DE69027320T2 - Gleichzeitiges testverfahren zweier analyten - Google Patents
Gleichzeitiges testverfahren zweier analytenInfo
- Publication number
- DE69027320T2 DE69027320T2 DE69027320T DE69027320T DE69027320T2 DE 69027320 T2 DE69027320 T2 DE 69027320T2 DE 69027320 T DE69027320 T DE 69027320T DE 69027320 T DE69027320 T DE 69027320T DE 69027320 T2 DE69027320 T2 DE 69027320T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- component
- immunoreactive
- substance
- detection method
- analyte
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000010998 test method Methods 0.000 title 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 93
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 54
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 43
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 20
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 63
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 39
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 36
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 35
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 33
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 30
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 15
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 15
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 15
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 14
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 12
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 10
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 10
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 claims description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 12
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 abstract description 4
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 abstract 1
- ZFFFJLDTCLJDHL-JQYCEVDMSA-N Pregnanediol-3-glucuronide Chemical compound O([C@H]1C[C@H]2CC[C@H]3[C@@H]4CC[C@@H]([C@]4(CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@@H](O)C)[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZFFFJLDTCLJDHL-JQYCEVDMSA-N 0.000 description 85
- FJAZVHYPASAQKM-JBAURARKSA-N estrone 3-O-(beta-D-glucuronide) Chemical compound C([C@@H]1[C@@H](C2=CC=3)CC[C@]4([C@H]1CCC4=O)C)CC2=CC=3O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O FJAZVHYPASAQKM-JBAURARKSA-N 0.000 description 70
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 48
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 21
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 21
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 21
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 19
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 19
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 18
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 230000011599 ovarian follicle development Effects 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000029849 luteinization Effects 0.000 description 5
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 3
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 3
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 3
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 2
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000001020 rhythmical effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- UVGHPGOONBRLCX-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[5-(2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoylamino]hexanoate Chemical compound S1CC2NC(=O)NC2C1CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O UVGHPGOONBRLCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 6-(4-aminophenyl)sulfonylpyridin-3-amine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=N1 XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 1
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035792 Kininogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical class C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229940095055 progestogen systemic hormonal contraceptives Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/972—Modified antibody, e.g. hybrid, bifunctional
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/819—Multifunctional antigen or antibody
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine Immunnachweismethode zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von zwei verschiedenen immunogenen zu analysierenden Substanzen (Analyten). Besonders betrifft die Erfindung eine Nachweismethode in einer Einzelprobe zur Bestimmung der relativen Konzentrationen verwandter hormonaler Stoffwechselprodukte wie Pregnandiol-3-glucuronid (P-3-G) und Oestron-3-glucuronid (E&sub1;-3-G). Insbesondere betrifft die Erfindung eine Immunnachweismethode, geeignet zur Überprüfung von Bestandteilen in menschlichem Urin zur Bestimmung des menschlichen Fruchtbarkeitszeitpunktes, das ist der Zeitpunkt, in dem lebensfähige Spermien und eine lebensfähige Eizelle gleichzeitig im weiblichen Geschlechtskanal vorhanden sein können.
- Aufgrund einer Vielzahl von Gründen kann es klinisch und/oder diagnostisch wünschenswert sein, die relativen Konzentrationen zweier verschiedener immunoger reaktiver Analyten in einer Einzelprobe zu bestimmen. In einigen Fällen erzeugt die Hormonaktivität und/oder der Hormonstoffwechsel von Säugern Situationen, in denen die Beziehungen zwischen Hormonkonzentrationen oder Stoffwechselprodukten in Körperflüssigkeiten chronologisch mit anderen Ereignissen übereinstimmen. Besonders kann die relative Konzentration von P-3-G und E&sub1;-3-G in menschlichem Urin zur Ermittlung des Fruchtbarkeitszeitpunktes im Menstruationszyklus benutzt werden. Falls aus bestimmten Gründen empfängnisverhütende Vorrichtungen und Mittel zur Verwendung nicht zur Verfügung stünden, wären Techniken wie ein Immunnachweisverfahren zur Bestimmung des Fruchtbarkeitszeitpunktes im Menstruationszyklus wünschenswert.
- Der menschliche Menstruationszyklus wird durch die zyklische Hormonfreisetzung aus den weiblichen Drüsen und Organan bestimmt. Diese Freisetzung ist vorhersagbar und geht spezifisch mit der Ovulation einher, bei der eine Eizelle aus den Ovarien freigesetzt und die Uterusauskleidung für die Schwangerschaft vorbereitet wird. Am Ende finden die freigesetzten Hormone und/oder deren Stoffwechselprodukte ihren Weg in den Urin. Die spezifischen biologischen Phänomene sind im Detail und klar in der Europäischen Patent-Veröffentlichung No. 0086095, veröffentlicht am 17. August 1983 im Europäischen Patentblatt 83/33 beschrieben. Es sei nur erwähnt, daß während eines normalen Menstruationszyklus der E&sub1;-3-G-Spiegel im weiblichen Urin ungefähr 6 Tage vor der Ovulation zu steigen beginnt, seinen Höhepunkt etwa einen Tag vor der Ovulation erreicht und während und nach der Ovulation schnell abfällt. Der P-3-G- Spiegel im weiblichen Urin beginnt am Tag der Ovulation zu steigen, erreicht seinen Höhepunkt 2 bis 3 Tage nach der Ovulation und bleibt während der lutealen Phase angehoben. Die Zusammenhänge zwischen den P-3-G- und E&sub1;-3-G-Spiegeln sind bekannt und anhand der oben erwähnten EP-Veröffentlichung wurde gefunden, daß das Verhältnis von Oestrogen- zu Gestagenstoffwechselprodukten im Urin zur Überwachung des Verlaufs des Menstruationszyklus brauchbar ist.
- Von besonderer Wichtigkeit beim Verfolgen des Menstruationszyklus zur Bestimmung der Hormonaktivität ist die Tatsache, daß während des fruchtbarsten Zeitpunktes der Gehalt an E&sub1;-3-G im Urin ungefähr 20 mal und mehr beträgt als der P-3-G-Gehalt. Daher wäre ein einfacher und zuverlässiger Nachweis, der fähig ist, den Zeitpunkt festzustellen und/oder zu bestimmen, an dem das E&sub1;-3-G/P-3-G-Verhältnis 20 oder größer ist, außerordentlich wertvoll bei der Feststellung, ob eine Frau fruchtbar ist.
- In der zuvor erwähnten '095-Patentveröffentlichung ist eine Immunnachweismethode zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von Antigenen in einer Einzelprobe offenbart. Der Immunnachweis verwendet ein Doppelligandenmolekül umfassend zwei verschiedene Antigene, die irreversibel über ein Brückenmolekül miteinander verbunden sind, um ein verlängertes Ligandenmolekül mit einem antigenen Rest an einem Ende und einem anderen antigenen Rest am anderen Ende zu präsentieren. Es ist bekannt, daß die Länge der Brücke zur Vermeidung einer sterischen Hinderung kritisch ist und es wurde gefunden, daß der Nachweis selbst empfindlich auf die Konzentration der Doppelliganden reagiert.
- Von dem in der '095-Patentveröffentlichung beschriebenen Nachweis wurde berichtet, daß er eine Verbesserung des in der britischen Patentschrift 2029011B beschriebenen Nachweises darstellt, der einen synthetischen bifunktionellen Liganden enthält, der durch Verbinden zweier verschiedener antigener Reste durch eine Proteinbindung wie Rinderserumalbumin (BSA) hergestellt wurde. Die Anzahl jedes Steroidmoleküls pro Molekül BSA kann jedoch durch stöchiometrisches Einstellen der Reagentien frei gewählt werden und die Einstellung bleibt schwierig. Wie in der '095-Veröffentlichung dargestellt, stellt die Methode der '011B-Patentbeschreibung aufgrund der Tendenz der bifunktionellen Liganden, multivalente Immunkomplexe zu bilden und unspezifisch zu reagieren, nicht immer sensitive Nachweismethoden zur Verfügung,.
- Die Doppelanalyten-Immunnachweismethode der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die Schwierigkeiten, die den Methoden des Standes der Technik innewohnen und stellt ein neuartiges Nachweisverfahren zur Verfügung, das ein ambifunktionelles Hybridkonjugat verwendet, das mindestens eine Antigenbindungsstelle eines Anti-P-3-G- Antikörpers oder P-3-G-Hormonrezeptors und eine Vielzahl antigener Determinanten eines E&sub1;-3-G-Moleküls enthält. Durch die Verwendung eines solchen Konjugats und der methodischen Aspekte der vorliegenden Erfindung wird ein Immunnachweisverfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen eines ersten und zweiten immunreaktiven Analyten in einer wäßrigen Einzelprobe zur Verfügung gestellt. In Übereinstimmung mit einem wichtigen Aspekt der Erfindung können der erste und zweite immunreaktive Analyt antigene Hormonstoffwechselprodukte sein, und zwar P-3-G und E&sub1;-3-G. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des menschlichen Fruchtbarkeitszeitpunktes durch Feststellen der Fälle in menschlichem Urin zur Verfügung, in denen das Verhältnis von E&sub1;-3-G zu P-3-G über einem zuvor bestimmten Schwellenwert liegt.
- In seinem breitesten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Analysensysteme (Kits) zur Verfügung, die in Verbindung mit Doppelanalyten- Immunnachweisen allgemein nützlich sind. Insbesondere stellt die Erfindung ein Nachweisverfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen eines ersten und zweiten immunreaktiven Analyten in einer wäßrigen Probe zur Verfügung. Die Analyten müssen nicht, auch wenn sie es im allgemeinen sind, metabolisch verwandt sein. Die vorliegende Erfindung ist auf die Bestimmung der relativen Konzentrationen dieser Analyten gerichtet und erzeugt ein Signal, wenn das Verhältnis eines Analyten zu einem anderen einen vorher bestimmten Wert übersteigt. Durch geeignete empirische Manipulation und Einstellung kann das Nachweisverfahren so eingestellt werden, daß sie ein positives Ergebnis bei jedem vorher bestimmten Verhältnis der Analyten zueinander zur Verfügung stellt.
- In Übereinstimmung mit der Erfindung, wird ein Nachweisverfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen eines ersten und zweiten immunreaktiven Analyten in einer wäßrigen Probe zur Verfügung gestellt. Das Nachweisverfahren beinhaltet die Schritte zur Bereitstellung einer Einfangreaktionskomponente, umfassend eine erste immunreaktive Substanz mit einer immunspezifischen Reaktivität, die zur immunspezifischen Reaktivität des ersten immunspezifischen Analyten analog ist. Die erste immunreaktive Substanz ist anfänglich an einen festen Träger gekoppelt oder zur Kopplung an einen festen Träger vorbereitet. Weiter beinhaltet das Nachweisverfahren eine Blockierungsreaktionskomponente, umfassend eine zweite immunreaktive Substanz mit der Fähigkeit, den zweiten immunreaktiven Analyten immunspezifisch zu binden. Ebenso wird in Übereinstimmung mit den breitesten Aspekten der Erfindung eine markierte Reaktionskomponente, umfassend eine dritte immunreaktive Substanz und einen an diese gekoppelten nachweisbaren Tag, bereitgestellt. Die dritte immunreaktive Substanz hat eine immunspezifische Reaktivität analog zur immunspezifischen Reaktivität der zweiten immunreaktiven Substanz.
- Als ein wichtiges Element beinhaltet die Erfindung ebenfalls das Bereitstellen einer ambifunktionellen Verbindungsreaktionskomponente, umfassend eine immunreaktive Hybridsubstanz mit mindestens einer ersten immunreaktiven Stelle, die die Fähigkeit besitzt, immunspezifisch entweder mit dem ersten immunreaktiven Analyten oder der ersten immunreaktiven Substanz zu binden. Die immunreaktive Hybridsubstanz hat mindestens eine zweite immunreaktive Stelle mit einer immunspezifischen Reaktivität, die analog zur immunspezifischen Reaktivität des zweiten immunreaktiven Analyten ist. Somit ist die zweite Stelle der immunreaktiven Hybridsubstanz fähig, immunspezifisch sowohl mit der zweiten wie auch dritten immunreaktiven Substanz zu binden.
- In Übereinstimmung mit der Erfindung beinhaltet die Methode den Schritt des Zusammenbringens der wäßrigen Probe mit (1) der Einfangreaktionskomponente, (2) einer Menge der ambifunktionellen Bindungskomponente, die gegenüber der Einfangreaktionskomponente ausreichend gering ist, um die Bindung zwischen der ersten immunreaktiven Stelle der Hybridsubstanz und der ersten immunreaktiven Substanz der Einfangkomponente in Gegenwart von mindestens einer festgesetzten Konzentration des ersten Analyten in der Probe so zu inhibieren, daß die Menge der ambifunktionellen Komponente mit der Fähigkeit, die erste immunreaktive Substanz zu binden, zu gering ist, um ein positives Nachweisergebnis zu erhalten, (3) die markierte Reaktionskomponente, und (4) eine Menge der Blockierungskomponente, die ausreichend hoch ist, um die zweite immunreaktive Stelle der Hybidsubstanz zu blockieren, und um die Bindung zwischen der letztgenannten und der zweiten immunreaktiven Substanz der markierten Komponente in Abwesenheit von mindestens einer festgesetzten Konzentration des zweiten Analyten in der Probe so zu inhibieren, daß die Menge der markierten Komponente mit der Fähigkeit, die zweite Stelle der Hybridsubstanz zu binden, zu gering ist, um ein positives Nachweisergebnis zu erhalten. Daher wird ein positives Nachweisergebnis nur erreicht, wenn die Konzentration des ersten Analyten in der Probe geringer ist als die festgelegte Konzentration und die Konzentration des zweiten Analyten in der Probe größer ist als die ausgewählte Konzentration, um dadurch eine bestimmbare Menge einer Immunzusammensetzung herzustellen, die sowohl die Einfangkomponente als auch die markierte Reaktionskomponente umfaßt.
- In einem spezifischeren Aspekt der Erfindung hat mindestens einer der immunreaktiven Analyten antigene Eigenschaften, und in einem bevorzugten Aspekt der Erfindung haben beide antigene Eigenschaften. Am meisten bevorzugt sind die Analyten steroidaler Natur, bevorzugt ein natürlich vorkommendes Hormon, und am meisten bevorzugt natürlich vorkommende Säuger-Steroidhormone oder deren Stoffwechselprodukte. In einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung ist der erste immunreaktive Analyt P-3-G und der zweite immunreaktive Analyt E&sub1;-3-G.
- In einem anderen wichtigen Aspekt der Erfindung umfaßt der feste Träger eine mikroporöse Membran. In einem anderen wichtigen Aspekt der Erfindung umfaßt der feste Träger ein verteilbares, wasserunlösliches Teilchen und die erste immunreaktive Substanz wird vor dem Verbindungsschritt an das Teilchen gekoppelt.
- In einem weiteren wichtigen Aspekt der Erfindung ist der nachweisbare Tag ein Goldsolteilchen.
- Die hybride, ambifunktionelle, immunreaktive Substanz kann eine erste proteinartige Substanz umfassend eine erste immunreaktive Stelle und eine zweite proteinartige Substanz umfassend eine zweite immunreaktive Stelle enthalten, wobei die erste und zweite proteinartige Substanz irreversibel miteinander verbunden sind, um die Hybridsubstanz zu präsentieren.
- In einem Aspekt der Erfindung kann deshalb die immunreaktive Hybridsubstanz der Erfindung beschrieben werden als umfassend mindestens eine antigene Hälfte und eine proteinartige Rezeptorhälfte, wobei die antigene Hälfte und die Rezeptorhälfte irreversibel miteinander verbunden sind, um die genannte Substanz zu präsentieren, die Hälften wahlweise durch eine Amidverbindung miteinander verbunden sind und wobei die Substanz zur Verwendung des gleichzeitigen Messens der Konzentrationen von zwei verschiedenen Analyten in einer einzigen wäßrigen Probe ist und die antigene Hälfte und die Rezeptorhälfte immunspezifisch reaktiv bei der Durchführung der gleichzeitigen Messung sind.
- In Übereinstimmung mit den Verfahrensaspekten der Erfindung kann während des Verbindungsschrittes die Probe mit der Blockierungskomponente zusammengebracht werden, bevor sie mit der markierten Komponente in Kontakt kommt.
- In einem anderen Verfahrensaspekt können die Blockierungskomponente, die ambifunktionelle Komponente und die feste Phasenkomponente mit der wäßrigen Probe zusammengebracht werden, um eine feste Testzwischenphase zu erzeugen. Die Testzwischenphase kann dann mit der markierten Komponente zusammengebracht werden, um eine Testergebnisphase zu erzeugen.
- Die erste immunreaktive Substanz kann vor dem Verbindungsschritt an den festen Träger gekoppelt werden. Alternativ kann die erste immunreaktive Substanz nach dem Verbindungsschritt an den festen Träger gekoppelt werden.
- Bevorzugt kann das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung zur Vorhersage des Fruchtbarkeitszeitpunktes des Menstruationszyklus benutzt werden. In diesem Fall kann der erste Analyt P-3-G und der zweite Analyt E&sub1;-3-G sein, wobei die erste immunreaktive Substanz P-3-G und die zweiten und dritten immunreaktiven Substanzen dieselben Antikörper gegen E&sub1;-3-G sind, wobei die erste immunreaktive Stelle mit einer Antigenbindungsstelle eines Antikörpers gegen P-3-G versehen ist und die zweite immunreaktive Stelle mit einer Antigendeterminante eines E&sub1;-3-G Moleküls ausgestattet ist. In diesem bevorzugten Aspekt der Erfindung sind der Antikörper gegen P-3-G und das E&sub1;-3-G Molekül irreversibel miteinander verbunden, um die ambifunktionelle, immunreaktive Hybridsubstanz zu präsentieren. Der nachweisbare Tag kann ein Goldsolteilchen sein, der feste Träger kann eine mikroporöse Membran umfassen und die erste immunreaktive Substanz wird vorzugsweise vor dem Verbindungsschritt an das Teilchen gekoppelt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird während des Verbindungsschrittes die Blockierungskomponente, die ambifunktionelle Bindungskomponente und die feste Phasenkomponente mit der wäßrigen Probe zusammengebracht, um eine Testzwischenphase zu erzeugen. Die Testzwischenphase kann danach mit der markierten Komponente zusammengebracht wird, um die Testergebnisphase zu erzeugen. In diesem bevorzugten Aspekt der Erfindung kann die Testzwischenphase gesammelt werden vor dem Kontaktieren mit der markierten Komponente. Nachdem dieser Kontakt hergestellt wurde, um die Testergebnisphase zu erzielen, kann diese direkt visuell durch Anfärben zum Nachweis von Goldsolteilchen inspiziert werden. In dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Testzwischenphase auf einer Membran gesammelt und die Testergebnisphase auf dieser Membran visuell inspiziert werden.
- In Übereinstimmung mit der Erfindung kann der nachweisbare Tag ein Goldsolteilchen, eine Komponente eines enzymatischen Färbesystems oder jede andere Art eines nachweisbaren Tags sein, der in Verbindung mit Immunnachweisen brauchbar ist.
- Die Erfindung stellt ebenfalls einen Nachweiskit (Analysensystem) zur Durchführung des Nachweisverfahrens der Erfindung bereit. Der Kit kann die Einfangkomponente, die Blockierungskomponente, die markierte Komponente und die ambifunktionelle Komponente umfassen. In Übereinstimmung mit den spezifischeren Aspekten der Erfindung kann der Nachweiskit auch eine mikroporöse Membran oder einen mikroporösen Filter zum sammeln und visuellen Inspizieren der Testergebnisphase enthalten.
- In einem weiteren wichtigen Aspekt der Erfindung stellt der Kit eine immunreaktive Hybridsubstanz, umfassend mindestens einen antigenen Rest und einen proteinartigen Antikörperrest bereit, wobei der antigene Rest und der Antikörperrest irreversibel miteinander verbunden sind, um die immunreaktive Substanz zu präsentieren.
- Figur 1 ist eine graphische Darstellung, die die rhythmische Schwankung der Konzentrationen von E&sub1;-3-G und P-3-G in menschlichem Urin während des Menstruationszyklus einer Frau darstellt (die Daten sind Durchschnittswerte von 50 Zyklen);
- Figur 2 ist eine graphische Darstellung, die die rhythmische Schwankung des E&sub1;-3-G/P- 3-G-Verhältnisses (die Daten beziehen sich auf die Werte aus Figur 1) während des Menstruationszyklus einer Frau zeigt; und
- Figur 3A, 3B, 3C und 3D sind Tabellen, die die verschieden Bedingungen darstellen, die positive oder negative Ergebnisse in Übereinstimmung mit der Erfindung liefern können.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Nachweisverfahren bereit zur Bestimmung der relativen Konzentrationen eines ersten und zweiten immunreaktiven Analyten in einer wäßrigen Probe, einen Kit mit Materialien zur Durchführung des Nachweisverfahrens der Erfindung, und eine neuartige immunreaktive Hybridsubstanz, umfassend mindestens einen antigen Rest und einen proteinartigen Antikörper oder einen Hormonrezeptorrest, deren Reste irreversibel miteinander verbunden sind, um eine ambifunktionelle Bindungskomponente zu präsentieren. Wie in der vorliegenden Beschreibung benutzt, bezeichnet der Ausdruck ambifunktionell ein Molekül, das mindestens eine antigene Bindungsstelle eines Antikörpers oder anderen Rezeptors und mindestens eine antigene Determinante eines Antigens besitzt, wobei das ambifunktionelle Molekül fähig ist, sowohl als Antikörper (Rezeptor) als auch als Antigen zu reagieren. Im Sinn der vorliegenden Erfindung besitzt die ambifunktionelle Komponente im allgemeinen eine antigene Bindungsstelle eines Antikörpers zu oder eines Hormonrezeptors von einer der Testanalyten und eine antigene Determinante des anderen Testanalyten. Weitere Details der ambifunktionellen Komponente sind nachfolgend beschrieben.
- In seinem weitesten Aspekt ist die Erfindung generell in jeder Situation anwendbar, in der es wünschenswert ist, die relativen Konzentrationen von zwei verschiedenen Analyten in einer wäßrigen Einzelprobe zu untersuchen. Insbesondere ist die Methode der vorliegenden Erfindung generell in Situationen anwendbar, die nach der Bestimmung des Verhältnisses der Konzentration eines Analyten in einer wäßrigen Lösung zur Konzentration eines anderen Analyten in einer wäßrigen Lösung verlangen. Daher stellt die Erfindung einen Nachweis bereit, der zwei Analyten gleichzeitig messen kann. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wie nachfolgend beschrieben wird, stellt die Erfindung einen gleichzeitigen Nachweis von Doppelanalyten zur Bestimmung des Verhältnisses von Oestron-3-glucuronid (E&sub1;-3-G) zu Pregnandiol-3-glucuronid (P-3-G) in menschlichem Urin bereit. Es ist von Vorteil, daß die Messung dieser steroidalen Stoffwechselprodukte zur Eingrenzung des Fruchtbarkeitszeitpunktes in menstruierenden Frauen brauchbar ist. Das Verhältnis von E&sub1;-3-G zu P-3-G stellt nützliche Informationen bereit, die den Beginn des Fruchtbarkeitszeitpunktes etwa 5 bis 6 Tage vor der Ovulation anzeigt und das Ende des Fruchtbarkeitszeitpunktes ungefähr 2 Tage nach der Ovulation. Der Nachweis beinhaltet die Verwendung einer festen Phase, an die P-3-G kovalent gebunden sein kann, einen Blockierungsantikörper gerichtet gegen E&sub1;-3-G, denselben Antikörper gegen E&sub1;-3-G, markiert mit Gold und eine ambifunktionelle Bindungskomponente.
- Der Nachweis erlaubt zwischen hohen und niedrigen Werten von E&sub1;-3-G und P-3-G gleichzeitig zu unterscheiden. Nur wenn der Wert von E&sub1;-3-G hoch und der Wert von P- 3-G niedrig ist, erhält man eine Färbung, die ein positives Ergebnis anzeigt. Die ambifunktionelle Bindungskomponente stellt eine Verbindung bereit, an der mit Goldmarkierte Antikörper binden können. Das Vorhandensein von freien P-3-G-Analyten im Urin inhibiert die Bindung der ambifunktionellen Bindungskomponente an die feste Phase. Das Vorhandensein von freien E&sub1;-3-G-Analyten im Urin inhibiert die Bindung eines Blockierungsantikörpers, gerichtet gegen E&sub1;-3-G, was dem Gold-markierten Antikörper die Bindung an die ambifunktionelle Bindungskomponente erlaubt. So betrachtet beinhaltet der gleichzeitige Nachweis von Doppelanalyten zwei Immunnachweise, die gleichzeitig durchgeführt werden. Im Urin wird P-3-G mittels eines konventionellen kompetitiven Inhibierungsnachweises nachgewiesen und zur gleichen Zeit wird der Urin auf das Vorhandensein von E&sub1;-3-G untersucht unter Nutzbarmachen eines positiven Schrittimmunnachweises wie in EP-A 0327843, veröffentlicht am 16. August 1989 beschrieben. So wird bei hohen P-3-G- Konzentrationen (d. h. höher als ein zuvor festgelegter, zuvor bestimmter Wert) keine Färbung bei irgendeinem Wert von E&sub1;-3-G erzielt. Ist der Wert von P-3-G niedriger als der zuvor festgelegte, bestimmte Wert, erhält man eine Färbung, die ein positives Ergebnis anzeigt, wann immer der Wert von E&sub1;-3-G über einem anderen zuvor festgelegten, bestimmten Wert liegt.
- In Bezug zu Figur 1 sind die Werte von E&sub1;-3-G und P-3-G in menschlichem Urin während des Menstruationszyklus graphisch dargestellt. Auch wenn die Kurven überlappend dargestellt sind, sollte bemerkt werden, daß E&sub1;-3-G mit einer Skalierung aufgetragen ist, die ungefähr ein bis neunfach komprimiert ist im Vergleich zum P-3-G- Auftrag und die Kurven tatsächlich nicht vergrößert sind. Die Tabelle gibt einfach die Art und Weise wider, in der die Werte der zwei Hormonstoffwechselprodukte während des Menstruationszyklus rhythmisch schwanken.
- In Figur 1 entspricht Tag Null dem Tag der Ovulation. Der Fruchtbarkeitszeitpunkt wird generell betrachtet als der Zeitbereich von ungefähr 5 bis 6 Tage vor bis etwa 2 Tage nach der Ovulation. Der menschliche Menstruationszyklus kann definiert werden als eine follikuläre Phase (bis zur Ovulation) und eine luteale Phase (nach der Ovulation). Während der follikulären Phase werden Oestrogene zur Regeneration der Gebärmutterschleimhaut abgegeben. Die Ovulation wird von der Ausscheidung von Gestagenen begleitet, um die Bildung der Gebärmutterschleimhaut zu stimulieren und so den Uterus auf die Einnistung einer befruchteten Eizelle vorzubereiten. Wenn keine Einnistung erfolgt, fällt der Spiegel an Gestagenen, was zum Abbau der Gebärmutterschleimhaut und zur Blutung führt. Der gesamte Zyklus dauert etwa 28 Tage. Dieses Phänomen kann durch Verfolgen der Konzentrationen der Hormonstoffwechselprodukte im Urin nachvollzogen werden. So ist anhand von Figur 1 zu sehen, daß der Spiegel des Gestagenstoffwechselproduktes P-3-G während der follikulären Phase relativ gering ist und ungefähr zum Zeitpunkt der Ovulation ansteigt, um einen Höhepunkt etwa 6 bis 8 Tage nach der Ovulation zu erreichen, gefolgt von einem anschließenden Abfall zum früheren follikulären Phasenspiegel. Der E&sub1;-3-G- Spiegel im Urin ist während der frühen follikulären Phase relativ gering und beginnt etwa 6 Tage vor der Ovulation anzusteigen und erreicht seinen Höhepunkt etwa 2 Tage vor der Ovulation. Der E&sub1;-3-G-Spiegel sinkt dann scharf zur Ovulation ab, um einen relativ geringen Spiegel während der lutealen Phase und wieder während der frühen follikulären Phase aufzunehmen. Das Verhältnis der E&sub1;-3-G-Konzentration zur P-3-G- Konzentration ist in Figur 2 dargestellt, in der zu sehen ist, daß das Verhältnis während der frühen follikulären Phase gering und etwa 6 Tage vor der Ovulation schnell ansteigt, und einen Höhepunkt direkt vor der Ovulation erreicht. Das Verhältnis von E&sub1;-3-G zu P- 3-G sinkt dann schnell zur Ovulation ab, um dann wieder einen geringen Spiegel während der lutealen Phase des Menstruationszyklus anzunehmen. Die vorliegende Erfindung stellt ein positives Ergebnis bereit, wenn das Verhältnis von E&sub1;-3-G zu P-3-G hoch ist, wobei der fruchtbarste Zeitpunkt des Zyklus eingegrenzt wird.
- In Bezug auf die Figuren 3A, 3B, 3C und 3D veranschaulichen die Diagramme den Immunnachweis schematisch während verschiedener Phasen des Menstruationszyklus. In diesen Figuren werden die folgenden Symbole zur Veranschaulichung der verschiedenen Komponenten verwendet:
- E = E&sub1;-3-G
- P = P-3-G
- Anti-E&sub1;-3-G-Antikörper
- Anti-P-3-G-Antikörper
- = feste mikroporöse Trägermembran
- fester Träger, an den P-3-G gebunden ist
- Gold-markierter Anti-E&sub1;-3-G-Antikörper
- Figur 3A veranschaulicht schematisch den Immunnachweis während des Fruchtbarkeitszeitpunktes, das heißt, wenn der E&sub1;-3-G-Spigel hoch und der P-3-G- Spiegel relativ gering ist. In dieser Situation ist zu wenig P-3-G in der Probe vorhanden, um eine Verbindung der ambifunktionellen Hybridbindungskomponente an das an die feste Phase gebundene P-3-G zu verhindern oder zu inhibieren. Zur selben Zeit ist der E&sub1;-3-G-Spiegel in der Probe ausreichend hoch, um den Anti-E&sub1;-3-G-Antikörper zu blockieren und ihn vom Blockieren der E&sub1;-3-G antigenen Determinante auf der ambifunktinonellen Bindungskomponente abzuhalten. Daher sind die E&sub1;-3-G antigenen Determinanten der ambifunktinonellen Bindungskomponente zur Bindung des Goldmarkierten Anti-E&sub1;-3-G-Antikörper frei. Die Goldmarkierung wird somit von der ambifunktionellen Bindungskomponente an den festen Träger gebunden und kann dann mit bloßem Auge erkannt werden. Wie in Figur 3A bis 3D dargestellt, besteht die feste Phase anfänglich aus einer mikroporösen Membran, an die P-3-G gebunden ist. Während des Nachweises wandern ungebundene Komponenten einfach durch die Membranporen, wie durch die Pfeile angedeutet, und sind somit auf der Einfangkomponente der festen Phase während der Bewertung der Testergebnisse nicht vorhanden.
- Figur 3B stellt die Bedingungen während der lutealen Phase dar, in der die E&sub1;-3-G- Konzentration in der Probe gering und die P-3-G-Konzentration in der Probe relativ hoch ist. In dieser Situation inhibiert der hohe P-3-G-Spiegel in der Probe die Bindung der ambifunktionellen Bindungskomponente an das an die feste Phase gebundene P-3-G. Alle Komponenten wandern einfach durch die Membranporen und es binden keine Goldmarkierungen. Figur 3C stellt die Bedingungen der frühen follikulären Phase dar, in der die Konzentration jedes Analyten gering ist. In diesem Fall bindet die ambifunktionelle Bindungskomponente an das an die feste Phase gebundene P-3-G. Der E&sub1;-3-G-Spiegel ist jedoch zu gering, um das Blockieren der E&sub1;-3-G-Determinante der ambifunktionellen Komponente durch den Blockierungsantikörper zu verhindern. Daher bindet der Gold-markierte Antikörper nicht an die feste Phase und passiert einfach die poröse Membran. Figur 3D stellt eine hypothetische Bedingung dar, in der der Spiegel jedes Analyten relativ hoch ist. Das kommt sicherlich nicht während eines menschlichen Menstruationszyklus vor, diese Bedingungen könnten aber in anderen Systemen auftreten. In diesem Fall inhibiert und verhindert der hohe P-3-G-Spiegel im Urin die Bindung der ambifunktionellen Bindungskomponente an die feste Phase, und es werden keine Komponenten des Nachweises von der festen Phase eingefangen.
- In der vorliegenden Offenbarung werden folgende Definitionen verwendet.
- Eine Substanz, die fähig ist, mit einer anderen immunreaktiven Substanz spezifisch zu binden. Im Sinne der vorliegenden Offenbarung ist die Terminologie anwendbar auf Liganden und Rezeptoren, einschließlich der Materialien, die antigen oder hapten sind, oder Antikörpereigenschaften ausbilden und Substanzen, die antigene Determinanten und/oder Antigen-Bindungsstellen von Antikörpern oder anderen Rezeptoren umfassen.
- Die Verbindung oder Zusammensetzung, die entdeckt oder bestimmt werden soll und die ein Ligand oder ein Rezeptor sein kann.
- Die Fähigkeit, spezifisch mit einem Bindungspartner aufgrund einer korrespondierenden Antigen-Bindungsstelle und antigenen Determinanten binden zu können.
- Die Fähigkeit, immunspezifisch mit der analogen Substanz um die immunogenen Bindungsstellen eines immunspezifischen Bindungspartners zu konkurrieren.
- Bezogen auf eine kovalente oder nichtkovalente Bindung oder eine andere physikalische Eigenschaft, die gekoppelte Komponenten während der Auswertung des Immunnachweises zusammenhält.
- Ausbilden einer Eigenschaft, z. B. eine reaktive Gruppe, die der Substanz erlaubt, mit einer anderen Substanz oder einem Objekt gekoppelt zu werden, wenn sie in deren Nähe gebracht wird. Im Sinn der vorliegenden Erfindung ist eine Komponente, die einen Biotinrest trägt, zum Koppeln an einen festen Träger oder eine andere Komponente vorbereitet, die einen Avidinrest trägt.
- Ein festes Material, das definierte physikalische Größe und Eigenschaften besitzt, die es während eines Immunnachweises unbeweglich bleiben lassen, oder falls es beweglich ist, es zulassen, daß es durch Filtration, Sedimentation und/oder Zentrifugation oder ähnliches eingefangen wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Terminologie mikroporöse Membranen, die inneren Oberflächen von Test- Reaktionsgefäßen oder Mikro-ELISA-Platten, Filterelemente und feste Partikel oder Kügelchen und dergleichen.
- Eine Substanz, gebunden an eine immunreaktive Substanz, die eine Entdeckung der immunreaktiven Substanz zu einem gewünschten Zeitpunkt erleichtert. Zur Zeit bekannte Markierungen oder Tags beinhalten Goldpartikel, Bestandteile in enzymatischen Färbereaktionen, fluoreszierende Materialien, radioaktive Materialien und dergleichen.
- Eine Eigenschaft, die das Ergebnis eines gleichzeitigen Besitzens von mindestens einer antigenen Determinante und wenigstens einer Antigen-Bindungsstelle ist. Solche Antigen-Bindungsstellen sind fähig zur immunchemischen Bindung der korrespondierenden antigenen Determinante des Antigens und sind funktionelle Komponenten von Antikörpern und anderen Rezeptoren. Eine Substanz ist ambifunktionell im Sinne der vorliegenden Beschreibung, wenn sie fähig ist, immunspezifisch sowohl als Ligand als auch als Rezeptor zu reagieren.
- Die Bezeichnung Hybrid im Sinne der vorliegenden Beschreibung bezieht sich einfach auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die immunspezifische reaktive Stellen von zwei oder mehr Liganden und/oder Rezeptoren beinhaltet und diese Stellen irreversibel durch äußere Umstände miteinander ge- oder verbunden sind.
- Eine Stelle auf einer Substanz oder einer Verbindung, die fähig ist, immunspezifisch mit einem Bindungspartner, zum Beispiel einer variablen Region eines Antikörpers oder einer antigenen Determinante zu reagieren.
- Die Erfindung ist weiter durch die folgenden Beispiele erläutert:
- Ein ambifunktionelles Hybridbindungskonjugat, enthaltend mindestens eine Antigen- Bindungsstelle eines Anti-P-3-G-Antikörpers und eine Mehrzahl von antigenen Determinanten eines E&sub1;-3-G-Moleküls wurde mittels des Carbodiimid-Verfahrens nach Goodfriend et al. hergestellt; siehe "Antibodies to Bradykinin and Angiotensin: A Use of Carbodiimides in Immunology", Science (Washington), Vol. 144, Seiten 1344-1346, (12. Juni 1964). Eine Lösung, enthaltend Anti-P-3-G-Antikörper wurde konzentriert und gegen 0,15 M NaCl bei 4ºC dialysiert. Die erhaltene Lösung besaß eine Antikörper- Konzentration von 11,5 mg/ml; ein 1,5 ml Aliquot davon enthielt also 17,25 mg (1,078 x 10&supmin;&sup4; mol) des Anti-P-3-G-Antikörpers. 22 mg (4,4 x 10&supmin;² mmol) E&sub1;-3-G wurden in 0,5 ml H&sub2;O gelöst und mit 1,5 ml der Anti-P-3-G-Antikörper-Lösung versetzt. Die erhaltene Mischung hat ein Verhältnis von ungefähr 1:400 mol/mol von Anti-P-3-G- Antikörper (MG = 160 000) zu E&sub1;-3-G (MG = 500). 16 mg wasserlösliches Carbodiimid, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-HCl (Sigma; MG = 191,7) wurden in der Mischung aus Anti-P-3-G-Antikörper und E&sub1;-3-G gelöst und die erhaltene Mischung wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Reaktionsprodukt wurde 1:2 in PBS/Azid verdünnt, gegen PBS/Azid (pH 7,4) dialysiert und durch einen 0,22 µm Filter (Gelman) gefiltert. Das Endvolumen betrug 4 ml.
- -Pregnandiol-3-Glucuronid (P-3-G; Sigma) wurde in einer 50% Ethanol/Wasser-Lösung gelöst. 0,156 µg/ml und 0,625 µg/ml Konzentrationen wurden in einer 0,1% Gelatine- Lösung in PBS (pH 7,4) mit 0,2% Natriumazid hergestellt. -Oestron-3-glucuronid(E&sub1;-3-G)-Standards wurden im wesentlichen auf die gleiche Art hergestellt, um Konzentrationen von 0, 0,156, 0,3125, 0,625, 1,25 und 5 µg/ml erhalten.
- -Anti-P-3-G-Antikörper wurde in 2,5% PEG 8000 in PBS (pH 7,4) mit 0,02% Natriumazid verdünnt, um eine Konzentration von 512 µg/L zu erhalten.
- -Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Konjugat, daß ein ambifunktionelles Hybridmolekül mit mindestens einer Antigen-Bindungsstelle eines Anti-P-3-G- Antikörpers und einer Mehrzahl von E&sub1;-3-G antigenen Determinanten umfaßt, wurde zu einem Verhältnis von 1:40 in einer 1% BSA-Lösung in PBS (pH 7,4) mit 0,02% Natriumazid verdünnt.
- -Anti-E&sub1;-3-G-Antikörper wurde im wesentlichen wie in Beispiel 1 der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Nummer 105285 mit Goldsolteilchen markiert, die nach dem Frens-Verfahren hergestellt wurden. Diesbezüglich wurden 12,32 ml einer 100 mM Natriumborat-Pufferlösung (pH 10,5) schnell mit 164,25 ml der Golddispersion vermischt, die Teilchen mit einem Durchschnitt von etwa 60 bis 90 nM enthielt. Während des Mischens wurden 36,5 ml einer 188 µg/ml Antikörperlösung in 2mM Boratpuffer zugesetzt und für 15 Minuten inkubiert. 16,4 ml einer 5% 20 M PEG-Lösung (Sigma, St. Louis) wurden während des Mischens zugegeben und die Beimischung wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gold-markierte Antikörperlösung wurde in einem Sorvall-GSA-Rotor dreimal bei 10000 Upm in einer Sorvall RC5B zentrifugiert. Nach jeder Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das rote Sediment in Johnson-Puffer (0,6 g/L TRIZMA , 0,01 g/L PEG (20 M) und 0,01 g/L Thimerosal in gereinigtem Wasser, mit HCl auf pH 9,0 eingestellt) resuspendiert. Die Lösung wurde durch einen 0,22 µM Filter gefiltert und mit Johnson-Puffer auf ein Volumen von 46,9 ml eingestellt. Zum Schluß wurde die Antikörper- Lösung auf ein Verhältnis von 1:20 mit einer 40 mM MgSO&sub4;, 1% BSA und 0,02% Natriumazid-Lösung eingestellt.
- -Gelatine/P-3-G wurde durch direktes Koppeln mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids hergestellt. In diesem Verfahren wurden 150 mg Gelatine in 4 ml warmen Wasser gelöst und mit 1 ml Pyridin versetzt. Es wurde eine 5 ml Lösung mit 20% Pyridin in Wasser erhalten. In einem getrennten Behältnis wurden 20 mg P-3-G in 0,2 ml Pyridin gelöst und soviel Wasser zugegeben, um eine 1 ml Lösung mit 20% Pyridin zu erzeugen. 1 ml dieser Gelatine-Lösung wurde mit 0,625 ml der P-3-G-Lösung gemischt und mit 9,55 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid- HCl versetzt und gelöst. Die Mischung wurde unter Rühren zwei Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Lösung wurde gegen warmes PBS/Azid dialysiert und mit PBS/Azid auf eine Gelatine-Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnt. Je 10 ml der 1 mg/ml Gelatine-P-3-G-Lösung wurden dann auf eine Anzahl von Millipore Immobilon aktivierten mikroporösen Membranen (0,65 µM) aufgebracht und das Gelatine-P-3-G wurde auf diesen immobilisiert. Nach dem Aufbringen wurden die Membranen für 5 Minuten in eine unverdünnten Monoethanolamin-Lösung eingetaucht.
- -0,2% Igepal in H&sub2;O.
- 1. Die Proben wurden so hergerichtet, daß sie alle Kombinationen der vorstehend angeführten verschiedenen Standardhormon-Konzentrationen enthielten.
- 2. Zwölf Reaktionsgefäße wurde bereitgestellt und in jedes wurden 80 µl der Probe, 25 µl E&sub1;-3-G-Antikörper-Lösung (Blockierungs-Antikörper) und 20 µl der verdünnten Lösung der ambifunktionellen Hybridbindungskomponente mit anschließendem Rühren nach jeder Zugabe zugegeben.
- 3. Die Mischungen aus Schritt 2. wurden jeweils durch eine feste Phase geschüttet, d. h. eine Membran, auf die Gelatine-P-3-G aufgebracht war, und die in einem Durchfluß-Nachweisgerät (FTA) befestigt war. Dieses Gerät gleicht im wesentlichen dem in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Nummer 107240, eingereicht am 29. Oktober 1987, beschriebenen Gerät.
- 4. 0,2 ml der verdünnten Lösung der Gold-markierten Komponente wurde dann durch die Membran passiert.
- 5. Die Membran wurde dann durch Hindurchleiten der Waschlösung durch die Membran gewaschen, bis der Deckel des FTA-Geräts gefüllt war.
- 6. Die Ergebnisse wurden durch visuelle Überprüfung ermittelt und durch Beobachten der Membran, um die rosa Farbe zu erkennen, die charakteristisch für das Vorhandensein von Goldteilchen ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Es ist zu erkennen, daß die Proben mit einer hohen Konzentration an P-3-G (0,625 µg/ml) keine Färbung auf der Membran hinterließen, unabhängig von der E&sub1;-3-G- Konzentration. Bei niedrigen P-3-G-Konzentrationen (0,156 µg/ml) entwickelten die Proben mit geringen E&sub1;-3-G-Konzentrationen (0,3125 µg/ml und darunter) keine Färbung, während Proben mit hohen E&sub1;-3- G-Konzentrationen (über 0,3125 µg/ml) ausgeprägte rosa Färbungen zeigten. Tabelle 1 E&sub1;-3-G-Konzentration (µg/ml) P-3-G-Konzentration (µg/ml)
- In der Tabelle bedeutet das (-) Zeichen keine Farbbildung und das (+) Zeichen eine ausgeprägte Farbbildung.
- Im vorangegangenen Beispiel bestand der feste Träger aus einer mikroporösen Membran. Die feste Komponente wurde durch Kopplung von P-3-G an die mikroporöse Membran mittels einer Gelatinebindung hergestellt. In diesem Fall wurde die erste immunspezifische Substanz, also P-3-G selbst, zuerst an den festen Träger vor dem Kontaktschritt (Schritt 3 im Beispiel 2 des Nachweisverfahrens) gekoppelt. Als ein Ergebnis des Kontaktschrittes band die ambifunktionelle Hybridbindungskomponente an P-3-G auf dem festen Träger in den Fällen, in denen die Menge des P-3-G-Analyts in der Probe unzureichend war, um die Bindung zu inhibieren. In den Fällen, in denen die P-3-G-Konzentration höher war als die zuvor bestimmte Menge, passierte die ambifunktionelle Hybridkomponente einfach die Membran. Auf alle Fälle kann der Kontaktierungsschritt, was auch immer nach dem Kontaktschritt auf der Membran vorhanden ist, grob als Testzwischenphase charakterisiert werden. Im Falle geringen P- 3-G-Gehalts enthält die Zwischenphase eine ambifunktionelle Hybridbindungskomponente, die an P-3-G auf der festen Komponente gebunden ist. Im Fall hoher P-3-G-Konzentration in der Probe enthält die Zwischenphase nur die feste Phasenkomponente, umfassend nicht reagiertes P-3-G, das an die Membran gebunden ist. Wenn E&sub1;-3-G in ausreichend hohen Konzentrationen in der Originalprobe vorhanden war, blieben die E&sub1;-3-G antigenen Determinanten der ambifunktionellen Hybridbindungskomponente der Testzwischenphase unblockiert, hingegen in den Fällen, in denen der E&sub1;-3-G-Spiegel in der Probenlösung unter dem zuvor ausgewählten Spiegel lag, die E&sub1;-3-G antigenen Determinanten auf der ambifunktionellen Hybridkomponente durch Blockieren mit Anti-E&sub1;-3-G-Antikörper blockiert wurden. In jedem Fall wurden die verschiedenen Testzwischenphasen mit der Gold-markierten Komponente aus Schritt 4 in Kontakt gebracht. In den Fällen, in denen die ambifunktionelle Hybridbindungskomponente an die feste Komponente gebunden war und die E&sub1;-3-G antigenen Determinanten darauf unblockiert blieben, band die markierte Komponente an die ambifunktionelle Komponente und wurde so an den festen Träger gebunden. In allen anderen Fällen passierte die markierte Komponente einfach durch die Membran. Eine rosa Testergebnisphase wurde also in den Fällen erzielt, in denen die E&sub1;-3-G- Konzentrationen hoch und die P-3-G-Konzentrationen in der Testprobe gering waren. In allen anderen Fällen blieb die Ergebnisphase ungefärbt.
- -P-3-G- und E&sub1;-3-G-Proben wurden in einer 50% Ethanol/Wasser-Lösung gelöst und P-3-G-Konzentrationen von 1,25, 2,5 und 5 µg/ml und E&sub1;-3-G-Konzentrationen von 0,625, 0,3125, 0,156, 0,78 und 0,039 µg/ml wurden in einer 0,1% BSA-Lösung in PBS (pH 7,4) hergestellt.
- -Wie in Beispiel 2, jedoch betrug die Anti-E&sub1;-3-G- Antikörper-Konzentration in der Lösung 128 µg/ml.
- -Wie in Beispiel 2, jedoch wurde das Konjugat aus Beispiel 1 auf 1:150 verdünnt.
- -Anti-E&sub1;-3-G-Antikörper wurde mit Goldteilchen markiert, die nach dem Frens-Verfahren hergestellt wurden. In diesem Fall wurden 12,79 ml einer 100 mM Natriumborat- Pufferlösung (pH 10) schnell mit 170,5 ml der Golddispersion vermischt, die Teilchen mit einem Durchschnitt von etwa 56 nM enthielt. Während des Mischens wurden 37,8 ml einer 180 µg/ml Antikörperlösung in 2 mM Boratpuffer zugesetzt und für 15 Minuten inkubiert. 17,5 ml einer 5% 20 M PEG-Lösung (Sigma, St. Louis) wurden während des Mischens zugegeben und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gold-markierte Antikörperlösung wurde in einem Sorvall-GSA-Rotor dreimal bei 10000 Upm in einer Sorvall-RC5B-Zentrifuge zentrifugiert. Nach jeder Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das rote Sediment in Johnson- Puffer (pH 9,0) resuspendiert. Schließlich wurde die Lösung durch einen 0,22 µM Filter gefiltert und mit Johnson-Puffer auf ein Volumen von 5,2 ml eingestellt. Die Antikörper-Lösung wurde auf ein Verhältnis von 1:100 mit einer 40 mM MgSO&sub4;, 1% BSA und 0,02% Natriumazid- Lösung eingestellt.
- -In diesem Beispiel bestand die feste Phasenkomponente aus einer biotinylierten Gelatine/P-3-G-Komponente (BGP), die das Einfangen der Verbindung an einer mit Avidin behandelten Membran ermöglicht.
- -Gelatine/P-3-G wurde durch Lösen von 8,27 mg P-3-G in einer 20% Pyridin/Wasser- Lösung mit einem Endvolumen von 0,276 ml (30 mg P-3-G/ml) hergestellt. 20 mg der Gelatine wurden ebenfalls in einer 20% Pyridin/Wasser-Lösung mit einem Endvolumen von 0,485 ml (41,2 mg Gelatine/ml) hergestellt. Die Lösungen von P-3-G und Gelatine wurden gemischt, um eine Mischung mit einem molaren P-3-G/Gelatine-Verhältnis von 50:1 zu erzeugen. 8 mg des Wasser löslichen Carbodiimid aus Beispiel 1 und 2 wurde der Mischung zugefügt und bei Raumtemperatur eine Stunde inkubiert. Das Reaktionsprodukt wurde gegen PBS/Azid dialysiert und die Konzentration so eingestellt, daß die Endlösung 13 mg Gelatine/ml enthielt. Die Lösung wurde ferner auf eine Gelatine-Konzentration von 1 mg/ml mit 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,0) verdünnt und 0,585 ml einer 1 mg/ml Biotin-LC-NHS-Lösung in DMSO wurde zu 3,9 ml der verdünnten Gelatine/P-3-G-Lösung zugegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Das erhaltene biotinylierte Gealtine/P-3-G (BGP) wurde dann gegen PBS/Azid dialysiert und die BGP-Lösung auf eine Verdünnung von 1:32 in PBS verdünnt.
- -20 µl einer 2,5 mg/ml Avidin-Lösung in PBS mit 10 mg/ml 4-Dimethylaminopyridin wurde auf eine Anzahl von Millipore Immobilon mikroporösen aktivierten Membranen (0,65 µM) geträufelt und das Avidin auf jeder Membran immobilisiert. Die Avidin behandelten Membranen wurden dann mit 10% Ethanolamin in Carbonatpuffer (1 M; pH 9,5) über Nacht blockiert.
- 1. Die Proben wurden so hergerichtet, daß sie alle Kombinationen der vorstehend angeführten verschiedenen Standardhormon-Konzentrationen enthielten.
- 2. 15 Reaktionsgefäße wurde bereitgestellt und in jedes wurden 50 µl der Probe, 25 µl der Anti-E&sub1;-3-G-Antikörper-Lösung (128 µg/L), 20 µl der verdünnten BGP-Lösung und 20 µl der verdünnten Lösung der ambifunktionellen Hybridbindungskomponente mit anschließendem Rühren nach jeder Zugabe zugegeben.
- 3. Die Mischung aus Schritt 2 wurde jeweils durch eine feste Phase passiert, d. h. eine Membran, auf die Avidin aufgebracht war, und die in einem wie in Beispiel 2 verwendeten Durchfluß-Nachweisgerät (FTA) befestigt war.
- 4. 0,2 ml der verdünnten Lösung der Gold-markierten Komponente wurde dann durch die Membran passiert.
- 5. Die Membran wurde dann durch Hindurchleiten der Waschlösung durch die Membran gewaschen, bis der Deckel des FTA-Geräts gefüllt war.
- 6. Die Ergebnisse wurden durch visuelle Überprüfung ermittelt und durch Beobachten der Membran, um die rosa Farbe zu erkennen, die charakteristisch für das Vorhandensein von Goldteilchen ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt, aus der zu erkennen ist, daß die Proben mit einer geringen Konzentration an E&sub1;-3-G nur eine geringe oder gar keine Färbung auf der Membran hinterließen, unabhängig von der P-3-G-Konzentration. Bei hohen E&sub1;-3-G-Spiegeln veränderte sich die Färbung umgekehrt zur P-3-G-Konzentration. Es ist zu bemerken, daß die Proben mit hohen E&sub1;-3-G-Konzentrationen und hohen P-3-G-Konzentrationen weniger Färbung ergaben als die Proben mit hohen E&sub1;-3-G-Konzentrationen und geringen P-3-G- Konzentrationen. Tabelle 2 E&sub1;-3-G-Konzentration (µg/ml) P-3-G-Konzentration (µg/ml)
- In der obigen Tabelle bedeutet (0) keine sichtbare Farbbildung und je größer die Zahl, je intensiver war die Farbbildung.
- In Beispiel 3 umfaßt die feste Phasenkomponente eine immunreaktive Substanz, und zwar P-3-G, das für eine Kopplung an einen festen Träger angepaßt war. In diesem Beispiel war Gelatine/P-3-G biotinyliert und an einen mit Avidin behandelten Träger (die mikroporöse Membran) nach dem Kontaktschritt gekoppelt worden. In Schritt 2 wurden daher die Probe, der Blockierungsantikörper, die BGP-Lösung und die ambifunktionelle Hybridkomponente alle miteinander gemischt, bevor sie in Schritt 3 mit der Avidin behandelten Membran in Kontakt gebracht wurden. In den Fällen, in denen die E&sub1;-3-G- Konzentration hoch und die P-3-G-Konzentration in der Probe gering war, wurde in Schritt 2 eine Immunverbindung gebildet, umfassend die markierte Komponente, die ambifunktionelle Hybridkomponente und die feste Phasenkomponente. Solch eine Immunverbindung wurde als Testzwischenphase durch die Reaktion zwischen Biotin und Avidin gebildet, wenn die Mischung mit der mit Avidin behandelten Membran in Schritt 3 in Kontakt gebracht wurde. Die Testzwischenphase wurde dann mit der Gold- markierten Komponente in Schritt 4 in Kontakt gebracht, wie in Verbindung mit Beispiel 2 dargelegt, um eine Testergebnisphase herzustellen, die rosa gefärbt war bei hohem E&sub1;- 3-G und geringem P-3-G in der Probe, und ansonsten ungefärbt oder nur schwach gefärbt war.
- In den vorstehenden Beschreibungen bestand die Einfangkomponente aus einer immunreaktiven Substanz (P-3-G), die entweder mit einer festen Phase, einer mikroporösen, durchflußartigen Membran gekoppelt oder zur Kopplung angepaßt war. Alternativ könnte die Einfangreaktionskomponente aus einer immunreaktiven Substanz zusammengesetzt sein, die an ein fein verteilbares, schwebendes, wasserunlösliches, festes Phasenteilchen gekoppelt ist, ähnlich der festen Phasenkomponente wie in EP-A 0310872, veröffentlicht am 12. April 1989, offenbart. In solch einem Fall würde die Einfangreaktionskomponente umfassen, eine erste immunreaktive Substanz (P-3-G), die zuerst an ein Latexteilchen, ein Sepharosekügelchen, Glaskügelchen usw. gekoppelt ist. Eine Immunverbindung, umfassend die Einfangkomponente, die markierte Komponente und die ambifunktionelle Komponente würde im Fall eines positiven Ergebnisses hergestellt. Solch eine Immunverbindung könnte dann in der Art und Weise gesammelt werden, wie in der '872 Anmeldung beschrieben, mittels eines porösen Matrixeinfangelements, Sedimentation und/oder Zentrifugation, um eine Testergebnisphase zu erhalten, die auf dem porösen Matrixeinfangelement zur visuellen Begutachtung gesammelt wurde.
- Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Verwendung eines positiven Schrittnachweises wie in den EP-Anmeldungen 0310872, 0327843 beschrieben, wie auch FTA-Geräte der Art, offenbart in der EP-Anmeldung 0313833, veröffentlicht am 3. Mai 1989, und wenigstens in bestimmten Aspekten, das Metall-Immunnachweisverfahren wie in der EP- Anmeldung 0310872 beschrieben. Auf diese Druckschriften wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
- Die vorliegende Erfindung stellt die vorstehend dargestellten Immunnachweisverfahren bereit. Die Erfindung stellt ebenfalls Kits mit Materialien bereit, enthaltend gemessene Mengen der Testkomponenten zur Durchführung eines einzelnen oder einer Mehrzahl von wiederholbaren Tests. Die Erfindung stellt ferner eine neue ambifunktionelle Reaktionskomponente bereit, die mindestens einen antigenen Rest und einen proteinähnlichen Rezeptorrest umfaßt, dessen Reste irreversibel miteinander verbunden sind, um die ambifunktionelle Komponente zu präsentieren. Solch eine ambifunktionelle Hybridkomponente und eine Methode zu ihrer Herstellung sind vorstehend in Beispiel 1 beschrieben.
- In Übereinstimmung mit der Erfindung und dem Wissen des Durchschnittsfachmanns, den diese Erfindung betrifft, müssen Immunnachweise im allgemeinen zur Ermittlung und/oder Bestimmung von spezifisch gewünschten Ergebnissen eingestellt werden. Die Konzentrationen und/oder Konstruktionen der verschiedenen Nachweiskomponenten müssen gewöhnlich empirisch eingestellt werden, mittels Standards oder dergleichen, um die gewünschte Sensibilität und/oder Einstellung zu erreichen. Die Menge der immunreaktiven Substanz der Einfangreaktionskomponente ist einfach durch Koppeln von mehr oder weniger Substanz an den festen Träger justierbar. Die Einfangkomponente konkurriert mit einem der Analyten um die Bindungsstellen auf der ambifunktionellen Komponente, und daher kann die Menge der immunreaktiven Einfangkomponente justiert werden, um die Menge des Analyten einzustellen, der ein positives Ergebnis liefert. Gleichfalls kann die Menge der Blockierungsreaktionskomponente justiert werden, um die Menge des zweiten immunreaktiven Analyten einzustellen, der einen positiven Test erzeugt.
- Die Menge der ambifunktionellen Reaktionskomponente und das Verhältnis der darauf vorkommenden ersten immunreaktiven Stelle zur zweiten immunreaktiven Stelle kann ebenfalls justiert werden, um den Nachweis weiter einzustellen und/oder zu sensitivieren. Diese Manipulationen sind dem Durchschnittsfachmann, an den diese Erfindung gerichtet ist, alle bekannt, und entsprechen den Manipulationen, die generell notwendig sind, um Immunnachweisverfahren zu konstruieren. Es sei nur erwähnt, daß die ambifunktionelle Reaktionskomponente der vorliegenden Erfindung neu ist und aufgrund seiner neuartigen Konstruktion die Flexibilität der Feineinstellung des Nachweises maximiert ist.
Claims (26)
1. Eine Nachweismethode zur Bestimmung der relativen Konzentrationen einer ersten
und zweiten immunreaktiven zu analysierenden Substanz in einer wäßrigen Probe, wobei
die Nachweismethode umfaßt:
Bereitstellen einer Einfangreaktionskomponente umfassend eine erste immunreaktive
Substanz mit einer immunspezifischen Reaktivität, die zur immunspezifischen Reaktivität
der ersten immunspezifischen zu analysierenden Substanz analog ist, wobei die erste
immunspezifische zu analysierende Substanz anfänglich an einen festen Träger gekoppelt
oder zur Kopplung an einen festen Träger angepaßt ist;
Bereitstellen einer Blockierungsreaktionskomponente umfassend eine zweite
immunreaktive Substanz mit der Fähigkeit, die zweite immunreaktive zu analysierende
Substanz immunspezifisch zu binden;
Bereitstellen einer markierten Reaktionskomponente umfassend eine dritte
immunreaktive Substanz und einen an diese gekoppelten nachweisbaren Tag, wobei dritte
immunreaktive Substanz mit einer immunspezifischen Reaktivität analog zur
immunspezifischen Reaktivität der zweiten immunreaktiven zu analysierenden Substanz
ist;
Bereitstellen einer ambifunktionellen Reaktionskomponente umfassend eine
immunreaktive Hybridsubstanz mit mindestens einer ersten immunreaktiven Stelle, die
die Fähigkeit besitzt, immunspezifisch mit der ersten immunreaktiven zu analysierenden
Substanz und der ersten immunreaktiven Substanz zu binden, und mindestens einer
zweiten immunreaktiven Stelle mit einer immunspezifischen Reaktivität, die analog zur
immunspezifischen Reaktivität der zweiten immunreaktiven zu analysierenden Substanz
ist, wobei die zweite Stelle fähig ist, immunspezifisch mit der zweiten und dritten
immunreaktiven zu analysierenden Substanz zu binden;
Verbinden der wäßrigen Probe mit (1) der Einfangreaktionskomponente, (2) einer
Menge der ambifunktionellen Komponente, die gegenüber der
Einfangreaktionskomponente ausreichend gering ist, um die Bindung zwischen der ersten
immunreaktiven Stelle der Hybridsubstanz und der ersten immunreaktiven Substanz der
Einfangkomponente in Gegenwart von mindestens einer festgesetzten Konzentration der
ersten zu analysierenden Substanz in der Probe so zu inhibieren, daß die Menge der
ambifunktionellen Komponente mit der Fähigkeit, die erste immunreaktive Substanz zu
binden, zu gering ist, um ein positives Nachweisergebnis zu erhalten, (3) die markierte
Reaktionskomponente, und (4) eine Menge der Blockierungskomponente, die
ausreichend hoch ist, um die zweite immunreaktive Stelle der Hybidsubstanz zu
blockieren, und um die Bindung zwischen der letztgenannten und der zweiten
immunreaktiven Substanz der markierten Komponente in der Abwesenheit von
mindestens einer festgesetzten Konzentration der zweiten zu analysierenden Substanz in
der Probe so zu inhibieren, daß die Menge der markierten Komponente mit der
Fähigkeit, die zweite Stelle der Hybridsubstanz zu binden, zu gering ist, um ein positives
Nachweisergebnis zu erhalten, wobei ein positives Nachweisergebnis nur erreicht wird,
wenn die Konzentration der ersten zu analysierenden Substanz in der Probe geringer ist
als die festgelegte Konzentration und die Konzentration der zweiten zu analysierenden
Substanz in der Probe größer ist als die ausgewählte Konzentration, um dadurch eine
bestimmbare Menge einer Immunzusammensetzung herzustellen, die sowohl die
Einfangkomponente als auch die markierte Reaktionskomponente umfaßt.
2. Eine Nachweismethode nach Anspruch 1, wobei mindestens eine der
immunreaktiven zu analysierenden Substanzen antigene Eigenschaften hat.
3. Eine Nachweismethode nach Anspruch 2, wobei die erste und zweite immunreaktive
zu analysierende Substanz jeweils antigene Eigenschaften hat.
4. Eine Nachweismethode nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste und
zweite immunreaktive zu analysierende Substanz jeweils ein Steroid, wahlweise ein
natürlich vorkommendes Hormon, wie natürlich vorkommende menschliche
Steroidhormone oder deren Metaboliten sind.
5. Eine Nachweismethode nach Anspruch 4, wobei die erste immunreaktive zu
analysierende Substanz P-3-G und die zweite immunreaktive zu analysierende Substanz
E&sub1;-3-G ist.
6. Eine Nachweismethode nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der nachweisbare
Tag ein Goldsolteilchen oder eine Komponente eines enzymatischen
Farbreaktionssystems ist.
7. Eine Nachweismethode nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die
immunreaktive Hybridsubstanz eine erste proteinartige Substanz umfassend die erste
immunreaktive Stelle und eine zweite proteinartige Substanz umfassend die zweite
immunreaktive Stelle enthält, wobei die erste und zweite proteinartige Substanz
irreversibel miteinander verbunden sind, um die Hybridsubstanz zu präsantieren.
8. Eine Nachweismethode nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der feste Träger
eine mikroporöse Membran umfaßt.
9. Eine Nachweismethode nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei während des
Verbindungsschrittes die Probe mit der Blockierungskomponente zusammengebracht
wird, bevor sie mit der markierten Komponente in Kontakt kommt.
10. Eine Nachweismethode nach Anspruch 9, in der während des Verbindungsschrittes
die Blockierungskomponente, die ambifunktionelle Komponente und die feste
Phasenkomponente mit der wäßrigen Probe zusammengebracht werden, um eine
Testzwischenphase zu erzeugen und die Testzwischenphase mit der markierten
Komponente zusammengebracht wird, um eine Testergebnisphase zu erzeugen.
11. Eine Nachweismethode nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die erste
immunreaktive Substanz vor dem Verbindungsschritt an den festen Träger gekoppelt
wird.
12. Eine Nachweismethode nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die erste
immunreaktive Substanz während oder nach dem Verbindungsschritt an den festen
Träger gekoppelt wird.
13. Eine Nachweismethode nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in der während des
Verbindungsschrittes die wäßrige Probe mit der Einfangkomponente zusammengebracht
wird, bevor sie mit der markierten Komponente in Kontakt kommt.
14. Eine Nachweismethode nach Anspruch 13, in der die erste immunreaktive Substanz
der Einfangkomponente an einen festen Träger gekoppelt wird, nachdem die wäßrige
Probe mit der Einfangkomponente zusammengebracht wird und bevor die wäßrige Probe
mit der markierten Komponente in Kontakt kommt.
15. Eine Nachweismethode nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in der der feste Träger
ein verteilbares, wasserunlösliches Teilchen umfaßt und die erste immunreaktive
Substanz vor dem Verbindungsschritt an das Teilchen gekoppelt wird.
16. Eine Nachweismethode nach Anspruch 15, in der der nachweisbare Tag ein
Goldsolteilchen ist und während des Verbindungsschrittes die Blockierungskomponente,
die ambifunktionelle Komponente und die markierte Komponente mit der Probe
zusammengebracht werden, um eine Immunzusammensetzung herzustellen, die das
wasserunlösliche Teilchen und das Goldsolteilchen enthält, wenn der Test positiv
ausfällt, und in der die Immunzusammenstellung wahlweise gesammelt und direkt visuell
inspiziert wird, zum Beispiel auf einem Filterelement zur Anfärbung zum Nachweis von
Gold in der gesammelten Masse.
17. Eine Nachweismethode nach Anspruch 1 zur Vorhersage der fruchtbaren Periode
des Menstruationszyklus und in der die erste zu analysierende Substanz P-3-G und die
zweite zu analysierende Substanz E&sub1;-3-G ist, wobei die erste immunreaktive Substanz P-
3-G und die zweiten und dritten immunreaktiven Substanzen die selben Antikörper gegen
E&sub1;-3-G sind, wobei die erste immunreaktive Stelle mit einer Antigenbindungsstelle eines
Antikörpers gegen P-3-G versehen ist und die zweite immunreaktive Stelle mit einer
Antigendeterminante eines E&sub1;-3-G Moleküls ausgestattet ist, und der Antikörper gegen
P-3-G und das E&sub1;-3-G Molekül wahlweise irreversibel miteinander verbunden sind, um
die immunreaktive Hybridsubstanz zu präsentieren.
18. Eine Nachweismethode nach Anspruch 17, in der der feste Träger eine mikroporöse
Membran umfaßt und die erste immunreaktive Substanz vor dem Verbindungsschritt an
diese gekoppelt wird.
19. Eine Nachweismethode nach Anspruch 18, in der während des Verbindungsschrittes
die Blockierungskomponente, die ambifunktionelle Komponente und die feste
Phasenkomponente mit der wäßrigen Probe zusammengebracht werden, um eine
Testzwischenphase zu erzeugen und die Testzwischenphase danach mit der markierten
Komponente zusammengebracht wird, um die Testergebnisphase zu erzeugen.
20. Eine Nachweismethode nach einem der Ansprüche 17 bis 19, in der der
nachweisbare Tag ein Goldsolteilchen ist.
21. Eine Nachweismethode nach Anspruch 20, in der der Schritt des Zusammenstellens
der Testzwischenphase vor dem Verbinden mit der markierten Komponente enthalten ist,
und das direkte visuelle Inspizieren der Testergebnisphase zur Anfärbung zum Nachweis
von Gold enthalten ist, und in der wahlweise die Testzwischenphase auf der Membran
zusammengestellt und die Testergebnisphase auf der Membran visuell inspiziert wird.
22. Ein Nachweiskit zur Durchführung einer Nachweismethode nach einem der
Ansprüche 1 bis 20, wobei das Kit die Einfangkomponente, die
Blockierungskomponente, die markierte Komponente und die ambifunktionelle
Komponente umfaßt.
23. Ein Nachweiskit zur Durchführung einer Nachweismethode nach Anspruch 21,
wobei das Kit die Einfangkomponente, die Blockierungskomponente, die markierte
Komponente, die ambifunktionelle Komponente und ein Element zur Zusammenstellung
der Testzwischenphase und visuellen Inspizierung der Testergebnisphase umfaßt, wobei
das Element wahlweise ein Filter ist.
24. Eine immunreaktive Hybridsubstanz umfassend mindestens eine antigene Hälfte und
eine proteinartige Rezeptorhälfte, wobei die antigene Hälfte und die Rezeptorhälfte
irreversibel miteinander verbunden sind, um die obige Substanz zu präsentieren, die
Hälften wahlweise durch eine Amidverbindung miteinander verbunden sind und wobei
die Substanz zum Gebrauch des gleichzeitigen Messens der Konzentrationen von zwei
verschiedenen zu analysierenden Substanzen in einer einzigen wäßrigen Probe ist und die
antigene Hälfte und die Rezeptorhälfte immunspezifisch reaktiv bei der Durchführung
der gleichzeitigen Messung sind.
25. Eine Substanz nach Anspruch 24, wobei die Rezeptorhälfte von einem Antikörper
gegen P-3-G und/oder die antigene Hälfte von E&sub1;-3-G stammt.
26. Eine Substanz nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Substanz mindestens zwei
antigene Hälften umfaßt.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US32633789A | 1989-03-21 | 1989-03-21 | |
PCT/US1990/001227 WO1990011521A1 (en) | 1989-03-21 | 1990-03-07 | Simultaneous dual analyte assay |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE69027320D1 DE69027320D1 (de) | 1996-07-11 |
DE69027320T2 true DE69027320T2 (de) | 1996-11-07 |
Family
ID=23271789
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE69027320T Expired - Lifetime DE69027320T2 (de) | 1989-03-21 | 1990-03-07 | Gleichzeitiges testverfahren zweier analyten |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5242804A (de) |
EP (1) | EP0470966B1 (de) |
JP (1) | JP2955357B2 (de) |
AT (1) | ATE139032T1 (de) |
CA (1) | CA2049036A1 (de) |
DE (1) | DE69027320T2 (de) |
DK (1) | DK0470966T3 (de) |
ES (1) | ES2088427T3 (de) |
WO (1) | WO1990011521A1 (de) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9217864D0 (en) | 1992-08-21 | 1992-10-07 | Unilever Plc | Monitoring method |
US6121056A (en) * | 1993-02-24 | 2000-09-19 | Dade Behring Inc. | Random detection of antigens with antibodies immobilized on soluble submicron particles |
US5874216A (en) | 1996-02-23 | 1999-02-23 | Ensys Environmental Products, Inc. | Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof |
JP3609240B2 (ja) * | 1997-08-07 | 2005-01-12 | 日東電工株式会社 | 免疫学的検査法および免疫学的検査用キット |
US20030186311A1 (en) * | 1999-05-21 | 2003-10-02 | Bioforce Nanosciences, Inc. | Parallel analysis of molecular interactions |
US6673562B2 (en) | 2000-08-24 | 2004-01-06 | Spectral Diagnostics, Inc. | Differential immunoassay |
US6998251B2 (en) * | 2001-01-12 | 2006-02-14 | Syngenta Participations Ag | Nanoporous membrane reactor for miniaturized reactions and enhanced reaction kinetics |
US8917272B2 (en) * | 2009-09-30 | 2014-12-23 | Mckesson Financial Holdings | Methods, apparatuses, and computer program products for facilitating visualization and analysis of medical data |
US8828329B2 (en) | 2010-10-01 | 2014-09-09 | Church & Dwight, Co., Inc. | Electronic analyte assaying device |
DK2972353T3 (da) | 2013-03-11 | 2023-03-27 | Meso Scale Technologies Llc | Forbedrede fremgangsmåder til udførelse af multipleksanalyser |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL7807532A (nl) * | 1978-07-13 | 1980-01-15 | Akzo Nv | Metaal-immunotest. |
GB2029011B (en) * | 1978-09-01 | 1983-02-02 | Coulson W | Use of a synthetic bifunctional ligand for the immunimetric determination of the concentration ratio of two solutes |
IE54109B1 (en) * | 1982-02-10 | 1989-06-21 | Boots Celltech Diagnostics | Assay |
US4506009A (en) * | 1982-03-30 | 1985-03-19 | University Of California | Heterogeneous immunoassay method |
GB8607101D0 (en) * | 1986-03-21 | 1986-04-30 | Serono Diagnostics Ltd | Immunoassay |
US4853335A (en) * | 1987-09-28 | 1989-08-01 | Olsen Duane A | Colloidal gold particle concentration immunoassay |
US4952517A (en) * | 1988-02-08 | 1990-08-28 | Hygeia Sciences, Inc. | Positive step immunoassay |
-
1990
- 1990-03-07 DE DE69027320T patent/DE69027320T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-07 EP EP90905904A patent/EP0470966B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-07 AT AT90905904T patent/ATE139032T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-07 CA CA002049036A patent/CA2049036A1/en not_active Abandoned
- 1990-03-07 WO PCT/US1990/001227 patent/WO1990011521A1/en active IP Right Grant
- 1990-03-07 DK DK90905904.0T patent/DK0470966T3/da active
- 1990-03-07 ES ES90905904T patent/ES2088427T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-07 JP JP2505452A patent/JP2955357B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-02-14 US US07/834,990 patent/US5242804A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US5242804A (en) | 1993-09-07 |
EP0470966B1 (de) | 1996-06-05 |
EP0470966A4 (en) | 1992-09-09 |
EP0470966A1 (de) | 1992-02-19 |
JPH04506112A (ja) | 1992-10-22 |
CA2049036A1 (en) | 1990-09-22 |
ATE139032T1 (de) | 1996-06-15 |
ES2088427T3 (es) | 1996-08-16 |
WO1990011521A1 (en) | 1990-10-04 |
DK0470966T3 (da) | 1996-09-30 |
JP2955357B2 (ja) | 1999-10-04 |
DE69027320D1 (de) | 1996-07-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE68908432T2 (de) | Schwellwertimmunoassay. | |
DE3852117T2 (de) | Immunoassay mit Verwendung von nichtmetallischen, kolloidalen Teilchen. | |
DE3781335T2 (de) | Immunoassay mit verwendung von kolloidalem gold. | |
DE3884979T2 (de) | Agglutinationsimmunotest und Satz zur Bestimmung einer mehrwertigen Immunspezies unter Verwendung einer gepufferten Salzwasch-Lösung. | |
EP1143248B1 (de) | Verfahren zu Immobilisierung von Konjugaten in diagnostischen Tests | |
DE69126248T2 (de) | Immunchromatographischer assay und verfahren zur nutzung desselben | |
DE2743445C2 (de) | Immunchemisches Haptenmeßverfahren durch Agglutinationshemmung | |
DE69213240T2 (de) | Wasserlösliche reagenzien und konjugate auf polymerbasis, die vom divinylsulfon abgeleitete reste enthalten | |
DE3872500T2 (de) | Verwendung eines mit biotin verknuepften immobilisierten rezeptors in einer testvorrichtung, einem testsatz und einer methode zur bestimmung eines liganden. | |
DE68923800T2 (de) | Vorrichtung und verfahren zur bestimmung eines analyten in einer flüssigen probe mittels folgereaktionen. | |
EP0363942B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz | |
DE68927118T2 (de) | Ionenfang-Teste und -Vorrichtungen | |
DE3882058T2 (de) | Immunoreaktives Reagens, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur Bestimmung einer immunoreaktiven Spezies. | |
DE2744835B2 (de) | Immunchemisches Meßverfahren | |
DE2744836A1 (de) | Immunchemisches messverfahren | |
DE69333582T2 (de) | Verbessertes Verfahren zur Bestimmung von Estradiol in einer Probenflüssigkeit und Kit | |
EP0356964B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz | |
DE69027320T2 (de) | Gleichzeitiges testverfahren zweier analyten | |
DE3922960A1 (de) | Verfahren zur bestimmung eines analyten | |
DE68917613T2 (de) | Natriumdecylsulfat enthaltende Waschlösung, Testsatz und Verfahren zur Bestimmung eines immunologischen Liganden. | |
DE3822750A1 (de) | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz | |
EP0263401A1 (de) | Immunometrisches Bestimmungsverfahren | |
WO2009043393A1 (de) | Fertilitätstest | |
EP0345732A2 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpertiters | |
DE60019988T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Rezeptorbindungseigenschaften und Reagenz zum Assay |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: HYGEIA SCIENCES, INC., NEW YORK, N.Y., US |
|
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8330 | Complete renunciation |