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Diese Erfindung betrifft die Behandlung
von Pilzinfektionen (insbesondere Saprolegnia parasitica) beim Fisch,
besonders, jedoch nicht ausschließlich, bei Forelle, bei Lachs
und im Allgemeinen bei forellenartigen Fischen. Die vorliegende
Erfindung liefert auch Behandlungen anderer Fischkrankheiten, wie
gegen bakterielle Infektionen (beispielsweise bakterielle Kiemenschwellung – Flavobacterium
branchiophilum und Cytophaga psychrophila), Protozoen-Infektionen,
wie Flimmertierchen (beispielsweise Ichthyophthirius multifiliis) und
Geißeltierchen
(beispielsweise Ichthyobodo necatrix).
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Saprolegnia parasitica ist ein sich
schnell verbreitender und verhängnisvoller
Pilzparasit, der sowohl Fische als auch Fischeier nachteilig beeinflusst.
Er wird herkömmlicherweise
mit Malachitgrün
(Diaminotriphenylmethan) behandelt, doch obwohl man annimmt, dass
diese Behandlung hoch wirksam ist, bringt die Anwendung von Malachitgrün eine Vielzahl
von potenziellen Problemen mit sich: es ist vermutet worden, dass
die Verbindung möglicherweise
ein Karzinogen und Teratogen ist, obwohl diese Wirkungen bislang
nicht bestätigt wurden;
da sie ein starker Farbstoff ist, neigt sie dazu, Wasser zu verfärben, und
sie kann unter bestimmten Bedingungen eine Färbung der Fische bewirken,
die behandelt worden sind; sie besitzt einen verhältnismäßig langen
Vorhaltezeitraum, sodass wesentliche Rückstände in behandelten Fischen
vorliegen können,
wenn sie gefangen und zum Verbrauch verkauft werden; und die Verbindung
ist nicht als ein Arzneimittel für
veterinärmedizinische
Zwecke gelistet und sie ist gegenwärtig für die Verwendung in US-Bundesbrutstätten verboten worden.
Der Artikel von D. J. Alderman in Journal of Fish Diseases 8 (1985)
289–298
liefert einen Überblick über die
Verwendung von Malachitgrün
zur Behandlung von Fischkrankheiten und diskutiert einige der damit verbundenen
Probleme.
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Eine derzeit verfügbare Alternative zu Malachitgrün ist Formalin,
welches die Substanz ist, die gegenwärtig in US-Bundeszuchtstätten verwendet wird. Jedoch
kann sie infolge der reizerzeugenden Wirkung dieser Substanz nur
unter streng kontrollierten Bedingungen verwendet werden. Es besteht
daher Bedarf für
eine verbesserte Behandlung von Pilz- und anderen Krankheiten bei
Fischen, insbesondere eine, die eine hohe Wirksamkeit mit einer
geringen Toxizität
verbindet. Viele Versuche zur Identifizierung neuer Behandlungsmöglichkeiten
sind in der Vergangenheit unternommen worden und die Ergebnisse
des Screenings von 40 potenziellen alternativen Substanzen sind
in dem, im Journal of Fish Diseases 5 (1982) 113–123 erschienen Artikel von D.
J. Alderman, aufgeführt,
der auch Standardprotokolle zur Testung von Behandlungsmöglichkeiten
liefert. Jedoch trotz dieser und anderer Untersuchungen (wie sie
in dem in Aquaculture 38 (1984) 97–104 erschienen Artikel von
T. A. Bailey beschrieben sind), sind den Autoren der vorliegenden
Erfindung keine geeigneten alternativen Behandlungsmöglichkeiten
zu Malachitgrün
und Formalin bekannt, die Marktreife erreicht haben.
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GB 22263063 offenbart eine gegen
Geschwüre
wirksame Zusammensetzung für
Fische, basierend auf einem Gemisch aus Formaldehyd, einem quarternären Ammoniumsalz
mit bakterizider Wirkung und einem bromierten Alkandiol, das selbst
eine antibakterizide Wirkung besitzt.
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Das Abstract von HU 38833 beschreibt
ein Antifungizid und antimikrobielles Produkt, umfassend 0,5% Bradophen,
0,05% Bronopol und 5% hydrophilysiertes Silizium, zur Verwendung
für veterinärmedizinische Zwecke.
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Es wurde nun gefunden, dass Bronopol
(2-Brom-2-nitro-propan-1,3-diol)
eine gute Wirkung bei verhältnismäßig gerin gen
Konzentrationen gegen Saprolegnia parasitica aufweist, und es ist
gefahrlos zu verwenden. Bronopol ist eine bekannte Verbindung und
es wird in Konzentrationen zwischen 0,01 und 0,2% als ein antimikrobielles
Konservierungsmittel und als antiseptisches Mittel in oberflächlich anzuwendenden
pharmazeutischen Formulierungen, Kosmetika und Toilettenartikeln
verwendet. Im "Handbook
of Pharmaceutical Excipients",
veröffentlicht
durch The Pharmaceutical Press (1994), ist jedoch behauptet worden,
dass einer der hauptsächlichen
Nachteile der Bronopole ihre verhältnismäßig mangelhafte Wirkung gegen
Hefen und Schimmelpilze ist. Es ist daher überraschend, dass Bronopol
in verhältnismäßig geringen
Konzentrationen gegen Saprolegnia wirksam ist.
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Wie nachstehend genauer beschrieben,
ist gezeigt worden, dass Bronopol gegen Saprolegnia parasitica-Infektionen
bei Lachs, Forelle und Forelleneiern wirksam ist. Es wird jedoch
angenommen, dass die Behandlung gegen die gleiche Infektion bei
anderen Lachsarten und im Allgemeinen auch tatsächlich bei anderen Fischen
(beispielsweise Zierfischen und Heimfischen), Fischeiern und anderen
Wassertieren (wie Krabben oder Garnelen) wirksam ist. Es wird erwartet,
dass es auch Wirksamkeit gegen andere Pilzinfektionen aufweist.
Des weiteren kann Bronopol auch zur Prophylaxe verwendet werden,
wie es in den nachstehenden Versuchen zur Verhinderung oder Verlangsamung
der Ausbreitung der Infektion gezeigt worden ist.
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Bronopol ist ein kommerzielles Produkt,
das von vielen Quellen verfügbar
ist. Es kann hergestellt werden, indem Nitromethan mit Paraformaldehyd
in alkalischer Umgebung umgesetzt wird, gefolgt von Bromierung.
Es ist auch bekannt, dass einige Verbindungen (wie 5-Brom-5-nitro-1,3-dioxan)
bei ihrer Zersetzung Bronopol freisetzen, und die vorliegende Erfindung
kann daher auch auf die Verwendung derartiger Verbindungen anstelle
von Bronopol ausgedehnt werden.
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Somit liefert die vorliegende Erfindung
bezüglich
eines Aspekts die Anwendung von Bronopol (2-Brom-2-nitropropan-1,3- diol) zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer beliebigen
der nachstehenden Fischkrankheiten: Pilzinfektionen, Geißeltierchen-Infektionen,
Flimmertierchen-Infektionen, bakterielle Kiemenschwellung und myxobakterielle
Infektionen, wobei das Arzneimittel Bronopol als seinen alleinigen
oder hauptsächlichen
wirksamen Inhaltsstoff gegen die vorstehend erwähnten Krankheiten enthält. Die
Krankheiten können
durch einen beliebigen der nachstehenden verursachenden Organismen
hervorgerufen werden: Saprolegnia parasitica, Ichthyobodo necatrix,
Ichthyophthirius multifiliis, Flavobacterium branchiophilum und
Cytophaga psychrophila. Diese Krankheiten können Krankheiten bei forellenartigen
Fischen, besonders Krankheiten bei Forellen oder Lachsen, sein.
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Bezüglich eines anderen Aspekts
liefert die vorliegende Erfindung ein Behandlungsbad zur Behandlung
oder Prophylaxe einer beliebigen der nachfolgenden Krankheiten beim
Fisch: Pilzinfektionen, Geißeltierchen-Infektionen,
Flimmertierchen-Infektionen,
bakterielle Kiemenschwellung und myxobakterielle Infektionen, wobei
das Behandlungsbad Bronopol in einer Konzentration im Bereich von
1 bis 1000 mg·l–1 (ppm)
als den alleinigen oder hauptsächlichen
wirksamen Inhaltsstoff gegen derartige Krankheiten enthält.
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Vorzugsweise liegt die Konzentration
an Bronopol im Behandlungsbad im Bereich von 5 mg·l–1 bis
200 mg·l–1 und
Idealerweise 10 mg·l–1 bis
100 mg·l–1.
Bronopol ist eine feste kristalline Substanz und es kann herkömmlicherweise
als eine Lösung
in einem polaren Lösungsmittel,
wie Wasser oder Dowanol (Dipropylenglycolmonoethylether), hergestellt
werden.
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Versuch 1 (nachstehend) wurde unter
milden alkalischen Bedingungen (annähernd pH 7,4 bis 7,5) durchgeführt und
es ist möglich,
dass diese Bedingungen für
die von Bronopol gezeigte antifungale Wirkung günstig sind.
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Während
der Versuche wurde Bronopol auch gegen verschiedene andere Fischkrankheiten
getestet und es wurde festgestellt, dass es gegen Ichthyobodo necatrix,
der ein Geißel tierchen-Ektoparasit
ist, Flavobacterium branchiophilum (der verursachende Organismus
der bakteriellen Kiemenschwellung) und Cytophaga psychrophila, der
ein Myxobakterium und der verursachende Organismus des Regenbogenforellensyndroms
ist, der Kalterwasserkrankheit, Sattelkrankheit und Flossenfäule in forellenartigen
Fischen wirksam ist. Die Wirksamkeit gegen Cytophaga weist auf eine
allgemeine Wirksamkeit gegen Myxobakterien hin und die Wirksamkeit
gegen Ichthyobodo lässt
sowohl eine allgemeine Wirkung gegen Flagellaten vermuten, als auch gegen
Geißeltierchen,
wie Ichthyophthirius multifiliis.
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Der hauptsächliche praktische Nutzen der
Wirkung gegen Cytophaga scheint in der Desinfektion von Behältern und
Ausrüstungen
zu liegen und die vorliegende Erfindung umfasst daher ein Verfahren
zur Desinfektion von Behältern
für Fische
und/oder von Instrumenten bei der Fischhaltung, wobei das Verfahren
den Schritt des Einwirkens einer Bronopol enthaltenden Lösung auf
den/die Behälter/Ausrüstung umfasst.
Vorzugsweise liegt Bronopol in einer Konzentration zwischen annähernd 1
und 2000 mg·l–1,
bevorzugter 5 bis 1000 mg·l–1,
vor. Die Einwirkzeit liegt vorzugsweise zwischen 2 und 40 min.
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Die vorliegende Erfindung wird nun
anhand der Beispiele mit Bezug auf die nachfolgenden experimentellen
Versuche genauer beschrieben:
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Versuch 1
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In vitro-Wirksamkeit von
Bronopol gegen Saprolegnia parasitica
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Dieser Versuch wurde unter Anwendung
der Verfahren, die in dem vorstehend zitierten Journal of Fish Diseases
(1982) 5, 113–123
beschrieben sind, durchgeführt.
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Herstellung der Impfkultur
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Eine Kultur von Saprolegnia parasitica
wurde bei 16°C
in Flusswasser, Glucose, Hefeextrakt-Agar (RGY), bestehend aus Hefeextrakt
(1 g), D (+) Glucose (5 g) und Agar (12 g), in 1 l Flusswasser gehalten.
Platten mit RGY wurden mit dem Testorga nismus beimpft und bei 25°C inkubiert
bis das Wachstum gerade den gesamten Durchmesser der Schale bedeckte
(annähernd
72 Stunden). Aus den äußeren 10
mm der Kultur wurden mittels einer Stanze von 4 mm Durchmesser (angepasst
von einer Stanze für
die Gelchromatografie durch anschweißen) Scheiben herausgeschnitten
und anschließend
als Standardimpfkultur zur Testung verwendet.
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Test
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Verfahren
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Bronopol wurde bezüglich der
Wirksamkeit gegen Saprolegnia parasitica-Kulturen bei verschiedenen Konzentrationen
im Bereich von 50 mg·l–1 bis
100 mg·l–1 unter
Anwendung des Protokolls II des vorstehend erwähnten J. Fish Diseases-Artikels
wie folgt getestet. Polycarbonat-Filtermembranen mit einer Porosität von 0,2 μm und einem
Durchmesser von 25 mm (Nucleopore; Sterlin) wurden durch Autoklavieren
sterilisiert und anschließend
auf der Oberfläche
von RGY-Platten angeordnet (7 pro 90 mm-Petrischale). Eine 4 mm-Scheiben-Standardimpfkultur
wurde anschließend
umgedreht auf das Zentrum des Filters gegeben. Die Schalen, die
die Filter enthielten, wurden anschließend inkubiert bis das entstehende
Pilzgeflecht zum größten Teil
den Rand des Filters erreicht hatte. Die ursprüngliche Impfkultur wurde dann
unter Verwendung von heißen
Pinzettenspitzen gekürzt
(so weit wie möglich),
um die Zerstörung
des eng benachbarten Pilzgeflechts zu vermeiden. Die Pilzgeflechte
wurden gemeinsam mit ihren Trägerfiltern
von der Agar-Oberfläche auf
den Filtern abgehoben, in freie, sterile Petrischalen übertragen
und vollständig
in die Bronopol-Lösung
mit den ausgewählten Konzentrationen
eingetaucht. Nach Ablauf der einstündigen Einwirkzeit wurde die
Bronopol-Lösung
durch Absaugen entfernt und zweimal durch Waschlösungen von sterilem Flusswasser
(für 5
bzw. 30 min) ersetzt, bevor das Pilzgeflecht und die Filter auf
die Oberfläche
einer frischen RGY-Platte übertragen
wurden, die Filter zuoberst. Nach 24- stündiger
Inkubation bei 16°C
wurde jedes beliebige neue Wachstum entlang des Rands des Filters
an vier Punkten entlang des Filters, in Intervallen von 90° gemessen.
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Das Experiment wurde mit sechs gesonderten
Kulturproben bei jeder Konzentration von Bronopol durchgeführt und
es wurde unter Verwendung von Malachitgrün anstelle von Bronopol wiederholt.
Eine negative Testkontrolle ohne wirksames Mittel wurde ebenfalls
durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angeführt:
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Tabelle
1A
radiales Wachstum in mm, 24 h nach Einwirkung eines Bads
der Testkonzentration
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Diskussion
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In diesem Test wurden die nackte
Pilzhyphe Bronopol ausgesetzt, von dem gezeigt worden ist, dass bei
einer so geringen Konzentration wie bei 50 ppm für 5 Minuten eine hemmende Wirkung
gegen nachfolgendes vegetatives Wachstum aufweist. Eine Einwirkung
von zehn Minuten bei 500 ppm verhindert jegliches vegetative Wachstum
in diesem Testverfahren.
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Test 1B
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Verfahren
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In diesem Test wurde Bronopol bezüglich seiner
Wirksamkeit gegen Saprolegnia parasitica getestet unter Anwendung
des strengeren Protokolls III in dem vorstehend erwähnten J.
Fish Diseases-Artikel, wobei das Verfahren wie folgt ist:
Vier
Scheiben der Impfkultur wurden in jedes Fach einer sterilen Mehrfachschale
gegeben (25 Fächer
in fünf Reihen;
Sterilin). Fünf
verschiedene Testkonzentrationen, die für fünf verschiedene Einwirkzeiten
angewendet wurden, konnten somit in einer Platte viermal durchgeführt werden.
Die Testkonzentrationen wurden aseptisch in Volumina von 2,5 ml
zu jedem Fach für
die jeweiligen standardisierten Einwirkzeiten, die 5, 10, 20, 40
und 80 min betrugen, zugesetzt. Nach Beendigung der individuellen
Einwirkzeiten wurden die Testlösungen
aus den Fächern
durch Absaugen entfernt. Jeder Satz an Scheiben wurde anschließend in
situ zweimal mit sterilem Flusswasser gewaschen (für 5 bzw.
30 min) und anschließend
mit weiteren 2,5 ml sterilem Flusswasser in situ 72 h bei 16°C inkubiert.
Danach wurden die Scheiben unter einem Stereomikroskop mittels Durchlicht und
dunklem Hintergrund untersucht und bezüglich der Gegenwart oder Abwesenheit
von neuem Wachstum auf der Oberfläche der Agarscheiben bewertet.
In allen zweifelhaften Fällen,
insbesondere an der Grenze zwischen Wachstum und nicht Wachstum,
wurden die Scheiben für
weitere 72 h bei 16°C
in RGY übertragen,
um die Lebensfähigkeit
des Mycels innerhalb der Scheibe genau zu bestimmen. Der Test wurde
wiederholt, indem Bronopol durch Malachitgrünoxalat ersetzt wurde.
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Die Ergebnisse wurden sowohl hinsichtlich
der Wirkung auf die Sporenbildung als auch hinsichtlich der Wirkung
auf das vegetative Wachstum angegeben und sie sind in den nachstehenden
Tabellen aufgeführt:
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Tabelle
1B (i)
Bronopol-Wirkung auf die Sporenbildung (prozentuale
Hemmung)
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Tabelle
1B (ii)
Malachitgrünoxalat-Wirkung
auf die Sporenbildung (prozentuale Hemmung)
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Tabelle
1B (iii)
Bronopol-Wirkung auf das vegetative Wachstum (prozentuale
Hemmung)
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Tabelle
1B (iv)
Malachitgrünoxalat-Wirkung
auf das vegetative Wachstum (prozentuale Hemmung)
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Diskussion
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Bronopol hatte eine deutliche Wirkung
auf die unmittelbare Sporenbildung bei kurzen Einwirkzeiten von
5 Minuten bei Konzentrationen von 100 ppm (oder möglicherweise)
weniger. Dieser Test nutzt ein Agarpropfenverfahren, indem der das
Mycel enthaltende Agar augenscheinlich der Hyphe Schutz bietet,
das Bronopol jedoch noch durchdringt und bei einer 20-minütigen Einwirkung
von 1000 ppm jegliches nachfolgende Wachstum verhindert und diese
Konzentration hat auch eine wesentliche Wirkung in weniger als 5
Minuten. Des weiteren scheint auch die geringere 100 ppm Einwirkung
nach 80 Minuten eine gewisse hemmende Wirkung zu haben.
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Versuch 2
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In vivo-Wirksamkeit von
Bronopol gegen Saprolegnia parasitica-Infektionen beim Lachs
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Verfahren
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105 Atlantiklachse (Salmon salar)
gemischten Geschlechts, annähernd
8 Monate alt und mit einem Gewicht von annähernd 30 g im Durchschnitt
wurden in drei Behandlungsgruppen eingeteilt; jeweils 35 Fische. Jede
Gruppe wurde in Süßwasser
bei 12,5°C
in einem 210 1-Glasfaserbehälter
gehalten.
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Die Fische erhielten täglich 2%
ihres Körpergewichts
an dem Futtermittel „Biomar". Nach zweiwöchiger Akklimatisierung
wurden alle drei Gruppen künstlich
mit Saprolegnia parasitica infiziert, das Datum der Infektion wurde
als „Tag
0" des Versuchs
bezeichnet. Die Gruppen wurden anschließend an den Tagen 1, 3 und 5
wie folgt behandelt:
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Am Tag 8 des Versuchs wurden alle
Fische getötet
und der Grad der Infektion wurde für jeden Fisch gemäß dem nachfolgenden
Auswertesystem bewertet:
| Grad
der Pilzinfektion | Bewertung |
| Keine | 1 |
| Mild
(der Pilz war zu < 25%
auf der Oberfläche
des Fisches sichtbar) | 2 |
| Mittel
(der Pilz war zu 50% auf der Oberfläche des Fisches sichtbar) | 3 |
| Schwer
(Verletzung(en)auf dem Fisch) | 4 |
| Mortalität | 5 |
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Ergebnisse
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Die Zahl der Fische in jeder Kategorie
des vorstehenden Auswertesystems und die Gesamtbewertung für jede Gruppe
waren wie folgt:
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Die kumulativen Zahlen der Mortalitäten für jeden
Tag des Versuchs sind in 1 grafisch
dargestellt.
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Schlussfolgerung
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Bronopol erwies sich gegen Saprolegnia
parasitica Infektionen als wirksam und verminderte auch die Mortalität um 50%
im Vergleich zu sowohl den unbehandelten als auch zu den mit Malachitgrün behandelten Gruppen.
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Versuch 3
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In vivo-Wirksamkeit gegen
Ichthyobodo necatrix-Infektion in Regenbogenforellen
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Verfahren
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Regenbogenforellen (Oncorhyncus mykiss)
mit einem mittleren Gewicht von 15 g wurden in diesem Versuch verwendet
und sie wurden vor der Behandlung in einem einzelnen Teich mit 6
schwer mit Ichthybodo infizierten Individuen eingeschränkt gehalten.
Die Infektion der vorher gesunden Individuen wurde nach 5 Tagen
durch mikroskopische Untersuchung von befestigten Kiemenproben nachgewiesen.
Die Behandlung mit Bronopol wurde einer Gruppe von 20 Fischen unter
Anwendung des gleichen Verfahrens wie in Versuch 2 verabreicht.
Der Versuch wurde wiederholt mit einer Gruppe von 19 infizierten
Fischen, die mit Formalin behandelt wurden (eine Standardbehandlung
für Ichthyobodo),
und mit einer Gruppe von 20 infizierten Fischen, die keine Behandlung
erhielten und als eine Kontrollgruppe dien ten. Nach 7-tägiger Behandlung
wurde die mittlere Anzahl der Parasiten pro Kiemenfilament in jeder
Gruppe bewertet (durch Zählen
der Anzahl der Parasiten auf jeweils 10 Filamenten von 5 Fischen)
und nach 14 Tagen wurde eine erneute Zählung durchgeführt, wobei
der jeweilige Fisch eingeteilt wurde, dass er entweder keine Infektion
aufweist, oder dass er gemäß dem Infektionsgrad
in eine der vier Infektionskategorien eingeordnet wurde.
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Es trat keine Mortalität auf.
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Schlussfolgerung
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Es wurde gezeigt, dass Bronopol eine
gute Wirksamkeit gegen Ichthyobodo-Infektion in Regenbogenforellen
besitzt. Obwohl es weniger wirksam als Formalin ist, bringt seine
Anwendung weniger Risiken mit sich. Es wird vermutet, dass Bronopol
in anderen forellenartigen Fischen eine ähnliche Wirksamkeit gegen Ichthyobodo-Infektion
und im Allgemeinen bei Fischen und anderen Wassertieren besitzt,
und es ist auch zur Prophylaxe gegen diese Krankheit geeignet.
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Versuch 4
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In vitro-Wirksamkeit von
Bronopol gegen Cytophaga Psychrophila
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Verfahren
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Als erstes wurde die minimale bakterizide
Konzentration (MBC) für
Bronopol gegen Cytophaga Psychrophila durch Kultivieren des Organismus
in Nährlösung bestimmt,
und anschließend
wurden verschiedene Verdünnungen
von Bronopol zugesetzt, um zu bestimmen, welche Konzentration Cytophaga
abtöten
würde.
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Dann wurden, basierend auf den MBC-Ergebnisse,
die zum Abtöten
von Cytophaga erforderlichen Kontaktzeiten untersucht. Eine bekannte
Zahl lebensfähiger
Bakterien wurde destilliertem Wasser zugesetzt und der Einwirkung
von verschiedenen Konzentrationen an Bronopol für 2–40 Minuten unterworfen. Anschließend wurden
die Bakterien durch Filtration extrahiert und die extrahierten Bakterien
wurden hinsichtlich der Lebensfähigkeit
getestet, indem ihr Wachstum in Kulturlösung durch Messen der optischen
Dichte bei 520 nm bestimmt wurde.
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Ergebnisse
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Die Ergebnisse sind in 2 grafisch dargestellt.
Die minimale Testkonzentration, die sich als wirksam erwies, betrug
5 mg·l–1 (ppm),
doch es ist wahrscheinlich, dass die tatsächliche minimale Konzentration
zwischen 1 mg·l–1 und
5 mg·l–1 liegt.
Es wurde auch festgestellt, dass eine Einwirkzeit bis zu 40 min
erforderlich war, um das bakterielle Wachstum nach dem erneuten
Beimpfen auf frischen Medien zu verhindern, wenn Konzentrationen
zwischen 5 mg·l–1 und
400 mg·l–1 verwendet
wurden, wobei die erforderliche Einwirkzeit auf etwa 4 min bei einer
Konzentration von 1000 mg·l–1 und
auf etwa 2 min bei 2000 mg·l–1 verringert
werden konnte.
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Schlussfolgerung
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Es wurde gezeigt, dass Bronopol bei
so geringer Konzentration wie 5 mg·l–1 wirksam
gegen Cytophaga psychrophila ist.
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Cytophaga ist ein Beispiel für die Gruppe
von Bakterien, die als Myxobakterien bekannt sind, die durch eine
Schutzschicht aus Mucopolysacchariden charakterisiert sind, und
die im Allgemeinen gegenüber
Desinfektionsmittel resistent sind (beispielsweise beträgt die zum
Abtöten
von Cytophaga erforderliche Konzentration an jodhaltigen Desinfektionsmitteln
annähernd
2000 mg·l–1).
Basierend auf den bekannten Verwendungszwecken von Bronopol ist
diese Wirkung daher überraschend
und sie kann auf eine allgemeine Wirksamkeit gegen Myxobakterien
hinweisen. Ähnlich
erweist sich Bronopol als geeignetes Behandlungsmittel zur Desinfektion
von Fischbehältern
und Ausrüstungen
und es kann auch zur Behandlung und/oder Prophylaxe verschiedener,
durch diesen Organismus hervorgerufener Krankheiten in Forellen
und anderen forellenartigen Fischen verwendet werden, und auch (wenn
diese auftreten) bei anderen Fischen und Wassertieren.
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Versuch 5
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In vivo-Wirksamkeit
von Bronopol gegen Flavobacterium branchophilum-Infektionen bei
Regenbogenforellen
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Sieben Behälter mit jeweils 150 Regenbogenforellen,
bei einer Besetzungsdichte von 100 g·l–1 wurden in
dieses Experiment eingeschlossen. Die Größe der Fische betrug durchschnittlich
15 g. Die Wassertemperatur betrug 11°C und es wurde mit einer Geschwindigkeit
von einmal pro Stunde umgewälzt.
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Ein Behälter mit Fischen wurde als
eine Negativkontrolle gehalten und es wurde nicht infiziert oder
behandelt. Ein zusätzlicher
Behälter
wurde infiziert, jedoch nicht behandelt, damit es als Positivkontrolle
dient. Zwei Behälter
wurden mit Chloramin-T bei einer Konzentration von 10 mg·l–1 behandelt
(eine herkömmliche Behandlung).
Drei Behälter
wurden mit Bronopol behandelt, jeweils mit den nachfolgenden Konzentrationen: 5,
25 und 50 mg·l–1.
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Die Fische wurden am Tag 1 infiziert
und die Behälter
wurden in diesem Experiment an den Tagen 2 und 4 entweder mit Chloramin-T
oder Bronopol behandelt. Alle sechs Behälter, die experimentell mit
F. branchophilum infiziert wurden, wurden mit den entsprechenden
Therapeutika gleichzeitig für
eine Stunde in einem statischen Wasserbad unter Belüftung behandelt.
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Die Wirksamkeit der jeweiligen Behandlung
wurde anhand klinischer Zeichen, der durch Enzymimmunoassay (EIA)
gemessenen Antigenspiegel der Kiemen, der Mortalitätsraten
und der kumulativen Mortalität und
abschließend
durch histologische Untersuchung bewertet.
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Die Kiemenproben für den EIA
wurden von fünf
Fischen in den jeweiligen Behältern
vor der experimentellen Infektion und vor der Behandlung entnommen.
Weitere Kiemenproben wurden 6 und 36 Stunden nach dem Beginn der
Behandlung entnommen, wonach die Gruppen erneut mit identischen
Konzentrationen der gleichen Therapeutika in identischer Weise behandelt
wurden. Kiemenproben von fünf
Fischen aus jedem Behälter
wurden erneut 6 und 36 Stunden nach der zweiten Behandlung entnommen.
Die Mortalität
in jedem Behälter
wurde jeden Tag aufgezeichnet. Die Ergebnisse werden grafisch in
den 3 bis 5 dargestellt.
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Basierend auf der Mortalität und den
Daten der EIA wurde festgestellt, dass die geringste Konzentration
von Bronopol (5 mg·l–1, 5) unwirksam war. Die Mortalität steht
in inverser Beziehung zu der Dosis an Bronopol (3).
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Es ist augenscheinlich, dass die
Mortalität
eng mit den auf den auf den Kiemen nachgewiesenen Antigenspiegeln
verbunden ist, und dass der EIA ein geeignetes Arbeitsmittel zum
Aufzeichnen der Wirksamkeit der Fähigkeit eines Therapeutikums
ist, Bakterien von der Kiemenoberfläche zu entfernen. Wie die Mortalität ist die
bakterielle Antigenkonzentration der Kiemen zu den meisten Probezeiten
invers proportional zu der Dosis des Therapeutikums (5). Die beiden höchsten Konzentra tionen
von Bronopol entfernten nach der zweiten Behandlung die Bakterien
wirksam von der Oberfläche
der Kiemen (5). Es ist
klar, dass Bronopol wirksam gegen Flavobacterium branchophilum ist,
und dass Bronopol in dem Versuch bei Konzentrationen von 25 mg·l–1 und
50 mg·l–1 die
Mortalität
in den infizierten Fischen vermindert, sowohl im Vergleich zu den
unbehandelten Fischen als auch zu den mit Chloramin-T behandelten
Fischen.
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Versuch 6
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In vivo-Wirksamkeit
von Bronopol gegen Saprolegnia parasitica bei Braunforellen
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Verfahren
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Dieser Versuch erfolgt, um die Wirksamkeit
von Bronopol bei Braunforellen zu bewerten, die in natürlicher
Weise mit Saprolegnia parasitica infiziert waren. 40 Fische wurden
in diesem Versuch verwendet und diese wurden in zwei gleich große Gruppen
eingeteilt, die in gesonderten Wasserbehältern gehalten wurden. Ein
stark mit Saprolegnia parasitica infizierter moribunder (sterbender)
Fisch wurde in jeden Behälter
gesetzt, um die anderen Fische in natürlicher Weise zu infizieren.
An den Tagen 1, 3 und 5 des Versuchs wurden die Fischer einer Gruppe
15 min mit einem 50 mg·l–1 Bronopol-Bad
behandelt, während
die Fische der zweiten Gruppe unbehandelt blieben und als eine Kontrolle
dienten. Der Grad der Infektion der Fische in beiden Gruppen wurde
am Tag 7 des Versuchs bewertet.
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Ergebnisse
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In beiden Gruppen starb der moribunde
Fisch am Tag 1 des Versuchs, er wurde jedoch in jedem Fall in dem
Behälter
belassen, um eine gute Exposition in den verbleibenden Fischen sicherzustellen.
Am Tag 7 des Versuchs wurde bemerkt, dass alle Fische der Kontrollgruppe
stark durch Saprolegnia beeinträchtigt
waren und sie wurden aus humanitären
Gründen
getö tet.
Im Gegensatz dazu waren alle Fische der mit Bronopol behandelten
Gruppe gesund und wiesen keine augenscheinlichen Zeichen einer Saprolegnia-Infektion
auf.
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Schlussfolgerung
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Die wiederholte Behandlung mit Bronopol
bei einer Konzentration von 50 mg·l–1 scheint
zur Behandlung gegen Saprolegnia Infektion bei Braunforellen, und/oder
als vorbeugendes Mittel zur Verhinderung von Infektionen hoch wirksam
zu sein.
