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Die
Erfindung betrifft die Behandlung von Pilzinfektionen (speziell
Saprolegnia parasitica) von Fischeiern, insbesondere, aber nicht
ausschließlich
Forelle, Lachs und Lachsartige im allgemeinen. Die Erfindung liefert
auch die Behandlung von anderen Fischerkrankungen, wie bakteriellen
Infektionen (beispielsweise bakterielle Kiemenerkrankung – Flavobacterium
branchiophilum und Cytophaga psychrophila), Protozoeninfektionen,
wie die von Ciliaten (beispielsweise Ichthyophtirius multifiliis)
und Flagellatén
(beispielsweise Ichthyobodo necatrix).
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Saprolegnia
parasitica ist ein sich schnell ausbreitender und fataler Pilzparasit,
der sowohl Fische als auch Fischeier befällt. Er wird herkömmlich mit
Malachitgrün
(Diaminotriphenylmethan) behandelt, aber obwohl diese Behandlung
sehr wirksam ist, weist die Verwendung von Malachitgrün mehrere
potentielle Probleme auf: Die Verbindung wurde als mögliches
Carzinogen und Teratogen genannt, obwohl diese Wirkungen bisher
nicht bewiesen sind, da sie ein starker Farbstoff ist, tendiert
sie zur Verfärbung
von Wasser und kann unter bestimmten Umständen eine Färbung des Fisches verursachen,
der behandelt wurde, sie hat eine relativ lange Zurückhalteperiode,
so dass signifikante Rückstande
bei behandeltem Fisch vorhanden sein können, wenn dieser gefischt
und zum Verzehr verkauft wird und die Verbindung ist nicht als Tierarzneimittel
zugelassen und deren Verwendung ist derzeit in US Staatsfischereien
verboten. Der Artikel von D.J. Alderman in Journal of Fish Diseases
8 (1985), 289-298 liefert eine Zusammenfassung der Verwendung von
Malachitgrün
bei der Behandlung von Fischerkrankungen und diskutiert einige der
hiermit assoziierten Probleme.
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Eine
derzeit verfügbare
Alternative zu Malachitgrün
ist Formalin, das die Substanz ist, die derzeit in US Staatsfischereien
verwendet wird. Jedoch kann die Substanz aufgrund ihrer reizenden
Eigenschaften nur unter strikt kontrollierten Bedingungen verwendet
werden. Es besteht daher ein Bedarf für eine verbesserte Behandlung
von Pilzerkrankungen und anderen Erkrankungen bei Fischen, insbesondere
eine, die eine hohe Wirksamkeit mit einer geringen Toxizität vereinigt.
Viele Versuche zur Identifizierung von neuen Behandlungen wurden
in der Vergangenheit versucht und die Ergebnisse des Screenings
von 40 potentiellen Alternativsubstanzen sind im Artikel von D.J.
Alderman beschrieben, der in Journal of Fish Diseases 5 (1982) 113-123
erschienen ist, der auch Standardprotokolle für den Test der Behandlungen
mit den potentiellen Substanzen beschreibt. Jedoch ist trotz dieser
und anderer Arbeiten (wie sie im Artikel von T.A. Bailey beschrieben
sind, der in Acquaculture 38 (1984) 97-104 beschrieben ist) den
Anmeldern nicht bekannt, dass eine geeignete Alternativbehandlung
zu Malachitgrün
und Formalin den Markt erreicht hat.
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Es
wurde nun festgestellt, dass Bronopol (2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol)
eine gute Aktivität
bei relativ geringen Konzentrationen gegen Saprolegnia parasitica
aufweist und sicher anzuwenden ist. Bronopol ist eine bekannte Verbindung
und wird in Konzentrationen zwischen 0,01 und 0,2 % als antimikrobielles
Konservierungsmittel und Antiseptikum in topischen pharmazeutischen
Formulierungen, Kosmetika und Toilettenartikel verwendet.
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Kombinationen
mit Bronopol sind auch in der Tiermedizin bekannt. Beispielsweise
bezieht sich die
GB 2
263 063 A auf eine Kombination aus Bronopol, Formaldehyd
und einem quarternären
Ammoniumsalz, die bei der Behandlung von Ulcerationen, bakerieller
Kiemenerkrankung und systemischen bakteriellen Infektionen wirksam
ist. Es werden keine Effekte des Bronopol enthaltenden Gemisches
bei der Behandlung von Pilz- oder Myxobakterieninfektionen bei Fischeiern
erwähnt.
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Die
HU 38 833 beschreibt ein Gemisch
aus Bronopol, Bradophen und Silicon, das tiermedizinische Anwendung
als Fungizid aufweist, jedoch wird nicht erwähnt, ob ein solches Gemisch
in einer wässrigen
Umgebung auf Fisch oder andere Wasserorganismen wirksam wäre.
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Es
ist jedoch in "Handbook
of Pharmaceutical Excipients",
das von The Pharmaceutical Press (1994) veröffentlicht wurde, beschrieben,
dass einer der Hauptnachteile von Bronopol die relativ schwache
Aktivität gegen
Hefen und Schimmelpilze ist. Es ist daher überraschend, dass Bronopol
bei relativ geringen Konzentrationen gegen Saprolegnia wirksam ist.
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Wie
dies detaillierter beschrieben wird, wurde von Bronopol gezeigt,
dass es gegen Saprolegnia parasitica Infektion bei Lachs, Forelle
und Forelleneiern wirksam ist. Es wird jedoch daher erwartet, dass
die Behandlung gegen dieselbe Infektion in anderen lachsartigen
Spezies und auf jeden Fall bei Fischeiern wirksam ist. Es wird erwartet,
dass es auch eine Wirksamkeit gegen andere Pilzinfektionen gibt.
Ferner kann es auch als prophylaktisches Mittel verwendet werden,
da von Bronopl in den später
beschriebenen Versuchen gezeigt wurde, dass es das Ausbreiten der
Infektion verhindert oder verlangsamt.
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Bronopol
ist ein im Handel erhältliches
Produkt, das von einer Vielzahl an Quellen verfügbar ist. Es kann durch die
Umsetzung von Nitromethan mit Paraformaldehyd in einer alkalischen
Umgebung, gefolgt von einer Bromierung hergestellt werden. Es ist
auch bekannt, dass einige Verbindungen (wie 5-Brom-5-nitro-1,3-dioxan) unter Freisetzung
von Bronopol zerfallen und die Erfindung betrifft daher auch die
Verwendung solcher Verbindungen anstelle von Bronopol.
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Daher
liefert die Erfindung in einem Aspekt die Verwendung von Bronopol
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe
von Pilzinfektionen bei Fischeiern. Genauer gesagt betrifft die
Erfindung die Verwendung von Bronopol bei der Behandlung und/oder
Prophylaxe von Saprolegnia parasitica. Eine bestimmte Verwendung
der Erfindung ist die Behandlung von Fischeiern von Lachsartigen,
insbesondere Forelle und Lachs.
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Die
Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung von Bronopol zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Fischeiern, die
an einer Pilzinfektion leiden, durch die Verabreichung von Bronopol
in einem Behandlungsbad in einer pharmazeutisch wirksamen Menge.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren das Anhalten des Wasserdurchflusses
durch das Bad während
der Verabreichung der Behandlung, vorzugsweise für einen Zeitraum von nicht
weniger als 30 Minuten.
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Vorzugsweise
liegt die Konzentration von Bronopol im Behandlungsbad im Bereich
von 1 mg/l (ppm) bis 1000 mg/l, vorzugsweise 5 mg/l bis 200 mg/l
und idealerweise 10 mg/l bis 100 mg/l. Bronopol ist eine feste kristalline
Substanz und kann als Lösung
in einem polaren Lösemittel
wie Wasser oder Dowanol (Dipropylenglycolmonoethylether) hergestellt
werden.
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Der
Versuch 1 (siehe später)
wird in schwach alkalischen Bedingungen (etwa pH 7,4 bis 7,5) ausgeführt und
es ist möglich,
dass diese Bedingungen für
die durch Bronopol gezeigte Antipilzaktivität vorteilhaft sind.
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Während der
Versuche wird Bronopol auch gegen andere Fischerkrankungen getestet
und ist wirksam gegen Ichthyobodo nécatrix, der ein ektoparasitärer Flagellatenprotozoe
ist, Flavobacterium branchiophilum (der verursachende Organismus
der bakteriellen Kiemenerkrankung) und Cytophaga psychrophila, das
ein Myxobakterium ist und der verursachende Organismus des Regenbogenforellensyndroms,
der Kaltwassererkrankung, der Sattelrücken- und Hirnstielerkrankung
bei lachsartigen Fischen. Die Aktivität gegen Cytophaga zeigt eine
mögliche
Wirkung gegen Myxobakterien im allgemeinen und die Aktivität gegen
Ichthyobodo fegt auch eine Wirksamkeit gegen Flagellaten im allgemeinen,
wie auch Ciliatenprotozoen, wie Ichthyophthirius multifiliis nahe.
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Daher
weitet ein weiterer Aspekt der Erfindung die Verwendung von Bronopol
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe
einer Protozoeninfektion, wie durch einen Flagellaten (beispielsweise
Ichthyobodo necatrix) oder einen Ciliaten (wie Ichthyophthirius
multifiliis) bei Fisch oder anderen Wasserorganismen, insbesondere
lachsartigem Fisch und speziell Forelle aus.
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In
einem alternativen Aspekt erstreckt sich die Erfindung auf die Verwendung
von Bronopol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung
oder Prophylaxe einer bakteriellen Kiemenerkrankung (beispielsweise
Flavobacterium branchophilum) bei Fisch oder anderen Wasserorganismen,
insbesandere lachsartigem Fisch und speziell Forelle.
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Die
Erfindung umfasst auch die Verwendung von Bronopol zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung solcher Protozoen- oder Flavobakterieninfektionen
bei Fischen oder anderen Wasserorganismen durch die Verabreichung
von Bronopol in einem Behandlungsbad in einer pharmazeutisch wirksamen
Menge. Vorzugsweise wird Bronopol in einer Konzentration zwischen
1 und 500 mg/l, bevorzugter zwischen 10 und 100 mg/l verabreicht.
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Es
ist möglich,
dass Bronopol auch bei der Behandlung von Fischen wirksam ist, die
an einer Myxobakterieninfektion leiden und die Erfindung erstreckt
sich daher auch auf die Verwendung von Bronopol zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Myxobakterieninfektionen
(insbesondere Cytophaga psychrophila) von Fisch oder anderen Wasserorganismen,
insbesondere lachsartigem Fisch und speziell Forelle.
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Die
Erfindung wird hierin später
im Detail durch Beispiele unter Bezugnahme auf die folgenden Experimente
beschrieben.
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Versuch 1
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In vitro Wirksamkeit von
Bronopol gegen Saprolegnia parasitica
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Dieser
Versuch wird mittels der in Journal of Fish Diseases (1982) 5, 113-123
beschriebenen Verfahren ausgeführt,
die oben zitiert sind.
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Herstellung des Impfguts
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Eine
Kultur von Saprolegnia parasitica wird bei 16°C auf Agar aus Flusswasser,
Glucose, Hefeextrakt (RGY) gehalten, der Hefeextrakt (1 g), D-(+)-Glucose
(5 g) und Agar (12 g) in 1 l Flusswasser enthält. Die RGY Platten werden
mit dem Testorganismus angeimpft und bei 25°C inkubiert, bis das Wachstum
gerade den vollen Durchmesser der Platte bedeckt (etwa 72 Stunden).
Es werden Scheiben aus den äußeren 10
mm der Kultur mittels einer Stanzvorrichtung mit 4 mm (konstruiert
aus einer Gelchromatographievertiefungsstanzvorrichtung, an die
ein Griff angebracht wurde) und als Standardimpfgut für die Tests
verwendet.
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Test 1A
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Verfahren
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Bronopol
wird auf eine Aktivität
gegenüber
Saprolegnia parasitica Kulturen bei verschiedenen Konzentrationen,
die von 50 mg/l bis 100 mg/l reichen, unter Verwendung des Protokolls
II des vorher erwähnten
J. Fish Diseases Artikel folgendermaßen getestet. Es werden Polycarbonatfiltermembranen
mit einer Porosität von
0,2 μm und
einem Durchmesser von 25 mm (Nuclepore, Sterlin) sterilisiert und
dann auf die Oberfläche von
RGY Platten (7 pro 90 mm Petrischale) gegeben. Dann wird ein 4 mm
Scheibenstandardimpfgut invertiert im Zentrum des Filters platziert.
Die die Filter enthaltenden Schalen werden dann inkubiert, bis die
entstehende Myzelmatte fast die Kante der Filter erreicht hat. Das
ursprüngliche
Impfgut wird dann (soweit möglich)
mittels heißer
Pinzettenspitzen abgezogen, um die Zerstörung der lose haftenden Myzelmatte
zu vermeiden. Die Myzelmatten werden zusammen mit den Trägerfiltern
von der Agaroberfläche
der Filter abgehoben, in leere, sterile Petrischalen überführt und
vollständig
in die Bronopollösung
in ausgewählten
Konzentrationen eingetaucht. Am Ende der 1 Stunde betragenden Expositionszeit
wird die Bronopollösung
durch Absaugen entfernt und durch 2 Waschschritte mit sterilem Flusswasser
(jeweils für
5 und 30 Minuten) ersetzt, bevor die Myzelmatte und die Filter mit
dem Filter als oberstes auf die Oberfläche einer frischen RGY Platte überführt werden. Nach
einer Inkubation bei 16°C
für 24
Stunden wird jedes neue Wachstum über die Kanten der Filter an
4 Punkten um das Filter herum in Abständen von 90° gemessen.
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Das
Experiment wird mittels 6 getrennter Kulturproben bei jeder Bronopolkonzentration
ausgeführt und
wird unter Verwendung von Malachitgrün anstelle von Bronopol wiederholt.
Es wird. auch ein Negativkontrolltest ohne Wirkstoff ausgeführt. Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.
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Tabelle
1A Radiales
Wachstum in mm nach einer Exposition für 24 Stunden gegenüber dem
Testkonzentrationsbad
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Diskussion
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In
diesem Test werden nackte Pilzhyphen gegenüber Bronopol exponiert, was
einen hemmenden Effekt gegen anschließendes vegetatives Wachstum
bei 50 ppm für
5 Minuten zeigt. Eine Exposition für 10 Minuten bei 500 ppm verhindert
das gesamte vegetative Wachstum bei diesem Testverfahren.
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Test 1B
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Verfahren
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In
diesem Test wird Bronopol auf eine Wirksamkeit gegenüber Saprolegnia
parasitica unter Verwendung des anspruchsvolleren Protokolls III
des vorher erwähnten
J. Fish Diseases Artikels getestet, wobei das Verfahren folgendermaßen abläuft:
Vier
scheibenförmige
Impfmaterialien werden in jedes Kompartiment einer sterilen Replidish
(25 Kompartimentierungen in 5 Reihen, Sterilin) gegeben. Fünf unterschiedliche
Testkonzentrationen werden für
5 verschiedene Expositionszeiten angewendet und können so
vierfach in einer Schale ausgeführt
werden. Die Testkonzentrationen werden aseptisch in Volumina von
2,5 ml zu jedem Kompartiment für
die Standardexpositionszeiten gegeben, die 5, 10, 20, 40 und 80
Minuten betragen. Am Ende der einzelnen Expositionszeiten werden
die Testlösungen
aus den Kompartimenten durch Absaugen entfernt. Jeder Satz Scheiben
wird dann in situ mit einem zweimaligen Wechsel an sterilem Flusswasser
gewaschen (jeweils für
5 und 30 Minuten) und dann in weiteren 2,5 ml an sterilem Flusswasser
in situ für
72 Stunden bei 16°C
inkubiert. Anschließend
werden die Scheiben unter einem Stereomikroskop mittels einer transmittierten
Dunkelfeldbeleuchtung untersucht und auf das Vorkommen oder die
Abwesenheit von neuem Wachstum auf der Agarscheibenoberfläche ausgewertet.
In allen Zweifelsfällen,
insbesondere an der Grenzlinie zwischen Wachstum und keinem Wachstum
werden die Scheiben in RGY für
weitere 72 Stunden bei 16°C überführt, um
genau die Lebensfähigkeit
des Mycels innerhalb der Scheibe zu bestimmen. Der Test wird wiederholt,
wobei Malachitgrünoxalat
anstelle von Bronopol verwendet wird.
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Die
Ergebnisse werden sowohl als Effekt auf die Zoosporulation als auch
in Bezug auf die Wirkung auf das vegetative Wachstum ausgedrückt und
sind in den folgenden Tabellen gezeigt:
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Tabelle
1B (i) Bronopol – Wirkung
auf die Zoosporulation (prozentuale Hemmung)
-
Tabelle
1B (ii) Malachitgrünoxalat – Wirkung
auf die Zoosporulation (prozentuale Hemmung)
-
Tabelle
1B (iii) Bronopol – Wirkung
auf das vegetative Wachstum (prozentuale Hemmung)
-
Tabelle
1B (iv) Malachitgrünoxalat – Wirkung
auf das vegetative Wachstum (prozentuale Hemmung)
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Diskussion
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Bronopol
hat einen deutlichen Effekt auf die unmittelbare Zoosporulation
bei so kurzen Expositionen wie 5 Minuten und Konzentrationen von
100 ppm oder (möglicherweise)
wenige. Dieser Test verwendet ein Agarstopfenverfahren, worin der
das Myzel enthaltende Agar offensichtlich einen Schutz für die Hyphen
bietet, aber Bronopol immer noch penetriert und eine Exposition
für 20
Minuten bei 1000 ppm das gesamte anschließende Wachstum verhindert und
diese Konzentration auch einen signifikanten Effekt bei so kurzen
Zeiten wie 5 Minuten aufweist. Ferner scheint die geringere Exposition
bei 100 ppm für
80 Minuten ebenfalls einen hemmenden Effekt aufzuweisen.
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Versuch 2
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In
vivo Wirksamkeit von Bronopol gegen Saprolegnia parasitica Infektion
bei Forelleneiern Etwa 913 000 Regenbogenforelleneier werden in
diesem Versuch verwendet, der zwischen drei Farmstationen aufgeteilt wird.
In jedem Fall werden die Eier sorgfältig in Wasser bei gleicher
Temperatur getaucht, nachdem alle Fäkalien, Blut oder weiße (tote)
Eier entfernt wurden. Die Eier werden verfolgt, bis sie das Augenstadium
erreicht haben und werden dann durch Fallenlassen in Wasser aus
einer Höhe
von etwa 0,5 m geschockt. Der Zweck des Schocks ist es, alle schwachen
oder unfruchtbaren Eier zu töten,
die aufgrund der Ruptur der inneren Membran weiß werden. Tote Eier werden
entfernt und gezählt.
Der Versuch wird fortgesetzt, bis die Eier schlüpfen, wonach tote Eier erneut
entfernt und gezählt
werden. Während
des Versuchs wird das Maß an
Pilzinfektion (aufgrund von Saprolegnia) verfolgt.
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Die
erste Farmstation (Station 1) wird mit Grundwasser betrieben und
die Eier werden in einem Trog und Schalensystem nach dem Ablaichen
bis zum Schlüpfen
gehalten. Die Inkubatorvolumina betragen 101 l mit einer Wasseraustauschgeschwindigkeit
von 40 l/min (wobei die Zeit für
den Wasseraustausch 2,5 Minuten beträgt).
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Die
Station 2 wird auch mit Grundwasser betrieben. Nach dem Ablaichen
bis zum Schock werden die Eier in vertikalen Inkubatoren mit einem
Volumen von 20 l gehalten. Die Wasseraustauschgeschwindigkeit beträgt 13,6
l/min und die Zeit für
den Wasseraustausch 1,5 Minuten. Vom Schock bis zum Schlüpfen werden
die Eier in einem Trog und Schalensystem gehalten, wobei die Inkubatorvolumina
145 l betragen und die Wasseraustauschgeschwindigkeit 27 l/min beträgt (die
Wasseraustauschzeit beträgt
5,4 Minuten). Die Eier an der Station 2 werden in 3 Ansätze eingeteilt,
die getrennt und zu unterschiedlichen Zeiten getestet werden.
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Die
Station 3 wird mit Flusswasser betrieben und die Eier werden in
einem Trog und Schalensystem nach dem Ablaichen bis zum Schlüpfen gehalten.
Die Inkubatoren haben ein Volumen von 190 l mit einer Wasseraustauschgeschwindigkeit
von 10 l/min und einer Wasseraustauschzeit von 19 Minuten.
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An
jeder Station (und für
jeden Ansatz in Station 2) werden die Eier in 3 Behandlungsgruppen
aufgeteilt, wobei eine eine Bronopolbehandlung, eine eine Malachitgrünbehandlung
und eine keine Behandlung erhält
(um als Negativkontrolle zu dienen). Die Anzahl an Eiern in jeder
Gruppe ist wie folgt:
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Tabelle
2A Anzahl
an Eiern pro Behandlungsgruppe
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Bronopol
wird bei einer Konzentration von 500 g/l oben auf die Inkubatoren
gegeben und über
die Eier durch das hereinkommende Wasser verteilt. Der Wasserfluss
wird dann abgeschaltet, wenn die Behandlung etwa halb durch den
Trog gelaufen ist. Es wird dann ein Ansatz für 30 Minuten gebildet, worin
die Konzentration des Bronopols im allgemeinen im Bereich von 1
mg/l bis 50 mg/l liegt.
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Malachitgrün wird als
Spülbehandlung
verwendet. Es wird oben auf den Inkubator verabreicht und mit dem
hereinkommenden Wasser durch die Eier gespült (der Wasserfluss wird nicht
abgeschaltet). Dies ist das gewöhnliche
Verfahren an allen Stationen. Die Dosierung variiert von Station
zu Station wie folgt: Station 1 15 mg/l, Station 2 40 mg/l, Station
3 5 mg/l.
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Die
Eier sowohl in den Bronopol- als auch Malachitgrüngruppen werden jeden Tag nach
dem Ablaichen bis zum Schlüpfen
behandelt.
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Das
Pilzwachstum wird visuell als Prozentsatz an Eiern, die mit Pilzwachstum
bedeckt sind, jeden zweiten Tag der Studie an den Stationen 1 und
2 und jeden Tag an der Station 3 visuell ermittelt. Die Ergebnisse
sind graphisch in den
1 bis
3 dargestellt
und sind in der folgenden Tabelle 2B zusammengefasst: Tabelle
2B Prozentsatz
an Behandlungstagen mit dem Ausmaß an Pilzwachstum
-
Die
Tabelle 2B zeigt, dass Bronopol zu keinem Pilzwachstum für 46,63
% der Tage führt,
die die Eier behandelt werden. Dies kann mit 41,57 % für Malachitgrün und 28,09
%, wenn keine Behandlung angewendet wird, verglichen werden. Sowohl
Bronopol als auch Malchitgrün
verhindern, dass die Eier zu mehr als 25 % mit Pilzwachstum bedeckt
werden.
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Tote
Eier werden gezählt
und beim Schock und Schlüpfen
entfernt und die Anzahl an toten Eiern wird für jeden Fall in den folgenden
Tabellen 2C bis 2K aufgeführt.
Die Tabellen 2 L und 2 M zeigen die Gesamtmortalitäten jeweils
beim Schock und Schlüpfen.
(Die Station 1 berichtet keine Mortalitäten beim Schlüpfen und daher
kommt der geringere ursprüngliche
Wert in Tabelle 2 M).
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Tabelle
2C Anzahl
an toten Eiern nach dem Schock in der Station 1
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Tabelle
2D Anzahl
an toten Eiern nach dem Schock in der Station 2 (Ansatz 1)
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Tabelle
2E Anzahl
an toten Eiern nach dem Schock in der Station 2 (Ansatz 2)
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Tabelle
2F Anzahl
an toten Eiern nach dem Schock in der Station 2 (Ansatz 3)
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Tabelle
2G Anzahl
an toten Eiern nach dem Schock in der Station 3
-
Tabelle
2H Anzahl
an toten Eiern nach dem Schlüpfen
in der Station 2 (Ansatz 1)
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Tabelle
2I Anzahl
an toten Eiern nach dem Schlüpfen
in der Station 2 (Ansatz 2)
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Tabelle
2J Anzahl
an toten Eiern nach dem Schlüpfen
in der Station 2 (Ansatz 3)
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Tabelle
2K Anzahl
an toten Eiern nach dem Schlüpfen
in der Station 3
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Tabelle
2L Zusammenfassung
der Anzahl an toten Eiern nach dem Schock
-
Tabelle
2M Zusammenfassung
der Anzahl an toten Eiern nach dem Schlüpfen
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Schlussfolgerung
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Bronopol
scheint bei der Kontrolle von Pilzinfektionen bei lachsartigen Eiern
genauso wirksam zu sein, wie Malachitgrün. Die Gesamtmortalitäten beim
Schlüpfen
sind für
Malachitgrün
und Bronopol niedriger als die Negativkontrolle mit jeweils 14,20
%, 17,70 % und 47,66 % an toten Eiern.
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Versuch 3 – Referenzversuch
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In vivo Wirksamkeit von
Bronopol gegen Saprolegnia parasitica Infektion bei Lachs
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Verfahren
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105
Atlantiklachse (Salmon salar) gemischten Geschlechts mit einem Alter
von etwa 8 Monaten, die im Mittel etwa 30 g wiegen, werden in drei
Behandlungsgruppen von jeweils 35 Fischen eingefeilt. Jede Gruppe
wird in frischem Wasser bei 12,5°C
in einem 210 Liter Fiberglastank gehalten. Die Fische werden täglich mit
2 % ihres Körpergewichts
an "Biomar" Produktionsfutter
gefüttert.
Nach 2 Wochen Akklimatisierung werden alle drei Gruppen künstlich
mit Saprolegnia parasitica infiziert, wobei der Tag der Infektion
als Tag 0 des Versuchs bezeichnet wird. Die Gruppen werden dann
an den Tagen 1, 3 und 5 folgendermaßen behandelt:
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Am
Tag 8 des Versuchs werden alle Fische getötet und das Infektionsausmaß jedes
Fisches wird gemäß dem folgenden
Bewertungssystem untersucht:
- (*Tote
Fische werden entfernt, wenn Todesfälle auftreten, um die Kontamination
des Wassers zu vermeiden).
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Ergebnisse
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Die
Anzahl an Fischen in jeder Kategorie des obigen Bewertungssystems
und die Gesamtbewertung für
jede Gruppe sehen folgendermaßen
aus:
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Die
kumulativen Mortalitätszahlen
für jeden
Versuchstag sind graphisch in 4 angegeben.
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Schlussfolgerung
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Bionopol
ist gegen eine Saprolegnia Infektion wirksam und verringert auch
die Mortalitäten
um 50 % im Vergleich sowohl zu der Gruppe ohne Behandlung als auch
zu der mit Malachitgrün
behandelten.
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Versuch 4-Referenztest
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In vivo Wirksamkeit von
Bronopol gegen Ichthyobodo necatrix Infektion in der Regenbogenforelle
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Verfahren
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Regenbogenforellen
(Oncorhyncus mykiss) mit einem mittleren Gewicht von 15 g werden
in diesem Versuch verwendet und in einem gemeinsamen Becken mit
6 Individuen zusammengebracht, die stark mit Ichthyobodo infiziert
sind. Die Infektion der vorher gesunden Individuen wird nach 5 Tagen
durch eine Mikroskopie von entnommenen Kiemenproben bestätigt. Die
Bronopolbehandlung wird einer Gruppe von 20 Fischen unter Verwendung
desselben Verfahrens wie in Versuch 3 verabreicht. Der Versuch wird
mittels einer Gruppe an 19 infizierten Fischen wiederholt, die mit
Formalin (einer Standardbehandlung für Ichthyobodo) behandelt werden, wobei
eine weitere Gruppe an 20 infizierten Fischen keine Behandlung erhält und als
Kontrolle wirkt. 7 Tage nach der Behandlung wird die mittlere Anzahl
an Parasiten pro Kiemenfilament in jeder Gruppe (durch Zählen der
Anzahl an Parasiten bei 5 Fischen auf jeweils 10 Filamenten) ermittelt
und nach 14 Tagen wird eine weitere Zählung ausgeführt, wobei
die einzelnen Fische entweder als ohne Infektion kategorisiert werden
oder in eine von 4 infizierten Kategorien gemäß dem Ausmaß der Infektion eingeteilt
werden. Ergebnisse
- Keine Mortalitäten beobachtet
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Schlussfolgerung
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Bronopol
zeigt eine gute Aktivität
gegen eine Ichthyobodo Infektion bei der Regenbogenforelle. Obwohl
es weniger wirksam als Formalin ist, trägt dessen Verwendung weniger
Risiko. Es kann angenommen werden, dass Bronopol eine ähnliche
Wirksamkeit gegen eine Ichthyobodo Infektion in anderen Lachsartigen und
bei Fisch und Wasserorganismen im allgemeinen aufweist und dass
es auch bei der Prophylaxe dieser Erkrankung brauchbar ist.
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Versuch 5
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In vitro Wirksamkeit von
Bronopol gegen Cytophaga psychrophila
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Verfahren
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Zuerst
wird die minimale bakterizide Konzentration (MBC) für Bronopol
gegen Cytophaga psychrophila etabliert, indem man den Organismus
in Medium anzieht und dann unterschiedliche Verdünnungen an Bronopol zugibt,
um zu ermitteln, welche Konzentration Cytophaga töten könnte.
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Dann
werden basierend auf den MBC Ergebnissen die Kontaktzeiten ermittelt,
die zum Töten
von Cytophaga erforderlich sind. Eine bekannte Anzahl an lebensfähigen Bakterien
wird zu destilliertem Wasser gegeben und gegenüber verschiedenen Konzentrationen
an Bronopol für
2 bis 40 Minuten exportiert. Dann werden die Bakterien durch Filtration
extrahiert und die extrahierten Bakterien werden auf die Lebensfähigkeit
getestet, indem man ihr Wachstum in einem Kulturmedium durch Messen
der optischen Dichte bei 520 nm untersucht.
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Ergebnisse
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Die
Ergebnisse werden graphisch in 5 dargestellt.
Die minimale Testkonzentration, die wirksam ist, beträgt 5 mg/l
(ppm), es ist aber wahrscheinlich, dass die tatsächlich minimal wirksame Konzentration
zwischen 1 mg/l und 5 mg/l liegt. Es wird auch festgestellt, dass
eine Expositionszeit von bis zu 40 Minuten erforderlich ist, um
das bakterielle Wachstum nach einem Wiederanimpfen auf frisches
Medium zu verhindern, wenn Konzentrationen zwischen 5 mg/l und 400
mg/l verwendet werden, wobei die erforderliche Expositionszeit bei
einer Konzentration von 1000 mg/l auf etwa 4 Minuten und bei 2000
mg/l auf etwa 2 Minuten verringert wird.
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Schlussfolgerung
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Von
Bonopol wird gezeigt, dass es gegen Cytophaga psychrophila bei so
geringen Konzentrationen wie 5 mg/l wirksam ist. Cytophaga ist ein
Beispiel für
die Bakteriengruppe, die als Myxobakterien bekannt ist, die durch
eine schützende
Mukopolysaccharidschicht gekennzeichnet sind und die im allgemeinen
gegen Desinfektionsmittel resistent sind (beispielsweise beträgt die Dosis
an Iodophordesinfektionsmittel, die zum Töten von Cytophaga erforderlich
ist, etwa 2000 mg/l). Basierend auf den bekannten Verwendungen von
Bronopol ist diese Aktivität
daher überraschend
und kann eine Aktivität
gegen Myxobakterien im allgemeinen anzeigen. Bronopol dürfte eine
geeignete Desinfektionsbehandlung für Fischtanks und deren Ausrüstung sein
und kann auch bei der Behandlung und/oder Prophylaxe für verschiedene
Erkrankungen brauchbar sein, die durch diesen Organismus bei Forellen
oder anderen lachsartigen Fischen verursacht werden und ebenfalls
(falls diese auftreten) bei anderen Fischen und Wasserorganismen.
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Versuch 6 – Referenzversuch
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In vivo Wirksamkeit von
Bronopol gegen eine Infektion von Flavobacterium branchophilum bei
der Regenbogenforelle
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Mehrere
Tanks mit jeweils 150 Regenbogenforellen mit einer Besatzdichte
von 100 g/l werden in diesem Experiment einbezogen. Der Fisch ist
im Mittel 15 g groß.
Die Wassertemperatur beträgt
11°C und
das Wasser wird mit einer Geschwindigkeit von einmal pro Stunde
ausgetauscht.
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Ein
Fischtank wird als Negativkontrolle gehalten und weder infiziert
noch behandelt. Ein zusätzlicher Tank
wird infiziert, aber nicht behandelt, um als Positivkontrolle zu
dienen. Zwei Tanks werden mit Chloramin-T (eine herkömmliche
Behandlung) mit einer Konzentration von 10 mg/l behandelt. 3 Tanks
werden mit Bronopol jeweils mit den folgenden Konzentrationen behandelt:
5, 25 und 50 mg/l.
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Die
Fische werden am Tag 0 infiziert und die Tanks werden entweder mit
Chloramin-T oder Bronopol an den Tagen 2 und 4 des Experiments behandelt.
Alle 6 Tanks, die experimentell mit F branchiophilum infiziert sind,
werden mit den jeweiligen Therapeutika gleichzeitig für 1 Stunde
in einem statischen Bad mit Belüftung behandelt.
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Die
Wirksamkeit jeder Behandlung wird durch klinische Anzeichen, bakterielle
Kiemenantigenspiegel, die durch einen Enzymimmuntest (EIA) gemessen
werden, Motalitätsraten
und kumulative Mortalität
und schließlich
durch histologische Untersuchung gemessen.
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Die
Kiemenproben für
den EIA werden aus 5 Fischen in jedem Tank vor der experimentellen
Infektion und vor der Behandlung gewonnen. Weitere Kiemenproben
werden 6 und 36 Stunden nach der anfänglichen Behandlung gewonnen,
nachdem die Gruppen erneut mit identischen Konzentrationen desselben
Therapeutikums auf identische Weise behandelt wurden. Es werden
erneut Kiemenproben von 5 Fischen aus jedem Tank 6 und 36 Stunden
nach der zweiten Behandlung entnommen. Die Mortalität in jedem
Tank wird jeden Tag aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind graphisch
in den 6 bis 8 gezeigt.
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Auf
der Grundlage der Mortalität
und den EIA Daten ist die geringste Bronopolkonzentration (5 mg/l, 5)
unwirksam. Die Mortalität
hängt invers
mit der Dosis an Bronopol (6) zusammen.
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Es
ist ersichtlich, dass die Mortalität eng mit den bakteriellen
Antigenmengen zusammenhängt,
die auf den Kiemen detektiert werden und dass der EIA ein brauchbares
Werkzeug zur Verfolgung der Wirksamkeit eines Therapeutikums zur
Eliminierung von Bakterien von der Oberfläche der Kiemen ist. Wie die
Mortalität
ist die bakterielle Kiemenantigenkonzentration bei den meisten Probenzeiten
umgekehrt proportional zur Dosis des Therapeutikums (8).
Zwei der höchsten
Konzentrationen an Bronopol eliminieren die Bakterien wirksam von
der Kiemenoberfläche
nach der zweiten Behandlung (8). Es ist
ersichtlich, dass Bronopol gegen Flavobacterium branchophilum wirksam
ist und dass im Versuch Bronopol mit 25 mg/l und 50 mg/l die Mortalitäten unter
den infizierten Fischen sowohl im Vergleich zum unbehandelten Fisch
als auch zum Fisch verringert, der mit Chloramin-T behandelt wird.
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Versuch 7 – Referenzversuch
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In vivo Wirksamkeit von
Bronopol gegen Saprolegnia parasitica in Braunforellen
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Verfahren
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Dieser
Versuch wird angelegt, um die Wirksamkeit von Bronopol bei der Behandlung
von Braunforellen zu ermitteln, die natürlicherweise mit Saprolegnia
parasitica infiziert sind. 40 Fische werden im Versuch verwendet
und sie werden in 2 Gruppen gleichmäßig eingeteilt, die in getrennten
Tanks gehalten werden. Ein stark erkrankter Fisch, der stark mit
Saprolegnia parasitica infiziert ist, wird mit der Intention in
jeden Tank gegeben, die anderen Fische natürlich zu infizieren. An den
Tagen 1, 3 und 5 des Versuchs werden die Fische in einer Gruppe
in einem 50 mg/l Bad an Bronopol für 15 Minuten behandelt, während der
Fisch in der zweiten Gruppe unbehandelt bleibt und als Kontrolle
wirkt. Das Ausmaß der
Infektion der Fische in beiden Gruppen wird am Tag 7 des Versuchs
ermittelt.
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Ergebnisse
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In
beiden Gruppen sterben die stark erkrankten Fische am Tag 1 des
Versuchs, werden aber jeweils im Tank belassen, um die gute Infektionsprovokation
für die
verbleibenden Fische sicherzustellen. Am Tag 7 des Versuchs wird
festgestellt, dass alle Fische in der Kontrollgruppe stark mit Saprolegnia
infiziert sind und sie werden aus humanitären Gründen getötet. Im Gegensatz dazu sind
die Fische in der Bronopolbehandlungsgruppe alle gesund und haben
keine sichtbaren Anzeichen einer Saprolegnia Infektion.
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Schlussfolgerung
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Eine
wiederholte Behandlung mit Bronopol bei einer Konzentration von
50 mg/l scheint als Behandlung für
eine Saprolegnia Infektion bei Braunforellen und/oder als Prophylaktikum
zur Verhinderung der Infektion sehr wirksam zu sein.
