CN102016980A

CN102016980A - 用于治疗癌症的胰岛素样生长因子结合蛋白7

Info

Publication number: CN102016980A
Application number: CN2008801128537A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·格林; 纳伦德拉·瓦加佩耶
Original assignee: University of Massachusetts UMass
Current assignee: University of Massachusetts UMass
Priority date: 2007-09-11
Filing date: 2008-09-11
Publication date: 2011-04-13
Also published as: CA2699290A1; EP2201562B1; EP2201562A2; CA2699290C; EP2201562A4; EP3399520A1; US8034792B2; EP3399520B1; KR20100065189A; CA2999440A1; JP2011507801A; WO2009036188A2; US8598135B2; WO2009036188A3; US20120094925A1; US20140178339A1; US20090142302A1; CA2999440C; US9248163B2

Abstract

治疗受试者中的肿瘤的方法包括鉴定患有、有风险患有、或怀疑患有肿瘤的受试者，并且若所述肿瘤具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或表达活化的或致癌性的BRAF或RAS，则对所述受试者施用有效量的IGFBP7剂。

Description

用于治疗癌症的胰岛素样生长因子结合蛋白7

相关申请

本申请要求2007年9月11日提交的美国临时专利申请流水号60/993,211和2008年8月27日提交的美国临时专利申请流水号61/092,230的权益。通过参考而将两篇在先申请的全部内容完整收入本文。

发明领域

本发明涉及用包含多肽的药剂(agent)治疗癌症。

发明背景

活化性V-Raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1(BRAF)突变在许多类型的癌症(包括50-70％的黑素瘤、15％的结肠直肠癌和卵巢癌、和36-69％的乳头状甲状腺癌)中是普遍的(综述于Davies等，2002，Nature，417：949-954；及Namba等，2003，J.Clin.Endocr.Metab.，88：4393-97)。也已经在多至82％的良性黑素细胞肿瘤(痣)中鉴定出活化性BRAF突变(Pollock等，2003，Nature Genet.，33：19-20)。最常见的活化性BRAF突变是第600位处用谷氨酸对缬氨酸的替代(V600E；先前鉴定为V599E)。此突变产生有高度活性的激酶，其刺激组成型胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号传导。已经显示了BRAFV600E的表达在培养的人成纤维细胞(Zhu等，1998，Genes Dev.，12：2997-3007)和人黑素细胞(Michaloglou等，2005，Nature，436：720-724)中及在体内在瘤前痣(preneoplasticnevi)(Michaloglou等，2005，Nature，436：720-724)中诱导衰老。

发明概述

本公开内容部分基于如下令人惊讶的发现，即胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)在具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导的细胞，例如表达活化形式的BRAF或RAS病毒癌基因同系物(RAS)(例如成神经细胞瘤RAS病毒癌基因同系物(NRAS)、V-KI-RAS2柯斯顿(Kirsten)大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)、V-HA-RAS Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(HRAS))的细胞中诱导衰老(senescence)和/或凋亡(apoptosis)。本文描述了使用IGFBP7剂来诊断和治疗肿瘤(例如癌症)、诱导细胞凋亡、诱导细胞衰老、和抑制细胞增殖的方法。

一方面，本申请的特征为治疗受试者中的肿瘤的方法，其如下实现，即鉴定患有、有风险患有、或怀疑患有肿瘤的受试者；并对所述受试者施用有效量的IGFBP7剂，由此治疗所述肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症(例如黑素瘤、癌瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠直肠癌、或乳头状甲状腺癌)。在一些实施方案中，所述肿瘤具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导。在一些实施方案中，所述肿瘤的生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径。在一些实施方案中，所述肿瘤表达活化的或致癌性的BRAF或RAS(例如NRAS、KRAS、或HRAS)。在一些实施方案中，所述活化的或致癌性的BRAF具有残基600处缬氨酸突变成谷氨酰胺的突变(BRAFV600E)。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括评估来自所述受试者的样品以确定增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导的存在，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或表达活化的或致癌性的BRAF或RAS，并基于增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导的存在，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或表达活化的或致癌性的BRAF或RAS来选择进行治疗的受试者。在一些实施方案中，所述样品包括来自肿瘤的细胞、核酸、或多肽。在一些实施方案中，所述活化的或致癌性的BRAF具有残基600处缬氨酸突变成谷氨酰胺的突变(BRAFV600E)。

另一方面，本申请的特征为在如下的细胞(例如肿瘤细胞)中诱导衰老的方法，包括给所述细胞施用有效量的IGFBP7剂，所述细胞具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或表达活化的或致癌性的BRAF或RAS(例如NRAS、KRAS、或HRAS)。在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。

又一方面，本申请的特征为在如下的细胞(例如肿瘤细胞)中诱导凋亡的方法，包括对所述细胞施用有效量的IGFBP7剂，所述细胞具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或表达活化的或致癌性的BRAF或RAS(例如NRAS、KRAS、或HRAS)。

另一方面，本申请的特征为抑制如下细胞(例如肿瘤细胞)的增殖的方法，其中所述方法包括对所述细胞施用有效量的IGFBP7剂，所述细胞具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或表达活化的或致癌性的BRAF或RAS(例如NRAS、KRAS、或HRAS)。

又一方面，本申请的特征为在含有如下细胞的肿瘤受试者中抑制生长(例如转移性生长(metastatic))的方法，包括对所述受试者施用有效量的IGFBP7剂，所述细胞具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或表达活化的或致癌性的BRAF或RAS(例如NRAS、KRAS、或HRAS)。

另一方面，本申请的特征为IGFBP7剂在制备用于治疗受试者中的肿瘤或癌症(例如黑素瘤、癌瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠直肠癌、或乳头状甲状腺癌)的药物中的用途。在一些实施方案中，所述肿瘤具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导(signaling)，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或表达活化的BRAF或RAS(例如NRAS、KRAS、或HRAS)。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是转移性的。

又一方面，本申请的特征为用于治疗受试者中的肿瘤或癌症(例如黑素瘤、癌瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠直肠癌、或乳头状甲状腺癌)的分离的IGFBP7剂。在一些实施方案中，所述肿瘤具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或表达活化的BRAF或RAS(例如NRAS、KRAS、或HRAS)。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是转移性的。

在一些实施方案中，所述IGFBP7剂是包含与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：7至少80％相同(例如至少85％、90％、95％、98％、或99％相同)的多肽的组合物。所述多肽可以与异源部分(例如异源多肽序列)偶联。在一些实施方案中，所述IGFBP7剂包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7的功能片段或域。可以例如表面(topically)、系统、或局部(locally)(例如通过药物释放植入物)施用所述IGFBP7剂。

在一些实施方案中，通过将诱导IGFBP7或其活性片段或类似物表达的组合物(例如编码与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7至少80％同一性(例如至少85％、90％、95％、98％、或99％同一性)的多肽的核酸)导入受试者中来施用所述IGFBP7剂。所述核酸可以在载体，例如病毒载体(例如腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、或慢病毒载体)中。在一些实施方案中，通过将含有编码与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7至少80％相同(例如至少85％、90％、95％、98％、或99％相同)的多肽的核酸的细胞导入受试者中来施用所述IGFBP7剂，所述细胞分泌所述多肽(the IGFBP7agent is administeredby introducing into the subject a cell that a nucleic acid encoding a polypeptide atleast 80％identical(e.g.，at least 85％，90％，95％，98％，or 99％identical)to SEQID NO：1 or SEQ ID NO：7that secretes the polypeptide)。

另一方面，本申请的特征为诊断损伤(例如黑素细胞皮肤损伤)的方法，包括：获得损伤(例如黑素细胞皮肤损伤)样品(例如组织样品、细胞样品、蛋白质样品、或核酸样品)，并测定所述样品中的IGFBP7表达，其中若所述样品可检测地表达IGFBP7，则所述损伤诊断为良性(例如黑素细胞痣)，且其中若所述样品不表达IGFBP7，则所述损伤诊断为癌性(例如黑素瘤)。在一些实施方案中，所述方法包括测定所述样品是否具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活是否依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或是否含有活化的BRAF或RAS(例如BRAFV600E)，并且若所述样品表达IGFBP7并具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或含有活化的BRAF或RAS，则所述损伤诊断为良性(例如黑素细胞痣)。若所述样品不表达IGFBP7并具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或含有活化的BRAF或RAS，则所述损伤诊断为癌性(例如黑素瘤)。在一些实施方案中，所述方法包括测定所述样品是否具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活是否依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或是否含有活化的BRAF或RAS(例如BRAFV600E)，并且若所述样品表达IGFBP7并具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或含有活化的BRAF或RAS，则所述损伤诊断为良性(例如黑素细胞痣)，且若所述样品表达IGFBP7但没有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活不依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或不含活化的BRAF或RAS，则所述损伤诊断为癌性(例如黑素瘤)。

“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指任何肽连接的氨基酸链，不管长度或翻译后修饰。

如本文中所使用的，“有风险形成癌症”(或“有形成癌症的风险”)的受试者指具有形成癌症的素因(predisposition)，即形成癌症的遗传或家族素因，或者已经暴露于能导致癌症的条件的受试者。从上文出发，会显而易见的是，“有风险形成癌症”的受试者不是所有受试者。

“怀疑患有癌症的”受试者指具有癌症的一种或多种症状的受试者。癌症症状是本领域技术人员公知的，包括但不限于体重减轻、虚弱(weakness)、过度疲劳(excessive fatigue)、进食困难(difficulty eating)、食欲不振(loss ofappetite)、不常见的痣特征(unusual mole feature)、新色素沉着皮肤区(newlypigmented skin area)、皮肤生长、皮肤溃疡、皮肤肿块(skin lump)、慢性咳嗽(chronic cough)、气喘恶化(worsening breathlessness)、呼吸困难(breathingdifficulty)、淋巴结肿大(enlarged lymph node)、咳血(coughing up blood)、血尿(blood in the urine)、血便(blood in stool)、恶心(nausea)、呕吐(vomiting)、肝转移(liver metastases)、肺转移(lung metastases)、骨转移(bone metastases)、乳房或乳头变化(breast or nipple change)、乳头溢液(nipple discharge)、肚胀(abdominal fullness)、胃气胀(bloating)、腹腔积水(fluid in peritoneal cavity)、便秘(constipation)、腹胀(abdominal distension)、结肠穿孔(perforation ofcolon)、急性腹膜炎(acute peritonitis)(感染、发热、疼痛)、阴道出血(vaginalbleeding)、疼痛、呕血(vomiting blood)、大量出汗(heavy sweating)、发热、高血压(high blood pressure)、贫血(anemia)、腹泻(diarrhea)、黄疸(jaundice)、头晕(dizziness)、受寒(chill)、肌肉痉挛(muscle spasm)、结肠转移(colonmetastases)、肺转移(lung metastases)、膀胱转移(bladder metastases)、肝转移(liver metastases)、骨转移(bone metastases)、肾转移(kidney metastases)、胰转移(pancreas metastases)、吞咽困难(difficulty swallowing)等。例如，已经被内科医生诊断为患有癌症的患者仍被怀疑患有癌症。

术语“癌症”指具有自主生长能力的细胞。此类细胞的例子包括具有以快速增殖的细胞生长表征的异常状态或状况的细胞。该术语想要包括癌性生长，例如肿瘤；致癌性过程、转移性组织、和恶性转化的细胞、组织、或器官，不管组织病理学类型或侵入性阶段。还包括多种器官系统诸如呼吸、心血管、肾、生殖、血液学、神经学、肝、胃肠、和内分泌系统的恶性；以及腺癌，包括恶性诸如大多数结肠癌、肾细胞癌瘤、前列腺癌和/或睾丸肿瘤，非小细胞肺癌(non-small cell carcinoma of the lung)、小肠癌(cancer of the smallintestine)、和食道癌(cancer of the esophagus)。“天然发生的”癌症包括不是以实验方法通过将癌细胞植入受试者中诱导的任何癌症，并且包括例如自发发生的癌症、通过将患者暴露于致癌原引起的癌症、源自于转基因癌基因的插入或肿瘤抑制基因的敲除的癌症、和由感染(例如病毒感染)引起的癌症。术语“癌瘤”是本领域公认的，指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤。

除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常的理解具有相同的意义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用与本文中所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但是下文描述了合适的方法和材料。通过提及而完整收录本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、和其它参考文献。在矛盾的情况中，应当以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法、和实施例仅是例示性的，而并不意图是限制性的。

在下文的附图和描述中列出了本发明的一个或多个实施方案的详情。从描述和附图及权利要求书出发，本发明的其它特征、目的、和优点会是显而易见的。

附图简述

图1A是全基因组shRNA筛选BRAFV600E介导的对细胞增殖的阻断所需要的基因的示意性汇总。

图1B是描绘17种BRAFV600E/BJ KD细胞系增殖的一组照片表示。将稳定表达指定的shRNA的1x10⁴个BJ成纤维细胞在12孔板形式中培养，用BRAFV600E表达逆转录病毒感染，并在14天后用结晶紫染色。NS，非沉默对照shRNA。

图1C是一幅柱状图，其描绘了17种BRAFV600E/黑素细胞KD细胞系的定量增殖测定法。用BRAFV600E表达逆转录病毒感染稳定表达指定的shRNA的BJ成纤维细胞，并在14天后通过锥虫蓝(trypan)排除测试来分析。相对于正常黑素细胞的生长表示BRAFV600E/黑素细胞的生长。对于BRAFV600E/黑素细胞KD细胞系，相对于相应黑素细胞KD细胞系在没有BRAFV600E表达的情况中的生长来将数值标准化。误差工形线(bar)表示标准误差。

图1D是一幅柱状图，其描绘了17种BRAFV600E/黑素细胞KD细胞系的DNA复制测定法。通过BRAFV600E表达后4天的BrdU掺入来监测DNA复制。

图1E是一幅柱状图，其描绘了17种BRAFV600E/黑素细胞KD细胞系的凋亡。通过BRAFV600E表达后4天的膜联蛋白V-PE染色来监测凋亡。

图1F是一组免疫印迹，其描绘了在17种BRAFV600E/黑素细胞KD细胞系之每一种中监测p16^INK4a的诱导和组蛋白3赖氨酸9(H3K9)的乙酰化的免疫印迹分析。β-ACTIN(ACTB)作为加样对照监测。

图2A(顶部)是对来自正常黑素细胞、BRAFV600E/黑素细胞、稳定表达IGFBP7shRNA的BRAFV600E/黑素细胞的CM中或用I-IGFBP7抗体处理以免疫消减IGFBP7的BRAFV600E/黑素细胞CM中的IGFBP7水平的分析。

图2A(底部)是一幅柱状图，其描绘了添加上文所描述的不同CM后未处理的黑素细胞的增殖。添加CM后14天测量增殖，并相对于未处理的黑素细胞的生长标准化。误差工形线表示标准误差。

图2B是纯化的、重组IGFBP7(rIGFBP7)的考马斯染色凝胶。在左侧按kDa显示了分子量标志物的位置。

图2C是一幅线图，描绘了监测处理后14天rIGFBP7对黑素细胞生长的影响的增殖测定法。

图2D是一组12幅显微照片，其描绘了对用表达空载体(第一栏)或BRAFV600E(第二栏)的逆转录病毒感染的黑素细胞，或用来自BRAFV600E/黑素细胞的CM(第三栏)或rIGFBP7(第四栏)处理的黑素细胞的β-半乳糖苷酶染色。以10X、20X和40X的放大率显示图像。

图2E是一组柱状图，其描绘了未处理的黑素细胞、或稳定表达非沉默(NS)或IGFBP7shRNA的黑素细胞的生长速率。每天监测细胞数目达6天。

图3A是监测来自人黑素瘤细胞系的CM中的IGFBP7表达的免疫印迹分析(顶部)和相关的柱状图(底部)，该柱状图显示了对含有活化性BRAFV600E突变(SK-MEL-28、MALME-3M、WM793B、WM39、和WM278)、活化性RASQ61R突变(SK-MEL-2、SK MEL-103、和WM1366)、或者BRAF和RAS两者都为野生型(CHL、SK-MEL-31、WM1321、和WM3211)的人黑素瘤细胞系的IGFBP7表达的定量实时RT-PCR分析。误差工形线表示标准误差。

图3B是一幅柱状图，其描绘了用rIGFBP7处理后24小时的人黑素瘤细胞系的增殖。相对于相应的细胞系在没有添加rIGFBP7的情况中的生长来将增殖标准化。误差工形线表示标准误差。

图3C是一幅柱状图，其描绘了用rIGFBP7处理后24小时的人黑素瘤细胞系的凋亡。

图3D是在存在或没有rIGFBP7的情况中且稳定表达非沉默(NS)、SMARCB1或BNIP3L shRNA的SK-MEL-28细胞中的SMARCB1、BNIP3L和活化的胱天蛋白酶3(act-CASP3)表达的一组免疫印迹。β-肌动蛋白(ACTB)作为加样对照监测。

图3E是一幅柱状图，其描绘了在SK-MEL-28细胞中STAT1募集至SMARCB1启动子，如通过ChIP分析所测量的。

图3F是一对柱状图，其描绘了用NS或STAT1 siRNA处理后SK-MEL-28细胞中的SMARCB1(左侧)或STAT1(右侧)mRNA水平，如通过qRT-PCR所测量的。

图3G是一对柱状图，其描绘了在SK-MEL-28细胞中SMARCB1(左侧)或BRG1(右侧)募集至BNIP3L启动子，如通过ChIP分析所测量的。

图3H是一幅线图，其描绘了SK-MEL-28细胞的凋亡。将SK-MEL-28细胞与rIGFBP7一起温育0、2、6、12、或24小时，之后清洗细胞，并在缺乏rIGFBP7的培养基中培养。然后在24小时后定量凋亡。

图4A是一组免疫印迹，其监测用渐增浓度的rIGFBP7(0.2、1.0、2.0、5.0或10μg/ml)处理24小时的SK-MEL-28细胞中的磷酸-ERK和总ERK的水平。

图4B是一幅柱状图，其描绘了SK-MEL-28细胞对rIGFBP7的敏感性。用空表达载体或组成性活性ERK2突变体转染细胞。用rIGFBP7处理后24小时分析细胞生长，并相对于相应的细胞系在没有添加rIGFBP7的情况中的生长标准化。误差工形线表示标准误差。

图4C是一组免疫印迹，其监测用空表达载体或组成性活化的ERK2突变体稳定转染的SK-MEL-28细胞中的BNIP3L、act-CASP3、磷酸-ERK和总ERK的表达。不处理或用10μg/ml rIGFBP7处理SK-MEL-28细胞达24小时，如标示的，之后收获细胞。

图4D是一组免疫印迹，其监测用rIGFBP、MEK抑制剂(MEK-i)或RAF抑制剂(RAF-i)处理后24小时的SK-MEL-28细胞中的BNIP3L、SMARCB1、act-CASP3、磷酸-ERK和总ERK的表达。

图5A是一幅线图，其描绘了用rIGFBP7局部处理的异种移植小鼠的肿瘤体积。将SK MEL 28或SK-MEL-31细胞皮下注射入裸鼠体侧中，并在3、6、和9天后(箭)，在肿瘤位置处给小鼠注射rIGBP7或(作为对照)PBS。误差工形线表示标准误差。

图5B是一副线图，其描绘了用rIGFBP7系统处理的异种移植小鼠的肿瘤体积。将SK-MEL-28或SK-MEL-31细胞注射入裸鼠的体侧中。在肿瘤达到100mm³的大小时，在第6天、第9天、和第12天时(箭)通过尾静脉注射系统施用100μg rIGFBP7。

图5C是一幅柱状图，其描绘了rIGFBP7对肿瘤生长的剂量依赖性抑制。将SK-MEL-28细胞注射入裸鼠的体侧中，如(图5B)中所描绘的，之后通过尾静脉注射系统施用2、20、50、100、或250μg rIGFBP7。注射后第21天时测量肿瘤体积。

图6A是一组免疫组织化学载玻片，其描绘了正常人皮肤(正常皮肤—第1栏)、痣(BRAFV600E阳性—第2栏和第3栏)、和黑素瘤(BRAFV600E-第4栏和第5栏；和BRAF-wt-第6栏和第7栏)样品中的IGFBP7表达。用苏木精和曙红(H&E)对样品染色(第1行)。以2X(第2行)和/或20X(第3行)放大率显示描绘IGFBP7表达的图像。箭头标示正常皮肤中的IGFBP7阳性黑素细胞。

图6B是活化的BRAF如何促进衰老的示意性汇总。在BRAF-wt黑素细胞中，通过BRAF-MEK-ERK途径的正常信号传导导致IGFBP7的诱导，继而其抑制通过自分泌/旁分泌途径的BRAF-MEK-ERK途径；结果是受控的增殖。在BRAFV600E阳性痣中，BRAF-MEK-ERK途径的组成性活化导致IGFBP7的诱导，其抑制所述途径，并活化衰老基因。在BRAFV600E阳性黑素瘤中，IGFBP7表达是丧失的，并且细胞经历不受控的增殖。外源性IGFBP7的添加抑制BRAF-MEK-ERK途径，并活化凋亡基因。

图7A是人IGFBP7的多肽序列(SEQ ID NO：1；GenBank登录号NP_001544)。

图7B是人IGFBP7mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：2；GenBank登录号NM_001553)。

图8A是人BRAF的多肽序列(SEQ ID NO：3；GenBank登录号NP_004324)。

图8B是人BRAF mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：4；GenBank登录号NM_004333)。

图9A是人NRAS的多肽序列(SEQ ID NO：5；GenBank登录号NP_002515)。

图9B是人NRAS mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：6；GenBank登录号NM_002524)。

图10A是IGFBP7启动子的示意图；通过垂直线按比例显示CpG二核苷酸的位置。

图10B是对黑素细胞痣(BRAFV600E)、黑素瘤(BRAF wt)、和黑素瘤(BRAFV600E)中的IGFBP7启动子的亚硫酸氢盐序列分析。每个圆圈表示CpG二核苷酸：空心(白色)圆圈表示未甲基化的CpG位点，而实心(黑色)圆圈标示甲基化的CpG位点。每行表示单克隆。

图10C是对一组指定的黑素瘤细胞系中的IGFBP7启动子的亚硫酸氢盐序列分析。每个圆圈表示CpG二核苷酸：空心(白色)圆圈表示未甲基化的CpG位点，而实心(黑色)圆圈标示甲基化的CpG位点。每行表示单克隆。

图10D是一幅柱状图，其描绘了用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷酸(5-aza)处理后黑素瘤细胞系中的IGFBP7mRNA水平，如通过qRT-PCR所测量的。误差工形线表示标准误差。

图11A是一幅柱状图，其描绘了指定的人癌细胞系对IGFBP7介导的凋亡的敏感性。通过工形线标示RAS/BRAF突变状态，如图例上所显示的。

图11B是一幅柱状图，其描绘了指定的人癌细胞系对由MEK抑制剂U0216实现的生长抑制的敏感性。通过工形线标示RAS/BRAF突变状态，如图例上所显示的。

图12A是用于测定IGFBP7对异种移植小鼠中的转移性肺肿瘤的影响的实验方案的示意图。

图12B和图12C是小鼠的一对照片表示，其显示了用A375(Fluc-IRES-GFP)细胞注射后第6天时体内GFP表达细胞的浓度。图12B，PBS-对照处理的；图12C，IGFBP7处理的。

图12D是描绘实验过程里对小鼠存活的Kaplan-Meier分析的图。

图13A是用于测定IGFBP7对异种移植小鼠中的转移性肺肿瘤的影响的实验方案的示意图。

图13B是描绘实验过程里对小鼠存活的Kaplan-Meier分析的图。

发明详述

本公开内容包括用IGFBP7剂治疗肿瘤(例如癌症)、诱导细胞凋亡、诱导细胞衰老、和抑制细胞增殖的方法。

IGFBP7剂

可以与本文中所描述的方法一起使用的IGFBP7剂指如下的药剂，其包含IGFBP7多肽序列和，备选地，一种或多种多肽或非多肽部分(moieties)，从而所述药剂具有rIGFBP7在体外抑制人BJ原代包皮成纤维细胞增殖的能力的至少25％(例如至少：30％；40％；50％；60％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；97％；98％；99％；99.5％，或100％或甚至更大)(参见实施例1)。例示性药剂包括IGFBP7的片段和类似物(参见下文)。IGFBP7多肽序列可以包括成熟的、可溶性IGFBP7多肽(例如SEQ ID NO：1的残基24至282、25至282、26至282、27至282、28至282、或29至282)、IGFBP7的一个或多个域、或其片段或变体。IGFBP7的例示性片段包含来自SEQ ID NO：1的残基84至103的序列(GMECVKSRKRRKGKAGAAAG；SEQ ID NO：7)。

在某些实施方案中，IGFBP7多肽包括与整个或部分天然存在的IGFBP7多肽基本上相同的序列。与本文所描述的IGFBP7多肽序列“基本上相同的”多肽具有如下的氨基酸序列，其与由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7表示的IGFBP7多肽的氨基酸序列至少65％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，例如100％)相同。此外，具有多至50，例如1、3、5、10、15、20、25、30、或40处氨基酸插入、删除、或替代(例如保守氨基酸替代)的IGFBP7多肽在本文所描述的组合物和方法中会是有用的。“保守氨基酸替代”指如下的替代，其中氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中已经限定了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

可以使用BLAST 2.0程序(其对于公众在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST可获得)来测定两种氨基酸序列之间的百分比同一性。使用缺省参数(BLOSUM62矩阵，缺口存在代价(gap existence cost)11，每残基缺口代价1，和λ比率0.85)来实施序列比较。BLAST程序中所使用的数学算法记载于Altschul等，1997，Nucleic Acids Research，25：3389-3402。

本文中所描述的方法中有用的IGFBP7多肽可以是，但不限于重组多肽和天然存在多肽。IGFBP7多肽可以获自任何人或哺乳动物物种，并且包括具有所公开的活性的可变剪接形式和其它同等型。已经在黑猩猩(例如GenBank登录号XP_517274)、猕猴(例如GenBank登录号XP_001083041、XP_001082658)、牛(例如GenBank登录号XP_873466)、犬(例如GenBank登录号XP_850270、XP_861128)、小鼠(例如GenBank登录号Q61581)、和大鼠(例如GenBank登录号NP_001013066)中鉴定出与人IGFBP7多肽具有相似性的非人IGFBP7多肽。

新方法中也有用的是融合蛋白，其中将IGFBP7多肽的一部分与无关的多肽(例如标志多肽或纯化标签)融合以创建融合蛋白。例如，可以将多肽与肽标签融合以便于纯化(例如与六组氨酸标签或FLAG标签融合以便于纯化细菌表达的多肽或与血凝素标签或FLAG标签融合以便于纯化真核细胞中表达的多肽)。还有用的是例如包含第一部分和第二部分的多肽；所述第一部分包括例如IGFBP7多肽，而所述第二部分包括例如可检测的标志物或血清蛋白质，例如免疫球蛋白恒定区，或人血清清蛋白。

IGFBP7的氨基端区域(SEQ ID NO：1的多至残基81)含有与其它胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)具有同源性的区域。此区域包括在残基32、35、40、48、57、59、60、63、71、和81处的保守半胱氨酸残基和残基56至63处的保守“GCGCCxxC”域(参见Kim等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.94：12981-86)。IGFBP7的其它保守域包括在约残基118至156处的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂和滤泡素抑制素样域(保守域数据库登录号cd00104)和在约残基160-162至248处的免疫球蛋白域(细胞粘附分子亚家族)(保守域数据库登录号cd00931)。可以在生成IGFBP7多肽的片段、类似物和变体时使用保守的残基和域(domain)。

IGFBP7剂可以在多肽上的一个或多个位点(例如在氨基或羧基端)具有一处或多处化学修饰(例如翻译后修饰)。化学修饰的方法是本领域技术人员公知的，并且可以用于改变IGFBP7剂的一项或多项特性，例如活性、稳定性、保留、或药动学。例示性修饰包括糖基化和PEG化。IGFBP7在SEQID NO：l的残基171至173处含有推定的N糖基化位点。对IGFBP4的PEG化记载于US 2006/0100144。可以与IGFBP7剂一起使用类似的修饰和方法。

IGFBP7剂还可以是IGFBP7多肽(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7)的肽模拟物型式，其功能片段或变体。可以依照本领域已知的用于生成肽模拟物的方法来修饰这些多肽。参见例如Kazmierski，W.M.编，PeptidomimeticsProtocols，Human Press(Totowa NJ 1998)；Goodman等编，Houben-WeylMethods of Organic Chemistry：Synthesis of Peptides and Peptidomimetics，Thiele Verlag(New York 2003)；及Mayo等，J.Biol.Chem.，278：45746(2003)。在一些情况中，本文中所公开的肽和片段的这些修饰的肽模拟物型式相对于非肽模拟肽展现出增强的体内稳定性。

用于创建肽模拟物的方法包括用D氨基酸对映体替换肽序列中的一个或多个(例如所有)氨基酸。此类序列在本文中称为“逆”序列。在另一种方法中，氨基酸残基的N端至C端次序是颠倒的，从而氨基酸残基从初始肽的N端至C端的次序变成氨基酸残基从经过修饰的肽模拟物中的C端至N端的次序。此类可以称为“反”序列。

肽模拟物可以是逆(retro)和反型式(inverso)两者，即本文中所公开的肽的“逆-反”型式。新的肽模拟物可以由如下安排的D-氨基酸构成，使得氨基酸残基从肽模拟物中的N端至C端的次序对应于氨基酸残基从初始肽中的C端至N端的次序。

用于制备肽模拟物的其它方法包括用化学独特的但公认的氨基酸功能类似物，即人工氨基酸类似物替换肽中的一个或多个氨基酸残基。人工氨基酸类似物包括β-氨基酸、β-取代的β-氨基酸(“β³-氨基酸”)、氨基酸的含磷类似物，诸如α-氨基磷酸和α-氨基次膦酸、和具有非肽连接的氨基酸。可以使用人工氨基酸来创建肽模拟物(peptidomimetics)，诸如类肽(peptoid)寡聚物(例如类肽酰胺或酯类似物)，β-肽、环肽、寡尿素(oligourea)或寡氨基甲酸酯(oligocarbamate)肽；或杂环分子。

在本文所公开的方法中也有用的是编码本文所描述的IGFBP7剂，例如天然存在的IGFBP7多肽或者改变或删除了天然存在的氨基酸序列的IGFBP7多肽形式(例如IGFBP7的片段或类似物)的核酸分子。某些核酸可以编码在正常生理学条件下可溶的多肽。可以通过本领域已知的任何手段来在细胞内表达(例如外源表达)IGFBP7剂。为了生成表达IGFBP7剂的细胞，可以使用本领域已知的多种技术之任一种来转染、转化、或转导细胞。可以使用任何数目的本领域技术人员已知的转染、转化、和转导方案，例如那些记载于Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York.N.Y.，或多种商品化的试剂盒(例如Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，Calif.)中的。此类技术可以产生稳定的或瞬时的转化体。一种合适的转染技术是电穿孔，其可以使用商品化的设备对多种细胞类型(包括哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌)实施。对特定的宿主细胞类型以实验方式确定用于电穿孔的最佳条件(包括电压、电阻和脉冲长度)，并且可以自制造商获得用于优化电穿孔的一般准则。

施用IGFBP7剂的例示性方法包括向受试者中导入编码本文所描述的IGFBP7剂的核酸。在一些实施方案中，编码IGFBP7剂的核酸包含在载体内，例如如包含表达IGFBP7剂的核酸的病毒。例示性的病毒载体包括腺病毒(综述于Altaras等，2005，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，99：193-260)、腺伴随病毒(综述于Park等，2008，Front.Biosci.，13：2653-59；还可参见Williams，2007，Mol.Ther.，15：2053-54)、细小病毒、慢病毒、逆转录病毒(综述于Tai等，2008，Front.Biosci.，13：3083-95)、和单纯疱疹病毒。Patil等，2005，AAPS J.，7：E61-77中综述了投递核酸的方法，通过提及而将其完整收入本文。

在一些实施方案中，向癌细胞或癌细胞附近的细胞直接施用表达IGFBP7多肽的核酸。在一些实施方案中，向离体细胞施用表达IGFBP7多肽的核酸，然后对受试者在肿瘤附近施用所述离体细胞。

可以通过本领域已知的任何手段来生成IGFBP7剂，例如通过化学合成、重组方法、或者自天然生成IGFBP7的细胞的分离来实现。纯化和分离包含多肽的分子的方法也是本领域技术人员公知的。从培养细胞纯化IGFBP7的例示性方法记载于Yamauchi等，1994，Biochem J.，303：591-598。

IGFBP7的片段和类似物的生成

片段的生成

可以以数种方式例如重组方式、通过蛋白水解消化、或者通过化学合成来生成蛋白质片段。可以通过从编码多肽的核酸的一端(对于末端片段)或两端(对于内部片段)除去一个或多个核苷酸来生成多肽的内部或末端片段经过诱变的DNA的表达生成多肽片段。如此用“末端步切(end-nibbling)”内切核酸酶进行的消化可以生成编码一系列片段的DNA。也可以通过随机剪切、限制性消化或上文所讨论的方法的组合来生成编码蛋白质片段的DNA。

也可以使用本领域已知的技术诸如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学来化学合成片段。例如，可以将本发明的肽任意分成具有想要的长度且没有片段交叠的片段，或者分成具有想要的长度的交叠片段。

类似物的生成：通过随机方法来生成经过改变的DNA和肽序列

可以通过编码蛋白质或蛋白质的特定域或区域的DNA的随机诱变来制备蛋白质的氨基酸序列变体。有用的方法包括PCR诱变和饱和诱变。还可以通过合成一套简并寡核苷酸序列来生成随机氨基酸序列变体的文库。(用于筛选变体文库中的蛋白质的方法在本文中的别处)。

PCR诱变

在PCR诱变中，使用降低的Taq聚合酶保真度来将随机突变引入DNA的克隆片段中(Leung等，1989，Technique 1：11-15)。这是一种非常有力且相对快速的引入随机突变的方法。在降低通过Taq DNA聚合酶进行的DNA合成的保真度的条件下(例如通过使用dGTP/dATP比率为5和向PCR反应添加Mn²⁺)使用聚合酶链式反应(PCR)来扩增要诱变的DNA区。将所扩增DNA片段的集合(pool)插入合适的克隆载体中以提供随机突变体文库。

饱和诱变

饱和诱变容许将大量的单碱基替代快速引入克隆的DNA片段中(Mayers等，1985，Science 229：242)。此技术包括突变的产生(例如通过在体外化学处理或照射单链DNA，并合成互补的DNA链)。可以通过调控处理的严格来调控突变频率，并且可以获得基本上所有有可能的碱基替代。因为此规程没有牵涉遗传选择突变型片段，所以获得中性替代及那些改变功能的替代两者。点突变的分布并不偏向于保守的序列元件。

简并寡核苷酸

还可以自一套简并寡核苷酸序列产生同系物文库。可以在自动化DNA合成仪中实施简并序列的化学合成，然后将合成的基因连接入合适的表达载体中。简并寡核苷酸的合成是本领域已知的(参见例如Narang，SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等(1981)Recombinant DNA，Proc 3rd ClevelandSympos.Macromolecules编AG Walton，Amsterdam：Elsevier第273页-第289页；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等(1984)Science198：1056；Ike等(1983)Nucleic Acid Res.11：477。已经在其它蛋白质的定向进化中采用此类技术(参见例如Scott等(1990)Science 249：386-390；Roberts等(1992)PNAS 89：2429-2433；Devlin等(1990)Science 249：404-406；Cwirla等(1990)PNAS 87：6378-6382；以及美国专利No.5,223,409，5,198,346，和5,096,815)。

类似物的生成：通过定向诱变来生成经过改变的DNA和肽序列

可以使用非随机或定向诱变技术来在特定区域中提供特定的序列或突变。可以使用这些技术来创建变体，其包含例如蛋白质的已知氨基酸序列的残基的删除、插入、或替代。可以个别地或连续地修饰突变位点，例如如下实现：(1)首先用保守氨基酸替换，然后用更激进的选择，这取决于所实现的结果，(2)删除靶残基，或者(3)在定位位点附近插入相同或不同类的残基，或者选项1-3的组合。

丙氨酸扫描诱变

丙氨酸扫描诱变是一种对于鉴定想要的蛋白质中作为用于诱变的优选位置或域的某些残基或区域有用的方法，Cunningham和Wells(Science244：1081-1085，1989)。在丙氨酸扫描中，鉴定残基或一组靶残基(例如带电荷的残基诸如Arg、Asp、His、Lys、和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替换。氨基酸的替换可以影响氨基酸与细胞中或外部的周围水性环境的相互作用。然后通过在替代位点或为替代位点引入别的或其它变体来改进那些表明对替代功能敏感性的域。如此，虽然用于引入氨基酸序列变异的位点是预先确定的，但是突变的性质本身不需要是预先预定的。例如，为了优化给定位点处的突变的性能，可以在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并且对所表达的想要蛋白质亚基变体筛选想要活性的最佳组合。

寡核苷酸介导的诱变

寡核苷酸介导的诱变是一种对于制备DNA的替代、删除、和插入变体有用的方法，参见例如Adelman等，(DNA 2：183，1983)。简言之，通过将编码突变的寡核苷酸与DNA模板杂交来改变想要的DNA，其中所述模板是单链形式的质粒或噬菌体，其含有想要的蛋白质的未改变的或天然的DNA序列。杂交后，使用DNA聚合酶来合成模板的整个第二条互补链，如此其会掺入寡核苷酸引物，并且会编码想要的蛋白质DNA中的所述变化。一般而言，可以使用长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸会具有12个至15个核苷酸，它们在编码突变的核苷酸的任一侧上与模板完全互补。这确保寡核苷酸会与单链DNA模板分子正确杂交。容易使用本领域已知的技术诸如记载于Crea等(Proc.Natl.Acad.Sci.(1978)USA，75：5765)的技术来合成寡核苷酸。

盒式诱变

用于制备变体的另一种方法，即盒式诱变基于记载于Wells等(Gene(1985)34：315)的技术。起始材料是含有要突变的蛋白质亚基DNA的质粒(或其它载体)。鉴定要突变的蛋白质亚基DNA中的密码子。在鉴定出的突变位点的每一侧上必须有独特的限制性内切核酸酶位点。若没有此类限制性位点存在，则它们可以使用用于在想要的蛋白质亚基DNA中的合适位置处引入它们的上文所描述的寡核苷酸介导的诱变方法来产生。已经将限制性位点引入质粒中后，在这些位点处切割质粒以使其线性化。使用标准规程来合成如下的双链寡核苷酸，其编码限制性位点之间的DNA的序列但含有想要的突变。使用标准技术分开合成两条链，然后杂交在一起。此双链寡核苷酸称为盒。将此盒设计成具有与线性化的质粒的末端可比较(comparable)的3’和5’末端，从而可以将其直接连接至质粒。此质粒现在含有突变的想要蛋白质亚基DNA序列。

组合诱变

也可以使用组合诱变来生成突变体。例如，比对同系物组或其它相关蛋白质的氨基酸序列，优选地，以提升(promote)有可能的最高同源性。可以选择比对序列的给定位置处出现的所有氨基酸来创建组合序列的简并集合。通过在核酸水平的组合诱变来产生变体的多样化文库，并且由多样化的基因文库编码。例如，可以以酶方法将合成寡核苷酸的混合物连接入基因序列中，使得潜在序列的简并集合作为个体肽，或者备选地，作为含有简并序列组的较大的融合蛋白组可表达。

用于筛选肽片段或同系物的文库的初级高通量(high-through-put)方法

用于筛选所生成的突变型基因产物的各种技术是本领域已知的。用于筛选大基因文库的技术通常包括将基因文库克隆入可复制的表达载体中，用所得的载体文库转化合适的细胞，并在测量想要的活性(例如对人BJ增殖的抑制)的检测的条件下表达基因。下文所描述的每种技术适合用于筛选大量通过例如随机诱变技术创建的序列的高通量分析。

活化性突变

本文中所描述的方法和组合物在包含如下细胞的癌症的治疗中是特别有用的，所述细胞具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导、生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径，和/或在BRAF信号转导途径中具有活化性突变(例如活化性BRAF或RAS(例如NRAS、HRAS、或KRAS))(参见例如Dhomen和Marais，2007，Curr.Opin.Genet.Dev.，17：31-39)。BRAF活化MAP激酶胞内信号调节激酶(MEK)，继而其磷酸化和活化胞内信号调节激酶1和2(ERK1和ERK2)。已经在大多数所测试的黑素瘤样品中，以及在来自数种其它类型的癌症的样品中找到了活化性BRAF突变。已经在数种癌症中找到了活化性RAS突变，包括黑素瘤、多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、滤泡性癌、滤泡性腺瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺腺癌、胆囊癌、胆管癌、甲状腺癌、和多种癌瘤。

可以通过例如检测细胞或细胞溶胞物中的这些蛋白质的磷酸化形式的存在来测量细胞中的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导的增强。对磷酸化的BRAF、MEK和Erk特异性的抗体可购自例如Cell Signaling Technology，Inc.(Danvers，Massachusetts)和Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，California)。

生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径的细胞在Ras-BRAF-MEK-Erk途径的成分的表达或活性受到人工抑制(例如通过药理学(例如法尼基转移酶抑制剂R115777、MEK1/2抑制剂PD184352、MEK抑制剂U0216(Cell Signaling)、MEK抑制剂PD98054(Calbiochem)、RAF抑制剂GW5074(Sigma)、BAY 43-9006、CI-1040、寄端霉素(hypothemycin)、或PD0325901)(Solit等，2006，Nature，439：358-362；Alessi等，1995，J.Biol.Chem.，270：27489-94)或遗传手段(例如用显性阴性(negative)Ras、MEK1 shRNA、或针对途径的一种成分的抑制性核苷酸进行的转染))时会展示降低的生长和/或存活。

活化的BRAF蛋白质具有下列一项或多项特性：提高的激酶活性、体内或体外向ERK的信号传导增强、NIH 3T3细胞的转化、和人包皮成纤维细胞(例如BJ成纤维细胞或原代包皮成纤维细胞)的增殖减缓。例示性的活化性BRAF点突变包括用Glu对Val600的替代(V600E；通过例如在BRAF编码序列的核苷酸1799处的T→A转换引起)、用Ile对Arg462的替代(R462I；通过例如在BRAF编码序列的核苷酸1385处的G→T转换引起)、用Ser对Ile463的替代(I463S；通过例如在BRAF编码序列的核苷酸1388处的T→G转化引起)、用Glu对Gly464的替代(G464E；通过例如在BRAF编码序列的核苷酸1391处的G→A转换引起)、用Glu对Lys601的替代(K601E；通过例如核苷酸1801处的A→G转换引起)、用Val对Gly465的替代(G465V)、用Arg(L596R)或Val(L596V)对Leu596的替代、用Arg(G468R)或Ala(G468A)对Gly468的替代、和用Gly对Asp593的替代(D593G)。还已经鉴定出由染色体重排引起的活化性BRAF突变。例如，已经报告了由染色体7q倒位引起的AKAP9和BRAF蛋白的融合，导致AKAP9基因的外显子1-8与BRAF的外显子9-18之间以符合读码框方式融合(Ciampi等，2005，J.Clin.Invest.，115：94-101)。

活化的RAS蛋白具有下列一项或多项特性：体内或体外的向RAF(例如BRAF)的信号传导增强、NIH 3T3细胞的转化、和人包皮成纤维细胞(例如原代包皮成纤维细胞BJ成纤维细胞)的增殖减缓。例示性的活化性NRAS点突变包括用Arg对Gly13的替代(G13R，通过密码子13处的G→C突变引起)和用Arg对Gln61的替代(Q61R，通过密码子61处的CAA→CGA突变引起)。还可参见Bos等，1985，Nature，315：726-730；Davis等，1984，Cytogenet.CellGenet.，37：448-449；Taparowsky等，1983，Cell，34：581-586；Yuasa等，1984，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81：3670-74)。例示性的活化性HRAS点突变包括用Val对Gly12的替代(G12V，通过密码子12处的GGC→GTC突变引起)和用Lys对Gln61的替代(Q61K，通过密码子61处的CAG→AAG突变引起)。例示性的活化性KRAS点突变包括用Cys对Gly12的替代(G12C，通过核苷酸34处的G→T转换引起)、用Arg对Gly 12的替代(G12R，通过密码子12处的G→C转换引起)、用Asp对Gly13的替代(G13D，通过密码子13处的G→A转换引起)、用Thr对Ala59的替代(A59T，通过密码子59处的G→A转换引起)、用Asp对Gly12的替代(G12D)、用Val对Gly12的替代(G12V)、用Ser对Gly12的替代(G12S，通过密码子12处的G→A转换引起)、Gly11的插入(G11-INS，通过外显子1中的3-bp插入引起)、和用Arg对Gly13的替代(G13R，通过密码子13处的G→C转换引起)。

组成性活化的ERK突变体包括ERK2Q103A和ERK2L73P，S151D(Emrick等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：18101-06；Emrick等，2001，J.Biol.Chem.，276：46469-79)。例示性的活化的MEK1突变体是MEK1EE(Tournier等，1999，Mol.Cell Biol.，19：1569-81)。

可以通过测定来自受试者的样品中的突变型核酸的存在来检测活化性BRAF、RAS、ERK、或MEK突变。用于检测BRAF突变的例示性的商品化测定法是Mutector

突变检测试剂盒(Trimgen，Sparks，MD；产品目录编号GP04、MH1001-01、MH1001-02、MH1001-03、MH1001-04)(Xing等，2004，Clin.Endocrinol.Metab.，89：2867-72；Ichii-Nakato等，2006，J.Invest.Dermatol.，126：2111-18)。用于检测KRAS突变的例示性的商品化测定法可购自DxS Ltd.(Manchester，UK)。

检测突变型核酸的其它例示性方法包括直接测序；限制性片段分析(Cohen等，2003，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，44：2876-78)；单链构象多态性凝胶电泳(Lee等，2003，Br.J.Cancer.，89：1958-60)；定点诱变/限制性分析(Alsina等，2003，Clin.Cancer Res.，9：6419-25；Goydos等，2005，J.Am.Coll.Surg.，200：362-370)；序列特异性PCR(Deng等，2004，Clin.Cancer Res.，10：191-195)；实时聚合酶链式反应和解链曲线分析(Ikenoue等，2004，Cancer Genet.Cytogenet.，149：68-71)；缺口连接酶链式反应(Goldenberg等，2004，Mod.Pathol.，17：1386-91)；突变体等位基因特异性PCR扩增(MASA)(Lilleberg等，2004，Ann.NY Acad.Sci.，1022：250-256；Sapio等，2006，Eur.J.Endocrinol.，154：341-348)；等位基因特异性PCR(Burger等，2006，Eur.Urol.，50：1102-09)；实时等位基因特异性PCR(Jarry等，2004，Mol.Cell.Probes.，18：349-352；Yancovitz等，2007，J.Mol.Diagn.，9：178-183)；PCR限制性片段长度多态性(RFLP)分析(Hayashida等，2004，Thyroid，14：910-915；Chung等，2006，Clin.Endocrinol.(Oxf.)，65：660-666)；错配连接测定法(Busby和Morris，2005，J.Clin.Pathol.，58：372-375)；连接酶检测反应(Turner等，2005，J.Cutan.Pathol.，32：334-339)；高分辨率扩增子解链分析(Willmore-Payne等，2005，Hum.Pathol.，36：486-493)；变性剂毛细管电泳(Hinselwood等，2005，Electrophoresis，26：2553-61)；环杂交迁移率变动测定法(loop-hybrid mobility shift assay)(Matsukuma等，2006，J.Mol.Diagn.，8：504-512)；单碱基延伸分析(Kann等，2006，Clin.Chem.，52：2299-2302)；寡核苷酸微阵列(Kim等，2007，J.Mol.Diagn.，9：55-63)；原位杂交；原位扩增；和检测核苷酸多态性(例如单核苷酸多态性)的其它已知手段。还可参见US 2006/0246476、US 2006/0252041、US 2007/0020657、和US 2007/0087350。在一些实施方案中，测定数种突变型核酸的存在与否(例如序贯地或者同时地)。

也可以通过测定突变型蛋白质的存在来检测活化性BRAF、RAS、ERK、或MEK突变。用于检测突变型蛋白质的例示性方法包括使用突变特异性抗体的免疫学方法(Fensterle等，2004，BMC Cancer，4：62；Kawakami等，2005，Cancer Metastasis Rev.，24：357-66)；含有突变特异性抗体的阵列；和质谱术(例如MS/MS或MALDI-TOF质谱术)(Powell等，2005，J.Pathol.，205：558-64)。在一些实施方案中，测定数种突变型蛋白质的存在与否(例如序贯地或者同时地)。

也可以通过对样品测定BRAF或RAS活性来检测活化性BRAF、RAS、ERK、或MEK突变(参见例如US 2006/0211073)。或者，可以通过检测由突变型蛋白质所产生的基因表达的特征性样式来推断活化性BRAF、RAS、ERK、或MEK突变的存在。

来自受试者的样品可以是任何类型的，包括但不限于活组织检查、吸出物、血液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、或其它体液。样品通常会包括受试者的细胞，例如来自受试者的肿瘤、损伤、或怀疑为癌性的组织的细胞。然而，本文所描述的检测方法中有许多灵敏得足以检测出无细胞样品中痕量的突变型核酸或蛋白质，甚至在存在相应的野生型核酸或蛋白质的情况中。可以将含有细胞的样品固定或者以其它方式处理，之后进行测定。

癌症诊断学

可以通过对来自受怀疑的肿瘤的样品(例如一种或多种细胞)测试IGFBP7表达来实现某些癌症(例如具有活化的BRAF或RAS的癌症)的诊断。具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导、生长和/或存在依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或含有活化的BRAF或RAS并且基本上没有表达或没有可检测地表达IGFBP7的样品(例如与来自受试者的非癌性细胞或组织的样品或参照值(例如从正常细胞或组织样品获得的)相比)被诊断为癌性。同样地，没有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导、生长和/或存在不依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或不含活化的BRAF或RAS并且基本上不表达或没有可检测地表达IGFBP7的样品(例如与来自受试者的非癌性细胞或组织的样品或参照值(例如从正常细胞或组织样品获得的)相比)可以被诊断为癌性。

可以对任何器官或组织的损伤或受怀疑的肿瘤使用本文中所描述的诊断方法。在器官或组织是皮肤时，样品可以含有黑素细胞。具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导、生长和/或存在依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或含有活化的BRAF或RAS并且基本上表达IGFBP7的黑素细胞被诊断为黑素细胞痣(黑痣)；具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导、生长和/或存在依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或表达活化的BRAF或RAS，但基本上不表达IGFBP7的黑素细胞被诊断为黑素瘤。没有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导、生长和/或存在不依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或不含活化的BRAF或RAS但确实基本上或可检测地表达IGFBP7的黑素细胞也被诊断为黑素瘤。可以与组织切片(例如冷冻组织切片)一起使用测定法，因此对于组织学分析和临床诊断是有用的。所述方法不需要特定的组织固定方法，因为该测定法与未固定的细胞或组织或者与数种固定剂(例如甲醇/丙酮固定，或甲醛固定)一起运行。测定法可以与石蜡切片(例如复原的石蜡切片)一起运行。其它有用的组织固定方法是本领域普通技术人员已知的。

用于检测样品中的IGFBP7表达的方法包括检测mRNA或cDNA和检测蛋白质，例如使用抗体或其它结合蛋白质，或使用活性测定法来实现。也有可能使用多种分子技术之任一种(包括RT-PCR和微阵列分析)来检测IGFBP7mRNA或cDNA。

本领域中已知的基因表达分析的方法的例子包括DNA阵列或微阵列(Brazma和Vilo，FEBS Lett.，2000，480，17-24；Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16)、SAGE(基因表达系列分析)(Madden等，Drug Discov.Today，2000，5，415-425)、READS(经消化的cDNA的限制酶扩增(restriction enzymeamplification of digested cDNA))(Prashar和Weissman，Methods Enzymol.，1999，303，258-72)、TOGA(总基因表达分析(total gene expression analysis))(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，1976-81)、蛋白质阵列和蛋白质组学(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Jungblut等，Electrophoresis，1999，20，2100-10)、表达序列标签(EST)测序(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Larsson等，J.Biotechnol.，2000，80，143-57)、消减式RNA指纹(subtractive RNAfingerprinting，SuRF)(Fuchs等，Anal.Biochem.，2000，286，91-98；Larson等，Cytometry，2000，41，203-208)、消减克隆、差别展示(DD)(Jurecic和Belmont，Curr.Opin.Microbiol.，2000，3，316-21)、比较基因组杂交(Carulli等，J.CellBiochem.Suppl.，1998，31，286-96)、FISH(荧光原位杂交)技术(Going和Gusterson，Eur.J.Cancer，1999，35，1895-904)和质谱术方法(综述于To，Comb.Chem.High Throughput Screen，2000，3，235-41)。

癌症

可以使用新方法来诊断和治疗数种类型的癌症，例如黑素瘤、甲状腺癌(例如乳头状甲状腺癌、未分化甲状腺癌(anaplastic thyroid carcinoma)、滤泡性癌(follicular carcinoma)、滤泡性腺瘤(follicular adenoma))、结肠直肠癌、肺癌(例如腺癌、非小细胞肺癌)、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma))、多发性骨髓瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、和其它癌瘤。诊断癌症的方法是本领域技术人员公知的。在一些实施方案中，新方法对于任何类型的具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导、生长和/或存在依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或含有活化的或致癌性BRAF或RAS的肿瘤、癌症、或新生物可以是有用的。

药学配制剂

可以将本文中所描述的IGFBP7剂(它们在本文都可以称为“活性化合物”)掺入药学组合物中。此类组合物通常包括活性化合物和药学可接受载体或赋形剂。“药学可接受载体”可以包括与药学施用相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。还可以将补充的活性化合物掺入组合物中。

有许多可以将在新方法中使用的新组合物投递至受试者(一般而言)，且具体地，投递至那些受试者中的特定细胞或组织的方法。例如，可以将本文中所描述的IGFBP7剂注射入受试者或受试者的组织中。在另一个例子中，可以将编码IGFBP7剂的载体(例如质粒或病毒)导入受试者的细胞或组织中。然后载体会进入该组织的一种或多种细胞，并表达IGFBP7剂。可以如下增强此类质粒的投递特异性，即将它们与器官或组织特异性亲和力联系起来，从而它们优先进入指定的细胞类型。然而，因为IGFBP7能在细胞外起作用，所以不必将载体直接投递至肿瘤细胞。可以将载体投递至肿瘤周围的组织。表达蛋白质进行肿瘤疗法的方法记载于例如Cross和Burmester，2006，Clin.Med.Res.，4：218-227；Lejuene等，2007，Expert Rev.Anticancer Ther.7：701-713；及Bloquel等，2004，J.Gene Med.，6：S11-S23。

可以将化合物及其生理学可接受盐和溶剂化物配制用于口服、表面(topical)、口腔、胃肠外或直肠施用或者通过吸入或吹入(经由口或鼻)进行的施用。

一般会将化合物配制用于通过注射(例如推注或连续输注)进行的胃肠外施用。供注射用的配制剂可以以单位剂量形式呈现，例如在安瓿中或者在装有添加的防腐剂的多剂容器中。组合物可以采取诸如悬浮液、溶液或油性或水性媒介中的乳剂等形式，而且可以含有配方剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分在使用前可以是粉末形式，供与合适媒介(例如无菌无热原水)的构建。若组合物意图在特定的治疗区域中使用，则可以通过向肿瘤位置中的一次或多次局部注射来施用组合物以尽可能多地消除与化合物在治疗区域外的活性有关的任何副作用。

在先前所描述的配制剂外，还可以将化合物配制为积存制剂(depotpreparation)。可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或者通过肌肉内注射来施用此类长效配制剂。如此，例如化合物可以用合适的聚合物或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂，或者作为略溶性衍生物(例如作为略溶性盐)配制。积存制剂可以包括包埋的或包囊的分泌IGFBP7剂的细胞或组织，其可以例如通过植入或通过肌肉内注射来施用。

若想要的话，可以在包装或分配器装置中呈现组合物，所述包装或分配器装置可以装有含有活性成分的一个或多个单位剂量形式。包装可以例如包括金属或塑料薄片，诸如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有施用指令。

本发明的治疗性组合物还可以含有载体或赋形剂，其中许多是熟练技术人员已知的。用于制备此类配制剂的方法是公知的，并可参见例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，University of the Sciences inPhiladelphia(USIP)，2005。

还可以使用本领域已知的方法来将组合物配制用于活性化合物的细胞内投递。例如，组合物可以包括投递活性化合物穿过胞质膜的脂质体或其它载体。还可以使用用膜渗透性肽(membrane-permeant peptide)诸如Tat或触角(Antennapedia)覆盖的小泡。用于增强细胞内投递的许多其它方法对于本领域技术人员是熟悉的

公认的是，可以独立地或者彼此组合地使用本文中所描述的药学组合物和方法。也就是说，可以以时间交叠或非交叠方案对受试者施用一种或多种药学组合物(例如包含IGFBP7剂的药学组合物)，和/或进行本文所描述的一种或多种治疗方法。在疗法在时间上交叠时，疗法一般可以以任何次序发生，并且可以是同时的(例如一起在复合的组合物中同时施用或者同时地但作为分开的组合物施用)或者分散的。举例而言，可以同时或序贯地对患有本文所描述的病症的受试者施用选择性杀死异常细胞的细胞毒剂和在一个实施方案中可以与治疗剂、细胞毒剂、成像剂等偶联或连接的抗体(例如本发明的抗体)两者。

有效剂量

可以通过标准药学规程来测定IGFBP7剂的毒性和治疗功效，其使用培养中的细胞或者实验动物测定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)来实现。毒性与治疗效果之间的剂量比率是治疗系数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。优选展现出大的治疗系数的抑制剂。虽然可以使用展现出毒性副作用的抑制剂，但是要注意设计如下的投递系统，其将此类化合物靶向受累组织位置以使对非靶向细胞的潜在损害最小化，由此降低副作用。

可以在配制人用剂量范围中使用自细胞培养测定法和动物研究获得的数据。优选地，此类化合物的剂量位于包括具有少许毒性或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以在此范围内变化，这取决于所采用的剂量形式和所利用的施用路径。对于在新方法中所使用的任何化合物，最初可以自细胞培养测定法评估治疗有效剂量。也可以在动物模型中计算剂量以达到包括IC50(即，实现对症状的半最大抑制的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围，如在细胞培养中所测定的。可以使用此类信息来更精确地确定人中有用的剂量。

实施例

材料和方法

细胞系和培养

原代包皮成纤维细胞(BJ)和人黑素瘤细胞系获自ATCC，并在补充有10％胎牛血清的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基中于37℃在5％CO₂下培养。人原代黑素细胞获自Cascade Biologics，并依照供应商的推荐培养。

逆转录病毒和质粒

自质粒pBABE-zeo(Addgene)和pBABE-zeo/BRAFV600E生成表达空载体或BRAFV600E的逆转录病毒(Michaloglou等，2005，Nature，436：720-724)。还获得表达组成性活化的ERK2突变体ERK2Q103A和ERK2L73P、S151D(Emrick等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：18101-06；Emrick等，2001，J.Biol.Chem.，276：46469-79)和MEK1突变体MEK1EE(Tournier等，1999，Mol.Cell Biol.，19：1569-81)的质粒。

shRNA筛选

经由马萨诸塞大学医学院shRNA文库核心设备获得人shRNAmir文库(释放(release)1.20；Open Biosystems)。以约2.6×10⁵pfu/ml的滴度产生10种逆转录病毒集合，各包含约6000个shRNA克隆。共转染入PhoenixGP3包装细胞系中后产生这些逆转录病毒原液(Grignani，1998，Cancer Res.，58：14-19)。在100mm平板中用逆转录病毒原液以MOI为0.2转导PFF成纤维细胞(1.2×10⁶)，并在2天后选择对嘌呤霉素(1.5μ/gml)的抗性达7天。然后在所有细胞均被感染的条件下(MOI 20)用携带BRAFV600E的逆转录病毒感染细胞。绕过BRAFV600E诱导的细胞增殖阻断的细胞形成集落，将其合并并扩充，并通过序列分析来鉴定shRNA。为了鉴定候选shRNA，对转导病毒的shRNA区进行PCR扩增(使用引物PSM2-正向，5’-GCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3’(SEQ ID NO：8)和PSM2-反向，5’-GAGACGTGCTACTTCCATTTGTC-3’(SEQID NO：9))，并克隆入pGEM-T Easy(Promega)中。每种集合对平均48个克隆进行测序(使用引物PSM2-seq，5’-GAGGGCCTATTTCCCATGAT-3’(SEQ IDNO：10))。如下产生各种PFF或黑素细胞敲除细胞系，即用针对候选基因的单一shRNA稳定转导6×10⁴个细胞，接着用BRAFV600E表达逆转录病毒感染。自Open Biosystems文库获得或合成各种shRNA。

定量实时RT-PCR

逆转录病毒转导和嘌呤霉素选择后7天，使用TRIZOL3(Invitrogen)分离总RNA。使用SuperScript3 II逆转录酶(Invitrogen)依照制造商的指令实施逆转录，接着使用具有Rox的Platinum SYBR3Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen)来进行定量实时PCR。

增殖测定法

对于图1B中所显示的增殖测定法，将稳定表达shRNA的1×10⁴个细胞在12孔平板形式中培养，用BRAFV600E表达逆转录病毒感染，并在14天后用结晶紫染色。对于所有其它定量增殖测定法，在相关图例中指定的时间点通过锥虫蓝排除测试来测量细胞成活力。数值表示为百分比细胞生长，如相关图例中所描绘的。对于图2A中所显示的增殖测定法，每3天补充CM，并在CM处理总共14天后测量增殖。除非另有说明，以10μg/ml的浓度将rIGFBP7添加至培养基。

凋亡测定法

用BRAFV600E表达逆转录病毒感染PFF成纤维细胞或黑素细胞或shRNA敲除衍生物(5×10⁵个细胞)，并在4天后在膜联蛋白V-PE(BDBiosciences)方面对总细胞群体染色。为了在rIGFBP7处理后监测黑素瘤细胞中的凋亡，用rIGFBP7(10μg/ml)处理5×10⁵个细胞达24小时，并在膜联蛋白V-PE方面染色。

DNA复制测定法

用BRAFV600E表达逆转录病毒感染PFF成纤维细胞或黑素细胞或shRNA敲除衍生物(5×10⁵个细胞)，并在约4天后在BrdU掺入方面对总细胞群体染色。简言之，用BRAFV600E表达逆转录病毒感染4天的末期前4小时，将细胞与20μM BrdU(Sigma)一起温育以容许BrdU掺入，在该点在70％乙醇中固定细胞，使用0.2％Triton3X-100透化，用2N HCl处理，并使用a-BrdU抗体(Ab-3，Oncogene)来探查，然后使用抗小鼠IgG德克萨斯红偶联的抗体(Calbiochem)来检测所述a-BrdU抗体。

抗体和免疫印迹分析

为了制备细胞提取物，在Laemmli缓冲液中溶解细胞；对于磷酸-蛋白质，在存在磷酸酶抑制剂混合物(Sigma)的情况中溶解细胞。为了制备条件化培养基，在Opti-MEM3(Invitrogen)中培养细胞达24小时，收获培养液，并使用Centricon3Plus 20管(Millipore)来浓缩。相对于细胞数目标准化条件化培养液，之后加载凝胶。对于图3D和图4C中所显示的实验，以10μg/ml的浓度将rIGFBP7添加至培养基。对于图4D的MEK/RAF抑制剂实验，用2μg/ml或10μg/ml rIGFBP7、20μM或40μM MEK抑制剂PD98054(Calbiochem)、或者5nM或10nM RAF抑制剂GW5074(Sigma)处理SK MEL-28细胞达24小时，之后收获细胞。通过SDS-PAGE溶解蛋白质，并转移至硝化纤维素。用下列抗体探查印迹：α-p16(Abcam)、α-乙酰化H3K9(Upstate)、α-IGFBP7(SantaCruz)、α-SMARCB1(Abnova)、α-BNIP3L(Proscience)、α-BRAFV600E(SantaCruz)、α-切割的胱天蛋白酶-3p11(Santa Cruz)、α-β-肌动蛋白(Sigma)、α-磷酸-ERK(Cell Signaling)或α-ERK(Cell Signaling)。

重组IGFBP7表达和纯化

使用Bac-to-Bac3杆状病毒表达系统(Invitrogen)依照制造商的指令，使用表达带有C端Flag标签的融合蛋白的人IGFBP7表达载体pFASTBAC-1/IGFBP7(Oh等，1996，J.Biol.Chem.，271：30322-25)来生成重组杆状病毒。然后将重组杆状病毒构建体转染入Sf9细胞(Invitrogen)中进行杆状病毒生成，并进行扩增以生成重组IGFBP7蛋白。收集来自IGFBP7表达Sf9细胞的条件化培养基，与I-Flag M2珠(Sigma)一起温育，并使用I-Flag肽洗脱结合的蛋白质。

衰老有关的β-半乳糖苷酶测定法

用PBS清洗用表达载体或BRAFV600E的逆转录病毒感染的黑素细胞，或用BRAFV600E/黑素细胞CM或rIGFBP7(10μg/ml)处理14天的黑素细胞两次(于室温5分钟)，用3％甲醛固定(于室温5分钟)，并用PBS再清洗三次。然后将细胞在SA-β-Gal染色溶液(1mg/mL X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚b-D-半乳糖苷)、40mM柠檬酸/磷酸钠(pH6.0)、5mM亚铁氰化钾、5mM铁氰化钾、150mMNaCl和2mM MgCl₂)中于37℃(0％CO₂)温育过夜。用PBS清洗细胞，并在ZeissAxiovert3 40CFL显微镜上显现。使用QCapture3Pro第5版软件(QImagingCorporation)捕捉图像。

ChIP测定法

使用rIGFBP7处理后24小时制备的提取物来实施染色质免疫沉淀(ChIP)测定法。使用下列抗体：α-BRG1(de La Serna等，2000，Mol.Cell.Biol.，20：2839-51)、α-磷酸-STAT1(Upstate)、及α-SMARCB1和α-STAT1(SantaCruz)。对于对SMARCB1启动子的ChIP实验，使用跨越位于转录起始位点上游约2.4kb的STAT1结合位点的引物。对于对BNIP3L启动子的ChIP实验，使用一系列覆盖约2kb BNIP3L启动子的引物对；添加rIGFBP7后，SMARCB1和BRG1被募集至转录起始位点附近的BNIP3L启动子。通过使用具有Rox的Platinum SYBR3Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen)进行的定量实时PCR来分析ChIP产物。如先前所描述的那样完成倍数差异的计算(Pfaffl，2001，Nucleics Acids Res.，29：e45)。

肿瘤形成测定法

将5×10⁶个SK-MEL-28或SK-MEL-31细胞在100μl无血清DMEM中悬浮，并皮下注射入无胸腺Balb/c(nu/nu)小鼠(Taconic)的右体侧中。3天、6天、和9天后，在肿瘤位置给小鼠注射总体积100μl中的20μg rIGBP7或作为对照的PBS。每三天测量肿瘤尺寸，并使用公式π/6×(长度)×(宽度)²计算肿瘤体积。对于系统施用实验，将5×10⁶个SK-MEL-28或SK-MEL-31细胞注射入裸鼠的体侧中，并在肿瘤达到100mm³的大小时，在第6天、第9天、和第12天时通过尾静脉注射投递总体积100μl中的100μg rIGFBP7。每三天测量肿瘤尺寸。依照实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee，IACUC)准则来实施动物实验。

免疫组织化学

本研究得到UMass医学中心机构审查委员会(Medical Center institutionalreview board)批准。从UMass医学中心，Worcester，MA的病理学文件检索来自正常皮肤(n＝5)、痣(n＝20)和恶性黑素瘤(原发性(n＝7)和转移性(n＝13))的档案材料。再检查所有病例的组织学切片，并由皮肤病理学家确认诊断。将所有患者数据脱鉴定(de-identify)。

切出5微米厚的切片用于免疫组织化学研究，其使用标准技术用热诱导性表位恢复缓冲液和针对IGFBP7的一抗(1∶20稀释；Santa Cruz)来实施。合适的阳性和阴性对照包括在内。通过确定胞质中的IGFBP7表达来记录正染色。没有记录显著的细胞核染色。由皮肤病理学家检查所有经过染色的载玻片。使用加有40μl/ml的20mg/ml蛋白酶K和4μl/ml的0.1M DTT的ISS缓冲液(20X SSC pH7.0、3M NaCl、0.3M柠檬酸钠、1M NaCl、和10％SDS)自十份10μm厚的切片分离用于基因型分型的基因组DNA。简言之，自载玻片刮下组织样品，并于61℃在具有蛋白酶K和DTT的ISS缓冲液中温育过夜。第二天，用酚-氯仿提取样品两次(第二轮使用Phase Lock Gel(Eppendorf))，然后使用乙醇沉淀样品。定量基因组DNA，并通过凝胶电泳，接着进行PCR扩增和TA克隆(Promega)来检查其完整性。对多个克隆测序以鉴定BRAF基因的外显子15中的V600E突变(T1796A)(引物：正向引物：

5’-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3’(SEQ ID NO：11)，反向引物：

5’-GGCCAAAATTTAATCAGTGGA-3’(SEQ ID NO：12))。

亚硫酸氢盐测序

基本上如所描述的那样实施亚硫酸氢盐修饰(Frommer等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：1827-31)，只是在亚硫酸氢盐处理(在黑暗中实施)过程中以125mM的浓度使用氢醌，并在亚硫酸氢盐反应后在QIAQUICK3柱(Qiagen)上对DNA脱盐。为每种细胞系或人组织样品测序6个克隆。对于5-氮杂-2’-脱氧胞苷酸(5-aza)处理，用10μM 5-aza(Calbiochem)处理黑素瘤细胞系达48小时。

实施例1：全基因组shRNA筛选鉴定BRAFV600E介导的衰老和凋亡所需要的因子

为了鉴定BRAFV600E阻断原代细胞增殖所需要的基因，实施全基因组小发夹RNA(shRNA)筛选(图1A中示意性显示)。在人原代包皮成纤维细胞(PFF)中实施初次筛选。将包含针对约28,000种基因的约62,400种shRNA的人shRNA文库分成10个集合，其被包装入逆转录病毒颗粒中，并用于稳定转导PFF。然后在所有细胞均被感染的条件下用表达BRAFV600E的逆转录病毒感染细胞。绕过BRAFV600E诱导的细胞增殖阻断的细胞形成集落，将其合并和扩充，并通过序列分析来鉴定shRNA。如下确认阳性候选物，即用针对候选基因的单一shRNA稳定转导PFF，用BRAFV600E表达逆转录病毒感染，并定量细胞增殖。然后在二次筛选中对确认的候选shRNA测试其在BRAFV600E表达原代人黑素细胞中绕过增殖阻断的能力。

筛选鉴定出17种基因，它们在shRNA介导的敲除后使BRAFV600E表达PFF(BRAFV600E-PFF)和黑素细胞(BRAFV600E黑素细胞)能够增殖。表1中列出了这些基因，并在图1B中显示了17种BRAFV600E-PFF敲除(KD)细胞系的增殖测定法。如自先前的研究预期的(Zhu等，1998，Genes Dev.，12：2997-3007)，BRAFV600E在含有对照非沉默(NS)shRNA的PFF(BRAFV600E-PFF-NS)中的表达有效抑制细胞增殖(图1B)。显著地，然而，此阻断在所有17种BRAFV600E-PFF KD细胞系中均被克服。定量实时RT-PCR(qRT-PCR)在所有情况中确认，靶基因的表达在相应的PFF和黑素细胞KD细胞系中是降低的。对于所有17种基因，针对同一靶基因的第二种无关shRNA也使PFF能够在BRAFV600E表达后增殖。

表1.BRAFV600E诱导的对细胞增殖的阻断所需要的基因

如自先前的研究所预期的(Michaloglou等，2005，Nature，436：720-724)，BRAFV600E在原代黑素细胞中的表达有效阻断细胞增殖(图1C)。比较而言，BRAFV600E未能在所有17种黑素细胞KD细胞系中阻断细胞增殖。如此，我们鉴定出的17种基因是BRAFV600E阻断PFF和原代黑素细胞两者的增殖所需要的。

在黑素细胞中表达BRAFV600E后，大多数细胞变得衰老(图1D)，这与先前的研究一致(Michaloglou等，2005，Nature，436：720-724)，虽然有约10％的细胞经历凋亡(图1E)。为了确定17种基因在这两条途径中的作用，在BRAFV600E表达后在每种黑素细胞KD细胞系中实施凋亡和衰老测定法。图1E的结果显示了17种基因中仅三种是凋亡所需要的：BNIP3L，其编码促凋亡BCL2家族蛋白；SMARCB1，其编码SWI/SNF染色质重建复合物的成分；和胰岛素生长因子结合蛋白7(IGFBP7)，其编码与IGF结合蛋白具有弱同源性的分泌性蛋白质。比较而言，17种基因中除了BNIP3L外均是BRAFV600E诱导生长阻滞(arrest)所需要的(图1D)，并且是衰老的特征性标志物(参见下文)。在PFF中获得相同的结果。

已经提出了细胞周期抑制剂p16^INK4a在复制性和癌基因诱导型衰老中发挥重要作用(综述于Ben-Porath和Weinberg，2005，Int.J.Biochem.Cell Biol.，37：961-976)。例如，p16^INK4a在黑素细胞中在表达活化的BRAF后受到诱导，在黑素细胞痣中进行表达，并且在黑素瘤中受到频繁删除(Michaloglou等，2005，Nature，436：720-724；Piccinin等，1997，Int.J.Cancer，74：26-30)。因此测定我们的筛选中鉴定出的基因是否是p16^INK4a诱导所需要的。图1F显示了，p16^INK4a水平在BRAFV600E表达后在表达非沉默shRNA的对照黑素细胞中实质性升高。显著地，p16^INK4a表达在17种黑素细胞KD细胞系中的16种中没有受到BRAFV600E诱导。唯一的例外是在BNIP3L方面敲除的细胞系，其(如上文所描述的)明确牵涉凋亡。组蛋白H3赖氨酸9(H3K9)乙酰化的丧失(即另一种充分表征的衰老标志物(Narita等，2006，Cell，126：503-514))也在BRAFV600E表达后在对照黑素细胞中但不在除BNIP3L KD细胞系之外的任何黑素细胞KD细胞系中发生(图1F)。

实施例2：分泌性蛋白质，即IGFBP7经由自分泌/旁分泌途径诱导衰老和凋亡

筛选中鉴定出的17种基因编码已知的肿瘤抑制物(TP53、MEN1、NF2、和SMARCB1)、促凋亡蛋白(BNIP3L)、细胞周期调节物(BUB1)、和RAS-RAF-MEK-ERK信号传导途径的调控物(PEA15、RAP1GAP、和HSPA9)。出乎意料地，衰老和凋亡两者的诱导所需要的基因之一是IGFBP7，其编码分泌性蛋白质(Wilson等，1997，J.Clin.Endocrinol.Metab.，82：1301-1303)。此结果提出如下的可能性，即BRAFV600E介导的对细胞增殖的阻断可经由IGFBP7在细胞外发挥功能的自分泌/旁分泌途径发生。

为了确认IGFBP7实际上是分泌的并且询问IGFBP7是否在细胞外发挥功能，分析来自BRAFV600E黑素细胞的条件化培养基(CM)诱导衰老的能力。图2A的免疫印迹(顶部小图)显示了，黑素细胞中表达BRAFV600E后，CM中的IGFBP7水平实质性升高。向未处理的黑素细胞添加来自BRAFV600E黑素细胞的CM阻断细胞增殖，这主要源自于对衰老的诱导(图2A，底部小图，并参见下文图2D)。

两项实验证实，IGFBP7活化在BRAF-MEK-ERK信号传导下游。第一项，通过添加MEK抑制剂来阻断BRAFV600E介导的IGFBP7诱导。第二项，组成性活化的ERK突变体(ERK2Q103A或ERK2L73P、S151D)的表达足以活化IGFBP7转录。

IGFBP7启动子含有二聚体AP-1(JUN/FOS)转录因子的共有结合位点。JUN(也称为c-Jun)是经由RAF-MEK-ERK信号传导活化的(Leppa等，1998，EMBO J.，17：4404-13)，其提出如下的可能性，即AP-1牵涉BRAFV600E介导的IGFBP7诱导。染色质免疫沉淀(ChIP)分析证实，JUN响应BRAFV600E表达而结合IGFBP7启动子，并且siRNA介导的JUN敲除在BRAFV600E/黑素细胞中消除对IGFBP7转录的诱导。

接着，证实了IGFBP7是负责BRAFV600E介导的细胞增殖阻断的分泌性蛋白质。在一项实验中，用靶向IGFBP7的shRNA处理BRAFV600E黑素细胞。图2A显示了，IGFBP7是表达IGFBP7shRNA的BRAFV600E黑素细胞的CM所缺少的(顶部小图)，并且此CM没有抑制未处理黑素细胞的细胞增殖(底部小图)。在第二项实验中，用I-IGFBP7抗体的免疫消减有效地自BRAFV600E黑素细胞的CM除去IGFBP7(顶部小图)。经过免疫消减的CM也未能抑制未处理黑素细胞的细胞增殖(底部小图)。

为了证实IGFBP7能阻断细胞增殖，自杆状病毒感染的昆虫细胞纯化纯化的重组IGFBP7(rIGFBP7)。图2B显示了，表达和纯化后，检测出约33kDa的多肽(rIGFBP7的预期大小)。rIGFBP7的添加以剂量依赖性方式阻断原代黑素细胞的增殖(图2C)。生长阻滞的细胞具有扩大的、平坦的形态学，并且在衰老有关的β-半乳糖苷酶方面染色呈阳性(图2D)。总的来说，图2A-2D的结果指明，表达BRAFV600E后，黑素细胞合成并分泌增加量的IGFBP7，然后其经由自分泌/旁分泌途径起作用来诱导衰老。

原代黑素细胞表达低水平的IGFBP7的发现(图2A和参见下文)提出如下的可能性，即在正常条件下IGFBP7能调节黑素细胞增殖。为了测试此想法，比较未处理的黑素细胞、表达非沉默shRNA的对照黑素细胞、和表达IGFBP7shRNA的黑素细胞的增殖比率。图2E的结果显示了，黑素细胞增殖在IGFBP7敲除后加速。如此，正常的黑素细胞表达低水平的IGFBP7，其抑制增殖。在以高水平存在时，诸如表达BRAFV600E后，IGFBP7诱导衰老。

实施例3：含有活化性BRAF突变的黑素瘤细胞系对IGFBP7介导的凋亡的选择性敏感性

接着，分析IGFBP7阻断一组人黑素瘤细胞系中的细胞增殖的能力。细胞含有活化性BRAF突变(BRAFV600E；SK-MEL-28、MALME-3M、WM793B、WM39和WM278)、活化性RAS突变(RASQ61R；SK-MEL-2、SK-MEL-103、和WM1366)，或者是BRAF和RAS两者的野生型(CHL、SK-MEL-31、WM1321和WM3211)。对于每种细胞系，通过免疫印迹分析来测定CM中的IGFBP7存在(图3A)，并在增殖测定法中测量对IGFBP7诱导的生长抑制的敏感性(图3B)。结果揭示IGFBP7表达与对IGFBP7介导的生长抑制的敏感性之间显著的反相关，其与BRAF或RAS的状态相关联。最重要的是，含有活化性BRAF突变的黑素瘤细胞系未能表达IGFBP7，并且对IGFBP7介导的生长抑制高度敏感。比较而言，具有野生型BRAF和RAS的细胞表达IGFBP7，并且对IGFBP7介导的生长抑制是相对不敏感的。最后，含有活化性RAS突变的黑素瘤细胞系表达低水平的IGFBP7，并且对IGFBP7介导的生长抑制部分敏感。

关于凋亡和衰老进一步分析IGFBP7介导的细胞增殖阻断。显著地，在含有活化性BRAF突变的黑素瘤细胞系中，rIGFBP7强烈诱导凋亡，并且存活的衰老细胞是不可检出的(图3C)。如此，IGFBP7主要诱导原代黑素细胞中的衰老和BRAFV600E阳性黑素瘤细胞中的凋亡。

为了了解此差别响应的基础，在原代黑素细胞和BRAFV600E阳性SK-MEL-28黑素瘤细胞中分析17种鉴定出的基因的表达。定量RT-PCR显示，在原代黑素细胞中，BRAFV600E的表达导致牵涉凋亡(BNIP3L、IGFBP7和SMARCB1)和衰老(PEA15、IGFBP7、MEN1、FBXO31、SMARCB1、和HSPA9)的7种基因的转录上调。BRAFV600E介导的对所有7种基因的诱导在IGFBP7敲除的情况中没有发生。向黑素细胞添加rIGFBP7后，7种基因中的6种受到诱导，除IGFBP7外。显著地，向SK-MEL-28细胞添加rIGFBP7后，IGFBP7和PEA15均不被上调。PEA15(即一种已知的BRAF-MEK-ERK信号传导调节物(Formstecher等，2001，Dev.Cell，1：239-250))是衰老所需要的(参见图1F)。如此，经IGFBP7处理的SK-MEL-28细胞中缺乏PEA15诱导可以解释它们未能经历衰老。BNIP3L在表达BRAFV600E或添加rIGFBP7后在原代黑素细胞中仅受到适度地上调，这与经IGFBP7处理的黑素细胞中的相对低水平凋亡相一致(参见图1E)。

实施例4：IGFBP7经由BNIP3L的上调来诱导凋亡

如上文所描述的，BRAFV600E介导的凋亡依赖于IGFBP7、SMARCB1、和BNIP3L，这提出如下的可能性，即这三种蛋白质是凋亡所需要的通常途径的成分。实施一系列实验来证实此想法，并建立途径的次序。图3D显示了，向SK-MEL-28细胞添加rIGFBP7后，SMARCB1和BNIP3L的表达是显著升高的，并且发生凋亡，如通过胱天蛋白酶3活化所证明的。SMARCB1 shRNA的表达阻断BNIP3L的诱导和凋亡。比较而言，BNIP3L shRNA的表达仍然导致rIGFBP7添加后的SMARCB1诱导，虽然没有发生凋亡。总的来说，这些结果揭示如下的途径，其中IGFBP7提高SMARCB1的表达，继而其导致BNIP3L的表达升高，在凋亡中达到顶点(图3D，底部小图)。

在BRAFV600E/黑素细胞中，对SMARCB1和BNIP3L的诱导在IGFBP7敲除后受到阻断。此外，向未处理的黑素细胞添加来自BRAFV600E表达黑素细胞的CM实质性上调SMARCB1和BNIP3L，其在缺乏IGFBP7的各种对照CM中没有发生。如此，在BRAFV600E/黑素细胞中，对SMARCB1和BNIP3L的诱导也依赖于IGFBP7，并且在IGFBP7下游。

接着，确定IGFBP7介导的BNIP3L和SMARCB1诱导的机械论基础。STAT1牵涉某些SMARCB1诱导型转录应答，而SMARCB1启动子含有位于转录起始位点上游约2.4kb的STAT1结合位点(Hartman等，2005，Genes Dev.，19：2953-68)。调查STAT1在IGFBP7介导的SMARCB1转录诱导中的潜在作用。ChIP实验揭示，向SK-MEL-28细胞添加rIGFBP7后，STAT1被募集SMARCB1启动子(图3E)，并且shRNA介导的敲除实验确认，STAT1是IGFBP7介导的SMARCB1上调所需要的(图3F)。

如上文所描述的，SMARCB1是IGFBP7上调BNIP3L所需要的(图3D)。ChIP实验揭示，添加rIGFBP7后，SMARCB1以及BRG1(即SWI/SNF复合物的一种必要亚基(Bultman等，2000，Mol.Cell，6：1287-95))被募集至转录起始位点附近的BNIP3L启动子(图3G)。敲除SMARCB1后，BRG1(和如预期的SMARCB1)未能与BNIP3L启动子结合。总的来说，这些结果指明，IGFBP7刺激BNIP3L转录，其至少部分如下实现，即提高SMARCB1的细胞内水平，导致含有SMARCB1的SWI/SNF染色质重建复合物(其被募集至BNIP3L启动子，并促进BNIP3L转录活化)的形成。

最后，确定凋亡是否依赖于rIGFBP7的连续存在或者在瞬时暴露于rIGFBP7后是否是不可逆的。将SK-MEL-28细胞与rIGFBP7一起温育达多个时间长度，之后，清洗细胞，并在缺乏rIGFBP7的培养基中培养，并在24小时后定量凋亡。图3H中所显示的结果指明与rIGFBP7一起温育6小时后，细胞不可逆地进行凋亡，其甚至在除去rIGFBP7后发生。

实施例5：IGFBP7阻断BRAF-MEK-ERK信号传导来活化凋亡途径

如上文所提及的，在BRAFV600E阳性黑素瘤细胞中，BRAF-MEK-ERK信号传导是超活化的，致使细胞高度依赖于此途径。如此，用BRAF shRNA(Hoeflich等，2006，Cancer Res.，999-1006)或BRAF抑制剂(Sharma等，2005，Cancer Res.，65：2412-2421)或MEK抑制剂(Solit等，2006，Nature，439：358-362)处理BRAFV600E阳性黑素瘤细胞阻断细胞增殖。确定IGFBP7是否至少部分通过抑制BRAF-MEK-ERK信号传导来阻断细胞增殖。

为了测试此想法，将rIGFBP7添加至BRAFV600E阳性SK-MEL-28黑素瘤细胞，并分析总体的和活化的ERK(磷酸-ERK)的水平。图4A的免疫印迹实验显示了，rIGFBP7的添加导致磷酸-ERK的剂量依赖性丧失，指明BRAF-MEK-ERK信号传导受到抑制。

类似地，黑素细胞中的BRAFV600E表达明显降低磷酸-ERK水平，其在表达IGFBP7shRNA的BRAFV600E/黑素细胞中没有发生。此外，向未处理的黑素细胞添加来自BRAFV600E/黑素细胞的CM实质性降低磷酸-ERK的水平，其在缺乏IGFBP7的各种对照CM的情况中没有发生。rIGFBP7还阻断生长因子诱导的ERK活化。总的来说，这些结果指明IGFBP7抑制BRAF-MEK-ERK信号传导。

向SK-MEL-28细胞添加rIGFBP7导致活化的MEK1/2的水平降低，这与磷酸ERK水平降低和凋亡一致。此外，组成性活化的MEK1突变体(MEK1EE)的异位表达阻止IGFBP7阻断ERK活化。这些结果表明，IGFBP7阻断BRAF对MEK的磷酸化。最后，向SK MEL-28细胞添加IGFBP7导致RAF抑制性蛋白质(RKIP)的上调，已经显示了所述RAF抑制性蛋白质与数种RAF蛋白(包括BRAF)相互作用，并抑制RAF介导的MEK磷酸化(参见例如Park等，2005，Oncogene，24：3535-40)。在SK-MEL-28细胞中敲除RKIP后，rIGFBP7未能阻断MEK或ERK的活化。总的来说，这些结果指明，IGFBP7通过诱导RKIP来抑制BRAF-MEK-ERK信号传导，所述RKIP阻止BRAF磷酸化MEK。

为了建立对BRAF-MEK-ERK信号传导的抑制与IGFBP7介导的对细胞增殖的阻断之间的关系，在组成性活化的ERK2突变体(ERK2Q103A或ERK2L73P、S151D)中分析对rIGFBP7的敏感性。图4B显示了，SK-MEL-28细胞中的ERK2(左侧)或MEK1(右侧)突变体表达基本上克服IGFBP7介导的细胞增殖阻断。组成性活化的ERK2突变体的表达还阻断黑素细胞中BRAFV600E和IGFBP7诱导的衰老。另外，任一组成性活化的ERK2突变体的异位表达提高磷酸-ERK2水平，并阻止IGFBP7介导的BNIP3L上调和对凋亡的诱导(图4C)。

上述结果得出两项结论。第一，IGFBP7至少部分经由对BRAF-MEK-ERK信号传导的抑制来阻断细胞增殖。第二，对BRAF-MEK-ERK信号传导的抑制是IGFBP7介导的凋亡途径的活化所需要的。图4D显示了，MEK或RAF的化学抑制剂的添加阻断BRAF-MEK-ERK信号传导。然而，与rIGFBP7不同，MEK和RAF抑制剂没有提高BINP3L水平或者有效诱导凋亡，指明对BRAF-MEK-ERK信号传导的抑制不足以诱导IGFBP7介导的凋亡。如此，IGFBP7具有凋亡途径的诱导所需要的第二种独立的活性。

实施例6：IGFBP7抑制异种移植小鼠中的BRAFV600E阳性肿瘤的生长

IGFBP7抑制BRAFV600E阳性人黑素瘤细胞系增殖的能力(参见图3B)提出如下的可能性，即IGFBP7能抑制含有活化性BRAF突变的肿瘤的生长。作为此可能性的第一次测试，将含有(SK-MEL-28)或缺乏(SK-MEL-31)活化性BRAF突变的人黑素瘤细胞皮下注射入裸鼠的体侧中。3天、6天、和9天后，在肿瘤位置给小鼠注射rIGFBP7或作为对照的PBS。图5A的结果显示了，rIGFBP7基本上抑制BRAFV600E阳性肿瘤的生长，但是对含有野生型BRAF的肿瘤没有影响。

还确定肿瘤生长是否也可以受到rIGFBP7的系统施用抑制。将SK-MEL-28或SK-MEL-31细胞注射入裸鼠的体侧中，并且在肿瘤达到100mm³的大小时，在第6天、第9天和第12天通过尾静脉注射来投递100μgrIGFBP7。图5B的结果显示了，rIGFBP7的系统施用完全抑制BRAFV600E阳性肿瘤的生长，而含有野生型BRAF的肿瘤不受影响。在用rIGFBP7处理的小鼠中，BRAFV600E阳性肿瘤为脱氧尿苷三磷酸切口末端标记(TUNEL)阳性，指明对肿瘤生长的抑制源自于凋亡。通过系统施用的rIGFBP7阻抑肿瘤生长是剂量依赖性的，并且可以在没有明显不利影响的前提下投递比抑制肿瘤生长所需要的浓度高的浓度(图5C)。

实施例7：IGFBP7表达的丧失对于BRAFV600E阳性黑素瘤是至关重要的

如上文所显示的，BRAFV600E阳性黑素瘤细胞系未能表达IGFBP7，并且对IGFBP7介导的凋亡是高度敏感的。这些结果提出如下的可能性，即IGFBP7发挥肿瘤抑制物的功能，并且IGFBP7的丧失可以是BRAFV600E阳性黑素瘤的形成所需要的。为了调查此可能性，我们对一系列人皮肤、痣、和黑素瘤样品实施IGFBP7表达的免疫组织化学分析。

图6和表2的结果显示了，正常的皮肤黑素细胞表达低的但可检测水平的IGFBP7，这与在培养的原代黑素细胞中的结果一致(参见图2A)。

BRAFV600E阳性痣表达高水平的IGFBP7，这与如下发现一致，即BRAFV600E在黑素细胞中的表达提高IGFBP7水平(图2A)。显著地，BRAFV600E阳性黑素瘤没有表达可检测水平的IGFBP7。比较而言，在缺乏活化的BRAF的黑素瘤中明显地表达IGFBP7。

表2.人皮肤、痣、和黑素瘤样品中的BRAFV600E和IGFBP7状态

病理学	样品数目	BRAFV600E状态	IGFBP7状态
				正常皮肤	5	-	+
良性痣	20	+	+
				黑素瘤	13	+	-
黑素瘤	7	-	+

为了确定IGFBP7表达的丧失是否是外遗传(epigenetic)沉默的结果，实施亚硫酸氢盐序列分析。图10A显示了，IGFBP7启动子在BRAFV600E阳性黑素瘤中但不是在BRAFV600E阳性痣或缺乏活化的BRAF的黑素瘤中是密集地超甲基化的。在一组黑素瘤细胞系中的类似分析显示，IGFBP7启动子在BRAFV600E阳性黑素瘤细胞系中是密集地超甲基化的，而在NRASQ61R阳性黑素瘤细胞系中是适度地超甲基化的(图10B)。用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷酸处理这些细胞系恢复IGFBP7在BRAFV600E和NRASQ61R阳性细胞系中的表达，但是在BRAF/RAS野生型细胞系中没有影响(图10C)。

总的来说，这些结果提示，在BRAFV600E阳性黑素瘤的形成过程中，IGFBP7表达是丧失的(例如通过牵涉启动子超甲基化的外遗传沉默)，其使逃脱痣特征性的BRAFV600E介导的衰老能够实现。

实施例8：IGFBP7的功能性肽衍生物

评估IGFBP7的肽衍生物的抑制活性。基于先前的观察(Sato等，1999，JCell Biochem.1999Nov 1；75(2)：187-95)，生成20个氨基酸的肽G₈₄MECVKSRKRRKGKAGAAAG₁₀₃(SEQ ID NO：7)。在如先前所描述的那样测定时，对此肽测试其诱导血管内皮细胞中的索样结构的能力(Akaogi等，Cell Growth Differ.1996Dec；7(12)：1671-7)。20个氨基酸的肽与全长IGFBP7具有类似的诱导血管内皮细胞中的索样结构的活性。

实施例9：用IGFBP7和IDO抑制剂的联合治疗

对淋巴细胞浸润阳性的黑素瘤患者具有较好的预后、减少的复发和几乎没有转移。能改善黑素瘤中的免疫监视的进展会在改善黑素瘤患者的寿命质量方面具有显著影响。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径在人黑素瘤中频繁地受到活化，导致恶性表型诸如自发性细胞增殖。上文所描述的筛选鉴定出称作BIN1的基因，其影响酶吲哚胺2，3-加双氧酶(IDO)。IDO在色氨酸代谢中异化(catabolize)第一步，如此消减T细胞在其活性方面所依赖的色氨酸集合。分析具有BRAFV600E和WT BRAF的黑素瘤样品中的IDO水平和淋巴细胞浸润。与BRAF-MEK-ERK途径抑制剂(例如本文中所描述的IGFBP7剂)组合使用IDO抑制剂可以提供治疗黑素瘤的额外效果。

实施例10：人癌细胞系对IGFBP7介导的凋亡是敏感的

在人癌细胞系(其获自国立癌症研究所(National Cancer Institute，NCI))的NCI 60组中评估IGFBP7诱导凋亡的能力。该组包括对应于下组的细胞系：乳腺癌(MDA-MB-231、HS 578T、BT-549、T47-D、MCF7)、卵巢癌(NCI-ADR-RES、OVCAR-3、OVCAR-5、OVCAR-8、OVCAR-4、SK-OV-3、IGROV1)、前列腺癌(DU-145、PC-3)、肾癌(TK-10、CAKI-1、A496、ACHN、RXF-393、786-0、SN12C、UO-31)、非小细胞肺癌(NCI-H460、HOP-62、A549-ATCC、NCI-H226、EKVX、NCI-H322M、HOP-92、NCI-H522)、中枢神经系统癌(CNS)(SF-295、SF-268、SF-539、SNB-19、SNB-75、U251)、结肠癌(HCT-15、SW-620、COLO205、HT29、HCC-2998、HCT-116、SM-12)、黑素瘤(SK-MEL-28、SK-M2L-2、LOX IMVI、M14、MALM-3M、SK-MEL-5、UACC-257、UACC-62、MDA-MB-435)、和造血癌(hematopoietic cancer)(CCRF-CEM，K-562，MOLT-4，SR，RPMI-8226)。这些细胞系已经得到广泛的表征，并且它们在许多人癌基因(包括BRAF和RAS(例如NRAS、KRAS、或HRAS))方面的突变状态是已知的(参见万维网于discover.nci.nih.gov/cellminer/mutationGeneLoad.do)。

如上文所描述的那样表达和纯化rIGFBP7。为了监测rIGFBP7处理后的凋亡，用rIGFBP7(10μg/ml)处理5×10⁵个细胞达24小时，并在膜联蛋白V-PE方面染色。图11A中显示了结果。rIGFBP7在11/11(100％)含有BRAF突变的细胞系和8/13(61.5％)含有RAS突变的细胞系中诱导凋亡。一种细胞系含有BRAF和RAS突变两者，并且此细胞系对rIGFBP7诱导的凋亡是易感的。不含BRAF或RAS突变的细胞系中，仅4/34(11.8％)对由rIGFBP7介导的凋亡易感。

还测定上述细胞系对Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径的生长依赖性。用20μM MEK抑制剂U0216(Cell Signaling)处理每种细胞系的1.5×10⁵个细胞达24小时，并测定细胞系的生长。图11B中显示了结果。U0216在11/11(100％)含有BRAF突变的细胞系和11/13(84.6)含有RAS突变的细胞系中抑制生长。含有BRAF和RAS突变两者的一种细胞系对由U0216进行的生长抑制易感。不含BRAF或RAS突变的细胞系(0/34)无一对由U0216进行的生长抑制易感。

实施例11：IGFBP7抑制异种移植物转移并增强存活

作为是否可以使用IGFBP7来治疗转移性黑素瘤的第一项测试，使用转移性疾病的完善建立的小鼠模型，其中人黑素瘤细胞在尾静脉注射后形成肺转移(参见例如，Collisson等，2003，Cancer Res.，63：5669-73；Hoeflich等，2006，Cancer Res.，66：999-1006；Zimmerman等，1987，Cancer Res.，47：2305-10)。对于这些实验，使用A375(Fluc-IRES-GFP)细胞，它们是高度转移性的、稳定表达Fluc-IRES-GFP报告构建体的BRAF阳性人黑素瘤细胞系(其中Fluc是萤火虫萤光素酶基因，IRES是内部核糖体进入位点，而GFP是绿色荧光蛋白)(Collisson等，2003，Cancer Res.，63：5669-5673)。Fluc-IRES-GFP的存在使肿瘤生长能够在活的动物中通过连续生物发光光学成像随时间量化。

测试两种处理方案。在一组实验中，注射A375-Fluc细胞后3天启动IGFBP7的施用，此时转移性疾病会是显著的(图12A)。在这些实验中，将7x10⁵个A375(Fluc-IRES-GFP)细胞注射入10只无胸腺Balb/c(nu/nu)小鼠(Taconic)的尾静脉中。第3天、第6天和第9天时，经由尾静脉给小鼠注射100μg纯化的重组IGFBP7(n＝5只小鼠)或作为对照的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(n＝5只小鼠)。第6天时，通过使用Xenogen牌生物发光成像系统来对小鼠分析转移性肿瘤负荷的定量。如所预期的，注射PBS的小鼠展示转移性肺肿瘤(图12B)，而注射rIGFBP7的小鼠没有显示肺转移的证据(图12C)。在30天里每天对小鼠监测成活力，并通过存活测定法(Kaplan-Meier分析)来评估系统施用的IGFBP7抑制转移性疾病的能力。图12D显示了，所有5只对照小鼠在注射A375(Fluc-IRES-GFP)细胞后20天时死亡，而注射rIGFBP7的小鼠在第30天时仍活着。

在第二组实验中，在注射A375(Fluc-IRES-GFP)细胞前和在注射A375(Fluc-IRES-GFP)细胞后立刻启动IGFBP7的施用以测试IGFBP7预防性发挥功能来阻止转移和/或治疗早期转移性疾病的能力(图13A)。在这些实验中，将100μg纯化的重组IGFBP7(或作为对照的PBS)注射入小鼠(n＝每组5只小鼠)的尾静脉中。1天后，给小鼠注射7x10⁵个A375(Fluc-IRES-GFP)细胞，接着在第3天和第6天注射100μg。在30天里每天对小鼠监测成活力，并通过存活测定法(Kaplan-Meier分析)来评估系统施用的IGFBP7抑制转移性疾病的能力。图13B的结果显示了，用PBS处理的小鼠在注射A375(Fluc-IRES-GFP)细胞后18天内死亡，而注射rIGFBP7的小鼠在第30天时仍活着。这些初步结果强烈支持使用rIGFBP7来治疗和预防转移性黑素瘤的可能性。

其它实施方案

已经描述了本发明的许多实施方案。然而，应当理解的是，可以在不背离本发明的精神和范围的前提下进行各种修饰。因而，其它实施方案在所附权利要求书的范围内。

Claims

1.一种治疗受试者中的肿瘤的方法，该方法包括：

鉴定患有、有风险患有、或怀疑患有肿瘤的受试者；

测定所述肿瘤的细胞是否具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导、生长和/或存活是否依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或是否表达活化的或致癌性的BRAF或RAS；和

若所述肿瘤具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或表达活化的或致癌性的BRAF或RAS，则对所述受试者施用有效量的IGFBP7剂，由此治疗肿瘤。

2.权利要求1的方法，其中所述肿瘤是癌症。

3.权利要求2的方法，其中所述癌症是黑素瘤。

4.权利要求2的方法，其中所述癌症是癌瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、或乳头状甲状腺癌。

5.权利要求2的方法，其中所述癌症表达活化的或致癌性的BRAF或RAS。

6.权利要求2的方法，其中所述活化的或致癌性的BRAF是BRAFV600E。

7.权利要求1的方法，其中所述致癌性的BRAF是BRAFV600E。

8.权利要求1的方法，其中所述IGFBP7剂包含与SEQ ID NO：1或SEQID NO：7具有至少80％同一性的多肽。

9.权利要求8的方法，其中所述多肽与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7具有至少85％同一性。

10.权利要求8的方法，其中所述多肽是与异源部分偶联的。

11.权利要求10的方法，其中所述异源部分是异源多肽序列。

12.权利要求1的方法，其中所述IGFBP7剂由与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：7具有至少80％同一性的多肽构成。

13.权利要求12的方法，其中所述多肽与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7具有至少85％的同一性。

14.权利要求1的方法，其中所述IGFBP7剂包含SEQ ID NO：1的功能性片段或域。

15.权利要求1的方法，其中通过向所述受试者导入编码与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7具有至少85％同一性的多肽的核酸来施用所述IGFBP7剂。

16.权利要求15的方法，其中所述核酸在病毒载体中。

17.权利要求16的方法，其中所述病毒载体是腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、或慢病毒载体。

18.权利要求1的方法，其中表面、系统、或局部施用所述IGFBP7剂。

19.权利要求18的方法，其中通过药物释放植入物局部施用所述IGFBP7剂。

20.一种抑制具有增强的Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导，生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或表达活化的或致癌性的BRAF或RAS的细胞增殖的方法，该方法包括给所述细胞施用有效量的IGFBP7剂。

21.权利要求20的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。

22.IGFBP7剂在制备用于治疗受试者中的肿瘤的药物中的用途。

23.权利要求22的用途，其中所述肿瘤是黑素瘤。

24.权利要求22的用途，其中所述肿瘤具有增强Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导、生长和/或存活依赖于Ras-BRAF-MEK-Erk信号传导途径、和/或表达活化的或致癌性的BRAF或RAS(例如NRAS)。

25.一种诊断黑素细胞皮肤损伤的方法，该方法包括：

获得黑素细胞皮肤损伤的样品；

测定所述样品中的IGFBP7表达；并

测定所述样品是否含有活化的BRAF或RAS；

其中若所述样品表达IGFBP7并含有活化的BRAF或RAS，则所述损伤被诊断为黑素细胞痣，

其中若所述样品不表达IGFBP7但含有活化的BRAF或RAS，则所述损伤被诊断为黑素瘤，且

其中若所述样品表达IGFBP7但不含活化的BRAF或RAS，则所述损伤被诊断为黑素瘤。

26.权利要求25的方法，其中所述样品是细胞。

27.权利要求25的方法，其中所述表达是mRNA表达。

28.权利要求25的方法，其中所述表达是蛋白质表达。

29.一种治疗受试者中的黑素瘤的方法，该方法包括：

鉴定患有、有风险患有、或怀疑患有黑素瘤的受试者；并

对所述受试者施用有效量的IGFBP7剂，由此治疗所述黑素瘤。

30.权利要求29的方法，其中所述IGFBP7剂是包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7具有至少80％同一性的多肽的组合物。