto 4”). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X y R son cada uno OH (compuesto 6). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -CH(CH³)CONH² (compuesto 8). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -CH(CH²OH)COOH (compuesto 9). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -CH(CH²OH)CONH² (compuesto 10). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -C H ²CH³ (compuesto 12). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -(C H ²)²CH³ (compuesto 13). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -C H ²CH(CH³)² (compuesto 14). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -C H ²CF³ (designado en esta memoria “DMeCF³” o “compuesto 15”). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -C H ²C(=O)-NHOH (compuesto 17). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -NHCSNH² (compuesto 18). En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en donde X es OH y R es -C H ²CH²F (compuesto 19).

En una realización, el compuesto de la presente invención es selectivo para la isoforma a2 de Na,K-ATPasa sobre otras isoformas de Na,K-ATPasa. En otras realizaciones, el compuesto de la presente invención es selectivo para la isoforma a2p1, a2p2 y/o a2p3 de Na,K-ATPasa sobre la isoforma a1p1 de Na,K-ATPasa, representando cada posibilidad una realización separada de la presente invención.

En otras realizaciones, la presente invención se refiere a una composición que comprende un compuesto de fórmula (I), y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones preferidas, la composición farmacéutica es una composición oftálmica adecuada para aplicación tópica al ojo en forma de una disolución de gotas oculares, una pomada, una suspensión, un gel o una crema. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

Preferiblemente, la composición comprende además al menos un agente farmacéuticamente aceptable de uno o más de un estabilizador, un conservante, un agente quelante, un agente que modifica la viscosidad, un agente de tamponado, un agente de ajuste de pH. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

Los compuestos de la presente invención son preferiblemente selectivos para la isoforma a2 de Na,K-ATPasa sobre las otras isoformas de Na,K-ATPasa, es decir, inhiben la isoforma a2 (especialmente la isoforma a2p3) sobre otras isoformas de esta enzima, por ejemplo, la isoforma a1. Como tal, son útiles en métodos para reducir la hipertensión ocular, o para tratar enfermedades asociadas con la hipertensión ocular, tal como glaucoma. Por consiguiente, en una realización, la presente invención se refiere a un método para reducir la hipertensión ocular, o para tratar condiciones asociadas con la hipertensión ocular tal como glaucoma, administrando a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica según la presente invención.

En otras realizaciones, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I para usar en la reducción de hipertensión ocular, o para tratar enfermedades o trastornos asociados con la hipertensión ocular, tal como glaucoma. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

En otras realizaciones, los compuestos de la invención son también útiles como agentes cardiotónicos. Por consiguiente, en una realización, la presente invención se refiere a una composición cardiotónica que comprende un compuesto de fórmula (I), o un compuesto de fórmula (IA). En otra realización, la presente invención se refiere al compuesto de fórmula (I) o fórmula (IA), para usar como un agente cardiotónico. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

La presente invención se entenderá mejor en conjunto con la descripción, figuras y reivindicaciones posteriores.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1 Características técnicas de los experimentos de hipertensión ocular. Se usaron conejos blancos de Nueva Zelanda para medidas de PIO, la PIO (mm de Hg) de los conejos se midió usando un neumotonómetro calibrado (Modelo 30, Reichert Technologies).

FIGs. 2A-B Síntesis de derivados de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina (Fig. 2A) y purificación por HPLC de fase inversa de DGlyN, un compuesto representativo de la presente invención (Fig. 2B);

FIGs. 3A-B Inhibición de la actividad de N,K-ATPasa de complejos de isotermas purificados por derivados de digoxina. Los experimentos representativos para la inhibición de la actividad de Na,K-ATPasa por DGlyN (FIG. 3A) DMe (FIG.

3B). Isoterma a1/p1 □; isoterma a2/p1 ■; isoterma a3/p1 ▼. Las líneas son las curvas ajustadas para un modelo de inhibición de un sitio (véase el Ejemplo 4: Sección experimental).

FIG. 4 Hipertensión ocular transitoria inducida por 4-aminopiridina (4AP) en conejos. Control ■; 4AP, 1 gota (40 mg/ml) □ ; 4AP, 2 gotas (40 mg/ml) A.

FIGs. 5A-E Efectos de DMe (Fig. 5A), DGlyN (FIG. 5B), digoxina (FIG. 5C), ouabaína (FIG. 5D) y digoxigenina (FIG.

5E) en hipertensión ocular inducida por 4AP. Se añadieron glucósidos cardiacos (GCs) (1 gota, 25 j l ) a las concentraciones indicadas a ambos ojos 30 min antes de la adición de 4AP (40 mg/ml, 1 gota, 25 jl). Durante este periodo de pre-incubación hubo poco o ningún cambio en PIO. PIO se midió en los momentos indicados después de la adición de 4AP. En cada experimento se usó un conejo par cada concentración. Los valores son la media de la PIO en ambos ojos.

FIG. 6 Comparación del cambio en PIO con diferentes GCs. La figura representa el cambio de PIO (en mm Hg) después de 1,5 horas de administración de 4AP y GC 0,1 mM. La figura representa un promedio de 3 experimentos diferentes con la MEE.

FIGs. 7A-C Curso temporal de los efectos de derivados de digoxina en la PIO. En este experimento la PIO se elevó durante 7-8 horas, mediante la aplicación de 4AP cada 2 horas o bien en ausencia de glucósidos cardiacos o después de la aplicación de una gota del glucósido cardiaco (FIG. 7A y FIG. 7B), o se aplicó una gota de glucósido cardiaco una hora después de la primera aplicación de 4AP (FIG. 7C). Todas las demás condiciones y medidas son como se describen en la Fig. 5.

FIGs. 8A-B Efecto de DMe, DGlyN y digoxigenina en la hipertensión ocular inducida por IB-MECA, en donde DMe a las concentraciones indicadas se añadió 30 minutos antes de IB-MECA (Fig. 8A), digoxigenina, DGlyN o DMe, 1 mM se añadieron 1,5 horas después de la primera adición de IB-MECA (Fig. 8B), digoxigenina o DGlyN, 3 mM se añadieron 1,5 horas después de la primera adición de IB-MECA (Fig. 8C), se añadió IB-MECA 1 jM en el tiempo cero y cada 2 horas después de ahí (flechas).

FIG. 9 Disociación de digoxigenina, digoxina, DGlyN y DMe de la isoforma a2. La Fig. 9 representa los datos normalizados de experimentos representativos usando los cuatro glucósidos cardiacos diferentes, obtenido como se describe en los Métodos.

FIG. 10 Modelo de Digoxina unida a la Na,K-ATPasa, en donde el modelo representa el complejo a1p1 porcino (4HYT) con digoxina unida (3B0W) (Fig. 10A), detalle de residuos cerca de la digoxina unida (la numeración es para a1 y p1 porcina) (Fig. 10B), y p1 frente a p3 que muestra p1Gln84 y p3Val89 (Figs. 10C y Figs. 10D respectivamente).

FIG. 11 muestra la expresión de complejos de isoforma a2p3 y a2p2 además de a2p1 y a1p1 en geles teñidos de azul Coomassie. Las proteínas se desnaturalizaron antes del tratamiento con PNGasa.

FIG. 12 Activación de K de la actividad Na,K-ATPasa de complejos de isoformas a1p1, a2p1, a2p2, a2p3. La Figura muestra curvas representativas.

FIG. 13 Inhibición de la actividad Na,K-ATPasa de a1p1, a2p1, a2p2, a2p3 por digoxina. La Figura muestra curvas representativas.

FIG. 14 Inhibición de la actividad NA,K-ATPasa de a1p1, a2p1, a2p2, a2p3 por DIB. La Figura muestra curvas representativas.

FIG. 15 Inhibición de hipertensión ocular aguda por DIB. La Figura representa los efectos promedio de diferentes concentraciones de DIB en cuatro experimentos.

Descripción detallada de la invención

A menos que se especifique otra cosa, “un” o “una” significa “uno o más”.

La presente invención se refiere a derivados de digoxina que son inhibidores selectivos de la isoforma a2 de Na,K-ATPasa. Los compuestos de la invención reducen de forma efectiva la presión intraocular, y son útiles en el tratamiento de trastornos asociados con la elevada presión intraocular, tal como glaucomas, y/o como agentes cardiotónicos.

El término “inhibidor selectivo de la isoforma a2 de Na,K-ATPasa” significa que el compuesto inhibe la isoforma a2 de Na,K-ATPasa a un mayor grado que las demás isoformas, por ejemplo, la a1. En algunas realizaciones, los compuestos descritos en esta memoria son selectivos para la isoforma a2p1, a2p2 y/o a2p3 de Na,K-ATPasa sobre la isoforma a1p1 de Na,K-ATPasa. En algunas realizaciones, la selectividad del compuesto para la isoforma a2 de Na,K-ATPasa (por ejemplo, isoforma a2p1, a2p2 y/o a2p3) es hasta aproximadamente 20 veces por encima de las demás isoformas, por ejemplo, inhibición hasta 16 veces, 8 veces, 5 veces o 2 veces mayor que la isoforma a2 sobre las demás isoformas de esta enzima.

Compuestos

Según un aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto representado por la estructura de la fórmula general (I):

en donde

R y X son como se definen anteriormente, incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos y mezclas de los mismos. Varios compuestos preferidos de fórmula (I) se ejemplifican a continuación, representando cada posibilidad una realización separada de la presente invención.

Un compuesto de fórmula (1), en que X es OH y R se deriva de glicinamida (R = -CH²C(=O)-NH²), abreviado en esta memoria como “DGlyN”.

Un compuesto de fórmula (2), en que X es OH y R es CH³ , abreviado en esta memoria como “DMe”.

Un compuesto de fórmula (3), en que X es OH y R se deriva de propionamida (R = -CH²CH²C(=O)-NH²), abreviado en esta memoria como “DPrN”.

Un compuesto de fórmula (4), en que X es OH y R se deriva de semicarbazida (R = -NHC(=O)-NH²), abreviado en esta memoria como “DSCar”.

Un compuesto de fórmula (6), en que X y R son cada uno OH, abreviado en esta memoria como “DOH”.

Un compuesto de fórmula (8), en que X es OH y R se deriva de alaninamida (R = -CH(CH³)CONH²), abreviado en esta memoria como “DAlaN”.

Un compuesto de fórmula (9), en que X es OH y R se deriva de serina (R = -CH(CH²OH)COOH), abreviado en esta memoria como “DSer”.

Un compuesto de fórmula (10), en que X es OH y R se deriva de serinamida (R = -CH(CH²OH)CONH²), abreviado en esta memoria como “DSerN”.

Un compuesto de fórmula (12), en que X es OH y R es -C H ²CH³ abreviado en esta memoria como “DEt” .

Un compuesto de fórmula (13), en que X es OH y R es -(CH ²)²CH³ abreviado en esta memoria como “DPr” o “DP”. Un compuesto de fórmula (14), en que X es OH y R es -C H ²CH(CH³)² abreviado en esta memoria como “DiBu”. Un compuesto de fórmula (15), en que X es OH y R se deriva de 2,2,2-trifluoroetilo (R = -CH²CF³), abreviado en esta memoria como “DMeCF³” .

Un compuesto de fórmula (17) en donde X es OH y R es -C H ²C(=O)-NHOH, abreviado en esta memoria como “DGlyNHOH”.

Un compuesto de fórmula (18) en donde X es OH y R se deriva de semitiocarbazida (R = -NHCSNH²), abreviado en esta memoria como “DSSCar”.

Un compuesto de fórmula (19) en donde X es OH y R es -CH ²CH²F, abreviado en esta memoria como “DCH²CH²F”. Estos y otros compuestos representativos se muestran a continuación en la Tabla 1.

El término grupo “alquilo C¹-C⁶” se refiere a cualquier hidrocarburo alifático saturado, que incluye grupos de cadena lineal y cadena ramificada que contienen entre 1 y 6 átomos de carbono. El término grupo “alquilo C¹-C⁴” se refiere a cualquier hidrocarburo alifático saturado, que incluye grupos de cadena lineal y cadena ramificada que contienen entre 1 y 4 átomos de carbono. Ejemplos no limitantes de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, neopentilo, 1-hexilo, 2-hexilo y 3-hexilo. El grupo alquilo puede estar sustituido o no sustituido.

El término “halógeno” se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.

Uno o más de los compuestos de la invención, puede estar presente como una sal. El término “sal” incluye sales de adición tanto básicas como ácidas, e incluye sales formadas con aniones y cationes orgánicos e inorgánicos. El término “catión orgánico o inorgánico” se refiere a contraiones para un ácido. Los contraiones pueden elegirse de los metales alcalinos y alcalinotérreos (tal como litio, sodio, potasio, bario, aluminio y calcio), amonio y similares. Además, el término incluye sales que se forman mediante reacciones ácido-base estándar de grupos básicos y ácidos orgánicos 0 inorgánicos. Dichos ácidos incluyen ácidos clorhídrico, fluorhídrico, bromhídrico, trifluoroacético, sulfúrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, maleico, fumárico, cólico, pamoico, múcico, D-canfórico, ftálico, tartárico, salicílico, metanosulfónico, bencenosulfónico, p-toluensulfónico, sórbico, pícrico, benzoico, cinámico y similares.

La presente invención también incluye solvatos de los compuestos de la presente invención y sales de los mismos. “Solvato” significa una asociación física de un compuesto de la invención con una o más moléculas de disolvente. Esta asociación física implica grados variables de enlace iónico y covalente, que incluye enlace de hidrógeno. En ciertos ejemplos el solvato será capaz de aislamiento. “Solvato” incluye solvatos tanto en fase disolución como aislables. Ejemplos no limitantes de solvatos adecuados incluyen etanolatos, metanolatos y similares. “Hidrato” es un solvato en donde la molécula de disolvente es agua.

La presente invención también incluye polimorfos de los compuestos de la presente invención y sales de los mismos. El término “polimorfo” se refiere a un estado cristalino particular de una sustancia, que puede caracterizarse por propiedades físicas particulares tales como difracción de rayos X, espectro IR, punto de fusión y similares.

Composiciones farmacéuticas y usos terapéuticos

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula I para usar en un método para tratar trastornos asociados con la elevada presión intraocular, y en particular para tratar glaucoma, administrando una cantidad efectiva de unas composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula I como el ingrediente activo (es decir, compuestos 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 18 o 19) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula I para usar en un método para reducir la elevada presión intraocular, administrando una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I como el ingrediente activo (es decir, compuestos 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 12, 13,14, 15, 17, 18 o 19) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la invención es una composición oftálmica que se administra tópicamente en el ojo de un paciente para facilitar los niveles intraoculares efectivos del fármaco y para prevenir el nivel de fármaco innecesario en otros órganos. Dicha administración no sistémica, específica del sitio, reduce los efectos secundarios asociados con los fármacos. Sin embargo, la administración sistémica oral o de otra forma en una dosis efectiva para reducir la presión intraocular también es posible. Por ejemplo, la composición puede administrarse mediante un parche dérmico para liberación extensa.

Cuando la administración es tópica, las composiciones farmacéuticas que contienen el derivado de digoxina de fórmula 1 pueden formularse en varias formas terapéuticas adecuadas para la distribución tópica, que incluyen disoluciones, suspensiones, emulsiones y geles. El vehículo en estas formulaciones puede ser cualquier vehículo farmacéutico aceptable tal como solución salina, solución salina tamponada, gel carbopol, aceite mineral y similares. Las formulaciones pueden preparase de acuerdo con los procedimientos conocidos para la preparación de formulaciones oftálmicas. Preferiblemente, la concentración del derivado de digoxina en las composiciones farmacéuticas está en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 pg/ml, preferiblemente de aproximadamente 80 a aproximadamente 800 pg/ml y la formulación se aplica preferiblemente en una a cuatro dosis por día en donde cada dosis contiene aproximadamente 1 a 125 pg del derivado de digoxina, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 pg de derivado de digoxina.

Las composiciones farmacéuticas tópicas pueden estar en forma de gotas oculares para aplicarse por instilación en el ojo o pueden estar en forma de una pomada viscosa, gel o crema a aplicar mediante una pomada en la superficie ocular y pueden contener medios de control de liberación para facilitar la liberación sostenida durante un prolongado periodo de tiempo.

Las composiciones pueden incluir además sustancias farmacéuticamente aceptables auxiliares no tóxicas tales como estabilizadores, conservantes, agentes quelantes, agentes de modificación de la viscosidad, agentes de tamponado y/o agentes de ajuste de pH. Adicionalmente, las composiciones pueden contener otros agentes oftálmicos activos tal como agentes antibacterianos, potenciadores del confort, antioxidantes, fármacos reductores de la presión intraocular (PIO) y similares.

De acuerdo con otras realizaciones, el derivado de digoxina puede cargarse en un dispositivo de distribución de fármaco a insertar o implantar en el ojo del paciente para permitir la distribución del fármaco a una velocidad controlada y continua, mediante disolución, difusión o lixiviado, manteniendo así la concentración terapéutica efectiva durante un prolongado periodo de tiempo. El dispositivo de distribución de fármaco puede ser por ejemplo una película fina biocompatible cargada con el agente activo, insertada por ejemplo debajo del párpado inferior.

Otra posible aplicación de un glucósido cardiaco selectivo de a2 es como un fármaco cardiotónico efectivo, con cardiotoxicidad reducida, en comparación con fármacos conocidos tal como digoxina. Por consiguiente, en otras realizaciones, la presente invención proporciona composiciones cardiotónicas que comprenden un compuesto de fórmula I como el ingrediente activo (es decir, compuestos 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 18 o 19) y un vehículo farmacéuticamente activo. De acuerdo con esta realización, los compuestos según la invención pueden por lo tanto formularse para la administración oral, bucal, tópica, parenteral o rectal.

Para la administración oral, la composición puede proporcionarse, por ejemplo, en forma de comprimidos, cápsulas, polvos, disoluciones, jarabes o suspensiones preparadas por métodos convencionales usando diluyentes aceptables. Para la administración bucal, la composición puede proporcionarse en forma de comprimidos o bolsitas formulados de forma convencional.

Los compuestos según la invención pueden formularse para administración parenteral por inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden proporcionarse en forma de ampollas que contiene dosis sencillas o pueden proporcionarse en recipientes de dosis múltiples con conservante añadido. La composición puede estar en forma de suspensiones, disoluciones y similares.

De forma alternativa, el ingrediente activo puede proporcionarse en forma de polvo para reconstituirse antes del uso con un vehículo adecuado. Para el uso tópico, los compuestos según la invención pueden formularse de la manera convencional como pomadas, cremas, geles, lociones, polvos o pulverizaciones.

Los principios de la invención, que usan un derivado de isoflavona conjugada con albúmina unido a un resto bioactivo tal como un agente de formación de imágenes o un agente terapéutico para la distribución selectiva a células susceptibles a la isoflavona según la presente invención, pueden entenderse mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

En los siguientes ejemplos, solo los compuestos 1-4, 6, 8-10, 12-15 y 17-19 son compuestos de la presente invención. Todos los demás compuestos de los ejemplos se presentan aquí solo con propósito de comparación.

Ejemplo 1: Síntesis y prueba de derivados de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina.

Los derivados de perhidro-1,4-oxazepina se prepararon según el método descrito en (15). La Fig. 2A muestra la ruta sintética que implica (a) oxidación de peryodato selectiva del tercer resto de digitoxosa y (b) aminación reductora del dialdehído usando la amina libre (R-NH²) más NaCNBH³ , para el caso de glicinamida. Los compuestos se purificaron por HPLC, como se ve por el ejemplo representativo del derivado DGlyN en la Fig. 2B. El progreso de ambas etapas de las reacciones además de la purificación de los compuestos se monitorizó de forma rutinaria por medidas de cromatografía en capa fina y espectrometría de masas. Se obtuvieron espectros y asignaciones completas de 1H y 13C RMN para varios derivados y se publicarán en otra parte. Las estructuras de compuestos representativos de la invención se muestran en la Tabla 1. Para la verificación de estructuras, se determinaron también las masas de los compuestos purificados. La tabla muestra las estructuras de los diferentes sustituyentes amina, nombres, y masas teóricas y encontradas experimentalmente de quince derivados de digoxina, y también el derivado de glicina de bisdigitoxosa digoxigenina. Los espectros de masas se obtuvieron en un espectrómetro de Micromasas ZQ 4000, con Ionización por electropulverización.

Tabla 1. Estructuras, nombres y masas de derivados de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina

* bis-glicina se refiere a un derivado de glicina de bis-digitoxosa digoxigenina.

Ejemplo 2: Inhibición de la actividad de Na,K-ATPasa.

Las Figs. 3A-B muestran curvas para la inhibición de actividad Na,K-ATPasa de isotermas humanas purificadas (a1p1, a2p1 y a3p1) de dos derivados, DGlyN (FIG. 3A) y DMe (FIG. 3B), con selectividad mejorada para a2 en comparación con la propia digoxina. La Tabla 2 proporciona información de los efectos inhibidores de dieciséis derivados de perhidro-1-4-oxazepina de digoxina, de acuerdo con la presente invención. Los datos en la Tabla 2 muestran que las relaciones de selectividad de isoterma (Kia1/a2) de varios derivados: DGlyN (7,45±0,46), DMe (6,47±0,71), DGly (5,1±0,54), DPrN (5,28±0,75) y DSCar (4,98±1,2) son significativamente mayores que las de digoxina (3,44±0,34). Para estos compuestos, los valores Ki para tanto a l como a2 son menores que para la digoxina, pero el efecto es mayor para a2 en comparación con a1. Consecuentemente, la relación Ki a1/a2 es mayor para los compuestos de la invención en comparación con la digoxina. En todos los casos la Ki para a3 es más cercana a la de a l que la de a2. Esta característica se ve claramente para DMe y DGlyN como se ve en las Figs. 3A-B, y también es aplicable a los demás compuestos abarcados por la Fórmula (I). Por consiguiente, es principalmente la Kia1/a2 la que está afectada por la modificación de la tercera digitoxosa. Los valores Ki de varios derivados en la Tabla 2 (por ejemplo DEt) son significativamente menores que para la propia digoxina pero no se observó un efecto diferencial entre las isoformas, de manera que la relación de selectividad no se mejoró. Los valores de Ki de varios derivados distintos en la Tabla 2 (por ejemplo DEtDA) son significativamente menores que para la propia digoxina y se observó algún efecto diferencial. En otros casos (por ejemplo DOH y DSer los valores de Ki fueron mayores que para la digoxina y no se mejoró la selectividad para a2. El resultado en la Tabla 2 de que el derivado de glicina de bis-digitoxosa digoxigenina (DbisGly) muestra menor selectividad para a2 sobre a l en comparación con el derivado de glicina de la tri-digitoxosa (DGly) muestra que la modificación del tercer residuo de digitoxosa es óptimo para este efecto, coherente con una conclusión similar en (6). En resumen, la estrategia de modificar el tercer resto de digitoxosa produjo compuestos con una relación Kia1/a2 mejorada, alcanzando más de dos veces el valor de la digoxina en el caso de los derivados más selectivos de a2, DGlyN y DMe.

Tabla 2: Valores Ki para la inhibición de la actividad de Na,K-ATPasa de isotermas a1p1 y a2p1 con relaciones de selectividad

*Dbis es bis digitóxido de digoxigenina

La abreviatura GC corresponde a la siguiente amina de partida: DOH-hidroxilamina; DGly-glicina; DGlMe-metiléster de glicina; DGlyN-glicinamida; DAlaN-alaninamida; Dser-serina; DSerN-serinamida; DSCar-semicarbazida; DPrN-propionamida; DEtDA-etilendiamina; DMe-metilamina; DEt-etilamina; DMeCF³-2,2,2-trifluoroetilamina; DbisGly-bisdigitóxido de glicina. Los valores p se calcularon por la prueba t y se indicaron como *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. n, número de experimentos independientes. p (a2va1) indica la significancia de las diferencias entre Kia2p1 y Kia1p1. p (v digoxina) indica la significancia de la diferencia de la relación de selectividad (Kia1p1/Kia2p1) en comparación con la (Kia1p1/Kia2p1) de la digoxina.

Ejemplo 3: Reducción de la presión intraocular mediante digoxina aplicada tópicamente y derivados de perhidro-1,4-oxazepina.

La presión intraocular en conejos se midió usando un “Neumotonómetro Reichert Modelo 30^TM” después de anestesiar la córnea con anestésico local. Se usaron dos diferentes agentes farmacológicos para inducir la elevación aguda de PIO y determinar si los glucósidos aplicados tópicamente de la presente invención son capaces de hacer frente a dicho efecto. Primero, la elevación de PIO se indujo de forma aguda con 4-aminopiridina (4AP), que se ha presentado anteriormente para elevar de forma aguda y transitoria la PIO en los ojos de conejos en 4-8 mm de Hg desde una PIO en descanso de 22-24 mm de Hg (16). Se mostró que el mecanismo de hipertensión ocular inducido por 4AP, que es un bloqueante bien conocido de un canal de K dependiente del voltaje, implica la liberación de norepinefrina desde los nervios simpáticos del iris-cuerpo ciliar, llevando a una tasa de entrada de humor acuoso aumentada. La Fig. 4 confirma el efecto básico de 4AP. Una o dos gotas de 4AP en cada ojo elevó la PIO en 3-6 mm de Hg, y el efecto se disipó después de 5 horas.

Como la PIO refleja un equilibrio de la entrada y la salida del humor acuoso, la reducción de la entrada inducida por 4AP aumentada de humor acuoso mediante glucósidos cardiacos evitaría el aumento de la PIO. Por consiguiente, el diseño experimental estándar para probar los efectos de los glucósidos cardiacos implicó la aplicación tópica de los compuestos (1 gota en cada ojo) 30 minutos antes de la aplicación de 4AP y medida de PIO cada 30 minutos durante cinco horas. Las Figs. 5A-E muestran los efectos de DMe (Fig. 5A), DGlyN (Fig. 5B), digoxina (Fig. 5C), ouabaína (Fig. 5D) y digoxigenina (Fig. 5E) en la PIO usando este protocolo. Cada experimento se hizo tres veces, aunque las figuras representan un experimento representativo que usa un conejo diferente para cada concentración del glucósido cardiaco. Los valores representados representan las presiones promedio para ambos ojos aunque los valores son similares en cada ojo medido de forma separada. La digoxina (Fig. 5C) a una alta concentración (1 mM) es capaz de prevenir el aumento inducido por 4AP en la PIO, mientras que la digoxina 0,25 mM es poco efectiva. En comparación, tanto DMe como DGlyN (Fig. 5A y Fig. 5B respectivamente), el más selectivo de a2 de los nuevos derivados de perhidro-1,4-oxazepina, son efectivos a concentraciones mucho menores (0,05-0,1 mM) que la digoxina. De forma similar la aglicona de digoxina, digoxigenina, redujo de forma efectiva la PIO a concentraciones menores que la digoxina (Fig. 5E). Finalmente, la ouabaína, un glucósido cardiaco soluble en agua ampliamente usado, redujo algo la PIO solo a 1 mM mientras a concentraciones menores fue poco efectiva (Fig. 5D).

La Fig. 6 compara los efectos relativos de DGlyN, DMe, digoxigenina, digoxina y ouabaína, en la PIO todas a 0,1 mM y un punto temporal. Los datos representan el efecto promedio ± EEM de los tres experimentos separados (es decir 6 ojos en total) y confirman el orden como DGlyN“ DMe“ digoxigenina>digoxina>ouabaína.

Con el tiempo, los glucósidos cardiacos que penetran al epitelio ciliar después de una única aplicación se arrastrarán del ojo a la circulación general y por tanto el efecto en la PIO se disipará. Aunque las Figs. 5 y 6 demuestran que los glucósidos cardiacos reducen la PIO con mayor o menor eficacia, mediante este protocolo experimental la longevidad del efecto no puede evaluarse debido a la naturaleza transitoria del efecto del propio 4AP. Por consiguiente, se realizaron experimentos adicionales en que el efecto de una única gota de digoxina, digoxigenina, DGlyN, DMe u ouabaína se comparó cuando el 4AP se añadió después de cada dos horas para así mantener la PIO al nivel elevado durante 7-8 horas, incluso en ausencia de los glucósidos cardiacos (Fig. 7). Mediante este protocolo, la reducción de la PIO se ve de hecho que es transitoria en la Fig. 7. La Fig. 7A muestra un experimento representativo con DMe que demuestra una clara dependencia del tiempo de depuración en la concentración. La PIO se mantiene al nivel bajo durante 5,8, 4,5 y 2,5 horas para 2 mM, 0,5 mM y 0,2 mM respectivamente, antes de que la PIO suba de nuevo al nivel elevado con 4AP. Otros experimentos mostraron que a concentraciones iguales el tiempo de depuración para DGlyN es ligeramente más rápido que para DMe. Se detectaron diferencias notables en los tiempos de depuración entre DMe, DGlyN, digoxigenina, digoxina y ouabaína cuando se aplicaron a concentraciones iguales (1 mM). Como se ve en la Fig. 7b , DMe mantuvo la PIO al nivel bajo durante 5,5 horas, en comparación con las 3,5 horas para DGlyN, aproximadamente 2 horas para digoxigenina y solo 1 hora para digoxina. La ouabaína se arrastró a una velocidad entre la de la digoxina y la digoxigenina. El dato no se muestra por claridad. En resumen, los derivados más selectivos de a2 DMe (compuesto 2) y DGlyN (compuesto 1) producen el efecto de más larga duración para reducir la PIO, en comparación con digoxina (un cardio-glucósido (GC) menos selectivo de a2), o digoxigenina un GC no selectivo.

La Fig. 7C muestra que DGlyN y DMe invierten rápidamente la hipertensión ocular pre-establecida. DGlyN o DMe (0,1 o 1 mM) se aplicaron una hora después de la primera aplicación de 4AP, que se añadió cada dos horas. Evidentemente, en 30 minutos DGlyN y DMe invirtieron la subida inicial de la PIO, indicando que los compuestos permean la córnea y se unen a la bomba suficientemente rápido como para tener este efecto. La PIO normalizada se mantuvo entonces durante al menos 4 horas, como en la Fig. 7B. Independientemente de los efectos superiores de los derivados selectivos de a2 a bajas concentraciones en comparación con la propia digoxina, el rápido comienzo de los efectos de DGlyN y DMe sugiere la inhibición de a2, porque se conoce a2 por unirse a glucósidos cardiacos mucho más rápidamente que a1 (17).

Para verificar que los derivados de digoxina inhiben la entrada de humor acuoso directamente y que no actúan indirectamente, por ejemplo, interfiriendo con la propia 4AP, se usó IB-MECA tópico. IB-MECA induce la hipertensión ocular aguda mediante un mecanismo diferente y bien definido. Específicamente, IB-MECA es un agonista selectivo del receptor de adenosina A3, y eleva la entrada del humor acuoso y la PIO activando los canales de Cl de las células NPE (18, 19). Una única gota de IB-MECA (1 pM) indujo un aumento significativo aunque transitorio en la PIO, mientras que la aplicación repetida cada 2 horas mantuvo la PIO aumentada durante 4-5 horas (véase la Fig. 8A de control). La Figura 8A representa los efectos de DMe (0,1-1 mM) aplicado antes de la IB-MECA, y se obtuvo un resultado similar para DGlyN (no mostrado). La Figura 8B representa los efectos de digoxigenina, DGlyN y DMe (1 mM) aplicados después de IB-MECA. Los efectos de digoxigenina, DGlyN y DMe a 1 mM fueron casi los mismos que se ven con 4AP en la Fig. 7C, excluyendo obviamente la noción de la interferencia de los GC con la acción de la propia 4AP. Además, la duración del efecto fue significativamente mayor para DMe y DGlyN que para la digoxigenina. Además, cuando la concentración de DGlyN y digoxigenina se elevaron a 3 mM, la diferencia en la duración del efecto se amplificó en gran medida en comparación con el experimento con 1 mM.

El espesor de la córnea se midió también después de la aplicación de Digoxina (1 mM), DGlyN (0,5 mM), DMe (0,5 mM) y ouabaína (1 mM) después de 4AP. Al menos durante una escala de tiempo de 4 horas, el espesor de la córnea, medido en micras, no se afectó significativamente. Por consiguiente, en este estudio, no se detectó cambio en el espesor de la córnea (Tabla 3), indicativo de la falta de efectos tóxicos locales. Además no se observó ni rojez ni irritación local en la conjuntiva o la córnea. Se obtuvieron resultados similares con GCs aplicados después de IB-MECA.

Tabla 3: Espesor de la córnea por paquimetría antes y después de la aplicación de glucósidos cardiacos

OD, ojo derecho, OI ojo izquierdo. El espesor de la córnea se da en micras. Cada valor representa el promedio de tres medidas independientes.

Ejemplo 4: Disociación de glucósidos cardiacos de a2p1

Ya que la principal isoforma en las células NPE es a2 y la disociación desde la bomba se espera que afecte a la duración de los efectos en la PIO, se compararon las velocidades de disociación de diferentes glucósidos cardiacos procedentes de la isoforma a2p1 purificada. Las velocidades de disociación de digoxina, digoxigenina, DGlyN y DMe se compararon usando el protocolo descrito en (20). La Figura 9 representa experimentos representativos para cada uno de los cuatro compuestos y la Tabla 4 muestra las constantes de velocidad promedio y los semi-tiempos a partir de tres o cuatro experimentos. Evidentemente, la aglicona de digoxigenina disocia mucho más rápido que la digoxina o cualquier otra glicona, y DMe y DGlyN también disocian significativamente más despacio que la propia digoxina. La lenta disociación de DMe y DGlyN sugieren su potencial de un efecto duradero en la PlO.

Tabla 4: Velocidades de disociación de glucósidos cardiacos del complejo de la isoforma a2p1.

Ejemplo 5: Derivados de digoxina con selectividad mejorada para el complejo a2p3

Debido a que a2p3 y no a2p1 es el principal complejo de isoforma en las células NPE, se investigó adicionalmente si la isoforma p1, p2 o p3 es un factor importante.

Modelado molecular de la digoxina unida a Na,K-ATPasa

Una visión molecular a las interacciones del tercer residuo de digitoxosa y la selectividad de la isoforma se ilustra en la Fig. 10A. La figura presenta un modelo molecular en que la molécula de digoxina (coordina 3B0W) se introdujo en la molécula unida a ouabaína de alta afinidad (4HYT) (14) de manera que las partes de lactona y esteroide de ouabaína y digoxina solapan estrechamente, y entonces se obtuvo una estructura de energía mínima. Los tres residuos de digitoxosa apuntan hacia afuera hacia subunidades tanto a como p. La imagen ampliada en la Fig. 10B muestra el resto digitoxosa en la proximidad (<3,5A) de residuos AspAspArgTrp887 en L7/8 de a, estando la tercera digitoxosa cerca tanto de aTrp887 como además de pGln84. El soporte para esta orientación hacia la subunidad p viene de una vieja observación de que las sondas de fotoafinidad situadas en la tercera digitoxosa de la digitoxina marcan las subunidades tanto a como p, mientras que las sondas de fotoafinidad situadas en otras regiones de moléculas de glucósido cardiaco marcan solo la subunidad a (21, 22). Como se sugiere por el modelo, aTrp887 es uno de solo cuatro residuos en los bucles extracelulares que son diferentes en a2 (y a3) de a1, (Gln119, Glu307, Val881 y Trp887 en a l de cerdo), y se dedujeron anteriormente que eran candidatos para determinar la selectividad de la isoforma (23). La gran proximidad a uno de estos cuatro residuos se adapta muy bien con la noción de que las interacciones de la tercera digitoxosa son importantes para la selectividad de la isoforma, y los actuales descubrimientos de que los derivados de la tercera digitoxosa pueden mejorar la selectividad de la isoforma. En a2, Trp887 se sustituye por una treonina.

Además, Gln84 en p1 se sustituye por Val89 en p3 y Glu en p2 (Fig. 10C y D). Como a2p3 es el principal complejo de isoforma en las células NPE parece que introduciendo grupos alifáticos mayores en los derivados de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina que Me y Et que ya se han probado, sería posible producir derivados de digoxina con selectividad mejorada para a2p3 en comparación con a1p1 el complejo de isoforma principal en todas las demás células. Otra posible ventaja de derivados más hidrófobos es que podría esperarse que fueran más permeables a través de la córnea y por consiguiente, potencialmente, efectivos en la reducción de la PIO a menores concentraciones que DMe o DGlyN.

Expresión, purificación y caracterización de los complejos de isoforma a2p3 y a2p2 humanos

Para desarrollar compuestos con mayor selectividad a a2p3 humano, se expresaron complejos de isoforma a2p3 y a2p2 humano como se describe en los métodos posteriores. La Figura 11 muestra un gel de proteína de los complejos de isoforma purificada a2p1, a2p2, a2p3 y a lp l antes o después del tratamiento con PNGasa (en el estado desnaturalizado). p1 tiene 3 sitios de glucosilación, p3 tiene dos sitios de glucosilación mientras que p2 tiene siete sitios de glucosilación. El orden de movilidad en el gel, p3>p2>p1, se adapta bien a las masas predichas de las subunidades desglucosiladas de p1, 37172,6>p2, 35422,2>p3, 33678,9. Las actividades de N,K-ATPasa promedio de los complejos purificados fueron; a lp l, 19,3±2; a2p1, 18,2±1,6; a2p2, 7,7±1,8 y a2p3 9,7±0,26 jmoles/min/mg de proteína (n=4). Debido a que los glucósidos cardiacos y los iones K son mutuamente antagonistas, un punto importante en relación a la unión de glucósidos cardiacos es el K0,5 K para la activación de Na,K-ATPasa. El término “Ko^,5 K” como se usa en esta memoria significa la mitad de la concentración máxima de iones potasio (K) necesarios para la activación de la actividad de Na,K-ATPasa. La Fig. 12 y la Tabla 5 muestra que las afinidades aparentes por K son significativamente diferente entre los complejos de isoforma, en el orden a1p1< a2p1< a2p2< a2p3. La inhibición mediante digoxina es más efectiva para las isoformas con mayor Ko^,5 K (Ki a1p1> a2p1> a2p2> a2p3), que lleva por tanto a una mayor selectividad para a2p3 sobre a1p1 (Fig. 13). Esta selectividad aumentada se explica por un menor grado de antagonismo K-digoxina y se espera para todos los glucósidos cardiacos en el mismo grado que para la digoxina.

Tabla 5: K⁰⁵ K para la activación de la actividad de Na,K-ATPasa de los complejos de isoforma a1p1, a2p1, a2p2 y a2p3

Síntesis y selectividad de la isoforma de derivados alifáticos de digoxina

Se ha sintetizado y purificado un conjunto adicional de derivados de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina con sustituyentes alifáticos propilo (DP), isopropilo (DIP), iso-butilo (DIB), terc-butilo (DtB) y trifluoroetilo (DMeCF3). La Tabla 6 muestra los resultados de la inhibición y selectividad de los derivados alifáticos más recientes para cuatro complejos de isoforma de Na,K-ATPasa, en comparación con la propia digoxina y DMe, la Fig. 14 ilustra los efectos del derivado de isobutilo más selectivo, DIB. No se observó una diferencia significativa en a1p1 frente a a2p1 cuando se compara con DMe. Sin embargo, para a2p3, todos los derivados alifáticos incluyendo DMe son significativamente superiores a la digoxina y en el caso del derivado de isobutilo la relación de selectividad alcanza las 16 veces. Generalmente, las curvas para a2p2 caen entre aquellas para a2p3 y a2p1. Como se menciona anteriormente, la diferencia en K^0,5 K entre los complejos a2p1-3 se traducirían en una diferencia en Ki como se ve para la digoxina en el sentido de Ki a2p1> a2p2> a2p3. Sin embargo, el aumento en la selectividad para a2p3:a1p1 es significativamente mayor que la vista con digoxina (6,5 veces) para todos los nuevos derivados y especialmente para el derivado de isobutilo, DIB (16 veces). Este descubrimiento podría implicar que todos los derivados alifáticos, pero especialmente DIB, interactúan más específicamente con a2p3 que con a2p1. En cualquier caso la Ki de 5,8 nM para la inhibición de a2p3 por DIB es menor que la vista para cualquiera de los demás derivados alifáticos (u otros).

La baja Ki para la inhibición de a2p3 implica que DIB podría ser un buen inhibidor de la PIO en conejos. Esto se probó en los experimentos resumidos en la Fig. 15. De hecho el DIB aplicado tópicamente antes de 4Ap evitó de forma efectiva el aumento de la PIO. La concentración necesaria para evitar totalmente el aumento de la PIO (>30 j M) era aproximadamente 2 veces menor que la necesaria para el derivado más efectivo probado anteriormente (DMe).

Tabla 6. Selectividad de derivados de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina alifáticos para el complejo de isoterma a2p3

En conclusión, se ha demostrado actualmente que la modificación del tercer residuo de digitoxosa de la digoxina puede producir derivados con selectividad aumentada para a2 sobre a l. En comparación con la digoxina (Kia1/a2 3,44 veces), la relación de selectividad se aumentó significativamente en el orden DGlyN>DMe>DGly»DPrN“ DSCar, alcanzando un valor máximo de Kia1/a2=7,45 para DGlyN (Tabla 2).

Además la relación de selectividad, Kia2p3/a1p1,6,5 para la propia digoxina, se mejoró significativamente para todos los derivados más alifáticos, DP, DIP, DIB, DtB y DMeCF³ , alcanzando a casi 16 veces para DIB.

Considerando las estructuras de los sustituyentes en el anillo de perhidro-1-4-oxazepina (Tablas 1,2, y 6), parece que la selectividad a2:a1 aumentada (especialmente a2/p3) se consigue con pequeños grupos R que tienen un potencial enlace de H (por ejemplo, glicina, glicinamida, propionamida, semicarbazida, semitiocarbazida), o pequeños grupos hidrófobos (por ejemplo, Me, Et, Pr, iPr y t-Bu), mientras que sustituyentes mayores (alanina, alaninamida, serina, serinamida mejoran la selectividad en un menor grado, aunque estos compuestos puede ser también terapéuticamente útiles. Las características importantes de la selectividad de isoforma son (a) la selectividad de a2 puede restringirse a glucósidos de digital con residuos de p-digitoxosa ya que, por ejemplo, la ouabaína, un a-ramnósido, es ligeramente selectivo para a l sobre a2 y (b) el tercer residuo de digitoxosa es óptimo como se concluye anteriormente y también en (6).

Aunque las estructuras de las conformaciones unidas a ouabaína de la Na,K-ATPasa renal (12-14) son coherentes, en general, con la falta observada de selectividad de isoforma de las agliconas, porque la propia ouabaína solo es ligeramente selectiva para a1 sobre a2 (Tabla 2), estas estructuras no pueden explicar en detalle ni la moderada selectividad de la digoxina por a2 ni la selectividad aumentada por a2 de los derivados de perhidro-1,4-oxazepina. Sin desear estar unidos a ningún mecanismo o teoría particular, se hipotetiza que la selectividad relativamente alta de los derivados de perhidro-1,4-oxazepina de la invención (por ejemplo, DGlyN) por a2 sobre a1, indica una interacción diferencial con los residuos específicos de la isoforma en los bucles exteriores de a2 y a1. La diferencia muy grande de velocidades de disociación entre agliconas y gliconas enfatizan el papel de los azúcares en la unión a a2. Las interacciones específicas con a2 de los derivados de digitoxosa modificada de restos DGlyN y DMe se indican también directamente por las velocidades de disociación más lentas en comparación con la digoxina (Fig. 9 y la Tabla 4). De forma similar la selectividad aumentada de los derivados más alifáticos en la Tabla 6 tal como DIB para el complejo a2p3 sobre a1p1 pueden indicar unas interacciones más específicas con pVa189. Los presentes descubrimientos confirman y validan el concepto de que la modificación del tercer residuo de digitoxosa puede aumentar la selectividad por la isoforma a2.

En conclusión, los derivados de digoxina selectivos de a2 descritos en esta memoria reducen la presión intraocular, y por consiguiente tienen el potencial como fármacos nuevos de controlar la PIO y la prevención del glaucoma. Cuando se evalúan por la dosis y especialmente la duración de los efectos, los compuestos más selectivos de a2 DMe y DGlyN son significativamente más efectivos que la digoxina moderadamente selectiva de a2 o digoxigenina no selectiva. Además cuando la selectividad de a2p3 se tiene en cuenta con los compuestos tales como DIB, se observa una efectividad superior. Una conclusión importante es que a2p3 de hecho juega un papel principal en la producción del humor acuoso, como podría predecirse por su expresión prominente en las células NPE.

Los nuevos derivados de perhidro-1,4-oxazepina descritos en esta memoria pueden tener también un perfil de seguridad favorable, haciéndolos adecuados como candidatos para fármaco. La toxicidad local de los glucósidos cardiacos selectivos de a2p3, específicamente hinchando la córnea y la lente debería ser mínima porque el endotelio de la córnea expresa a l y una cantidad menor de a3 pero no a2, y el epitelio de la lente expresa solo a l. Además, los efectos cardiotóxicos sistémicos deberían ser mínimos.

Finalmente, los derivados de perhidro-1,4-oxazepina de la digitoxina más hidrófoba pueden ser incluso más efectivos que los derivados de digoxina en la reducción de hipertensión ocular, y/o como agentes cardiotónicos, sin embargo, estos no forman parte de la presente invención.

Ejemplo 5 - Efectos en la presión intraocular en ratas

Para evaluar si los compuestos de la presente invención son capaces de controlar la PIO en un modelo animal de hipertensión ocular crónica, y para evaluar su toxicidad local y sistémica, se está induciendo hipertensión ocular en ratas, por ejemplo, impidiendo la salida del humor acuoso usando microperlas (24). Los derivados de digoxina se añaden diariamente y se siguen los cambios de PIO, las señales de inflamación, edema de la córnea o claridad de la lente. Para la toxicidad sistémica se mide la concentración de los derivados de digoxina en sangre mediante radioinmunoensayo.

Ejemplo 6: Sección experimental

Materiales

Se usó la cepa de Escherichia (E.) coli XL-1 azul para la propagación y preparación de constructos de plásmidos. La enzima lítica de levadura de ICN Biomedicals Inc (cat. 152270) se usó para la transformación de la cepa deficiente de proteasa de P. pastoris SMD1165 (his4, prbl). DDM (cat. D310) y C12E8 (25% en p/p, núm. de cat. O330) se compraron de Anatrace. SOPS sintético (sal sódica)) se obtuvo de Avanti Polar Lipids, y se almacenó como una disolución de cloroformo. La resina de afinidad al metal BD Talon (cat. 635503) se obtuvo de Clontech. El colesterol, ouabaína (O3125, digoxina (D6003), 4-aminopiridina, (A78403) e iB-MECA (I146)) se obtuvieron de Sigma. El metanol de grado HPLC se compró de Baker. Todos los disolventes orgánicos y aminas eran de grado analítico de la mayor pureza.

Preparación de constructos ha1hp1, ha1hp2, ha1hp3, ha2hp1, ha2hp2, ha2hp3, ha3hp1

Los p1, p2 y p3 humanos se clonaron en el vector de expresión pHIL-D2 que contenía el a l y a2 humano. Los vectores de expresión pHIL-D2 que contenían a l porcino (p), a l humano (h) o a2 humano con p1 porcino marcado con Hisx10 se generaron previamente (7, 9). Los ADNc p1 humano (acceso: P05026), p2 humano (Acceso: P14415) y p3 humano (Acceso: P54709) en el vector pSD5 fueron una donación de K. Geering Universidad de Lausana Suiza. Los marcos de lectura abierta y regiones laterales de hp1, hp2 y hp3 (en pSD5) se amplificaron de forma separada por reacción de cadena polimerasa (PCR) usando cebadores sintéticos que contenían sitios de escisión BgllI y Salí. Cada uno de los fragmentos amplificados se digirió con Bglíí y Salí y se ligó al plásmido tratado con BglII y Salí pHIL-D2-(pa1/His10pp1) para generar pHIL-D2 (pa1/Hisl0hp1o2o3). Los fragmentos que contienen hp1, hp2 y hp3 se escindieron de pHíL-D2-(pa1/His10hp1o2o3) y se subclonaron en pHIL-D2-(ha1/His10pp1) o pHIL-D2-(ha2/His10pp1) para producir pHIL-D2-(ha1/His10hp1o2o3) y pHIL-D2-(ha2/His10hp1o2o3). Los plásmidos recientemente creados se analizaron para la correcta integración y correcta secuencia del inserto por digestiones enzimáticas de restricción y secuenciación. El ADN de cada constructo se preparó en grandes cantidades en E. coli XL-1 Azul para la transformación de Pichia pastori.

Transformación de levadura. Expresión y purificación de isoformas de Na,K-ATPasa humana.

Los métodos de transformación, cultivo de clones de P. pastori, expresión de proteína de isoformas humanas de Na,K-ATPasa (a1p1, a2p1, a3p1), preparación de la membrana, solubilización de membranas en DDM y purificación en perlas de BD-Talon se han descrito en detalle (6-9, 11, 25). En los experimentos iniciales los tres complejos de isoforma purificados (0,3-0,5 mg/ml) se eluyeron de las perlas de BD-Talon en una disolución que contenía Imidazol 170 mM, NaCl 100 mM; Tricina.HCl 20 mM pH 7,4; C12E8, 0,1 mg/ml; SOPS 0,07 mg/ml colesterol 0,01 mg/ml, glicerol al 25%. En experimentos posteriores los complejos de isoforma se reconstituyeron con FXYD1 purificado en las perlas de BD-Talon juntos como se describe en detalle en (10, 11) antes de la elución de complejos a1p1FXYD1, a2p1FXYD1 y a3p1FXYD1. Las proteínas se almacenaron a -80°C. La concentración de proteína se determinó con BCA (B9643 Sigma).

Ensayo de la actividad de Na,K-ATPasa de complejos de isoforma purificados

La inhibición de la actividad de Na,K-ATPasa de los complejos a1p1, a2p1 y a3p1 solubles en detergente por GC se determinó como se describe en (6) usando o bien los complejos ap o apFXYD1. La presencia o ausencia de FXYD1 no afecta a la inhibición de actividad de Na,K-ATPasa mediante glucósidos cardiacos (6), pero estabiliza fuertemente los complejos (9-11). El K⁰⁵ K se estimó variando la concentración de K en un medio que contiene un total fijo de K+cloruro de colina de 60 mM, y NaCl constante de 140 mM. Las curvas se ajustaron a la función de Hill v= Vmax*[S]ⁿ/([S]ⁿ+Kⁿ), donde S es la concentración de K, n es el coeficiente de Hill y Kⁿ es K⁰⁵ K. Por comparación de diferentes curvas la relación v/Vmax para cada curva se calculó y se representó de nuevo. En experimentos para evaluar la inhibición de la actividad de Na,K-ATPasa por glucósidos cardiacos de la presente invención, el porcentaje de inhibición VGC/V0 se calculó y los valores Ki se obtuvieron ajustando los datos a la función VGC/V0 =Ki/([GC]+Ki)+c. La inhibición se estimó en 3-8 experimentos separados y se calcularon los valores Ki promedio ±EEM. La significancia de las diferencias entre Kial y Kia2 se calculó mediante el ensayo t de Student desapareado (valores p). la relación de Kia1/a2±EEM se calculó para cada compuesto y los valores p se calcularon por comparación con digoxina. Los valores p <0,05 se consideraron significativos.

Velocidades de disociación de glucósidos cardiacos. Se incubaron complejos a2p1FXYD1 purificados (0,3-0,5 mg/ml) durante 30 minutos a 37°C en un medio que contenía ATP, 1 mM; NaCl 100 mM; MgCh, 4 mM Histidina.HCl 25 mM pH 7,4 sin (Control) o con 1 pM de diferentes glucósidos cardiacos. Las disoluciones enzimáticas se diluyeron entonces 100 veces en un medio que contenía NaCl 100 mM, KCl 5 mM, EDTA 1 mM (Tris), 0,005 mg/ml de C12E8, 0,01 mg/ml de SOPS, 0,001 mg/ml de colesterol y se incubaron a 37°C durante diferentes longitudes de tiempo. Se eliminaron alícuotas a diferentes tiempos y la actividad de Na,K-ATPasa se midió por triplicado durante 0,5 minutos (digoxigenina) 0 2 minutos (otros glucósidos cardiacos) en el medio de actividad estándar que contenía ATP 200 pM. La actividad de las muestras de ensayo se dividió por la actividad de las muestras de control y el tiempo para la inversión de la inhibición se analizó ajustando los datos a la función vt=v~e-kt+c. Las curvas normalizadas para comparación de diferentes experimentos (por ejemplo como en la Fig. 9) se obtuvieron restando el valor constante c de cada valor de la actividad y re-ajustando la relación vt/v~=1-e'kt.

Síntesis de derivados de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina

Las síntesis de los diferentes derivados de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina se realizaron en dos etapas: 1) oxidación de digoxina con peryodato sódico para dar un dialdehído de anillo abierto en el tercer resto de azúcar y 2) aminación reductora con una amina primaria, en presencia de NaCNBH³ , cerrando un anillo de 7 miembros para dar el derivado de perhidro-1,4-oxazepina de digoxina. Como un ejemplo, la síntesis de DGlyN se proporciona a continuación. Es evidente para un experto en la técnica que los demás compuestos de la presente invención pueden prepararse por el mismo o similares métodos.

Oxidación de digoxina con NaIO⁴ (26)

En un tubo de ensayo de polipropileno de 50 ml, se añadió una disolución de NaIO⁴ (400 mg, 1840 pmoles) en H²O (4 ml) bajo agitación a temperatura ambiente a una suspensión de digoxina (400 mg, 512 pmoles) en EtOH al 95% (36 ml, no totalmente soluble) y la mezcla que disolvió inmediatamente se dejó estar a temperatura ambiente durante 1 h. Durante ese tiempo se formó un precipitado. El NaIO³ precipitado se eliminó, por centrifugación a 3.000x g durante 15 minutos y filtración a través de un filtro de jeringa (PTFE, 0,2 um, 25 mm). La disolución se concentró en un evaporador y se extrajo con 40 ml de CHCh. La fase orgánica se lavó con 2x8 ml de agua, se secó sobre Na²SO⁴ anhidro, se filtró y se evaporó en un evaporador, y alto vacío toda la noche para dar el dialdehído, que se disolvió en 48 ml de metanol absoluto para dar una disolución 10 mM de dialdehído.

Aminación reductora con hidrocloruro de glicinamida

Se añadió hidrocloruro de glicinamida (28,2 mg, 256 pmoles, PM = 110,54, Aldrich) a la disolución de dialdehído de digoxina (180 mg = 240 pmoles) para dar concentraciones de 12 mM y 10 mM, respectivamente. El pH aparente se corrigió a 5-6 con ácido acético concentrado en metanol, y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 5 min. La base de Schiff que se forma se redujo con NaCNBH³ , (59,6 mg, 480 pmoles, PM= 123,95, 20 mM) con agitación. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (SiO² con acetona/CHCh (3:2). La mezcla se dejó durante 1,5 h, la creación de DGlyN y desaparición de dialdehído de digoxina se confirmó por espectrometría de masas, y el metanol se evaporó por rotavapor y alto vacío toda la noche. Ya que pueden darse reacciones secundarias, tal como hidrólisis inducida por ácido o base del dialdehído a bis-digitoxósido, el producto final se purificó. La mezcla de reacción de DGlyN se disolvió en una cantidad mínima (5,4 ml) de metanol al 50%, se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 pm, PTFE, y se usó para la purificación por HPLC (Fig. 2B). La purificación por HPLC se hizo en una columna semi-preparativa Purospher STAR RP-18e, se eluyó con un gradiente de 50-80% de metanol en agua en 15 volúmenes de columna a un caudal de 4 ml/min. Otros derivados se purificaron usando gradientes óptimos de metanol establecidos en las marchas de HPLC analítico (Chromolith RP-18e) antes de la aplicación a la columna semipreparativa. El metanol fue de grado de gradiente HPLC JT Baker.

Se prepararon compuestos adicionales mediante un método similar. Sus datos de espectro de masas se presentan en la Tabla 1.

Los derivados de digitoxina (que no se reivindican) pueden hacerse por métodos similares como se describen en esta memoria, usando el andamio de digitoxina (X = H) en vez del andamio de digoxina (X = OH).

Medida de presión intraocular en conejos

Animales

Se alojaron conejos blancos de Nueva Zelanda (3-3,5 kg) de aproximadamente 1 año, de cualquier sexo, de forma individual en jaulas separadas en condiciones ambiente para el animal en un ciclo inverso de 12 horas de oscuridad/luz. Para los experimentos los animales se transfirieron a retenedores de conejo en una atmósfera tranquila y calmada (Fig. 1). No se detectaron anormalidades oculares antes o durante los experimentos. El cuidado y tratamiento del animal se sometieron a la aprobación del comité institucional para experimentos animales, permiso IACUC del Instituto Weizmann (núm. 04270911-2).

Preparación y administración del fármaco

Las disoluciones madre de glucósidos cardiacos se disolvieron en etanol, y se diluyeron en tampón fosfato (PBS) en cada día del experimento de manera que la concentración final en etanol no excedió el 1%.

Modelado

Se introdujo digoxina (coordinados 3B0W) manualmente en la estructura de Na,K-ATPasa de riñón de cerdo unida con ouabaína (4HYT) de manera que los restos esteroide y lactona de ouabaína y digoxina se superpusieron tan cerca como fue posible, véase la referencia. El archivo estructural con digoxina unida se sometió entonces al Servidor de Minimización de Energía YASARA. La figura estructural se preparó con PyMOL.

Medidas de presión intraocular y espesor de la córnea

La PIO (mm de Hg) de los conejos se midió usando un Neumotonómetro calibrado (Modelo 30, Reichert technologies, Fig. 1). Se aplicó un anestésico local Oxibuprocaína HCl (0,4%, 25 j l ) a cada córnea aproximadamente 1 minuto antes de las medidas de PIO. Dos lecturas de PIO de base se tomaron antes de la administración tópica del GC (o PBS como control) y después de media hora (tiempo cero). Las lecturas de las dos medidas fueron casi idénticas, sugiriendo que los GC no tenían efecto en la PIO basal. En el tiempo cero una gota de 4AP (40 mg/ml, 30 j l ) o IB-MECA (1 jM , 30 j l) se administró a ambos ojos de cada conejo las medidas de PIO se hicieron a diferentes tiempos como se indica en cada experimento. En los experimentos para los que la PIO se elevó durante varias horas, se añadió 4AP cada 1,5 horas o IB-MECA cada 2 horas. Las lecturas del Neumotonómetro se aceptaron cuando la desviación estándar del valor X mm de Hg estuvo entre 0,1-0,4 mm de Hg es decir X±0,1-0,4 mm de Hg, que representa un error posible de 6-13% en comparación con el aumento mínimo de 3 mm de Hg y 1,6-6,7% en comparación con el aumento máximo de 6 mm de Hg en la PIO inducida por 4AP o IB-MECA. Cada experimento se repitió dos o tres veces con resultados similares. En todos los casos las figuras representan el efecto promedio en la PIO (es decir para cuatro o seis ojos) en comparación con el control ±EEM. Donde la barras de error no se ven en las figuras, los errores son menores que los símbolos usados. La significancia de las diferencias desde el control se calculó por el ensayo t de Student desapareado (valores p). Los valores p <0,05 se consideraron significativos. El espesor de la córnea (jm ) se midió usando un paquímetro ultrasónico (Sonogage pachometer, Cleveland, EE.UU.), antes y durante el experimento con tratamientos de GC y 4AP. Los valores representan los promedios de tres medidas independientes para cada ojo.

Abreviaturas:

PIO, presión intraocular;

GC, glucósido cardiaco;

4AP, 4-aminopiridina.

Referencias

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Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto representado por la estructura de fórmula general (I):

en donde R se selecciona del grupo que consiste en -C H ²C(=O)-NH² (compuesto 1), -CH³ (compuesto 2), -(CH²)²-C(=O)-NH² (compuesto 3), -NHC(=O)-NH² (compuesto 4), -Oh (compuesto 6), -Ch (c H³)c On H² (compuesto 8), -CH(CH²OH)COOH (compuesto 9), -CH(CH²OH)CONH (compuesto 10), -CH²CH³ (compuesto 12), -(CH²)²CH³ (compuesto 13), -CH²CH(CH³)² (compuesto 14), -CH²CF³ (compuesto 15), -CH²C(=O)-NHOH (compuesto 17), -NHCSNH² (compuesto 18), -c H²Ch ²F (compuesto 19); y

X es OH,

incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos y mezclas de los mismos.

2. El compuesto según la reivindicación 1, que es selectiva para la isoforma a2 de Na,K-ATPasa sobre otras isoformas de Na,K-ATPasa.

3. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

4. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o la composición farmacéutica según la reivindicación 3, para usar en la reducción de la hipertensión ocular, o para tratar glaucoma.

5. El compuesto o composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 4, en donde dicho medicamento es una composición oftálmica adecuada para la aplicación tópica al ojo en forma de una disolución de gotas oculares, una pomada, una suspensión, un gel o una crema.

6. Una composición cardiotónica que comprende el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.