ES2965744T3

ES2965744T3 - Inversión sexual funcional de crustáceos decápodos hembras

Info

Publication number: ES2965744T3
Application number: ES15859875T
Authority: ES
Inventors: Assaf Shechter; Ohad Rosen; Amir Sagi
Original assignee: Enzootic Holdings Ltd
Current assignee: Enzootic Holdings Ltd
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2035-11-13
Also published as: US11624052B2; AU2015346969B2; WO2016075697A1; US20200190467A1; EP3217785B1; US10570368B2; AU2015346969A1; CN107406825B; EP3217785A4; CN107406825A; EP3217785A1; US20170313975A1

Abstract

La presente invención proporciona un cultivo celular primario que combina un medio de cultivo celular y células derivadas de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo. La invención también proporciona métodos para obtener una progenie exclusivamente femenina inyectando/trasplantando inicialmente el cultivo celular primario a una hembra genética para obtener un Neomacho macho. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inversión sexual funcional de crustáceos decápodos hembras

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a; entre otras cosas, seis hembras de crustáceos decápodos de sexo invertido.

Antecedentes de la invención

Los atributos de la selección de sexo en la cría de animales y la capacidad de formar una infraestructura agrotécnica a su alrededor que mejore el rendimiento ya están bien establecidos en animales de cría, tal como el ganado vacuno, las aves de corral y los peces (De Vries (2008); Correa y col., (2005) y Beardmore y col., (2001)). La acuicultura de crustáceos todavía utiliza predominantemente poblaciones heterógenas que suprimen la mayoría de los patrones de crecimiento dimórfico sexual. Cuando se segregan, los crustáceos demuestran tasas de crecimiento mejoradas ya que se asigna energía al crecimiento en lugar de a la maduración de las gónadas y otras actividades sexuales relacionadas con la reproducción. Predominantemente, la acuicultura de crustáceos depende exclusivamente de viveros y criaderos para el suministro de juveniles, ya que la reproducción no es parte de la etapa de crecimiento en la piscifactoría y no es deseable dedicarle energía. Por lo tanto, la cría de poblaciones de un solo sexo, ya sea exclusivamente masculinas o exclusivamente femeninas, produce mayores rendimientos y un mayor valor comercial. Aunque en algunas especies de crustáceos las poblaciones exclusivamente masculinas generan mayores rendimientos en condiciones de cría extensivas, varios estudios sugieren (Gopal y col., (2010) y Otoshi y col., (2003)) que en condiciones de cría intensiva y en la mayoría de las especies de crustáceos decápodos criadas en la actualidad son las hembras las que son económicamente más favorables. En una población exclusivamente femenina en condiciones comerciales, los tamaños finales en el momento de la extracción son muy uniformes, con la obtención de un valor de producción hasta un 35 % mayor que en una exclusivamente masculina. Asimismo, parece que la separación de los machos reduce la agresividad y el estrés, disminuye el canibalismo, ofrece una mayor homogeneidad en el tamaño de comercialización y, lo más importante, permite tasas de carga ganadera más altas.

La diferenciación sexual y el desarrollo de características sexuales secundarias están controlados por diferentes mecanismos a lo largo de la evolución. En los vertebrados y algunos grupos de invertebrados, estos procesos están bajo el control de las hormonas sexuales. Dada la reciente confirmación de que los insectos probablemente no tienen hormonas sexuales, los agentes responsables de la maduración sexual de los artrópodos siguen siendo objeto de debate. Los crustáceos que están evolutivamente próximos a los insectos poseen una glándula androgénica (AG) que es responsable de la diferenciación sexual masculina. Resulta interesante que, en algunos crustáceos, la regulación endocrina de la diferenciación sexual precede a la aparición fenotípica de esta característica externa secundaria.

El papel de la AG en la diferenciación sexual masculina se ha demostrado en varias especies de crustáceos mediante la observación de los caracteres sexuales primarios y secundarios después de la extirpación o el trasplante de la AG. En el anfípodoOrchestia gamarella,la ablación bilateral de la AG disminuyó la espermatogénesis y obstruyó el desarrollo de los caracteres masculinos secundarios. En elMacrobrachium rosenbergii,se logró una inversión sexual completamente funcional de machos a neohembras y de hembras a neomachos mediante, respectivamente, la ablación y el trasplante quirúrgicos bilaterales de la AG.

El documento WO00/44768 describe un método para producir camarones o gambas hembras que comprende aparear camarones o gambas neomachos con camarones o gambas hembras.

Khalaila y col., Gen. Comp. Endocrinol. (2001) 121: 242-249, desvela que el trasplante de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada a un crustáceo decápodo hembra induce la inversión sexual.

Hasta la fecha, no se ha logrado ninguna tecnología eficaz para la producción de poblaciones femeninas de crustáceos decápodos de un solo sexo. Todavía existe la necesidad de métodos eficientes, rentables y seguros para la producción de poblaciones exclusivamente femeninas de crustáceos decápodos de un solo sexo.

Resumen de la invención

En una realización, la presente invención proporciona un crustáceo decápodo hembra que comprende un cultivo celular primario que comprende: medio de cultivo celular y células obtenidas de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo. El cultivo celular primario puede carecer de fragmentos tisulares. La glándula AG hipertrofiada también puede ser hiperplástica o hiperplásica. Los términos “ hiperplásica” e “ hiperplástica” son intercambiables.

En otra realización, la presente invención proporciona además un crustáceo decápodo hembra que comprende una composición que comprende al menos 1 x 102 células solitarias obtenidas de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo.

También se describe un crustáceo decápodo hembra genética (WZ), que comprende un cultivo celular primario. El crustáceo decápodo hembra genética, que comprende un cultivo celular primario, puede experimentar una inversión sexual completa (a macho): neomacho. También se describe un crustáceo decápodo homogamético WW.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Modelo esquemático de determinación del sexo en la producción de neomachos, hembras WW y descendencia exclusivamente femenina. 5 - representa a las hembras y $ - representa a los machos. Las letras W y Z se utilizan para ilustrar el modelo de determinación del sexo basado en cromosomas. WZ y WW son hembras y<z>Z son machos. X describe la reproducción y las flechas pequeñas señalan la descendencia de cada cruce. Los porcentajes (%) reflejan las proporciones en cada descendencia comparando machos frente a hembras o hembras normales (WZ) frente a hembras homogaméticas (WW). La inyección se refiere a la administración de un cultivo en suspensión de células de la AG hipertrofiada disociadas enzimáticamente. La flecha grande señala la continuación del diagrama hasta la reproducción de hembras WW.

Figura 2: Una microfotografía de una comparación histológica de glándulas androgénicas intactas e hipertrofiadas deM. rosenbergii.(A) Secciones de una glándula androgénica (AG) intacta y (B) una AG hipertrofiada que se tiñeron con hematoxilina y eosina y se observaron con un microscopio óptico. Se señala la ubicación de la AG (flechas). Conducto deferente (SD). La barra de escala representa 50 pm.

Figura 3: Una microfotografía de un cultivo celular primario de AG hipertrofiada disociado enzimáticamente en suspensión deM. rosenbergiia lo largo del tiempo. Las células de la a G se documentaron (A) 2 días y (B) 6 días después de sembrarlas mediante un microscopio óptico invertido. Se señala la ubicación de las células de la AG en el cultivo (flecha). La barra de escala representa 500 pm en (A) y 100 pm en (B).

Figura 4: Microfotografías que muestran la inyección de un cultivo primario de células de la AG hipertrofiada disociadas enzimáticamente en suspensión mediante un aparato microinyector en hembras deM. rosenbergiiposlarvarias. (A) Primero se sujeta una poslarva sobre una superficie de plastilina antes de (B) colocarse bajo una lupa de laboratorio para operar un microinyector. (C) La inserción de un capilar de vidrio (resaltado por un círculo) del microinyector (lado superior de la imagen) en el procedimiento de inyección de la suspensión celular.

Figura 5: Microfotografías que muestran los caracteres sexuales secundarios externos enM. rosenbergii.(A) Imagen de un macho ($) y dos hembras (5) - fuente: Eudes Correia. (B) Imágenes de microscopio de disección del segundo pleópodo de un macho (imagen superior) y una hembra (imagen inferior) deM. rosenbergii.El pleópodo masculino contiene tanto apéndice masculino (flecha blanca) como apéndice interno (flecha negra) mientras que el pleópodo femenino contiene solo apéndice interno.

Figura 6: Una microfotografía de gel que muestra la determinación genética del sexo de PL que se sospecha que son neomachos. Para diferenciar los machos morfológicamente indistinguibles de los neomachos, se examinaron genéticamente todas las PL representativas que se habían manipulado mediante inyección y se examinaron para determinar su desarrollo (^ ) o falta de (x) AM y gonoporos masculinos, utilizando una secuencia de ADN específica de la hembra. Esta última se amplificó mediante PCR y se separó a través de un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio y se visualizó mediante UV (panel superior). Se utilizó p-actina deMrcomo control positivo para PCR, asegurando la presencia de ADN en cada muestra (panel inferior). El ADN de una hembra verdadera deM. rosenbergii(5) y el agua actuaron como control positivo y negativo (CN), respectivamente.

Figura 7: Microfotografías que muestran que los neomachos deM. rosenbergiidesarrollan caracteres sexuales masculinos distintivos. Una inyección única de suspensión celular de AG induce el desarrollo de caracteres sexuales específicos restringidos al macho deM. rosenbergii:AM en el segundo par de pleópodos (flecha blanca) y gonoporos en las bases de los quintos pereiópodos (flechas). Morfológicamente, los machos (columna de la izquierda) y los neomachos (columna del medio) son indistinguibles entre sí. Las hembras solo portan apéndice interno (flecha negra) y no desarrollan gonoporos en la base de los quintos pereiópodos (columna derecha).

Figura 8: Microfotografías que muestran que los neomachos deM. rosenbergiialcanzan una diferenciación morfotípica masculina completa. Los neomachos resultantes de una única suspensión de células de la AG progresaron a través de una diferenciación morfotípica normal y se desarrollaron hasta convertirse en machos de pinzas azules completamente maduros, según el sistema de medición convencional desarrollado por Kuris y col., (1987). El propodo (pinza) del neomacho creció hasta casi el doble de largo que el caparazón (70 mm en comparación con 37 mm, respectivamente). También se observó un tejido testicular grande tras la disección (recuadro).

Figura 9: Microfotografías que muestran que los neomachos deM. rosenbergiipresentan gonadogénesis masculina completa. Las secciones transversales histológicas teñidas con hematoxilina y eosina revelan (A) un conducto deferente lleno de espermatozoides junto con (B) lóbulos testiculares muy activos. En estos últimos se observaron regiones muy densas (en división) y poco densas (maduras). (C) Los espermatozoides dentro del conducto deferente mostraron la morfología característica de paraguas invertido de un verdadero espermatozoide maduro deMr. (D) Los espermatogonios grandes y redondos (Sg) están muy teñidos y se encuentran en la periferia de un lóbulo, a diferencia de los espermatozoides (Sz), que estaban poco teñidos y acogen la mayor parte del volumen de un lóbulo, como sucede con los machos sexualmente reproductivos deM. rosenbergii.Barra = 250 pm (A y B) y 50 pm (C y D). Los campos definidos en los cuadros de A y B se ampliaron y documentaron como C y D, respectivamente.

Figura 10: Prueba de descendencia molecular de neomacho cruzado con una hembra normal: Una microfotografía de gel que muestra la determinación genética del sexo de PL seleccionadas de la descendencia de un neomacho cruzado con una hembra normal. Para diferenciar los machos de las hembras morfológicamente indistinguibles (a la temprana edad de PL<20>), se examinó genéticamente a todos los representantes utilizando un marcador sexual de ADN específico de W. Este último se amplificó mediante PCR y se separó a través de un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio y se visualizó mediante UV (panel superior). Para diferenciar aún más a las 2 subpoblaciones de hembras, WZ y WW, el análisis molecular se realizó utilizando un marcador sexual de ADN específico de Z, con los machos como control (panel central). Se utilizó p-actina deMrcomo control positivo para PCR, asegurando la presencia de ADN en cada muestra (panel inferior).

Figura 11: Gráficos de sectores que muestran la distribución genotípica de la descendencia neomacho * hembra normal. Los genotipos con respecto al sexo genético de las PL de la descendencia de un neomacho y una hembra normal se determinaron utilizando los marcadores moleculares sexuales en función de los cuales se calcularon las distribuciones finales. (A) La distribución total de 865 PL basada únicamente en el marcador sexual específico de Z reveló que aproximadamente tres cuartas partes de la descendencia (77 %) está compuesta por hembras WZ y machos ZZ. Las PL restantes (23 %) son hembras WW. (B) Se tomaron muestras de un grupo representativo de 174 PL (de las 865 PL) y se analizaron genéticamente utilizando los marcadores sexuales específicos de W y Z. La determinación final del sexo genotípico indicó que las hembras WW y los machos ZZ tienen una proporción de 1:1 (24,1 % cada uno) y ambos tienen una proporción de aproximadamente 1:2,1 con respecto a las hembras WZ normales (51,8 %).

Descripción detallada de la invención

En una realización, la presente invención proporciona un crustáceo decápodo hembra que comprende un cultivo celular primario que comprende: medio de cultivo celular y células obtenidas de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo. “ Un cultivo celular primario” también puede ser un cultivo celular procedente de una glándula androgénica. “ Un cultivo celular primario” puede no incluir células inmortalizadas. “ Un cultivo celular primario” puede no incluir células transformadas. “ Un cultivo celular primario” puede no incluir células neoplásicas. Una composición puede comprender “ un cultivo celular primario” . Un crustáceo decápodo puede ser un crustáceo decápodo peneido. El crustáceo decápodo puede serMacrobrachium rosenbergii.

Las células dentro de “ un cultivo celular primario” pueden comprender o consistir en células de la glándula androgénica hipertrofiada enzimáticamente disociadas. Se puede utilizar un cultivo celular primario como método inesperadamente robusto y exitoso para producir un crustáceo decápodo neomacho. Una composición para su uso en inyección en hembras poslarvarias de crustáceos decápodos da lugar a inversión sexual. Una composición que comprende células se utiliza en el trasplante de células como se describe en el presente documento. Una composición que comprende células se utiliza en el trasplante de células solitarias. La fuente de las células descritas en el presente documento y el crustáceo decápodo que se va a tratar con las células descritas en el presente documento son de la misma especie. Una hembra poslarvaria de crustáceo decápodo (que tiene una composición de cromosomas femeninos) que ha experimentado una inversión sexual a un macho sexualmente funcional, denominado “ neomacho” , es crucial para la producción posterior de una descendencia o cría exclusivamente femenino monosexual. Una hembra poslarvaria de crustáceo decápodo como se describe en el presente documento es una hembra de crustáceo decápodo natural.

Al menos el 40 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento sobrevivieron a esta intervención. Al menos el 50 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento sobrevivieron a esta intervención. Al menos el 60 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento sobrevivieron a esta intervención. Al menos el 70 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento sobrevivieron a esta intervención. Al menos el 75 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento sobrevivieron a esta intervención. Al menos el 80 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento sobrevivieron a esta intervención. El 81 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento sobrevivieron a esta intervención (datos no mostrados). Un trasplante puede ser un trasplante alogénico.

Al menos del 40 % al 90 % de las hembras genéticas sometidas a inyección de células como se describe en el presente documento sobrevivieron a esta intervención. Al menos del 50 % al 80 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento sobrevivieron a esta intervención. Al menos del 60 % al 80 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento sobrevivieron a esta intervención.

Al menos el 25%de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Un “ neomacho” es una hembra genética que tiene la capacidad de fecundar óvulos. Tener la capacidad de fertilizar huevos es tener la capacidad de aparearse con un crustáceo decápodo hembra como se describe en el presente documento. Un “ neomacho” es una hembra genética que tiene la capacidad de fecundar óvulos al alcanzar la madurez sexual como macho. Un “ neomacho” es una hembra genética que comprende apéndice masculino (AM). Un “ neomacho” es una hembra genética que comprende al menos un gonoporo masculino. Un “ neomacho” es una hembra genética que comprende apéndice masculino (AM), al menos un gonoporo masculino y que tiene la capacidad de fecundar óvulos al alcanzar la madurez sexual. Al menos el 30 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Al menos el 35 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Al menos el 40 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Al menos el 45 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Al menos el 50 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Al menos el 60 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Al menos el 70 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Al menos el 80 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Al menos el 90 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos.

Del 25 % al 90 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Del 25 % al 60 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos. Del 25 % al 50 % de las hembras genéticas sometidas a inyección/trasplante de células como se describe en el presente documento se convirtieron en neomachos.

Un “ neomacho” es un neomacho de crustáceo decápodo. Un “ macho” es un macho de crustáceo decápodo. Una “ hembra” es una hembra de crustáceo decápodo.

En otra realización, todas las células dentro del cultivo celular primario son células procedentes de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo. En otra realización, el cultivo celular primario es un “ cultivo celular primario de glándula androgénica hipertrofiada” .

Al menos el 50 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG. Al menos el 60 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG. Al menos el 65 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG. Al menos el 70 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG. Al menos el 75 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG. Al menos el 80 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG. Al menos el 85 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG. Al menos el 90 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG. Al menos el 95 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG. Al menos el 98 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG. Al menos el 99 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células endocrinas de la AG.

Las células endocrinas de la AG producen al menos un factor. Las células endocrinas de la AG expresan y/o producen factores que inducen la diferenciación sexual. Las células endocrinas de la AG expresan y/o producen al menos un factor que induce el desarrollo de caracteres sexuales masculinos. Las células endocrinas de la AG expresan y/o producen un transcrito codificante de tipo insulínico específico de la AG(IAG)y/o proteína. Las células endocrinas de la AG expresan y/o producen una proteína que pertenece a la familia de hormonas de la insulina. Las células endocrinas de la AG expresan y/o producen múltiples factores que inducen el desarrollo de caracteres sexuales masculinos. Las células endocrinas de la AG son parte de un eje endocrino que controla la diferenciación sexual, el desarrollo y el mantenimiento de los caracteres sexuales masculinos.

Al menos el 8 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 10 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 20 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 25 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 30%de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 35 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 40 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 45 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 50 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 60 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 70 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 80 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 90 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias. Al menos el 95 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento son células solitarias.

Al menos el 8 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están agregadas. Al menos el 10 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están aglomeradas. Al menos el 20 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están aglomeradas. Al menos el 25 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están aglomeradas. Al menos el 30 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están agregadas. Al menos el 35 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están agregadas. Al menos el 40 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están agregadas. Al menos el 45 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están agregadas. Al menos el 50 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están agregadas. Al menos el 60 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están agregadas. Al menos el 70 % de las células dentro del cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento están agregadas.

Un agregado de células puede comprender entre 2 y 70 células. Un agregado de células puede comprender entre 2 y 50 células. Un agregado de células puede comprender entre 2 y 40 células. Un agregado de células puede comprender entre 2 y 30 células. Un agregado de células puede comprender entre 2 y 25 células. Un agregado de células puede comprender entre 2 y 20 células.

El cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento pueden estar desprovistos o sustancialmente desprovistos de un tejido intacto. El cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento pueden estar desprovistos o sustancialmente desprovistos de fragmentos tisulares.

La glándula AG hipertrofiada también puede ser una glándula AG hiperplástica/hiperplásica. La glándula AG hipertrofiada es una glándula cuyo volumen ha aumentado. La glándula AG hipertrofiada es una glándula cuyo volumen se ha aumentado por medios artificiales. La glándula AG hipertrofiada es una glándula con células componentes agrandadas (en comparación con una glándula normal). La glándula AG hiperplásica se caracteriza por un mayor número de células (en comparación con la glándula normal).

El cultivo celular primario y/o una composición como se describe en el presente documento puede comprender al menos 1 x 102 células o células solitarias procedentes de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo. El cultivo celular primario y/o una composición como se describe en el presente documento comprende al menos 1 x 103 células o células solitarias procedentes de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo. El cultivo celular primario y/o una composición como se describe en el presente documento comprende al menos 1 x 104 células o células solitarias procedentes de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo. El cultivo celular primario y/o una composición como se describe en el presente documento comprende al menos 1 x 105 células o células solitarias procedentes de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo. El cultivo celular primario y/o una composición como se describe en el presente documento comprende al menos 1 x 106 células o células solitarias procedentes de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo. El cultivo celular primario y/o una composición como se describe en el presente documento comprende al menos 1 x 107 células o células solitarias procedentes de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo. El cultivo celular primario y/o una composición como se describe en el presente documento comprende al menos 1 x 108 células o células solitarias procedentes de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo.

Una composición como se describe en el presente documento puede comprender medio de cultivo celular. El medio de cultivo celular respalda el crecimiento de las células descritas en el presente documento. El medio de cultivo celular respalda la proliferación de las células descritas en el presente documento. El medio de cultivo celular induce o mantiene la secreción de hormonas andrógenas por parte de las células descritas en el presente documento. Los expertos en la técnica conocen los medios de cultivo celular adecuados.

Una composición como se describe en el presente documento comprende: Arginina, biotina, NaCI, glucosa, insulina, cistina, colina, KCl, penicilina, transferrina, glutamina, folato, NaH<2>PO<4>, factores de crecimiento específicos de estreptomicina, histidina nicotinamida, NaHCO<3>, rojo de fenol, isoleucina, pantotenato, CaCh, suero completo, leucina, piridoxal, MgCh, Lisina, tiamina, metionina, riboflavina, fenilalanina, treonina, triptófano, tirosina, valina o cualquier combinación de los mismos.

Un medio de cultivo celular adecuado comprende L-15. Un medio de cultivo celular adecuado comprende L-15 tamponado. Un medio de cultivo celular adecuado comprende uno o más aminoácidos de base libre. Un medio de cultivo celular adecuado comprende L-glutamina. Un medio de cultivo celular adecuado comprende suero. Un medio de cultivo celular adecuado comprende suero bovino fetal. Un medio de cultivo celular adecuado comprende un antibiótico o una combinación de antibióticos tales como, aunque no de forma limitativa, penicilina-estreptomicina.

Decápodos con inversión sexual

En otra realización, la presente invención proporciona un crustáceo decápodo hembra, que comprende el cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento. Un crustáceo decápodo hembra es un crustáceo decápodo con una edad poslarvaria de hasta 180 días. En otra realización, la presente invención proporciona un crustáceo decápodo hembra en proceso de inversión sexual, que comprende el cultivo celular primario y/o la composición como se describe en el presente documento. El crustáceo decápodo hembra que se ha sometido a una inversión sexual según la presente invención puede producir descendencia. El crustáceo decápodo hembra que se ha sometido a una inversión sexual según la presente invención puede producir descendencia de crustáceos decápodos homogaméticos WW.

Las células hipertrofiadas se obtienen de una AG hipertrofiada de un crustáceo decápodo macho adulto después de al menos 5 días de la extirpación quirúrgica bilateral del complejo del órgano X y las glándulas del seno. Las células hipertrofiadas se obtienen de una Ag hipertrofiada de un crustáceo decápodo macho adulto después de al menos 8 días de la extirpación quirúrgica bilateral del complejo del órgano X y las glándulas del seno. Las células hipertrofiadas se obtienen de una AG hipertrofiada de un crustáceo decápodo macho adulto después de cualquier tratamiento conocido que pueda inducir hipertrofia en una AG. Las células hipertrofiadas se obtienen de una AG hipertrofiada de un crustáceo decápodo macho adulto después de 4-15 días de la extirpación quirúrgica bilateral del complejo del órgano X y las glándulas del seno.

La composición descrita en el presente documento se utiliza en inyección una o más veces en un crustáceo decápodo hembra en el intervalo de edad poslarvaria de 1 a 100 días. La composición descrita en el presente documento se utiliza en inyección una o más veces en un crustáceo decápodo hembra en el intervalo de edad poslarvaria de 1 a 50 días. La inyección se realiza mediante un aparato microinyector. La inyección en una hembra sexualmente inmadura induce la inversión funcional del sexo a macho y/o neomacho.

Como se usa en la presente descripción, las formas singulares “ un” , “ una” y “ el/la/los/las” incluyen formas en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “ un agente terapéutico” incluye la referencia a más de un agente terapéutico.

A menos que se indique específicamente o resulte evidente por el contexto, como se utiliza en la presente descripción, se entiende que el término “ o” es inclusivo.

El término “ incluyendo” se utiliza en el presente documento para referirse, y se utiliza indistintamente, a la expresión “ incluyendo, aunque no de forma limitativa” .

Como se utilizan en la presente descripción, las expresiones “ comprende” , “ que comprende” , “ que contiene” , “ que tiene” y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los EE. UU. y pueden significar “ incluye” , “ incluyendo” y similares; “ que consiste esencialmente en” o “ consiste esencialmente” también tiene el significado que se le atribuye en la ley de patentes de los EE. UU. y la expresión es abierta, lo que permite la presencia de más de lo que se menciona siempre que las características básicas o novedosas de lo que se menciona no se modifiquen por la presencia de más de lo que se menciona, pero excluye las realizaciones de la técnica anterior.

Una composición puede comprender principios activos farmacéuticos. Se pueden añadir principios activos farmacéuticos antes del trasplante. Los principios activos farmacéuticos incluyen, aunque no de forma limitativa, cualquiera de los ejemplos específicos descritos en el presente documento. Los expertos en la técnica reconocerán también muchos otros compuestos que entran dentro de esta categoría y son útiles según la invención.

Como se usa en el presente documento, “ una cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de células que produce el efecto deseado (tal como tratamiento o inversión sexual).

A menos que se indique específicamente o resulte evidente por el contexto, como se utiliza en la presente descripción, se entiende que el término “ aproximadamente” está dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo dentro de 2 desviaciones estándar de la media. Aproximadamente puede entenderse como dentro del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 % o 0,01 % del valor establecido. A menos que se desprenda otra cosa por el contexto, todos los valores numéricos proporcionados en el presente documento están modificados por el término aproximadamente.

Ventajas adicionales de la presente invención resultarán evidentes para un experto en la técnica tras el examen de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Además, cada una de las diversas realizaciones y aspectos de la presente invención según se define y reivindica en la sección de reivindicaciones más adelante encuentra apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Generalmente, la nomenclatura usada usa en la presente descripción y los procedimientos de laboratorio que se usan en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican a fondo en la literatura. Véase, por ejemplo, “ Molecular Cloning: A laboratory Manual “ Sambrooky col.,(1989); “ Current Protocols in Molecular Biology” Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y col., “ Current Protocols in Molecular Biology” , John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning” , John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y col., “ Recombinant DNA” , Scientific American Books, Nueva York; Birren y col. (eds) “ Genome Analysis: A Laboratory Manual Series” , Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías establecidas en las patentes de los EE. UU. n.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; ''Cell Biology: A Laboratory Handbook” , Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “ Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; “ Current Protocols in Immunology” volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites y col. (eds), “ Basic and Clinical Immunology” (8.a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), “ Selected Methods in Cellular Immunology” , W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía científica y de patentes; véase, por ejemplo, la patente de los EE. UU. n.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “ Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “ Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); “ Transcription and Translation” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “ Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “ Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “ PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications” , Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y col., “ Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales.

Material y métodos

Animales

Se criaron machos de pinzas azules deMacrobrachium rosenbergii(40±5 g) en tanques separados de 600 l a 28±2 °C con aireación constante, régimen de luz de 14:10 (L:O) y se alimentaron a voluntad (gránulos de camarón con 30 % de proteína) en las instalaciones de Enzootic Holdings Ltd. Se criaron individuos jóvenes deM. rosenbergiidespués de la metamorfosis (es decir, poslarvas (PL)) en un tanque en forma de U de 3,5 metros cúbicos y se mantuvieron como se ha indicado anteriormente.

Hipertrofia de las glándulas androgénicas y disociación celular enzimática

Se sabe que el complejo neuroendocrino del órgano X y las glándulas de los senos, ubicado en el pedúnculo ocular, secreta neuropéptidos que reprimen la glándula androgénica (AG) y sus actividades. De este modo, se aplicó a los machos de pinzas azules deM. rosenbergiiuna manipulación endocrina que implica su eliminación mediante extirpación quirúrgica e induce tanto hipertrofia como hiperplasia de la AG. Ocho días después de la manipulación endocrina; los machos inducidos fueron anestesiados durante 15 minutos en agua helada complementada con hipoclorito al 0,2 % con el fin de desinfectar. Después de eso, se diseccionaron los animales y se aislaron sus AG hipertrofiadas bajo un microscopio óptico de disección. Posteriormente, las células se separaron mediante disociación enzimática. En resumen, todas las AG hipertrofiadas se agruparon en un solo tubo y se colocaron en hielo. Posteriormente, se añadió 1 ml de una mezcla específica de enzimas y antibióticos [medio Leibovitz L-15 con L-Glutamina, 0,1 % peso/volumen (p/v) de colagenasa tipo I, 0,1 % (p/v) de colagenasa tipo IV y solución de penicilinaestreptomicina]. A continuación, se colocó el tubo de reacción de disociación en un rotador a una velocidad de 25 RPM durante 40 minutos a temperatura ambiente (TA) y seguido de una centrifugación a 500*g durante 5 minutos, también a TA. Tras la centrifugación, el tubo se colocó en una campana de flujo laminar biológica esterilizada. Se eliminó el sobrenadante (que no incluye células vivas) y el sedimento celular se lavó resuspendiéndolo en 1 ml de medio de alimentación [medio Leibovitz L-15 con L-Glutamina, 10 % volumen/volumen (v/v) de suero fetal bovino y solución de penicilina-estreptomicina] y con posterior centrifugación a 500*g durante 5 minutos a TA. El procedimiento de lavado se repitió tres veces. Finalmente, las células se resuspendieron en 500 pl de medio de alimentación.

Conteo celular

La concentración y la viabilidad celular se midieron utilizando tinción estándar con azul tripano. En resumen, las células se tiñeron con una solución de azul tripano a una concentración final del 0,08 % y después se cargaron en un hemocitómetro para su observación bajo un microscopio óptico con un aumento de *100.

Cultivo celular primario de AG

Se sembraron inmediatamente fracciones de 10 pl de las células suspendidas en el medio en una placa de 24 pocillos recubierta con 20 pg/ml de poli D-lisina (PDL) a una densidad de ~1*104 células por pocillo o se cargaron primero en un aparato microinyector, se pasaron a través del capilar de vidrio del microinyector a un tubo de 1,5 ml y después se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de ~1*104 células por pocillo. De las células recogidas, se asignó una fracción para evaluación de la viabilidad y se tiñó como se ha descrito anteriormente. Las células se cultivaron en una estufa sin CO<2>a 27 °C. Desde veinticuatro horas después de la siembra en adelante, el medio de cultivo se reemplazó parcialmente cada dos días. En general, las células se mantuvieron durante 21 días durante los cuales se supervisaron bajo un microscopio óptico invertido y se documentaron su morfología, densidad e interacciones.

Inyección de suspensión celular de AG hipertrofiada en PL

Se examinó la capacidad de las células de AG hipertrofiada purificadas y cultivadas para inducir la inversión sexual. En la población mixta (machos y hembras) de PL 60 o 30 días o menos (PL<6ü, PL<<3>ü; n=913) se inyectaron ~2x103 células de AG hipertrofiado. En general, cada PL se sujetó sobre una superficie de plastilina y, mediante el aparato microinyector, mientras se observaba a través de una lupa de laboratorio, las células de AG hipertrofiada del cultivo primario se suspendieron y se administraron mediante una única inyección en el tejido muscular del primer segmento abdominal. Después de eso, las PL inyectadas se dividieron en dos grupos: (1) Que comprende la mayoría de las PL (n=883) que se mantuvieron en un tanque en forma de U de 3,5 metros cúbicos o en un tanque circular de ~10 metros cúbicos o en un estanque de tierra rectangular (~250 m2; ~8 m * 30 m) con una profundidad de agua de 1 m para el crecimiento. (2) Que comprende PL representativas (n=30) que se mantuvieron en un tanque en forma de U de 3,5 metros cúbicos. Estas últimas PL se examinaron de forma rutinaria y se siguieron de forma rutinaria para detectar la inversión sexual en presuntos neomachos.

Examen de apéndice masculino (AM) y gonoporos masculinos

Para evaluar los rasgos masculinos, se extirpó el segundo par de pleópodos (pata natatoria) mediante pinzas finas y se confirmó la presencia o ausencia del AM bajo un microscopio óptico. En neomachos maduros (1 año de edad) se realizó un ensayo de regeneración. En resumen, se permitió que los neomachos con AM confirmado, como se ha descrito anteriormente, mudaran y se examinó la regeneración del AM.

Se examinó la aparición de gonoporos masculinos en la base de los quintos pereiópodos (pierna ambulatoria) colocando la PL en su lado dorsal y observando con una lupa de laboratorio.

Análisis molecular

El segundo par de pleópodos previamente extirpados para la observación del AM se había utilizado para la extracción de ADN genómico (ADNg) para la determinación genética del sexo. En resumen, se extrajo ADNg mediante el kit de PCR de tejido REDExtract-N-Amp (Sigma, Israel) y se utilizó como molde para la PCR de marcadores sexuales de ADN específicos de W o Z (Ventura y col., 2011). Los productos de la PCR se separaron en un gel de agarosa al 2 %, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron en un dispositivo de UV.

Histología

Se diseccionaron los testículos junto con el conducto espermático proximal ('conductos deferentes') de neomachos (1 año de edad). Las muestras de tejido se fijaron en medio de Carnoy II modificado [etanol al 60 % (v/v; Bio-Lab Ltd, Israel), cloroformo al 30 % (v/v; Frutarom, Israel), ácido acético glacial al 10 % (v/v; Sigma, Israel) y formaldehído al 2 % (v/v; Sigma, Israel) durante 24 h, se deshidrataron gradualmente a través de una serie de concentraciones crecientes de alcohol hasta Xylen (Sigma, Israel) y se incluyeron en Paraplast (Kendall, Mansfield, MA) según procedimientos convencionales. Se cortaron secciones de 5 pm en portaobjetos recubiertos de silano (Menzel-Glaser, Braunschweig, Alemania). Se tiñeron secciones consecutivas utilizando hematoxilina estándar (Bar Naor, Israel) y eosina (Bar Naor, Israel) para observaciones morfológicas.

Ejemplo 1

Producción de neomachos mediante una única inyección de la suspensión celular en hembras poslarvarias de crustáceo decápodo

Los datos experimentales proporcionados en el presente documento demuestran la capacidad de producir un cultivo celular primario de glándula androgénica hipertrofiada de crustáceos decápodos disociados enzimáticamente en suspensión y la utilización del cultivo celular primario de glándula androgénica hipertrofiada de crustáceos decápodos para la producción de neomachos. Estos neomachos se utilizan además para aparearse y producir hembras WW, lo que da como resultado la generación de una descendencia de cultivo monosexual exclusivamente femenina.

Cromosomas W y Z: determinación del sexo

El diagrama de flujo esquemático presentado en la Figura 1 ilustra el modelo de determinación del sexo basado en los cromosomas W y Z. Según este modo genético de herencia, las hembras son heterogaméticas (WZ) y los machos homogaméticos (ZZ). El diagrama destaca que incluso una sola inyección de cultivo celular primario de AG hipertrofiada en suspensión a PL hembras de crustáceos decápodos jóvenes puede inducir una inversión sexual completa y funcional en un neomacho. Inesperadamente, esta manipulación no provocó enfermedades ni la muerte de los animales tratados. Es importante enfatizar que la presente invención supera los obstáculos asociados con la implantación de tejido de AG que dieron lugar a una tasa de mortalidad devastadora y una baja tasa de inversión sexual.

Los neomachos “ producidos” , que son plenamente funcionales sexualmente como machos, son hembras genéticas que portan un gameto W. Tras un apareamiento exitoso de un neomacho (WZ) con una hembra normal (tal como WZ), se encontró que el 25 % de la descendencia eran machos (ZZ) y el 75 % restante eran hembras. De estas últimas, el 67 % fueron identificadas como hembras heterogaméticas normales (WZ), mientras que el 33 % restante fueron singulares hembras homogaméticas WW.

El apareamiento adicional de estas hembras homogaméticas WW con machos dio lugar a una descendencia femenina 100 % heterogamética WZ.

Como requisito previo para obtener un cultivo celular de glándula androgénica hipertrofiada suspensible, los crustáceos decápodos machos adultos deben ser inducidos endocrinológicamente para que los niveles de neuropéptidos inhibidores de AG específicos disminuyan y la glándula produzca cantidades suficientes de hormonas andrógenas que puedan de hecho inducir el desarrollo masculino en un animal capaz de desarrollarse tanto a macho como a hembra (independientemente de la composición de sus cromosomas sexuales). Esta intervención, a su vez, conduce a la hipertrofia de la AG y las células que la componen.

Las comparaciones histológicas entre una AG intacta (Fig. 2A) y una AG hipertrofiada (Fig. 2B) demuestran claramente las diferencias sustanciales en el tamaño total de la AG, el número de células que la componen y su caracterización. Las AG hipertrofiadas extirpadas quirúrgicamente se disociaron utilizando una mezcla enzimática específica para obtener una suspensión de células individuales.

El paso por el microinyector no pareció tener un efecto evidente sobre la viabilidad de las células de la AG. El cultivo de células primarias sembradas se documentó los días 2 y 6 (Fig. 3A y 3B, respectivamente) y se encontró que era viable durante hasta 21 días en cultivo.

Las imágenes del cultivo con microscopio óptico resaltaron la viabilidad de las células, demostrando extensiones celulares bien desarrolladas (Fig. 3). Estas últimas son caracterizaciones distintivas de un cultivo primario vivo sano, a diferencia de las células muertas que tienden a encogerse y posteriormente desprenderse de la superficie del pocillo y flotar.

Para inyectar la suspensión celular a PL muy pequeñas, en edades tempranas como entre 20 y 60 días o menos después de la metamorfosis (denominadas P<l><6<o>), se montó una infraestructura especializada que combinaba un aparato microinyector y una lupa de laboratorio (Fig. 4). La manipulación se realizó en cada animal inmovilizado bajo una lupa de laboratorio utilizando un aparato microinyector (Fig. 4).

A un total de 450 PL hembras se les inyectó una vez una suspensión de cultivo celular primario de AG hipertrofiada. La mortalidad directa provocada por la manipulación se registró inmediatamente después de la manipulación y hasta las 48 horas. Se encontró que la tasa de supervivencia inmediata de las PL era alta, situándose en el 81 %.

Al alcanzar la madurez sexual, elM. rosenbergiidemuestra un claro dimorfismo sexual y los machos son muy distintos de las hembras (Fig. 5A). Antes de la madurez sexual completa, el carácter sexual secundario específico del varón, AM, se puede detectar en el segundo par de pleópodos de los machos cuando se observa con lupa de laboratorio (Fig. 5B, panel superior). Esto contrasta con el apéndice interno, que se observa tanto en machos como en hembras (Fig. 5B).

En total, se criaron 210 hembras a las que se les administró una única inyección de células de AG hipertrofiada en suspensión durante un periodo de 7 a 8 meses en diversas condiciones (estanques de tierra, tanques de 3,5 metros cúbicos, etc.). La gran mayoría de estos animales manipulados se criaron en estanques de tierra en condiciones de crecimiento, por lo que se examinaron solo una vez en la extracción final, 9 meses después de la manipulación. Se descubrió que cien hembras tenían una inversión sexual completa a neomachos, según los desarrollos del AM y dos gonoporos masculinos visibles en la base de los quintos pereiópodos. Otras hembras presentaron una inversión sexual parcial y solo se observaron algunas de las características masculinas. Además, se observaron los tres morfotipos masculinos distintivos de esta especie (macho pequeño, pinzas naranjas y pinzas azules). En un grupo representativo supervisado de forma más estrecha, 16 hembras (validadas según un marcador sexual genético, Fig. 6) se manipularon como se ha indicado anteriormente. Aproximadamente 50 días después de la manipulación, todas estas 16 hembras genéticas habían desarrollado AM, 13 de las cuales también habían desarrollado gonoporos masculinos (~81 %) (Fig. 7, columna central), por lo que se consideraban neomachos. Catorce (14) machos PL intactos de la misma edad que las hembras manipuladas, que han servido de referencia, presentaron tanto AM como gonoporos en el primer punto de evaluación (Fig. 6 y Fig. 7, columna izquierda), como se esperaba.

Los neomachos se supervisaron semanalmente y se encontró que conservaban su AM. Asimismo, un año después de la manipulación, los neomachos regeneraron sus AM después de un ensayo de regeneración de muda. Estos neomachos se mantuvieron en tanques separados, se sometieron a una diferenciación morfotípica completa y se desarrollaron hasta convertirse en el morfotipo masculino dominante: los de 'pinzas azules' (un individuo representativo presentado en la Fig. 8). Con respecto a la gonadogénesis, se diseccionaron neomachos de pinzas azules y se tomaron muestras de su sistema reproductivo, que comprende testículos maduros (Fig. 9, recuadro) para un estudio histológico (Fig. 9). Los individuos disecados revelaron un conducto deferente bien desarrollado (Fig. 9A) lleno de espermatozoides. Bajo gran aumento, la morfología de las células demostró la estructura distintiva del paraguas invertido que caracteriza a este tipo de células maduras en machos deM. rosenbergii(Fig. 9B).

Asimismo, se observó un tejido testicular bien desarrollado compuesto por regiones muy teñidas y ligeramente teñidas (Fig. 9C). Con un gran aumento, se descubrió que las regiones muy teñidas, ubicadas en la periferia de cualquier lóbulo determinado, albergaban espermatogonios redondos en división (Fig. 9D). Se encontró que las regiones poco teñidas, que comprendían la mayor parte del volumen del lóbulo, albergaban espermatozoides maduros.

Ejemplo 2

Cruce de los neo-machos recién obtenidos con hembras normales

Se alojaron neomachosMrjunto con hembras normales en tanques colectivos (3,5-10 metros cúbicos). Una vez a la semana, se recogieron todas las hembras del tanque, después de lo cual, solo las hembras con huevos se trasladaron a tanques de vidrio individuales. Las hembras se supervisaron a diario hasta que el color de los huevos cambió de naranja a gris, momento en el que fueron transferidas a tanques de desove con 12-15 ppt de agua salina. Después de la eclosión, se retiraron las hembras y se inició el cultivo de larvas como de costumbre. Para determinar si una hembra había sido realmente fertilizada por un neomacho, cada descendencia se mantuvo por separado e inmediatamente después de la metamorfosis se determinó el género y el sexo genotípico de las poslarvas como se ha descrito anteriormente.

Las hembras que se había alojado junto con reproductores neomachos en tanques colectivos habían sido fecundadas con éxito. Tras la metamorfosis, las PL se caracterizaron genéticamente utilizando los marcadores sexuales del ADN para verificar que efectivamente estaban presentes las PL WW (Fig. 10) (excluyendo así la posibilidad de que la hembra hubiera sido fecundada por un macho ZZ normal). En total, de 865 individuos examinados que representan 4 cruces diferentes de al menos 2 neomachos diferentes, el 77 % (n=668) fueron positivos para el marcador sexual del ADN del cromosoma Z, es decir, hembras WZ y machos ZZ (Fig. 11A). En consecuencia, el 23 % restante (n=197) se determinaron como hembras WW. Asimismo, se utilizaron marcadores sexuales de ADN de los cromosomas W y Z para caracterizar de manera integral la distribución precisa de genotipos entre una muestra de 174 PL. De estas últimas, 42 fueron identificadas como machos ZZ (24,1 %), 90 como hembras WZ (51,8 %) y 42 como hembras WW (24,1 %), con una proporción genotípica de ZZ:WZ:WW de 1: 2,1: 1 (Fig. 11B).

Ejemplo 3

Cruce a escala comercial

Generación P

En la generación parental (P), un único reproductor (macho ZZ normal y hembra WZ) produjo una descendencia compuesta por entre 2000 y 5000 miles de hermanos WZ.

Generación F1

De estos últimos, 10 hembras WZ de primera generación (F1) elegidas al azar se sometieron a la manipulación de inversión sexual que incluyó la inyección de células como se describe en el presente documento. Al menos 5 de las hembras WZ elegidas tuvieron una inversión sexual exitosa a neomachos WZ completamente funcionales. Este ensayo en el que se registró una tasa de éxito del 50 % coincide con otros que implican una inversión sexual exitosa de hembras WZ a neomachos.

Generación F2

Cada uno de estos neomachos (hermanos) alcanzó la madurez sexual y se le permitió aparearse una vez con una hembra WZ normal. Estos cruces dieron lugar a al menos cinco descendencias F2. Cada cría de la descendencia F2 está relacionada como prima con una cría F2 paralela de F2. Dentro de cada una de las descendencias F2 mencionadas se obtuvieron al menos 700 hembras WW. Evidentemente, estas hembras WW no podrían haberse obtenido sin la manipulación de inversión sexual de las hembras WZ y, por lo tanto, no son un producto de la naturaleza.

Cada una de las hembras WW F2 obtenidas de diferentes descendencias F2 deben ser primas producidas a partir de cruces que implican al menos a 5 neomachos F1 diferentes (que deben ser hermanos neomachos F1) provenientes de los mismos progenitores. Se obtuvieron al menos 5 de estos primos, un número mínimo necesario para la producción en masa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un crustáceo decápodo hembra, que comprende un cultivo celular primario que comprende: medio de cultivo celular y células obtenidas de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo.

2. El crustáceo decápodo hembra de la reivindicación 1, que experimenta una inversión sexual a un macho sexualmente funcional.

3. Un crustáceo decápodo hembra, que comprende una composición que comprende al menos 1 x 102 células solitarias obtenidas de una glándula androgénica (AG) hipertrofiada de un crustáceo decápodo.