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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung trifft im Allgemeinen ein Verfahren zur Bestimmung und
Quantifizierung zellulärer
Anhaftungserscheinungen. Sie ist insbesondere auf ein Durchflusssystem
zur Bestimmung der Bindungskapazität von Blutplättchen bzw.
deren Vorgängern
oder anderen Zellen in biologischen Proben, das ein vollautomatisches
oder halbautomatisches sein kann, gerichtet. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist besonders nützlich bei
der Beurteilung von Individuen hinsichtlich Abnormalitäten bei
der Plättchenaktivität oder -funktion
wie denjenigen, die bei einer Thrombose, einer Herzerkrankung, einem
Schlaganfall oder anderen Gefäßerkrankungen
auftreten.
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Stand der
Technik für
die Erfindung
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Blutplättchen sind
spezialisierte adhäsive
Zellen, die eine zentrale Rolle bei hämostatischen Vorgängen wie
der Blutkoagulation spielen. Wenn Endothelzellen, die ein Blutgefäß auskleiden,
beschädigt
sind, haften Blutplättchen
schnell an und aggregieren an der verletzten Stelle, wobei sie das
primäre
hämostatische Blutgerinnsel
bilden. Zusätzlich
zu ihrer Aufgabe, eine Blutung zu stoppen, spielen Blutplättchen auch
eine zentrale Rolle bei der Bildung von lebensbedrohlichen arteriellen
Thromben. Studien an Patienten, die an Herzanfällen und Schlaganfällen litten,
haben gezeigt, dass diese Erkrankungen durch das Aufreißen einer
arteriosklerotischen Plaque ausgelöst werden, wodurch Bestandteile
der Gefäßwand freigelegt
werden, die in der Lage sind, Blutplättchen zu aktivieren. Dieses
Anhaften von Blutplättchen
an exponierten Subendothelkomponenten, zusammen mit der Freisetzung
chemischer Mediatoren, die in der Lage sind, eine Plättchenaggregation
und eine Gefäßeinengung
auszulösen,
führen
zur Bildung lebensbedrohlicher Thromben.
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Plättchenadhäsionsvorgänge sind
entscheidend abhängig
von der Wechselwirkung von Plättchenoberflächenrezeptoren
mit spezifischen adhäsiven
Proteinen, die in der beschädigten
Blutgefäßwand vorhanden
sind. Zwei dieser Proteine, der von-Willebrand-Faktor (vWf) und Collagen,
spielen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der ersten
Anhaftung von Blutplättchen
an der Gefäßwand. Der
von-Willebrand-Faktor bindet an zwei große Rezeptoren auf der Blutplättchenoberfläche, den
Glykoprotein-(GP-)Ib/V/IX-Komplex und GPIIb/IIIa. Dabei wird die
anfängliche
Wechselwirkung zwischen Blutplättchen
und vWf von der vWf-GPIb/V/IX-Wechselwirkung
vermittelt. Dabei ist dies ein vorübergehender Anhaftungsvorgang,
der nicht nur die Riffelung der Blutplättchen unterstützt, sondern
auch für
die GPIIb/IIIa-Aktivierung
erforderliche Signale überträgt. Dabei
bindet der letztere Rezeptor an eine bestimmte Stelle des vWf-Moleküls und stabilisiert
die Blutplättchenadhäsion an
der Stelle der Gefäßverletzung,
insbesondere unter den Bedingungen einer hohen Scherspannung. Collagen
bindet auch an zwei bestimmte Rezeptoren auf der Plättchenoberfläche, GPIa/IIa und
GPVI. Jüngere
Studien legen nahe, dass beide Rezeptoren für eine effiziente Plättchenadhäsion am
Collagen erforderlich sind, wobei letzterer Rezeptor (GPVI) eine
bedeutende Rolle bei der Collagen-ausgelösten Signalleitung spielt.
Eine Anzahl weiterer Rezeptoren auf der Plättchenoberfläche, einschließlich Integrin α5β1 (ein
Fibronectin-Rezeptor), Integrin α6β1 (ein Laminin-Rezeptor) und Integrin α5β3 (ein
Vitronectin-Rezeptor), kann ebenfalls an dem ersten Adhäsionsvorgang
beteiligt sein.
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Der
Grund für
eine solch große
Anzahl von Adhäsionsrezeptoren
auf der Plättchenoberfläche ist
noch nicht klar erkannt worden. Eine Möglichkeit ist, dass das Blutplättchen unterschiedliche
Adhäsionsmechanismen
an verschiedenen Stellen des Gefäßsystems
nutzen kann. So ist beispielsweise gut verstanden, dass unter den
Bedingungen einer hoher Scherspannung wie denjenigen, die bei der
Mikrozirkulation oder in stenotischen Arterien herrschen, die Plättchenadhäsion entscheidet
von der Bindung von vWf an sowohl GPIb/V/IX als auch GPIIb/IIIa
abhängig
ist. Unter diesen Bedingungen können
Collagen, Fibrinogen, Fibronectin, Vitronectin oder Laminin bei
Abwesenheit von vWf eine stabile Plättchenadhäsion nicht unterstützen. Jedoch
ist unter schwächeren
Schwerbedingungen wie in Venen oder großen Arterien vWf für eine stabile
Plättchenadhäsion nicht
wesentlich, und eines oder mehrere dieser letzteren Substrate können eine
stabile Plättchenadhäsion vermitteln.
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Von
Mulvihill et al., Thrombosis and Haemostasis, Bd. 62, 989 (1989)
wurde die Rolle von adhäsiven Plättchen-α-globulären Proteinen
bei der Thrombin-stimulierten Plättchenakkumulation
an proteinbeschichteten Glaskapillaren beschrieben. Weiterhin wurde
von Mulvihill et al., Thrombosis and Haemostasis, Bd. 58, 724 (1987)
die Anwendung monoklonaler Antikörper
auf humanes Plättchenmembranglykoprotein
IIb-IIIa zum quantitativen Aufbringen von Plättchen auf künstliche
Oberflächen
beschrieben.
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Bisher
gab es jedoch noch keine routinemäßigen klinischen Tests, mit
welchen der Adhäsionsvorgang für Plättchen und
andere Zellen über
einen Bereich von Scherspannungen und verschiedenen Haftflächen beurteilt
werden konnte. Die entscheidende Rolle der Plättchenadhäsion bei vielen Funktionsstörungen,
einschließlich
Hämostase
und Thrombose, vorausgesetzt, besteht dringender klinischer Bedarf
an der Entwicklung einfacher, schneller und zuverlässiger Diagnosetests,
mit welchen die Haftfunktion von Plättchen adäquat beurteilt werden kann.
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Ein
System, das gegenwärtig
für die
Analyse der Plättchenfunktion
(PFA-100, hergestellt und vertrieben von DADE International) kommerziell
zur Verfügung
steht, ist entwickelt worden, um die primäre von Plättchen abhängige Hämostase in mit Citrat versetztem
Vollblut in vitro zu messen, und besteht aus einem mikroprozessorgesteuerten
Gerät und
einer Einweg-Testpatrone.
Die Testpatrone enthält
einen Behälter
für das
mit Citrat versetzte Vollblut und eine Kapillare, die mit einer
Kappe bedeckt ist, die eine biologisch aktive Membran mit einer
mittigen Öffnung
enthält.
Die Membran ist mit faserigem Pferdesehnencollagen Typ I beschichtet.
Zusätzlich
ist entweder Epinephrin (Adrenalin) oder ADP auf der Membran vorhanden,
um die Plättchenaktivierung
zu verstärken.
Das Analysegerät
saugt Vollblut durch die Kapillare in die Kappe, wo es mit der Membran in
Berührung
kommt und anschließend
durch die Öffnung
strömt.
Als Reaktion auf die Stimulierung durch Collagen, ADP oder Adrenalin
und die hohe Scherspannung (~5 000 bis 6 000 s–1)
haften die Blutplättchen
auf der Membranoberfläche
in dem die Öffnung
umgebenden Bereich an und aggregieren. Schließlich verstopft ein Blutplättchenpfropfen
die Öffnung,
wodurch der Blutstrom unterbrochen wird. Der Zeitraum, der erforderlich ist,
um das Verschließen
der Öffnung
zu erreichen, wird als Verschlusszeit definiert.
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Bei
den Arbeiten, die zur Erfindung geführt haben, ist von den Erfindern
ein Durchflussverfahren zur Messung der Adhäsion oder der Bindungsfähigkeit
von Plättchen
und anderen Zellen in biologischen Proben entwickelt worden. Das
Verfahren erlaubt das Kopieren oder Nachahmen eines Spektrums von
Bedingungen wie Durchfluss und Wandscherspannung, die typisch für diejenigen
sind, die in vivo vorkommen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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In
einem erfindungsgemäßen Merkmal
wird ein Diagnoseverfahren zur Bestimmung des Vorliegens oder des
Risikos zur Entwicklung eines Zustandes oder einer Funktionsstörung, die
mit zellulären
Abnormalitäten
verknüpft
ist, bei einem Individuum, bereitgestellt, umfassend:
- I. das Bestimmen der Bindungskapazität von Zellen in einer biologischen
Probe von dem Individuum an ein adhäsives Substrat durch Führen dieser
biologischen Probe in laminarer Strömung über ein adhäsives Substrat, das auf einem
festen Träger
immobilisiert ist, unter definierten Strömungsbedingungen und einer
Zeitdauer, die ausreicht, die es den Zellen der biologischen Probe
ermöglicht,
an das adhäsive
Substrat zu binden, und anschließendes Bestimmen der Anzahl
der Zellen, die an das adhäsive
Substrat gebunden sind, um die Bindungskapazität dieser Zellen anzugeben;
und
- II. Vergleichen der ermittelten Bindungskapazität dieser
Zellen in der biologischen Probe mit einer zuvor bestimmten Standardbindungskapazität für solche
Zellen, wobei eine Abweichung der ermittelten Bindungskapazität von der
zuvor ermittelten Standardbindungskapazität auf das Vorliegen oder das
Risiko zur Entwicklung eines Zustands oder einer Funktionsstörung, die
mit zellulären
Abnormalitäten
verknüpft
ist, bei dem Individuum hinweist.
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In
einer speziellen erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird die Messung des Vermögens
von Plättchen,
ein adhäsives
Blutgerinnsel zu bilden, unter Bedingungen, die die normale Homöostase nachahmen,
bereitgestellt. Sie kann deshalb als ein diagnostisches Hilfsmittel
zur Bestimmung des kardiovaskulären
Risikos bei Mensch oder Tier, speziell des Risikos von Komplikationen,
die mit einer übermäßigen Blutung
und/oder mit Blutgerinnungsereignissen wie Polyzythämie, einer
Herzerkrankung, einem Schlaganfall, einer vorübergehenden Ischämie oder
einer peripheren Gefäßerkrankung
verbunden sind, angewendet werden.
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In
einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal
wird ein Verfahren zur Bestimmung der modifizierenden Wirkung einer
Substanz auf die Bindungskapazität
von Zellen in einer biologischen Probe von einem Individuum bereitgestellt,
umfassend:
- I. das Führen der biologischen Probe
in Gegenwart dieser Substanz über
ein adhäsives
Substrat, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, unter
definierten Strömungsbedingungen
und eine Zeitdauer, die es den Zellen der biologischen Probe ermöglicht,
an das adhäsive
Substrat zu binden, und anschließendes Bestimmen der Zellen,
die an das adhäsive
Substrat gebunden sind; und
- II. Vergleichen des in Verfahrensschritt (I) erhaltenen Resultates
mit dem Resultat, das erhalten wird, wenn der Verfahrensschritt
(I) in Abwesenheit dieser Substanz durchgeführt wird.
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In
einem anderen erfindungsgemäßen Merkmal
wird ein System zur Bestimmung des Vorliegens oder des Risikos zur
Entwicklung eines Zustandes oder einer Funktionsstörung, die
mit zellulären
Abnormalitäten verknüpft ist,
bei einem Individuum bereitgestellt, umfassend:
- I.
einen festen Träger,
auf welchem ein adhäsives
Substrat immobilisiert ist,
- II. Mittel zum Leiten einer biologischen Probe von dem Individuum
in laminarer Strömung über das
adhäsive Substrat
unter definierten Strömungsbedingungen
und einen Zeitraum lang, der ausreicht, um die Zellen der biologischen
Probe in die Lage zu versetzen, an das adhäsive Substrat zu binden, und
- III. Detektionsmittel, um die Anzahl der an das adhäsive Substrat
gebundenen Zellen zu bestimmen.
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Spezielle
Beschreibung der Erfindung
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In
dieser Beschreibung und den anschließenden Ansprüchen ist,
sofern der Kontext nichts anderes erfordert, das Verb "umfassen" und Konjugationen
wie "umfasst" und "umfassend" so zu verstehen,
dass es den Einschluss einer festgestellten Ganzheit, einer Stufe
oder Gruppe von Ganzheiten oder Stufen, aber nicht den Ausschluss
irgendeiner anderen Ganzheit, Stufe oder Gruppe von Ganzheiten oder
Stufen bedeutet.
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Die
hier benutzte Bezeichnung "biologische
Probe" umfasst eine
beliebige Probe, die Zellen enthält, die
vermutlich eine Bindungskapazität
besitzen, einschließlich,
aber nicht darauf beschränkt,
verarbeiteten und unverarbeiteten biologischen Proben wie Vollblut
(nativ oder gerinnungshemmend gemacht), Plasma, Blutplättchen,
Blutplättchen
(gewaschen und in einem isotonischen Puffer resuspendiert), Lymphe,
weißen
Zellen, roten Blutzellen, Gewebeextrakt oder Biopsiematerial.
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Vorzugsweise
umfassen die Zellen Blutplättchen
oder deren Vorgänger.
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Die
hier benutzte Bezeichnung "Individuum" umfasst sowohl ein
gesundes Individuum als auch ein Individuum mit einem bekannten
oder vermuteten kardiovaskulären
bzw. einem anderen damit verwandten Zustand oder einer entsprechenden
Fehlfunktion.
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Die
Bezeichnung "adhäsives Substrat" wird hier in ihrem
umfassendsten Sinn benutzt, um einen beliebigen Liganden einzuschließen, mit
welchem eine Zelle in der biologischen Probe bis zu einem Maß wechselwirken
kann, das in einer ständigen
oder zeitweiligen Bindung der Zelle an den Liganden resultiert.
Adhäsive
Substrate umfassen Rezeptoren für
Zelloberflächenliganden,
Liganden für
Zelloberflächenrezeptoren
und Immunglobulinmoleküle,
die in der Lage sind, mit Zelloberflächenantigenen oder -epitopen
zu wechselwirken, immobilisierte Zellen mit Wechselwirkungskapazität für Zellen
in der Probe sowie spezifische oder unspezifische Aggregationssubstrate.
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In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist das adhäsive
Substrat für
die Adhäsion oder
Bindung von Plättchen
oder Vorgängern
davon geeignet und umfasst unter anderem Moleküle, die mit Zelloberflächenrezeptoren
Wechselwirken, wie vWf, Fibrinogen, Collagen, Vitronectin, Laminin
oder Fibronectin.
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Die
hier benutzte Bezeichnung "fester
Träger" umfasst ein Gerät, eine
Apparatur, ein Röhrchen
(einschließlich
eines Mikrokapillarröhrchens),
eine Kammer, ein Filter, ein Rohr oder einen Objektträger, die
für die Immobilisierung
eines adhäsiven
Substrats geeignet sind. So kann der feste Träger beispielsweise ein festes Material
wie Polymer, Glas, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Metall oder Cellulose
sein. Alternativ kann der feste Träger die Oberfläche eines
biologischen Materials wie Zellen, Gewebe oder ein beliebiges anderes
biologisches Substrat, das für
die Immobilisierung eines adhäsiven
Substrats geeignet ist, sein.
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Die
Bezeichnung "Bestimmung
der Anzahl von Zellen" umfasst,
dass die immobilisierten Zellen von der biologischen Probe einem
Vorgang unterworfen werden, der in der Lage ist, die immobilisierten
Zellen zu detektieren. Bequemerweise wird ein Marker auf der immobilisierten
Zelloberfläche,
in der Membran oder dem Cytosol der Zelle ausgewählt und detektiert. Erforderlichenfalls
kann die immobilisierte Zelle vollständig oder teilweise aufgerissen
werden, um einen Zugang zu dem Marker zu erhalten. Alternativ kann
es erforderlich sein, dass die Zelle durchlässig gemacht wird, um die Detektion
eines intrazellulären
Markers zu ermöglichen. Der
Marker kann beispielsweise ein Antigen, Enzym, Rezeptor, Ligand
für einen Rezeptor
oder ein beliebiges anderes Molekül sein, das in der Lage ist,
als Detektionsmarker verwendet zu werden.
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In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist der Marker ein solcher, der für die Detektion von Plättchen oder
deren Vorgängern,
die an das adhäsive
Substrat gebunden sind, geeignet ist. Solche Marker umfassen u.
a. Laktatdehydrogenase (LDH), Plättchenfaktor
4, P-Selectin, Thromboxan B2 oder β-Thromboglobulin.
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In
einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der Marker
durch spektralphotometrische Mittel, wie bei der Detektion der Plättchen-LDH,
nachgewiesen.
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Die
Bezeichnung "Durchfluss" bezieht sich in
dieser Beschreibung auch auf die gleichwertigen Bezeichnungen "Perfusionsgeschwindigkeit", "Scherrate" oder "Wandscherspannung". Dabei kann die
biologische Probe über
das immobilisierte adhäsive
Substrat unter Verwendung eines beliebigen Durchflussreglers wie
einer Einstufenpumpe, einer drehzahlgeregelten Pumpe, einer Spritzenpumpe
oder der Schwerkraft geleitet werden. Die Regelung des Durchflusses
kann durch einen beliebigen geeigneten Vorgang wie die Veränderung
der Pumpengeschwindigkeit erreicht werden.
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Der
Durchfluss ist als Milliliter Fluid pro Minute definiert. Die Scherung
ist eine Folge der relativen parallelen Bewegung von Fluidschichten
während
des Strömens,
sodass in einem Behälter
die Fluidgeschwindigkeit in der Nähe der Wand niedriger als diejenige
zum Zentrum ist. Diese Differenz des Durchflusses zwischen konzentrischen
Fluidschichten erzeugt einen "Schereffekt". Die Scherung ist
entweder als Scherrate oder Scherspannung definiert. Die Scherrate
wird in cm/s pro cm (oder als den Kehrwert einer Sekunde s–1) angegeben.
Die Scherspannung ist die Kraft pro Flächeneinheit (angegeben als Dyn/cm2 oder Pascal) und äquivalent der Scherrate mal
Viskosität.
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Typische
hier vorkommende Durchflüsse überstreichen
den Bereich, der erforderlich ist, um diejenigen zu entwickeln,
von denen angenommen wird, dass sie in vivo im Gefäßsystem
existieren. Typischerweise reichen Scherraten von etwa 20 bis etwa
20 000 s–1 und
insbesondere von etwa 30 bis etwa 3 000 s–1.
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Im
erfindungsgemäßen Verfahren,
wie es zuvor im weitesten Sinne beschrieben worden ist, kann die Detektion
von Zellen wie Plättchen,
die an das adhäsive
Substrat gebunden sind, durch Aufreißen der gebundenen Zellen und
Detektieren der aufgerissenen Zellen erfolgen.
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Dabei
soll die hier benutzte Bezeichnung "Aufreißen" einen beliebigen Vorgang oder ein beliebiges Verfahren
zum Waschen, zur Lyse, zur Permeabilisierung oder zu einer anderen
Veränderung
der Zellen umfassen. Weiterhin ist festzustellen, dass das Aufreißen der
an das adhäsive
Substrat gebundenen Zellen mit einem geeigneten Mittel wie einem
Lyse-Puffer oder einem Tensid durchgeführt werden kann. Das Aufreißen der
Zellen ist für
die Quantifizierung bestimmter Marker nützlich.
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Durch
die erfindungsgemäße Bestimmung
der Bindungskapazität
von Zellen, insbesondere Plättchen oder
Vorgängern
davon, wird ein Diagnoseverfahren zur Bestimmung des Vorliegens
oder des Risikos zur Entwicklung eines Zustandes oder einer Funktionsstörung, der/die
mit zellulären
Abnormalitäten,
insbesondere Abnormalitäten,
an welchen Plättchen
oder deren Vorgänger
beteiligt sind, verknüpft
ist, bei einem Individuum bereitgestellt. In Tabelle 1 sind mehrere
Zustände
aufgezählt,
bei welchen durch eine genaue Bestimmung der Plättchenfunktion die Diagnose
und die richtige Behandlung von Individuen unterstützt wird.
Weiterhin wird durch eine kontinuierliche Überwachung der Plättchenfunktion
auch die Beurteilung der Reaktion eines Individuums auf die Behandlung
unterstützt.
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Insbesondere
stellt das erfindungsgemäße Verfahren
ein Diagnoseverfahren zur Bestimmung des Risikos eines Individuums,
ein Blutgerinnsel zu bilden, bereit. Dabei kann das Risiko eines
Individuums, ein Blutgerinnsel zu bilden, bestimmt werden, indem
zwischen verschiedenen Gruppen von Individuen ein Vergleich durchgeführt wird.
So kann beispielsweise ein Vergleich von Blutproben von normalen
gesunden Individuen mit Blutproben von Patienten mit dem Risiko
der Bildung eines Blutgerinnsels durch Messen und Vergleichen der
Adhäsion
von Plättchen
aus den Blutproben jeder Gruppe über
einen standardisierten, spezifizierten Zeitraum bei einem spezifizierten
Durchfluss und einer spezifizierten Temperatur durchgeführt werden.
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Bisher
gab es keine spezifischen Tests, die Informationen über die
Wahrscheinlichkeit eines Individuums, ein arterielles Blutgerinnsel
zu bilden, und das daraus folgende Risiko eines Herzanfalls oder
eines Schlaganfalls liefern. Das erhöhte Risiko eines Herzanfalls
und eines Schlaganfalls wurde bisher indirekt durch Messung des
Gehalts an Cholesterin und Blutglucose, zusammen mit einer klinischen
Untersuchung, beurteilt. Außer
mit einer Herzerkrankung und einem Schlaganfall sind Abnormalitäten der
Plättchenfunktion
mit vielen anderen Funktionsstörungen
(siehe Tabelle 1) verbunden. Bei all diesen Zuständen wird von einer genauen Bestimmung
der Plättchenfunktion
die Diagnose und die richtige Behandlung des Patienten sehr unterstützt. Eine
kontinuierliche Überwachung
der Plättchenfunktion
unterstützt
auch bei der Bewertung der Reaktion eines Patienten auf die Behandlung.
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Tabelle
1: Bedeutung der Plättchenaktivität für verschiedene
Erkrankungen
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Klinische
Zustände,
auf welche sich das erfindungsgemäße Verfahren richtet, sind
beispielsweise die vollständige
Beurteilung des kardiovaskulären
Risikos bei sonst gesunden Individuen, die Beurteilung von Patienten,
die an einer Thrombose gelitten hatten, die Überwachung der Wirksamkeit
einer verordneten Anti-Plättchen-Therapie,
die Bewertung des Blutungs- oder Blutgerinnselrisikos bei Patienten,
die für
einen großen
chirurgischen Eingriff vorgesehen sind, die Bewertung des Blutgerinnselrisikoprofils
bei Patienten mit einem hohen Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung,
einschließlich
derjenigen mit Diabetes mellitus, Bluthochdruck, hohen Blutcholesterinwerten,
einer schweren familiären
Vorbelastung durch Blutgerinnsel, Raucher und solche mit identifizierbaren
Thrombosemarkern, die Beurteilung des Blutgerinnselrisikos bei Patienten
mit einer peripheren Gefäßerkrankung
und die Untersuchung des Profils von Patienten mit Blutungsstörungen.
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Wie
weiter oben beschrieben wird in einem wieder anderen erfindungsgemäßen Merkmal
ein Diagnoseverfahren zur Bestimmung des Vorliegens oder des Risikos
zur Entwicklung eines Zustands oder einer Funktionsstörung, die
mit zellulären
Abnormalitäten
verknüpft
ist, bei einem Individuum bereitgestellt, umfassend:
- I. die Entnahme einer biologischen Probe von dem Individuum,
- II. das Bestimmen der Bindungskapazität von Zellen in der biologischen
Probe an ein adhäsives
Substrat durch Führen
dieser biologischen Probe in laminarer Strömung über ein adhäsives Substrat, das auf einem festen
Träger
immobilisiert ist, unter definierten Strömungsbedingungen und einer
Zeitdauer, die ausreicht, die es den Zellen der biologischen Probe
ermöglicht,
an das adhäsive
Substrat zu binden, und anschließendes Bestimmen der Anzahl
der Zellen, die an das adhäsive
Substrat gebunden sind; und
- III. Vergleichen der ermittelten Bindungskapazität dieser
Zellen in der biologischen Probe mit einer zuvor bestimmten Standardbindungskapazität für solche
Zellen, wobei eine Abweichung der ermittelten Bindungskapazität von der
zuvor ermittelten Standardbindungskapazität auf das Vorliegen oder das
Risiko zur Entwicklung eines Zustands oder einer Funktionsstörung, die
mit zellulären
Abnormalitäten
verknüpft
ist, bei dem Individuum hinweist.
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Bei
den Arbeiten, die zur Erfindung geführt haben, ist festgestellt
worden, dass bei einer Kontrollpopulation aus gesunden Individuen
die mittlere Plättchenzahl,
die durch das Verfahren und die Vorrichtung, die hierin beschrieben
werden, bei einer Scherrate von 600 s–1 unter
Verwendung von vWf oder Collagen als adhäsives Substrat der stationären Phase
bestimmt wurde, in den Bereich von 170 bis 430 LDH (U/l) fällt. Von Individuen
mit einer Plättchenzahl
von unter 170 LDH (U/l) wird angenommen, dass sie das Risiko von
mit einem übermäßigen Bluten
verbundenen Komplikationen haben, und von Individuen mit einem Plättchengehalt von über 450
LDH (U/l) wird angenommen, dass sie ein erhöhtes Risiko haben, mit einer
nicht ordnungsgemäßen Blutgerinnselbildung
verbundene Komplikationen zu entwickeln.
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In
einem noch anderen erfindungsgemäßen Merkmal
wird ein System zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Risikos
zur Entwicklung eines Zustandes oder einer Funktionsstörung, die
mit zellulären Abnormalitäten verknüpft ist,
bei einem Individuum bereitgestellt, umfassend:
- I.
einen festen Träger,
auf welchem ein adhäsives
Substrat immobilisiert ist,
- II. Mittel zum Leiten einer biologischen Probe von dem Individuum
in laminarer Strömung über das
adhäsive Substrat
unter definierten Strömungsbedingungen
und einen Zeitraum lang, der ausreicht, um die Zellen der biologischen
Probe in die Lage zu versetzen, an das adhäsive Substrat zu binden, und
- III. Detektionsmittel, um die Anzahl der an das adhäsive Substrat
gebundenen Zellen zu bestimmen.
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Vorzugsweise
ist der feste Träger
ein Mikrokapillar- oder ein anderes Röhrchen und wird das adhäsive Substrat
auf seiner Innenfläche
immobilisiert. Weiterhin wird ebenfalls vorzugsweise die biologische
Probe durch das Mikrokapillarröhrchen
hindurchgesaugt oder mittels einer Pumpe wie einer Spritzenpumpe
strömen gelassen.
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Erfindungsgemäß wird weiterhin
ein Verfahren zur Bestimmung der modifizierenden Wirkung einer Substanz
auf die Bindungskapazität
von Zellen in einer biologischen Probe von einem Individuum bereitgestellt,
umfassend zunächst
das Führen
der biologischen Probe in Gegenwart dieser Substanz über ein
adhäsives
Substrat, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, unter
definierten Strömungsbedingungen
und einer Zeitdauer, die es den Zellen der biologischen Probe ermöglicht,
an das adhäsive
Substrat zu binden, und anschließendes Bestimmen der Zellen,
die an das adhäsive
Substrat gebunden haben, und Vergleichen des in Verfahrensschritt
(I) erhaltenen Resultates mit dem Resultat, das erhalten wird, wenn
der Verfahrensschritt (I) in Abwesenheit dieser Substanz durchgeführt wird.
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Dabei
wird hierin die Bezeichnung "Substanz" im weitesten Sinne
benutzt, um sowohl eine einzelne Verbindung als auch ein Verbindungsgemisch
zu umfassen. Die Bezeichnung umfasst auch sowohl synthetische als
auch natürliche
Substanzen, einschließlich
biologischer Materialien wie Antikörper, Hormone, andere Proteine
oder Polypeptide.
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Dabei
kann die Substanz beispielsweise ein bekanntes Anti-Plättchen-Mittel
sein. Alternativ kann die Substanz eine solche sein, die wegen ihrer
modifizierenden Wirkungen auf Plättchen
bzw. deren Vorgänger oder
andere Zellen ausgewählt
worden ist.
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Die
Bezeichnung "Modifizierung" wird hier benutzt,
um eine beliebige Wirkung zu benennen, welche die Substanz auf die Bindungskapazität von Zellen
wie Plättchen
oder deren Vorgängern
am adhäsiven
Substrat hat. Dementsprechend umfasst die Bezeichnung sowohl die
Erhöhung
als auch die Hemmung der Bindungskapazität.
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In
den bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen
wird ein Durchflussversuch bereitgestellt, der die quantitative
Bewertung der Plättchenadhäsion über einen
weiten Bereich von Scherspannungen erlaubt. Mit diesem System werden
Adhäsionsversuche
in Mikrokapillarröhrchen
durchgeführt,
die mit adhäsiven
Proteinen beschichtet sind, die in der normalen beschädigten Blutgefäßwand vorhanden
sind. Die Mikrokapillarröhrchen
sind mit verschiedenen adhäsiven
Substraten wie von-Willebrand-Faktor (vWf), Fibrinogen oder Collagen
beschichtet. Weitere relevante Substrate umfassen Vitronectin, Laminin,
Fibronectin oder eine beliebige andere adhäsive Oberfläche, die das Vermögen hat,
die Plättchenadhäsion zu
unterstützen.
Plättchen
in (nativem oder gerinnungshemmend gemachtem) Vollblut und Plasma
oder gewaschene Plättchen
(in einem isotonischen Puffer resuspendiert), werden durch die Mikrokapillarröhrchen mit
einem definierten Durchfluss gesaugt, der Wandscherraten über den
Bereich (20 bis 20 000 s–1) erreicht, von denen
angenommen wird, dass sie in vivo im Gefäßsystem existieren. Der Durchfluss
(und somit die Scherspannung) wird unter Verwendung einer Spritzenpumpe
genau kontrolliert. Die Perfusionszeiten können von einigen Sekunden bis
zu 60 Minuten variiert werden. Nach der Perfusion von Plättchen durch
die Mikrokapillarröhrchen
hindurch werden ungebundene Zellen durch Waschen mit derselben Scherspannung
entfernt, rote Zellen (unter Verwendung von 1 % Ammoniumoxalat oder
einer anderen Lösung,
die vorzugsweise rote Blutzellen lysiert) lysiert und die übrig gebliebenen
anhaftenden Plättchen
mit einem Tensid lysiert. Die Plättchenlysate
werden auf einen Plättchenmarker
(d.h. Laktatdehydrogenase, Plättchenfaktor
4, P-Selectin, Thromboxan B2, β-Thromboglobulin
oder einen anderen Marker, der genau die Anzahl von am Mikrokapillarröhrchen anhaftenden
Plättchen
vorhersagt) untersucht. In Situationen, in welchen der Marker für die Plättchen spezifisch
ist (d.h.
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Plättchenfaktor
4 und β-Thromboglobulin)
kann die Lyse der roten Zellen weggelassen werden. Die Anzahl der
Plättchen,
die an der adhäsiven
Substratbeschichtung der Mikrokapillarröhrchen anhaften, kann dann
durch Vergleichen des Gehaltes an diesem Marker gegen einen vorher
festgelegten Standard, der unter Verwendung bekannter Plättchengehalte
vorher erhalten worden ist, bestimmt werden.
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Unter
Einbeziehung normaler gesunder Blutspender ist gezeigt worden, dass
dieser Versuch ein zuverlässiges
und reproduzierbares Verfahren zur Quantifizierung der Plättchenadhäsion ist.
Der Schwankungskoeffizient (CV) bei einer vWf-Matrix unter Einbeziehung
eines einzelnen Blutspenders beträgt 13 %, während der CV zwischen Blutspendern
19 % beträgt,
alle innerhalb des akzeptablen Bereichs für solche klinischen Tests,
wie sie vom International Committee for Standardisation in Haematology
definiert worden sind. Die Versuche können mit einem (unter Verwendung
von Citrat, Heparin oder PPACK) gerinnungshemmend gemachten Vollblut
oder mit gewaschenen Plättchen
bis zu vier Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt werden. Zeitverlaufstudien
haben gezeigt, dass eine lineare Zunahme der Anzahl von Plättchen,
die sich in den beschichteten Mikrokapillarröhrchen ansammeln, über die
ersten fünf
Minuten der Perfusionszeit besteht. Die Matrixkonzentration ist
auch eine wichtige Determinante der Plättchenadhäsion mit einer maximalen Adhäsion bei
einer vWf-Beschichtungskonzentration
von 100 μg/ml.
Die Wirkung der Scherrate auf die Plättchenadhäsion an einer vWf-Matrix ist
gezeigt worden, und eine Erhöhung
der Scherrate von 750 auf 3 000 s–1 führt zu einer
entsprechenden Erhöhung
der Anzahl der an der vWf-Matrix anhaftenden Plättchen.
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Eine
wichtige Beobachtung bei dem erfindungsgemäßen Versuch besteht darin,
dass es eine signifikante Differenz zwischen den Blutplättchen von
Männern
und Frauen hinsichtlich der Adhäsion
an einer vWf-Matrix gibt, und Studien zeigen, dass 50 bis 80 mehr
Plättchen
von Männern
als von Frauen unter den gleichen Versuchsbedingungen an der Matrix
anhaften. Trotz intensiver Untersuchungen ist eine geschlechtsspezifische
Differenz der Plättchenreaktivität unter
Verwendung einer Vielfalt von Plättchenfunktionsversuchen nicht
gefunden worden. Der geschlechtsspezifische Unterschied in der Haftfähigkeit
der Plättchen
gewinnt Bedeutung im Lichte der Tatsache, dass Männer im Alter von 25 bis 55
6 bis 7 Mal häufiger
an Herzanfällen
leiden als Frauen. Diese Studien zeigen auch, dass Frauen mit einer
kardiovaskulären
Erkrankung eine deutlich stärkere
Plättchenadhäsion als
gesunde weibliche Kontrollen zeigen. Es ist gesichert, dass Plättchen von
Patienten mit einer kardiovaskulären
Erkrankung eine erhöhte
Reaktivität
auf äußere Stimuli
haben und in vitro spontan aggregieren.
-
Es
wurden auch Adhäsionsstudien
an einigen anderen adhäsiven
Matrizen durchgeführt,
einschließlich
Rinder-vWf, Fibrinogen und faserigem Collagen Typ I. Wie bei humanem
vWf ist die Plättchenadhäsion an diesen
Oberflächen
mit CVs zwischen 10 und 15 % für
einen einzelnen Spender reproduzierbar. Wie bei humanem vWf spielt
die Matrixkonzentration eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der
Anzahl von an der Oberfläche
einer jeden Matrix anhaftenden Plättchen. Der Einfluss einer
sich erhöhenden
Scherrate auf die Plättchenadhäsion an
Fibrinogen und Collagen wurde untersucht. Im Gegensatz zu vWf ist
Fibrinogen nur in der Lage, eine stabile Plättchenadhäsion bei Scherkräften von
unter 150 s–1 zu
unterstützen.
Im Gegensatz dazu ist Collagen in der Lage, eine stabile Plättchenadhäsion bei
so hohen Scherraten wie 3 000 s–1 zu
unterstützen. Die
Plättchenadhäsion an
Collagen bei Scherraten >750
s–1 ist
entscheidend von der vWf-GPIb-Wechselwirkung abhängig. Der Versuch stellt auch
eine nützliche
Möglichkeit
der Untersuchung der Wirksamkeit von Anti-Plättchen-Arzneimitteln bereit.
So führt
beispielsweise eine Vorbehandlung von Plättchen mit dem Anti-GPIIb/IIIa-Arzneimittel
ReoPro (5 μg/ml)
zu einer 90%igen Verringerung der Plättchenadhäsion an vWf.
-
Das
erfindungsgemäße Diagnosesystem
hat eine Reihe signifikanter Unterschiede zu dem gegenwärtig zur
Verfügung
stehenden System DADE PFA-100, wie weiter oben diskutiert. Diese
umfassen:
- 1. Im erfindungsgemäßen System
ist die Strömung
laminar, wohldefiniert und über
jeden einzelnen Versuch hindurch feststehend. Im System PF-100 ist
die Strömung
(und daher die Scherspannung) in Abhängigkeit vom Verschlussgrad
der Öffnung
variabel.
- 2. Im erfindungsgemäßen System
können
Versuche über
einen weiten Bereich von Scherraten (hoch und niedrig, physiologisch
und pathologisch) durchgeführt
werden. Im System PFA-100 werden alle Versuche bei hohen Scherraten
(5 000 bis 6 000 s–1) durchgeführt.
- 3. Im erfindungsgemäßen System
kann die Plättchenadhäsion innerhalb
eines Bereichs physiologisch relevanter Oberflächen untersucht werden. Weiterhin
müssen
lösliche
Agonisten wie ADP oder Adrenalin der Haftfläche nicht zugesetzt werden,
um die Plättchenaktivierung
zu verstärken.
Das System PFA-100 ist ein auf einem Verstopfungsvorgang basierendes
System, das eine starke Plättchenaktivierung
erfordert und somit die Arten von für den Versuch zur Verfügung stehenden
Haftflächen
begrenzt. Die Bildung eines Verschlussthrombus erfordert faseriges
Collagen Typ I (das in vitro die am stärksten thrombogene Oberfläche bildet),
eine hohe Scherspannung (um die Plättchenthrombusbildung zu verstärken) und
lösliche Agonisten wie
ADP oder Adrenalin (um die Plättchenaktivierung
zu potenzieren).
- 4. Im erfindungsgemäßen System
kann die Anzahl der an der Matrix anhaftenden Plättchen direkt durch Messung
eines Plättchenmarkers
in gesamten Zelllysaten bestimmt werden. Das System PFA-100 misst die
Plättchenakkumulation
indirekt durch Überwachung
der Verschlusszeit.
-
Die
Erfindung wird hierin in Bezug auf humane Zellen exemplifiziert.
Dies geschieht jedoch unter der Voraussetzung, dass sich die Erfindung
auf die Zellen aller Tiere, einschließlich Nutztiere (beispielsweise Schafe,
Kühe, Pferde
und Esel), Versuchstiere (beispielsweise Ratten, Meerschweinchen,
Kaninchen und Hamster), Haustiere (beispielsweise Hunde und Katzen),
in Gefangenschaft gehaltene Wildtiere (beispielsweise Kängurus,
Hirsche und Füchse)
und Geflügel
(beispielsweise Hühner,
Enten, Zwerghühner
und Fasane), erstreckt.
-
Weitere
erfindungsgemäße Merkmale
werden ausführlicher
in der folgenden speziellen Beschreibung und den folgenden Beispielen
erläutert.
Dabei ist es jedoch selbstverständlich,
dass diese spezielle Beschreibung und diese Beispiele ausschließlich zum
Zweck der Erläuterung
der Erfindung dienen. Sie sind keinesfalls als Beschränkung der
weiter oben gegebenen allgemeinen Beschreibung der Erfindung zu
verstehen.
-
Von
den Figuren zeigt
-
1 ein
Diagramm der Variabilität
der Plättchenadhäsion an
einer vWf-Matrix; der Variationskoeffizient ist für jede Gruppe
angegeben
-
2 ein
Balkendiagramm des Einflusses verschiedener Antikoagulantien auf
die Plättchenadhäsion an
einer vWf-Matrix,
-
3 ein
Balkendiagramm des zeitlichen Verlaufs der Plättchenadhäsion bei Strömung,
-
4 ein
Balkendiagramm des Einflusses einer erhöhten Scherung auf die Plättchenadhäsion an vWf,
-
5 ein
Diagramm, in welchem die Unterschiede der Plättchenadhäsion zwischen männlichen
und weiblichen Blutspendern herausgearbeitet worden sind,
-
6 ein
Balkendiagramm des Einflusses auf die Plättchenadhäsion unter Verwendung von Blut,
das von weiblichen Spendern mit einer Gefäßerkrankung in der Krankengeschichte
entnommen worden war,
-
7 ein
Balkendiagramm des Einflusses einer erhöhten Scherung auf die Plättchenadhäsion an
einer Fibrinogenmatrix,
-
8 ein
Balkendiagramm des Einflusses einer erhöhten Scherung auf die Plättchenadhäsion an
einer Collagenmatrix,
-
9 ein
Balkendiagramm der Abhängigkeit
der Plättchenadhäsion an
einer Collagenmatrix bei hoher Scherung von GPIb,
-
10 ein
Balkendiagramm des Einflusses von Anti-Plättchen-Arzneimitteln
auf die Plättchenadhäsion an
einer vWf-Matrix,
-
11 die
normale Schwankungsbreite der Plättchenadhäsion an
einer vWf-Matrix im Plättchenadhäsionsversuch,
-
12 die
normale Schwankungsbreite der Plättchenadhäsion an
einer Collagenmatrix im Plättchenadhäsionsversuch,
-
13 die
normale Schwankungsbreite der Plättchenadhäsion an
einer Collagenmatrix bei hoher Scherung im Plättchenadhäsionsversuch,
-
14 einen
Vergleich im erfindungsgemäßen Plättchenadhäsionsversuch
der Plättchenadhäsion an mit
Collagen beschichteten Mikrokapillaren nach bis zu acht Wochen langer
feuchter oder trockener Lagerung der Mikrokapillaren,
-
15 Grade
der Plättchenadhäsion an
eine vWf-Matrix unter Verwendung von Blut, das Spendern ohne Komplikationen,
Blutungen oder Blutgerinnsel in der Krankengeschichte entnommen
worden war,
-
16 Grade
der Plättchenadhäsion an
einer Collagenmatrix unter Verwendung von Blut, das Spendern ohne
Komplikationen, Blutungen oder Blutgerinnsel in der Krankengeschichte
entnommen worden war,
-
17 den
Einfluss von Aggrastat mit drei verschiedenen Konzentrationen und
von ReoPro mit einer Konzentration auf die Plättchenadhäsion an mit vWf beschichteten
Mikrokapillarröhrchen
bei einer Scherrate von 600 s–1,
-
18 ein
Schema einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
die zur Bestimmung von Adhäsion
oder Bindungskapazität
von Blutplättchen
in einer Blutprobe oder Zellsuspension verwendet werden kann, und
-
19 ein
Schema einer erfindungsgemäßen halbautomatischen
Vorrichtung.
-
In 18 umfasst
die schematisch gezeigte Vorrichtung eine Anzahl von Mikrokapillarröhrchen 11,
die innen mit einem haftfähigen
Substrat wie vWf oder Collagen beschichtet sind, und welche mit
Spritzenpumpen 12 in fluider Verbindung stehen, um es zu
ermöglichen,
dass Flüssigkeiten
durch die Röhrchen 11 unter
definierten Strömungsbedingungen
und -zeiten hindurchgesaugt werden. Die Röhrchen 11 sind auch
an den Probebehälter 13 und
den Waschpufferbehälter 14 angeschlossen.
-
Bei
Verwendung der in 18 gezeigten Vorrichtung wird
eine Blutprobe oder Zellsuspension von einem Patienten in den Probenbehälter 13 gefüllt und
dann von den Spritzenpumpen 12 mit einem festgelegten Durchfluss
durch die Kapillarröhrchen 11 gesaugt.
Danach werden die Röhrchen 11 mit
Waschpuffer aus dem Behälter 14 gewaschen
und anschließend
entfernt. Danach können
an den Röhrchen
anhaftende rote Blutzellen wie weiter oben beschrieben lysiert und
das Lysat verworfen werden. An den Röhrchen anhaftende Plättchen können dann
lysiert werden, und das Lysat kann gesammelt und, wie weiter oben
beschrieben, auf den LDH-Gehalt untersucht werden.
-
In 19 ist
schematisch ein Beispiel einer halbautomatischen erfindungsgemäßen Vorrichtung
gezeigt, welche die Analyse einer Anzahl einzelner Blutproben ermöglicht.
In dieser Vorrichtung ist jedes innen beschichtete Mikrokapillarröhrchen 21 an
ein Auswahlventil 22 angeschlossen, das ausgewählt werden
kann, um die Perfusion von einer Blutprobe 23, Waschpuffer
oder Lyse-Reagenzien 2 oder II durch das Mikrokapillarröhrchen 21 hindurch
zu ermöglichen.
Der Durchfluss einer Blutprobe durch jedes Röhrchen 21 wird von einer
Spritzenpumpe 24 gesteuert, die ihrerseits von der Steuerung 25 kontrolliert
wird. Es können
spezielle Rechenprogramme angewendet werden, um die Perfusion der
Blutproben bei einem streng definierten, vorher festgelegten Durchfluss
sicherzustellen, und damit die verschiedenen Wasch- und anschließenden Lyse-Vorgänge von
Zellen wie roten Blutzellen und/oder Blutplättchen, die an dem jeweiligen
Mikrokapillarröhrchen 21 anhaften,
automatisch unter ihrer Kontrolle ablaufen. Die in dem jeweiligen
Mikrokapillarröhrchen 21 erhaltene Lyse-Probe
wird, wie weiter oben erwähnt,
durch Spektralphotometrie analysiert.
-
Beispiel 1: Veränderung
der Plättchenadhäsion an
einer vWf-Matrix
bei Strömung
-
Die
Veränderung
der Plättchenadhäsion wurde
unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht.
Für diese
Untersuchungen wurden Mikrokapillarröhrchen mit vWf (100 μg/ml) 2 Stunden
lang bei Raumtemperatur beschichtet und anschließend mit 25 % Vol./Vol. hitzeinaktiviertem
humanem Serum 60 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert. Die
Analyse der Veränderung
innerhalb eines Spenders wurde durchgeführt, indem gewaschene Plättchen von
einem einzigen Spender am selben Tag durch 10 einzelne vWf-beschichtete
Mikrokapillarröhrchen
gesaugt wurden. In getrennten Versuchen wurden von 10 verschiedenen
Spendern erhaltene Plättchen
an unterschiedlichen Tagen durch vWf-beschichtete Mikrokapillarröhrchen gesaugt.
-
Gewaschene
Plättchen,
die von einem Spender (innerhalb eines Spenders) oder von verschiedenen Spendern
(zwischen Spendern) erhalten worden waren, wurden 5 Minuten lang
bei 150 s–1 durch
vWf-beschichtete Mikrokapillarröhrchen
gesaugt. Nicht anhaftende Plättchen
wurden durch 10 Minuten langes Waschen bei 150 s–1 entfernt,
und die Anzahl der an der Matrix anhaftenden Plättchen wurde quantifiziert
und als die Zahl anhaftender Plättchen/min/mm2/108 gesaugte Plättchen angegeben.
Die Ergebnisse aus 10 einzelnen Versuchen wurden dargestellt.
-
Der
Variationskoeffizient (CV) eines einzelnen Spenders betrug 13,0
%, während
der CV zwischen Spendern 19,4 % betrug. Beide CVs liegen innerhalb
für klinische
Tests akzeptabler Bereiche.
-
Beispiel 2: Einfluss eines
Antikoagulans auf die Plättchenadhäsion bei
Strömung
-
Von
einer Anzahl verschiedener Antikoagulantien, die in der klinischen
Praxis für
das Sammeln von Blut verwendet werden, wurde der Einfluss von drei
unterschiedlichen Antikoagulantien (Citrat, Heparin und PPACK) auf
die Plättchenadhäsion unter
Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
untersucht. Vollblut, das in Gegenwart von Citrat (0,38 % Gew./Vol.
Trinatriumcitrat), Heparin (10 U/ml) mit niedrigem Molekulargewicht
oder PPACK (40 μM)
gesammelt worden war, wurde 5 Minuten lang bei 150 s–1 durch
mit vWf-beschichtete Mikrokapillarröhrchen gesaugt. Nicht anhaftende
Zellen wurden durch 10 Minuten langes Waschen bei 150 s–1 aus
dem Röhrchen
entfernt und die anhaftenden Erythrocyten durch Behandlung mit 1
% Gew./Vol. Ammoniumoxalat lysiert. Anhaftende Plättchen und
Thromben wurden mit 1 % Vol./Vol. Triton X-100 lysiert und für die anschließende LDH-Analyse
gesammelt. LDH-Gehalte(U/ml) in den Ganze-Zellen-Lysaten wurden durch
Spektralphotometrie quantifiziert. Die in 2 veranschaulichten
Ergebnisse zeigen, dass die Plättchenakkumulation
an der vWf-Oberfläche
von der Art des verwendeten Antikoagulans nicht beeinflusst wurde.
-
Beispiel 3: Zeitlicher
Verlauf der Plättchenadhäsion bei
Strömung
-
Der
zeitliche Verlauf der Plättchenadhäsion an
vWf bei Strömung
wurde untersucht. Mit Citrat versetztes Vollblut wurde 1, 2, 5 oder
10 Minuten lang bei 150 s–1 durch mit vWf-beschichtete
Mikrokapillarröhrchen gesaugt.
Nicht anhaftende Zellen wurden aus dem Röhrchen durch 10 Minuten langes
Waschen bei 150 s–1 entfernt und die Zellen
wie in Beispiel 2 beschrieben lysiert. Das Maß der Plättchenadhäsion wurde indirekt durch Messung
der Plättchen-LDH,
wie in Beispiel 2 beschrieben, quantifiziert.
-
3 zeigt,
dass mit steigender Perfusionszeit eine entsprechende Zunahme der
Plättchenakkumulation
an der vWf-Oberfläche einhergeht.
-
Beispiel 4: Einfluss einer
sich erhöhenden
Scherung auf die Plättchenadhäsion an
vWf bei Strömung
-
Es
ist bekannt, dass die Plättchenadhäsion in
vivo über
einen weiten Bereich von Scherspannungen stattfindet, und dass eine
Anzahl von Subendothelproteinen und Plättchenoberflächenrezeptoren
erforderlich ist, um diesen Vorgang zu vermitteln. Unter den Bedingungen
einer starken Scherung wie sie in Arteriolen oder verengten Gefäßen herrschen,
ist die Plättchenadhäsion an
subendothelial gebundenem vWf wesentlich. Jedoch können bei
schwächeren
Scherbedingungen andere adhäsive
Proteine wie Collagen oder Fibronectin eine von vWf unabhängige Plättchenadhäsion vermitteln.
-
Um
die Rolle von vWf bei der Vermittlung der Plättchenadhäsion unter verschiedenen Scherbedingungen
zu untersuchen, wurden gleiche Volumina (8 ml) von mit Citrat versetztem
Vollblut durch mit vWf-beschichtete Mikrokapillarröhrchen mit
einem Durchfluss von 150, 750 bzw. 3 000 s–1 gesaugt.
Nicht anhaftende Zellen wurden durch 10 Minuten langes Waschen bei
150 s–1 aus
dem Röhrchen
entfernt und anhaftende Erythrocyten durch eine Behandlung mit 1
% Gew./Vol. Ammoniumoxalat lysiert. Anhaftende Plättchen wurden
mit 1 % Vol./Vol. Triton X-100 lysiert und für die anschließende LDH-Analyse
gesammelt. Der Grad der Plättchenadhäsion wurde
indirekt durch Messung der Plättchen-LDH,
wie in Beispiel 2 beschrieben, quantifiziert. Die in 4 veranschaulichten
Ergebnisse zeigen, dass mit sich verstärkender Scherspannung eine
entsprechende Zunahme der Anzahl der anhaftenden Plättchen einhergeht.
-
Beispiel 5: Geschlechtsspezifische
Unterschiede der Plättchenadhäsion bei
Strömung
-
Frühere Studien
haben gezeigt, dass Männer
im Alter von 25 bis 55 Jahren mit einer 6 bis 7 Mal höheren Wahrscheinlichkeit
von einem Herzanfall heimgesucht werden als Frauen. Der folgende
Test wurde durchgeführt,
um zu untersuchen, ob ein geschlechtsspezifischer Unterschied der
Plättchenadhäsion bei
Strömung
existiert. Mit Citrat versetztes Vollblut, das von gesunden männlichen
und weiblichen Spendern im Alter von 25 bis 55 Jahren, die zuvor
nicht an einer kardiovaskulären
Erkrankung gelitten hatten, gesammelt worden war, wurde 10 Minuten
lang bei 150 s–1 durch mit vWf-beschichtete
Mikrokapillarröhrchen
gesaugt. Darauf folgte eine 10-minütige Waschung bei 150 s–1,
um die nicht anhaftenden Zellen zu entfernen, wonach anhaftende Erythrocyten
mit 1 % Gew./Vol. Ammoniumoxalat lysiert wurden. Anschließend wurden
anhaftende Plättchen und
Thromben von der Oberfläche
mit 1 % Vol./Vol. Triton X-100 lysiert und für die LDH-Analyse durch Messung
der Plättchen-LDH,
wie in Beispiel 2 beschrieben, gesammelt. Die in 5 veranschaulichten
Ergebnisse zeigen, dass 50 bis 80 % mehr Plättchen von männlichen
Spendern, verglichen mit Spenderinnen, sich an der vWf-Oberfläche ansammeln.
-
Im
Gegensatz dazu ergab Blut, das von Spenderinnen mit einer Herz-
und/oder kardiovaskulären
Erkrankung in ihrer Krankengeschichte gesammelt worden war, eine
etwa 2fache Erhöhung
der Plättchenadhäsion an
der vWf-Oberfläche.
-
Mit
Citrat versetztes Vollblut, das entweder von normalen Spenderinnen
oder von solchen, die eine Krankengeschichte mit einer kardiovaskulären Erkrankung
(akute Herzkranzgefäßsyndrome
oder cerebrovaskuläre
Anfälle)
gehabt hatten, wurde 10 Minuten lang bei 150 s–1 durch
mit vWf-beschichtete Mikrokapillarröhrchen gesaugt. Nicht anhaftende
Zellen wurden durch 10 Minuten langes Waschen bei 150 s–1 entfernt,
und der Grad der Plättchenadhäsion wurde
durch Messung der Plättchen- LDH, wie in Beispiel
2 beschrieben, indirekt quantifiziert. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
-
Beispiel 6: Einfluss einer
sich erhöhenden
Scherung auf die Plättchenadhäsion an
Fibrinogen- und Collagensubstrate bei Strömung
-
Zur
Untersuchung des Einflusses der Wandscherrate auf die Plättchenadhäsion an
einem Fibrinogen- oder Collagensubstrat wurden gleiche Volumina
von mit Citrat versetztem Vollblut durch mit Collagen oder Fibrinogen
beschichtete Mikrokapillarröhrchen
bei verschiedenen Scherraten gesaugt.
-
Gewaschene
Plättchen
wurden durch mit Fibrinogen beschichtete Mikrokapillarröhrchen bei
Scherraten von 30, 75, 150 und 750 s–1 5
Minuten lang gesaugt. Nicht anhaftende Plättchen wurden durch 10 Minuten langes
Waschen bei derselben Scherrate entfernt, und die Anzahl der an
der Matrix anhaftenden Plättchen wurde
quantifiziert und als Anzahl anhaftende Plättchen/min/mm2/108 gesaugte Plättchen angegeben.
-
Gleiche
Volumina (8 ml) von mit Citrat versetztem Vollblut wurden 5 Minuten
lang bei einer Scherrate von 150, 750 und 3 000 s–1 durch
mit Collagen beschichtete Mikrokapillarröhrchen gesaugt. Nicht anhaftende Zellen
wurden durch 10 Minuten langes Waschen bei 150 s–1 entfernt,
und der Grad der Plättchenadhäsion wurde
durch Messung der Plättchen-LDH,
wie in Beispiel 2 beschrieben, indirekt quantifiziert.
-
7 zeigt,
dass die Plättchenadhäsion an
einem Fibrinogensubstrat bei niedriger Scherrate (<150 s–1)
maximal ist, mit der entsprechenden Abnahme der Plättchenadhäsion mit
einer höheren
Scherung, sodass bei 750 s–1 keine Plättchen an
dem adhäsiven
Substrat anhafteten. Wie in 8 gezeigt,
wurde ein ähnlicher Trend
bei der Plättchenadhäsion an
einem Collagensubstrat beobachtet, wobei jedoch dieses Substrat
in der Lage war, die Plättchenadhäsion bei
hohen Scherraten (>3
000 s–1)
zu unterstützen.
-
Beispiel 7: GPIb-abhängige Plättchenadhäsion an
Collagen bei hohen Scherraten
-
Es
war zuvor gezeigt worden, dass die Plättchenadhäsion an entweder vWf oder Collagen
bei hohen Scherraten von der GPIb-vWf-Wechselwirkung abhängig ist.
Die Plättchenadhäsion an
Collagen unter hohen Scherraten erfordert eine Abscheidung des Plasma-abgeleiteten
vWf auf der immobilisierten Collagenmatrix. Nach der Immobilisierung
unterstützt
der vWf die Plättchenadhäsion durch
seine Wechselwirkung mit GPIb. Zur Untersuchung der Rolle von GPIb
bei der Unterstützung
der Plättchenadhäsion an
Collagen unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde mit Citrat
versetztes Vollblut 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem Anti-GPIb-Antikörper, AK2,
behandelt. Gleiche Volumina (8 ml) von Blut, das unbehandelt oder mit
Anti-GPIb behandelt worden war, wurden durch mit Collagen beschichtete
Mikrokapillarröhrchen
bei 150, 750 und 3 000 s–1 gesaugt. Nicht anhaftende
Zellen wurden durch 10 Minuten langes Waschen der Röhrchen bei
150 s–1 entfernt
und die Plättchen-LDH-Gehalte,
wie in Beispiel 2 beschrieben, quantifiziert, um den Grad der Plättchenadhäsion zu
bestimmen. Wie in 9 veranschaulicht, verschwand
die Plättchenadhäsion an Collagen
bei Scherraten von über
750 s–1,
wenn die Ligandenbindung an GPIb verhindert wurde.
-
Beispiel 8: Einfluss von
Anti-Plättchen-Arzneimitteln
auf die Plättchenadhäsion bei
Strömung
-
Der
Einfluss des Anti-Plättchen-Arzneimittels
ReoPro (7E3) auf die Plättchenadhäsion an
vWf unter Strömung
wurde untersucht. Mit Citrat versetztes Vollblut, das mit ReoPro
(5 μg/ml)
10 Minuten lang bei Raumtemperatur vorbehandelt worden war, wurde
10 Minuten lang bei 150 s–1 durch mit vWf-beschichtete Mikrokapillarröhrchen gesaugt.
Nicht anhaftende Zellen wurden durch 10 Minuten langes Waschen bei
150 s–1 entfernt und
anhaftende Erythrocyten durch Behandlung mit 1 % Ammoniumoxalat
lysiert. Danach wurden anhaftende Plättchen durch Zugabe von 1 %
Triton X-100 lysiert und LDH-Gehalte(U/ml) durch Spektralphotometrie
analysiert. Wie in 10 gezeigt, hatte eine Behandlung
des Blutes mit ReoPro einen dramatischen Einfluss auf die Plättchenadhäsion an
der vWf-Matrix, die um etwa 90 % verringert wurde.
-
Beispiel 9
-
Die
Reproduzierbarkeit der Plättchenadhäsion im
erfindungsgemäßen Plättchenadhäsionsversuch
ist in den 11, 12 und 13 für verschiedene
Oberflächenbeschichtungen
und Scherbedingungen gezeigt.
-
Mit
Citrat gerinnungshemmend gemachtes Vollblut wurde 2 Minuten lang
bei 600 s–1 durch
mit vWf beschichtete Mikrokapillarröhrchen gesaugt. Nicht anhaftende
Zellen wurden durch Waschen mit Tyrode-Puffer entfernt und anhaftende
Erythrocyten durch eine Behandlung mit 1 % Ammoniumoxalat lysiert.
Anschließend wurden
anhaftende Plättchen
mit 1 Triton X-100 lysiert und die LDH-Gehalte(U/l) in den Ganze-Zellen-Lysaten durch
Spektralphotometrie quantifiziert. Die Ergebnisse von 12 normalen
Spendern sind in 8 veranschaulicht. Bei jedem
Spender wurde das Blut am selben Tag durch vier einzelne mit vWf
beschichtete Mikrokapillarröhrchen
gesaugt. Die mittlere +2SD ist für
jeden Spender angegeben.
-
Vollblut,
das mit Citrat gerinnungshemmend gemacht worden war, wurde 2 Minuten
lang bei 600 s–1 durch mit Collagen
beschichtete Mikrokapillarröhrchen
gesaugt. Nicht anhaftende Zellen wurden durch waschen mit Tyrode-Puffer
entfernt, und der Grad der Plättchenadhäsion wurde,
wie weiter oben beschrieben, durch Messung der Plättchen-LDH
indirekt quantifiziert. Die Ergebnisse für 12 normale Spender
sind in 12 gezeigt. Bei jedem Spender
wurde das Blut am selben Tag durch vier einzelne mit Collagen beschichtete
Mikrokapillarröhrchen
gesaugt. Die mittlere +2SD für
jeden Spender ist angegeben.
-
Mit
Citrat gerinnungshemmend gemachtes Vollblut wurde 1 Minute lang
bei 3 000 s–1 durch
mit Collagen beschichtete Mikrokapillarröhrchen gesaugt. Nicht anhaftende
Zellen wurden durch Waschen entfernt, und der Grad der Plättchenadhäsion wurde,
wie weiter oben beschrieben, durch Messung der Plättchen-LDH indirekt
quantifiziert. Die Ergebnisse für 12 normale
Spender sind in 13 gezeigt. Bei jedem Spender
wurde das Blut am selben Tag durch vier einzelne mit Collagen beschichtete
Mikrokapillarröhrchen
gesaugt. Die mittlere +2SD ist für
jeden Spender angegeben.
-
Beispiel 10
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Es
wurden die Grade der Plättchenadhäsion unter
Verwendung von mit Collagen beschichteten Mikrokapillaren nach bis
zu 8 Wochen langer feuchter oder trockener Lagerung bestimmt.
-
Mikrokapillaren,
die mit Collagen unter Standardbedingungen (über Nacht bei 4°C) beschichtet
worden waren, wurden mit beschichteten Mikrokapillaren verglichen,
die 1 bis 8 Wochen lang feucht bei 4°C oder 1 bis 8 Wochen lang trocken
gelagert worden waren. Mit Citrat gerinnungshemmend gemachtes Vollblut
wurde 1 Minute lang bei 3 000 s–1 durch
mit dem Collagen beschichtete Mikrokapillarröhrchen gesaugt. Nicht anhaftende
Zellen wurden durch Waschen entfernt, und der Grad der Plättchenadhäsion wurde,
wie in Beispiel 9 beschrieben, durch Messung der Plättchen-LDH
indirekt quantifiziert. Die Ergebnisse von fünf Versuchen sind in 14 gezeigt.
In jedem Versuch wurde das Blut am selben Tag durch vier Mikrokapillarröhrchen von
jedem Typ von mit Collagen beschichteten Mikrokapillarröhrchen gesaugt.
Die mittlere +2SD für
jede Beschichtung in jedem Versuch ist angegeben.
-
Beispiel 11
-
Es
wurden die Grade der Plättchenadhäsion in
dem erfindungsgemäßen Plättchenadhäsionsversuch innerhalb
einer Gruppe von Patienten mit Rückenmarkbildungsstörungen bestimmt,
die auf der Basis von einer komplikationsfreien klinischen Vorgeschichte
(definiert als Blutgerinnsel oder Blutung, das/die klinisch nicht
dokumentiert war – wobei
diese Definition eine subklinische thrombotische Erkrankung nicht
ausschließt),
Blutungskomplikationen oder Blutgerinnselkomplikationen in Untergruppen
unterteilt worden war.
-
Mit
Citrat gerinnungshemmend gemachtes Vollblut wurde mit einer Scherrate
von 600 s–1 durch
Mikrokapillarröhrchen,
die, wie angegeben, mit Collagen oder vWf beschichtet worden waren,
gesaugt. Nicht anhaftende Zellen wurden durch Waschen entfernt und
der Grad der Plättchenadhäsion wurde,
wie in Beispiel 9 beschrieben, durch Messung der Plättchen-LDH
indirekt quantifiziert. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den 15 und 16 gezeigt.
In jedem Versuch wurde die Blutprobe des Patienten am selben Tag
durch vier einzelne Mikrokapillarröhrchen gesaugt. Die mittlere
+2SD für
jeden Patienten ist angegeben.
-
Beispiel 12
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Der
Einfluss einer Vorbehandlung von Vollblut mit den Anti-Plättchen-Mitteln
Aggrastat oder ReoPro auf die Plättchenadhäsion wurde
in dem erfindungsgemäßen Plättchenadhäsionsversuch
bestimmt.
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Vollblut
wurde mit 100, 200 oder 500 nM Aggrastat oder 20 μg/ml ReoPro
10 Minuten lang bei 37°C inkubiert,
bevor es 2 Minuten lang bei 600 s–1 durch
ein mit vWf beschichtetes Mikrokapillarröhrchen gesaugt wurde. Nicht
anhaftende Zellen wurden durch Waschen entfernt, und der Grad der
Plättchenadhäsion wurde, wie
in Beispiel 9 beschrieben, durch Messung der Plättchen-LDH indirekt quantifiziert.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 17 gezeigt.
-
Der
Fachmann wird erkennen, dass die hier beschriebene Erfindung Veränderungen
und Modifizierungen unterliegen kann, die nicht die spezifisch beschriebenen
sind. Daher ist es selbstverständlich,
dass die Erfindung alle solche Veränderungen und Modifizierungen
einschließt.
Die Erfindung umfasst auch alle Stufen, Merkmale, Zusammensetzungen
und Verbindungen, auf die sich in dieser Beschreibung bezogen worden
ist, oder welche in dieser Beschreibung angegeben worden sind, einzeln
oder zusammen, und eine beliebige und alle Kombinationen aus zwei
oder mehreren dieser Stufen oder Merkmale.
