FR2852327A1

FR2852327A1 - Procede de mise en contact de particules ciblees et de cellules vivantes en suspension

Info

Publication number: FR2852327A1
Application number: FR0303035A
Authority: FR
Inventors: Nelly Henry; Stephanie Sarda; Christophe Hubert
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2003-03-11
Filing date: 2003-03-11
Publication date: 2004-09-17
Also published as: WO2004082456A3; WO2004082456A2

Abstract

Procédé de mise en contact de particules porteuses d'une molécule de reconnaissance avec des cellules porteuses d'une molécule cible. Les particules et les cellules étant en suspension dans un fluide aqueux, il est appliqué un cisaillement contrôlé au fluide.

Description

L'invention a pour objet un nouveau procédé de collage de particules sur des cellules en suspension visées par un lien moléculaire spécifique. L'une des premières applications est offerte par la phase initiale des protocoles de tri d'une sous population de cellules au sein d'un mélange.

L'isolement et/ou la purification de sous populations cellulaires au sein d'un mélange de cellules constitue une étape importante de nombreux procédés employés en recherche, notamment pour l'étude de la biologie cellulaire, dans le domaine du diagnostic, de la thérapeutique, et dans l'industrie pharmaceutique en général.

Les procédés employés pour isoler et/ou purifier une sous population de cellules au sein d'un mélange reposent sur les propriétés physico chimiques, immunologiques ou fonctionnelles des cellules.

Notamment, il est connu d'utiliser des particules magnétiques porteuses d'une molécule de reconnaissance présentant une affinité pour un récepteur de la population de cellules que l'on souhaite isoler (A. Orfao et al., Clinical Biochemistry, 29(1), 1996, 5-9 ; N. Ma et al., Transient Contractional Flow Device, 24. 09.2002, Wiley Periodicals, Wiley Interscience).

Les particules et les cellules sont mélangées de façon à favoriser l'adhérence des particules aux cellules ciblées par l'intermédiaire d'une liaison entre la molécule de reconnaissance et le récepteur. L'application d'un champ magnétique permet de séparer la sous population de cellules ciblées du reste du mélange.

Lors de l'isolement d'une sous population de cellules, on cherche à la fois à obtenir une grande spécificité et de bons rendements.

Dans les procédés de l'art antérieur, l'étape limitante pour l'obtention de rendements satisfaisants était l'étape d'ancrage des particules sur les cellules. En vue de réaliser cet ancrage, on agite le mélange de cellules et de particules. Généralement, le mode d'agitation le plus répandu est l'agitation rotative. Des tubes contenant les particules et les cellules sont clampés sur un disque tournant, perpendiculairement à l'axe de rotation.

Ce procédé permet d'inverser le liquide dans le tube deux fois par tour et de favoriser la mise en contact des particules avec les cellules. On constate toutefois qu'une agitation trop douce donne des rendements d'isolement faibles, tandis qu'une agitation trop forte entraîne la destruction des cellules.

La Demanderesse s'est donc fixé pour objectif la mise au point d'un procédé de mise en contact de particules avec des cellules, qui soit doté de rendements élevés et qui n'entraîne pas la destruction des cellules.

Plusieurs auteurs se sont penchés sur l'effet du cisaillement sur l'agrégation cellulaire.

Brodland G. W. "New information from cell aggregate compression tests and its implications for theories of cell sorting." Biorheology. 2003; 40(1,2,3): 273-277.

Tandon P., Diamond SL. "Kinetics of beta2-integrin and L-selectin bonding during neutrophil aggregation in shear flow. " Biophys J. 1998 Dec.; 75 (6): 3163- 78.

Bell G.I. "Estimate of the sticking probability for cells in uniform shear flow with adhésion caused by specific bonds." Cell Biophys. 1981 Sep.; 3 (3): 289-304.

Il s'agit toutefois dans ces documents de mécanismes de reconnaissance de cellules entre elles et de la formation d'agrégats cellulaires.

Le document : Pierres A., Benodiel A. M., Bongrand P. "Use of a laminar flow chamber to study the rate of bond formation and dissociation between surface-bound adhésion molécules: effect to applied force and distance between surfaces. " Faraday Discuss. 1998; (111): 321-30 ; discussion 331-43, étudie l'interaction entre des particules porteuses d'une molécule de reconnaissance et des molécules cibles greffées sur un plan fixe sont dans un flux laminaire. Il s'agit là encore d'une configuration distincte de celle de l'invention et les conditions expérimentales relèvent le rôle du cisaillement sur le détachement des particules.

La présente invention a pour objet un procédé de mise en contact de particules porteuses d'une molécule de reconnaissance avec des cellules porteuses d'une molécule cible, la molécule de reconnaissance présentant une affinité pour la molécule cible, les particules et les cellules étant en suspension dans un fluide aqueux, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il est appliqué un cisaillement contrôlé au fluide.

Par cisaillement on entend la force issue du mouvement relatif d'un fluide par rapport à une paroi. Le cisaillement est contrôlé quand on peut décrire la distribution des vitesses dans le fluide grâce à la géométrie du dispositif choisi et aux flux appliqués.

Le dispositif peut être par exemple un système rotatif où la contrainte de cisaillement est appliquée par le mouvement d'un solide de révolution autour de son axe de symétrie. Le solide de révolution utilisable dans la présente invention peut être par exemple un disque, un cône ou un cylindre. Il peut également être un cône tronqué.

Dans ce cas, le fluide auquel est appliqué le cisaillement contrôlé est préférentiellement placé dans un récipient cylindrique dont l'axe de symétrie est confondu avec celui du solide de révolution. Lorsque le fluide à mélanger représente une faible quantité de liquide, on peut prévoir de le déposer sur un plan sous forme d'une goutte et d'appliquer le cisaillement directement sur la goutte.

Lorsque l'on utilise un dispositif de cisaillement contrôlé constitué d'un système cône plan particulier tel que celui représenté sur la figure 2a on observe que le cisaillement appliqué au fluide est uniforme dans tout le milieu.

Un autre type de cisaillement peut aussi être appliqué par le déplacement d'un plan par rapport à un autre qui lui est parallèle, dans une géométrie confinée comme illustré sur la figure 2b.

Enfin, une distribution de vitesses produisant un cisaillement contrôlé peut également être obtenu en réglant le flux de liquide dans un micro canal comme illustré sur la figure 2c.

Selon le procédé de l'invention, des particules porteuses d'une molécule de reconnaissance et des cellules, dont certaines sont porteuses d'une molécule cible, sont en suspension dans le fluide aqueux. Sous l'effet du cisaillement appliqué les corps en suspension entrent en collision et l'adhésion des cellules aux particules est favorisée.

Le couple molécule de reconnaissance-molécule cible est choisi, de façon connue, parmi les couples récepteur-ligand naturels susceptibles de former une liaison spécifique de courte portée. On peut citer par exemple les liaisons antigène - anticorps, lectine-sucres, protéine-peptide, protéine-lipide.

De façon préférentielle, la molécule cible est un site naturel de la cellule.

On peut prévoir qu'un ligand de ce site soit greffé directement sur les particules magnétiques. Dans ce cas, il s'agit d'un système de reconnaissance simple.

On peut également prévoir d'utiliser un ligand d'un site naturel de la cellule (cible primaire) greffé par une molécule cible secondaire. Dans ce cas, les cellules que l'on cherche à isoler sont traitées à l'aide du ligand greffé. Le site de reconnaissance de la cellule se lie au ligand et se trouve par conséquent lié à la cible secondaire.

On utilise alors des particules greffées par une molécule de reconnaissance spécifique de la cible secondaire. Dans ce cas, il s'agit d'un système de reconnaissance double.

Cette dernière variante présente l'avantage de permettre l'utilisation d'un même lot de particules greffées par une même molécule de reconnaissance pour cibler des cellules porteuses de récepteurs différents. Ces récepteurs sont reconnus par un ligand spécifique de chaque cellule auquel on greffe une molécule cible appropriée.

C'est cette dernière variante qui est illustrée dans les exemples : les cellules ciblées sont constituées d'une lignée de lymphocytes B. Le récepteur ciblé (cible primaire) est la glycoprotéine CD 19 présente sur tous les lymphocytes B.

La biotine greffée sur un anticorps anti-CD 19 constitue la cible secondaire des cellules.

Les particules sont greffées par une molécule de reconnaissance spécifique de la biotine : lastreptavidine.

Lorsque l'on applique un cisaillement contrôlé au fluide aqueux dans lequel sont en suspension les particules porteuses d'une molécule de reconnaissance et les cellules porteuses d'une molécule cible (primaire ou secondaire), on imprime au fluide un

mouvement qui conditionne la physique des chocs des corps en suspension. Les forces ainsi appliquées lors des chocs particule-cellule favorisent la reconnaissance de la molécule cible par la molécule de reconnaissance. Celles-ci, du fait de leur affinité, se lient l'une à l'autre et forment ainsi un lien entre la particule et la cellule correspondante.

Les cellules capturées par des particules magnétiques peuvent être observées en cytométrie de flux. Elles peuvent également être triées en gradient de champ magnétique et séparées des cellules non capturées.

L'utilisation d'un système cône plan dans lequel le cisaillement appliqué est le même dans la totalité du milieu permet de faire les observations suivantes : - On obtient, par l'application d'un cisaillement contrôlé, notamment rotatif, des rendements de capture beaucoup plus élevés qu'avec les systèmes d'agitation de l'art antérieur ; - Le rendement de la capture est fonction du taux de cisaillement appliqué ; - Pour un fluide donné, l'évolution de la capture en fonction du taux de cisaillement appliqué présente un plateau à partir d'une valeur du taux de cisaillement que l'on nomme taux cisaillement seuil : # s, le rendement n'étant pas améliorable au-delà de ce cisaillement seuil.

Préférentiellement, selon le procédé de l'invention, pour un fluide donné, on applique au fluide de suspension des cellules et des particules, une distribution de cisaillement telle que dans tout le fluide le taux de cisaillement soit supérieur ou égal à 1% du taux de cisaillement seuil, # s, de ce fluide, encore plus préférentiellement supérieur ou égal à 2% de ce taux de cisaillement seuil. Avantageusement, on choisit d'appliquer un taux de cisaillement supérieur ou égal à 5% du taux de cisaillement seuil, encore plus avantageusement supérieur ou égal à 10%, ou mieux à 20% du taux de cisaillement seuil.

De préférence encore, on applique un taux de cisaillement supérieur ou égal à 50% du taux de cisaillement seuil, encore plus avantageusement supérieur ou égal à 100% du taux de cisaillement seuil.

L'invention a également pour objet un procédé de mise en contact de particules porteuses d'une molécule de reconnaissance avec des cellules porteuses d'une molécule cible (primaire ou secondaire), présentant une affinité pour la molécule de reconnaissance, les particules et les cellules étant en suspension dans un fluide aqueux, ce procédé étant caractérisé en ce que : (i) dans une première étape, on mesure le taux de cisaillement seuil de ce fluide, (ii) dans une seconde étape, on applique à ce fluide un mouvement de cisaillement contrôlé, notamment rotatif, d'une vitesse telle que le taux de cisaillement

dans le fluide soit partout supérieur ou égal à 1% du taux de cisaillement seuil, # s, de ce fluide, encore plus préférentiellement supérieur ou égal à 2% de ce taux de cisaillement seuil. Avantageusement, on choisit d'appliquer un taux de cisaillement supérieur ou égal à 5% du taux de cisaillement seuil, encore plus avantageusement supérieur ou égal à 10%, ou mieux à 20% du taux de cisaillement seuil. De préférence encore, on applique un taux de cisaillement supérieur ou égal à 50% du taux de cisaillement seuil, encore plus avantageusement supérieur ou égal à 100% du taux de cisaillement seuil.

De façon avantageuse, les particules porteuses de la molécule de reconnaissance sont des particules magnétiques :
Les cellules cibles capturées par des particules magnétiques peuvent être mises en évidence en utilisant la cytométrie en flux. Elles peuvent être isolées physiquement du mélange de cellules initialement présent dans le fluide par application du champ magnétique.

L'invention a en outre pour objet un procédé de tri d'une sous-population de cellules dans un fluide aqueux, lesdites cellules étant porteuses d'une molécule cible (primaire ou secondaire), ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de mise en contact des cellules contenues dans le fluide avec des particules magnétiques porteuses de molécules de reconnaissance présentant une affinité pour les molécules cibles, suivant la méthode décrite ci-dessus.

Généralement, ce procédé comporte en outre au moins une autre étape : l'application d'un champ magnétique.

Le fluide aqueux à traiter peut être le résultat d'un prélèvement biologique tel qu'un échantillon de sang ou de moelle, une suspension aqueuse de cellules prélevées par biopsie ou par toute autre méthode.

Il peut également être le résultat de la mise en culture de cellules.

Outre les cellules à trier, le fluide aqueux peut donc comporter d'autres cellules et des molécules biologiques de toute nature, des sels ou des polymères.

Il peut être un fluide issu directement d'un prélèvement biologique ou avoir déjà subi un premier tri par toute méthode connue de l'homme du métier.

La dilution du fluide doit être suffisante pour éviter l'agrégation des cellules entre elles.

Les particules employées dans le procédé de l'invention sont d'une taille allant préférentiellement de quelques dizaines de nanomètres à quelques microns.

Parmi les molécules magnétiques commerciales utilisables dans la présente invention on peut citer celles commercialisées sous la marque Dynabead par la Société DYNAL.

Le procédé de l'invention est d'une grande utilité dans le domaine de l'investigation clinique et du diagnostic. Il peut en effet contribuer à l'isolement d'une sous-population de cellules caractéristiques d'une pathologie au sein d'un mélange de cellules saines, ou la présence d'un type cellulaire déplacé dans un tissu donné, exemple : la présence des cellules endothéliales dans le sang, marqueur de thromboses.

Le procédé de l'invention se distingue des procédés de tri cellulaire de l'art antérieur par sa grande rapidité et ses rendements élevés, il est donc particulièrement utile dans la recherche et l'isolement de sous-populations cellulaires présentes en très petites quantités. Il trouve des applications notamment dans le diagnostic ante-natal, l'isolement de cellules dendritiques, le diagnostic du cancer, du SIDA, etc...

PARTIE EXPERIMENTALE
Les figures la, lb et lereprésentent respectivement des dispositifs de cisaillement cône-plan, plan-plan et cylindrique, ce dernier étant également dénommé système Couette, susceptibles d'être utilisés dans le procédé de l'invention pour l'application d'un cisaillement contrôlé, notamment rotatif. On peut aussi appliquer un flux contrôlé dans un micro-canal.

La figure 2a représente un système de cisaillement cône-plan dont les cotes sont ajustées de façon à fournir un taux de cisaillement uniforme dans la totalité du milieu. Le dispositif représenté sur la figure 2a comporte un plan P sur lequel peut être déposé un échantillon. Il comporte un cône tronqué dont la base est parallèle au plan P et dont l'axe x est perpendiculaire au plan P. d définit la distance du plan P à la base du cône et # définit l'angle que fait le côté du cône avec le plan P. En tout point du plan P, r définit la distance à l'axe x et e définit la distance au côté du cône. Le dispositif de la figure 2a se caractérise par le fait qu'en tout point du plan le rapport r/e est constant. La force de cisaillement appliquée, qui dépend de la vitesse de rotation #, est la même en tout point du dispositif. Dans le cas où l'échantillon à traiter est d'une taille supérieure à celle d'une goutte, on prévoit de remplacer le plan P par un récipient à fond plat. Généralement # est petit, de préférence c'est un angle de 1 à 5 degrés, généralement 1 à 2 degrés. Dans ce système, le cisaillement est y = co.r/e.

La figure 2b représente un système de cisaillement plan-plan constitué d'un plan fixe et d'un plan mobile, parallèles, séparés par une distance e, le fluide étant placé entre ces deux plans. Lorsque le plan mobile se déplace parallèlement au plan fixe, il imprime au fluide un mouvement de cisaillement. Si l'on définit par v (x,t) vitesse d'un point du fluide situé à une distance x du plan fixe à un instant t, le cisaillement appliqué en ce point est y =dv(x,t)/dx.

La figure 2c représente un système de cisaillement du type micro canal, dans lequel le fluide est contraint de traverser un canal de faible diamètre e, dans sa

longueur. Ce mouvement du fluide exerce sur lui une force de cisaillement. Si l'on définit par v (x,t) vitesse d'un point du fluide situé à une distance x de la paroi du canal à un instant t, le cisaillement appliqué en ce point est y =dv (x,t)/dx.

I/ MODELE EXPERIMENTAL
1. 1- Modèle cellulaire : lignée de lymphocytes B, lymphoblastome Bernard immortalisé par EBV1 au laboratoire d'Immuno-modulation par les médiateurs de l'inflammation de l'Université de Bordeaux 2 (UMR-CNRS 5540). Ces cellules seront désignées dans la suite par cellules LB (lignée Bernard).

1.2- Récepteur cellulaire : le récepteur ciblé pour la capture est le CD 19, glycoprotéine de surface de 80kD présente sur tous les lymphocytes B.

Particules : Il s'agit de particules de latex magnétiques d'un diamètre d'environ 3 m produites par la Société Dynal. Ces particules sont couvertes par une protéine de reconnaissance la streptavidine.

1. 3- Lien moléculaire : Le lien moléculaire permettant l'association des particules aux cellules selon un mode spécifique est le lien Streptavidine-biotin. La biotin est un petit ligand d'un poids moléculaire de 244 qui se lie avec une très forte affinité (Ka#1014M-1) à la streptavidine, protéine de 60 kD, qui possède 4 sites équivalents pour la fixation de la biotin. La streptavidine est portée par les particules et la biotin est portée par les cellules via un anticorps anti-CD19 biotinylé dirigé contre une protéine de surface ubiquitaire des lymphocytes B.

III METHODES D'ANALYSE DE L'ASSOCIATION PARTICULES-CELLULES
Méthode d'analyse de la capture : 2.1- Cytométrie en flux
Les particules utilisées, chargées en oxyde de fer, possèdent une fluorescence à large spectre qui permet de les mettre en évidence à la surface des cellules en utilisant la cytométrie en flux. Les cellules porteuses de particules se distinguent clairement dans un diagramme de cytométrie montrant la fluorescence des cellules sur le canal FL3 mesurant l'intensité émise aux plus grandes longueurs d'onde. Les cellules porteuses de particules apparaissent à une intensité de fluorescence nettement plus élevée que les cellules sans particules comme cela est représenté sur la figure 3.

Sur la figure 3 on observe la fluorescence obtenue sur le canal 3 des plus grandes longueurs d'onde pour (A) des cellules sans particules et (B) des cellules ayant été capturées par des particules.

2. 2- Tri physique en gradient de champ magnétique et comptage
La deuxième méthode permettant de suivre l'efficacité de l'association particule-cellule consiste à trier physiquement les cellules ayant capturé des particules magnétiques en plaçant les échantillons dans un gradient de champ après la phase de mise en contact des particules avec les cellules. Cette expérience est réalisée sur une population homogène (lignée). Le gradient de champ permet de concentrer les cellules rendues magnétiques par l'association avec les particules et de les séparer ainsi des cellules sans particules qui sont insensibles au champ comme cela est représenté sur la figure 4.

Sur cette figure, on distingue nettement la formation du culot magnétique sur la paroi du tube à l'endroit ou le champ magnétique est le plus fort. Les objets non magnétiques restés en suspension peuvent être isolés en prélevant le surnageant.

Le comptage sous microscope des cellules présentes dans le surnageant et des cellules présentes dans le culot magnétique révèle l'efficacité du tri.

III/ PROCEDE DE MISE EN CONTACT SUIVANT L'ART ANTERIEUR
3.1- Conditions générales
Une étape cruciale de la mise en #uvre de ces méthodes de tri est le mode de mise en contact des particules avec les cellules à trier. Il faut mélanger efficacement, de façon à permettre la formation du lien moléculaire entre les particules et les cellules sans toutefois endommager les cellules.

Aujourd'hui plusieurs modes d'agitation douce sont appliqués. Le plus répandu et le plus efficace est l'agitation rotative. Les tubes contenant les particules et les cellules sont clampés, sur un disque tournant, perpendiculairement à l'axe de rotation. Ceci permet d'inverser le liquide dans le tube deux fois par tour.

3. 2- Taux d'association au récepteur CD19
Les lymphocytes B (2.105 cell. /ml), préalablement repérés par un anticorps anti-CD19 biotinylé sont mis en contact avec les particules (10 particules/ cellule) dans un milieu physiologique de maintien des cellules. La suspension de cellules et de particules est mise à incuber sur l'agitateur rotatif à une vitesse de 5 rpm et à température ambiante.

Après une heure l'échantillon est repris pour être analysé en cytométrie en flux. Cette analyse, illustrée par la figure 5, montre que seulement une fraction des cellules mises en contact avec les particules a un signal caractéristique de cellules porteuses de particules. Une incubation supplémentaire de une heure n'augmente pas la fraction de cellules recrutées. Cette fraction représente environ 40 % des cellules totales.

La figure 5 représente un diagramme de cytométrie d'une suspension de cellules marquées par des anti-CD19 biotinylés et de particules couvertes de streptavidine.

Cette suspension a été agitée pendant une heure sur l'agitateur rotatif muni de tubes tel que

présenté plus haut. On voit se distinguer une fraction de cellules associées à des particules représentant environ 40 % de la population totale.

3. 3- Cinétique de l'association
L'association des particules aux cellules est suivie en fonction du temps de mise en contact. On constate que le plateau de l'association est obtenu à 30 min comme illustré par la figure 6.

La figure 6 représente la cinétique de fixation des particules greffées par la streptavidine sur les cellules LB biotinylées. Le plateau est obtenu à 30 min. Il correspond à la fixation de particules sur seulement 40 % des cellules.

3. 4- Influence de la vitesse de rotation
L'augmentation de la vitesse de rotation de l'agitateur jusqu'à 15 rpm permet d'augmenter la fraction de cellules recrutées jusqu'à 50 % comme illustré sur la figure 7. Néanmoins, au-delà de 15 rpm la viabilité cellulaire est largement entamée. La cinétique réalisée à 20 rpm doit être interrompue rapidement car les cellules sont abîmées (bulles, éclatement...).

La figure 7 représente les cinétiques d'association obtenues à 5 et 15 rpm. Les autres conditions sont identiques à celles employées au point 3.3.

IV/ PROCEDE DE MISE EN CONTACT SELON L'INVENTION
4.1- Géométrie et procédé de mise en contact
La méthode de mise en contact des cellules avec les particules illustrée ici permet de recruter plus de 95 % des cellules ciblées en moins de cinq minutes. De plus ce procédé n'affecte aucunement la viabilité des cellules. Il s'agit d'appliquer un cisaillement contrôlé sur la suspension. La géométrie qui permet d'appliquer ce cisaillement est présentée sur la figure 8.

La figure 8 représente la géométrie de cisaillement cône-plan employée dans la mise en #uvre expérimentale de l'invention.

Une goutte (volume Vt=164.8 l) du milieu à agiter est placée sur un plan fixe. Un cône tronqué d'axe perpendiculaire au plan est amené en contact avec cette goutte, la base du cône se trouvant à 50 m du plan environ. L'axe du cône étant relié à un moteur on lui applique un mouvement de rotation pendant un temps donné à une vitesse donnée. Le mouvement peut aussi optionnellement être appliqué au plan alors que le cône est fixe.

4. 2- Taux d'association au récepteur CD19 : effet du cisaillement, cinétique
Les résultats obtenus dans la configuration décrite au point 4. 1 sont présentés sur la figure 9.

La figure 9 représente la cinétique d'association des particules couvertes de streptavidine avec les cellules biotinylées. Dans toutes les expériences la concentration

en cellules est égale à 2.105 cell./ml et la concentration en particules est égale à 2.106 part./ml. On a représenté trois ordres de grandeur de cisaillement ainsi que la cinétique obtenue en agitation rotative classique à 5 rpm.

On note que la fraction de cellules recrutées sous un cisaillement de 10s-1, c'est-à-dire à une valeur de cisaillement correspondant à 2% du taux de cisaillement seuil observé pour ce système, est équivalente à celle recrutée sous agitation classique à 5 rpm.

Pour tous les cisaillements plus élevés, on obtient à la fois une accélération importante de la fixation des particules et une augmentation sensible de la fraction de cellules recrutées.

Sur la figure 10 est représentée la fraction de cellules recrutées au plateau cinétique en fonction du taux de cisaillement ( y ). On voit qu'un effet optimum est obtenu pour un cisaillement de 500s-1 qui correspond au taux cisaillement seuil du milieu y s.

Les cisaillements appliqués n'endommagent pas les cellules comme le montrent les paramètres de diffusion aux petits et aux grands angles.

4. 3- Capture physique
Comme on peut le voir sur la figure 11, l'augmentation de la fraction de cellules associées à des particules est exactement reflétée dans les expériences de tri physique. Après une mise en contact classique à 5 rpm, on récupère 40 % des cellules dans le culot magnétique et 60 % non capturée dans le surnageant. Après mise en contact en cisaillement contrôlé 96 % des cellules sont récupérées dans le culot magnétique.

La figure 11montre les fractions de cellules récupérées après séparation sous champ magnétique des suspensions de cellules et de particules mises en contact (A) en cisaillement contrôlé, (B) en agitation rotative. Dans les échantillons témoins, les cellules n'ont pas reçu d'anticorps biotinylés.

supernatant désigne les cellules récupérées dans le surnageant (non magnétiques) et pellet désigne les cellules récupérées dans le culot magnétique.

On constate par ces exemples comparatifs que l'application d'un cisaillement contrôlé sur un mélange de cellules et de particules porteuses de molécules de reconnaissance complémentaires permet d'augmenter considérablement la fraction de cellules capturées et de diminuer d'un facteur 15 le temps nécessaire pour atteindre le plateau.

Dans cet exemple, sont capturées dans une cellule de cisaillement côneplan 95 % des cellules ciblées en 2 min pour les cisaillements les plus élevés. Dans ces conditions, les méthodes classiques de mise en contact ne permettent que le recrutement de 40 % des cellules et ce en trente minutes.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de mise en contact de particules porteuses d'une molécule de reconnaissance avec des cellules porteuses d'une molécule cible, la molécule de reconnaissance présentant une affinité pour la molécule cible, les particules et les cellules étant en suspension dans un fluide aqueux, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il est appliqué un cisaillement contrôlé au fluide.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est appliqué un cisaillement rotatif au fluide.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le cisaillement rotatif résulte du mouvement d'un solide de révolution choisi parmi un disque, un cône, un cylindre ou un cône tronqué autour de son axe de symétrie.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le fluide auquel est appliqué le cisaillement rotatif est placé dans un récipient cylindrique dont l'axe de symétrie est confondu avec celui du solide de révolution.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le dispositif de cisaillement rotatif est constitué d'un système cône plan comportant un plan P, un cône tronqué dont la base est parallèle au plan P et dont l'axe x est perpendiculaire au plan P, en tout point du plan P, r définit la distance à l'axe x et e définit la distance au côté du cône, le dispositif étant caractérisé par le fait qu'en tout point du plan P le rapport r/e est constant.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le cisaillement appliqué au fluide résulte du mouvement d'un premier plan par rapport à un second plan, parallèle au premier.

7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le cisaillement appliqué au fluide résulte du mouvement de ce fluide dans un micro canal.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le couple molécule de reconnaissance-molécule cible est choisi parmi les couples récepteur-ligand naturels susceptibles de former une liaison spécifique de courte portée.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le couple molécule de reconnaissance-molécule cible est choisi parmi les couples antigène - anticorps, lectine-sucres, protéine-peptide, protéine-lipide.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le couple molécule de reconnaissance-molécule cible est le couple streptavidine-biotine.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la molécule cible est un site naturel de la cellule.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on utilise un ligand d'un site naturel de la cellule (cible primaire) greffé par une molécule cible secondaire et des particules greffées par une molécule de reconnaissance spécifique de la cible secondaire.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les cellules cibles sont constituées d'une lignée de lymphocytes B, le récepteur ciblé est la glycoprotéine CD 19, la biotine greffée sur un anticorps anti-CD 19 constitue la cible cellulaire, les particules sont greffées par la streptavidine.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les particules porteuses de la molécule de reconnaissance sont des particules magnétiques.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins une étape d'observation en cytométrie de flux.

16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins une étape de tri en gradient de champ magnétique.

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, de mise en contact de particules avec des cellules, les particules et les cellules étant en suspension dans un fluide aqueux, ce procédé étant caractérisé en ce que : (i) dans une première étape, on mesure le taux de cisaillement seuil de ce fluide, (ii) dans une seconde étape, on applique à ce fluide un mouvement de cisaillement contrôlé tel que le taux de cisaillement dans le fluide soit partout supérieur ou égal à 1%, préférentiellement à 2%, encore plus préférentiellement à 10% du taux de cisaillement seuil de ce fluide.

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'à l'étape (ii) on applique un mouvement de cisaillement contrôlé tel que le taux de cisaillement dans le fluide soit partout supérieur ou égal à 20%, préférentiellement à 50%, encore plus préférentiellement à 100% du taux de cisaillement seuil de ce fluide.

19. Procédé de tri d'une sous-population de cellules dans un fluide aqueux, lesdites cellules étant porteuses d'une molécule cible, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de mise en contact des cellules contenues dans le fluide avec des particules magnétiques porteuses de molécules de reconnaissance présentant une affinité pour les molécules cibles, selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que le fluide aqueux à traiter est le résultat d'un prélèvement biologique.

21. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 dans le diagnostic ante-natal, l'isolement de cellules dendritiques, le diagnostic du cancer, ou du SIDA.