JP6508754B2 - 放流用サケ稚魚の感染症予防剤 - Google Patents

Description

本発明は、放流用サケ稚魚の感染症予防剤に関し、詳細には、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメン、亜麻仁油、綿実油およびリノレン酸からなる群から選択される１以上の成分を含有する、放流用サケ稚魚のトリコジナ症を予防する感染症予防剤、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメン、ガンマ−テルピネン、亜麻仁油、綿実油、リノレン酸およびリノール酸からなる群から選択される１以上の成分を含有する、放流用サケ稚魚のトリコジナ症を予防する感染症予防剤、ならびに、それらの感染症予防剤を用いた放流用サケ稚魚の感染症を予防する方法に関する。

サケは広く一般に親しまれている食用魚である。サケは、安定した漁業資源確保のために増殖事業が行われおり、サケ増殖事業では、母川へ戻ってきた親魚から人工的に採卵し、これに精子をかけて受精させた後、ふ化場にてふ化させ、一定程度の大きさになるまで稚魚を飼育した後、河川へ放流している。

一方、トリコジナおよびイクチオボドは、いずれも真核単細胞の寄生虫（原虫）であり、サケ稚魚の体表に寄生して、トリコジナ症やイクチオボド症を引き起こす。トリコジナ症やイクチオボド症のサケ稚魚では、体表組織の損傷ないし壊死が生じ、ついには斃死に至る。また、斃死に至らずとも、これらの原虫の寄生により鰓にダメージを受けて海水適応能を失うことから、放流されて降海した後、海にて死滅する。近年、サケふ化場においてトリコジナ症やイクチオボド症によるサケ稚魚の健康被害ないし大量斃死が起こっており、問題になっている。

この点、特許文献１には、茶抽出物を含有するサケ・マス類用のイクチオボド防除剤が、特許文献２には、マトリンを含有する魚類用のトリコジナ症の予防／治療用組成物が、それぞれ開示されている。

特開２００６−２１９４７８号公報 特開２００６−２８０７２号公報

しかしながら、特許文献１に記載のイクチオボド防除剤は、当該防除剤を溶解した飼育水に魚を浸漬して用いるものであり、掛け流し飼育を通常とするサケ稚魚の飼育現場においては、当該防除剤の使用には手間がかかる。また、特許文献２に記載のトリコジナ症の予防／治療用組成物は、白点虫およびネオベネデニアに対する駆虫効果ならびにマダイおよびヒラメにおける白点虫の感染予防効果が示されているのみであり、サケ稚魚のトリコジナ症やイクチオボド症に対する予防効果は示されていない。したがって、経口投与などの簡便な方法により、サケ稚魚のトリコジナ症やイクチオボド症を効果的に予防できる感染症予防剤が求められている。

本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、経口投与などの簡便な方法によりトリコジナ症やイクチオボド症を効果的に予防できる、放流用サケ稚魚のトリコジナ症やイクチオボド症の感染症予防剤、ならびに、それを用いた放流用サケ稚魚の感染症を予防する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメン、亜麻仁油、綿実油およびリノレン酸からなる群から選択される１以上の成分を飼料に添加して給餌することにより、サケ稚魚へのイクチオボドの寄生を予防できることを見出した。また、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメン、ガンマ−テルピネン、亜麻仁油、綿実油、リノレン酸およびリノール酸からなる群から選択される１以上の成分を飼料に添加して給餌することにより、サケ稚魚へのトリコジナの寄生を予防できることを見出した。そこで、これらの知見に基づいて、下記の各発明を完成した。

（１）本発明に係る放流用サケ稚魚のイクチオボド症を予防する感染症予防剤は、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメン、亜麻仁油、綿実油およびリノレン酸からなる群から選択される１以上の成分を含有する。

（２）本発明に係る放流用サケ稚魚のトリコジナ症を予防する感染症予防剤は、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメン、ガンマ−テルピネン、亜麻仁油、綿実油、リノレン酸およびリノール酸からなる群から選択される１以上の成分を含有する。

（３）（１）の感染症予防剤においては、前記成分が下記の投与量または添加濃度で飼料に添加して用いられることが好ましい；
オレガノ油；投与量２７ｍｇ／日／ｋｇ体重以下、添加濃度０．０９重量％以下、
カルバクロール；投与量１５．９１ｍｇ／日／ｋｇ体重以下、添加濃度０．０５３重量％以下、
パラ−シメン；投与量４．２３ｍｇ／日／ｋｇ体重以下、添加濃度０．０１４重量％以下、
亜麻仁油；投与量２７０ｍｇ／日／ｋｇ体重以上、添加濃度０．９重量％以上、
綿実油；投与量２７０ｍｇ／日／ｋｇ体重以上、添加濃度０．９重量％以上、
リノレン酸；投与量１５６．６ｍｇ／日／ｋｇ体重以上、添加濃度０．５重量％以上、
リノール酸；投与量４０．５ｍｇ／日／ｋｇ体重以上、添加濃度０．１重量％以上。

（４）（２）の感染症予防剤においては、前記成分が下記の投与量または添加濃度で飼料に添加して用いられることが好ましい；
オレガノ油；投与量２７ｍｇ／日／ｋｇ体重未満、添加濃度０．０９重量％未満、
カルバクロール；投与量１５．９１ｍｇ／日／ｋｇ体重未満、添加濃度０．０５３重量％以下、
パラ−シメン；投与量４．２３ｍｇ／日／ｋｇ体重未満、添加濃度０．０１４重量％以下、
ガンマ−テルピネン；投与量２．８５ｍｇ／日／ｋｇ体重以下、添加濃度０．０１０重量％未満、
亜麻仁油；投与量２７０ｍｇ／日／ｋｇ体重より大、添加濃度０．９重量％より大、
綿実油；投与量８１０ｍｇ／日／ｋｇ体重未満、添加濃度２．７重量％未満、
リノレン酸；投与量１５６．６ｍｇ／日／ｋｇ体重より大、添加濃度０．５重量％より大、
リノール酸；投与量４０．５ｍｇ／日／ｋｇ体重より大、添加濃度０．１重量％より大。

（５）本発明に係る感染症予防剤においては、オレガノ油および亜麻仁油を含有し、かつ、亜麻仁油をオレガノ油の賦形剤として用いることが好ましい。

（６）本発明に係る放流用サケ稚魚の感染症を予防する方法は、（１）から（５）のいずれかに記載の感染症予防剤を放流用サケ稚魚に投与する工程を有する。

（７）（６）の方法は、トリコジナ症およびイクチオボド症に感染していない放流用サケ稚魚に前記感染症予防剤を７日間以上投与する工程を有することが好ましい。

本発明に係る感染症予防剤や感染症を予防する方法によれば、経口投与などの簡便な方法により、稚魚の成長や各種生理機能に悪影響を及ぼさずに、サケ稚魚のトリコジナ症やイクチオボド症を効果的に予防することができる。また、本発明に係る感染症予防剤や感染症を予防する方法によれば、トリコジナやイクチオボドの寄生によるサケ稚魚の成長や各種生理機能への悪影響を顕著に軽減し、健康なサケ稚魚を作出することができる。

ハーブ精油（ハッカ油、ユーカリ油およびオレガノ油）を添加した飼料を給餌して飼育したサケ稚魚における、トリコジナの寄生量を示す棒グラフである。 ハーブ精油（ハッカ油、ユーカリ油およびオレガノ油）を添加した飼料を給餌して飼育したサケ稚魚における、イクチオボドの寄生量を示す棒グラフである。 ハーブ精油（ハッカ油、ユーカリ油およびオレガノ油）を添加した飼料を給餌して飼育したサケ稚魚の、累積斃死尾数を示す棒グラフである。 オレガノ油の含有成分とその含有割合を示す図である。 オレガノ油ならびにオレガノ油含有成分（カルバクロール、パラ−シメン、ガンマ−テルピネンおよびシネオール）を添加した飼料を給餌して飼育したサケ稚魚における、トリコジナの寄生量を示す折れ線グラフである。 オレガノ油ならびにオレガノ油含有成分（カルバクロール、パラ−シメン、ガンマ−テルピネンおよびシネオール）を添加した飼料を給餌して飼育したサケ稚魚における、イクチオボドの寄生量を示す折れ線グラフである。 オレガノ油ならびにオレガノ油含有成分（カルバクロール、パラ−シメン、ガンマ−テルピネンおよびシネオール）を添加した飼料を給餌して飼育したサケ稚魚の、累積斃死尾数を示す棒グラフである。 食用・飼料添加用油（魚油、綿実油および亜麻仁油）を添加した飼料を給餌して飼育したサケ稚魚における、トリコジナの寄生量を示す棒グラフである。 食用・飼料添加用油（魚油、綿実油および亜麻仁油）を添加した飼料を給餌して飼育したサケ稚魚における、トリコジナの寄生量を示す棒グラフである。 食用・飼料添加用油（魚油、綿実油および亜麻仁油）を添加した飼料を給餌して飼育したサケ稚魚の、累積斃死尾数を示す棒グラフである。 亜麻仁油の脂肪酸組成を示す図である。 リノール酸およびリノレン酸を添加した飼料を給餌して飼育したサケ稚魚における、トリコジナおよびイクチオボドの寄生量ならびに累積斃死尾数を示す棒グラフである。 感染試験の前に、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌しながらの飼育（以下、「事前投与の飼育」という。）を行わなかったサケ稚魚（グループ１）、ならびに、事前投与の飼育を７日間（グループ２）および１４日間（グループ３）行ったサケ稚魚における、トリコジナの寄生量を示す棒グラフである。 感染試験の前に、事前投与の飼育を行わなかったサケ稚魚（グループ１）、ならびに、事前投与の飼育を７日間（グループ２）および１４日間（グループ３）行ったサケ稚魚における、イクチオボドの寄生量を示す棒グラフである。 感染試験の前に、事前投与の飼育を行わなかったサケ稚魚（グループ１）、ならびに、事前投与の飼育を７日間（グループ２）および１４日間（グループ３）行ったサケ稚魚の累積斃死尾数を示す棒グラフである。 オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌して飼育した、原虫に感染していないサケ稚魚における、体重および各種生理機能を示す棒グラフである。 オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌して飼育した、感染試験後のサケ稚魚における、体重および各種生理機能を示す棒グラフである。

以下、本発明に係る放流用サケ稚魚の感染症予防剤および放流用サケ稚魚の感染症を予防する方法について詳細に説明する。

本発明において、「放流用サケ稚魚」とは、将来、河川や海などの自然環境に放流することを目的として飼育しているサケ稚魚をいう。ここで、本発明に係る「サケ」は、サケ目サケ科に属する魚をいう。また、本発明に係る「稚魚」は仔魚も含む広義の概念であり、「仔稚魚」と交換可能に用いられる場合がある。

本発明に係る放流用サケ稚魚のイクチオボド症を予防する感染症予防剤は、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメン、亜麻仁油、綿実油およびリノレン酸からなる群から選択される１以上の成分を含有する。また、本発明に係る放流用サケ稚魚のトリコジナ症を予防する感染症予防剤は、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメン、ガンマ−テルピネン、亜麻仁油、綿実油、リノレン酸およびリノール酸からなる群から選択される１以上の成分を含有する。

ここで、オレガノ油は、シソ科ハナハッカ属オレガノ（Origanum vulgare）の地上部（主として葉）から抽出される精油（植物が産出する揮発性の油）の一種であり、一般的には、香料などに用いられる。本発明に係る「オレガノ油」は、市販品を用いることができるほか、オレガノの地上部から水蒸気蒸留法などの定法により抽出して用いることができる。

亜麻仁油はアマ科アマ属アマ（Linum usitatissimum）の種子から抽出され、一般的には、食用や飼料用、あるいは塗料用溶剤などに用いられる油である。本発明に係る「亜麻仁油」は、市販品を用いることができるほか、アマの種子から圧搾などの定法により抽出して用いることができる。

綿実油はワタ（ワタ属（Gossypium）の植物） の種子から抽出され、一般的には食用に用いられる油である。本発明に係る「綿実油」は、市販品を用いることができるほか、ワタの種子から圧搾などの定法により抽出して用いることができる。

本発明において、「カルバクロール」、「パラ−シメン」、「ガンマ−テルピネン」、「リノール酸」および「リノレン酸」は、化学合成物でもよく、天然物から得たものでもよい。天然物から得る場合は、これらの成分を含有する天然物やその抽出物をそのまま用いてもよく、当該天然物やその抽出物から、これらの成分をさらに抽出、分離・精製して用いてもよい。

例えば、「カルバクロール」を含有する天然物やその抽出物としては、オレガノ、タイム、ヒメジソ、オオヤマジソ、ホソバヤマジソなどのシソ科植物およびヒバなどのヒノキ科植物やそれらの精油などを挙げることができる。また、「パラ−シメン」を含有する天然物やその抽出物としては、オレガノ、タイム、クミン、レモンなどの植物やそれらの精油などを挙げることができる。また、「ガンマ−テルピネン」を含有する天然物およびその抽出物としては、オレガノ、ティートリー、タイム、マンダリン、レモン、スギ、ヒバなどの植物やそれらの精油などを挙げることができる。また、「リノレン酸」を含有する天然物やその抽出物としては、アマ、エゴマ、なたねおよび大豆の種子やそれらから抽出される油などを挙げることができる。また、「リノール酸」を含有する天然物やその抽出物としては、アマ、ブドウ、ワタおよび大豆の種子ならびにトウモロコシの胚芽やそれらから抽出される油などを挙げることができる。

天然物からの抽出方法としては、一般的な方法を使用することができ、例えば、水、有機溶媒、あるいは水と有機溶媒との混合物を用いた溶媒抽出法を挙げることができる。溶媒抽出法としては、上記天然物を浸漬する方法や、浸漬して加温（常温〜溶媒の沸点の範囲）しながら攪拌する方法などを挙げることができる。得られた抽出物は、必要に応じて濾過や遠心分離に供して固形物を除いた後、そのまま、または当該抽出物を濃縮もしくは乾燥して用いることができる。

なお、有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコールや、酢酸エチルなどのエステル、エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレンアルコール、グリセリンなどの多価アルコール類、ジエチルエーテル、石油エーテルなどのエーテル類、アセトン、酢酸などの極性溶媒、ベンゼン、ヘキサン、キシレンなどの炭化水素溶媒などを挙げることができる。これらの溶媒は、単独で用いてもよく、二種類以上を適宜組み合わせて用いてもよい。

分離・精製方法もまた、一般的な方法を使用することができ、例えば、活性炭、シリカゲル、ポリマー系担体などを用いた吸脱着、カラムクロマトグラフィー、液−液抽出、分別沈殿などの方法を挙げることができる。

本発明に係る感染症予防剤を投与する方法としては、例えば、経口投与を挙げることができる。経口投与は、例えば、本発明に係る感染症予防剤のみを稚魚に直接経口投与してもよく、本発明に係る感染症予防剤を飼料に添加して当該飼料を給餌することにより経口投与してもよく、飼育水に添加して経口投与するなどしてもよい。

本発明に係る放流用サケ稚魚のイクチオボド症を予防する感染症予防剤において、前記成分の投与量または飼料に添加する際の添加濃度は特に限定されないが、例えば、後述する実施例１（１）に示すとおり、「オレガノ油」については、投与量２７ｍｇ／日／ｋｇ体重以下または飼料への添加濃度０．０９重量％以下で、イクチオボドの寄生予防効果ないし斃死抑制効果が得られることが分かっており、イクチオボドの寄生予防効果をより高めるためには、投与量１３．５ｍｇ／日／ｋｇ体重未満または飼料への添加濃度０．０４５重量％未満が好ましく、投与量５．４ｍｇ／日／ｋｇ体重以下または飼料への添加濃度０．０１８重量％以下がより好ましい。また、後述する実施例２（１）に示すとおり、「亜麻仁油」および「綿実油」については、いずれも、投与量２７０ｍｇ／日／ｋｇ体重以上または飼料への添加濃度０．９重量％以上で、イクチオボドの寄生予防効果が得られることが分かっている。

また、本発明に係る放流用サケ稚魚のトリコジナ症を予防する感染症予防剤においても、前記成分の投与量または飼料に添加する際の添加濃度は特に限定されないが、例えば、後述する実施例１（１）に示すとおり、「オレガノ油」については、投与量２７ｍｇ／日／ｋｇ体重未満または飼料への添加濃度０．０９重量％未満で、トリコジナの寄生予防効果が得られることが分かっている。また、後述する実施例２（１）に示すとおり、「亜麻仁油」については、投与量２７０ｍｇ／日／ｋｇ体重より大または飼料への添加濃度０．９重量％より大でトリコジナの寄生予防効果が得られることが分かっており、トリコジナの寄生予防効果をより高めるためには、投与量５４０ｍｇ／日／ｋｇ体重以上または飼料への添加濃度１．８重量％以上が好ましい。また、後述する実施例２（１）に示すとおり、「綿実油」については、投与量８１０ｍｇ／日／ｋｇ体重未満または飼料への添加濃度２．７重量％未満でトリコジナの寄生予防効果が得られることが分かっており、トリコジナの寄生予防効果をより高めるためには、投与量２７０ｍｇ／日／ｋｇ体重以上８１０ｍｇ／日／ｋｇ体重未満または飼料への添加濃度０．９重量％以上２．７重量％未満が好ましい。

ここで、図４に示すとおり、「カルバクロール」、「パラ−シメン」および「ガンマ−テルピネン」は、オレガノ油にそれぞれ５８．９２重量％、１５．６５重量％および１０．５７重量％含まれる。また、図１１に示すとおり、「リノレン酸」および「リノール酸」は、亜麻仁油にそれぞれ５８重量％および１５重量％含まれる。したがって、上述のオレガノ油および亜麻仁油の好適な投与量および飼料への添加濃度にこれらの含有割合を乗じることにより、「カルバクロール」、「パラ−シメン」、「ガンマ−テルピネン」、「リノレン酸」および「リノール酸」の好適な投与量および飼料への添加濃度を求めることができる。すなわち、具体的には、下記のとおりである；

《本発明に係る放流用サケ稚魚のイクチオボド症を予防する感染症予防剤》
〈カルバクロール〉
投与量；２７×５８．９２重量％＝１５．９０８４＝１５．９１ｍｇ／日／ｋｇ体重以下、好ましくは１３．５×５８．９２重量％＝７．９５５４２＝７．９６ｍｇ／日／ｋｇ体重以下、より好ましくは５．４×５８．９２重量％＝３．１８１６８＝３．１８ｍｇ／日／ｋｇ体重以下。
添加濃度；０．０９×５８．９２重量％＝０．０５３０２８＝０．０５３重量％以下、好ましくは０．０４５×５８．９２重量％＝０．０２６５１４＝０．０２７重量％以下、より好ましくは０．０１８×５８．９２重量％＝０．０１０６０５６＝０．０１１重量％以下。
〈パラ−シメン〉
投与量；２７×１５．６５重量％＝４．２２５５＝４．２３ｍｇ／日／ｋｇ体重以下、好ましくは１３．５×１５．６５重量％＝２．１１２７５＝２．１１ｍｇ／日／ｋｇ体重以下、より好ましくは５．４×１５．６５重量％＝０．８４５１＝０．８５ｍｇ／日／ｋｇ体重以下。
添加濃度；０．０９×１５．６５重量％＝０．０１４０８５＝０．０１４重量％以下、好ましくは０．０４５×１５．６５重量％＝０．００７０４２５＝０．００７重量％以下、より好ましくは０．０１８×１５．６５重量％＝０．００２８１７＝０．００３重量％以下。
〈リノレン酸〉
投与量；２７０×５８重量％＝１５６．６＝１５６．６ｍｇ／日／ｋｇ体重以上。
添加濃度；０．９×５８重量％＝０．５２２＝０．５重量％以上。
〈リノール酸〉
投与量；２７０×１５重量％＝４０．５＝４０．５ｍｇ／日／ｋｇ体重以上。
添加濃度；０．９×１５重量％＝０．１３５＝０．１重量％以上。

《本発明に係る放流用サケ稚魚のトリコジナ症を予防する感染症予防剤》
〈カルバクロール〉
投与量；２７×５８．９２重量％＝１５．９０８４＝１５．９１ｍｇ／日／ｋｇ体重未満。
添加濃度；０．０９×５８．９２重量％＝０．０５３０２８＝０．０５３重量％以下。
〈パラ−シメン〉
投与量；２７×１５．６５重量％＝４．２２５５＝４．２３ｍｇ／日／ｋｇ体重未満。
添加濃度；０．０９×１５．６５重量％＝０．０１４０８５＝０．０１４重量％以下。
〈ガンマ−テルピネン〉
投与量；２７×１０．５７重量％＝２．８５３９＝２．８５ｍｇ／日／ｋｇ体重以下。
添加濃度；０．０９×１０．５７重量％＝０．００９５１３＝０．０１０重量％未満。
〈リノレン酸〉
投与量；２７０×５８重量％＝１５６．６＝１５６．６ｍｇ／日／ｋｇ体重より大、好ましくは５４０×５８重量％＝３１３．２ｍｇ／日／ｋｇ体重以上。
添加濃度；０．９×５８重量％＝０．５２２＝０．５重量％より大、好ましくは１．８×５８重量％＝１．０４４＝１．０重量％以上。
〈リノール酸〉
投与量；２７０×１５重量％＝４０．５＝４０．５ｍｇ／日／ｋｇ体重より大、好ましくは５４０×１５重量％＝８１ｍｇ／日／ｋｇ体重以上。
添加濃度；０．９×１５重量％＝０．１３５＝０．１重量％より大、好ましくは１．８×１５重量％＝０．２７＝０．２重量％以上。

ここで、オレガノ油の好適な投与量または飼料への添加濃度は極小量であるため、飼料へ添加するにあたっては、飼料に均一に混合することが困難である。そこで、本発明に係る感染症予防剤においては、前記成分のうち、オレガノ油および亜麻仁油を含有し、かつ、亜麻仁油をオレガノ油の賦形剤として用いることが好ましい。亜麻仁油の好適な投与量または飼料への添加濃度は比較的大きいため、亜麻仁油にオレガノ油を混合して容量を増やし、これを飼料に添加することより、飼料に均一に混合することができる。また、オレガノ油は揮発性が高く、保存あるいは使用期間中に揮発して減じるのに対して、亜麻仁油の揮発性は小さいことから、亜麻仁油をオレガノ油の賦形剤として用いることにより、オレガノ油の揮発を抑制することもできる。

次に、本発明は、放流用サケ稚魚の感染症を予防する方法を提供する。本発明に係る放流用サケ稚魚の感染症を予防する方法は、上述した本発明に係る感染症予防剤を放流用サケ稚魚に投与する工程を有する。なお、本発明に係る感染症を予防する方法において、上述した本発明に係る感染症予防剤と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。

本発明に係る感染症を予防する方法においては、トリコジナ症やイクチオボド症の予防効果を高めるために、トリコジナ症およびイクチオボド症に感染していない放流用サケ稚魚に、本発明に係る感染症予防剤を７日間以上投与する工程を有することが好ましい。

以下、本発明に係る放流用サケ稚魚の感染症予防剤および感染症を予防する方法について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

＜実験方法＞
以下の実施例においては、特記しない限り、以下の実験方法を用いた。
（１）稚魚の飼育
稚魚は、１００尾または５００尾を一群として、容積６０Ｌのアクリル水槽に収容し、湧水系河川水（水温７．８〜８．０℃）の掛け流しで飼育した。水槽の換水率は２回／時とした。飼料は魚類用初期飼料（アルテックＫ−２：日清丸紅飼料株式会社）を用いた。給餌は、約３％体重／日の量を、1日３回に分けて毎日与えた。各実施例においては、いずれの群にも同一量の飼料を与えた。

（２）投与量の算出
飼料への添加物（ハーブ精油、食用・飼料添加用油またはそれらの含有成分）の投与量は、添加濃度と１日あたりの給餌量とから算出し、稚魚のｋｇ体重当たりの１日の投与量（ｍｇ／日／ｋｇ体重）として表した。

（３）トリコジナの定量
トリコジナのサイズは約１００μｍと大きいため、トリコジナの定量は、顕微鏡観察により行った。具体的には、まず、生きたままの稚魚を０．２％トリカイン水溶液の中に１０分間漬け、体表に寄生する全ての原虫を脱離させた。次に、稚魚をトリカイン水溶液から取り出し、残ったトリカイン水溶液全量をプランクトン算定盤に入れ、実体顕微鏡観察を用いて液中に存在するトリコジナの個体数を数えた。トリコジナの寄生量は、稚魚のｇ体重当たりのトリコジナ個体数（個体／ｇ体重）として表した。トリコジナの寄生量を各群間で比較するにあたっては、各群毎に平均値を算出し、一元配置分散分析法および多重比較検定Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法により検定を行った。

（４）イクチオボドの定量
イクチオボドのサイズは１０μｍと小さく、顕微鏡観察による計数が不可能である。そのため、イクチオボドの定量は、イクチオボド・リボゾームＲＮＡ遺伝子のＤＮＡコピー数を定量することにより行った。なお、イクチオボド・リボゾームＲＮＡ遺伝子のＤＮＡコピー数と個体数の間には有意な線形性相関があることが知られている（水野ら。平成２６年度日本水産学会春季大会で発表）。

具体的には、まず、生きたままの稚魚を０．２％トリカイン水溶液の中に１０分間漬け、体表に寄生する全ての原虫を脱離させた。次に、稚魚をトリカイン水溶液から取り出し、残ったトリカイン水溶液全量を、１００００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離に供して沈殿物を回収し、沈殿物から定法に従ってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型とし、既知のイクチオボド・リボゾームＤＮＡの配列から選択した特異的プライマー（フォワードプライマー；５’−ＧＴＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＧＡＴＧＣＣ−３’（配列番号１）、リバースプライマー；５’−ＧＣＴＧＴＡＴＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣ−３’（配列番号２））およびリアルタイムＰＣＲ装置（７５００型：アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。イクチオボドの寄生量は、稚魚のｇ体重当たりのイクチオボド・リボゾームＲＮＡ遺伝子のＤＮＡコピー数（１０^−１８ｍｏｌ（ａｍｏｌ）／ｇ体重）として表した。イクチオボドの寄生量を各群間で比較するにあたっては、各群毎に平均値を算出し、一元配置分散分析法および多重比較検定Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法により検定を行った。

（５）海水移行試験
４０Ｌの人工海水を張った６０Ｌの水槽に稚魚を投入し、エアレーションをかけながら８℃で４８時間無給餌で飼育した後、稚魚の生残数を数えた。海水移行試験後の生残数は、海水移行後生残率（％）として、水槽に投入した稚魚の数に対する百分率で表した。

（６）鰓Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ活性の解析
稚魚を２００ｐｐｍフェノキシエタノールで麻酔した後、左側の一番外側の鰓弁を採取し、解析まで−８０℃で凍結保存した。解析にあたっては、左側鰓サンプルをＳＥＩ緩衝液中で摩砕し、Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク質の定量を行った後、試料とした。この試料とＡＴＰを溶解したＳＥＩ緩衝液を混和し、３７℃で３０分間反応させた（酵素反応群）。また、同時に、Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅの阻害剤であるウアバインを添加して、同様に反応させた（酵素反応阻害群）。続いて、これらの反応液に含有される遊離リン量を測定し、酵素反応群と酵素反応阻害群の間の遊離リン量の差を求めた。鰓Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ活性の値は、鰓のタンパク質量および１時間当たりに出る遊離リン量の差（μｍｏｌ Ｐｉ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈ）として表した。

（７）鰓Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニット遺伝子発現量の解析
稚魚を２００ｐｐｍフェノキシエタノールで麻酔した後、右側の一番外側の鰓弁を採取し、解析までＲＮａｓｅ不活剤（ＲＮＡｌａｔｅｒ；Ａｍｂｉｏｎ社）中で保存した。解析にあたっては、右側鰓サンプルからＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後、ゲノムＤＮＡを除去するためＤＮａｓｅＩ処理を行い、試料とした。この試料をランダムプライマーと逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)とを用いて逆転写し、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、既知のＮａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニット遺伝子の配列から設計した特異的プライマー（フォワードプライマー；５’−ＡＧＣＴＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＴ−３’（配列番号３）、リバースプライマー；５’−ＡＴＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡ−３’（配列番号４））およびリアルタイムＰＣＲ装置（７５００型：アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。同一の鋳型および定量用プライマー（フォワードプライマー；５’−ＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡ−３’（配列番号５）、リバースプライマー；５’−ＧＧＣＧＧＧＡＡＣＧＴＴＧＡＡＧＧＴ−３’（配列番号６））を用いて、内部対照遺伝子（β−ａｃｔｉｎ遺伝子）の発現量の定量も行った。スタンダードには、予めｃＤＮＡクローニングにより得たサケＮａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニットｃＤＮＡ断片を用いた。鰓Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニット遺伝子発現量は、内部対照遺伝子の発現量に対する比較相対値として表した。

（８）血漿リゾチーム活性の解析
稚魚を２００ｐｐｍフェノキシエタノールで麻酔した後、尾柄部をメスで切断し、ヘパリン処理したヘマトクリット管に血液を採集した。採集した血液を４℃、２０００×ｇで１５分間遠心分離に供した後、上清（血漿）を回収した。一方、０．０６７Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２４）に０．１５ｍｇ／ｍLとなるようMicrococcus Lysodeikticusを懸濁し、細菌懸濁液を調製した。細菌懸濁液１００ｍＬに血漿５ｍＬを添加し、５分間、１分ごとに波長５４０ｎｍで吸光度測定を行って、１分当たりの吸光度変化の平均値を算出した。血漿に代えてリゾチーム標準品（Ｓｉｇｍａ社）を用いて同様の吸光度測定を行い、リゾチーム標準品１ｇが１分間に変化させる吸光度変化を１Ｕｎｉｔとした。血漿リゾチーム活性は、血漿１ｍＬ当たり１分間当たりのＵｎｉｔ（Ｕｎｉｔ／ｍＬ／ｍｉｎ）として表した。

（９）血漿コルチゾル量の解析
本実験方法（８）に記載の方法により、血漿を回収した。血漿からジエチルエーテルを用いてステロイドを抽出した。酵素免疫測定法によるコルチゾル測定キット（ＥＡ６５；Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いてステロイド中のコルチゾル量を測定した。血漿コルチゾル量は、血漿１ｍＬ当たりの量（ｎｇ／ｍＬ）として表した。

（１０）熱ショックタンパク質７０（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＨＳＰ７０）遺伝子発現量の解析
稚魚から肝臓を採取し、本実験方法（７）に記載の方法に準じて、肝臓サンプルからｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、既知のＨＳＰ７０遺伝子の配列から設計した特異的プライマー（フォワードプライマー；５’−ＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号７）、リバースプライマー；５’−ＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＴＴＧＴＴＣ−３’（配列番号８））およびリアルタイムＰＣＲ装置（７５００型：アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。同一の鋳型ならびに配列番号５および６の定量用プライマーを用いて、内部対照遺伝子（β−ａｃｔｉｎ遺伝子）の発現量の定量も行った。スタンダードには、予めｃＤＮＡクローニングにより得たサケＨＳＰ７０ ｃＤＮＡ断片を用いた。肝臓のＨＳＰ７０遺伝子発現量は、内部対照遺伝子の発現量に対する比較相対値として表した。

（１１）嗅覚応答の電気生理学的解析
麻酔剤（ＦＡ１００；ＤＳファーマアニマルヘルス社）を用いて稚魚を不動化させた。１０^−５ＭのＬ−セリンを流速約２．７ ｍＬ／分で約１分３０秒間稚魚の鼻腔内へと滴下することにより嗅覚を刺激し、嗅覚電図（Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｏｌｆａｃｔｏｇｒａｍ；ＥＯＧ）を記録した。また、同様に、飼育用水を滴下してＥＯＧを記録した。嗅覚応答の値は、飼育用水に対するＥＯＧ応答強度／１０^−５ＭのＬ−セリンに対するＥＯＧ応答強度の比較相対値として表した。

＜実施例１＞ハーブ精油の検討
（１）ハーブ精油の種類と添加濃度の検討
［１−１］事前投与
稚魚（平均体重０．３１ｇ、ｎ＝３０）を５００尾ずつ１３群に分け、第１〜１３群とした。各群に、表１に示す添加濃度および投与量となるよう、ハーブ精油（ハッカ油、ユーカリ油およびオレガノ油）を添加した飼料を給餌しながら、平成２６年１月２２日〜２月１４日まで約３週間飼育した。２月１４日に、各群の稚魚に寄生する原虫を観察または検出したところ、寄生は全く認められなかった。

［１−２］感染試験
続いて、各水槽に一辺１０ｃｍ角のバスケットかごを上部から吊す形で設置して、かごの中に、イクチオボド（平均寄生数 ０．１７ａｍｏｌ／ｇ体重、ｎ＝３０）およびトリコジナ（平均寄生数１０７個体／ｇ体重, ｎ＝３０）のいずれもが寄生している稚魚を５０尾ずつ（平均体重 ０．５０ｇ、ｎ＝３０）収容して飼育することにより、感染試験を行った。感染試験は２月１５日から４週間行った。感染試験中の飼料は、表１と同様のものを用いた。感染試験修了後（３月１５日）に各群から稚魚をランダムに７尾ずつ採集し、実験方法（３）および（４）に記載の方法によりトリコジナおよびイクチオボドを定量した。また、３月１５日までに各群で斃死した稚魚の累積尾数（累積斃死尾数）を数えた。１月２２日から３月１５日までの各群への総給餌量は５８０ｇだった。トリコジナの定量結果を図１に、イクチオボドの定量結果を図２に、稚魚の累積斃死尾数を図３にそれぞれ示す。

図１に示すように、トリコジナの寄生量（平均値）は、第１群（コントロール）では２３７７個体／ｇ体重であったのに対して、第２群（ハッカ油を０．００９重量％添加）では２１９０個体／ｇ体重、第３群（ハッカ油を０．０１８重量％添加）では２４５７個体／ｇ体重、第４群（ハッカ油を０．０４５重量％添加）では１２９１個体／ｇ体重、第５群（ハッカ油を０．０９０重量％添加）では２３１６個体／ｇ体重、第６群（ユーカリ油を０．００９重量％添加）では２４９３個体／ｇ体重、第７群（ユーカリ油を０．０１８重量％添加）では２４１２個体／ｇ体重、第８群（ユーカリ油を０．０４５重量％添加）では１２９１個体／ｇ体重、第９群（ユーカリ油を０．０９０重量％添加）では１８７４個体／ｇ体重、第１０群（オレガノ油を０．００９重量％添加）では１１２．７個体／ｇ体重、第１１群（オレガノ油を０．０１８重量％添加）では５．３１７個体／ｇ体重、第１２群（オレガノ油を０．０４５重量％添加）では１１３２個体／ｇ体重、第１３群（オレガノ油を０．０９０重量％添加）では２０１１個体／ｇ体重であった。

すなわち、オレガノ油を０．０９重量％添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して、有意差は無いものの、トリコジナの寄生量が小さい傾向であり、オレガノ油を０．００９重量％、０．０１８重量％および０．０４５重量％添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してトリコジナの寄生量が顕著に小さかった（Ｐ＜０．０５）。この結果から、オレガノ油は、サケ稚魚へのトリコジナの寄生を顕著に予防することが明らかになった。また、オレガノ油の飼料への添加濃度が０．０９重量％未満または投与量が２７ｍｇ／日／ｋｇ未満であれば、トリコジナの寄生の予防効果が得られることが明らかになった。

また、図２に示すように、イクチオボドの寄生量（平均値）は、第１群（コントロール）では４２．７６ａｍｏｌ／ｇ体重であったのに対して、第２群（ハッカ油を０．００９重量％添加）では３８．９５ａｍｏｌ／ｇ体重、第３群（ハッカ油を０．０１８重量％添加）では６９１．９ａｍｏｌ／ｇ体重、第４群（ハッカ油を０．０４５重量％添加）では６１．２０ａｍｏｌ／ｇ体重、第５群（ハッカ油を０．０９０重量％添加）では５２．２９ａｍｏｌ／ｇ体重、第６群（ユーカリ油を０．００９重量％添加）では２８．０８ａｍｏｌ／ｇ体重、第７群（ユーカリ油を０．０１８重量％添加）では２０．０６ａｍｏｌ／ｇ体重、第８群（ユーカリ油を０．０４５重量％添加）では１２３．５ａｍｏｌ／ｇ体重、第９群（ユーカリ油を０．０９０重量％添加）では８．５２３ａｍｏｌ／ｇ体重、第１０群（オレガノ油を０．００９重量％添加）では５．４０６ａｍｏｌ／ｇ体重、第１１群（オレガノ油を０．０１８重量％添加）では５．５７８ａｍｏｌ／ｇ体重、第１２群（オレガノ油を０．０４５重量％添加）では４５．７１ａｍｏｌ／ｇ体重、第１３群（オレガノ油を０．０９０重量％添加）では２０．２６ａｍｏｌ／ｇ体重であった。

すなわち、オレガノ油を０．００９重量％、０．０１８重量％および０．０９重量％添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してイクチオボドの寄生量が小さかった。特に、オレガノ油を０．００９重量％および０．０１８重量％添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してイクチオボドの寄生量が顕著に小さかった（Ｐ＜０．０５）。この結果から、オレガノ油は、サケ稚魚へのイクチオボドの寄生を顕著に予防することが明らかになった。また、オレガノ油を０．０４５重量％添加した飼料を給餌した群ではコントロールと比較してトリコジナの寄生量が同程度であったが、オレガノ油を０．００９重量％、０．０１８重量％および０．０９重量％添加した飼料を給餌した群ではコントロールと比較してイクチオボドの寄生量が減少したこと、および、後述する稚魚の斃死抑制効果がオレガノ油を０．０４５重量％添加した飼料を給餌した群においても顕著に得られることを鑑みれば、オレガノ油の飼料への添加濃度が０．０９重量％以下、または、投与量が２７ｍｇ／日／ｋｇ以下であれば、イクチオボドの寄生の予防効果が得られると考えられた。

最後に、図３に示すように、稚魚の累積斃死尾数は、第１群（コントロール）では３５３尾であったのに対して、第２群（ハッカ油を０．００９重量％添加）では２２３尾、第３群（ハッカ油を０．０１８重量％添加）では２０１尾、第４群（ハッカ油を０．０４５重量％添加）では１８０尾、第５群（ハッカ油を０．０９０重量％添加）では１８８尾、第６群（ユーカリ油を０．００９重量％添加）では１１１尾、第７群（ユーカリ油を０．０１８重量％添加）では９２尾、第８群（ユーカリ油を０．０４５重量％添加）では２４５尾、第９群（ユーカリ油を０．０９０重量％添加）では１８０尾、第１０群（オレガノ油を０．００９重量％添加）では３尾、第１１群（オレガノ油を０．０１８重量％添加）では１尾、第１２群（オレガノ油を０．０４５重量％添加）では５８尾、第１３群（オレガノ油を０．０９０重量％添加）では１７８尾であった。

すなわち、ハッカ油、ユーカリ油およびオレガノ油を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して稚魚の累積斃死尾数が小さくなった。特に、オレガノ油を０．００９重量％および０．０１８重量％添加した飼料を給餌した群では、稚魚の累積斃死尾数が顕著に小さかった。これらの結果から、オレガノ油は、サケ稚魚へのイクチオボドやトリコジナの寄生を予防することにより、サケ稚魚の斃死を顕著に抑制することが明らかになった。また、オレガノ油の飼料への添加濃度が０．０４５重量％未満、または、投与量が１３．５ｍｇ／日／ｋｇ未満である場合に、稚魚の斃死抑制効果が高くなることが明らかになった。

（２）オレガノ油中の有効成分の検討
［２−１］含有成分の解析
イクチオボドおよびトリコジナの寄生の予防効果が認められたオレガノ油を、下記の条件で、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）に供した。得られたマススペクトルの主要ピークについて、香料ライブラリーで検索して含有成分の同定を行った。また、得られたトータルイオンクロマトグラムの面積百分率により、各含有成分の含有割合を求めた。その結果を図４に示す。

試料調製；オレガノ油９０μＬをアセトン１５００μＬに溶解させた。
ＧＣ／ＭＳ装置；ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０ＳＥ
カラム；Ｒｔｘ−５ｍｓ（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）
サンプル注入量；０．５μＬ
気化室；温度２５０℃、スプリット比５０：１
ガスの種類；ヘリウム
ガス圧；３７．１ｋＰａ（線速度３２．４ｃｍ／秒）
カラム温度；５０℃から３℃／分で昇温し、３００℃で５分保持した。
イオン源温度；２００℃
インターフェイス温度；２５０℃
測定；４０〜４００ｍ／ｚまでスキャンモードにて測定

図４に示すように、オレガノ油には、カルバクロールが５８．９２重量％、パラ−シメンが１５．６５重量％、ガンマ−テルピネンが１０．５７重量％およびユーカリプトール（シネオール）が０．０６重量％含まれることが明らかになった。そこで、カルバクロール、パラ−シメン、ガンマ−テルピネンおよびシネオール（以下、まとめて「オレガノ油含有成分」という。）について、イクチオボドおよびトリコジナの寄生の予防効果を検討した。

［２−２］事前投与
具体的には、まず、原虫が全く寄生していない稚魚（平均体重１．８０ｇ、ｎ＝３０）を、１００尾ずつ６群に分け、第１〜６群とした。各群に、表２に示す添加濃度および投与量となるよう、オレガノ油、カルバクロール（試薬特級；和光純薬工業社）、パラ−シメン（試薬特級；和光純薬工業社）、ガンマ−テルピネン（試薬特級；和光純薬工業社）およびシネオール（試薬特級；和光純薬工業社）を添加した飼料を給餌しながら、平成２６年３月２１日〜４月４日まで２週間飼育した。なお、飼料における各オレガノ油含有成分の添加濃度および投与量は、オレガノ油の添加濃度を０．０１８重量％とした場合に相当する。

［２−３］感染試験
続いて、本実施例１（１）［１−２］に記載の方法により、４月５日から５月２日までの４週間、感染試験を行った。感染試験中の飼料は、表２と同様のものを用いた。なお、感染試験開始時には、各群の稚魚に原虫が全く寄生していないことを予め確認した。感染試験開始から１４日目（４月１８日）および２８日目（５月２日）に、各群から稚魚をランダムに１０尾採集し、実験方法（３）および（４）に記載の方法によりトリコジナおよびイクチオボドを定量した。また、各群ごとに、５月２日までの稚魚の累積斃死尾数を数えた。３月２１日から５月２日までの各群の総給餌量は１６０ｇだった。トリコジナの定量結果を図５に、イクチオボドの定量結果を図６に、稚魚の累積斃死尾数を図７にそれぞれ示す。

図５に示すように、２８日目のトリコジナの寄生量（平均値）は、第１群（コントロール）では２５８１個体／ｇ体重であったのに対して、第２群（オレガノ油を０．０１８重量％添加）では４８５．８個体／ｇ体重、第３群（カルバクロールを０．０１０重量％添加）では７７７．７個体／ｇ体重、第４群（パラ−シメンを０．００２８重量％添加）では７３２．８個体／ｇ体重、第５群（ガンマ−テルピネンを０．００１９重量％添加）では８３９．１個体／ｇ体重、第６群（シネオールを０．００００１０重量％添加）では２６３５個体／ｇ体重であった。

すなわち、シネオールを添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してトリコジナの寄生量は同程度であったのに対して、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメンおよびガンマ−テルピネンを添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してトリコジナの寄生量が顕著に小さかった（Ｐ＜０．０５）。この結果から、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメンおよびガンマ−テルピネンは、サケ稚魚へのトリコジナの寄生を予防することが明らかになった。

また、図６に示すように、２８日目のイクチオボドの寄生量（平均値）は、第１群（コントロール）では１．６５９ａｍｏｌ／ｇ体重であったのに対して、第２群（オレガノ油を０．０１８重量％添加）では０．６３１２ａｍｏｌ／ｇ体重、第３群（カルバクロールを０．０１０重量％添加）では０．９２１６ａｍｏｌ／ｇ体重、第４群（パラ−シメンを０．００２８重量％添加）では０．７３９８ａｍｏｌ／ｇ体重、第５群（ガンマ−テルピネンを０．００１９重量％添加）では３．２９４ａｍｏｌ／ｇ体重、第６群（シネオールを０．００００１０重量％添加）では２．４２０ａｍｏｌ／ｇ体重であった。

すなわち、ガンマ−テルピネンおよびシネオールを添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してイクチオボドの寄生量が大きかったのに対して、オレガノ油、カルバクロールおよびパラ−シメンを添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してイクチオボドの寄生量が顕著に小さかった（Ｐ＜０．０５）。この結果から、オレガノ油、カルバクロールおよびパラ−シメンは、サケ稚魚へのイクチオボドの寄生を予防することが明らかになった。

最後に、図７に示すように、稚魚の累積斃死尾数は、第１群（コントロール）では４５尾であったのに対して、第２群（オレガノ油を０．０１８重量％添加）では７尾、第３群（カルバクロールを０．０１０重量％添加）では１４尾、第４群（パラ−シメンを０．００２８重量％添加）では２４尾、第５群（ガンマ−テルピネンを０．００１９重量％添加）では４０尾、第６群（シネオールを０．００００１０重量％添加）では４３尾であった。

すなわち、シネオールを添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して稚魚の累積斃死尾数は同程度であったのに対して、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメンおよびガンマ−テルピネンを添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して稚魚の累積斃死尾数が小さくなった。この結果から、オレガノ油、カルバクロール、パラ−シメンおよびガンマ−テルピネンは、サケ稚魚へのイクチオボドやトリコジナの寄生を抑制することにより、サケ稚魚の斃死を抑制することが明らかになった。

＜実施例２＞食用・飼料添加用油の検討
（１）食用・飼料添加用油の種類と添加濃度の検討
［１−１］事前投与
稚魚（平均体重０．３１ｇ、ｎ＝３０）を５００尾ずつ１０群に分け、第１〜１０群とした。各群に、表３に示す添加濃度および投与量となるよう、食用油（綿実油および亜麻仁油）および飼料添加物フィードオイル（魚油）を添加した飼料を給餌しながら、平成２６年１月２２日〜２月１４日まで約３週間飼育した。２月１４日に、各群の稚魚に寄生する原虫を観察または検出したところ、寄生は全く認められなかった。

［１−２］感染試験
続いて、実施例１（１）［１−２］に記載の方法により感染試験を行った。ただし、感染試験中の飼料は、表３と同様のものを用いた。トリコジナの定量結果を図８に、イクチオボドの定量結果を図９に、稚魚の累積斃死尾数を図１０にそれぞれ示す。

図８に示すように、トリコジナの寄生量（平均値）は、第１群（コントロール）では２３７７個体／ｇ体重であったのに対して、第２群（魚油を０．９重量％添加）では８２１個体／ｇ体重、第３群（魚油を１．８重量％添加）では６８７．３個体／ｇ体重、第４群（魚油を２．７重量％添加）では９６７．５個体／ｇ体重、第５群（綿実油を０．９重量％添加）では１０７１個体／ｇ体重、第６群（綿実油を１．８重量％添加）では５３．８５個体／ｇ体重、第７群（綿実油を２．７重量％添加）では２４９３個体／ｇ体重、第８群（亜麻仁油を０．９重量％添加）では３２２９個体／ｇ体重、第９群（亜麻仁油を１．８重量％添加）では２．０７６個体／ｇ体重、第１０群（亜麻仁油を２．７重量％添加）では１．０００個体／ｇ体重であった。

すなわち、綿実油を０．９重量％および１．８重量％、ならびに亜麻仁油を１．８重量％および２．７重量％添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してトリコジナの寄生量が小さかった。特に、綿実油を１．８重量％、ならびに亜麻仁油を１．８重量％および２．７重量％添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してトリコジナの寄生量が顕著に小さかった（Ｐ＜０．０５）。この結果から、綿実油および亜麻仁油は、サケ稚魚へのトリコジナの寄生を予防することが明らかになった。また、綿実油の飼料への添加濃度が２．７重量％未満、または、投与量が８１０ｍｇ／日／ｋｇ体重未満である場合、および、亜麻仁油の飼料への添加濃度が０．９重量％より大、または、投与量が２７０ｍｇ／日／ｋｇより大である場合に、トリコジナの寄生の予防効果が得られることが明らかになった。

また、図９に示すように、イクチオボドの寄生量（平均値）は、第１群（コントロール）では４２．７６ａｍｏｌ／ｇ体重であったのに対して、第２群（魚油を０．９重量％添加）では２４．８３ａｍｏｌ／ｇ体重、第３群（魚油を１．８重量％添加）では２０．５６ａｍｏｌ／ｇ体重、第４群（魚油を２．７重量％添加）では１７．３８ａｍｏｌ／ｇ体重、第５群（綿実油を０．９重量％添加）では９．７８８ａｍｏｌ／ｇ体重、第６群（綿実油を１．８重量％添加）では２８．９４ａｍｏｌ／ｇ体重、第７群（綿実油を２．７重量％添加）では２．２０３ａｍｏｌ／ｇ体重、第８群（亜麻仁油を０．９重量％添加）では２．５７９ａｍｏｌ／ｇ体重、第９群（亜麻仁油を１．８重量％添加）では２．１０５ａｍｏｌ／ｇ体重、第１０群（亜麻仁油を２．７重量％添加）では８．０２４ａｍｏｌ／ｇ体重であった。

すなわち、綿実油を１．８重量％添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して、有意差は無いものの、イクチオボドの寄生量が小さい傾向であり、綿実油を０．９重量％および２．７重量％、ならびに亜麻仁油を０．９重量％、１．８重量％および２．７重量％添加した飼料を給餌した群ではコントロールと比較してイクチオボドの寄生量が小さかった。特に、綿実油を２．７重量％、ならびに亜麻仁油を０．９重量％、１．８重量％および２．７重量％添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してイクチオボドの寄生量が顕著に小さかった（Ｐ＜０．０５）。この結果から、綿実油および亜麻仁油は、サケ稚魚へのイクチオボドの寄生を予防することが明らかになった。そして、綿実油については、１．８重量％添加した飼料を給餌した群ではコントロールと比較してイクチオボドの寄生量に有意差が無かったが、０．９重量％および２．７重量％添加した飼料を給餌した群ではコントロールと比較してイクチオボドの寄生量が減少したこと、および、後述する稚魚の斃死抑制効果が綿実油を１．８重量％添加した飼料を給餌した群においても顕著に得られることを鑑みれば、綿実油の飼料への添加濃度が０．９重量％以上、または、投与量が２７０ｍｇ／日／ｋｇより以上であれば、イクチオボドの寄生の予防効果が得られると考えられた。また、亜麻仁油については、飼料への添加濃度が０．９重量％以上、または、投与量が２７０ｍｇ／日／ｋｇより以上であれば、イクチオボドの寄生の予防効果が得られることが明らかになった。

最後に、図１０に示すように、稚魚の累積斃死尾数は、第１群（コントロール）では３５３尾であったのに対して、第２群（魚油を０．９重量％添加）では９３尾、第３群（魚油を１．８重量％添加）では７３尾、第４群（魚油を２．７重量％添加）では７０尾、第５群（綿実油を０．９重量％添加）では２２尾、第６群（綿実油を１．８重量％添加）では５尾、第７群（綿実油を２．７重量％添加）では６１尾、第８群（亜麻仁油を０．９重量％添加）では９１尾、第９群（亜麻仁油を１．８重量％添加）では０尾、第１０群（亜麻仁油を２．７重量％添加）では４尾であった。

すなわち、魚油、綿実油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して稚魚の累積斃死尾数が小さくなった。特に、綿実油を１．８重量％、ならびに亜麻仁油を１．８重量％および２．７重量％添加した飼料を給餌した群で、稚魚の累積斃死尾数が顕著に小さかった。これらの結果から、綿実油および亜麻仁油は、サケ稚魚へのイクチオボドやトリコジナの寄生を予防することにより、サケ稚魚の斃死を顕著に抑制することが明らかになった。また、綿実油の飼料への添加濃度が０．９重量％以上２．７重量％未満、または、投与量が２７０ｍｇ／日／ｋｇ以上８１０ｍｇ／日／ｋｇ体重未満である場合、および、亜麻仁油の飼料への添加濃度が０．９重量％より大、または、投与量が２７０ｍｇ／日／ｋｇ体重より大である場合に、サケ稚魚の斃死抑制効果が高くなることが明らかになった。

（２）亜麻仁油中の有効成分の検討
［２−１］含有成分の解析
イクチオボドおよびトリコジナの寄生の予防効果が認められた亜麻仁油の脂肪酸組成を図１１に示す（関東化学株式会社試薬事業本部試薬技術部より提供）。図１１に示すように、亜麻仁油には、リノレン酸が５８重量％、リノール酸が１５重量％含まれることが明らかになった。そこで、リノール酸およびリノレン酸について、イクチオボドおよびトリコジナの寄生の予防効果を検討した。

［２−２］事前投与
具体的には、まず、稚魚（平均体重０．３１ｇ、ｎ＝３０）を５００尾ずつ４群に分け、第１〜４群とした。各群に、表４に示す添加濃度および投与量となるよう、リノール酸（試薬特級；和光純薬工業社）およびリノレン酸（試薬特級；和光純薬工業社）を添加した飼料を給餌しながら、平成２６年１月２２日〜２月１４日まで約３週間飼育した。２月１４日に、各群の稚魚に寄生する原虫を観察または検出したところ、寄生は全く認められなかった。

［２−３］感染試験
続いて、実施例１（１）［１−２］に記載の方法により感染試験を行った。ただし、感染試験中の飼料は、表４と同様のものを用いた。その結果を図１２に示す。

図１２の左側のグラフに示すように、トリコジナの寄生量（平均値）は、第１群（コントロール）では２３７７個体／ｇ体重であったのに対して、第２群（リノール酸を０．９重量％添加）では１９８．７個体／ｇ体重、第３群（リノレン酸を０．９重量％添加）では０個体／ｇ体重、第４群（リノール酸およびリノレン酸を各０．９重量％添加）では約６９．７３個体／ｇ体重であった。すなわち、リノール酸およびリノレン酸を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してトリコジナの寄生量が顕著に小さかった（Ｐ＜０．０５）。この結果から、リノール酸およびリノレン酸は、サケ稚魚へのトリコジナの寄生を予防することが明らかになった。

また、図１２の中央のグラフに示すように、イクチオボドの寄生量（平均値）は、第１群（コントロール）では４２．７６ａｍｏｌ／ｇ体重であったのに対して、第２群（リノール酸を０．９重量％添加）では１２９．０ａｍｏｌ／ｇ体重、第３群（リノレン酸を０．９重量％添加）では６．３０２ａｍｏｌ／ｇ体重、第４群（リノール酸およびリノレン酸を各０．９重量％添加）では４４．３２ａｍｏｌ／ｇ体重であった。すなわち、リノレン酸を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較してイクチオボドの寄生量が顕著に小さかった（Ｐ＜０．０５）。この結果から、リノレン酸は、サケ稚魚へのイクチオボドの寄生を予防することが明らかになった。

最後に、図１２の右側のグラフに示すように、稚魚の累積斃死尾数は、第１群（コントロール）では３５３尾であったのに対して、第２群（リノール酸を０．９重量％添加）では１尾、第３群（リノレン酸を０．９重量％添加）では１尾、第４群（リノール酸およびリノレン酸を各０．９重量％添加）では１０尾であった。すなわち、リノール酸およびリノレン酸を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して稚魚の累積斃死尾数が顕著に小さくなった。この結果から、リノール酸およびリノレン酸は、サケ稚魚へのイクチオボドやトリコジナの寄生を予防することにより、サケ稚魚の斃死を顕著に抑制することが明らかになった。

＜実施例３＞投与期間の検討
（１）事前投与
原虫が全く寄生していない稚魚（平均体重１．８０ｇ、ｎ＝３０）を、１００尾ずつ１２群に分け、第１〜１２群とした。この１２群を４群ずつのグループに分け、グループ１〜３とした。グループ２および３の各群には、感染試験の前に、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌しながらの飼育（以下、「事前投与の飼育」という。）を行った。オレガノ油および亜麻仁油の飼料への添加濃度および投与量は表５のとおりとした。事前投与の飼育は、グループ２は７日間（平成２６年３月２１日〜３月２８日まで）、グループ３は１４日間（平成２６年３月２１日〜４月４日まで）行った。グループ１は、事前投与の飼育を行わなかった。

（２）感染試験
続いて、グループ１〜３のそれぞれについて、実施例１（１）［１−２］に記載の方法により４週間の感染試験を行った。ただし、感染試験中の飼料は、表５と同様のものを用いた。なお、各グループの感染試験開始時には、稚魚に原虫が全く寄生していないことを予め確認した。感染試験開始から１４日目に、各群から１０尾の稚魚をサンプリングし、実験方法（３）および（４）に記載の方法によりトリコジナおよびイクチオボドを定量した。また、感染試験開始から２８日目に、稚魚の累積斃死尾数を求めた。各グループに飼育期間（事前投与の飼育と感染試験中の飼育を合わせた期間）中給餌した総給餌量は、グループ１で１２０ｇ、グループ２で１４０ｇ、グループ３で１６０ｇだった。トリコジナの定量結果を図１３に、イクチオボドの定量結果を図１４に、稚魚の累積斃死尾数を図１５にそれぞれ示す。

図１３に示すように、グループ１のトリコジナの寄生量（平均値）は、第１群（コントロール）では５９５．１個体／ｇ体重であったのに対して、第２群（オレガノ油を添加）では４７１．１個体／ｇ体重、第３群（亜麻仁油を添加）では３３３．６個体／ｇ体重、第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では３８３．０個体／ｇ体重であった。また、グループ２のトリコジナの寄生量（平均値）は、第５群（コントロール）では６４６．４個体／ｇ体重であったのに対して、第６群（オレガノ油を添加）では２６５．０個体／ｇ体重、第７群（亜麻仁油を添加）では２１０．５個体／ｇ体重、第８群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では２１８．６個体／ｇ体重であった。また、グループ３のトリコジナの寄生量（平均値）は、第９群（コントロール）では４４４．６個体／ｇ体重であったのに対して、第１０群（オレガノ油を添加）では７０．７８個体／ｇ体重、第１１群（亜麻仁油を添加）では５４．９６個体／ｇ体重、第１２群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では３９．４８個体／ｇ体重であった。

すなわち、グループ１では、コントロールと比較してトリコジナの寄生量の顕著な減少は認められなかったのに対して、グループ２および３では、コントロールと比較してトリコジナの寄生量が顕著に小さかった（Ｐ＜０．０５）。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、サケ稚魚のトリコジナ症の治療には有効でない一方で、予防に有効であることが明らかになった。また、トリコジナ症に感染していないサケ稚魚にオレガノ油および／または亜麻仁油を７日間以上投与すると、トリコジナの寄生の予防効果が高くなることが明らかになった。

また、図１４に示すように、グループ１のイクチオボドの寄生量（平均値）は、第１群（コントロール）では７．０８５ａｍｏｌ／ｇ体重であったのに対して、第２群（オレガノ油を添加）では５．２９４ａｍｏｌ／ｇ体重、第３群（亜麻仁油を添加）では３．８６４ａｍｏｌ／ｇ体重、第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では４．０１９ａｍｏｌ／ｇ体重であった。 また、グループ２のイクチオボドの寄生量（平均値）は、第５群（コントロール）では６．５５５ａｍｏｌ／ｇ体重であったのに対して、第６群（オレガノ油を添加）では０．５２９８ａｍｏｌ／ｇ体重、第７群（亜麻仁油を添加）では０．９０５６ａｍｏｌ／ｇ体重、第８群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では０．６４１１ａｍｏｌ／ｇ体重であった。また、グループ３のイクチオボドの寄生量（平均値）は、第９群（コントロール）では５．２４７ａｍｏｌ／ｇ体重であったのに対して、第１０群（オレガノ油を添加）では０．２７５７ａｍｏｌ／ｇ体重、第１１群（亜麻仁油を添加）では０．１９８６ａｍｏｌ／ｇ体重、第１２群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では０．３２７１ａｍｏｌ／ｇ体重であった。

すなわち、グループ１では、コントロールと比較してイクチオボドの寄生量の顕著な減少は認められなかったのに対して、グループ２および３では、コントロールと比較してイクチオボドの寄生量が顕著に小さかった（Ｐ＜０．０５）。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、サケ稚魚のイクチオボド症の治療には有効でない一方で、予防に有効であることが明らかになった。また、イクチオボド症に感染していないサケ稚魚にオレガノ油および／または亜麻仁油を７日間以上投与すると、イクチオボドの寄生の予防効果が高くなることが明らかになった。

最後に、図１５に示すように、グループ１の稚魚の累積斃死尾数は、第１群（コントロール）では４４尾であったのに対して、第２群（オレガノ油を添加）では４６尾、第３群（亜麻仁油を添加）では４０尾、第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では３８尾であった。また、グループ２の稚魚の累積斃死尾数は、第５群（コントロール）では４０尾であったのに対して、第６群（オレガノ油を添加）では２２尾、第７群（亜麻仁油を添加）では１７尾、第８群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では１７尾であった。また、グループ３の稚魚の累積斃死尾数は、第９群（コントロール）では４５尾であったのに対して、第１０群（オレガノ油を添加）では７尾、第１１群（亜麻仁油を添加）では５尾、第１２群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では３尾であった。

すなわち、グループ１では、コントロールと比較して稚魚の累積斃死尾数の顕著な減少は認められなかったのに対して、グループ２および３では、コントロールと比較して稚魚の累積斃死尾数が顕著に小さかった。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、トリコジナ症やイクチオボド症に対して、治療ではなく予防することにより、稚魚の斃死を抑制することが明らかになった。また、トリコジナ症やイクチオボド症に感染していない稚魚にオレガノ油および／または亜麻仁油を７日間以上投与すると、稚魚の斃死抑制効果が高くなることが明らかになった。

＜実施例４＞オレガノ油および亜麻仁油の安全性検証
（１）非感染魚での比較
原虫が全く寄生していない稚魚（平均体重１．８０ｇ、ｎ＝３０） を、１００尾ずつ４群に分け、第１〜４群とした。各群に、表５のグループ１の第１〜４群と同様にオレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌しながら、平成２６年３月２１日〜５月２日まで６週間飼育した。その後、各群の稚魚の体重を測定し、実験方法（５）〜（１１）に記載の方法により、海水移行試験（各群につき３０尾）、鰓Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ活性の解析、Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニット遺伝子発現量の解析、血漿リゾチーム活性の解析、血漿コルチゾル量の解析、ＨＳＰ７０遺伝子発現量の解析および嗅覚応答の電気生理学的解析に供した。その結果を図１６に示す。なお、この飼育期間終了後、各群の稚魚に寄生する原虫を観察または検出したところ、寄生は全く認められなかった。また、全群について斃死は１尾もなかった。

図１６に示すように、稚魚の体重（平均値）は、第１群（コントロール）では３．３３４ｇであったのに対して、第２群（オレガノ油を添加）では３．２９７ｇ、第３群（亜麻仁油を添加）では３．４１５ｇ、第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では３．４０７ｇであった。すなわち、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群の稚魚の体重は、コントロールと同程度であった（Ｐ＞０．０５：一元配置分散分析法）。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、サケ稚魚の成長に影響を及ぼさないことが明らかになった。

また、海水移行試験後の生残率は、第１群（コントロール）、第２群（オレガノ油を添加）、第３群（亜麻仁油を添加）および第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）のいずれにおいても１００％であった。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、サケ稚魚の海水適応能に影響を及ぼさないことが明らかになった。

また、鰓のＮａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ活性は、第１群（コントロール）では１．４８２μｍｏｌ Ｐｉ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈであったのに対して、第２群（オレガノ油を添加）では１．８７１μｍｏｌ Ｐｉ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈ、第３群（亜麻仁油を添加）では１．４２０μｍｏｌ Ｐｉ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈ、第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では１．４５０μｍｏｌ Ｐｉ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈであった。すなわち、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群の鰓Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ活性は、コントロールと同程度であった（Ｐ＞０．０５：一元配置分散分析法）。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、サケ稚魚の浸透圧調節機能に影響を及ぼさないことが明らかになった。

また、鰓のＮａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニット遺伝子発現量は、第１群（コントロール）では１７．３７であったのに対して、第２群（オレガノ油を添加）では８．０１１、第３群（亜麻仁油を添加）では７．１８０、第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では１２．４３であった。すなわち、コントロールとオレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群とで、鰓Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニット遺伝子発現量に有意な差は認められなかった（Ｐ＞０．０５：一元配置分散分析法）。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、サケ稚魚の鰓Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニット遺伝子発現量に影響を及ぼさないことが明らかになった。

また、血漿リゾチーム活性は、第１群（コントロール）では１１．３４Ｕｎｉｔ／ｍＬ／ｍｉｎであったのに対して、第２群（オレガノ油を添加）では５．５４４Ｕｎｉｔ／ｍＬ／ｍｉｎ、第３群（亜麻仁油を添加）では４．５３６Ｕｎｉｔ／ｍＬ／ｍｉｎ、第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では７．５１８Ｕｎｉｔ／ｍＬ／ｍｉｎであった。すなわち、コントロールとオレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群とで、血漿リゾチーム活性に有意な差は認められなかった（Ｐ＞０．０５：一元配置分散分析法）。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、稚魚の免疫機能に影響を及ぼさないことが明らかになった。

また、血漿コルチゾル量は、第１群（コントロール）では２．２０２ｎｇ／ｍＬであったのに対して、第２群（オレガノ油を添加）では２．１４２ｎｇ／ｍＬ、第３群（亜麻仁油を添加）では２．４１５ｎｇ／ｍＬ、第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では２．６８１ｎｇ／ｍＬであった。すなわち、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群の血漿コルチゾル量は、コントロールと同程度であった（Ｐ＞０．０５：一元配置分散分析法）。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、稚魚のストレス応答に影響を及ぼさないことが明らかになった。

また、肝臓のＨＳＰ７０遺伝子発現量は、第１群（コントロール）では２４２８であったのに対して、第２群（オレガノ油を添加）では１４０２、第３群（亜麻仁油を添加）では２３７１、第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では３４０４であった。すなわち、コントロールとオレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群とで、肝臓のＨＳＰ７０遺伝子発現量に有意な差は認められなかった（Ｐ＞０．０５：一元配置分散分析法）。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、稚魚のストレス応答に影響を及ぼさないことが明らかになった。

最後に、嗅覚応答の値は、第１群（コントロール）では４．８３８であったのに対して、第２群（オレガノ油を添加）では４．５０４、第３群（亜麻仁油を添加）では４．２７１、第４群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では４．３２０であった。すなわち、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群の嗅覚応答の値は、コントロールと同程度であった（Ｐ＞０．０５：一元配置分散分析法）。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、稚魚の嗅覚応答に影響を及ぼさないことが明らかになった。

以上の本実施例４（１）の結果から、オレガノ精油および亜麻仁油は、稚魚の成長や各種生理機能に悪影響を与えないことが明らかになった。

（２）感染試験後の比較
実施例３（２）の感染試験修了時に、グループ３の各群から稚魚をランダムに採集し、体重を測定し、実験方法（５）〜（９）に記載の方法により、海水移行試験（各群につき３０尾）、Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ活性の解析、Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニット遺伝子発現量の解析、血漿リゾチーム活性の解析および血漿コルチゾル量の解析に供した。その結果を図１７に示す。

図１７に示すように、稚魚の体重（平均値）は、第９群（コントロール）では２．７９９ｇであったのに対して、第１０群（オレガノ油を添加）では３．１９９ｇ、第１１群（亜麻仁油を添加）では３．３１４ｇ、第１２群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では３．３１３ｇであった。すなわち、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して稚魚の体重が大きかった（Ｐ＜０．０５：一元配置分散分析法および多重比較検定Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法）。これは、コントロールでは、トリコジナやイクチオボドの寄生により成長が抑制されたのに対して、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、トリコジナやイクチオボドの寄生が予防された結果、稚魚の成長抑制も軽減されたものと考えられる。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、トリコジナやイクチオボドの寄生によるサケ稚魚の成長への悪影響を軽減することが明らかになった。

また、海水移行試験後の生残率は、第９群（コントロール）では０％であったのに対して、第１０群（オレガノ油を添加）および第１１群（亜麻仁油を添加）では８０％、第１２群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では８３．３３％であった。すなわち、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して生残率が顕著に大きかった。これは、コントロールでは、トリコジナやイクチオボドの寄生により稚魚の鰓がダメージを受けて海水適応能が失われたのに対して、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、トリコジナやイクチオボドの寄生が予防された結果、鰓のダメージも軽減され、海水適応能が維持されたものと考えられる。この結果から、オレガノ油や亜麻仁油は、トリコジナやイクチオボドの寄生によるサケ稚魚の海水適応能への悪影響を軽減することが明らかになった。

また、鰓のＮａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ活性は、第９群（コントロール）では０．３７６μｍｏｌ Ｐｉ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈであったのに対して、第１０群（オレガノ油を添加）では１．０７３μｍｏｌ Ｐｉ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈ、第１１群（亜麻仁油を添加）では１．１５６μｍｏｌ Ｐｉ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈ、第１２群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では１．１３４μｍｏｌ Ｐｉ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈであった。すなわち、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して鰓Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ活性が顕著に大きかった（Ｐ＜０．０５：一元配置分散分析法および多重比較検定Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法）。これは、コントロールでは、トリコジナやイクチオボドの寄生により稚魚の鰓がダメージを受けて鰓からのＮａ^＋の能動的排出能力が低下したのに対して、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、トリコジナやイクチオボドの寄生が予防された結果、鰓のダメージも軽減され、鰓からのＮａ^＋の能動的排出能力が維持されたものと考えられる。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、トリコジナやイクチオボドの寄生によるサケ稚魚の鰓の浸透圧調節機能への悪影響を軽減することが明らかになった。

また、鰓のＮａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニット遺伝子発現量は、第９群（コントロール）では２．１２３であったのに対して、第１０群（オレガノ油を添加）では５．７３１、第１１群（亜麻仁油を添加）では５．００９、第１２群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では５．８４９であった。すなわち、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して、鰓Ｎａ^＋，Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ αサブユニット遺伝子発現量が顕著に大きかった（Ｐ＜０．０５：一元配置分散分析法および多重比較検定Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法）。これは、コントロールでは、トリコジナやイクチオボドの寄生により稚魚の鰓がダメージを受けて当該遺伝子の発現量が低下したのに対して、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、トリコジナやイクチオボドの寄生が予防された結果、鰓のダメージも軽減されて当該遺伝子の発現量が維持されたものと考えられる。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、トリコジナやイクチオボドの寄生によるサケ稚魚の海水適応能への悪影響を軽減することが明らかになった。

また、血漿リゾチーム活性は、第９群（コントロール）では０．６０７Ｕｎｉｔ／ｍＬ／ｍｉｎであったのに対して、第１０群（オレガノ油を添加）では４．６６７Ｕｎｉｔ／ｍＬ／ｍｉｎ、第１１群（亜麻仁油を添加）では６．４７４Ｕｎｉｔ／ｍＬ／ｍｉｎ、第１２群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では５．５１７Ｕｎｉｔ／ｍＬ／ｍｉｎであった。すなわち、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して、血漿リゾチーム活性が顕著に大きかった（Ｐ＜０．０５：一元配置分散分析法および多重比較検定Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法）。これは、コントロールでは、トリコジナやイクチオボドの寄生によりリゾチーム量またはその活性が減少したのに対して、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、トリコジナやイクチオボドの寄生が予防された結果、リゾチーム量またはその活性も維持されたものと考えられる。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、トリコジナやイクチオボドの寄生によるサケ稚魚の免疫機能への悪影響を軽減することが明らかになった。

また、血漿コルチゾル量は、第９群（コントロール）では１．１３７ｎｇ／ｍＬであったのに対して、第１０群（オレガノ油を添加）では２．７６３ｎｇ／ｍＬ、第１１群（亜麻仁油を添加）では３．１４７ｎｇ／ｍＬ、第１２群（オレガノ油および亜麻仁油を添加）では３．０３６ｎｇ／ｍＬであった。すなわち、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、コントロールと比較して、血漿コルチゾル量が顕著に大きかった（Ｐ＜０．０５：一元配置分散分析法および多重比較検定Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法）。これは、コントロールでは、トリコジナやイクチオボドの寄生により稚魚が弱ったために、ストレス応答に伴うコルチゾル量の増加が起こらなくなったのに対して、オレガノ油および亜麻仁油を添加した飼料を給餌した群では、トリコジナやイクチオボドの寄生が予防された結果、ストレス応答に伴うコルチゾル量の増加反応も維持されたものと考えられる。この結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、トリコジナやイクチオボドの寄生によるサケ稚魚のストレス応答能への悪影響を軽減することが明らかになった。

以上の本実施例４（２）の結果から、オレガノ油および亜麻仁油は、トリコジナやイクチオボドの寄生によるサケ稚魚の成長や各種生理機能への悪影響を、顕著に軽減することが明らかになった。

Claims (6)

1. カルバクロールおよび／またはリノレン酸を含有する、放流用サケ稚魚のイクチオボド症を予防する感染症予防剤。
2. カルバクロールおよび／またはリノレン酸を含有する、放流用サケ稚魚のトリコジナ症を予防する感染症予防剤。
3. 前記カルバクロールおよび／またはリノレン酸が下記の投与量または添加濃度で飼料に添加して用いられる、請求項１に記載の感染症予防剤；
   カルバクロール；投与量１５．９１ｍｇ／日／ｋｇ体重以下、添加濃度０．０５３重量％以下、
   リノレン酸；投与量１５６．６ｍｇ／日／ｋｇ体重以上、添加濃度０．５重量％以上。
4. 前記カルバクロールおよび／またはリノレン酸が下記の投与量または添加濃度で飼料に添加して用いられる、請求項２に記載の感染症予防剤；
   カルバクロール；投与量１５．９１ｍｇ／日／ｋｇ体重未満、添加濃度０．０５３重量％以下、
   リノレン酸；投与量１５６．６ｍｇ／日／ｋｇ体重より大、添加濃度０．５重量％より大。
5. 請求項１から４のいずれかに記載の感染症予防剤を放流用サケ稚魚に投与する工程を有する、放流用サケ稚魚の感染症を予防する方法。
6. トリコジナ症およびイクチオボド症に感染していない放流用サケ稚魚に前記感染症予防剤を７日間以上投与する工程を有する、請求項５に記載の方法。