CN102448484A - 调节角质化细胞增生和分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了调节角质化细胞增生和分化的方法，该方法通过使角质化细胞经受能够调节IGFBP7活性或表达的药剂，从而调节角质化细胞的增生和分化。本发明还提供了通过向主体给予IGFBP7多肽或编码IGFB7多肽的多核苷酸来治疗特征为过度增生角质化细胞的病状的方法。

Description

调节角质化细胞增生和分化的方法

技术领域

本发明在其一些实施方式中，涉及用于治疗特征为角质化细胞(角化细胞)过度增生的病状的方法和药物组合物。

背景技术

银屑病(牛皮癣)是一种慢性炎症性皮肤病，影响着约2-5％的世界人口。银屑病的病因是多因素的，被认为是由环境和遗传因素之间的相互作用所引起。银屑病典型的组织病理学特征包括表皮(过度不全角化)和免疫(嗜中性粒细胞微囊肿、表皮单核浸润和血管增生)的异常。银屑病的特征为角质化细胞的增生增加，凋亡减少和分化异常，并常常会伴随其他疾病或病况，如关节炎、心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、糖尿病等。

当前银屑病的治疗包括局部给予煤焦油、维生素D衍生物、维甲酸类、和钙神经素抑制剂；使用UVB、NB-UVB和/或激光的光疗法；联合全身疗法和光疗法(如口服补骨脂素后暴露于UVA下)；全身给予环孢霉素、甲氨蝶呤、维甲酸类等；给予生物制剂如阿来法塞(Alafacept)、英夫利昔单抗、依那西普和优特克单抗。

银屑病的病因还不清楚。已找到与引发该疾病的遗传易感性相关的多种候选基因(Griffiths and Barker，2007；Lowes等人，2007；Nair等人，2009；Nair等人，2006；Yang等人，2008；Zenz等人，2008；Zenz and Wagner，2006；Zhang等人，2009)，证明该疾病的发病机制涉及免疫功能障碍和表皮缺陷。

多种动物模型已用于模拟银屑病的表型。例如，发现Jun蛋白可诱导的表皮缺失会引起银屑病样皮肤疾病和关节炎(Zenz等人，2005)。另外，发现角质化细胞血清反应因子的丢失会引起小鼠过度增生性皮肤病(Koegel等人，2009)。还有，Shon等人[Exp Dermatol.2008Aug；17(8)：703-12]综述了该病的动物模型，发现这些模型反映了银屑病的二元病因学。

光疗前后患者银屑病皮肤的基因组规模分析揭示编码胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)的IGFBP7显著上调(Hochberg M.，Zeligson S.，等人，2007)。

IGFBP7属于IGFBP超家族，一大组分泌蛋白，它们具有共同的N末端半胱氨酸富集区域。已鉴定总共16个家族成员，其中的6个(IGFBP1-6)能以高亲和力结合IGFs，其他的10个成员以低亲和力结合胰岛素生长因子(IGFs)。IGFBP7(也被称为IGFBP-rP1或MAC25)以低亲和力结合IGFs，但可以高亲和力识别胰岛素，因此改变它的代谢、分布和结合胰岛素受体的能力。IGFBP7具有IGF/胰岛素-非依赖作用。例如，IGFBP7含有能够使它与生长因子TGF-β超家族中的成员活化素结合，调节正常乳房细胞的功能、性腺功能和滤泡刺激激素(FSH)释放的“滤泡抑素模型”。IGFBP7被证明可调节不同癌细胞系的细胞增生、细胞粘附、细胞衰老和血管生成(Akaogi等人，1996；Burger等人，2005；Ruan等人，2007；Sato等人，2007；Wilson等人，2002)。最近，IGFBP7被证明可介导黑素细胞的衰老和凋亡并可体内抑制黑色素瘤的生长(Wajapeyee等人，2008)。

IGFBP7以普遍存在的形式表达，可在所有人生理流体如在血清、尿液和羊水(Degeorges等人，2000；Lopez-Bermejo等人，2003)中以它的分泌形式找到。IGFBP7通过蛋白水解处理灭活，另外，超甲基化已被报道也会影响它在肿瘤形成组织中的表达。IGFBP7由TGF-β、糖皮质激素和视黄酸诱导。发现IGFBP7是在非角质化细胞类型和角质化细胞中差异表达的几个角质化细胞-特异性基因之一(Gazel等人，2003)。

美国专利申请20090035312教导了，利用靶向波形蛋白、CD59、HMGB1和IGFBP7的抗体鉴定用于抗血管生成和血管靶向方法设计和在体内和体外抑制血管生成的特异性靶分子的方法。

其他的背景技术包括Candille等人，Science 2007；Lande等人，Nature2008；Chamorro等人，J.Invest.Dermatolo.2009；Duncan等人，J.Invest.Dermatol.1994；Kruger-Krasagakis等人，Br.J.Dermatol.2006；Wrone-Smith等人，Am.J.Pathol.1997；Komine等人，J.Invest Dermatol.2007；Rahmounet al，J Invest Dermatol，2009；Krueger and Bowcock，2005；McKay and Leigh，1995；Bernerd等人，1992；Bovenschen等人，2005；Vissers等人，2008；Haider等人，2006；Bowen等人，2004；Gunduz等人，2006；Yang等人，2009；Laporte等人，2000；Raj等人，2006；Yamanaka等人，1997；Genua等人，2009；Neely等人，1991；Sadagurski等人，2007；Wertheimer等人，2001；Wertheimer等人，2000；Nickoloff等人，2006。

发明内容

根据本发明一些实施方式的方面，提供了治疗特征为角质化细胞过度增生的病状的方法，包括向需要其的主体给予治疗有效量的胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)多肽或编码IGFBP7多肽的核酸序列，从而治疗特征为角质化细胞过度增生的病状。

根据本发明一些实施方式的方面，提供了包含胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)多肽或编码IGFBP7多肽的核酸序列、和药学可接受载体的调配用于局部给予(外部给予，topical administration)的药物组合物。

根据本发明一些实施方式的方面，提供了胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)多肽或编码IGFBP7多肽的核酸序列在制造用于治疗特征为角质化细胞过度增生病状的药物中的用途。

根据本发明一些实施方式的方面，提供了调节角质化细胞增生和分化的方法，该方法包括使能够调节IGFBP7活性或表达的药剂作用于角质化细胞，从而调节角质化细胞的增生和分化。

根据本发明的一些实施方式，该药物组合物被鉴定可用于治疗特征为角质化细胞过度增生的病状。

根据本发明的一些实施方式，IGFBP7多肽含有至少一个IGFBP7功能性部分(functional portion)。

根据本发明的一些实施方式，特征为角质化细胞过度增生的病状是银屑病。

根据本发明的一些实施方式，特征为角质化细胞过度增生的病状选自由银屑病、扁平苔癣(lichen planus)、毛发红糠疹(pityriasis rubra pilaris，PRP)、丘疹鳞屑性疾病(papulosquamous disease)、皮炎和慢性单纯性苔癣(lichen simplex chronicus)所组成的组。

根据本发明的一些实施方式，皮炎选自由特应性皮炎(atopicdermatitis)和接触性皮炎所组成的组。

根据本发明的一些实施方式，该方法进一步包括向主体给予能够至少部分减轻该病状症状的药剂，其中，该药剂适合于局部给予或全身给予(系统给予，systemic administration)和/或与光疗法一起治疗主体。

根据本发明的一些实施方式，适合于局部给予的药剂选自由皮质类固醇(糖皮质激素)、维生素D类似物或衍生物、地蒽酚(蒽林，anthralin)、局部用维甲酸类(局部用类维生素A，topical retinoid)、钙神经素抑制剂、水杨酸、煤焦油和湿润剂(保湿液，moisturizer)所组成的组。

根据本发明的一些实施方式，光疗法选自由日光光疗法、UVB光疗法、窄带UVB光疗法、光化学疗法、PUVA和准分子激光所组成的组。

根据本发明的一些实施方式，适合于全身给予的药剂选自由维甲酸类(类视色素、维甲素、视黄素，retinoid)、免疫抑制药、免疫靶向生物制剂、免疫毒素和肿瘤坏死因子(TNF)阻断剂所组成的组。

根据本发明的一些实施方式，该药物组合物进一步包括选自由皮质类固醇、维生素D类似物、地蒽酚、局部用维甲酸类、钙神经素抑制剂、水杨酸、煤焦油、维甲酸类、免疫抑制药、免疫靶向生物制剂、免疫毒素和TNF阻断剂所组成的组的药剂。

根据本发明的一些实施方式，调节角质化细胞增生和分化包括下调角质化细胞的增生促进角质化细胞的分化。

根据本发明的一些实施方式，能够调节IGFBP7的活性或表达的药剂含有具有IGFBP7氨基酸序列的多肽。

根据本发明的一些实施方式，能够调节IGFBP7的活性或表达的药剂含有编码具有IGFBP7氨基酸序列的多肽的多核苷酸。

根据本发明的一些实施方式，下调该增生和促进该分化是为了治疗银屑病。

根据本发明的一些实施方式，调节角质化细胞增生和分化包括上调该增生。

根据本发明的一些实施方式，能够调节IGFBP7的活性或表达的药剂选自由能够使IGFBP7表达沉默的寡核苷酸、中和抗体、显性失活IGF(显性阴性IGF，dominant negative IGF)或胰岛素所组成的组。

根据本发明一些实施方式的方面，提供了治疗需要其的主体的银屑病的方法，该方法包括向主体给予治疗有效量的能够上调IGFBP7的活性或表达的药剂，从而治疗银屑病。

根据本发明的一些实施方式，该方法进一步包括向主体给予选自由以下药物组成的组的药物：局部治疗药物(皮质类固醇、维生素D类似物、地蒽酚、局部用维甲酸类、钙神经素抑制剂、水杨酸、煤焦油和湿润剂)、光疗药物(日光光疗、UVB光疗、窄带UVB治疗、光化疗、准分子激光)，以及注射或口服治疗药物(维甲酸类)、免疫抑制药(甲氨蝶呤、环孢霉素)、免疫靶向生物制剂、免疫毒素(地尼白介素(denileukin))和TNF生物阻断制剂。

根据本发明一些实施方式的方面，提供了促进皮肤再生的方法，包括将能够使IGFBP7活性或表达下调的药剂与皮肤接触，从而促进皮肤的再生。

根据本发明的一些实施方式，该药剂调配用于局部给予(局部给予)。

根据本发明一些实施方式的方面，提供了包含IGFBP7和药学可接受载体的调配用于局部给予的药物组合物。

根据本发明一些实施方式的方面，提供了包含能够使IGFBP7活性或表达下调的药剂和药学可接受载体的调配用于局部给予的药物组合物。

除非另有限定，否则本文使用的所有技术和/或科学术语的含义都与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同。虽然下面描述了示例方法和/或材料，但本发明实施方式的实施或试验中可使用与本文所描述的那些相似或者相同的方法和材料。如有冲突，以专利说明书为准，包括定义。另外，材料、方法和实施例仅为了说明，而不旨在必然进行限制。

附图说明

本文仅参考附图通过实施例说明本发明的一些实施方式。关于下面详细讨论的附图，要强调的是，所示细节仅为了举例，用于示意性地讨论本发明的实施方式。就此而言，参考附图所作的描述将使本领域普通技术人员明了本发明的实施方式如何实施。

附图中：

图1A-D是描绘银屑病中IGFBP7蛋白表达的免疫染色分析的代表性图像。来自患有斑块状银屑病患者(n＝13)或健康对照组(n＝13)的组织切片利用小鼠抗-IGFBP7或小鼠抗-KRT14抗体进行免疫染色分析(未示出)，并利用苏木素复染色。图1A-表示从健康对照组中获得并用小鼠抗-IGFBP7抗体染色的代表性组织切片；图1B-表示从健康对照组中获得并用非免疫血清染色的组织切片(阴性对照载玻片)；图1C-表示从患有斑块状银屑病患者中获得并用小鼠抗-IGFBP7抗体染色的代表性组织切片；图1D-是描述银屑病患者和对照组的染色强度的柱状图。染色强度由2个独立观测者评定为1-4的等级。数据表示为平均染色强度等级。直方柱指示组均值(^*p＜0.01，均值±SD)。

图2A-B描述HaCat细胞和原代人角质化细胞中IGFBP7表达的下调。图2A-用siRNA转染或用表达IGFBP7特异性shRNA的慢病毒载体感染HaCat细胞系和原代人角质化细胞。非特异性的siRNA或shRNA用作对照。RNA在培养48小时后提取。mRNA的表达用β-肌动蛋白(ACTB)或3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-pho sphate dehydrogenase，GAPDH)标准化(未示出)。结果表示为所占对照的百分数。数据表示为重复执行的三个独立实验的数据均值±SD。图2B-对从稳定表达IGFBP7特异性shRNA(shIGFBP7)或非特异性shRNA(对照)的HaCat细胞中获得的条件培养基的蛋白提取物，进行免疫印迹分析，使用抗-IGFBP7探针。注意到受IGFBP7特异性shRNA感染的细胞中IGFBP7表达显著下降。

图3A-F描述角质化细胞活力和增生的分析。图3A-使用MTT分析法，评估利用siRNA使IGFBP7下调并培养24和72小时(h)的HaCat细胞，和稳定表达IGFBP7特异性shRNA或对照shRNA的HaCat细胞的细胞活力。数据表示为三个独立实验的数据均值±SD。与对照细胞相比，^*p＜0.01。图3B-使用BrDu分析法(稳定转染)评估稳定表达IGFBP7特异性shRNA或对照shRNA的HaCat细胞。数据表示为三个独立实验的数据均值±SD。与对照细胞相比，^*p＜0.01。图3C和3D-通过qRT-PCR(图3C)和免疫印迹(图3D)评估稳定表达IGFBP7特异性shRNA或对照shRNA的HaCat细胞的KRT6a mRNA和蛋白水平。图3E和3F-用IGFBP7特异性siRNA(IGFBP7)或对照siRNA(对照)短暂转染原代角质化细胞，并使用MTT分析法(图3E，转染24和48小时后)和BrDu分析法(图3F，转染24小时后)评估。数据表示为三个独立实验的数据均值±SD(与对照细胞相比，^*p＜0.01)。注意，当IGFBP7下调时，与对照细胞相比，角质化细胞变得更具活力和增生更强，并表达较高水平的表皮增生标记物Krt6。这些结果说明了IGFBP7对角质化细胞的抗增生作用。

图4A-4C描述HaCat细胞或原代角质化细胞的凋亡分析。图4A-4B-将稳定表达IGFBP7特异性(IGFBP7)或对照shRNA(对照)(错义对照(混杂对照，scrambled control))的HaCat细胞在转染24小时后，暴露于10ng/μl的重组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(+)或载体(-)中。利用TUNEL分析法(图4A)或膜联蛋白V(Annexin V)分析法(图4B)测定凋亡。图4C-用IGFBP7特异性siRNA(IGFBP7)或错义对照siRNA(对照)短暂转染原代角质化细胞，然后将该细胞暴露于10ng/μl的重组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(+)或载体(-)中。通过TUNEL分析评估凋亡活性。所有实验重复进行三次。结果以均值±SD的形式表示。结果^*p＜0.01被认为存在显著性。注意，IGFBP7下调的角质化细胞具有显著的低凋亡水平，IGFBP7下调的细胞缺少TNF-α诱导的凋亡。这些结果表明，TNF-α介导的凋亡需要IGFBP7，IGFBP7表达的减少与人角质化细胞凋亡减少有关。

图5A-5C描述HaCat细胞或原代角质化细胞中的分化相关事件。图5A和5B-通过提高细胞外钙浓度，诱导稳定表达IGFBP7特异性或对照shRNA的HaCat细胞(图5A)或人原代角质化细胞(图5B)分化。分别评估KRT10和外皮蛋白(involucrin，INV)基因表达，作为早期和晚期分化相关事件的量度。数据表示为重复执行的三个独立实验的数据均值±SD；这些结果表明钙诱导的角质化细胞分化需要IGFBP7。图5C-利用从原代角质化细胞和HaCat细胞中获得的数据集中在钙诱导后对IGFBP7沉默表现出最大响应的前100个基因，进行全程的GO注释分析。显著性注释(p值＜0.01)包括与细胞增生和分化直接相关的过程：氧自由基应答、ATP水解偶联的质子转运、精子活力、氢离子稳态、未折叠蛋白应答、mRNA加工、RNA剪接、蛋白修饰、凋亡调节、钠离子转运、视觉、细胞增殖负向调节、钾离子转运。绿色柱对应于鉴定的GO注释的观察到的频率，与它们的期望频率(褐色柱)进行比较。

图6A-6C描述外源性表达IGFBP7的原代角质化细胞的细胞活力和增生的分析。原代角质化细胞用1.8μg/μl的人重组IGFBP7多肽(rIGFBP7；R&D systems Inc.Catalogue No.1334-B7-025)处理72小时，然后在缺少rIGFBP7的培养基中培养12小时。图6A-6B使用MTT法(图6A)和BrDU法(图6B)评估细胞活力和增生。图6C-通过TUNEL分析法量化凋亡。所有实验重复三次。结果以均值±SD的形式表示。结果^*p＜0.01被认为存在显著性。注意，IGFBP7多肽诱导了TNF-α介导的角质化细胞凋亡(图6C)并降低了角质化细胞的活力(图6A)和增生(图6B)。

图7A-7D描述IGFBP7下调的HaCat细胞的免疫分析。为了评估IGFBP7下调对通过胰岛素受体的信号的作用，从稳定表达IGFBP7特异性shRNA或对照shRNA的HaCat细胞中提取蛋白。蛋白提取物使用免疫印迹法分析，使用直接抗磷酸化IRS-1(pIRS，图7A，上图)和IRS-1(图7A，中图)或磷酸化ERK 1/2(pERK，图7B，上图)和ERK2(图7B，中图)的抗体。使用直接抗β-肌动蛋白的抗体进行的免疫染色作为对照(图7A，下图和图7B，下图)。图7C-7D-通过光密度法评估条带强度。该实验重复三次，结果以均值+SD的形式示出在图表中。图7C-磷酸化IRS-1(pIRS)和IRS-1的表达水平比。图7D-磷酸化ERK 1/2(pERK)和ERK2的表达水平比。结果显示，IGFBP7的下调增大了通过胰岛素受体的信号，这由IRS-1和酪氨酸激酶ERK1/2磷酸化的增加决定。相反，IGFBP7不影响SAMD 2/3磷酸化状态(数据未示出)，提示IGFBP7通过调节IGF/胰岛素信号影响KC(角质化细胞)。

图8是描述利用siRNA使IBFBP7下调的HaCat细胞中GFBP3、IGFBP6和IGFBP7的mRNA表达水平的柱状图。提取稳定表达IGFBP7特异性shRNA(IGFBP7shRNA)或非特异性shRNA(对照)的HaCat细胞中的RNA。使用qRT-PCR评估GFBP3、IGFBP6和IGFBP7mRNA的表达，并用ACTB或GAPDH标准化。结果表示为所占对照的百分比。数据表示为均值±SD。注意，IGFBP7的下调显著降低了IGFBP7的mRNA水平，但没有降低IGFBP3或IGFBP6的mRNA水平。

图9A-9D是描述钙诱导分化后通过siRNA使IGFBP7下调的HaCat细胞的形态变化的差相显微镜图像。将用IGFBP7特异性(图9A和9B)或对照(图9C和9D)shRNA稳定转染的HaCat细胞高密度地(80％)涂布于板中，并在低浓度(图9A和9C)或高浓度(图9B和9D)细胞外钙的存在下培养4天，通过差相显微镜检查。对照细胞具有典型的圆形鹅卵石状外观，但没有观察到IGFBP7下调的细胞发生显著变化。

图10是描述利用shRNA使IGFBP7下调的原代角质化细胞中的KRT6a基因表达的柱状图。使用特异性shRNA短暂下调IGFBP7的原代角质化细胞中的KRT6a mRNA水平通过qRT-PCR评估，如一般材料和实验方法中所描述的。注意，IGFBP7下调的角质化细胞中的KRT6a mRNA水平上调。

图11是描述钙诱导HaCat细胞兜甲蛋白(loricrin)表达的柱状图。通过提高细胞外钙浓度，诱导稳定表达IGFBP7特异性或对照shRNA的HaCat细胞分化。4天后，通过qRT-PCR评估兜甲蛋白(LOR)基因表达。数据表示为重复执行的三个独立实验的数据均值±SD。注意，虽然钙诱导表达对照shRNA的细胞的兜甲蛋白上调，但该兜甲蛋白表达水平显著低于表达IGFBP7-shRNA的细胞的兜甲蛋白表达水平。

图12是描述血清对IGFBP7表达的影响的图表。HaCat细胞在浓度逐渐增加的胎牛血清的存在下培养。48小时后提取RNA，使用qRT-PCR评估IGFBP7的表达，并利用ACTB或GAPDH标准化。数据以均值±SD的形式表示。注意，血清降低了IGFBP7的表达水平。

图13描述根据本发明一些实施方式的模型：因为已知可诱导细胞增生(增殖)的生长因子浓度的增大与IGFBP7表达的下降相关，而IGFBP7表达的下降与增生活性的增大相关，所以从IGFBP7的作用来看，可以想象恶性循环会导致银屑病，其中该两个因素(IGFBP7和角质化细胞增生)中的每个可加强另一个的影响。

图14A-14B是描述角质化细胞TUNEL分析的荧光显微镜图像。对使用特异性shRNA(图14B)或对照shRNA(图14A)短暂下调IGFBP7的原代角质化细胞，进行TUNEL分析。注意，被染成红色的细胞(对应凋亡细胞)是用对照shRNA而不是IFGBP7特异性shRNA处理的角质化细胞，表明用IGFBP7 shRNA处理的细胞凋亡受到抑制。

图15A-15D是散点图分析(scatter plots analyses)，描述了野生型和IGFBP7沉默细胞在应答高浓度钙时的基因表达变化。图15A-15B是比较野生型细胞(蓝点)与IGFBP7沉默细胞(红点)在暴露于高浓度钙中之后表达增大＞2倍(图15A)或下降＞1/2(图15B)的所有基因的表达水平变化的散点图。注意，虽然野生型细胞在应答高浓度钙时特定基因显著上调(图15A)或下调(图15B)，但IGFBP7沉默细胞在应答高浓度钙时，这些基因没有显著变化。在野生型细胞暴露于高浓度钙之后表现出差异表达的基因中大于95％基因中的IGFBP7沉默后，可观察到表达显著性衰减变化(图15A-B)。图15C-D是比较野生型细胞(蓝点)和相同数量随机选择的IGFBP7沉默细胞(红点)在暴露于高浓度钙之后表达增大大于两倍(图15C)或下降大于1/2(图15D)的基因的表达水平变化的散点图。图15A-B中看到的效果是可被钙诱导或抑制的基因所特有的，因为当对随机选择的基因集合(图15C-D)进行相同比较时没有观察到该效果。

图16是描述细胞衰老标记物β-半乳糖苷酶的表达的柱状图。注意，IGFBP7不影响角质化细胞的衰老。

图17是描述ERK的抑制对IFGBP7沉默细胞和对照的原代角质化细胞增生的影响的柱状图。IGFBP7 siRNA转染的原代角质化细胞用120μMPD98059(ERK抑制剂)处理72小时，每24小时更换新培养基。注意，ERK的抑制使IGFBP7下调诱导的细胞增生衰减(p＜0.01)。

图18是描述构建三维皮肤模型的示意图。简要地说，从皮肤活组织中收获原代角质化细胞和表皮成纤维细胞，将表皮成纤维细胞植入含有I型胶原的基质中，并将角质化细胞培育在空气表面处。在2-3周内出现分层。

图19是用于在图18中所描述的三维模型的空气表面处培育细胞的特定6-孔板的照片。

图20A-20C是描述用H-E染色的，培育7天(图20A)、10天(图20B)和12天(图20C)的器官型皮肤等效物(图18中所构建)的显微镜图像。注意，形成的所有表皮层在10天时出现正常的角质化(cornication)，在12天时开始脱屑。

图21是描述在体外形成三维表皮期间IGFBP7 mRNA表达的柱状图。“d”＝天；注意，在皮肤形成期间IGFBP7 mRNA表达增加。

图22A-22B是描述用H-E染色的，经对照siRNA(图22A)或IGFBP7特异性siRNA(图22B)转染的三维模型的显微镜图像，说明银屑病表型的复制是利用siRNA介导的IGFBP7下调的结果。

图23是构建银屑病体内模型的示意图。简要地说，通过将从银屑病患者获得的NK/T细胞注入移植到Bg小鼠上的正常人皮肤内来诱导银屑病。

图24是用苏木素和伊红(H-E)染色的，源自注射PBS的小鼠的组织切片的显微镜图像。注意，表皮中出现了大范围真皮浸润、表皮突(reteridge)延伸和典型的嗜中性脓肿(放大40倍)。

图25是用苏木素和伊红(H-E)染色的，源自注射地塞米松的小鼠的组织切片显微镜图像。注意，与图24相比表型变得正常化(放大40倍)。

图26是用苏木素和伊红(H-E)染色的，源自注射IGFBP7的小鼠的组织切片显微镜图像。注意，与图24相比的表型变得正常化(放大40倍)。

具体实施方式

本发明中的一些实施方式涉及调节角质化细胞的增生和/或分化的方法，更尤其是，但不仅是，治疗特征为角质化细胞过度增生的病状的方法。

在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应理解本发明的应用不必局限于下面的说明限定或通过实施例列举的细节。本发明能够有其他实施方式，或能够以多种方式实施或实现。

本发明人已公开了IGFBP7调节角质化细胞的增生和分化。

如下面实施例部分所示，银屑病组织样品与正常未感染组织相比，IGFBP7表达水平下降(图1A-1D；实施例1)。本发明人公开了，血清可刺激IGFBP7表达水平的下调(图12；实施例1)，IGFBP7特异性基因沉默(使用shRNA或siRNA；图2A-2B，图8；实施例2)可诱导角质化细胞的增生和活力(图3A-3F；实施例2)并减少角质化细胞的凋亡(图4A-4C；图14A-14B；实施例2)，但不影响角质化细胞的衰老(图16；实施例2)。而且，本发明人发现，IGFBP7是钙诱导的角质化细胞分化所需要的(图5A-5C，图9A-9D，图11，表3和4；实施例3)，IGFBP7沉默可诱导角质化细胞中的IRS1和ERK磷酸化(图7A-7D，实施例5)，ERK的抑制可使IGFBP7下调所诱导的细胞增生衰减(图17；实施例5)。另外，如下面实施例部分的实施例4所示，本发明人公开了，重组IGFBP7可抑制人角质化细胞的增生，诱导人角质化细胞的凋亡(图6)。而且，利用离体模型，本发明人证明，IGFBP7的减少会引起银屑病表型(实施例6；图22A-B)，重组IGFBP7可治愈人-鼠嵌合模型的银屑病(图23-26；实施例7)。这些结果说明，给予IGFBP7多肽或编码IGFBP7多肽的多核苷酸可以诱导角质化细胞的凋亡，因此可用于治疗与角质化细胞过度增生相关的病状。

根据本发明的方面，提供了调节角质化细胞增生和分化的方法，该方法包括使能够调节IGFBP7的活性或表达的药剂作用于角质化细胞，从而调节角质化细胞的增生和分化。

根据本发明的一些实施方式，调节角质化细胞的增生和分化包括下调角质化细胞的增生和促进角质化细胞的分化。

根据本发明的一些实施方式，下调角质化细胞的增生和促进角质化细胞的分化通过上调IGFBP7的活性或表达实现。

在此使用的术语“IGFBP7”表示指定为IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)基因符号的合成、重组和/或天然存在的多核苷酸和多肽序列。

根据本发明的一些实施方式，能够上调IGFBP7表达的药剂是设计和构建用于表达至少一个IGFBP7功能性部分的外源多核苷酸序列。因此，该外源多核苷酸序列可为编码IGFBP7分子的DNA或RNA序列，IGFBP7分子能够诱导角质化细胞凋亡。

IGFBP7多核苷酸序列的非限制性实例包括GenBank登记号NM_001553.1(SEQ ID NO：1)、GenBank登记号为NC_000004.11的核苷酸57897244-57976539(补体)、GenBank登记号为NT_022853.15的核苷酸5237126-5316421(补体)、登记号为AC_000047.1(Celera)的核苷酸55402267-55481286(补体)、GenBank登记号为NW_922162.1(Celera)的核苷酸5227241-5306260(补体)、GenBank登记号AC_000136.1(HuRef)的核苷酸53850817-53930078(补体)、GenBank登记号为NW_001838913.1(HuRef)的核苷酸5248335-5327596(补体)。

IGFBP7已从人、大鼠和小鼠源中克隆。表1提供了可根据本发明的一些实施方式使用的IGFBP7的核酸和多肽序列。

表1

表1：提供了来自多种物种的示例IGFBP7序列(胰岛素样生长因子结合蛋白7)及与人IGFBP7序列的相似度。“n”＝核酸序列；“a”＝氨基酸序列。

因此，IGFBP7编码序列信息可以从几个数据库中获得，包括GenBank数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

根据本发明的一些实施方式，能够上调IGFBP7表达的药剂是至少包含IGFBP7功能性部分的多肽。

天然存在的IGFBP7多肽序列的非限制实例包括GenBank登记号NP_001544.1(SEQ ID NO：12)、CCDS3512.1(SEQ ID NO：13)、Q16270(SEQ ID NO：14)、EAX05521.1(SEQ ID NO：15)、EAX05520.1(SEQ IDNO：16)、AAX29723.1(SEQ ID NO：17)、AAX42962.1(SEQ ID NO：18)、AAX36927.1(SEQ ID NO：19)，和AAX36528.1(SEQ ID NO：20)。

在此使用的术语“功能性部分”是指表现出分泌型多肽功能特性，如诱导角质化细胞凋亡和/或抑制角质化细胞增生的特性的IGFBP7蛋白(即，多肽)的部分。例如下面实施例2-7中描述的测定方法，可用于确定所给IGFBP7蛋白部分是否是这里所述的功能性部分。

包括IGFBP7功能性部分的多肽的定量方法包括体外(in vitro)测定法(如，利用原代角质化细胞或角质化细胞系进行凋亡测定、细胞活力测定和增生测定)，离体(ex vivo)分析法(如，在从过度增生的角质化细胞活组织中获得的原代角质化细胞培养物上或在实施例部分所描述的三维皮肤模型上进行凋亡测定、细胞活力测定和增生测定)和体内(in vivo)测定法(使用具有特征为角质化细胞过度增生的病状的动物模型，通过利用如实施例部分描述的组织学和免疫学检测方法，监测IGFBP7对组织形态的作用)。

如上述，IGFBP7可以是合成多肽。

在此使用的术语“多肽”包括天然肽(降解产物、合成肽或重组肽)和模拟肽(通常为合成肽)以及作为肽类似物的类肽(peptoids)和半类肽(semipeptoids)，这些肽可具有如使得肽在机体内更稳定或更能够穿入细胞的修饰。此类修饰包括，但不限于N端修饰、C端修饰、肽键修饰，包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH，主链修饰和残基修饰。制备模拟肽化合物的方法是本领域熟知的，并具体说明在如，Quantitative Drug Design，C.A.Ramsden Gd.，Chapter 17.2，F.Choplin Pergamon Press(1992)中，该文献通过引用合并在此，如同全部列出在此。下面进一步详细地描述这个方面。

该肽内的肽键(-CO-NH-)可用，如N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-偶氮键(-NH-N(R)-CO-)替换，其中R是任意烷基，如，甲基、carba键(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯双键(-CH＝CH-)、逆酰胺键(retro amide bonds)(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是通常位于碳原子上的“正”侧链。

这些修饰可以出现在沿着肽链的任意键上，甚至同时出现在几处(2-3)。

天然芳香族氨基酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸可以替代为合成的非天然酸，如TIC、萘基丙氨酸(Nol)、苯丙氨酸的环甲基化衍生物、苯丙氨酸的卤代衍生物或邻-甲基-酪氨酸。

除以上之外，本发明的肽还可以包括一种或多种修饰氨基酸，或一种或多种非氨基酸单体(如脂肪酸，复合糖等)。

术语“一种氨基酸”或“多种氨基酸”应理解成包括20种天然氨基酸，经常经体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括，如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸，和其他特殊(unusual)氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链赖氨素(isodesmosine)、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸(ornithine)。此外，术语“氨基酸”包括D型和L型氨基酸。

虽然本发明的肽优选以线性形式使用，但应理解，在环化不严重干扰肽性质的情况下，也可以使用肽的环化形式。

由于本发明的肽优选用于要求肽为可溶形式的治疗或诊断中，因此本发明的肽优选包括一种或多种非天然或天然极性氨基酸，包括但不限于因其含羟基侧链而能够增大肽溶解性的丝氨酸和苏氨酸。

本发明的肽可由肽合成领域技术人员已知的任何技术合成。对于固相肽合成，可在J.M.Stewart and J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963 and J.Meienhofer，Hormonal Proteinsand Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1973中找到许多技术的综述。对于经典的溶液合成，参见G.Schroder and K.Lupke，ThePeptides，vol.1，Academic Press(New York)，1965。

一般而言，这些方法包含将一种或多种氨基酸或适当保护的氨基酸，相继添加到扩展中的肽链中。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基用适当的保护基团保护。通过在适合于形成酰胺连键的条件下，使被保护或衍生化的氨基酸连接到惰性固相载体上或使其溶解，通过按顺序加入具有适当保护的互补基团(氨基或羧基)的下一个氨基酸完成。然后脱去新加入的氨基酸残基的保护基，接着加入下一种氨基酸(被适当保护)，如此等等。在所有期望氨基酸都按正确顺序连接后，相继或同时除去任何剩余的保护基团(和任何固相载体)从而得到最终的肽化合物。通过对这种一般程序进行简单地修改，每次可以将一种以上的氨基酸加入到扩展中的链中，例如，通过将被保护的三肽与被适当保护的二肽结合(在不使手性中心外消旋化的条件下)从而在脱保护后形成五肽，如此等等。肽合成的进一步描述公开在美国专利No.6,472,505中。

制备本发明肽化合物的优选方法包括固相肽合成法。

大规模肽合成描述在Andersson Biopolymers 2000；55(3)：227-50中。

IGFBP7还可使用重组技术制备。

例如，重组人IGFBP7可从许多商业来源得到，如AbDSerotec(Kidlington OXON，UK)商品目录号PHP178、Cell

(Canton，MA，USA)商品目录号CR1511B、R&D systems有限公司(Minneapolis，MN)、Abcam有限公司(Cambridge，MA，USA)商品目录号ab50195。

为了在哺乳动物细胞中表达外源IGFBP7，优选将编码IGFBP7的多核苷酸序列(如上文提供的多核苷酸序列)连接到适合哺乳动物细胞表达的核酸构建体中。这样的核酸构建体包括以组成、组织特异性或可诱导的方式引导多聚核苷酸在细胞中转录的启动子序列。

应理解本发明的核酸构建体也可利用编码表现出期望活性(如，诱导角质化细胞的凋亡活性)的IGFBP7同源物的多核苷酸。此类同源物可与IGFBP7多肽具有，例如，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性，如利用Wisconsin序列分析程序包的BestFit软件，利用空位权重等于50，长度权重等于3，平均匹配度等于10和平均错配度等于-9的Smith-Waterman算法确定的。

适用于本发明的组成型启动子是在大多数条件下和大多数类型的细胞中具有活性的启动子序列，如巨细胞病毒(CMV)和Rous肉瘤病毒(RSV)。适用于本发明的可诱导型启动子包括如四环素-可诱导型启动子(Zabala M，等人，Cancer Res.2004，64(8)：2799-804)。

可用于在角质化细胞中指导本发明多核苷酸表达的组织特异性型启动子的非限制性实例包括，角质化细胞特异性启动子如K14启动子[如GenBank登记号U11076(SEQ ID NO：21)、GenBank登记号DQ343282(SEQID NO：22)、GenBank登记号为AB091380(SEQ ID NO：23)的核苷酸1-2334或GenBank登记号为U11076(SEQ ID NO：21)的核苷酸1-2258或1-2281]，II型头发特异性角蛋白启动子[如，GenBank登记号AY037552(SEQ IDNO：24)]，角蛋白4(KRT4)启动子[如，GenBank登记号为AF066051(SEQ ID NO：25)的核苷酸1-1040或1-1103；GenBank登记号X97566(SEQ ID NO：26)的核苷酸1-925、1-948、1-1010]；角蛋白K17启动子GenBank登记号S81026(SEQ ID NO：27)；角蛋白K5启动子GenBank登记号S56203(SEQ ID NO：28)，II型头发角蛋白6启动子GenBank登记号为Y19211(SEQ ID NO：29)的核苷酸1-642、1-647或1-700，II型头发角蛋白1启动子[GenBank登记号为Y19206(SEQ ID NO：30)的核苷酸1-500、1-505或1-550]，65kD角蛋白II型启动子[GenBank登记号为X05418(SEQ ID NO：31)的核苷酸1-437或1-540]。

本发明的核酸构建体(在此也称为“表达载体”)包括使这个载体适合在原核生物、真核生物或优选二者中复制和整合的额外序列(如穿梭载体)。另外，典型的克隆载体也可含有转录和翻译起始序列、转录和翻译终止子，和多腺苷酸化信号。例如，此类构建体可典型地包括5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二条DNA链的合成起点，和3′LTR或其部分。

本发明的核酸构建体典型地包括将肽从其所处的宿主细胞中分泌出来的信号序列。优选用于这个目的的信号序列是哺乳动物细胞信号序列或本发明多肽变体的信号序列。

真核启动子典型地包含两种识别序列，TATA框和上游启动子元件。TATA框，位于转录起始位点上游的25-30位碱基对处，被认为参与指导RNA聚合酶开始RNA的合成。其他上游启动子元件决定转录起始速率。

与同源或异源启动子连接时，增强子元件可促进转录提升至1,000倍。增强子在处于转录起始位点的上游或者下游的时候是具有活性的。来源于病毒的许多增强子元件具有广宿主范围，并在多种组织中都具有活性。例如，SV40早期基因增强子适合于许多细胞类型。适合于本发明的其他增强子/启动子组合包括来源于多瘤病毒、人或鼠巨细胞病毒(CMV)的那些，以及来源于各种逆转录病毒如鼠白血病病毒、鼠或Rous肉瘤病毒和HIV的长末端重复序列。参见Enhancers and Eukaryotic Expression，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1983，该文献在此作为参考引入。

在构建表达载体时，优选将启动子与异源转录起始位点的距离设置成与该启动子在自然环境下与转录起始位点的距离近似相同。然而，如本领域众所周知的，在不损坏启动子功能的情况下可以对这个距离的各种变化进行调节。

也可将多聚腺苷化序列加入到表达载体中以便增加IGFBP7 mRNA翻译的效率。准确高效的多聚腺苷化需要2个不同的序列元件：位于多聚腺苷化位点下游的富含GU或U的序列，和位于上游核苷酸11-30之间的六个核苷酸高度保守序列AAUAAA。适合于本发明的终止和多腺苷酸化信号包括源于SV40的那些。

除已描述的元件以外，本发明的表达载体还可典型地包含其他旨在增大克隆核酸的表达水平或使携带重组DNA的细胞的鉴定易于进行的特定元件。例如，许多动物病毒包含促进病毒基因组在允许的细胞类型中进行额外染色体复制的DNA序列。携载这些病毒复制子的质粒可以独立地复制(replicated episomally)，只要质粒上携带的基因或宿主细胞基因组的基因能够提供合适的因子即可。

该载体可以包括或可以不包括真核复制子。如果存在真核复制子，则该载体可利用合适的可选标记在真核细胞中扩增。如果该载体不包含真核复制子，则无法进行游离型扩增(episomal amplification)。相反，重组DNA整合到工程细胞的基因组中，其中启动子指导期望核酸的表达。

本发明的表达载体可以进一步包括如允许从单一mRNA如内核糖体进入位点(IRES)和用于启动子嵌合多肽基因组整合的序列翻译几个蛋白的另外的多核苷酸序列。

哺乳动物细胞的表达载体的实例包括，但不限于，可从Invitrogen获得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，可从Promega获得的pCI，可从Strategene获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可从Clontech获得的pTRES，和它们的衍生物。

也可以使用包含来自于真核病毒如反转录病毒的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。源于牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，源于艾伯斯坦-巴尔病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例载体包括pMSG、pAV009/A⁺、pMTO10/A⁺、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，和任何其他允许蛋白表达在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他对真核细胞的表达有效的启动子的指导下进行的载体。

如以上所描述的，病毒是非常专一的感染原，它们已在许多情况下发生演变从而逃避宿主的防御机制。典型地，病毒感染特定细胞类型并在其中繁殖。病毒载体的靶向特异性利用它的天然特异性而特异性地靶向预定细胞类型，从而将重组基因导入到感染细胞中。因此本发明使用的载体类型将取决于转化的细胞类型。根据转化的细胞类型选择合适载体的能力完全在普通技术人员能力范围内，因此本文不对选择考虑因素进行概述。例如，可利用Friend来源的逆转录病毒载体(FOCH29-NeoR)靶向角质化细胞[Arango M.，等人，2005，Dermatology Online Journal 11(2)：2；该文献通过引用完整地合并在此]。

重组病毒载体对IGFBP7的体内表达有用，因为它们具有诸如横向感染(lateral infection)和靶向特异性的优点。横向感染是例如逆转录病毒生命周期中固有的，是单一感染细胞产生很多可出芽并感染邻近细胞的子代病毒颗粒的过程。结果是大面积迅速受到感染，其大部分最初并不是通过原始病毒颗粒感染的。这与纵向型感染相反，在纵向型感染中感染原仅通过母系子代(daughter progeny)蔓延。也可生产不可横向传播的病毒载体。如果期望目的是将特定基因导入到有限数目的靶细胞中，则这种性质可能是有利的。

有多种方法可以用来将本发明的表达载体导入到干细胞中。此类方法概括地描述在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1989，1992)中，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Md.(1989)，Chang等人，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，Mich.(1995)，Vega等人，Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor Mich.(1995)，Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，Butterworths，Boston Mass.(1988)和Gilboa et at.[Biotechniques 4(6)：504-512，1986]中，并包括如用重组病毒载体进行的稳定或短暂转染、脂质转染、电穿孔和感染。另外，对于正-负选择方法参见美国专利Nos.5,464,764和5,487,992。

通过病毒感染导入核酸具有优于其他方法如脂质转染和电穿孔的数个优点，因为病毒的感染本性可获得更高的转染效率。

目前优选的核酸体内转移技术包括用病毒型或非病毒型构建体，如腺病毒、慢病毒、单纯疱疹I型病毒，或腺相关病毒(AAV)和脂-基系统转染。对于脂质-介导的基因转移有用的脂质为，如，DOTMA、DOPE，和DC-Chol[Tonkinson等人，Cancer Investigation，14(1)：54-65(1996)]。用于基因治疗最优选的构建体为病毒，最优选腺病毒、AAV、慢病毒，或逆转录病毒。病毒构建体如逆转录病毒构建体包括转录启动子/增强子或一个基因座限定元件(locus-defining element)(或多个基因座限定元件)，或其他通过其他方式如选择性剪接、核RNA输出，或信使翻译后修饰控制基因表达的元件。此类载体构建体还包括包装信号、长末端重复序列(LTRs)或其部分，和适合于所用病毒的正和负链引物结合位点，除非它已存在于病毒构建体中。另外此类构建体典型地包括将肽从其所处宿主细胞中分泌出来的信号序列。用于这个目的的信号序列优选为哺乳动物信号序列或本发明的多肽变体信号序列。可选地，该构建体还可以包括指导多聚腺苷化的信号，以及一个或者多个限制位点和翻译中止序列。例如，此类构建体将典型地包括5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二条DNA链的合成起点，和3′LTR或其部分。其他可利用的载体可以是非病毒的，如阳离子脂质、聚赖氨酸，和树枝状大分子。

除了包含转录和翻译所插入的编码序列所必须的元件以外，本发明的表达构建体还可包括设计用于增强被表达肽的稳定性、产量、纯化或产率的序列。例如，可以设计包含本发明一些实施方式的IGFBP7蛋白和异源蛋白的融合蛋白或可切割的融合蛋白表达。可设计此类融合蛋白以便该融合蛋白容易通过亲和色谱分离，如通过将该融合蛋白固定在对异源蛋白具有特异性的柱上进行。在将切割位点设计在IGFBP7蛋白和异源蛋白之间的情况下，可通过用可分裂切割位点的适合的酶或药剂处理将IGFBP7蛋白从色谱柱上释放出来[例如，参见Booth等人，(1988)Immunol.Lett.19：65-70；和Gardella等人，(1990)J.Biol.Chem.265：15854-15859]。

如上文所提到的，多种原核或真核细胞可用作表达本发明IGFBP7多肽的宿主表达系统。这些包括，但不限于，微生物，如用包含编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌，用包含编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母，用包含编码序列的重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV、烟草花叶病毒，TMV)感染或用包含编码序列的重组质粒表达载体如Ti质粒转化的植物细胞系统。哺乳动物表达系统也可用于表达本发明的多肽。

细菌构建体的实例包括pET系列大肠杆菌表达载体[Studier等人.(1990)Methods in Enzymol.185：60-89]。

在酵母中，可以使用许多包含组成型或可诱导型启动子的载体，如美国专利申请第5,932,447号所公开的。替换地，可以使用促进外源DNA序列整合入酵母染色体中的载体。

在使用植物表达载体的情况下，编码序列的表达可通过许多启动子驱动。例如，可以使用病毒启动子如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson等人.(1984)Nature 310：511-514]，或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu等人.(1987)EMBO J.6：307-311]。替换地，可以使用植物启动子如RUBISCO的小亚基[Coruzzi等人.(1984)EMBO J.3：1671-1680和Brogli等人.，(1984)Science 224：838-843]或热激启动子，如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley等人.(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565]。可利用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、微注射、电穿孔和其他本领域普通技术人员熟知的技术将这些构建体导入到植物细胞中。参见如Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp 421-463。

本发明也可以使用本领域已熟知并在下文进一步说明的其他表达系统如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统。

在培养适当时间后进行重组多肽的回收。术语“回收重组多肽”是指收集包含多肽的全部发酵培养基，而并不意味着需要额外的分离或纯化步骤。尽管如此，本发明的多肽可利用多种标准蛋白纯化技术进行纯化，如，但不限于，亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、电泳、疏水作用色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、伴刀豆球蛋白A色谱法(concanavalin Achromatography)、色谱聚焦和差别溶解。

根据本发明的一些实施方式，下调增生和促进分化是为了治疗特征为角质化细胞过度增生(过度增生的角质化细胞)的病状，如银屑病中出现的表皮过度增生。

因此，根据本发明一些实施方式的方面，提供了治疗特征为角质化细胞过度增生的病状的方法，包含向主体给予治疗有效量的IGFBP7多肽或编码IGFBP7多肽的核酸序列，从而治疗特征为角质化细胞过度增生的病状。

术语“治疗”是指抑制、防止或阻止病状(疾病、紊乱、病况)发展和/或使病状减轻、缓和或消退。本领域的技术人员应理解，多种方法和测试可用于评估病状的发展，同样，多种方法和测试可用于评估病状的减轻、缓或消退。

如在此使用的，术语“主体”包括哺乳动物，优选患有该病状的任意年龄的人。

如在此使用的术语“过度增生的角质化细胞”是指增生到增大组织(如皮肤)中角质化细胞密度的程度的角质化细胞，和/或在组织中的增生速率与未受影响的(如健康)组织如健康主体的组织中的角质化细胞相比较大的角质化细胞。

如在此使用的术语“角质化细胞”是指产生角蛋白并形成表皮主要成分(约占表皮细胞群体的95％)的细胞。

含有角质化细胞的组织的非限制性实例包括皮肤、头皮、上消化道和呼吸道以及下泌尿生殖道和胃肠道的粘膜内衬。

根据本发明的一些实施方式，术语“角质化细胞过度增生”是指“表皮的过度增生”，除肿瘤形成以外的表皮细胞的异常增长(过度的角质化细胞增生)。

表皮过度增生导致表皮膨胀，并伴随着表皮脱落，是银屑病的主要表现。表皮过度增生经常在生理条件下发生(如伤口愈合期间)，在许多个体中是由用全反式维甲酸(RA)或它的前体，全反式视黄醇(all-transretinol)进行的局部治疗引起的。

如在此所使用的术语“特征为角质化细胞过度增生的病状”是指特征为角质化细胞过度增生或由角质化细胞过度增生引起的任何疾病、紊乱、或病况。

特征为角质化细胞过度增生的病状的非限制性实例包括银屑病、扁平苔癣、毛发红糠疹(PRP)、丘疹鳞屑性疾病、皮炎、和慢性单纯性苔癣。

根据本发明的一些实施方式，特征为角质化细胞过度增生的病状是银屑病。

如在此使用的术语“银屑病”是指成人和儿童的银屑病。

如在此使用的术语“扁平苔癣”是指影响皮肤和口腔黏膜的慢性皮肤黏膜疾病，它自身以丘疹、病变、或皮疹的形式出现。根据本发明的一些实施方式，术语“扁平苔癣”包括环状扁平苔癣、线型扁平苔癣、肥厚性扁平苔癣、萎缩性扁平苔癣、大疱性扁平苔癣、溃疡性扁平苔癣、毛囊性扁平苔癣、光化性扁平苔癣、色素性扁平苔癣、扁平苔癣涉及的部位、掌和足(掌跖扁平苔癣)扁平苔癣、黏膜扁平苔癣、甲扁平苔癣、头皮扁平苔癣、反向性扁平苔癣、药物诱导的扁平苔癣、红斑狼疮-扁平苔癣重叠综合征、类天疱疮样扁平苔藓、慢性苔藓样角化病、移植物抗宿主病苔癣样反应、苔藓样角化病，和/或苔癣样皮炎。

如在此使用的术语“毛发红糠疹(PRP)”是指一组特征为红橙色(reddish orange)鳞状斑块(scaling plaques)和角化性滤泡性丘疹的慢性紊乱。

如在此使用的术语“丘疹鳞屑性”疾病或紊乱是指丘疹和鳞屑，或者鳞状丘疹和斑块都出现的病况。

如在此使用的术语“皮炎”包括不同类型的皮肤炎症，如皮疹，它们通常对特定药剂或过敏原具有过敏性或刺激性反应。该术语也可用于表示湿疹，也称为皮炎湿疹或湿疹性皮炎。根据本发明的一些实施方式，术语皮炎是指特应性皮炎和接触性皮炎。

如在此使用的术语“慢性单纯性苔癣”是指特征为慢性搔痒和搔抓的皮肤紊乱，通常导致皮肤变厚、粗糙、和呈现褐色。

如在此使用的术语“给予”是指向主体给予活性剂的任何方式，包括全身给予(如静脉、口服)和/或局部给予(如，向皮肤，如局部给予)。

在此的术语“活性成分”是指可引起生物学效应(如诱导角质化细胞的凋亡和/或抑制其增生)的IGFBP7多肽或其功能性部分，和/或编码IGFBP7或编码其功能性部分的多核苷酸。

该活性剂可单独或作为还包括生理可接受载体的药物组合物的一部分给予。药物组合物的目的是为了使活性成分容易给予机体。

如在此使用的“药物组合物”是指含有这里所述的一种或多种活性成分与其他化学组分如生理上适合的载体和赋形剂的制剂。

下文中，可互换使用的术语“生理可接受载体”和“药学可接受载体”是指不会给机体造成显著刺激而且不会消除所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐剂包含在这些术语中。

在此的术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中从而进一步使活性成分容易给予的惰性物质。赋形剂的实例包括，但不局限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、和聚乙二醇。

药物的调配和给予技术可在作为参考引入在此的“Remington’sPharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co.，Easton，PA，latest edition中找到。

合适的给予途径可包含，例如局部给予[如，使用凝胶、液体喷雾剂和贴剂(其含有活性剂，可给予在皮肤外表面上)]、皮下给予、皮内给予(如通过皮内注射)、病灶内给予(如利用贴剂、凝胶、针)、全身给予如通过口服、直肠、经粘膜，尤其是经鼻，肠道或肠道外递送，包括肌内和髓内注射及鞘内、直接心室内、心脏内给予，如给予到右或左心室腔中，和给予到常见冠状动脉中，以及静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

本发明的药物组合物可通过本领域熟知的工艺制造，如通过常规的混合、溶解、造粒、包糖衣、研粉、乳化、作成胶囊、包埋(entrapping)或冷冻干燥过程。

因此可用常规方法利用一种或多种使活性成分容易加工成可以药用的制剂，包含赋形剂和辅剂的生理可接受载体，制造根据本发明使用的药物组合物。合适的剂型取决于所选的给予途径。

根据特定的实施方式，药物通过局部给予。

根据本发明的一些实施方式，将活性成分给予到主体的皮肤中的方式为非侵袭性的，如，利用给予于主体皮肤上的洗剂、软膏、乳膏、凝胶、液体喷雾剂或含有活性成分的贴剂。

本发明组合物利用的载体可以是多种形式。这些形式包括乳液型载体，包括，但不限于，水包油型、油包水型、水包油包水型，和硅树脂包水包油型乳液、乳膏、软膏、水溶液、洗剂，或气雾剂。本领域技术人员应理解，所给的组分主要分布于水相或油/硅树脂相中，取决于该组分在该组合物中的水溶性和分散性。

根据本发明的乳液通常含有药物有效量的在此公开的药剂和脂质或油。脂质和油可来自于动物、植物或石油，可以是天然或者合成的(即人造的)。优选的乳液还含有湿润剂，例如甘油。乳液优选进一步含有基于载体重量计约1％到约10％，更优选约2％到约5％的乳化剂。合适的乳化剂可为非离子、阴离子、或阳离子型乳化剂。合适的乳化剂描述在这些文献中，如1973年8月28日授予Dickert等人的美国专利No.3,755,560，1983年12月20日授予Dixon等人的美国专利No.4,421,769，和McCutcheon‘s Detergents and Emulsifiers，North American Edition，317-324页(1986)。

该乳液还可含有消泡剂(anti-foaming agent)从而使给予到角质组织上后所起的泡沫最小化。消泡剂包含高分子量的硅树脂和其他本领域熟知用于此种用途的材料。

合适的乳液可具有较宽范围的粘度，这取决于期望的产品形式。示例的低粘度乳液是优选的，它具有约50厘沱(centistoke)或更小的粘度，更优选约10厘沱或更小的粘度，最优选约5厘沱或更小的粘度。该乳液还可含有消泡剂从而使给予到角质组织上后所起的泡沫最小化。消泡剂包含高分子量硅树脂和其他本领域熟知用于此种用途的材料。

一种类型的乳液是硅树脂包水型乳液。硅树脂包水型乳液包含连续的硅树脂相和分散的水相。本发明优选的硅树脂包水型乳液含有以重量计约1％至约60％，优选约5％至约40％，更优选约10％至约20％的连续硅树脂相。连续硅树脂相作为包含或包围着下文描述的不连续水相的外相存在。

连续硅树脂相可包含聚有机硅氧烷油。优选的硅树脂包水型乳液体系经调配，用以提供用于递送本文公开的药物有效量的药剂的氧化稳定性媒介物。这些优选乳液的连续硅树脂相包含以重量计约50％到约99.9％的有机聚硅氧烷油和以重量计少于约50％的非硅树脂油。在特别优选的实施方式中，连续硅树脂相包含以连续硅树脂相重量计至少约50％，优选从约60％到约99.9％，更优选从约70％到约99.9％，甚至更优选从约80％到约99.9％的聚有机硅氧烷油，和以连续硅树脂相重量计多达约50％，优选少于约40％，更优选少于约30％，甚至更优选少于约10％，最优选少于约2％的非硅树脂油。这些有用的乳液体系与相当的含有较低浓度的聚有机硅氧烷油的油包水型乳液相比，可以在延长的时间段内提供更强的氧化稳定性。将非硅树脂油在连续硅树脂相中的浓度减到最小或将它完全除去，以便可能进一步增强该组合物中本发明活性化合物的氧化稳定性。这种类型的硅树脂包水型乳液描述在1997年12月25日授予Mason等人的美国专利No.5,691,380中。

用于该组合物中的有机聚硅氧烷油可为挥发型、非挥发型硅树脂，或挥发型与非挥发型硅树脂的混合物。如上下文中使用的术语“非挥发型”是指那些在环境条件下是液体并具有或大于100摄氏度的闪点(在1个大气压下)的硅树脂。如上下文中使用的术语“挥发型”表示所有其他硅树脂油。合适的有机聚硅氧烷可选自于覆盖较宽范围的挥发性和粘度的各种硅树脂。合适的有机聚硅氧烷油的实例包括本领域技术人员熟知的并在商业上可购买的聚烷基硅氧烷、环状聚烷基硅氧烷和聚烷基芳基硅氧烷。

连续硅树脂相可包含一种或多种非硅树脂油。优选将非硅树脂油在连续硅树脂相中的浓度减到最小或将它完全除去以便进一步增强该组合物中药物有效药剂的氧化稳定性。合适的非硅树脂油在约1个大气压下的熔点为约25℃或更低。适合用在连续硅树脂相中的非硅树脂油的实例有，局部用个人护理产品化工领域熟知的那些油包水型乳液形式的非硅树脂油，如，矿物油、植物油、合成油、半合成油等。

本发明有用的局部用组合物包含从约30％至约90％，更优选从约50％至约85％，最优选从约70％至约80％的分散水相。术语“分散相”是本领域技术人员熟知的，它暗示该相以悬浮于连续相中或被连续相包围的小颗粒或液滴形式存在。分散相也被称为内相或不连续相。分散水相是悬浮于上述连续相中或被上述连续相包围的小水性颗粒或液滴分散体。水相可以是水，或者水与一种或多种水溶性或水分散性成分的组合。此类可选成分的非限制性实例包括增稠剂、酸、碱、盐、螯合剂、树胶(gum)、水溶性或水分散性醇和多元醇、缓冲剂、防腐剂、防晒剂、着色剂等。

本发明局部用组合物的分散水相中典型地包含以组合物重量计从约25％至约90％，优选从约40％至约80％，更优选从约60％至约80％的水。

本发明的硅树脂包水型乳液优选含有乳化剂。在优选的实施方式中，该组合物含有以组合物重量计从约0.1％至约10％的乳化剂，更优选从约0.5％至约7.5％，最优选从约1％至约5％的乳化剂。乳化剂有助于水相分散和悬浮在连续硅树脂相中。

多种乳化剂可以用在此处形成优选的硅树脂包水型乳液。已知或常规的乳化剂可用于组合物中，前提时所选的乳化剂要与该组合物的主要组分在化学上和物理上相容并可以提供期望的分散特性。合适的乳化剂包含，也作为硅树脂表面活性剂为本领域技术人员所知的硅树脂乳化剂，如有机改性的有机聚硅氧烷、本领域技术人员所知的用在局部用个人护理产品中的不含硅的乳化剂，及其混合物。

有用的乳化剂包括多种硅树脂乳化剂。这些硅树脂乳化剂典型地为有机改性的有机聚硅氧烷，也作为硅树脂表面活性剂为本领域的普通技术人员所知。合适的乳化剂描述在这些文献中，如McCutcheon′s，Detergents andEmulsifiers，North American Edition(1986)，由Allured出版公司出版；1991年4月30日授予Ciotti等人的美国专利No.5,011,681；1983年12月20日授予Dixon等人的美国专利No.4,421,769；和1973年8月28日授予Dickert等人的美国专利No.3,755,560。

其他优选的局部用载体包括具有连续水相和分散于其中的疏水性水不溶相(“油相”)的水包油型乳液。包含水包油型乳液的合适载体的实例描述在1991年12月17日授予Turner，D.J.等人的美国专利No.5,073,371，和1991年12月17日授予Turner，D.J.等人的美国专利5,073,372中。尤其优选含有结构剂(structuring agent)、亲水性表面活性剂和水的水包油型乳液，这将在下文中详细说明。

优选的水包油型乳液含有用于辅助形成液晶凝胶网状结构的结构剂。不受理论限制，据认为结构剂有助于为组合物提供可增强组合物稳定性的流变特性。结构剂也可用作乳化剂或表面活性剂。本发明优选的组合物含有以组合物重量计从约0.5％至约20％，更优选从约1％至约10％，最优选从约1％至约5％的结构剂。本发明优选的结构剂选自于由硬脂酸、棕榈酸、十八醇、十六醇、二十二醇、硬脂酸、棕榈酸、具有平均约1至约21个环氧乙烷单元(ethylene oxide unit)的十八醇的聚乙二醇醚、具有平均约1至约5个环氧乙烷单元的十六醇的聚乙二醇醚，及其混合物组成的组。

多种阴离子表面活性剂在此是有用的。参见例如1975年12月30日授予Laughlin等人的美国专利3,929,678。另外，两性或两性离子表面活性剂在此也是有用的。

优选的水包油型乳液包含从约0.05％至约10％，优选从约1％至约6％，更优选从约1％至约3％的至少一种可将疏水材料分散在水相中的亲水表面活性剂(百分比以局部用载体的重量计)。该表面活性剂最少必须具有足以分散在水中的亲水性。合适的表面活性剂包括多种已知的阳离子型、阴离子型、两性离子型和两性表面活性剂中的任一种。参见McCutcheon′s.Detergents and Emulsifiers，North American Edition(1986)，由Allured出版公司出版；1991年4月30日授予Ciotti等人的美国专利No.5,011,681；1983年12月20日授予Dixon等人的美国专利No.4,421,769；和美国专利3,755,560。所选的具体表面活性剂取决于组合物的pH值和存在的其他组分。优选是阳离子型表面活性剂，尤其是二烷基季胺化合物，其实例描述在以下文献中：1992年9月29日授予McCall等人的美国专利No.5,151,209，1992年9月29日授予Steuri等人的美国专利No.5,151,210，美国专利No.5,120,532，美国专利No.4,387,090，美国专利No.3,155,591，美国专利No.3,929,678，美国专利No.3,959,461，McCutcheon′s，Detergents & Emulsifiers(North American edition 1979)M.C.Publishing公司，和Schwartz，等人，Surface Active Agents，Their chemistryand Technology，New York：Interscience Publishers，1949。

替换地，其他有用的阳离子型乳化剂包括氨基-酰胺。这些阳离子型乳化剂的非限制性实例包括硬脂酰胺丙基PG-二甲基氯化铵磷酸酯、山嵛酰胺丙基PG-二甲基氯化铵、硬脂酰胺丙基乙基二甲铵乙基硫酸盐、硬酯酰胺丙基二甲基-(肉豆蔻醇乙酸酯)氯化铵、硬酯酰胺丙基二甲基鲸蜡硬脂基苯甲磺酸铵(stearamidopropyl dimethyl cetearyl ammonium tosylate)、硬酯酰胺丙基二甲基氯化铵、硬酯酰胺丙基二甲基乳酸铵，及其混合物。

优选的水包油型乳液包含以局部用载体重量计从约25％至约98％，优选从约65％至约95％，更优选从约70％至约90％的水。

本发明的药物或化妆品组合物可调配成可被制药或化妆品工业利用的用于皮肤给予的多种形式中的任一种，包括溶液、洗剂、喷雾剂、乳膏、软膏、油膏、凝胶等，如下所述。

优选将本发明的药物或化妆品组合物调配成具有足够的粘性以便保留在所处理的皮肤区域上，并且不易蒸发，和/或不容易通过用水冲洗去除，但可借助于肥皂、清洁剂，和/或香波来去除。

制备具有这些性质的组合物的方法是本领域普通技术人员熟知的，并在Remington′s Pharmaceutical Sciences，1990(supra)；和PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，第六版，Williams & Wilkins(1995)中有详细的说明。

包括但不限于洗剂和乳膏的本发明局部用组合物可包含皮肤病学上可接受的润肤剂。此类组合物优选包含约2％至约50％的润肤剂。如在此使用的，术语“润肤剂”表示有利于预防或缓解干燥，还有利于保护皮肤的材料。多种合适的润肤剂是已知的并可以用在本文。参见例如Sagarin，Cosmetics，Science and Technology，第2版，Vol.1，pp.3243(1972)，其含有很多适合作润肤剂的材料的实例。优选的润肤剂是甘油。甘油用量优选为从或约0.001至或约20％，更优选从或约0.01至或约10％，最优选从或约0.1至或约5％，如3％。

根据本发明洗剂和乳膏一般含有溶液载体体系和一种或多种润肤剂。洗剂典型地包含从约1％至约20％，优选从约5％至约10％的润肤剂，从约50％至约90％，优选从约60％至约80％的水，和药物有效量的本文描述的药剂。乳膏典型地包含从约5％至约50％，优选从约10％至约20％的润肤剂，从约45％至约85％，优选从约50％至约75％的水，和药物有效量的此处描述的药剂。

本发明局部给予的药物或化妆品组合物还可包括为了使化妆品组合物富有香气和皮肤营养因子而加入的另外的组分。

选择此类适用于人角质组织，不会诱导毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应以及合理医学判断范围内的其他反应的组分。另外，此类可选组分是有用的，前提是它们不会不能接受地改变本发明活性化合物的益处。

CTFA Cosmetic Ingredient Handbook，第二版(1992)描述了多种通常用于护肤品行业的非限制性化妆品成分，它们适合用在本发明组合物中。这些成分类别的实例包括：磨料、吸收剂、美学组分如香气剂、颜料、色素/着色剂、精油、皮肤感觉剂(skin sensates)、收敛剂等(如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁香酚、乳酸薄荷酯、金缕梅馏分)、抗痤疮药、抗结块剂、消泡剂、抗微生物剂(如丁基氨基甲酸碘代丙酯)、抗氧化剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、膨胀剂、螯合剂、化学添加剂、着色剂、化妆品收敛剂、化妆品杀菌剂、变性剂、药用收敛剂、局部用镇痛药、成膜剂或材料，如，有助于组合物成膜特性和直接性(substantivity)的聚合物(如二十碳烯与乙烯基吡咯烷酮的共聚物)、不透明剂、pH调节剂、推进剂、还原剂、螯合剂、皮肤调理剂(如湿润剂，包括混合的(miscellaneous)和闭合的(occlusive))、皮肤舒缓剂和/或愈合剂(如泛醇和衍生物(如乙基泛醇)、真芦荟(aloe vera)、泛酸和它的衍生物、尿囊素、没药醇(bisabolol)，和甘草酸二钾)、皮肤治疗剂、增稠剂，和维生素及其衍生物。

本发明的药物或化妆品组合物可直接施用于皮肤。替换地，它可通过本领域已知的各种透皮给药系统经由正常皮肤给予而递送，如将组合物以随时间释放的方式释放到皮肤中的透皮贴剂。本领域已知的其他给药系统包括加压气雾剂瓶、离子电渗疗法或超声促渗法。离子电渗疗法用于提高皮肤的渗透性并使透皮递送容易进行。美国专利No.5,667,487和5,658,247公开了一种适合于超声-离子透入介导的治疗剂穿过皮肤输送的离子超声装置。替换地，或另外，脂质体或微胶粒也可用作递送载体。

有两种主要类型的皮肤贴剂可用于将活性剂给予到主体皮肤中。这些是储库型贴剂和基质型贴剂。储库型贴剂通常包含填充有固体药物(活性剂)的结构和稀释溶液，或在聚合物基质内并被速率控制材料的薄膜或膜包围的高度浓缩的药物溶液。基质型贴剂包含药物和形成使该药物通过扩散到外部环境中而释放的均相系统的聚合物。应注意，随着释放的持续进行，它在基质型贴剂中的释放速率通常会下降，因为活性剂具有逐渐变长的距离，因此需要更长的时间释放。对于透皮给药的进一步细节和实例见Prausnitz MR.，等人，2004.Nature Reviews，3：115-124；Scheindlin S.，2004.Transdermal drug delivery：Past，present，future.Molecular Interventions.Vol.4：308-312；Prausnitz MR and Langer R.，2008，Nature Biotechnology.26：1261-1268；Tanner T，and Marks R，2008，Delivery drugs by transdermalroute：review and comment.Skin Research and Technology，14：249-260，这里的每篇文献都通过引用完整地合并在此。

可用于将活性剂给予到皮肤中的根据本发明教导的经表皮给药贴剂的非限制性实例描述在Senti G.，等人，2009，J Allergy Clin Immunol.Sep 4.[Epub ahead of print]中，其通过引用完整地合并在此。

根据本发明的一些实施方式，利用储库型贴剂将活性剂给予到皮肤中。

可利用带有半固体储库以及塑料背衬的粘性弧面和可除去的保护覆盖层的闭合贴剂(occlusive patch)，将活性剂给予到完整皮肤中。

半固体储库可以为使用各种赋形剂如脂肪、油(如矿物油、凡士林、植物油或硅油)、聚合物、胶凝剂、悬浮剂、稳定剂、亲水溶剂、丙二醇、聚乙二醇、稳定型表面活性剂、胶体等及其组合物的任何凝胶、乳膏、软膏、乳液、悬浮液、微粒。

应注意，为了增大活性剂进入皮肤的递送量，可将活性剂与多种设计用于增大进入表皮或真皮层的递送量的媒介物一起调配。这样的媒介物包括，但是不限于脂质体、树枝状大分子、囊泡(noisome)、传递体、微乳剂，和固体脂质纳米颗粒(进一步的细节参见Cevc，G.Transfersomes，liposomes and other lipid suspensions on the skin：permeation enhancement，vesicle penetration，and transdermal drug delivery.Crit.Rev.Ther.DrugCarrier Syst.13，257-388(1996)，其通过引用完整地合并在此；Kogan A，Garti N.Microemulsions as transdermal drug delivery vehicles.Adv ColloidInterface Sci 2006；123-126：369-385，其通过引用完整地合并在此)。另外，可将该活性剂与增强活性剂进入皮肤的递送能力的化学增强剂如亚砜、氮酮(azone)、二醇、烷醇，和萜混合(进一步的细节参见Karande P，Jain A，Ergun K，Kispersky V，Mitragotri S.Design principles of chemical penetrationenhancers for transdermal drug delivery.Proc Natl Acad Sci USA2005；102：4688-4693；Williams AC，Barry BW.Penetration enhancers.AdvDrug Deliv Rev 2004；56：603-618；and Smith，EW.；Maibach，HI.，editors.Boca Raton，FL：Taylor and Francis Group；2006.Percutaneous PenetrationEnhancers，其中的每篇文献均通过引用完整地合并在此)。

该贴剂可包括调配在设计用于使药物容易渗透入表皮或真皮的乳液中的活性剂。例如，该贴剂可包含调配在甘油包油型乳液中的活性剂，该甘油包油型乳液设计用于使该活性剂容易渗透通过角质层而进入真皮。美国专利申请第20040067244号描述了适合于通过角质层进入真皮递送的甘油包油型乳液的非限制性实例，该专利申请通过引用完整地合并在此。此类甘油包油型乳液具有低于1微米的平均微滴大小，并包含连续的甘油相、至少一种包含内相的植物油、至少一种乳化稳定剂，和至少一种结构里包含至少一个疏水部分的生物活性化合物，其中该组合物使该生物活性化合物容易渗透通过角质层而进入真皮。

根据本发明的一些实施方式，将活性物质给予于皮肤上是对受破坏的皮肤执行的[如已用外源物质等进行可渗透化处理(如破裂)的皮肤或病变皮肤(含有病变的皮肤)]。

根据本发明的一些实施方式，对皮肤的破坏是临时执行的(如执行预定短的时间)，设计用于使活性成分能够更好地透入该皮肤。

皮肤破坏可通过在皮肤外层中引入微孔(如微通道)进行。此类微通道可利用如Radio-Frequency(RF)-Microchannel^TM(TransPharma Medical^TMLtd.)技术[http://www.transpharma-medical.com/technology_rf.html]形成。

另外或替换地，活性剂(如，IGFBP7多肽或编码其的多核苷酸)从贴剂到皮肤表皮层的递送能力可利用本领域已知的物理增强器增强，如超声、离子电泳、电穿孔、磁泳、显微操作针和连续混合[参见，例如RizwanM，Aqil M，Talegaonkar S，Azeem A，Sultana Y，Ali A.Enhanced transdermaldrug delivery techniques：an extensive review of patents.Recent Pat DrugDeliv Formul.2009；3(2)：105-24，其通过引用完整地合并在此]。

根据本发明的一些实施方式，该药物组合物调配用于皮内注射。

该活性剂可通过如针对Mantoux C(1908)测试描述的皮内注射而给予到主体皮肤真皮层中。简要地，可以皮内注射该活性剂(利用如，0.5ml或1.0ml结核菌素注射器，通过26规格或27规格的针进行)。可将注射器与皮肤呈45度角放置，使针尖对着皮肤斜放，全部刺入但不深于皮肤表层。轻轻注射约0.01至0.05ml的体积(如约0.02ml)以便产生表层小泡(Middleton’s Allergy principles&practice，第6版，2003)。

根据本发明的一些实施方式，该药物组合物调配成液体喷雾剂(如，包含预定浓度和剂量的活性剂的喷雾剂)。

根据本发明的一些实施方式，该药物组合物调配成凝胶(如，包含预定浓度和剂量的活性剂的凝胶)。

例如，选择活性剂的预定给予面积和可选地利用辅助设备进行划界，用于利用凝胶或喷雾剂给予(见如，http://www.truetext.com)。

因为特征为角质化细胞过度增生的病状如银屑病的病变经常会影响头皮，所以本发明的药物或化妆品组合物进一步包括适合用在头皮和头发上的润肤剂、表面活性剂和/或调理剂(conditioners)。

润肤剂包括，但是不限于，烃油和蜡，如矿物油、矿脂(petrolatum)等，植物和动物油和脂肪，如橄榄油、棕榈油、蓖麻油、玉米油、大豆油等，以及羊毛脂和它的衍生物，如羊毛脂、羊毛脂油、羊毛脂蜡、羊毛脂醇等。其他润肤剂包括具有10至20个碳原子的脂肪酸的酯类，如包括肉豆蔻酸、硬脂酸、异硬脂酸、棕榈酸的酯等，如肉豆蔻酸甲酯、肉豆蔻酸丙酯、肉豆蔻酸丁酯、硬脂酸丙酯、异硬脂酸丙酯、棕榈酸丙酯等。其他润肤剂包括具有10至20个碳原子的脂肪酸，包括硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、异硬脂酸、棕榈酸等。润肤剂还包括具有10至20个碳原子的脂肪醇，如十六烷基、肉豆蔻基、月桂基、异硬脂基、硬脂基等的脂肪醇。

虽然有些是水溶性的，但包括作为润肤剂的多元醇和聚醚衍生物，包括二醇、甘油、山梨醇、聚亚烷基二醇等，如丙二醇、双丙二醇、聚乙二醇200-500等。优选水溶性的实例。

当调配本发明用于头发上的药物或化妆品组合物时，优选利用乳化剂/表面活性剂。

表面活性剂的实例包括，但不限于，疏水烷基、烯基，或烷基芳香族官能团的聚氧烯烃氧化物(spolyoxyalkylene oxide)缩合产物，所述官能团具有可与亲水氧化烯、聚氧乙烯、氧化丙烯、氧化丁烯、聚氧乙烯或聚乙二醇缩合的游离反应性氢。尤其有效的是辛基苯酚与约7-约13摩尔的氧化乙烯的缩合产物，Rohm & Haas公司销售的商标为TRITON

的系列产品。

本发明调配用于头发上的组合物还包括其他成分，如香气剂、稳定剂、染料、抗微生物剂、抗菌剂、抗凝结剂、紫外线辐射吸收剂等。

优选还利用对酸解稳定的调理剂，如具有至少一个季铵部分和乙氧基化monoquat的硅树脂化合物，以便使本发明调配用于头发上的组合物稳定和可选地使其变稠。

还可包括可选的增稠剂以便提高组合物的美学效果并使组合物易于给予于头发上。优选以重量计约0％至约3％的量的非离子增稠剂。示例增稠剂为甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基乙基纤维素和羟乙基纤维素、二(氢化牛脂)邻苯二甲酸酰胺、交联的马来酸酐-甲基乙烯醚共聚物、瓜尔胶、黄原胶和阿拉伯树胶。

调理组合物的载体主要是水，但也可包含有机溶剂以便使该组合物容易制备或以便提供美学性质，如粘度控制。合适的溶剂包括低级醇如乙醇和异丙醇，二醇醚如2-丁氧基乙醇、乙二醇单乙醚、丙二醇和二乙二醇单乙醚或单甲基醚，及其混合物。非水溶剂在本发明调理组合物中的存在量以组合物中载体的总重量计为约1％至约50％，尤其是约5％至约25％。

可用于不透明调理剂中的非限制性调理试剂包括：硬脂基三甲基氯化铵、山嵛基三甲基氯化铵、西曲溴铵、大豆油基三甲基氯化铵、牛脂基三甲基氯化铵、二氢化牛脂基二甲基氯化铵、山嵛基三甲基铵甲基硫酸盐、Peg-2油基氯化铵、二氢化牛脂基二甲基溴化铵、二氢化牛脂基二甲基铵甲基硫酸盐、棕榈基三甲基氯化铵、氢化牛脂基三甲基氯化铵、氢化牛脂基三甲基溴化铵、二鲸蜡基二甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵、二棕榈基二甲基氯化铵、氢化牛脂基三甲基铵甲基硫酸盐、西曲铵对甲苯磺酸盐、二十烷基三甲基氯化铵，和二牛脂基二甲基氯化铵。

可用于使本发明组合物不透明化的材料包括脂肪酯、不透明聚合物，如苯乙烯聚合物，如Morton，International有限公司的OPACIFIER 653，和脂肪醇。脂肪醇的非限制实例有，鲸蜡醇、硬脂醇、C16-18烷基醇，山嵛醇，和花生醇。本发明调理组合物是不澄清的，它还可包括Lexamine S-13、二-鲸蜡基氯化铵和鲸蜡硬脂醇聚醚-20(ceteareth-20)。

香波配方有时有益于治疗头皮病变如头皮银屑病。

本发明的头发香波组合物可包含非离子表面活性剂或两性表面活性剂以便提高它的清洁性能。

非离子表面活性剂的实例包括，但是不限于，聚氧烯烃山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧烯烃山梨醇脂肪酸酯、聚氧烯烃甘油脂肪酸酯、聚氧烯烃脂肪酸酯、聚氧烯烃烷基酯、聚氧烯烃烷基苯基酯、聚氧烯烃(氢化)蓖麻油、蔗糖脂肪酸酯、聚甘油烷基醚、聚甘油脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺，和烷基葡萄糖苷。其中，优选烷基葡萄糖苷、聚氧烯烃(C₈～C₂₂)脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和脂肪酸烷醇酰胺。作为脂肪酸烷醇酰胺，优选带有具有8至18，更优选10至16个碳原子的酰基的那些。作为脂肪酸烷醇酰胺，可以使用单烷醇酰胺或二烷醇酰胺，优选带有具有2至3个碳原子的羟烷基的那些。实例包括油酸二乙醇酰胺、棕榈仁脂肪酸二乙醇酰胺、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、月桂酸二乙醇酰胺、聚氧乙烯椰子油脂肪酸单乙醇酰胺、椰子油脂肪酸单乙醇酰胺、月桂酸异丙醇酰胺，和月桂酸单乙醇酰胺。

可用于本发明香波组合物中的两性表面活性剂包括甜菜碱表面活性剂如烷基二甲氨基乙酸甜菜碱和脂肪酸酰胺丙基甜菜碱。作为脂肪酸酰胺丙基甜菜碱，优选带有具有8至18个，更优选10至16个碳原子的酰基的那些，尤其优选月桂基酰胺丙基甜菜碱、棕榈仁酰胺丙基甜菜碱和椰油酰胺丙基甜菜碱。

非离子表面活性剂和两性表面活性剂如果需要可掺入到本发明的头发香波组合物中。其中的两种或多种可结合使用。当本发明的头发香波组合物以水性液体香波形式提供时，优选使用脂肪酸酰胺丙基甜菜碱或脂肪酸烷醇酰胺，因为它不仅提高发泡力还可以使该香波具有充分的流动性。

非离子表面活性剂在头发香波组合物中的含量在从0至15wt％，更优选0.5至10wt％，还更优选从1至5wt％的范围内，而两性表面活性剂在头发香波组合物中的含量在从0至10wt％，更优选0.5至8wt％的范围内，还更优选从1至5wt％的范围内。

考虑到泡沫的质感、泡沫的润滑感、洗发时头发丝间摩擦力的减小以及干燥后头发的平滑度，本发明的头发香波组合物可进一步包含阳离子型聚合物。阳离子聚合物的实例包括阳离子型纤维素衍生物、阳离子淀粉、阳离子瓜尔胶衍生物、二烯丙基季铵盐均聚物、二烯丙基季铵盐/丙烯酰胺共聚物、季胺化聚乙烯吡咯烷酮衍生物、聚二醇-聚胺缩合产物、乙烯基咪唑三氯化物/乙烯基吡咯烷酮共聚物、羟乙基纤维素/二甲基二烯丙基氯化铵共聚物、乙烯基吡咯烷酮/季铵化甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮/烷氨基丙烯酸酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮/烷氨基丙烯酸酯/乙烯基己内酰胺共聚物、乙烯基吡咯烷酮/甲基丙烯酰氨基丙基三甲基氯化铵共聚物、烷基丙烯酰胺/丙烯酸酯/烷氨基烷基丙烯酰胺/甲基丙烯酸聚乙二醇酯共聚物、肥酸(己二酸，adipic acid)/二甲氨基羟丙基亚乙基三胺共聚物(CALTALETINE美国Sandos公司制造)，以及日本专利特许公开Sho第53-139734号和日本专利特许公开Sho第60-36407中所描述的阳离子聚合物。其中，优选阳离子纤维素衍生物和阳离子瓜尔胶衍生物。

其中的两种或多种阳离子聚合物可以结合使用。从提高洗发时泡沫的质量、头发干燥后的易处理性和提高触感的观点出发，它在本发明的头发香波组合物中的含量优选为从0.02至5wt％，更优选从0.05至1wt％，甚至更优选从0.1至0.3wt％。

本发明的头发香波组合物可进一步包含调理组分如硅树脂以便提高干燥后的光洁度。硅树脂的实例包括二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、氨基改性的硅树脂、聚醚改性的硅树脂、环氧改性的硅树脂、氟改性的硅树脂、环状硅树脂、烷基改性的硅树脂，和噁唑啉改性的硅树脂。其中，优选二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、氨基改性的硅树脂、聚醚改性的硅树脂、噁唑啉改性的硅树脂，和环状硅树脂。其中的两种或多种硅树脂可结合使用。它(它们)在本发明头发香波组合物中的含量优选在从0.01至20wt％，更优选从0.05至10wt％，还更优选从0.1至5wt％的范围内。

本发明的头发香波组合物除包括上述组分以外，根据使用目的还可包含水溶性聚合物如羟丙甲基纤维素、羟基纤维素、聚乙烯醇和聚乙二醇，多元醇如山梨醇，湿润剂，螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)，药物如维生素制剂，氨基酸和其衍生物，聚合物如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、尼龙或硅树脂的微粒及其疏水制品，源于动物或植物的提取物，紫外线吸收剂，珠光剂(pearling agent)，防腐材料，杀菌剂，pH调节剂，着色剂，和香气剂。

本发明的头发香波组合物可以根据需要，以选自于液体、粉末、凝胶和颗粒的任何形式提供。优选利用水或低级醇作为溶剂的液体组合物，尤其优选利用水的液体组合物。

如以上所提到的，该药物组合物可全身或局部给予，如通过注射给予。

对于注射，该药物组合物的活性成分可调配在水溶液中，优选生理学相容的缓冲液如汉克溶液(Hank’s solution)、林格溶液(Ringer’s solution)或生理盐缓冲液。对于经粘膜给予，将适合于透过屏障的穿透剂用在制剂中。此渗透剂在本领域一般是已知的。

对于口服给予，该药物组合物可容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药学可接受载体结合而调配。此类载体能够使该药物组合物调配成供患者口服的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、混悬剂等。口服使用的药物制剂可利用固体赋形剂制造，可选地研磨所得混合物，需要时可加入合适的辅剂并在此后对颗粒混合物进行加工，从而获得片剂或糖衣核。合适的赋形剂为，尤其是，填充剂如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制品如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠，和/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐如海藻酸钠。

糖衣核(dragee core)具有合适包衣。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可选地包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液(lacquer solution)和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入到片剂或糖衣丸包衣中，以便鉴定或表征不同的活性化合物剂量组合。

可口服使用的药物组合物，包括明胶制成的推入配合胶囊(push-fitcapsule)，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁，和可选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分溶解于或悬浮于合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇。另外，可加入稳定剂。所有用于口服给予的制剂所含剂量应适合所选的给予途径。

对于颊部(含服)给予，该组合物可采用用常规方法调配的片剂或锭剂的形式。

对于通过鼻吸入给予，根据本发明使用的活性成分可以所呈现的喷雾剂形式，从利用适合的推进剂如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，或二氧化碳的加压包装或雾化器中方便地递送。在加压喷雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀门确定从而递送计量的量。可将用在分配器中的如明胶胶囊和药筒，调配成包含该化合物与合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本文描述的药物组合物可调配用于肠胃外给予，如通过推注和连续输注给予。注射用制剂可以单位剂量的形式呈现，如，在安瓿或在多剂量容器中，其中可选地加入防腐剂。该组合物可以是油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液，或乳液，并可含有调配剂如悬浮剂、稳定剂，和/或分散剂。

肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式活性制剂的水溶液。另外，可将该活性成分的悬浮液配制成适当的油性或基于水的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可包含增大该悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇，或葡聚糖。可选地，该悬浮液还可包含合适的稳定剂或增大活性成分的溶解度从而允许制备高度浓缩的溶液的试剂。

替换地，该活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适的媒介物如无菌的基于无热源水的溶液进行重构(复溶)。

本发明的药物组合物还可利用如常规栓剂基质如可可豆油或其他甘油酯，调配成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂。

适用于本发明上下文的药物组合物包括其中活性成分的含量对达到预期目的有效的组合物成分。更具体地，治疗有效量是指对预防、缓和，或改善特征为角质化细胞过度增生的病状(如，银屑病)的症状或延长受治疗主体的存活时间有效的活性成分(上述药剂)量。

治疗有效量的确定完全在本领域普通技术人员的能力范围内，尤其是在阅读根据本文详细公开的内容之后。

对于用于本发明方法中的任何制剂，治疗有效量或剂量最初可根据体外和细胞培养物分析进行估计。例如，可以在动物模型中调配剂量，以获得期望的浓度或滴定度。此类信息可用于更准确地确定对于人有用的剂量。

本文描述的活性成分的毒性和治疗效能可通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定。可利用从这些体外和细胞培养物分析及动物研究中获得的数据，调配用于人的剂量范围。该剂量可随着采用的剂型和利用的给予途径而改变。个人医生可根据患者的病况，选择确切的制剂、给予途径和剂量(参见如Fingl等人，1975，″The Pharmacological Basisof Therapeutics″，Ch.1 p.1)。

剂量和时间间隔可单独地调整从而提供给组织(皮肤组织)足以诱导或抑制生物效果的水平(最低有效浓度，MEC)的活性成分。对于每种制剂，MEC有所不同，但可根据体外数据评价。达到MEC所需的剂量取决于个体特征和给予途径。可利用检测试验测定血浆浓度。

根据受治疗病况的严重性和反应，可进行单剂量或多剂量给予，持续几天至几周的治疗疗程，或直到实现治愈或病情减轻。

当然，该组合物的给予量将取决于受治疗对象、病情严重性、给予方式，处方医生的判断等。

本发明的组合物如果需要可放置在包装或分配装置中，如FDA批准的试剂盒，其可包含含有活性成分的一种或多种单位剂量形式。该包装可包含，例如，金属或塑料箔，如泡罩包装。该包装或分配装置还可附有给予说明。该包装或分配器还可提供与所含物相关的由管理药物制造、使用或销售的政府部门所规定的形式的公告，该公告反映该部门批准了该组合物或人用或兽用的形式。此公告，例如，可以是美国食品和药品管理局对于处方药批准的标志或者是已批准产品说明书。如上面进一步详细说明的，还可以制备包含本发明制备品、调配在相容性药物载体中的组合物，将其放置在合适的容器中，并标记用于治疗指示病况。

应理解，本文描述的治疗方案可利用常规抗银屑病药物强化。

因此，根据本发明的一些实施方式，该方法进一步包含将能够至少部分减轻该病状症状的药剂给予给主体，其中该药剂适合于局部或全身(如，口服或注射)给予和/或适合于与光疗法一起治疗主体。

应注意，给予能够至少部分减轻该病状症状的药剂可在用IGFBP7多肽或多核苷酸治疗之前进行，与用IGFBP7多肽或多核苷酸治疗同时进行或在用IGFBP7多肽或多核苷酸治疗之后进行。

能够至少部分减轻该病状症状的药剂可构成与如以上所描述的IGFBP7多肽或编码IGFBP7多肽的多核苷酸联合使用的药物组合物的一部分(如活性成分的一部分)。

适合于局部用治疗的药物(局部给予的药物)可为皮质类固醇、维生素D类似物或衍生物、地蒽酚、局部用维甲酸类、钙神经素抑制剂、水杨酸、煤焦油，和乳膏、软膏(油膏，unguent)、凝胶或乳液形式的湿润剂。

根据本发明的一些实施方式，该光疗可为日光光疗、B型紫外线(UVB)光疗、窄带UVB光疗、光化疗如PUVA[由补骨脂素(P)组成的联合治疗，然后将皮肤暴露于UVA(长波紫外射线辐射)下]，和准分子激光光疗。

适合于全身给予(药物全身给予)的药剂可为维甲酸类、免疫抑制药(如甲氨蝶呤、环孢霉素)、免疫靶向生物制剂(如阿来法塞、英夫利昔单抗、依那西普、优特克单抗)、免疫毒素(如地尼白介素)，和TNF-α阻断生物制剂(如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗等)。

根据本发明的一些实施方式，调节角质化细胞增生和分化包含通过下调IGFBP7的表达水平和/或活性而使该增生上调。

根据本发明的实施方式，上调该增生一般是为了治疗创伤、烧伤、溃疡和皮肤再生。

IGFBP7的下调可利用多种干扰转录和/或翻译的分子(如RNA沉默剂、核酶、脱氧核酶和反义物)在基因组和/或转录水平上进行，或可利用如拮抗剂、切割多肽的酶、中和IGFBP7活性的抗体(ab51392Abcam)等在蛋白水平上进行。

下面列出了能够下调IGFBP7的表达水平和/或活性的药剂。

能够下调IGFBP7药剂的一个实例为能够特异性结合IGFBP7的抗体或抗体片段。优选地，该抗体能够特异性结合IGFBP7的至少一个表位。如在此使用的，术语“表位”表示抗体互补位结合的抗原上的任意抗原决定簇。

表位(epitopic)决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，如氨基酸或碳水化合物侧链，并通常具有特定三维结构特征，以及特定电荷特征。

本发明中使用的术语“抗体”包括完整分子以及其功能片段，如能够结合巨噬细胞的Fab，F(ab′)2，和Fv。这些功能性抗体片段定义如下：(1)Fab，该片段含有抗体分子的单价抗原结合片段，可通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体从而产生完整的轻链和一条重链的一部分而制得；(2)Fab′，该抗体分子片段可通过用胃蛋白酶处理完整抗体，接着进行还原从而产生完整的轻链和一条重链的一部分而获得；每个抗体分子均获得两个Fab′片段；(3)F(ab′)2，该抗体片段可通过用胃蛋白酶处理完整抗体，随后不进行还原而获得；F(ab′)2为两个Fab′片段通过两个二硫键结合在一起的二聚体；(4)Fv，定义为表达为两条链的含有轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；和(5)单链抗体(“SCA”)，含有由合适多肽接头连接成基因融合单链分子的轻链可变区和重链可变区的基因工程分子。

制造多克隆或单克隆抗体以及其片段的方法是本领域熟知的(参见，例如，Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，New York，1988，其通过引用合并在此)。

根据本发明的抗体片段可通过抗体的蛋白水解，或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白表达系统)中表达编码该片段的DNA来制备。可以通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶经常规方法消化完整抗体获得抗体片段。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶酶切抗体从而提供表示F(ab′)2的5S片段而制得。这个片段可利用硫醇还原剂和可选地利用由二硫连键的断裂所形成的巯基的封闭基团进行进一步的切割，从而产生3.5S Fab′单价片段。替换地，利用胃蛋白酶酶切直接产生两个单价Fab′片段和Fc片段。这些方法描述在例如Goldenberg的美国专利4,036,945和4,331,647以及其中包含的引用文献中，该专利通过引用完整地合并在此。还可参见Porter，R.R.[Biochem.J.73：119-126(1959)]。也可利用切割抗体的其他方法，如将重链分离从而形成单价轻-重链片段，并进一步对片段进行切割的方法，或其他酶、化学或基因技术，只要该片段结合到可被完整抗体识别的抗原上即可。

Fv片段包含VH和VL链的结合体。这种结合可以是非共价的，如Inbar等人所描述的[Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 69：2659-62(19720]。替换地，该可变链可通过分子间二硫键连接或通过化学物如戊二醛交联。优选地，该Fv片段含有通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)是通过构建包含通过寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因而制备的。将结构基因插入到表达载体中，随后将其引入到宿主细胞如大肠杆菌中。该重组宿主细胞合成以接头肽桥接该两个V结构域的单一多肽链。制造sFv的方法描述在如[Whitlow and Filpula，Methods 2：97-105(1991)；Bird等人，Science 242：423-426(1988)；Pack等人，Bio/Technology 11：1271-77(1993)；和美国专利No.4,946,778中，该文献通过引用完整地合并在此。

另一形式的抗体片段是为单一互补决定区(CDR)编码的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可通过构建编码目的抗体的CDR的基因获得。此类基因通过如利用聚合酶链反应从产生抗体的细胞的RNA合成该可变区。参见，如Larrick和Fry[Methods，2：106-10(1991)]。

非人(如鼠)抗体的人源化形式为免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab)2或其他的抗体抗原结合序列)的嵌合分子，其包含极小的源于非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或家兔的CDR、具有期望特异性、亲和性和接受力的残基所替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替代。人源化抗体还可包含既不能在受体抗体中找到，也不能在所输入的CDR或框架序列中找到的残基。一般，该人源化抗体包含基本所有的至少一个，典型地为两个可变结构域，其中对应于非人免疫球蛋白CDR区的所有或基本所有的CDR区，以及所有或基本所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的。该人源化抗体还可选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分[Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)]。

用于人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。一般，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为输入残基，其典型地取自输入可变结构域。基本可按Winter和同事[Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)]描述的方法，通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人抗体的相应序列进行人源化。因此，这种人源化抗体为嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中不足一个完整的人可变结构域基本上已被来自于非人物种的相应序列所替代。实际上，人源化抗体典型地为这样的人抗体，其中的一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自于啮齿动物抗体相似位点的残基所替代。

人抗体还可利用多种本领域已知的技术生产，包括噬菌体展示文库(phage display libraries)[Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体[(Cole等人，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)和Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)]。类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物中来制造，如内源免疫球蛋白基因被部分或全部灭活的小鼠。激发后，观察到产生的人抗体在各个方面都非常类似于在人中看到的抗体，包括基因重排、组装，和抗体组库。该方法描述在如美国专利No.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016，和下列科学出版物中：Marks等人，Bio/Technology 10，：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368 812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology 14：826(1996)；和Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13，65-93(1995)。

IGFBP7的下调还可通过RNA沉默实现。如在此使用的，术语“RNA沉默”指的是通过RNA分子介导的，致使相应编码蛋白的基因的表达受到抑制或“沉默”的一组调节机制[如RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压制(quelling)、共抑制、和翻译阻遏]。RNA沉默已在多种类型的包括植物、动物，和真菌的生物体中观察到。

如在此使用的，术语“RNA沉默剂”是指能够抑制靶基因表达或使其“沉默”的RNA。在某些实施方式中，该RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制完全阻止mRNA分子的加工。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包含成对链的双螺旋RNA，以及可产生小非编码RNA的前体RNA。示例的RNA沉默剂包括dsRNA如siRNA、miRNA、和shRNA。在一个实施方式中，该RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方式中，RNA沉默剂能够介导翻译阻遏。

RNA干扰是指小干扰RNA(siRNA)在动物中介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。植物中的相应过程通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，在真菌中称为压制。转录后基因沉默过程被认为是用于阻止外源基因表达的进化保守的细胞防御机制，并为各种动物和植物(flora and phyla)所共有。对外源基因表达的这种抵御可能会演变，响应于由病毒感染或由转座子元件经由特异性地破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA的细胞应答而随机整合入宿主基因组中所产生的双链RNA(dsRNA)。

细胞中存在的长dsRNA刺激称为Dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer参与将dsRNA加工成称为小干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片段的过程。由Dicer活性产生的小干扰RNA典型地为约21至约23个核苷酸长度，并含有约19个碱基对的双链。RNAi反应还以核酸内切酶复合体为特征，核酸内切酶复合体通常称为RNA诱导沉默复合体(RISC)，可介导具有与双链siRNA的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与双链siRNA的反义链互补的区域中部。

因此，本发明考虑利用dsRNA下调来自mRNA的蛋白表达。

根据一个实施方式，dsRNA大于30bp。由于认为这些较长的双链RNA区域会引起干扰素和PKR应答的诱导，所以长dsRNA(即，大于30bp的dsRNA)的利用是非常受限制的。然而，长dsRNA的使用可提供许多优点，包括细胞可选择最佳沉默序列，由此减少测试大量siRNA的需要；长dsRNA将可以使沉默文库具有比siRNA可能需要的小的复杂性；以及，可能是最重要的，当用作治疗剂时，长dsRNA可以防止病毒逃逸突变。

多种研究证明长dsRNA可用来使基因表达沉默而不会诱导应激反应或引起严重的脱靶效应(off-target effect)-参见例如[Strat等人，NucleicAcids Research，2006，Vol.34，No.133803-3810；Bhargava A等人BrainRes.Protoc.2004；13：115-125；Diallo M.，等人，Oligonucleotides.2003；13：381-392；Paddison P.J.，等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA.2002；99：1443-1448；Tran N.，等人，FEBS Lett.2004；573：127-134]。

尤其，本发明还考虑将长dsRNA(超过30个碱基转录物)引入用于使干扰素通路未被激活的细胞(如，胚胎细胞和卵母细胞)基因沉默，参见例如Billy等人，PNAS 2001，Vol 98，pages 14428-14433；和Diallo等人，Oligonucleotides，October 1，2003，13(5)：381-392.doi：10.1089/154545703322617069。

本发明还考虑将特定设计以不会诱导干扰素和PKR路径的长dsRNA引入用于下调基因表达。例如，Shinagwa和Ishii[Genes & Dev.17(11)：1340-1345，2003]已开发出用于表达来自RNA聚合酶II(Pol II)启动子的长双链RNA的载体，称为pDECAP。因为来自pDECAP的转录本都缺少利于dsRNA输出到细胞质中的5′-帽结构和3′-多聚(A)尾，因此来自pDECAP的长dsRNA不能诱导干扰素反应。

另一个避免哺乳动物系统中的干扰素和PKR途径的方法通过经转染或内源性表达引入小抑制RNA(siRNA)进行。

术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)通路的小抑制RNA双链体(一般18-30碱基对)。siRNA典型地为化学合成的中心具有19bp双链区且末端上3′-突出端具有2个对称碱基的21多聚体(mer)，但最近已提出合成的25-30个碱基长度的RNA双链体与相同位置的21多聚体(mer)相比可具有增加100倍的效价。推测所观察到的利用较长RNA触发RNAi获得的增大的效价是由于为Dicer提供了底物(27多聚体(mer))而不是产品(21多聚体(mer))引起的，并推测这提高了siRNA双链体进入RISC的速率或效率。

已发现3′-突出端(overhang)的位置影响siRNA的效价，反义链上具有3′-突出端的不对称双链体通常比有义链(正义链)上具有3′-突出端的那些具有更大效能(Rose等人，2005)。这可能由装载入RISC中的不对称链引起，因为当靶向反义转录物时观察到相反的效能模式。

双链干扰RNA(如siRNA)的链可连接从而形成发夹或茎环结构(如shRNA)。因此，如所提到的，本发明的RNA沉默剂还可为短发夹RNA(shRNA)。

如在此使用的术语“shRNA”是指具有包含第一和第二互补序列区的茎环结构的RNA剂，互补的程度和该区的取向应足够使该区之间发生碱基配对，该第一和第二区通过环区连接，环是由于环区中的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺少碱基配对所引起。环中核苷酸的数目为在3至23，或5至15，或7至13，或4至9，或9至11之间并包括它们的数目。该环中的一些核苷酸可能与该环中的其他核苷酸发生碱基对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列实例包括5′-UUCAAGAGA-3′(Brummelkamp，T.R.等人，(2002)Science 296：550)和5′-UUUGUGUAG-3′(Castanotto，D.等人，(2002)RNA 8：1454)。本领域技术人员将意识到，所得到的单链寡核苷酸可形成包含能够与RNAi机制相互作用的双链区的茎环或发夹结构。

根据另一个实施方式，RNA沉默剂可为miRNA。miRNA是由编码各种大小的初级转录本的基因所构成的小RNA。它们已在动物和植物中均被鉴定出来。该初级转录物(称作“pri-miRNA”)通过多种核水解步骤加工为较短的前体miRNA，或“pre-miRNA”。pre-miRNA以折叠形式存在，以便使最终(成熟)miRNA以双链体形式出现，两条链称为miRNA(该链最终会与靶碱基配对)。pre-miRNA是某种形式的Dicer的底物，这种形式的Dicer可从前体中移出miRNA双链体，之后与siRNA类似，该双链体可被带入到RISC复合体中。已证明miRNA可通过前体形式而不是完整的初级形式的表达而被转基因表达并且是有效的(Parizotto等人，(2004)Genes & Development 18：2237-2242and Guo等人，(2005)Plant Cell17：1376-1386)。

不像siRNA，miRNA仅以部分互补性结合到转录序列上(Zeng等人，2002，Molec.Cell 9：1327-1333)，并阻遏翻译而不影响稳态RNA水平(Lee等人，1993，Cell 75：843-854；Wightman等人，1993，Cell 75：855-862)。miRNA和siRNA两者都通过Dicer加工，并与RNA-诱导沉默复合体的组分相关(Hutvagner等人，2001，Science 293：834-838；Grishok等人，2001，Cell 106：23-34；Ketting等人，2001，Genes Dev.15：2654-2659；Williams等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6889-6894；Hammond等人，2001，Science 293：1146-1150；Mourlatos等人，2002，Genes Dev.16：720-728)。最近有报道(Hutvagner等人，2002，Sciencexpress 297：2056-2060)认为通过miRNA途径的基因调节与通过siRNA途径的基因调节只能通过与靶转录物的互补程度确定。推测与mRNA靶仅有部分识别性的siRNA将起翻译阻遏作用，类似于miRNA，而不是引发RNA降解。

适用于本发明的RNA沉默剂的合成可如下进行。首先，从IGFBP7mRNA序列的起始编码子AUG的下游中，寻找AA二核苷酸序列。出现的每个AA和邻近3’端的19个核苷酸记录为潜在的siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点选自于开放阅读框，因为非翻译区(UTR)较富含调节蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能会干扰siRNA核酸内切酶的结合[Tuschl ChemBiochem.2：239-245]。但是应理解，针对非翻译区的siRNA也可能是有效的，如以GAPDH进行证明的，其中针对5’UTR的siRNA介导细胞GAPDH mRNA下降约90％和蛋白水平完全消失[www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html]。

其次，将潜在靶位点与合适的基因组数据库(如，人、小鼠、大鼠等)进行比较，利用任何序列对比软件，如可从NCBI服务器获得的BLAST软件[www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/]。滤除与其他编码序列具有显著同源性的推定靶位点。

选择合格的靶序列作为用于siRNA合成的模板。优选这些包括低G/C含量的序列，因为已证明与G/C含量高于55％的序列相比它们对于介导基因沉默更有效。优选沿着靶基因的长度选择几个用于评价的靶位点。为了更好地评价选择的siRNA，优选联合使用阴性对照。阴性对照优选包括与siRNA相同的核苷酸组成，但与该基因组没有显著的同源性。因此，优选使用核苷酸序列被打乱的siRNA，条件是它不与任何其他基因表现出任何显著的同源性。

例如，合适的IGFBP7 siRNA可从Sigma-Aldriech获得。

应理解，本发明的RNA沉默剂不必限制于这些仅包含RNA的分子，而且进一步包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。

在一些实施方式中，本文提供的RNA沉默剂可在功能上与细胞穿透肽相关。如在此使用的，“细胞穿透肽”是含有短(约12-30个残基)氨基酸序列的肽，或赋予与膜渗透复合物穿过细胞的胞质膜和/或核膜转运相关的能量非依赖性(即，非内吞)易位特性的功能基序。用于本发明膜渗透复合物中的细胞穿透肽优选包含至少一个非功能性半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基要么是游离的，要么经衍生化从而与双链核糖核酸形成二硫键，此连键已被修饰。赋予此种特性的代表性氨基酸基序在美国专利No.6,348,185中列出，其内容通过引用清楚地合并在此。本发明的细胞穿透肽优选包括，但是不限于，穿膜肽(penetratin)、转导肽(transportan)、pIsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS、和MAP。

利用RNA沉默剂靶向的mRNA包括，但是不限于，其表达与不期望的表型性状相关的那些。示例可被靶向的mRNA是编码截短蛋白的，即，包含缺失的那些。因此，可使本发明RNA沉默剂靶向于桥接区中缺失位的任一侧。将此种RNA沉默剂引入到细胞内，可使突变蛋白下调，同时使未突变蛋白不受影响。

另一种能够下调IGFBP7的药剂为能够特异性切割IGFBP7的mRNA转录物或DNA序列的DNA酶分子。DNA酶是能够切割单链和双链靶序列的单链多核苷酸(Breaker，R.R.and Joyce，G.Chemistry and Biology1995；2：655；Santoro，S.W.& Joyce，G.F.Proc.Natl，Acad.Sci.USA1997；943：4262)。已提出DNA酶的一般模型(10-23模型)。“10-23”DNA酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，该催化结构域两侧各为七至九个脱氧核糖核苷酸的两个底物识别结构域。这种类型的DNA酶可在嘌呤嘧啶连接处有效地切割它的底物RNA(Santoro，S.W.& Joyce，G.F.Proc.Natl，Acad.Sci.USA 199；for rev of DNAzymes see Khachigian，LM[CurrOpin Mol Ther 4：119-21(2002)])。

识别单链和双链靶切割位点的合成的工程DNA酶的构建和扩增的实例在Joyce等人的美国专利No.6,326,174中公开。最近观察到，针对人尿激酶受体的类似设计的DNA酶抑制了尿激酶受体的表达，并在体内成功地抑制了结肠癌细胞的转移(Itoh等人，20002，Abstract 409，Ann MeetingAm Soc Gen，www.asgt.org)。在另一个应用中，与癌基因bcr-ab1互补的DNA酶成功地抑制了白血病细胞中的癌基因表达，并降低CML和ALL情况下的自体骨髓移植的复发率。

IGFBP7的下调还可通过能够与编码IGFBP7的mRNA转录物特异性杂交的反义多核苷酸实现。

一定要考虑对反义方法重要的两个方面，对可用于有效下调IGFBP7的反义分子进行设计。第一个方面是将寡核苷酸递送到适当的细胞的细胞质中，而第二个方面是设计寡核苷酸，该寡核苷酸特异性结合细胞内指定的mRNA，以抑制其翻译的方式进行。

现有技术教导了许多可用于有效递送寡核苷酸进入多种细胞类型的递送策略[参见，例如，Luft J Mol Med 76：75-6(1998)；Kronenwett等人，Blood 91：852-62(1998)；Rajur等人，Bioconjug Chem 8：935-40(1997)；Lavigne等人，Biochem Biophys Res Commun 237：566-71(1997)和Aoki等人，(1997)Biochem Biophys Res Commun 231：540-5(1997)]。

另外，也可利用用于鉴定那些对它们的靶mRNA具有最高预测亲和力的序列的算法，该算法基于解释靶mRNA和寡核苷酸两者结构改变的能量学的热力学循环[参见，例如，Walton等人，Biotechnol Bioeng 65：1-9(1999)]。

此种算法已成功地用来在细胞中实施反义方法。例如，Walton等人开发的算法使得科学家们能够成功地设计针对家兔β-球蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF α)转录物的反义寡核苷酸。同一研究组新近报道了合理选择的寡核苷酸对抗细胞培养物中的三种模型靶mRNA(人乳酸脱氢酶A和B及大鼠gp130)的反义活性，如通过几乎在所有的情况下都证明有效的动力学PCR技术评价，包括用磷酸二酯和硫代磷酸酯(phosphorothioate)寡核苷酸化学物测试对抗两种细胞类型中三个不同靶的活性的测试。

另外，利用体外系统设计和预测特异寡核苷酸的功效的几种方法也已被公开(Matveeva等人，Nature Biotechnology 16：1374-1375(1998))。

几个临床试验已证明反义寡核苷酸的安全性、可行性，和有效性。例如，适合于癌症治疗的反义寡核苷酸已被成功使用[Holmund等人，CurrOpin Mol Ther 1：372-85(1999)]，同时通过靶向c-myb基因、p53和Bcl-2的反义寡核苷酸进行的血液恶性肿瘤治疗已进入临床试验，并证明可被患者耐受[Gerwitz Curr Opin Mol Ther 1：297-306(1999)]。

新近，反义介导的人类肝素酶基因表达的抑制已被报道可抑制小鼠模型中人癌症细胞的胸膜侵染(胸膜扩散，pleural dissemination)[Uno等人，Cancer Res 61：7855-60(2001)]。

因此，目前的共识是，如以上所描述的反义技术领域最近的发展，已导致高度准确的反义设计算法和多种寡核苷酸给药系统的产生，使得本领域普通技术人员能够设计和实施适合于下调已知序列的表达而不需要反复的实验的反义方法。

另一种能够下调IGFBP7的药剂是能够特异性切割编码IGFBP7的mRNA转录物的核酶分子。核酶正在逐渐地用于通过切割编码目的蛋白的mRNA而序列特异性地抑制基因表达[Welch等人，Curr Opin Biotechnol.9：486-96(1998)]。设计用于切割任何特异靶RNA的核酶的可能性已使它们成为基础研究和治疗应用中有价值的工具。在治疗领域，核酶已被用于靶向传染病中的病毒RNA、癌症中的显性癌基因和遗传障碍中的特异体细胞突变[Welch等人，Clin Diagn Virol.10：163-71(1998)]。最值得注意地，几种用于HIV患者的核酶基因治疗方案已进入临床一期试验。新近，核酶已被用于转基因动物研究、基因靶验证和途径阐明。几种核酶处于临床试验的各个阶段。ANGIOZYME是在人临床试验中研究的第一个化学合成的核酶。ANGIOZYME特异性地抑制血管生成途径的关键要素VEGF-r(血管表皮生长因子受体)的形成。Ribozyme Pharmaceuticals有限公司以及其他公司已证明在动物模型中抗血管生成治疗剂的重要性。在细胞培养物分析中发现，设计用于选择性地破坏丙型肝炎病毒(HCV)RNA的核酶HEPTAZYME有效地减少了丙型肝炎病毒RNA(Ribozyme Pharmaceuticals公司-WEB主页)。

还有一种能够下调IGFBP7活性的药剂为IGFBP7-效应子蛋白的非功能变体，也称为显性失活变体。此种显性失活变体是结合IGFBP7但是不能对来自它的下游信号转导通路造成影响的效应子蛋白。此类的实例包括显性失活IGF和显性失活胰岛素。例如此类药剂能够结合胰岛素但不能结合IRS1/2。

本文描述的任何下调药剂可连同如以上描述的药学可接受载体一起包括在药物组合物中。

作为在此使用的术语“约”是指±10％。

术语“包含”、“包含的”、“包括”、“包括的”、“具有”，和它们的词形变化形式意思是指“包括但是不限于”。这种术语包括术语“由……组成”和“基本上由……组成”。

术语“基本上由……组成”意思是指组合物或方法可包括另外的成分和/或步骤，但仅当该另外的成分和/或步骤不实质性地改变要求保护的组合物或方法的基本和新特征时才这样。

如在此使用的，单数形式“一个”、“一”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。

在整篇专利申请中，本发明的各种实施方式可以范围形式呈现。应当理解范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应该理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应视为已具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的各个数值。例如，如从1至6的范围描述应视为已具体地公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围，以及在此范围中的各个数值，例如，1、2、3、4、5，和6。不论范围宽度如何，这都能适用。

当本文中指出了数值范围时，其意在包括在所指范围内的任何提及数字(小数或整数)。本文中的表达在第一个指定数和第二个指定数之间的“范围”与从第一个指定数“至”第二个指定数的“范围”可互换使用，意在包括第一和第二个指定数及其间的所有小数和整数。

如在此使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、方法、技术和程序，包括但不限于，化学、药学、生物学、生物化学和医学领域技术人员已知，或易于从已知方式、方法、技术和程序开发出的那些方式、方法、技术和程序。

在此使用的术语“示例”是指“用作实例、例证，或图例”。被描述为“示例”的任何实施方式不必解读为优选的或比其他实施方式有利，和/或排除其他实施方式并入的特征。

在此使用的术语“可选地”是指“提供在一些实施方式中，而没有提供在其他实施方式中”。本发明任何特定的实施方式均可包括多个的“可选的”特征，除非此类特征相冲突。

应理解，为清楚起见而在单独实施方式的上下文中描述的本发明某些特征，也可结合提供在单个实施方式中。相反，为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发明的多种特征，也可单独地或以任何合适的子组合形式，或作为适合于本发明的任何其他被描述的实施方式提供。在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实施方式的实质特征，除非这些实施方式没有这些元素时是无效的。

如上文所描绘的和如下面权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面将在下面的实施例中找到实验支持。

实施例

现在参考下面的实施例，结合上面的描述以非限制方式阐述本发明的一些实施方式。

一般而言，在此使用的术语和本发明利用的实验程序包括分子、生物化学、微生物学，和重组DNA技术。此类技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook等人，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″Volumes I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等人，″Current Protocols in Molecular Biology″，JohnWiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide toMolecular Cloning″，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等人，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，New York；Birren等人(eds)″Genome Analysis：A Laboratory Manual Series″，Vols.1-4，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1998)；methodologies as set forth in U.S.Pat.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659and 5,272,057；″CellBiology：A Laboratory Handbook″，Volumes I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；″Current Protocols in Immunology″Volumes I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等人(eds)，″Basic and Clinical Immunology″(8th Edition)，Appleton &Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds)，″Selected Methods inCellular Immunology″，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫分析法详述在这些专利和科学作品文献中，参见，例如，美国专利No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，Eds.(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.，ed.(1986)；″Immobilized Cells andEnzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning″Perbal，B.，(1984)and″Methods in Enzymology″Vol.1-317，Academic Press；″PCRProtocols：A Guide To Methods And Applications″，Academic Press，SanDiego，CA(1990)；Marshak等人，″Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual″CSHL Press(1996)；所有这些文献都通过引用合并在此如同全部列出在此。其他一般性参考文献遍及本文。其中的程序被认为是本领域熟知的，仅为了便于读者阅读而提供。包含在其中的所有信息都通过引用合并在此。

一般材料和实验方法

细胞培养物-HaCat细胞，自发永生化人角质化细胞系，由Dina Ron博士(以色列海法市Technion)提供。将该细胞保存在含有0.075mM或1.4mM CaCl₂，添加有10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺，和1％青霉素/链霉素的高葡萄糖DMEM培养基(以色列，Beit-Ha-Emek，Biological Industries)中。

原代人角质化细胞购自于CELLnTEC Advanced Cell Systems(瑞士伯尔尼)。将细胞培育在含有0.15mM CaCl₂，添加有生长因子的KC生长培养基(KGM)(Bullet kit，Lonza，MD USA)中。培养基每2-3天更换一次。使用第3代细胞。为了进行分化，将细胞培养于KGM培养基和1.4mMCaCl₂中。

免疫组化-将甲醛-固定的5-μm石蜡-包埋的切片用含3％H₂O₂的甲醇在室温下处理15分钟，在柠檬酸盐缓冲液中用微波炉在90℃下加热15分钟，然后用小鼠抗-IGFBP7单克隆抗体(R&D Systems，MinneapolisMN，USA)、抗-角蛋白14抗体(BioGenex，San Ramon，CA)，或免疫前家兔抗血清在室温下染色1小时。在磷酸缓冲盐溶液中充分清洗后，该抗体利用ABC技术显色(Zymed Laboratories，South San Francisco，CA，USA)，该载玻片用苏木素复染色。

SiRNA转染-在用66nmol l^-1抗IGFBP7的siRNA双链体或阴性对照siRNA(Invitrogene Carlsbad，CA，USA)利用脂质转染胺试剂(Lipofectamine)2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)转染之前，将原代KC细胞以8×10⁴个细胞/孔的密度培养在6孔板中。测试五种不同的siRNA物种对IGFBP7下调的作用。选择用于这项研究进一步使用的siRNA IGFBP7双链体由5′-rGrCUrGrGUrAUrCUrCrCUrCUrArArGUTT-3′(SEQ ID NO：32)和5′-rArCUUrArGrArGrGrArGrAUrArCrCrArGrCTT-3′(SEQ ID NO：33)(Sigma-Proligo，TX，USA)组成。作为阴性对照，使用购自于InVitrogen的标准乱序siRNA(商品号12935200)。

shRNA慢病毒转导-为了获得稳定的基因下调，使用了DNA shRNA-表达慢病毒载体(5’-CCGGCAATCCACTAACACTTTAGTTCTCGAGAACTAAAGTGTTAGTGGATTGTTTTTG；SEQ ID NO：34；hIGFBP7NM_001553慢病毒颗粒，Sigma，cat No.TRCN0000077943)。非-靶向sh对照慢病毒颗粒购自于Sigma，商品目录号SHC002V。shRNA-表达慢病毒载体包含病毒包装信号、调节元件和嘌呤霉素抗性基因从而将shRNA序列包装到感染性病毒粒子中(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)。根据制造商的建议，用shRNA慢病毒颗粒转导HaCat细胞。简要地，转导前24小时，将细胞按1.6×10⁴个细胞/孔培育于6孔板中。将1-5μl病毒原液和2μl 4mg/ml的聚凝胺加入到细胞中，在加湿培养箱中于37℃下5％CO₂中孵育18-20小时。病毒原液的量根据期望的MOI(MOI＝5)和Sigma提供的总转导单位/ml确定。计算公式为(每孔中细胞的总数)*(期望的MOI)＝需要的总转导单位(TU)；需要的TU/(提供的TU/ml)＝每孔的慢病毒颗粒总ml。转导后24小时，细胞在PBS x 1中清洗两次，并保存在完全培养基中。培养扩增48小时后，将细胞保存在添加有终浓度为4μg/ml的嘌呤霉素的培养基中。在嘌呤霉素存在的情况下进行一周的挑选。在进一步使用前，挑选的克隆冷冻于液氮中。

根据与针对HaCat细胞描述的相同的方案转导原代角质化细胞，略有修改。转导后24小时，细胞在PBS x 1中清洗两次，并保存在含有0.15mM或1.4mM CaCl₂的KGM培养基中。培养扩增72小时后，对细胞进行体外分析。

定量逆转录-PCR-利用RNA提取试剂盒(德国曼海姆Roche)从培养的细胞中提取RNA。利用Reverse-iT第一链合成试剂盒(ABgene，Epson，UK)和随机六聚体，从500ng的总RNA合成cDNA。cDNAPCR扩增利用SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)与在下面表2中列出的基因-特异性内含子-杂交寡核苷酸对在Mx3000p/5p复合过滤系统(Stratagene，Cedar Creek，TX，USA)上进行。为了保证反应条件的特异性，在每次运行结束时，测量扩增产物的熔融温度(Tm)以确认它的均匀性。循环条件如以下：95℃维持10分钟、95℃维持10秒、62℃维持15秒，和72℃维持25秒，总共进行40个循环。每个样品重复分析三次。为了定量，利用连续稀释的、在同一个实时PCR中扩增的cDNA获得标准曲线。结果以ACTB和GAPDH mRNA水平进行标准化。定量操作之后，产物通过2.5％的琼脂糖凝胶电泳分离从而确认该反应是否扩增出预期大小的DNA片段。

表2：寡核苷酸序列

表2.给出用于扩增指示基因的引物以及它们的序列标识符。

微阵列杂交和数据分析-根据制造商的方案利用TotalPrep RNAAmplification Kit(Applied Biosystems/Ambion，Austin，USA)，反转录总RNA(200ng)并制备cDNA(互补RNA)。将1.5μg生物素化cRNA与Sentrix Human WG-6 v2阵列(包括48,701转录靶)杂交，清洗，然后在BeadArray Reader(Illumina，San Diego，CA)上进行扫描。将扫描数据输出到MatLab软件中，对分位点进行标准化，并将检测p值大于0.01的转录物从分析中去除(多于13,000个转录物具有小于0.01的p值)。在全局GO注释分析中，测试在基因集合中出现一次以上的所有GO注释。基因集合由钙诱导的上调或下调受IGFBP7沉默影响最显著的前100个基因组成。对于每个注释，在基因集合中随机选择号码相同的基因，计算它在此集合中出现的次数。该过程重复100次，建立GO注释(term)频率柱状图。结果利用One-sample Wilcoxon Signed-Ranks分析从而评估我们实验的基因集合中的相对富集度。

蛋白印迹法-使细胞在Cellytic MT裂解/提取试剂(Sigma-Aldrich，StLouis，MO，USA)与包括1mM PMSF、1mg ml-抑肽酶1和亮肽素(leupeptin)(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)的蛋白酶抑制剂中形成匀浆。在10,000xg、4℃下离心10分钟后，蛋白通过10％SDS-PAGE进行电泳，并转移到硝酸纤维素膜(Trans-Blot Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上。用含有3％BSA和0.01％吐温20的1×Tris缓冲盐溶液封闭1小时后，印迹用一抗孵育。一抗包括抗p-IRS-1、IRS-1、p-ERK 1/2、ERK2、SMAD 2/3、p-SMAD 2/3的抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)，IGFBP7(R&D Systems，Minneapolis MN，USA)，Cytokeratin 6(ABCAM，Cambridge，MA，USA)的抗体。印迹用Tris缓冲盐溶液-吐温(20mM Tris HCl，4mM Tris碱，140mM NaCl，1mM EDTA，0.1％吐温20)洗涤三次。与二抗辣根过氧化物酶结合的抗小鼠或抗家兔抗体(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)进行孵育和接着进行清洗后，利用EZ-ECL化学发光检测试剂盒(Biological Industries，Beit Haemek，Israel)检测蛋白。为了比较不同样品中的蛋白的量，用小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体(Abcam，Cambridge，UK)和二抗辣根过氧化物酶结合的抗小鼠抗体(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)重新探测印迹。

MTT分析-MTT测试是基于活细胞将黄色盐MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5二苯基溴化四唑)(Sigma，Aldrich St Louis，MO，USA)还原成紫蓝色不溶性甲臜沉淀的选择能力。将5mg/ml的MTT溶解于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，加入到每孔中(总体积的10％)，在37℃下孵育30分钟。孵育后，除去培养基，将紫色甲臜生成物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。收集上清液，接着用ELISA reader Zenyth 200(Anthos Labtec，Cambridge，UK)在560nm下进行扫描。

BrDu分析-通过Cell Proliferation ELISA BrDu色度试剂盒(德国曼海姆Roche)根据制造商的方案测定BrDu的掺入率。利用ELISA酶标仪测定在450nm下的吸光度。简要地，将细胞培养在6孔板中，用BrdU在37℃下孵育6小时。然后固定细胞并加入FixDenat溶液使DNA变性。在室温下加入抗-BrdU POD抗体处理90分钟，然后漂洗细胞。免疫复合物通过加入底物溶液利用ELISA酶标仪Zenyth 2000(Anthos Labtec，Cambridge，UK)测定在450nm处的吸光度。

TUNEL分析-利用TUNEL试剂盒(德国曼海姆Roche)根据制造商的方案对凋亡进行测定。简要地，将加入或未加入10ng/ml TNF-α(PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)的细胞置于盖玻片上12小时，空气干燥，用新鲜配制的固定液(含4％低聚甲醛的磷酸盐缓冲液)固定，然后用磷酸盐缓冲液漂洗两次。用含0.1％Triton X-100的0.1％柠檬酸钠通透细胞。将细胞样品在TUNEL反应混合液的存在下在37℃的加湿环境下避光孵育1小时，用DAPI进行复染色。每个载玻片计数超过1,000个细胞，并在荧光显微镜Zeiss Axioscope 2(Carl Zeiss MicroImaging，Inc.，Thornwood，NY)下进行检测。图像分析用Image-Pro Plus 5软件进行。认为利用标准学生t-检验计算p值小于0.01的凋亡活性差异是显著的。

膜联蛋白V(钙依赖性磷脂结合蛋白，Annexin V)分析-利用

膜联蛋白V Apoptosis Kit(Clontech Laboratories有限公司，CA，USA)根据制造商方案进行膜联蛋白V分析。简要地，将加入或未加入10ng/ml TNF-α(PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)的细胞置于盖玻片上12小时，用提供的结合缓冲液进行漂洗，用膜联蛋白V和碘化丙啶在室温下避光孵育15分钟。利用烟酸己可碱(Hoechst)复染细胞。每个载玻片计数超过1,000个细胞，在荧光显微镜(arl Zeiss MicroImaging，Inc.，Thornwood，NY)下进行检测。图像分析用Image-Pro Plus 5软件进行。认为利用标准学生t-检验计算p值小于0.01的凋亡活性差异是显著的。

衰老相关的β-半乳糖苷酶分析-细胞接种48小时后对6孔板每孔中的2-4×10⁴个细胞进行染色。该细胞密度可保证该染色在培养物到达融合(汇合，confluency)状态之前进行。按先前说明的有稍微修改的方法(DimriGP，Lee X，等人，1995.A biomarker that identifies senescent human cells inculture and in aging skin in vivo.Proc Natl Acad Sci USA 92：9363-9367)进行SA-β-Gal染色。简要地，细胞用冷PBS清洗，用0.5％的冷PBS稀释的戊二醛固定5分钟。固定后，在PBS中清洗细胞，并将其在含有1mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-Gal)(德国曼海姆Roche)和先前说明的其余组分(Dimri等人，1995，Supra)的染色液中37℃下孵育8小时。将0.1M柠檬酸和0.2M Na₂HPO₄溶液以适当比例混合用于在不同pH值下的染色。在之前的37℃孵育之后，细胞用冷PBS清洗三次，在图像收集前4℃保存在PBS中。

利用Matlab应用用于细胞标记(SegmentGui)和颜色分析[http://md.technion.ac.il/pictures/storage/45/47.zip]进行图像定量分析。对于每个测量，手动标记随机选择的250个细胞的最小值。Kolmogorov-Smirnov检验用于统计分析。认为P值小于0.05的差异是显著的。

实施例1：银屑病皮肤与正常皮肤相比IGFBP7表达下降

实验结果

银屑病皮肤与正常皮肤相比IGFBP7表达下降-先前的数据表明银屑病与IGFBP7表达的下降有关(Hochberg等人，2007)。为了在独立的患者组确认这些数据，本发明人通过免疫组化检测了IGFBP7蛋白在一系列银屑病(n＝13)和对照组(n＝13)的活组织中的表达(图1D)。发现IGFBP7在整个正常表皮中的表达都很强(图1A)，而在银屑病表皮中无表达或表达非常弱(图1C)。这些结果说明在银屑病患者的皮肤中IGFBP7的表达是下降的。

血清刺激下调IGFBP7表达-为了测试血清对IGFBP7表达水平的影响，在浓度逐渐增加的胎牛血清的存在下培养HaCat细胞，在48小时后检测IGFBP7RNA水平。如图12所示，发现血清刺激下调了IGFBP7表达，提示EGFR信号在调节IGFBP7表达中的可能作用。与此相反，没有观察到钙对IGFBP7的影响(数据未示出)。

实施例2：IGFBP7的下调增加角质化细胞的增生、活力和凋亡

为了测试IGFBP7是否参与特征为表皮角质化细胞异常增生和分化的银屑病、紊乱的发病机制，本发明人诱导了如以下角质化细胞中IGFBP7的下调。

实验结果

IGFBP7 siRNA导致IGFBP7特异性下调，而没有导致IGFBP家族中的其他基因下调-本发明人评估了IGFBP7表达在调节表皮角质化细胞增生中的作用。利用siRNA和shRNA分别暂时和稳定地降低IGFBP7在HaCat细胞中的表达，利用shRNA短暂地降低IGFBP7在人原代角质化细胞中的表达。IGFBP7的下调通过qRT-PCR(图2A)和条件培养基的免疫印迹确认(图2B)。为了排除使用的siRNA和shRNA的脱靶效应，本发明人测试了IGFBP7的下调对IGFBP7家族其他成员表达水平的影响，发现它们的mRNA水平没有显著性的改变(图8)，提示使用的siRNA和shRNA特异性地靶向IGFBP7。

IGFBP7下调增加角质化细胞的活力和增生-HaCat细胞中IGFBP7的下调增加如通过MTT分析(图3A)评估的细胞活力和通过BrDU掺入分析测定的细胞增生率(图3B)。在IGFBP7下调的HaCat细胞(图3C和3D)和原代角质化细胞(图10)中，表皮增生标记物KRT6的表达上调，同时细胞增生增加。在原代角质化细胞中利用MTT(图3E)和BrDU掺入分析(图3F)进一步证实了这些数据。

IGFBP7表达的下降与角质化细胞凋亡的下降相关-IGFBP7已被证明可诱导许多癌细胞系的细胞凋亡和衰老(Akaogi等人，1996；Burger等人，2005；Ruan等人，2007；Sato等人，2007；Wajapeyee等人，2008；Wilson等人，2002)。本发明人评估了IGFBP7下调对角质化细胞凋亡活性的影响。用IGFBP7-特异性或对照shRNA或siRNA稳定或短暂地转染HaCat细胞，利用TUNEL和膜联蛋白V分析对凋亡进行评价。本发明人发现HaCat细胞中IGFBP7表达的下降导致凋亡活性的同时下降，甚至在10ng/μl的重组TNF-α存在下亦是如此(图4A-4B)。类似地，在原代角质化细胞中，由IGFBP7特异性siRNA引起的IGFBP7下调阻止了TNF-α诱导的细胞凋亡(图4C)。类似地，在用IGFBP7-shRNA短暂下调的原代角质化细胞中凋亡受到显著地抑制，如利用TUNEL分析所示(图14A-14B)。

IGFBP7的减少不影响角质化细胞的衰老-观察到IGFBP7的下调对人角质化细胞的衰老速率没有影响，如通过细胞衰老标记物β-半乳糖苷酶的表达测定的(图16)。

实施例3：IGFBP7参与钙诱导的角质化细胞的分化

实验结果

IGFBP7是钙诱导与角质化细胞分化相关的基因的表达所需要的-为了探究IGFBP7在表皮稳态中的作用，本发明人诱导了表达IGFBP7-特异性或对照shRNA的HaCat细胞在先前描述的1.4mM Ca²⁺培养基的存在下的分化(Boukamp P，Petrussevska RT，等人，1988.Normal keratinization in aspontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.J CellBiol 106：761-771)。发现IGFBP7的下调阻断了三种角质化细胞分化标记物KRT10、外皮蛋白(involucrin)(图5A)和兜甲蛋白(图11)的诱导发生。另外，IGFBP7下调的细胞未能表现出钙诱导的分化的形态变化特征(图9A-9D)。用原代角质化细胞获得相似的结果(图5B)，提示IGFBP7还可参与到角质化细胞分化的调节。

IGFBP7调节与钙诱导的角质化细胞分化相关的基因的表达-为了在更广的层面探究这种可能性，本发明人进行了全基因表达分析(global geneexpression analysis)从而评估IGFBP7的下调对在低和高细胞外钙浓度下培养的HaCat细胞中差异表达的基因的表达的影响。本发明人发现，IGFBP7的下调使得在应答细胞外钙浓度增大时HaCat细胞和原代角质化细胞中表达变化高于2.5倍的基因的表达分别显著衰减了99.6％和76.2％。两组数据集合(p值小于0.01)的全局途径GO(基因本体论)分析显示，在分析中发现显著富集的几种过程注释与增生和分化的调节相关(图5C)。综合考虑，这些数据提示IGFBP7调节与钙诱导的角质化细胞分化相关的基因的表达。

为了评估IGFBP7的下调对在低和高细胞外钙浓度下培养的HaCat细胞中差异表达的基因的表达的影响，本发明人计算了，IGFBP7下调的细胞和对照细胞在应答细胞外钙浓度增大时展现在阵列上的所有基因(～48,000个转录物)的变化倍数(下表3和4，和图15A-15D)。这些基因根据两组数据集合变化倍数的差异(倍数变化的倍数变化)进行分选。前100个(100上调，100下调)基因在下表3和4中列出。

表3.钙诱导的调节被IGFBP7向下影响最显著的前100个基因

向下指数	探针Id#	基因符号	变化倍数＊
				1	6940070	SCGB1A1	16.3304
2	2470722	LYNX1	11.431
				3	6280576	S100A8	7.3454
4	5050682	SLC39A2	6.8848
				5	2680475	UBD	6.1127
6	1260270	ATP6V1B1	5.9157
				7	6580437	PLAT	5.7885
8	4540520	CLDN8	5.7463
				9	1090064	CD74	5.3426
10	4490356	KRT4	4.8539
				11	6020594	GCNT3	4.5458
12	6520767	top2A	4.4445
				13	7570440	E2F2	4.2843
14*	290544	MMP13	4.1875
				向下指数	探针Id#	基因符号	变化倍数＊
15*	2640609	S100P	4.0117
				16	1690301	ABP1	3.9195
17	5290739	FZD10	3.8779
				18	5960427	IQGAP3	3.8329
19	110040	PNCK	3.8256
				20	3780326	GBP2	3.7385
21	5570500	ALDH3B2	3.659
				22	3450497	TRIM31	3.639
23	5390014	ITLN2	3.5343
				24*	4590669	SERPINB4	3.5168
25	2900471	TTK	3.4925
				26	1850093	TNFSF10	3.3984
27	5360463	DEFB1	3.3324
				28	6510168	SAA2	3.3281
29	460072	CDCA5	3.3026
				30	7610343	C6ORF173	3.2944
31	6270092	DTL	3.2647
				32	2680370	HLA-DRA	3.2631
33	540128	SLCO2A1	3.2501
				34	2970437	TLR5	3.2377
35	4150474	KRT13	3.2271
				36	1240333	VTCN1	3.1957
37	6660414	CEP55	3.1584
				38	7320020	C18ORF45	3.1258
39	6220450	DHRS9	3.1112
				40	6980458	SNCAIP	3.0914
41	1580524	BARX2	3.078
				向下指数	探针Id#	基因符号	变化倍数＊
42	2030730	MMP12	3.0729
				43	3610619	ST6GALNAC1	3.06
44	6480500	HLA-DPA1	3.0502
				45	5080288	MCM10	3.0425
46	10307	CCL2	2.9786
				47	3060605	ASPM	2.9758
48	6040379	HLA-DRB4	2.9747
				49	6290561	HLA-DQA1	2.9632
50	1470750	TJP3	2.9446
				51	5340484	CDC2	2.9338
52	2450603	UBE2C	2.901
				53	3060736	AURKB	2.8951
54	3170497	CRABP2	2.8724
				55	5310128	KRT15	2.8459
56	840612	HMMR	2.8269
				57	3060056	HAS3	2.8237
58	10215	CD86	2.8135
				59	2750632	OLFM4	2.7965
60	5390594	HCAP-G	2.7914
				61	7400162	KIAA1199	2.7914
62	5870743	HLA-DMB	2.7763
				63	620343	SLPI	2.7747
64	4010053	HLA-DRB3	2.7716
				65	5960128	TAF15	2.7534
66	4880400	VSNL1	2.7509
				67	380538	CDH5	2.7439
68	10524	PRC1	2.7438
				向下指数	探针Id#	基因符号	变化倍数＊
69	6900592	MALL	2.7319
				70	3520066	PDZK1IP1	2.7282
71	2970731	RAET1G	2.7194
				72	2760164	EVA1	2.7069
73	1820040	SAA1	2.6988
				74	5570253	TROAP	2.6965
75	6330152	KIAA0101	2.6745
				76	3370403	C15ORF48	2.6686
77	5720647	ADAM19	2.6423
				78	7400097	TCN1	2.6372
79	4250379	FOS	2.6193
				80	6940280	ORC1L	2.6157
81	4920719	TRIM22	2.5946
				82	4290114	NUSAP1	2.5688
83	6770594	CD82	2.5585
				84	6100091	EGR2	2.5493
85	1090500	KRT1	2.5451
				86	2340541	FGFR3	2.5427
87	5310079	MAP3K8	2.5353
				88	4540364	SERPINB3	2.5315
89	2060196	AQP3	2.5286
				90	5220072	CFB	2.5099
91	6330484	GPR110	2.5075
				92	4040221	SERPINB1	2.505
93	20465	KLK11	2.4987
				94	7160040	PRIM1	2.4943
95	6620725	KIF2C	2.4837
				向下指数	探针Id#	基因符号	变化倍数＊
96	6520167	BIRC3	2.4812
				97	6220554	HS.25318	2.4578
98	5820360	C10ORF99	2.444
				99	7160706	INDO	2.4422
100	5810184	SYTL2	2.4247

表3.*通过qRT-PCR确认的基因。*对钙诱导的调节受IGFBP7沉默影响的变化倍数(向上或向下)利用下面的等式计算：

[{wt(Ca+/Ca-)}/{沉默IGFBP7(Ca+/Ca-)}]

表4.钙诱导的调节被IGFBP7沉默向上影响最显著的前100个基因

向上指数	探针Id#	符号	变化倍数＊
				1	1010136	HSPA6	31.4967
2	3120097	RGS7	7.2332
				3	3710035	HMOX1	6.2995
4	4540575	ARL4	4.742
				5	4290370	HS.570017	4.3452
6	2760239	AKR1C3	4.1106
				7	1470369	CCL26	4.0743
8	4480010	HS3ST2	3.8787
				9	7050372	TXNRD1	3.8565
10*	4900541	CYP1A1	3.7022
				11	130709	ABL2	3.5947
12*	2100301	INSIG1	3.5775
				13	3400292	PSG11	3.549
14	630010	ANKRD1	3.5442
				15	4780475	DUSP1	3.5115
16	4880593	LOC648517	3.4567
				向上指数	探针Id#	符号	变化倍数＊
17	4780376	CDH2	3.4565
				18	6250138	PNLIPRP3	3.3927
19	6960634	INSIG1	3.3512
				20	7040719	TNFSF15	3.3435
21	2970646	SLC7A11	3.3424
				22	6940524	PDE5A	3.3205
23	6040601	CTH	3.2527
				24	7150603	DNAJA4	3.1471
25	5860333	F3	3.1227
				26	5260193	PSG5	3.1128
27	7200114	CTGF	3.1025
				28	5860300	HSPA1A	2.9478
29	3190292	TAGLN	2.9395
				30	130563	HSD17B2	2.8586
31	5900367	HS.553217	2.8318
				32	780255	HSPA1L	2.8305
33	7610546	HMFN0839	2.816
				34	6580491	PAPSS2	2.7948
35	3840253	FAM46A	2.7782
				36	4150750	DCBLD2	2.7549
37	6840022	HS.387982	2.735
				38	4890048	ARL4	2.6492
39	5310184	FGD3	2.6445
				40	160132	CREB5	2.6292
41	2640576	SAMD4A	2.6247
				42	5870243	ELL2	2.6161
43	1820068	CPA4	2.6068
				向上指数	探针Id#	符号	变化倍数＊
44	6980095	IRS2	2.6066
				45	3060465	MAP2	2.6058
46	4730082	LOC644760	2.5786
				47	5670341	LOC554223	2.5774
48	4290376	RHOB	2.5764
				49	7510487	AQP11	2.5697
50	20010	DHCR7	2.5495
				51	5050347	DLC1	2.5445
52	4180524	CA12	2.543
				53	4880086	ETV5	2.5405
54	6330315	DST	2.5404
				55	1230528	HSPH1	2.5257
56	2340093	AFF4	2.5239
				57	940142	SQSTM1	2.5162
58	7160398	INHBE	2.5114
				59	2650324	ANXA10	2.5052
60	3400494	PTPDC1	2.5032
				61	2940255	PLA2G4C	2.4848
62	2100379	PPP1R3C	2.4559
				63	7050451	GCLM	2.4486
64	2320538	FADS3	2.4472
				65	1940048	OKL38	2.4467
66	6760735	TRPV6	2.4313
				67	510528	VEGF	2.4267
68	1050324	LPIN1	2.4072
				69	3130273	GAB2	2.3723
70	1980240	PLEKHC1	2.3577
				向上指数	探针Id#	符号	变化倍数＊
71*	780600	KLK6	2.3436
				72	2680711	HKDC1	2.3371
73	3830133	HS.556018	2.3197
				74	6100228	NFIL3	2.3145
75	520184	RAB32	2.3115
				76	380731	TUBA1	2.3106
77	3850669	LXN	2.3094
				78	150703	ATF3	2.3052
79	780228	RARB	2.2983
				80	2140192	DKK1	2.2962
81	3440411	HSPA1B	2.2913
				82	4760100	PTHLH	2.2861
83	2070672	FIBCD1	2.2837
				84	7210343	HS.107418	2.2837
85	1470176	TUBB2B	2.2813
				86	5960201	SNAI2	2.2727
87	780692	FLG	2.2588
				88	7510577	HS.551128	2.2452
89	7400692	ISL1	2.2303
				90	610639	RAB3IL1	2.2282
91	6200095	COL5A1	2.2199
				92	5130309	HS.159264	2.2186
93	6760170	LOC338758	2.2184
				94	1170576	HS.575324	2.2136
95	4730195	HIST1H4H	2.2122
				96	5810066	LOC285989	2.2104
97	60121	LOC399900	2.1984
				向上指数	探针Id#	符号	变化倍数＊
98	580445	NEXN	2.1814
				99	2260594	NOLA1	2.1768
100	650709	SLC2A6	2.1554

表4.*通过qRT-PCR验证的基因。*钙诱导的调节受IGFBP7沉默影响的变化倍数(向上或向下)利用下面的等式计算：

[{沉默IGFBP7(Ca+/Ca-)}/{wt(Ca+/Ca-)}].

实施例4：IGFBP7抑制角质化细胞增生并诱导其凋亡

实验结果

重组IGFBP7抑制人角质化细胞增生并诱导其凋亡-为了确认IGFBP7是否参与调节角质化细胞的增生和分化，本发明人检测了重组人IGFBP7多肽(rIGFBP7)对原代角质化细胞的影响。rIGFBP7的加入导致原代人角质化细胞培养物中活细胞数目减少，如通过MTT分析测定的(图6A)。通过BrDU分析(图6B)测得的角质化细胞增殖减少以及如图6C中所示的角质化细胞凋亡增加最可能解释这种观察结果。rIGFBP7没有对细胞分化造成显著的影响(数据未示出)。

实施例5：IGFBP7-沉默诱导角质化细胞中的IRS1和ERK磷酸化

实验结果

IGFBP7下调对TGF-β和胰岛素信号的影响-为了探究受IGFBP7下调影响的一个信号通路(或多个信号通路)，本发明人利用了IGFBP7稳定下调的HaCat细胞。发现IGFBP7的下调诱导了胰岛素受体相关的-胰岛素受体底物1(IRS1)和酪氨酸激酶ERK 1/2的磷酸化，提示通过胰岛素受体的信号受到干扰(图7A-7D)。相反，IGFBP7没有影响SMAD 2/3磷酸化状态(数据未示出)。

ERK的抑制使由IGFBP7下调诱导的细胞增生衰减-为了进一步探究ERK是否参与IGFBP7-介导的细胞增生，将用IGFBP7siRNA转染的原代角质化细胞用ERK抑制剂PD98059处理(120μM处理72小时，每24小时更新一次培养基)。如图17所示，ERK的抑制阻止了在IGFBP7-沉默细胞中观察到的角质化细胞增生的诱导发生。

实施例6：在缺少免疫元件情况下生理相关模型中IGFBP7的下调诱导银屑病样表型

本发明人利用三维器官型细胞培养系统作为研究IGFBP7表达下降在银屑病发病机制中的作用的模型(图18和19)。在这个模型系统中，将角质化细胞在由胶原和成纤维细胞组成的支撑物上的空气液体界面处培育两周。在这段时间内，角质化细胞完全分化，形成多层角化的上皮细胞，其忠实地复制了正常表皮生物的大部分生理学外观。本发明人确定了培育此种三维皮肤等效物所需要的条件。组织学和免疫组化分析确认了这些培养物中存在正规的分化程序。在7天和10天时，皮肤等效物表现出完整表皮分化和表皮主要层出现的特征：基底层、棘层、颗粒层、角化层和真皮。在12天时，角质层增厚并脱屑，即，发生角化的角质化细胞的脱落(图20)。发现IGFBP7的表达随着人工表皮的逐渐分层而增大(图21)。

为了确认角质化细胞单层中的这些发现与生理学的相关性，本发明人通过RNA干扰抑制皮肤器官型培养物中IGFBP7的表达。通过电穿孔，用IGFBP7-特异性或对照小干扰RNA转染增生的角质化细胞。接着，将转染的细胞作为体外皮肤等效模型的表皮组分，培育在由胶原和成纤维细胞制成的支撑物上的空气液体界面处。在14天时，在培养物中钻取活组织，用福尔马林固定并加工用于H&E染色。在7天时也钻取活组织用于RNA提取，转录成cDNA，并利用qRT-PCR对IGFBP7mRNA的表达进行分析。如在7天时测定的，IGFBP7特异性siRNA将IGFBP7表达抑制到小于皮肤等效物中正常水平的60％(数据未示出)。siRNA的作用在器官型皮肤模型中至少持续7天(数据未示出)。用H&E染色的、IGFBP7下调的皮肤等效物在14天时表现出显著的变化，包括异常分层、缺少颗粒层、角化不全和显著的过度角化(图22A和22B)。

实施例7：重组IGFBP7治愈人源化小鼠模型中的银屑病

为了评估IGFBP7在银屑病中的作用，本发明人利用了嵌合小鼠模型(图23)。该模型基于植入到米色-SCID小鼠上的健康对照组正常皮肤的使用。接着给植入物注射从银屑病患者中分离的NK/T细胞(Gilhar等人，2002)。3周内将从银屑病患者中分离的外周血单核细胞培养在NK完全培养基[RPMI 1640，10％人AB血清(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)、1％谷氨酰胺，和1％抗菌的青霉素/链霉素(Biological Industries，BeitHaemek，Israel)及100U/ml IL-2(Pepro Tech有限公司，Rocky Hill，NJ，USA)]中。此种细胞系表达异源NK细胞标记物并表现出NK细胞毒性。皮肤植入四周后，将该NK细胞注射到缺少T、B和NK细胞的米色-SCID小鼠上的人皮肤外植体中，在接下来的4周内，建立与真正的人类银屑病没有区别的皮肤表型((Gilhar等人，2002)。

在本文所用的实验系统中，NK注射两周后(植入6周后)，对3组小鼠用病灶内给予的PBS、局部用地塞米松和病灶内给予的IGFBP7进行治疗。治疗两周后(植入8周后)，通过组织学分析监测治疗效果。

如所预期的，所有用PBS治疗的5只小鼠都表现出典型的银屑病组织学特征，包括棘层肥厚(棘层增厚)、表皮突延伸、角化不全(角质层的细胞留有细胞核)，和过度角化(角质层增厚)和真皮中密集的单核浸润(图24)。所有这些特征在用地塞米松治疗的所有5只小鼠中均未出现(图25)。地塞米松是一种合成的类固醇，用作抗炎药物和免疫抑制剂。在用rIGFBP7治疗的那组小鼠中，三只小鼠完全恢复(图26)，一只小鼠部分恢复(50％)，一只仅表现出银屑病组织学特征。有趣的是，当用逆转表皮中银屑病表型的rIGFBP7治疗时，还可在真皮中看到单核浸润细胞，但数量较少，提示IGFBP7主要靶向于疾病发病机制的表皮组分。

结果分析

IGFBP7调节角质化细胞的增生、分化和凋亡-胰岛素样生长因子(IGF)-结合蛋白(IGFBP7)属于参与IGF信号调节的IGFBP超家族。IGFBP7涉及多个过程如性激素释放的调节、丝裂信号的中和、衰老的诱导、癌细胞中粘附和血管生成的调节。另外，发现银屑病表皮中的IGFBP7是下调的，用UVB光疗可将它的表达恢复至正常(Hochberg M.，等人，2007)。

本发明人研究了IGFBP7对与银屑病主要特征潜在关联的4个参数的影响：细胞增生、分化、凋亡和衰老。本发明人发现在HaCat细胞和原代人角质化细胞中低的IGFBP7表达引发细胞增生，阻断分化、减少凋亡，而对衰老速率没有影响。相反地，发现rIGFBP7可诱导细胞凋亡和减少细胞增生。

在IGFBP7下调的体外系统中研究了IGFBP7在调节银屑病中异常的角质化细胞增生和分化中的作用。用IGFBP7特异性shRNA-表达慢病毒载体转染HaCat细胞和原代人角质化细胞。发现IGFBP7的下调可增强该两个系统中的角质化细胞增生。另外，IGFBP7的下调与角质化细胞对TNF-α诱导的凋亡的易感性显著降低关联，但对衰老没有任何影响。还发现，IGFBP7的下调阻断了与钙诱导的人角质化细胞分化关联的基因的表达。

另外，发现重组IGFBP7能显著性地抑制角质化细胞增生和增强角质化细胞凋亡。这些数据使IGFBP7处于作为角质化细胞增生和分化的主要调节子的地位，提示这种蛋白在病理生理学和过度增生紊乱如银屑病的治疗中的潜在作用。

本发明人利用离体模型证明了，IGFBP7的减少可引起银屑病表型(实施例6，图22A-22B)。另外，本发明人利用体内模型证明了，重组IGFBP7可治愈人-小鼠嵌合模型中的银屑病(图23-26，实施例7)。

总之，这些数据使IGFBP7处于作为角质化细胞增生和分化的关键调节子的地位，因此建议将这种蛋白作为治疗各种与角质化细胞异常增生和分化相关的病状的有吸引力的靶点。

虽然本发明已结合其特定的实施方式进行描述，但显然，对于本领域技术人员而言，许多替换、修改和变更都是很明显的。因此，本发明旨在包括落在所附权利要求的精神和宽范围内的所有此类替换、修改和变更。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用完整地合并在本说明书中，如同每篇单独的出版物、专利或专利申请单独地明确被指出通过引用合并在此。另外，本申请中任何参考文献的引用或列出不应该被解释为承认此类参考文献是本发明的现有技术。对于使用的章节标题，它们不应该被解释为必然具有限制性。

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Claims (13)

1.一种治疗特征为过度增生角质化细胞的病状的方法，包括向需要其的主体给予治疗有效量的胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)多肽或编码所述IGFBP7多肽的核酸序列，从而治疗所述特征为过度增生角质化细胞的病状。

2.一种药物组合物，包含胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)多肽或编码所述IGFBP7多肽的核酸序列以及药学可接受载体，所述药物组合物配制用于局部给予。

3.胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)多肽或编码所述IGFBP7多肽的核酸序列在制造用于治疗特征为过度增生角质化细胞的病状的药物中的用途。

4.根据权利要求2所述的药物组合物，被鉴定用于治疗特征为过度增生角质化细胞的病状。

5.根据权利要求1所述的方法、根据权利要求2或4所述的药物组合物、或根据权利要求3所述的用途，其中，所述IGFBP7多肽包含IGFBP7的至少一个功能性部分。

6.根据权利要求1所述的方法、根据权利要求4所述的药物组合物、或根据权利要求3所述的用途，其中，所述特征为过度增生角质化细胞的病状是银屑病。

7.根据权利要求1所述的方法、根据权利要求4所述的药物组合物、或根据权利要求3所述的用途，其中，所述特征为过度增生角质化细胞的病状选自由银屑病、扁平苔癣、毛发红糠疹(PRP)、丘疹鳞屑性疾病、皮炎和慢性单纯性苔癣所组成的组。

8.根据权利要求7所述的方法、药物组合物或用途，其中，所述皮炎选自由特应性皮炎和接触性皮炎所组成的组。

9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括向所述主体给予能够至少部分减轻所述病状的症状的药剂，其中，所述药剂适合于局部或全身给予和/或适合与光疗法一起治疗所述主体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，适合于所述局部给予的所述药剂选自由皮质类固醇、维生素D类似物或衍生物、地蒽酚、局部用维甲酸类、钙神经素抑制剂、水杨酸、煤焦油和湿润剂所组成的组。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述光疗法选自由日光光疗法、UVB光疗法、窄带UVB光疗法、光化学疗法、PUVA和准分子激光所组成的组。

12.根据权利要求9所述的方法，其中，适合于所述全身给予的所述药剂选自由维甲酸类、免疫抑制药、免疫靶向生物制剂、免疫毒素和肿瘤坏死因子(TNF)阻断剂所组成的组。

13.根据权利要求2或4所述的药物组合物，进一步包含选自于由皮质类固醇、维生素D类似物、地蒽酚、局部用维甲酸类、钙神经素抑制剂、水杨酸、煤焦油、维甲酸类、免疫抑制药、免疫靶向生物制剂、免疫毒素和TNF阻断剂所组成的组的药剂。

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