JPH04506112A

JPH04506112A - 二つの分析対象の同時分析

Info

Publication number: JPH04506112A
Application number: JP2505452A
Authority: JP
Inventors: バーアー，イザック; コール，フランシス，エックス．; キャノン，エル．，エドワード
Original assignee: ハイジィア　サイエンス，インク．
Priority date: 1989-03-21
Filing date: 1990-03-07
Publication date: 1992-10-22
Anticipated expiration: 2014-10-04
Also published as: CA2049036A1; US5242804A; DK0470966T3; EP0470966B1; ES2088427T3; DE69027320D1; ATE139032T1; EP0470966A4; DE69027320T2; EP0470966A1; JP2955357B2; WO1990011521A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】腫… 二つの分析対象の同時測定１皿立１本発明は、免疫原性の、二つの異なる分析対象の、相対濃度を決定するための免疫測定法に関するものである。特に３本発明は、一つの試料中における。プレグナンジオール−３−グルクロニド（Ｐ−３−Ｇ）とエストロン−３−グルクロニド（Ｅｌ−３−Ｇ）のような、関連のあるホルモン性の代謝物の相対濃度を決定するための測定に関するものである。さらに詳細には１本発明は、ヒトの尿中の成分を検査して、ヒトの妊娠可能な期間、すなわち、生きた精子と生きた卵子が女性の生殖管に同時に存在しつる期間を決定するのに適した免疫測定法に関するものである。

王米孜１様々な理由で、免疫原として作用しつる。二つの別々の分析対象の相対濃度を決定することが、臨床や診断において、好ましい場合がある。ＩＩｉＩｇ乳動物のホルモンに関する活動やホルモンの代謝によって１体液中の複数のホルモンまたは代謝物の濃度の間の関係が時間生物学的に他の現象と関係づけられる例がいくつかある。特に、ヒトの尿中のＰ−３−ＧとＥｌ−３−Ｇの相対濃度は１月経周期の妊娠可能な期間を決定することに利用可能である。避妊装置や避妊具は様々な理由で使用可能でない場合もあるので０月経周期の妊娠可能な期間を決定するための免疫測定のような技術が要求されるようになってきた。

ヒトの月経周期は女性の組織および器官からのホルモンの周期的な放出に支配されている。このような放出は、予見可能であり、排卵に特異的に関係づけられる。排卵によって、卵子が卵巣から放出され、子宮壁は妊娠のための準備を整える。放出されたホルモンやホルモンの代謝物は、最終的には尿中に送られる。この特殊な生物学的な現象については、ヨーロッパ特許公報Ｎｏ、００８６［１９５（１９８３年８月１７日発行Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　０ｆｆｉｃｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　８３／３３　）に、詳細かつ明確に記されている。ここでは、以下の事実のみで充分である。正常な月経周期においては女性の尿中のＥｌ　 −３−Ｇのレベルは排卵の約６日前に上昇し始め、排卵の１日前に最高に達し、排卵中および排卵後に急速に下降する。また１女性の尿中のＰ−３−Ｇのレベルは。

排卵の日に上昇し始め、排卵後２．３日に最高に達し、黄体がある間、高レベルに保たれる。Ｐ−３−ＧのレベルとＥｌ−３−Ｇのレベルの関係は知られており、上記のヨーロッパ特許公報°０９５によれば、尿中のエストロゲン代謝物とプロゲスチン代謝物の比は９月経周期の進行をモニタするのに有効であるということがわかっている。

ホルモンの活動を確認することによって月経周期を追う場合に特に重要な事実は、妊娠可能な期間のほとんどにおいて、尿中のＥｌ　−３−ＧのレベルはＰ−３ −Ｇのレベルのほぼ２０倍またはそれ以上であるということである。したがって、　Ｅｌ−３−Ｇ／Ｐ−３−Ｇ比が２０またはそれ以上になっている期間を決定することのできる。簡単で信頼性のある測定法は１女性が妊娠可能であるかどうかを決定するうえで非常に価値がある。

上記°０９５特許公報には、単−試料中の複数の抗原の相対濃度を決定する方法が示されている。この免疫測定では、一方の端に抗原性の部分をもち、もう一方の端に別の抗原性の部分をもった延長リガンド分子を実現するために、架橋支持分子を介して非可逆的に結合した二つの異なる抗原をもつようにした。

二重リガンド分子を用いている。立体障害を避けるために架橋が充分に長いことがきわめて重要であり、測定自体は−この二４重リガンドの濃度に影響されるという欠点をもつ。

゛０９５特許公報に記された測定法は英国特許公報Ｎｏ、　ＧＢ　２０２９０１１Ｂに記された測定法の改良であるということになっている。

後者においては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク質との結合を用いて異なる抗原性部分をカップリングさせることによって調製した１合成二重リガンドを用いている。しかし、それぞれのステロイドの、Ｂ５Ａ１分子あたりの分子数は、試薬のストイキオメトリ−を調節することによって独立に変わりつるので、較正が困難である、また、　’０９５に概説されているように、’０ＩＩＢの方法は、二重リガンドが多価の免疫複合体を形成する傾向があり、また、非特異的に反応する傾向があるために、かならずしも感度の良い結果を与えない。

及豆塁ｌ刃本発明における二つの分析対象の免疫測定法は、従来技術に固有の困難な問題点に取り組み、新しい測定法を提供する。この新しい測定法においては、抗Ｐ−３ −Ｇ抗体分子またはＰ−３−Ｇホルモンリセブターの抗原結合部位を少なくとも一つもち、Ｅｌ　−３−Ｇ分子の抗原決定部位を複数持つような。

二重機能性の雑種共役体を用いる。このような共役体を用い。

本発明の手順を用いることにより、単一の水溶液試料中における第一の免疫反応性分析対象と第二の免疫反応性分析対象の相対濃度を決定するための免疫測定ができるようになる１本発明の重要な局面においては、第一および第二の免疫反応性分析対象は、抗原性のホルモン代謝物、すなわち、Ｐ−３−ＧとＥｌ−３−Ｇである。特、に本発明により、ヒトの尿中においてＥｌ−３−〇のＰ−３−Ｇに対する比が予め設定したいき値レベルよりも高いものを検出することによって、ヒトの妊娠可能な期間を決定するための手順が与えられる。

最も広い応用面では１本発明は、二つの分析対象をもつ免疫測定一般に関して有用な方法論および材料を提供する。特に。

水溶液試料中の、第一および第二の免疫反応性分析対象の相対濃度を決定する測定手順を９本発明は提供する９分析対象は。

一般的には代謝的に関連のあるものであるが、かならずしもそうでなくても良い、そして１本発明は、それらの相対濃度を決定し、他方の分析対象に対する一方の分析対象の比が予め設定したレベルを越えている場合にはかならずシグナルを出す、ということを指向している。実験的操作および較正を適切に行うことによって１分析対象の一方ともう一方の比を予めどんな値に設定しても正しい結果が得られるように、この測定法をデザインすることができる。　本発明に従うことによって、水溶液試料中の、第一および第二の免疫反応性分析対象の相対濃度を決定する測定手順が得られる。測定手順には、第一の免疫反応性物質の免疫特異的反応性と類似の免疫特異的反応性をもった第一の免疫反応性物質を含む、捕捉の反応のコンポーネントを供給する段階が含まれる。第一の免疫反応性物質は、最初に固相支持体にカップリングされるか、または、固相支持体にカップリングされるのに適するようにされる。測定手順にはさらに、第二の免疫反応性分析対象と免疫特異的に反応することができる第二の免疫反応性物質を含む、ブロッキングの反応のコンポーネントを供給する段階が含まれる０本発明の最も広い応用においては、第三の免疫反応性物質とそれにカップリングされた検出標識からなる。ラベルされた反応のコンポーネントも供給される。第三の免疫反応性物質は、第二の免疫反応性物質の免疫特異的反応性に類似した免疫特異的反応性をもつ。

重要な要素として１本発明は、二重機能性の連結の反応のコンポーネントの供給も含んでいる。このコンポーネントは、第一の免疫反応性分析対象と第一の免疫反応性物質の両方を結合できる第一の免疫反応性部位をもった。雑種の免疫反応性物質を必ず含んでいる。この雑種の免疫反応性物質は、また、第二の免疫反応性分析対象の免疫特異的反応性と類似の免疫特異的反応性をもった。第二の免疫反応性部位を必ずもっている。

従って、この雑種の免疫反応性物質の第二の部位は、免疫特異的に第二および第三の免疫反応性物質の両方を結合することができる。

本発明に従う手順には、水溶液試料が次のようなものと接触する段階がある　（１）捕捉の反応のコンポーネント　（２）二重機能性の連結のコンポーネントこれの量は捕捉の反応のコンポーネントの量に対して十分に少ないので、試料中の第一の分析対象の濃度が予め決められた濃度以上であるような場合には、雑種物質の第一の免疫反応性部位と捕捉のコンポーネント中の第一の免疫反応性物質との結合が阻害され、そのため。

第一の免疫反応性物質に結合できる二重機能性コンポーネントの量が少なくなって測定結果が陽性とならない、（３）ラベルされた反応のコンポーネント、（４）ブロッキングのコンポーネント９これの量は十分にたくさんあるので、試料中の第二の一分析対象の濃度が予め設定された濃度以下であるような場合には、雑種物質の第二の免疫反応性部位がブロックされて、この第二の部位とラベルされたコンポーネントの第二の免疫反応性物質との結合が阻害され、そのため、雑種物質の第二の部位に結合できるラベルされたコンポーネントの量が少なくなって測定結果が陽性とならない、従って、試料中の第一の分析対象の濃度が予め決めた濃度以下でしかも試料中の第二の分析対象の濃度が予め設定した濃度以上であるときのみ、確認可能な量の、捕捉のコンポーネントとラベル反応のコンポーネントからなる免疫複合体が生じ、測定結果が陽性となる。

本発明のもっと特殊な場合においては、免疫反応性分析対象のうちの少なくとも一方が抗原性であり１両方が抗原性であるのがより適当である。より特殊な場合には１分析対象はステロイド性であり、自然界に存在するホルモン性であるのがより適当である。さらに適当なのは、自然界に存在する哨乳動物のステロイドホルモンまたはその代謝物である１本発明において。

特に好適なのは、第一の免疫反応性分析対象がＰ−３−Ｇであり、第二の免疫反応性分析対象がＥｌ　−３−Ｇである場合である本発明において、別の重要な面は、固相支持体は微細孔性の膜を含んでいてもよいということである。もうひとつの重要なのは、この固相支持体は、水に不要の分散可能な粒子を含んでいて、第一の免疫反応性物質は、試料との接触の段階に先立ってこの粒子とカップリングされる。ということである。

本発明において、さらにもう一つ重要なのは、検出標識が。

金ゾル粒子でありうるということである。

雑種の二重機能性免疫反応性物質は、第一の免疫反応性部位をもつ第一のタンパク性物質と第二の免疫反応性部位をもつ第二のタンパク性物質からなっている。

ここで、第一および第二の免疫反応性物質は、不可逆的に結合して一体になることによって雑種物質を実現している。

本発明の手順では、接触の段階において、ラベルされたコンポーネントと接触させる前に、ブロッキングのコンポーネントと接触させる。

また３手順の面で、ブロッキングのコンポーネント、二重機能性の連結のコンポーネント、および、固相のコンポーネントはすべて水溶液試料と接触し、これによって、試験の中間段階の固体ができる。それから、この中間段階の固体をラベルされたコンポーネントと接触させると、試験の結果が出る。

第一の免疫反応性物質は、接触の段階に先立って固相支持体とカップリングしておいてもよい、また、別の方法として、接触の段階の後で固相支持体とカップリングしてもよい。

本発明の測定手順は９月経周期の妊娠可能な期間を予知するのに用いるのが望ましい。

この場合、第一の分析対象はＰ−３−Ｇでよく、第二の分析対象はＥｌ−３−Ｇでよく、第一の免疫反応性物質はＰ−３−Ｇでよく、第二および第三の免疫反応性物質はＥｌ　−３−Ｇに対する同じ抗体でよい、二重機能性物質の第一の免疫反応性部位はＰ−３−Ｇに対する抗体の抗原結合部位から供給し、二重機能性物質の第二の免疫反応性部位はＥｌ　−３−Ｇ分子の抗原決定部位から供給すればよい９この例においては、抗Ｐ−３−Ｇ抗体分子とＥｌ　−３−Ｇ分子は不可逆的に結合して二重機能性の雑種免疫反応性物質を作っている。検出標識は金ゾル粒子が適当である。固相支持体は、微細孔性膜を含んでいるのが適当である。第一の免疫反応性物質は接触の段階の前にこの膜とカップリングしておくのがよい１本発明の実施例においては。

接触の段階で、ブロッキングのコンポーネント、二重結合的結合のコンポーネント、および、固相のコンポーネントは水溶液試料と接触して、試験の中間産物を作り出す、この試験の中間産物はその後、ラベルされたコンポーネントと接触させられ。

試験の結果の産物を作る。この実施例においては、試験の中間産物を回収した後、これをラベルされたコンポーネントと接触させ、接触の後にできた試験の結果の産物を直接視覚的に調べて比色検定し、そこに金ゾル粒子が存在しているかどうかを見る。この実施例においては、試験の中間産物は膜上に集められ、試験の結果の産物もこの同じ膜上で視覚的に調ｌ＼られる。

本発明によれば、検出標識は金ゾル粒子であってもよいし。

酵素的な発色システムに関わる物質でもよいし、免疫測定に使用可能な他のどんな検出標識であってもよい。

本発明は１本発明の測定法を行うための測定キットをも供給する。このキットは、捕捉のコンポーネントブロッキングのコンポーネントラベルされたコンポーネント、および、二重機能性のコンポーネントからなる６本発明のより特殊な例に従うと、この測定キットには、試験の結果の産物を集め、また視覚的に検査するための、微細孔性の膜またはフィルタが含まれている。　本発明のもうひとつの別の重要な面は、少なくともひとつの抗原性部分とタンパク性の抗体部分をもった。雑種の免疫反応性物質を供給するということである。この抗原性部分と抗体部分は可逆的に結合していて、雑種免疫反応性物質を作っている。

隘立国生立説ｊ第１図は、ヒトの女性の月経周期における。ヒトの尿中のＥｌ　−３−ＧとＰ− ３−Ｇの濃度の周期的変動を示したグラフである（データは５０周期の平均値である）。

第２図は、ヒトの女性の月経周期におけるＥｌ　−３−Ｇ／Ｐ−３−Ｇの比の周期的変動を示したグラフである（データは第１図から計算した値である）。

第３Ａ、３Ｂ、３Ｃ，３０図は１本発明に従った場合に、異なった条件で、結果が陽性になるか陰性になるかを図式的に解説した図である６寒立１本発明は、水溶液試料中の第一および第二の分析対象の相対濃度を決定するための測定手順を供給する。また、その測定手順を遂行するための物質を揃えたキットを供給する。また、少なくともひとつの抗原部分と、タンパク性の抗体またはホルモンリセプター部分が不可逆的に結合して、二重機能性の連結用の化合物を形成している。新奇の雑種の免疫反応性物質を供給する６本稿で二重機能性という言葉を１）だ場合には、抗体または他のりセブターの抗原結合部位を少なくともひとつもっており、また、抗原の抗原決定部位を少なくともひとつもっている分子のことをさしていうのであり、従って、二重機能性の分子は抗体（またはりセブター）としても抗原としても反応できるのである１本発明における意味においては、二重機能性のコンポーネントは一般に、試験する分析対象のひとつに対する抗体または分析対象のホルモンリセブターの抗原結合部位をもっており、また、試験する分析対象のもう一方に由来する抗原決定部位をもっている。二重機能性のコンポーネントについてさらに詳しいことは以下に示す。

本発明は、広く、一般に、単一の水溶液試料中の二つの異なる分析対象の相対濃度を調べることが好ましいような状況ならばどんな状況にでも応用可能である。

特に９本発明の手順は。

水溶液試料中のひとつの分析対象の濃度の、もうひとつの分析対象の濃度に対する割合を決定することがめられる場合に一般に応用可能である。従って１本発明は、二つの分析対象を同時に測定することのできる測定法を実現している。実施例においては、以下に示す通り、ヒトの尿中のエストロン−３−グルクロニド（Ｅｌ−３−Ｇ）のプレグナンジオール−３−グルクロニドＣＰ−３−Ｇ）に対する比を決定するための、二つの分析対象の同時測定を行っている。これらのステロイド代謝物の測定が有用なのは１月経のある女性の妊娠可能な期間をそれ以外の期間と区別するのに利用できる。という点である。　Ｅｌ−３−ＧのＰ−３− Ｇに対する比は、排卵の５．６日前の、妊娠可能な期間の始まりと８排卵後約２日の、妊娠可能な期間の終わりを示す、有用な情報を与える。測定には、Ｐ−３ −Ｇが共有結合的に結合した固相：ブロッキング用の抗Ｅｌ−３−Ｇ抗体：金ラベルした同じ抗Ｅｌ　−３−Ｇ抗体；および、二重機能性の連結のコンポーネントが含まれている。

測定によって、Ｅｌ−３−ＧとＰ−３−Ｇの、高いレベルと低いレベルが区別できる。測定により、陽性の結果を示す着色が生じるのは、Ｅｌ−３−Ｇのレベルが高＜、Ｐ−３−Ｇのレベルが低いときのみである。二重機能性の連結のコンポーネントは金でラベルした抗体が結合することのできる結合を供給する。尿中の遊離のＰ−３−Ｇ分析対象は二重機能性の連結のコンポーネントの固相への結合を阻害する。尿中の遊離のＥｌ−３−Ｇ分析対象はブロッキング用の抗Ｅｌ　− ３−Ｇ抗体の結合を阻害して、二重機能性架橋のコンポーネントへの金ラベルされた抗体の結合を可能にする。この点で、二つの分析対象の同時測定には二つの免疫測定が含まれていて、それらが同時に進行するということになる　尿のＰ− ３−Ｇは従来の競争阻害法によって測定し、それと同時にポジティブステップ免疫測定法によってＥｌ−３−Ｇを測定する。このポジティブステップ免疫測定法というのは、現在出願中で同一の出瑠人に譲渡されたＩｚａｋ　Ｂａｈａｒの特許出願第１５３．０８１号（１９８８年２月８日に出願）記されているポジティブステップ免疫測定法と本質的に同じものである。この出願明細書全体を引用することにより１本願と一体化する。このように、Ｐ−３−Ｇの濃度が高いとき。

すなわち、予め決定された、予め較正されたレベルよりも高いときは、Ｅｌ−３ −ａのレベルがいくらであっても発色しない、Ｐ−３−Ｇのレベルが予め決定された。予め較正されたレベルよりも低ければ、Ｅｌ　−３−Ｇのレベルが別の予め決定された。予め較正されたレベルよりも高いときに必ず陽性の結果を示す色が得られる。

第１図を参照すると１月経周期におけるヒトの尿中のＥｌ−３−〇とＰ−３−Ｇのレベルがグラフで説明されている。線は重なるように描いであるがＥｌ　−３ −Ｇのプロットされているスケールは、Ｐ−３−Ｇのプロットされているスケールに対して１対９程度に縮小されていて、実際には重なっていない。

この図は単にこれらの二つのホルモン代謝物のレベルが月経周期においてどのように周期変動しているかを示しているに過ぎない、第１図において、第０日（ｄａｙ　Ｏ）とは排卵の日のことである。妊娠可能な期間は一般には排卵前はぼ５．６日から排卵後はぼ２日に渡る期間であると考えられている。ヒトの月経周期は瀘抱期（排卵まで）と黄体期（排卵後）に分けられるといってよい、濾胞期には子宮内膜を再生するためにエストロゲンが分泌される。排卵とともに、プロゲスチン類が分泌され、子宮内膜の形成を刺激することによって、子宮への受精卵の着床に備える０着床が起こらなければ、プロゲスチンのレベルは下がり子宮内膜の消失と出血に至る６周期は全部で２８日程度要する。これらの現象は、尿中のホルモン代謝物の濃度を追うことによってたどることができる。従って、第１図かられかるように、プロゲスチン代謝物であるＰ −３−Ｇのレベルは瀘胞期の間比較的低く、はぼ排卵の時期に上昇し始め、　ＩＩ−卵後６日から８日でピークに達し、その後、瀘胞期初期のレベルまで低下する。尿中のＥｌ−３−Ｇのレベルは、瀘胞期初期においては比較的低く、排卵前約６日から上昇し始め排卵前はぼ２日にピークに達する。Ｅｌ　−３−Ｇのレベルはその後排卵にあたって急激に落ち込み、黄体期から次の瀘胞期初期に渡って比較的低いレベルを保つ、Ｅｌ　−３−Ｇの濃度とＰ−３−Ｇの濃度の比が第２図にプロットされている。これをみると、瀘胞期初期には比は低く、排卵前６日頃に比は急速に上昇し始め、排卵直前にピークに達する。Ｅｌ　−３−ＧとＰ− ３−Ｇの比は排卵に伴って急速に低下し、もう一度１月経周期の瀘胞期の低いレベルをとりもどす１本発明はＰ−３−Ｇに対するＥｌ　−３−Ｇの比が高いときに陽性の結果を与える。これによって周期の中で。

もっとも妊娠可能な時期を区別する。

第３Ａ、３Ｂ、３Ｃ，３Ｄ図に関しては１月経周期のいろいろな時期ての免疫測定が図式的に示されている。これらの図の中で、さまざまなコンポーネントを示すのに９次のようなシンボルが使われている。

α−Ｅ　＝　抗Ｅｌ　−３−Ｇ抗体 α−Ｐ　＝　抗Ｐ−３−Ｇ抗体 −−−−−＝　固相微細孔性膜支持体ＰＰＰ　＝　Ｐ−３−Ｇの結合した固相支持体Ａｕα−Ｅ　＝　金ラベルした抗Ｅｌ　−３−Ｇ抗体第３Ａ図は、妊娠可能な期間での免疫測定を図式的に示している　すなわち、Ｅｌ−３−Ｇのレベルが高＜、Ｐ−３−Ｇのレベルが比較的低い場合である。この状況では、Ｐ−３−Ｇは試料中に存在するが、二重機能性の雑種のコンポーネントが固相のＰ−３−Ｇに付着するのを阻害するには不十分な量しかない、同時に、試料中のＥｌ−３−Ｇのレベルは、ブロッキング用の抗Ｅｌ　−３−Ｇ抗体と結合して二重機能性の連結のコンポーネントのＥｌ　−３−Ｇ抗原決定部位がブロックされるのを防ぐのに充分である。従って、二重機能性コンポーネントのＥｌ−３−Ｇ抗原決定部位は空いていて、金ラベルした抗Ｅｌ−３−Ｇ抗体２を結合できる。金ラベルはこのように、二重機能性の連結のコンポーネントを通して固相に連結されるので、これを目でみることができる９図３Ａから３Ｄに示したように。

固相は最初はＰ−３−Ｇを結合した微細孔膜であり、測定中に結合しなかったコンポーネントは、矢印で示されているように単純に孔を抜けていくので、試験結果の評価の段階では固相の捕捉のコンポーネント上には存在しない。

第３Ｂ図に示したのは、黄体期の条件である。試料中のＥｌ−３−Ｇの濃度は低く、試料中のＰ−３−Ｇの濃度は比較的高い、この状況では、試料中のＰ−３− Ｇのレベルが高いので。

二重機能性の連結のコンポーネントの固相Ｐ−３−Ｇへの結合が阻害される。そのため、全てのコンポーネントは単に膜の孔を通り抜けるので、金ラベルは結合しない、第３Ｃ図は、瀘胞期初期の条件である１両方の分析対象の濃度は低い、この場結合する。しかし、Ｅｌ−３−Ｇのレベルが低いので、ブロッキング用の抗体による二重機能性のコンボーネン［・上のＥｌ−３−Ｇ抗原決定部位のブロッキングを阻害できない、従って、金ラベルされた抗体は固相に結合できず、単に、微細孔性膜を通り抜ける。第３Ｄ図に示したのは、仮想的な条件で１両方の分析対象の濃度が比較的高い場合である。ヒトの月経周期においては、この条件にはおそらくならない、しかし、別の系においてこのような条件になるかもしれない、この場合、尿中のＰ−３−Ｇの濃度が高いので二重機能性の連結のコンポーネントが固相に結合しない、従って、この測定のコンポーネントはどれも固相に捕捉されない。

この明細書においては、以下の定義を用いている。

定義免疫反応性物質−もうひとつの免疫反応性物質と特異的に結合することのできる物質、この明細書の意味においては、この言葉は、抗原性、ハプテン性、または抗体型の性質をもったもの、および、抗体の抗原決定部位や他のりセブターの抗原結合部位をもつ物質を含む、リガンドとりセプターについて適用する。

分析対象−検出または確認されるべき化合物または混合物であり、リガンドまたはりセブターでありうる。

免疫特異的反応性−結合する相手と特異的に結合する能力で、対応する抗原結合部位と抗原決定部位に起因する。

類似の免疫特異的反応性−免疫特異的に結合する相手にある免疫原性の結合部位を、類似の物質と免疫特異的に競争する能力。

カップリングされたー共有結合または非共有結合によって。

また、カップリングして一体化している成分を免疫測定の間じゆうすつと一体化したままでいさせるような他のなんらかの物理的性質によって、−緒になっている。

カップリングされるのに適する一反応性の官能基のような。

もうひとつの物質または対象に近接したときにそれとカップリングすることを可能にする特徴をもっている０本発明における意味では、ビオチン部分をもった成分はアビジン部分をもった固相支持体または他の成分と「カップリングされるのに適している」。

固相支持体−特定の大きさと性質をもった固体で、免疫測定の作業中に固定化されているかまたは、固定化されていないとしても濾過、沈降、遠心等によって捕捉されるようになっているもの０本発明においては、この言葉は、微細孔性膜、試験管やマイクロイライザプレートの内面、フィルター、固体粒子またはビーズのようなものをさしている。

ラベルまたは検出標識−免疫反応性物質にカップリングされた物質で、迅速に免疫反応性物質を検出することを可能にする物質、現在知られているラベルまたは標識には、金ゾル粒子。

酵素的発色反応に関わる物質、蛍光物質、放射性物質等がある。

二重機能性−少なくともひとつの抗原決定部位と少なくともひとつの抗原結合部位を同時にもっていることに起因する性質、そのような抗原結合部位は、抗原の対応する抗原決定部位と免疫化学的に結合することができ、抗体や他のりセブターの機能的要素である９本稿の意味においては、物質が免疫特異的に、リガンドとしてもリセブターとしても反応できるような場合に、その物質を二重機能性であるという。

雑種の一本稿においては単に、二つ以上のりガントやリセブターに由来する免疫特異的反応部位をもった化合物または混合物のことをいう、ここで、これらの部位は、なんらかの外部的な方法で、不可逆的に結合あるいはカップリングしている。

免疫反応性部位−結合の相手と免疫特異的に反応することのできる。ある物質または複合体上の部位０例えば、抗体の可変領域や、抗原決定部位のことである。

本発明は以下の例によってさらに詳しく説明される。

罠立五ユ二重機能性の雑種の連結のコンポーネントの調製抗Ｐ−３−Ｇ抗体の抗原決定部位少なくともひとつと、　Ｅｌ−３−Ｇ分子の抗原決定部位を複数もった二重機能性雑種連結共役体は、「ブラジキニンとアンギオテンシンに対する抗体：免疫学におけるカルボジイミドの使用Ｊ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、　Ｖｏｌ、　１４４．　ｐｐ　１３４４−６）と題された記事に記されている。　Ｇ。

ｏｄｆｒｉｅｎｄらのカルボジイミド法を用いて調製した。従って、抗Ｐ−３− Ｇ抗体を含む溶液は濃縮し、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１に対して４℃で透析した、透析後の溶液は、抗体の濃度が１１．５ｍｇ／＋ｎｌであったから、　１．５ｍｌあたり、　１７．２５ｍｇ　（１，０７８Ｘｌ０−４モル）の抗Ｐ−３−Ｇ抗体を含んでいた。　２２ｍｇ　（４，４Ｘ　１０−２モル）のＥ１−３−Ｇを０．５ｍｌの８２０にとかし、これに、抗Ｐ−３−Ｇ抗体溶液１．５ｍｌ　ヲ加エテ、抗Ｐ−３−Ｇ抗体（分子１ｉ１６０．０００　）とＥｌ　−３−Ｇ　（分子量５００　）　ノモル比がホホｌ：４００　（７）混合液を作った。　１６ｍｇの水溶性カルボジイミドである。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（シグマ）（分子量１９１．７　）を、抗Ｐ−３−Ｇ抗体とＥｌ　−３−Ｇの混合液にとかした。この混合液を室温で１時間反応させた１反応産物は１．２の割合でＰＢＳ／アジドで希釈し、ＰＢＳ／アジド（ｐ）Ｉ　７．４）に対して透析し、　０．２２ミクロンのフィルターで濾過した　最終体積は４ｍｌであった失血■につの分析対象の測定材料標準試料−ブレグナンジオール−３０−グルクロニド（Ｐ−３−Ｇ）　（シグマ）はエタノールの５０％水溶液にとかした。濃度０、　＋５６　ｔＬ　ｇ／ｍ＋のものと０．６２５　ｕｇ／ｍ＋のものを０．１％ゼラチンのＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　−０，０２［％］アジ化ナナトリウム溶液とかして作った。

一二ストロンーβ−Ｄ−グルクロニド（Ｅｌ−３−Ｇ）の標準試料は１本質的に同様に調製し、０　、０．１５６　、０．３１２５．０．６２５　。

１．２５および５μｇ／ｍｌのものを作った。

ブロッキング用抗体−抗Ｅｌ−３−Ｇ抗体を、２．５％ＰＥＧ３０００ノＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，４）　−０，０２％７シ化ナトリウム溶液テ希釈し、５１２μ ｓ／Ｉとした。

二重機能性雑種連結コンポーネント−実施例＝に従って調製し、抗Ｐ−３−Ｇ抗体の抗原結合部位少なくともひとつと複数のＥｌ　−３−Ｇ抗原決定部位をもっている二重機能性雑種分子からなる共役体を、１・４０の希釈率で、１％ＢＳＡのＰＢＳ（ｐ）１７．４）−０，０２％アジ化ナトリウム溶液で希釈した。

ラベルされたコンポーネント−抗Ｅｌ−３−Ｇ抗体は１本質的には、共願の特許出願第１０５．２８５の実施例Ｉに記されているＦｒｅｎｓの方法を用いて、金ゾル粒子でラベルした。この明細書を引用することにより、本願に一体にする。

これに関しては、１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，５）　１２．３２ｍ１を手早く１６４．２５ｍ１の金ゾル分散液と混ぜた。この分散液には平均直径およそ６０から９０ｍｍの粒子がはいっている。混ぜながら、１８８μｓ／ｍｌの抗体の２ｍＭホウ酸緩衝液溶液を３６．５ｍｌ加え、１５分間反応させた。　１６．４ｍｌの５％ボリニチレングリコール（ＰＥＧ）２０Ｍ溶液を混ぜながら加え、混合物は室温で１５分間反応させた。この金ラベルした抗体溶液は、　５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳＡロータで１０．　ＯＯＯｒｐｍで３回、　５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５Ｂ遠心機で遠心した。各遠心の後で、上清を捨て、赤い沈殿をＪｏｈｎｓｏｎの緩衝液（０，６ｇ／ｌ　Ｔｒｉｚｍａ　Ｂａ５ｅ、　０゜０１６／Ｉ　ＰＥＧ　（２０Ｍ）　、　０．０１ｇ／ｌ　Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌを精製水に溶かし、　ＨＣｌでｐＨを９，０に合わせたもの）に懸濁した。この溶液を０．２２ミクロンのフィルターで濾過し、　Ｊｏｈｎｓｏｎの緩衝液で体積を４６．９ｍｌとした。最後にこの抗体溶液を１＝２０の希釈率で４０ｍｔＪ　ＭｇＳＯ４−１％ＢＳＡ−０，０２％アジ化ナトリウムで希釈した。

固相コンポーネント−ゼラチン／Ｐ−３−Ｇは、水溶性カルボジイミドを用いて直接カップリングさせて調製した。この手順においては、１５０ｍｇのゼラチンを４ｍｌの温水に溶かし、　１ｍｌのピリジンを加えて、　５ｍｌの２０％ピリジンを含む水溶液とした別の容器に２０ｍｇのＰ−３−Ｇを０．２ｍｌのピリジンに溶かし、水を加えて、２０％ピリジンを含む１ｍｌの水溶液とした。１ｍ】のゼラチン溶液を０．６２５ｍ１のＰ−３−Ｇ溶液と混ぜ、９゜５５ｍｇの１− エチル−３−（３−ジエチルアミノプロビル）カルボジイミド塩酸塩を加えてとかした。この混合物を混ぜながら２時間室温で反応させた。この溶液を温かいＰＢＳ／アジドに対して透析し。

ＰＢＳ／アジドでゼラチンの最終濃度が１ｍｇ／ｍｌ程度になるように希釈した。たくさんのＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＩｍｍｏｂｉ　Ｊｏｎ活性化微細孔膜（０，６５ミクロン）に、このＩｍｇ／ｍｌゼラチンＰ−３−Ｇ溶液をそれぞれ１０ｍ１ずつスポットし、この上に固定化した。スポットののち、膜は、モノエタノールアミンの希釈していない液に浸すことによってブロックした。

洗浄溶液−０，２％Ｉｇｅｐａｌ水溶液。

測定手順１、　上に概説した様々な標準ホルモン濃度の組み合わせを含む試料を作った。

２、　１２本のチューブを用意し、それぞれに、試料８０μｌ。

抗Ｅｌ−３−Ｇ抗体（ブロッキング用抗体）溶液（５１２μｇ／１）２５μｍ、二重機能性雑種連結化合物の希釈溶液２０μｍを順番に加えた。このとき、ひとつ加えるごとに混ぜた。

３、　２のステップの混合物をそれぞれ、固相、すなわち、フロースルーアッセイ（ＰＴＡ）装置に取付けたゼラチン／Ｐ−３−Ｇをスポットした膜、に注ぎ込んで通過させた。用いたＰＴＡ装置は本質的には井原で同一出願人に譲渡された特許出廓第１０７．２４０号（１９８７年１０月２９日出願）に示しであるタイプと同じタイプのものである。

４　それから、　０．２ｍｌの希釈した金ラベルコンポーネントの溶液を注ぎ込んで膜を通過させた。

５、　洗浄溶液を注ぎ込んで膜を通過させることにより。

ＰＴＡ装置のカップが一杯にまるまで膜を洗浄した。

６、　膜を目でみてピンク色の着色を観察することによって結果を得た。このピンク色は金粒子の存在を示す特徴である。結果は表＝に示した。高濃度（０，６２５ｕｇ／ｍｌ）のＰ−３−Ｇを含む試料の場合には、Ｅｌ　−３−Ｇの濃度がいくらであっても。

膜に着色はみられなかった。Ｐ−３−Ｇが低濃度（０，１５６μｇ／ｍｌ）の場合には、Ｅｌ−３−Ｇを低濃度（０，３１２５ｕ　ｇ／ｍｌまたはそれ以下）に含む試料では着色がみられなかったが、Ｅｌ−３−Ｇを高濃度（０，３１２５ｕｇ／ｍ１以上）に含む試料では、鮮やかなピンク色を生じた。

表工Ｅｌ　−３−Ｇの濃度（ｕｇ／ｍ１）０　０．１５６　０．３１２５　０．６２５　１．２５　５Ｐ− ３−Ｇの濃度上の表においてマイナスの印（−）は１着色しなかったことを示す、プラスの印（＋）は鮮やかに着色したことを示す。

上述の例においては、固相支持体は微細孔性膜からなっていた　固相コンポーネントは、Ｐ−３−Ｇをゼラチンで連結して微細孔性膜とカップリングさせることによって調製した。このようにこの場合には、第一の免疫反応性物質であるＰ− ３−Ｇは、接触の段階に先立って最初に固相支持体にカップリングされた（実施例＝の手順の３の段階）、接触の段階の結果。

Ｐ−３−Ｇ分析対象の量が結合を阻害しないほど少ないときには、二重機能性雑種連結コンポーネントが固相支持体の上のＰ−３−Ｇに結合した。予め較正した量よりもＰ−３−Ｇの濃度が高い場合には二重機能性雑種コンポーネントは単に膜を通過した。どちらの場合にしても、接触の段階の後に膜上に残っているものをとにかく試験の中間産物ということにする。

Ｐ−３−Ｇが低濃度の場合には、試験の中間産物には、固相コンポーネントに結合した二重機能性雑種コンポーネントが含まれている。試料中に高濃度のＰ−３ −Ｇが存在していた場合には、中間産物は、単に、膜に結合したＰ−３−Ｇが未反応のまま残っているだけの固相である。最初の試料中にＥｌ　−３−Ｇが充分にたくさんあれば、試験の中間産物における二重機能性雑種連結コンポーネントのＥｌ　−３−Ｇ抗原決定部位はブロックされずに残っている。一方、試料中のＥｌ　−３−Ｇのレベルが予め設定したレベルより低かった場合には、二重機能性雑種コンポーネント上のＥｌ−３−Ｇ抗原決定部位は、ブロッキング用の抗Ｅｌ−３−Ｇ抗体によってブロックされた。いずれの場合にしても、いろいろな試験の中間産物が、４の段階において、金ラベルしたコンポーネントと接触した。

そして、二重機能性雑種連結コンポーネントが固相コンポーネントに結合し。

そのＥｌ　−３−Ｇ抗原決定部位がブロックされずに残っていた場合には、ラベルされたコンポーネントが二重機能性コンポーネントに結合し、従って固相に結合した。その他の全ての場合には、ラベルされたコンポーネントは単に膜を通過した。従って、ピンク色の試験結果産物ができたのは、試験した試料中に、Ｅｌ −３−Ｇが高濃度であり、かつＰ−３−Ｇが低濃度であった場合であり、他の場合には試験結果の産物は着色しないままであった。

大皿土工二つの分析対象の測定材料標準試料−Ｐ〜３−ＧとＥｌ−３−Ｇの試料は、５０％エタノール水溶液中に溶かし、Ｐ−３−Ｇについては１．２５．２．５　、５Ｍｇ／ｍ１．　Ｅ　１−３ −　Ｇについては０．６２５　、０．３１２５．０．１５６　、０．０７８　、０．０３９　ｕｇ／ｍｌとなるように、０．１％ＢＳＡのＰＢＳ　（ｐＨ７，４）溶液に溶かしたものを作製した。

ブロッキング用抗体−抗Ｅｌ−３−Ｇ抗体溶液の濃度が１２８μｇ／ｍｌである点以外は、実施例■と同じ。

二重機能性雑種コンポーネント−実施例Ｈの共役体をに１５０の希釈率で希釈した点以外は実施例ＩＩと同様。

ラベルされたコンポーネント−Ｆ　ｒｅｎｓの方法を用いて抗Ｅｌ−３−Ｇ抗体を金ゾル粒子でラベルした。この場合、　１２．７９ｍ１の１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）と、平均直径５６ｎｍの粒子を含んだ金ゾル分散液２７０．５＋ｎＪを手早く混合した。混ぜながら、　２ｍＭホウ酸緩衝液に溶けた１８０μｇ／ｍｌの抗体溶液を３７．８ｍ１加えて、　１５分間反応させた。

混ぜながら、　１７．５ｍｌの５％　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　）　２０　Ｍ　（シグマ、セントルイス）を加え、室温で１５分間反応させた。この、金ラベルされた抗体の溶液は、　５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳＡロータで１０．０００ｒｐｍで３回、　５ｏｒｖａｌｌＲＣ５Ｂ遠心機を用いて遠心した。各遠心の後、上清を捨て、赤い沈殿をＪｏｈｎｓｏｎの緩衝液（ｐＨ９，０）に懸濁した。

最後に、この溶液を０．２２ミクロンのフィルタで濾過し、　Ｊｏｈｎｓｏｎの緩衝液で体積を５．２ｍｌとした。この抗体溶液は１：ｌＯＯの希釈率で、　４０ｍＭＭｇ５Ｏ４−１％ＢＳＡ−０，０２％アジ化ナトリウムで希釈した。

固相コンポーネント−この実施例においては、固相コンポーネントとしては、ビオチン化ゼラチン／Ｐ−３−Ｇ　（ＢＧＰ）を用いた。これは、アビジンをスポットした膜上での複合体の捕捉を効率化する。

Ａ、ビオチン化ゼラチン／Ｐ−３−Ｇ　（ＢＧＰ）−まず、ゼラチン／Ｐ−３− Ｇ　を調製した。　８．２７ｍｇのＰ−３−Ｇを２０％ピリジン水溶液に溶かし１体積を０．２７６ｍ１とした（３０ｍｇＰ−３−Ｇ／ｍｌ　）　、　２０ｍｇのゼラチンも２０％ピリジン水溶液に溶かし、　０．４８５ｍ１　とした（４１．２ｍｇゼラチン／ｍｌ　）　、　Ｐ−３−Ｇの溶液とゼラチンの溶液を一緒にして混ぜ、Ｐ−３−Ｇとゼラチンのモル比が５０：１となるようにし、実施例＝で用いた水溶性カルボジイミドを８ｍｇ加えて室温で１時間反応させた６反応産物はＰＢＳ／アジドに対して透析し、最終濃度が１３．０ｍｇゼラチン／ｍｌ　となるように濃度を調整した。この溶液をさらに、ゼラチン濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように、０．１Ｍ　炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８，０）を用いて希釈した。　３．９ｍｌのゼラチン／Ｐ−３−Ｇ溶液に、　０．５８５ｍ１の１ｍｇ／ｍｌのビオチン−ＬＣ−Ｎ）ＩｓのＤＭＳＯ溶液を加えた。この混合液を室温で４時間反応させた。できたビオチン化ゼラチン／Ｐ−３−Ｇ　（ＢＧＰ）は、ＰＢＳ／アジドに対して透析し、このＢＧＰ溶液は１：３２の希釈率でＰＢＳで希釈した。

Ｂ、アビジンをスポットした膜−１０ｍｇ／ｍｌの４−ジメチルアミノピリジンを含む２．５ｍｇ／ｍｌアビジンＰＢＳ溶液２０μｌを、たくさんのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ微細孔性活性化膜（０，６５ミクロン）上にそれぞれスポットし、アビジンはこの膜上に固定化された。この、アビジンをスポットした膜は、炭酸緩衝液（ＩＭ−ｐＨ９，５）に溶けた１０％エタノールアミンでブロックした。

２、　１５本のチューブを用意し、それぞれに、試料５０μｌ。

抗Ｅｌ−３−Ｇ抗体溶液（１２８μｇ／ｌ　）　２５μｌ、希釈したＢＧＰ溶液２０μｍ、二重機能性雑種連結化合物の希釈溶液２０μｍを順番に加えた。このとき、ひとつ加えるごとに混ぜた。

３、　２のステップの混合物をそれぞれ、実施例＝で使用したのと同じ種類のフロースルーアッセイ（ＰＴＡ）装置に取付けた。アビジンをスポットした固相の膜に注ぎ込んで通過させた。

４、　それから、　０．２ｍｌの希釈した金ラベルコンポーネントの溶液をそれぞれの膜に注ぎ込んで膜を通過させた。

５、　洗浄溶液を注ぎ込んで膜を通過させることにより。

ＰＴＡ装置のカップが一杯にまるまでそれぞれの膜を洗浄した。

６、　膜を目でみてピンク色の着色を観察することによって結果を得た。このピンク色は金粒子の存在を示す特徴である。結果は表：に示した。Ｅｌ　−３−Ｇ低濃度に含む試料では。

Ｐ−３−Ｇの濃度にかかわらず、膜はほとんどまたは全く着色しなかった。Ｅｌ −３−Ｇの濃度が高い場合には９着色はＰ−３−Ｇの濃度とは逆の関係で変化した。すなわち、高濃度のＥｌ　−３−Ｇを含みかつ高濃度のＰ−３−Ｇを含む試料においては、高濃度のＥｌ−３−Ｇを含み、低濃度のＰ−３−Ｇを含む試料よりも着色が少なかった。

表ＩＩＥｌ　−３−Ｇの濃度（μｇ／ｍｌ）　０．３９　０．７８　．０．＋５６　０．３１２５　０．６２５Ｐ−３−Ｇの濃度（μｇ／ｍ１）１．２５　０　０　１／２　４　４２．５　０　０　０　２　２上の表において０は９着色しなかったことを示す、数字が大きくなるほど着色の強度が高かったことを示す。

実施例■においては、固相コンポーネントは、固相支持体にカップリングさせるのに適するようにされた免疫反応性物質Ｐ−３−Ｇからなっている。この例においては、ゼラチン／Ｐ−３−Ｇはビオチン化され、接触のステップの後で、アビジンをスポットした支持体（微細孔性膜）とカップリングされた。従って、ステップ２において、試料、ブロッキング用抗体、ＢＧＰ溶液、および、二重機能性雑種コンポーネントは。

全て、ステップ３でアビジンをスポットした膜と接触させられる前に、混合された。試料中のＥｌ　−３−Ｇの濃度が高くてＰ−３−Ｇの濃度が低い場合には、ステップ２において、ラベルされたコンポーネントと二重機能性雑種コンポーネントと固相コンポーネントからなる免疫複合体が形成された。このような複合体は、ステップ３において混合液がアビジンなスポットした膜と接触させられたときに、ビオチンとアビジンの間の反応によって、試験の中間産物として集められた。試験の中間産物はそれから、金ラベルしたコンポーネントとステップ４において接触させられ、全て、上記の実施例＝で起こったことと同じように、試験の結果の産物ができ、試料中のＥｌ　−３−Ｇの濃度が高くてＰ−３−Ｇの濃度が低い場合にはにはピンク色をしていて、他の場合には無色であるかまたは弱く着色するのみであった。

上の記載において捕捉のコンポーネントは、固相の微細孔性のフロースルー型の膜にカップリングされるかまたはカップリングされるのに適するようにされるかした免疫反応性物質（Ｐ−３−Ｇ）であった、そのかわりに、捕捉反応のコンポーネントには、　Ｃｏ１ｅ等ので同一出願人に譲渡された特許出願第１０５、２８５号に完全に記されている固体のような１分散性で水に不溶の固体粒子にカップリングされた免疫反応性物質を用いることも可能である。その場合には、捕捉反応のコンポーネントには、最初にラテックス粒子やセファロースビーズ、ガラスピーズといったものにカップリングさせておいた第一の免疫反応性物質（Ｐ− ３−Ｇ）を用いることになるであろう、そして、この捕捉のコンポーネント、ラベルされたコンポーネント、および二重機能性コンポーネントからなる免疫複合体が、陽性の結果のときには生じるであろう、このような免疫複合体は上述のＣｏ１ｅの特許出願で述べられたような方法で集めることができる。すなわち、多孔性マトリックスの捕捉エレメントを用い。

沈降や遠心を用いて、多孔性マトリックスの捕捉エレメント上に試験の結果の産物を集めて視覚的に調べるのである。

上記のＢａｈａｒの特許出願第１５３．０８１号にあるポジティブステップ測定法およびＬｅｎｎｏｎ等の特許出願第１［１７，２４０号にあるような種類のＰＴＡ装置の利用を９本発明は含んでおり、また。

少なくともある局面においては、　Ｃｏ１ｅ　特許出願第１０５．２８５号にある金属ゾル捕捉免疫測定法も利用している。従って、上記のＢａｈａｒ　、　Ｌｅｎｎｏｎ等、およびＣｏ１ｅ等の特許出願は引用により本願と一体化し、この明細書に取り込んである。

本発明は上記のような免疫測定法を供給する。また１本発明は、量を測った試験のコンポーネントを含み、効率よく一回または複数回の繰り返しの試験を行うための材料のキットをも供給する０本発明はさらに、少なくともひとつの抗原性部分とタンパク性のリセブタの部分をもつ、新奇の二重機能性反応コンポーネントをも供給する。これらの部分は、付加違約に結合して一緒になることにより、二重機能性コンポーネントを実現している。このような二重機能性雑種コンポーネントとその作り方は上記の実施例工に記されている。

本発明に従えば９本発明の属する技術分野の通常の技術に詳しい者にはよく知られていることだが、免疫測定においては。

その時どきに必要とされている結果の検出や確認には較正が必要である。測定の様々なコンポーネントの濃度や構成は較正されなければならず、この作業は普通、標準物質等をもちいて実験的に行われ、それによって望ましい感度が得られ。

正確−二較正できるのである４このように、捕捉反応の免疫反応性物質の量は、単純に、固相支持体にカップリングさせる物質の量を変えることによって調節できる。捕捉のコンポーネントの物質は二重反応性コンポーネント上の結合部位への結合において、一方の分析対象と競争するので、捕捉のコンポーネントの免疫反応性物質の量を調節することによって、陽性の結果となるための分析対象のレベルを較正できる。同様に、ブロッキング反応のコンポーネントの量を調節することによって、陽性の結果となるための第二の免疫反応性物質のレベルを調節できる。

二重機能性の反応コンポーネントの量と、その上の第一の免疫反応性部位と第二の免疫反応性部位の数の比も、これらを調節することによってさらに正確に較正することができるし、感度をよくしたりすることができる。これらの操作は全て９本発明の属する技術分野における通常の技術をもった者にとっては１日常的な技術に属するものであり、免疫測定法を組み立てる上では一般的に必要となる操作である９本発明の二重機能性反応コンポーネントは新規のものであるが、その新規な構成のために、測定の微妙な調整のための柔軟性が最大限になっているのである。

ＦＩＧ、　！ＤＡＹＯＦＣＹＯＬＥ国際調査報告Ｐσｌυ５９０１０１２２７

Claims

【特許請求の範囲】

１．まず最初に固相支持体とカップリングするか、あるいは、カップリングするのに適するようにされた第一の免疫反応性物質で、この第一の免疫反応性分析対象の免疫特異的反応性に類似した免疫特異的反応性を持つ前記第一の免疫反応性物質から成る捕捉の反応コンポーネントを作り、免疫特異性に第二の免疫反応性分析対象と結合することができる第二の免疫反応性物質から成るブロッキング反応のコンポーネントを作り、前記第二の免疫反応性物質の免疫特異的反応性と類似した免疫特異的反応性を持つ第三の免疫反応性物質およびこれに結合した検出標識とから成る、ラベルされた反応のコンポーネントを作り、（１）上記の捕捉の反応コンポーネント，（２）試料中に少なくとも予め決められた濃度の上記の第一の分析対象が存在する場合には，陽性の測定結果を生ずるためには第一の免疫反応性物質に結合することのできる二重機能性コンポーネントの量が足りないような割合で，雑種物質の第一の免疫反応性部位と捕捉のコンポーネントの第一の免疫反応性物質との結合が阻害される程度に，捕捉の反応コンポーネントに対して充分に少ない量の上記二重機能性コンポーネント，（３）上記ラベルされた反応コンポーネントおよび（４）試料中に少なくとも予め設定された濃度の上記第二の分析対象が存在しない場合には，陽性の測定結果を生するためには上記雑種物質の第二の部位に結合できるラベルされたコンポーネントの量が足りないようになる程度まで，雑種物質の第二の免疫反応性部位がブロックされ，雑種物質の第二の免疫反応性部位とラベルされたコンポーネントの第二の免疫反応性物質との結合が阻害される程度に，十分に大量の上記ブロッキング用コンポーネントとから成る水溶液試料を接触させることによって，それによって陽性の測定結果が出るのは，試料中の第一の分析対象の濃度が予め決定された濃度以下でしかも試料中の第二の分析対象の濃度が予め設定された濃度以上の場合にのみ，捕捉のコンポーネントとラベルされた反応コンポーネントからなる免疫複合体を，確認可能な量生成することを特徴とする水溶液試料中の第一および第二の免疫反応性分析対象の相対的な濃度を決定するための測定法。
２．上記免疫反応性分析対象のうちの少なくともひとつが抗原性であることを特徴とする請求項１の測定法。
３．上記第一および第二の免疫反応性分析対象がそれぞれ抗原性であることを特徴とする請求項２の測定法。
４．上記第一および第二の免疫反応性分析対象がそれぞれステロイド性であることを特徴とする請求項３の測定法。
５．上記第一および第二の免疫反応性分析対象がそれぞれ自然界に存在するホルモン性であることを特徴とする請求項４の測定法。
６．上記第一および第二の免疫反応性分析対象がそれぞれ自然界に存在する哺乳動物のステロイドホルモンまたはその代謝物であることを特徴とする請求項５の測定法。
７．上記第一の免疫反応性分析対象がＰ−３−Ｇであり，第二の免疫反応性分析対象がＥ１−３−Ｇであることを特徴とする請求項６の測定法。
８．固相支持体が微細孔性膜であることを特徴とする上記請求項１の測定法。
９．固相支持体が分散性で水に不溶の粒子からなっており，上記第一の免疫反応性物質が接触のステップに先立ってこの粒子にカップリングされていることを特徴とする上記請求項１の測定法。
１０．上記検出標識が金ゾル粒子であることを特徴とする請求項９の測定法。
１１．接触のステップにおいて，ブロッキングのコンポーネント，二重機能性コンポーネント，および，ラベルされたコンポーネントが試料と接触することによって，試験が陽性であった場合には，水に不溶の粒子と金ゾル粒子を含んだ免疫複合体を形成することを特徴とする請求項１０の測定法。
１２．免疫複合体を集め，集められたものの中に金が存在することを示す着色を直接視覚的に調べるステップを含むことを特徴とする，上記請求項１１の測定手順。
１３．免疫複合体が集められ，視覚的に調べられるのが，フィルタエレメント上であることを特徴とする請求項１２の測定法。
１４．上記雑種免疫反応性物質が，上記第一の免疫反応性部位からなるタンパク性物質，および，上記第二の免疫反応性部位からなる第二のタンパク性物質を含んでおり，上記第一および第二のタンパク性物質が不可逆的に結合して一体となることによって，上記雑種物質を実現していることを特徴とする上記請求項１の測定法。
１５．上記接触のステップにおいて上記試料がラベルされたコンポーネントと接触させられる前にブロッキングのコンポーネントと接触させられることを特徴とする上記請求項１の測定法。
１６．上記接触のステップにおいて，ブロッキングのコンポーネント，二重機能性コンポーネント，および固相コンポーネントを，水溶液試料と接触させることによって試験の中間産物を作り，この試験の中間産物をラベルされたコンポーネントと接触させることによって試験の結果の産物を作ることを特徴とする，上記請求項１の測定手順。
１７．第一の免疫反応性物質が接触の段階に先立って固相支持体とカップリングされることを特徴とする，上記請求項１６の測定手順。
１８．第一の免疫反応性物質が接触の段階の後に固相支持体とカップリングされることを特徴とする，上記請求項１６の測定手順。
１９．上記第一の分析対象がＰ−３−Ｇであり，上記第二の分析対象がＥ１−３ −Ｇであり，上記第一の免疫反応性物質がＰ−３−Ｇであり，上記第二および第三の免疫反応性物質がＥ１−３−Ｇに対する同じ抗体であり，上記第一の免疫反応性部位がＰ−３−Ｇに対する抗体の抗原結合部位に由来し，上記第二の免疫反応性部位がＥ１−３−Ｇ分子の抗原決定部位に由来することを特徴とする，月経周期の妊娠可能な期間を予言するために用いられる，上記請求項１の測定手順。
２０．上記Ｐ−３−Ｇに対する抗体と上記Ｅ１−３−Ｇ分子が，不可逆的に結合して一体となり，上記雑種免疫反応性物質を実現していることを特徴とする，上記請求項１９の測定手順。
２１．上記検出標識が金ゾル粒子であることを特徴とする，上記請求項２０の測定手順。
２２．上記固相支持体が微細孔性膜からなり，上記第一の免疫反応性物質が接触のステップに先立ってそこにカップリングされることを特徴とする，上記請求項２１の測定手順。
２３．上記接触のステップにおいて，ブロッキングのコンポーネント，二重機能性コンポーネント，および固相コンポーネントを，水溶液試料と接触させることによって試験の中間産物を作り，その後この試験の中間産物をラベルされたコンポーネントと接触させることによって試験の結果の産物を作ることを特徴とする，上記請求項２２の測定手順。
２４．試験の中間産物を集め，その後，それをラペルされたコンポーネントと接触させ，試験の結果の産物を直接視覚的に調べて，そこに金ゾル粒子が存在することを示す着色を観察するステップを含むことを特徴とする，上記請求項２３の測定手順。
２５．試験の中間産物が膜上に集められ，試験の結果の産物が膜上で調べられることを特徴とする，上記請求項２４の測定手順。
２６．上記検出標識が金ゾル粒子であることを特徴とする，上記請求項１の測定手順。
２７．上記検出標識が，酵素的発色システムのコンポーネントであることを特徴とする，上記請求項１の測定手順。
２８．上記接触のステップにおいて，上記水溶液試料を，ラベルされたコンポーネントと接触させる前に，捕捉のコンポーネントと接触させることを特徴とする，上記請求項１の測定手順。
２９．上記捕捉のコンポーネントの第一の免疫反応性物質が最初に，接触のステップに先立って固相支持体とカップリングさせることを特徴とする，上記請求項１の測定手順。
３０．上記捕捉のコンポーネントの第一の免疫反応性物質が，接触のステップの間または後に固相支持体とカップリングさせることを特徴とする，上記請求項１の測定手順。
３１．水溶液試料を捕捉のコンポーネントと接触させた後で，捕捉のコンポーネントの第一の免疫反応性物質を固相支持体とカップリングさせ，その後で，水溶液試料をラペルされたコンポーネントと接触させることを特徴とする，上記請求項２８の測定手順。
３２．水溶液試料を捕捉のコンポーネントと接触させた後で，捕捉のコンポーネントの第一の免疫反応性物質を固相支持体とカップリングさせ，その後で，水溶液試料をラベルされたコンポーネントと接触させることを特徴とする，上記請求項２８の測定手順。
３３．上記捕捉のコンポーネント，上記ブロッキングのコンポーネント，上記ラベルされたコンポーネント，および，上記二重機能性コンポーネントからなる，上記請求項１の測定手順を行うための測定キット。
３４．上記捕捉のコンポーネント，上記ブロッキングのコンポーネント，上記ラベルされたコンポーネント，上記二重機能性コンポーネント，および，上記微細孔性膜からなる，上記請求項８の測定手順を行うための測定キット。
３５．上記捕捉のコンポーネント，上記ブロッキングのコンポーネント，上記ラベルされたコンポーネント，および，上記二重機能性コンポーネントからなる，上記請求項２１の測定手順を行うための測定キット。
３６．上記捕捉のコンポーネント，上記ブロッキングのコンポーネント，上記ラベルされたコンポーネント，および，試験の中間産物を集め，試験の結果の産物を視覚的に調べるためのエレメントからなる，上記請求項２４の測定手順を行うための測定キット。
３７．上記捕捉のコンポーネント，上記ブロッキングのコンポーネント，上記ラベルされたコンポーネント，および，試験の中間産物を集め，試験の結果の産物を視覚的に調べるためのフィルタからなる，上記請求項２５の測定手順を行うための測定キット。
３８．少なくともひとつの抗原部分とタンパク性のリセプター部分をもっていて，これらの抗原部分と抗体部分が不可逆的に結合して一体となっている，雑種免疫反応性物質。
３９．抗体部分が抗Ｐ−３−Ｇ抗体に由来することを特徴とする，上記請求項３８の物質。
４０．抗原部分がＥ１−３−Ｇに由来することを特徴とする，上記請求項３８の物質。
４１．抗原部分がＥ１−３−Ｇに由来することを特徴とする，上記請求項３９の物質。
４２．少なくとも二つの抗原部分をもつことを特徴とする，上記請求項３８の物質。
４３．上記部分がアミド結合を通して結合し一体となっていることを特徴とする，上記請求項３８の物質。