DE4035034C1 - Measuring blood clotting and thrombocyte action - by mixing blood sample with clotting retardant and measuring time required start agglutination - Google Patents
Measuring blood clotting and thrombocyte action - by mixing blood sample with clotting retardant and measuring time required start agglutinationInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der thrombozytenvermittelten Thrombinbildungszeit in blutplättchenreichem Plasma.The invention relates to a method for measuring platelet-mediated Thrombin formation time in platelet-rich Plasma.
Eine direkte Beurteilung und Messung der Thrombinbildung an der Thrombozytenoberfläche war bisher nicht möglich bzw. erfolgte unter Bedingungen, die eine Differenzierung zwischen der Thrombinbildung in der Gesamtblutprobe und an den Thrombozyten nicht zuließ.A direct assessment and measurement of thrombin formation the platelet surface has so far not been possible or was done under conditions that differentiate between of thrombin formation in the whole blood sample and on the Platelets not allowed.
Bisher erfolgen Untersuchungen des Gerinnungssystems in der Regel an Blutproben, die durch Na-Zitrat ungerinnbar gemacht wurden. (Vgl. die DE-AS 24 08 214)So far, the coagulation system has been examined in the Usually on blood tests made unclotable by sodium citrate were. (See DE-AS 24 08 214)
Auch Untersuchungen der Thrombozytenfunktion erfolgen in der Regel an Zitratblutproben. Zitrat bindet die Kalziumionen des Blutes und verhindert dadurch den Eintritt der Blutgerinnung. In der Abwesenheit von Kalziumionen läuft die Aktivierung des Gerinnungssystems, aber auch die Plättchenaktivierung anders ab, als bei Anwesenheit von Kalziumionen.Platelet function is also examined in the Rule on citrated blood samples. Citrate binds the calcium ions of the Blood and thereby prevents the occurrence of blood clotting. In the absence of calcium ions, the activation of the Coagulation system, but also the activation of platelets differently than when calcium ions are present.
Es ist im Prinzip schon lange bekannt, daß Blut auch durch Zugabe von Heparin, Hirudin oder niedermolekularen Heparinen ungerinnbar gemacht werden kann. Erst in jüngster Zeit wurde gezeigt (Basic-Micic, et al.: Beeinflußt niedermolekulares Heparin die Thrombozytenfunktion? Hämostaseologie 1989, 9; 748-257), daß sich das Aggregationsverhalten der Thrombozyten oder die Haftneigung der Thrombozyten in Blutproben, die mit Heparin oder niedermolekularem Heparin versetzt wurden, deutlich anders verhält als in Zitratblut. Hieraus ergab sich die Überlegung, Blutproben mit kleinen Mengen eines Gerinnungshemmstoffs zu versetzen, die ausreichen, um das Blut für einige Stunden flüssig zu halten. Wird aus einer solchen Blutprobe plättchenreiches Plasma gewonnen und wird dieses plättchenreiche Plasma in einer Scheibenküvette mit einem Durchmesser von 2 cm rotiert, so tritt nach einigen Minuten eine Aggregation der Thrombozyten auf, die durch die Bildung von Thrombin an der Thrombozytenoberfläche bedingt ist. In Abwesenheit der Thrombozyten, etwa wenn diese abzentrifugiert werden, tritt in einer so behandelten Plasmaprobe während einer Beobachtungszeit von bis zu 40 Min. keine Gerinnung auf.In principle, it has long been known that blood also passes through Add heparin, hirudin or low molecular weight heparins can be made non-coagulable. Only recently has been shown (Basic-Micic, et al .: Affects low molecular weight Heparin platelet function? Haemostaseology 1989, 9; 748-257) that the aggregation behavior of the platelets or the tendency of platelets to stick in blood samples taken with Heparin or low molecular weight heparin have been added, behaves significantly differently than in citrated blood. This resulted in considering taking blood samples with small amounts of an anticoagulant to move enough to get the blood for keep fluid for a few hours. Becomes from one Blood sample is obtained from platelet-rich plasma and this is platelet-rich plasma in a disc cuvette with a Diameter of 2 cm rotates, so occurs after a few minutes aggregation of platelets by formation is caused by thrombin on the platelet surface. In Absence of platelets, such as when they are spun down occurs in a plasma sample treated in this way an observation time of up to 40 min. no coagulation.
Das es sich hierbei um eine spezifisch thrombinbedingte Reaktion an den Thrombozyten handelt, konnte auch dadurch belegt werden, daß diese Reaktion durch Antitrombin III dosisabhängig gehemmt werden kann. Entscheidend für die Aktivierung von Thrombin an der Thrombozytenoberfläche sind:That this is a specific thrombin-related Reaction to the platelets could also do so be proven that this reaction by Antitrombin III can be inhibited depending on the dose. Crucial for that Activation of thrombin on the platelet surface are:
- 1. Der Kontakt mit der Küvettenwand. Diese Kontaktfläche kann durch Beschichten mit Endothelzellen, subendothelialer Matrix (dem Material, das Endothelzellen auf einer Oberfläche, an der sie wachsen, produzieren), Albumine oder andere Proteine oder auch durch Auswechseln der Küvettenwände gegen Materialien, die unterschiedliche Oberflächeneigenschaften haben, verändert werden.1. The contact with the cuvette wall. This contact area can be subendothelial by coating with endothelial cells Matrix (the material that endothelial cells make up a surface on which they grow, produce), Albumins or other proteins or by replacing them the cuvette walls against materials that are different Surface properties have to be changed.
- 2. Weitere für die Reaktion entscheidende Vorgänge sind die vorsichtige Durchmischung der Probe und die dabei erfolgende leichte Alkalisierung des PRP durch Entweichen von Kohlensäure. 2. Other processes that are decisive for the reaction are careful mixing of the sample and the slight alkalization of the PRP by escape of carbonic acid.
- 3. Die Aktivierung der Thrombozyten (Stimulation an der blutfremden Oberfläche, Formwandel, Aktivierung von Rezeptoren) ist eine weitere Voraussetzung für die Thrombinbildung an ihren Oberflächen.3. Activation of platelets (stimulation on the non-blood surface, change of shape, activation of Receptors) is another requirement for Thrombin formation on their surfaces.
-
4. Die in der Blutprobe vorhandenen Gerinnungsfaktoren und
ihre Hemmstoffe beeinflussen die Reaktionsgeschwindigkeit
wesentlich.
Die benötigte Blutmenge liegt bei 2-5 ml. Die Verdünnung der Blutprobe durch Zugabe des Antikoagulans kann auf 1 : 100 (1 Teil Antikoagulans + 99 Teile Blut) reduziert werden.
Andere Aktivatoren werden bei diesem Meßverfahren nicht zugesetzt.4. The coagulation factors present in the blood sample and their inhibitors significantly influence the reaction rate.
The amount of blood required is 2-5 ml. The dilution of the blood sample by adding the anticoagulant can be reduced to 1: 100 (1 part anticoagulant + 99 parts blood).
No other activators are added to this measurement process.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Messung der thrombozytenvermittelten Thrombinbildungszeit in blutplättchenreichem Plasma vorzuschlagen, das sich durch eine hohe Meßempfindlichkeit auszeichnet. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sollen somit Störungen der Blutgerinnung und der Thrombozytenfunktion mit hoher Empfindlichkeit erkannt werden können.The invention is therefore based on the object of a method for measuring the platelet mediated thrombin formation time to propose in platelet-rich plasma that spreads through is characterized by a high sensitivity. With the invention Procedures are said to interfere with blood clotting and platelet function with high sensitivity can be.
Zur Lösung dieser Aufgabe ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß das in einem lichtdurchlässigen Gefäß befindliche thrombozytenreiche Plasma, das aus einer mit einem die Gerinnung verzögernden Mittel versetzten Blutprobe stammt, in Kontakt mit der Oberfläche des Gefäßes bewegt wird, dessen Lichttransmissionsänderung dabei gemessen wird, wobei die Zeit bis zum Eintritt der Thrombin-induzierten Aggregation und/oder die Zeit bis zum Gerinnungseintritt gemessen wird. To achieve this object, the invention is characterized in that that what is in a translucent vessel platelet-rich plasma, which from one with one the Blood coagulation delaying agent comes from Contact with the surface of the vessel is moved, the The change in light transmission is measured, taking the time until the onset of thrombin-induced aggregation and / or the time to coagulation is measured.
Eine apparativ und meßtechnisch besonders einfache und daher bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das mit dem Plasma gefüllte Gefäß kontinuierlich gedreht wird, wie dies aus der eingangs erwähnten deutschen Auslegeschrift an sich schon bekannt ist. Allerdings ist diese Verfahrensführung nicht zwingend vorgeschrieben. Beispielsweise kann es auch genügen, das Plasma in dem Meßgefäß über eine geeignete Anordnung sich hin und her bewegen zu lassen, weil, wie erwähnt, wesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren die Relativbewegung zwischen dem Plasma und einer festen Oberfläche ist, im allgemeinen der Gefäßwand. Nach einem Denkmodell unterstützt diese Relativbewegung die Thrombinbildung an der Thrombozytenoberfläche und die hierdurch bedingte Thrombozytenaggregation und nachfolgende Gerinnung.A particularly simple apparatus and measurement technology and therefore preferred embodiment of the invention is characterized in that that the vessel filled with the plasma is continuous is filmed, like this from the German Interpretation is known in itself. However, this is Procedures are not mandatory. For example it may also be sufficient to use a plasma in the measuring vessel suitable arrangement to move back and forth because, as mentioned, the essential for the inventive method Relative movement between the plasma and a solid surface is, generally the vascular wall. According to a thinking model this relative movement supports thrombin formation at the Platelet surface and the resulting platelet aggregation and subsequent coagulation.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren mit anderen Meßverfahren verglichen.The method according to the invention is described below with others Measuring methods compared.
Der typische sogenannte Globaltest, d. h. ein Suchverfahren, mit dem man heute Störungen der Blutgerinnung erfaßt, ist die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPPT). Bei diesem Verfahren werden sogenannte partielle Thromboplastine, d. h. gerinnungsaktive Phospholipide, die im Thrombozyten, Gewebezellen und Erythrozyten enthalten sind, zusammen mit Kalziumionen dem thrombozytenfreien Zitratplasma zugesetzt. Die Thrombinbildung in der Probe wird anhand der Fibrinbildung gemessen. Es handelt sich hier um ein empfindliches Verfahren, das heute weltweit angewendet wird, das aber von der erfindungsgemäßen Methode in seiner Empfindlichkeit wesentlich übertroffen wird. Mit der neuen Methode werden Störungen des Gerinnungssystems auch dann erfaßt, wenn sie so geringfügig sind, daß die partielle Thromboplastinzeit die Störung noch nicht anzeigt.The typical so-called global test, i.e. H. a search procedure with which one today disorders of blood coagulation recorded is the activated partial thromboplastin time (aPPT). In this process, so-called partial Thromboplastins, i.e. H. coagulant phospholipids that contained in platelets, tissue cells and erythrocytes together with calcium ions are platelet-free Citrate plasma added. Thrombin formation in the sample is measured on the basis of fibrin formation. It is about this is a sensitive process that is used worldwide today is used, but that of the invention Method significantly exceeded in sensitivity becomes. With the new method, disturbances of the Coagulation system even if it is so minor are that the partial thromboplastin time is the Fault not yet displayed.
Die Thrombozytenfunktion wird heute meist mit Hilfe der sogenannten induzierten Aggregation erfaßt. Bei dieser Methode (nach Born) wird plättchenreiches Plasma mit Hilfe eines kleinen Magneten im Strahlengang eines Photometers in einem Meßröhrchen durch Rotation des Magneten mit einer Geschwindigkeit zwischen 500 und 1500 Umdrehung/Min. bewegt und es werden sogenannte Auslösesubstanzen zugesetzt. Solche standardmäßig zugesetzten Auslösesubstanzen sind ADP, Kollagen, Adrenalin und Thrombin.The platelet function is mostly today with the help of so-called induced aggregation detected. At this The method (according to Born) uses platelet-rich plasma Help a small magnet in the beam path of a Photometer in a measuring tube by rotating the Magnets with a speed between 500 and 1500 Revolution / min. moved and so-called trigger substances added. Such added by default The trigger substances are ADP, collagen, adrenaline and Thrombin.
Das neue Verfahren erfaßt Störungen der Plättchenfunktion, die durch Störungen der Thrombinbildung an der Thrombozytenoberfläche bedingt sind, das sind z. B. u. a. das sogenannte von Willebrand-Syndrom (s. Anlagen 1 und 2) und andere angeborene Störungen der Thrombozytenfunktion, z. B. Thrombasthenie, aber auch erworbene Thrombozytenfunktionsdefekte.The new method detects disorders of the platelet function, caused by disorders of thrombin formation at the Platelet surface are conditional, these are e.g. B. u. a. the so-called von Willebrand syndrome (see Annexes 1 and 2) and other congenital platelet dysfunction, e.g. B. thrombasthenia, but also acquired platelet function defects.
Einige Störungen, die sich auch medikamentös auslösen lassen, und die ausschließlich die Haftneigung der Thrombozyten vermindern, werden mit dem neuen System nicht erfaßt. Desgleichen ist das Verfahren zur Erfassung der Wirkung von "Aspirin" weniger empfindlich als die Aggregationsmeßmethoden. Some disorders that also trigger medication let, and that only the tendency of the The new system will not reduce platelets detected. The same applies to the procedure for recording the Effect of "aspirin" less sensitive than that Aggregation measurement methods.
Mit einem normalen Aggregometer kann die Thrombinbildung an der Thrombozytenoberfläche nicht erfaßt werden. Wahrscheinlich sind hierfür verantwortlich:Thrombin formation can be achieved with a normal aggregometer not be detected on the platelet surface. This is probably due to:
- 1. die hohe Verwirbelung der Blutprobe in der Meßküvette durch den Rührmagneten und1. the high turbulence of the blood sample in the measuring cell through the stirring magnet and
- 2. die zu geringe Abgabe von CO₂.2. the insufficient delivery of CO₂.
- 3. Bei dem neuen Verfahren kommt eine relativ kleine Plasmaprobe mit einer relativ großen Oberfläche in Kontakt.3. The new procedure comes with a relatively small one Plasma sample with a relatively large surface area in Contact.
Zur Erfassung einer Störung des Blutstillungssystems ist das neue Meßverfahren empfindlicher als bisher bekannte Methoden. Es liefert jedoch keine endgültige Diagnose. Eine Verlängerung der Meßzeiten erfordert in jedem Fall eine weitere Analyse der zugrundeliegenden Störung.This is to detect a bleeding system disorder new measuring methods more sensitive than previously known methods. However, it does not provide a definitive diagnosis. An extension of the measuring times requires a further analysis of the underlying disorder.
Ein seit 1949 bekanntes Verfahren, die Thrombelastographie nach Hartert, kann prinzipiell auch zur Erfassung der Thrombinbildung in teilantikoagulierten Blutproben verwendet werden. Hier ist eine Registrierung in Vollblutproben möglich. Aufgezeichnet wird aber nur die Gerinnung der Blutprobe; die vorausgehende Aggregation der Thrombozyten wird nicht erfaßt. Wahrscheinlich läßt sich aber das hier beschriebene, erfindungsgemäße Meßprinzip auch mit der Thrombelastographie mit etwas reduzierter Empfindlichkeit anwenden.A procedure known since 1949, thrombus stressography according to Hartert, can in principle also be used to record the Thrombin formation used in partially anticoagulated blood samples will. Registration in whole blood samples is possible here. However, only the coagulation of the blood sample is recorded; the previous platelet aggregation is not recorded. However, the invention described here can probably be used Measuring principle also with thrombus stress apply somewhat reduced sensitivity.
Im folgenden wird die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erfassung einer gesteigerten Thrombinbildung an der Thrombozytenoberfläche beschrieben. The following is the application of the method according to the invention to detect increased thrombin formation at the Platelet surface described.
Es ist wahrscheinlich, daß mit dem Verfahren eine gesteigerte Thromboseneigung wesentlich empfindlicher als mit bisherigen Verfahren erfaßt werden kann. Weder die beschriebene partielle Thromboplastinzeit noch die Aggregationstests sind hierfür geeignet. Bei Anwendung des neuen Meßverfahrens bei Patienten mit einer gesteigerten Thrombozytenzahl (Thrombozytose) fand sich bisher nur bei den Patienten mit manifesten arteriellen oder venösen Thrombosen eine hochgradige Verkürzung der Zeiten bis zur Aggregation und bis zur Gerinnung (siehe Fig. 3), während bei Patienten mit gleich hohen Thrombozytenzahlen ohne Thromboseneigung zwar eine Verkürzung der Reaktionszeiten - Aggregation und Gerinnung -, aber deutlich geringer als bei den Patienten mit Thromboseneigung nachweisbar war (Beispiel s. Fig. 4). Weitere prospektive Untersuchungen müssen die Brauchbarkeit des Verfahrens zur Erkennung einer Thromboseneigung verifizieren.It is likely that the method can detect an increased tendency to thrombosis to be significantly more sensitive than with previous methods. Neither the partial thromboplastin time described nor the aggregation tests are suitable for this. When using the new measurement method in patients with an increased platelet count (thrombocytosis), there was previously only a severe reduction in the time to aggregation and coagulation in patients with manifest arterial or venous thrombosis (see FIG. 3), while in patients with the same high number of platelets without a tendency to thrombosis, although a shortening of the reaction times - aggregation and coagulation -, but significantly less than was detectable in patients with a tendency to thrombosis (example see FIG. 4). Further prospective examinations must verify the usability of the method for detecting a tendency to thrombosis.
In erster Linie sind als Antikoagulantien zur Gerinnungsverzögerung in dem Meßsystem geeignet Hirudin oder andere synthetische Thrombinhemmer, niedermolekulare Heparine und andere, Glykoseaminoglykane (Pentosanpolysulfat, Lactobionsäurederivate) und weitaus geringer natives Heparin, welches von sich aus eine Plättchenaktivierung auslösen kann.They are primarily used as anticoagulants to delay coagulation suitable Hirudin or others in the measuring system synthetic thrombin inhibitors, low molecular weight heparins and other, glycoseaminoglycans (pentosan polysulfate, lactobionic acid derivatives) and far less native heparin, which can trigger platelet activation by itself.
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse von Untersuchungen mit verschiedenen Hirudin-Konzentrationen aufgeführt. Hier zeigt sich, daß die Gerinnungszeit bei 0,5 µg/ml im Mittel 10,8 Min. und bei 0,7 µg/ml 12 Min. beträgt. Mit 1 µg/ml wird die Gerinnungszeit mit 18,4 Min. so lang, daß der Test recht unpraktikabel wird. Die bestgeeignete Endkonzentration für Hirudin liegt zwischen 0,5 und 0,7 µg/ml. Table 1 shows the results of investigations with different hirudin concentrations listed. Here shows that the coagulation time at 0.5 µg / ml averaged 10.8 min. and at 0.7 µg / ml is 12 minutes. With 1 µg / ml the Clotting time of 18.4 minutes so long that the test is right becomes impractical. The most suitable final concentration for Hirudin is between 0.5 and 0.7 µg / ml.
Bezüglich der Wahl der Drehzahl der Scheibenküvette sind im Prinzip Drehzahlen zwischen 10 und 60 Min. möglich. Mit zunehmender Drehzahl wird die Aggregations- und Gerinnungszeit nur gering verkürzt, zur Zeit wird im wesentlichen eine Drehzahl von ca. 20 UPM verwendet.Regarding the choice of the speed of the disc cuvette are in Principle speeds between 10 and 60 minutes possible. With The speed of aggregation and clotting increases only slightly shortened, at the moment there is essentially one Speed of about 20 RPM used.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Untersuchung von Vorgängen, die die Thrombinbildung unter den gewählten Meßbedingungen beeinflussen. Hierzu eignet sich besonders der Ersatz der Küvettenwände durch Endothelzellen oder durch andere natürliche und künstliche Oberflächen. So hat sich z. B. gezeigt, daß an einer endothelbeschichteten Küvette die Thrombinbildung und die hierdurch bedingte Aggregation und Gerinnung nicht beobachtet werden können. Wird ein größerer Teil der Endothelzellen an einer Küvettenwand geschädigt, so kann man durch mikroskopische Beobachtung der Küvettenwände erkennen, daß zwischen den geschädigten Endothelzellen an der Küvettenwand ähnlich wie in einem Blutgefäß die Thrombozyten haften bleiben und lokal ein kleines Fibringerinnsel entsteht, während die Gesamtprobe flüssig bleibt. Diese Meßbedingungen sind den Verhältnissen in vivo schon sehr weitgehend angenähert. Sie lassen erhoffen, daß man mit dem ursprünglichen System und auch mit abgewandten Meßsystemen die Wirkung thrombosehemmender Medikamente besser beurteilen kann, als das bisher mit in vitro-Testen möglich war. Insbesondere lag bisher das Augenmerk bei derartigen Verfahren entweder auf der Erfassung einer gerinnungshemmenden Wirkung oder auf der Erfassung einer thrombozytenfunktionshemmenden Wirkung. Mit dem neuen Verfahren ist es möglich, besonders die Interaktion der beiden an der Blutstillung beteiligten Partner: Thrombozyten und Blutgerinnung zu erfassen.The method according to the invention is also suitable for investigation of processes that prevent thrombin formation among the influence the selected measurement conditions. This is suitable especially the replacement of the cuvette walls with endothelial cells or through other natural and artificial surfaces. So z. B. shown that on an endothelium coated Cuvette the thrombin formation and the resulting Aggregation and coagulation cannot be observed. Becomes a larger part of the endothelial cells on a cuvette wall damaged, you can by microscopic observation of the Cell walls recognize that between the damaged Endothelial cells on the cuvette wall similar to those in one The blood platelets adhere and stick locally small fibrin clot is formed during the whole sample stays fluid. These measurement conditions are the conditions Already largely approximated in vivo. You hope that you can with the original system and also with averted Measuring systems the effect of thrombosis-inhibiting drugs can judge better than previously with in vitro tests was possible. In particular, the focus has so far been on such procedures either on the detection of a anticoagulant effect or on the detection of a antiplatelet effect. With the new Procedure it is possible, especially the interaction of the two partners involved in hemostasis: platelets and To detect blood clotting.
Das System eignet sich auch zur Untersuchung der an der Thrombinbildung auf den Thrombozyten beteiligten Einzelreaktionen, die bisher noch nicht hinreichend bekannt sind. Zum Beispiel ist bisher unklar, wieviele Thrombin-Rezeptoren es auf der Thrombozytenoberfläche gibt. Weiterhin ist das Verfahren geeignet zur Erfassung von Medikamentenwirkungen, insbesondere wird eine Erklärung des Wirkmechanismus von Glykosaminoglykanen erwartet, anhand von Blutproben von Patienten, die mit diesen Medikamenten behandelt werden und die mit Hirudin teilantikoaguliert wurden.The system is also suitable for the investigation of the Thrombin formation on the platelet involved individual reactions, that are not yet well known. For example So far it is unclear how many thrombin receptors there are on the Platelet surface there. Furthermore, the procedure suitable for recording drug effects, in particular will explain the mechanism of action of glycosaminoglycans expected based on blood samples from patients who to be treated with these drugs and those with hirudin were partially anticoagulated.
Es ist noch nicht absehbar, welche bekannten thrombosehemmenden Prinzipien mit dem neuen Meßsystem erfaßt werden.It is not yet clear which known thrombosis-inhibiting drugs Principles can be captured with the new measuring system.
Der Kern der Erfindung, verglichen mit den bisherigen Verfahren, liegt daher in folgendem:The essence of the invention compared to the previous ones Procedure, therefore lies in the following:
-
1. Es ist ein empfindliches Verfahren, das die Thrombinbildung
an der Thrombozytenoberfläche und die dadurch
anschließend ausgelöste Gerinnung registriert. Ein
solches Verfahren stand bisher nicht zur Verfügung. Die
Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt
zustande durch
- a) die Wahl eines Teilantikoagulanz, d. h. eine Menge einer gerinnungshemmenden Substanz, die Blut nicht vollständig ungerinnbar macht, aber die Gerinnung für mehrere Stunden verzögert. Die optimalen Bedingungen (auch die Mischungsverhältnisse) müssen für jedes Antikoagulanz neu bestimmt werden. Dies ist dem Fachmann anhand weniger Versuche möglich. Sie betragen für das niedermolekulare Heparin- Präparat Fraxiparin beispielsweise 5-10 µg/ml Blut und für Hirudin 0,5-0,7 µg/ml Blut.
- a) the choice of a partial anticoagulant, ie an amount of an anticoagulant that does not make blood completely non-coagulable, but delays clotting for several hours. The optimal conditions (also the mixing ratios) have to be determined anew for each anticoagulant. The person skilled in the art can do this on the basis of a few experiments. They are, for example, 5-10 µg / ml blood for the low-molecular heparin preparation fraxiparin and 0.5-0.7 µg / ml blood for hirudin.
-
2. Die Verwendung des bereits bekannten Prinzips der
Untersuchung der spontanen Aggregation der Thrombozyten
in einer Scheibenküvette (vgl. die DE-AS 24 08 214)
wurde hier abgewandelt, um einen ausreichenden Kontakt
zwischen Blutplättchen und Küvettenwand herzustellen, der
zu einer Teilaktivierung der Thrombozyten führt, die
ihrerseits die Thrombinbildung an den Thrombozyten und
anschließend die in der Gesamtprobe erfolgende Gerinnung
(Fibrinbildung) auslöst.
Aus diesen neuen Meßbedingungen resultiert der entscheidende Gewinn an Empfindlichkeit.2. The use of the already known principle of examining the spontaneous aggregation of platelets in a disc cuvette (cf. DE-AS 24 08 214) was modified here in order to produce sufficient contact between platelets and cuvette wall, which leads to partial activation of the platelets , which in turn triggers platelet formation and then coagulation (fibrin formation) in the overall sample.
The decisive gain in sensitivity results from these new measuring conditions.
Vergleichende Untersuchungen zwischen dem neuen Meßverfahren und Tierversuche zur Erfassung einer thrombosehemmenden Wirkung sind vorgesehen.Comparative studies between the new measurement method and animal studies to detect a thrombosis-inhibiting Effects are provided.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere wichtige Merkmale ergeben. Die Figuren zeigen Diagramme, wobei über der Zeit das Lichtdurchlässigkeitsvermögen verschiedener Proben gemessen wurde, wie dies weiter unten noch näher erläutert wird. Die Meßapparatur entspricht dabei im Prinzip derjenigen nach der schon mehrfach erwähnten deutschen Auslegeschrift 24 08 214.The invention is described below using exemplary embodiments explained in more detail, which are other important features surrender. The figures show diagrams The light transmittance of various samples was measured as will be explained in more detail below. The The measuring apparatus corresponds in principle to that of the German interpretation 24 08 214 already mentioned several times.
Blutproben werden unter Zugabe einer geringen Menge eines gerinnungsverzögernden Mittels (z. B. Hirudin oder ein niedermolekulares Heparin) entnommen. Aus der Blutprobe wird plättchenreiches Plasma durch Zentrifugieren gewonnen. Das thrombozytenreiche Plasma wird in einer auf 37°C erwärmten rotierenden Scheibenküvette mit 10-60 Umdrehungen (Minute) bis zu 30 Min. lang rotiert. Die Konzentration des "Teilantikoagulanz" ist so gewählt, daß in Normalproben innerhalb von 6-8 Min. eine thrombinbedingte Aggregation des plättchenreichen Plasmas (PRP) eintritt, die unmittelbar von Gerinnung gefolgt ist. Beide Vorgänge (Aggregation und Gerinnung) können aufgezeichnet werden oder einfacher durch Registrierung einer vorgegebenen Änderung der Extinktion (E0,1) erfaßt werden. Bei der Aggregation nimmt die Lichtdurchlässigkeit zu, bei der Gerinnung nimmt sie wieder ab. Störungen des Blutstillungsmechanismus, wie z. B. des milden v. Willebrand-Syndroms mit noch normaler partieller Thromboplastinzeit können mit dem System leicht erfaßt werden, aber das System erfaßt hochempfindlich auch andere Störungen, bei denen die Thrombinbildung an der Thrombozytenoberfläche verzögert ist.Blood samples are taken with the addition of a small amount of one anticoagulant (e.g. hirudin or a low molecular weight heparin). The blood sample becomes platelet-rich plasma obtained by centrifugation. The platelet-rich plasma is heated to 37 ° C in a rotating disc cuvette with 10-60 revolutions (minute) rotates for up to 30 minutes. The concentration of the "partial anticoagulant" is selected so that in normal samples within 6-8 min. A thrombin-related aggregation of the platelet-rich Plasma (PRP) occurs immediately from coagulation followed. Both processes (aggregation and coagulation) can be recorded or easier by registering one predetermined change in absorbance (E0.1) can be detected. When aggregating, the translucency increases, at Coagulation decreases. Disorders of the hemostasis mechanism, such as B. the mild v. With Willebrand syndrome even normal partial thromboplastin time can be achieved with the System can be easily detected, but the system is highly sensitive also other disorders in which thrombin formation is delayed on the platelet surface.
Das Diagramm von Fig. 1 zeigt ein mit der Apparatur nach der erwähnten Auslegeschrift gewonnenes Diagramm, nämlich die Registrierung mit dem plättchenreichen Plasma (PRP) einer gesunden Person (Registrierung 30 Min. nach der Blutentnahme; Antikoagulanz: 5 µg CY 216 (Fraxiparin), pro ml Blut Gerinnungszeit 8 Min. nach Rotationsbeginn, Aggregationszeit 5,7 Min. Der Pfeil A in Fig. 1 gibt den Zeitpunkt der Aggregation an und der Pfeil G den Zeitpunkt der Gerinnung.The diagram of FIG. 1 shows a diagram obtained with the apparatus according to the above-mentioned design specification, namely the registration with the platelet-rich plasma (PRP) of a healthy person (registration 30 minutes after the blood sample; anticoagulant: 5 μg CY 216 (fraxiparin), per ml of blood clotting time 8 minutes after the start of rotation, aggregation time 5.7 minutes. The arrow A in FIG. 1 indicates the time of the aggregation and the arrow G the time of the clotting.
Fig. 2 zeigt das Meßergebnis bei einer Probe eines Patienten mit einem milden v. Willebrand-Syndrom (normale partielle Thromboplastinzeit!), v. Willebrand-Faktor 42% der Norm (Antikoagulation mit 5 µg Fraxiparin/ml Blut). Registrierung 30 Min. nach der Blutentnahme. Die Aggregationszeit A und die Gerinnungszeit G sind im Vergleich zu einer Normalprobe (vgl. Fig. 1) mehr als verdoppelt (Aggregationszeit 17 Min., Gerinnungszeit 19 Min.). Fig. 2 shows the measurement result of a patient with mild v in a sample. Willebrand syndrome (normal partial thromboplastin time!), V. Willebrand factor 42% of the norm (anticoagulation with 5 µg fraxiparin / ml blood). Registration 30 minutes after taking blood. The aggregation time A and the clotting time G are more than doubled in comparison to a normal sample (cf. FIG. 1) (aggregation time 17 minutes, clotting time 19 minutes).
In Fig. 3 wurde eine Thrombozytose (ca. 1 Mill. Thrombozyten/µl) mit Thromboseneigung, Antikoagulation mit 5 µg CY 216 (Fraxinparin/ml Blut) untersucht. Registrierung 30 Min. nach Blutentnahme. Die Aggregationszeit A ist auf 1,7 Min., die Gerinnungszeit G auf 3,5 Min. verkürzt.In Fig. 3 is a thrombocytosis (ca. 1 Mill. Platelets / ul) with thrombosis, anticoagulation with 5 ug CY 216 (Fraxinparin / ml blood) was investigated. Registration 30 minutes after taking blood. The aggregation time A is reduced to 1.7 minutes, the clotting time G to 3.5 minutes.
In Fig. 4 wurde eine Thrombozytose (1 Mill. Thrombozyten/µl), Patient ohne Thromboseneigung, untersucht. Es lagen die gleichen Bedingungen wie in Fig. 3 vor. Die Aggregationszeit A beträgt 5 Min., die Gerinnungszeit G 8 Min.In FIG. 4 is a thrombocytosis was (1 Mill. Platelets / ul), patient without thrombosis examined. The same conditions were present as in FIG. 3. The aggregation time A is 5 minutes, the clotting time G 8 minutes.
In Fig. 5 wurde eine PRP-Probe, die von einem mit Marcumar behandelten Patienten stammt, unter den gleichen Bedingungen untersucht (TPZ 18%). Registrierung 30′ nach Blutentnahme, Antikoagulation nach 5 µg CY 216 ml Blut. Aggregationszeit und Gerinnungszeit betragen <30 Min.In Fig. 5, a PRP sample derived from a Marcumar-treated patient was examined under the same conditions (TPZ 18%). Registration 30 ' after blood collection, anticoagulation after 5 µg CY 216 ml blood. Aggregation time and clotting time are <30 minutes.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient somit zur Erkennung von Störungen der Blutgerinnung und der Thrombozytenfunktion mit bisher nicht erreichter Empfindlichkeit durch Messung der Thrombinbildung an der Thrombozytenoberfläche. Das Verfahren dient ferner zur Erfassung einer gesteigerten Thrombosenneigung durch Verkürzung der Thrombinbildungszeit an der Thrombozytenoberfläche in einer antikoagulierten Blutprobe, sowie zur Erfassung der Wirkung thrombosehemmender Medikamente unter Bedingungen, die den in vivo-Bedingungen näher kommen als bisherige Verfahren und die möglicherweise in Zukunft zum Teil Tierversuche ersetzen können.The method according to the invention thus serves for the detection of Disorders of blood clotting and platelet function with Sensitivity not previously achieved by measuring the Thrombin formation on the platelet surface. The procedure also serves to detect an increased thrombosis tendency by shortening the thrombin formation time on the platelet surface in an anticoagulated blood sample, as well as for Assessment of the effects of antithrombotic drugs under Conditions closer to in vivo conditions than previous procedures and possibly some of them in the future Animal testing can replace.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2286580C1 (en) * | 2005-03-03 | 2006-10-27 | Илья Николаевич Медведев | Method for diagnosing beginning blood platelets aggregation disorders |
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