ES2259738T3

ES2259738T3 - Uso de bronopol para el tratamiento de enfermedades en huevos de peces.

Info

Publication number: ES2259738T3
Application number: ES03002673T
Authority: ES
Inventors: Julian Charles Braidwood
Original assignee: Vericore Ltd
Current assignee: Vericore Ltd
Priority date: 1996-08-01
Filing date: 1997-07-29
Publication date: 2006-10-16
Anticipated expiration: 2017-07-29
Also published as: EP0954296B9; US6160023A; EP1310246A3; DE69725610T2; DE69735558D1; DK0954296T3; EP1310246A2; DE69735558T2; GB9616139D0; PT954296E; DK1310246T3; CY2519B1; WO1998005311A1; AU3702597A; PT1310246E; DE69725610D1; ATE251904T1; EP1310246B1; EP0954296B1; EP0954296A1

Abstract

El uso de bronopol (2-bromo-2-nitropropano-1, 3-diol) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento para cualquiera de las siguientes enfermedades en huevos de peces: infecciones por hongos, infecciones por protozoarios flagelados, infecciones por protozoarios ciliados, enfermedad bacteriana de las branquias, e infecciones micobacterianas.

Description

Uso de bronopol para el tratamiento de enfermedades en huevos de peces.

Esta invención se relaciona con el tratamiento de infecciones de hongos especialmente Saprolegnia parasítica de huevos de peces, particularmente, pero no exclusivamente, trucha, salmón, salmónidos en general. La invención también provee tratamientos para otras enfermedades de peces como infecciones bacterianas (por ejemplo la enfermedad bacteriana de las branquias- Flavobacterium branchiophilum y Cytophaga psychrophila), infecciones protozoarias como ciliados (por ejemplo Ichthyophthirius multifiliis) y flagelados (por ejemplo Ichthyobodo necatrix).

Saprolegnia parasítica es un parásito fúngico de rápida propagación y es fatal, afectando al pez y a los huevos de pez. Es convencionalmente tratado con verde de malaquita (díamino-trifenilmetano), pero aunque este tratamiento es altamente efectivo, el uso de verde de malaquita trae un número de problemas potenciales: el compuesto ha sido sugerido como un posible carcinógeno y teratógeno, aunque estos efectos todavía no están comprobados; siendo un tinte fuerte, tiende a decolorar el agua, y puede, bajo ciertas circunstancias, causar manchas en los peces que han sido tratados; tiene un periodo de retención relativamente largo, por lo que residuos significantes pueden estar presentes en peces tratados cuando son cosechados y vendidos para consumo; y el compuesto no esta licenciado como un medicamento veterinario, y de hecho su uso es prohibido en los criaderos Federales de EEUU. El artículo por D.J. Alderman en el Journal of Fish Diseases 8(1985) 289-298 da una crítica del uso de verde de malaquita en el tratamiento de enfermedades de peces, y discute algunos problemas asociados con este.

Una alternativa a la verde de malaquita disponible actualmente es formalina, la cual es la sustancia ahora utilizada en los criaderos Federales de EEUU. Sin embargo, debido al poder de irritación de la sustancia, solamente puede ser utilizada bajo condiciones estrictamente controladas. Existe por lo tanto la necesidad para un tratamiento mejorado para hongos y otras enfermedades de los peces, particularmente uno que combine alta eficacia con baja toxicidad. Varios intentos para identificar nuevos tratamientos se han hecho en el pasado y los resultados de la exploración de 40 sustancias potencialmente alternativas son mostradas en el artículo por D.J. Alderman que apareció en el Journal of Fish Diseases 5 (1982) 113-123, la cual también plantea protocolos estándar para las pruebas de tratamientos candidatos. Sin embargo, a pesar de este y otro trabajo (como el descrito en el artículo por T.A. Bailey que apareció en Aquaculture 38 (1984) 97-104), los solicitantes no están consientes de ningún tratamiento alternativo adecuado, a la verde de malaquita y la formalina, que haya llegado al mercado.

Ahora se ha encontrado que bronopol (2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol) tiene buena actividad a relativamente bajas concentraciones contra Saprolegnia parasítica, y es seguro utilizarlo. Bronopol es un compuesto conocido, y es utilizado en concentraciones entre 0.01% y 0.2% como un preservativo antimicrobiano y un antiséptico en formulaciones tópicas farmacéuticas, cosméticos, y artículos de aseo. Combinaciones de bronopol también son conocidas en la técnica veterinaria. Por ejemplo GB2263063 se refiere a una combinación de bronopol, formaldehído y una sal cuaternaria de amonio, que es efectivo en el tratamiento de ulceraciones, enfermedades bacterianas en las branquias e infecciones bacterianas sistémicas. No se mencionan los efectos de la mezcla que contiene bronopol en el tratamiento de infecciones de hongos o micobacterianas en huevos de peces. HU38833 revela una mezcla de bronopol, bradofen y silicona el cual tiene aplicaciones veterinarias, como un fungicida, in embargo, no menciona si aquella mezcla seria eficaz en un ambiente acuático en peces y en otros organismos acuáticos. Es indicado sin embargo en el "Manual de Excipientes Farmacéuticos" publicado por The Pharmaceutical Press (1994) que una de las desventajas mayores de bronopol es su actividad relativamente pobre contra levaduras y mohos. Es por lo tanto sorprendente que bronopol sea efectivo en concentraciones relativamente bajas contra Saprolegnia.

Como será descrito en mayor detalle abajo, se ha mostrado que bronopol es efectivo contra la infección de Saprolegnia parasítica en salmón, trucha y huevos de trucha. Es previsto, sin embargo, que el tratamiento será efectivo contra la misma infección en otras especies salmónidas, y por supuesto en huevos de peces. Es esperado que también habrá eficacia contra otras infecciones de hongos. Además, como se ha mostrado en los ensayos descritos abajo que bronopol previene o reduce la rapidez de proliferación de la infección, también puede ser utilizado como un profiláctico.

Bronopol es un producto comercial disponible de un número de fuentes. Puede ser fabricado al reaccionar nitrometano con paraformaldehído en un ambiente alcalino, seguido por brominación. También se sabe que algunos compuestos (tales como 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxano) se rompen para liberar bronopol, y la invención por lo tanto también se extiende al uso de tales compuestos en lugar de bronopol.

Por lo tanto, la invención provee, en un aspecto, el uso de bronopol en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de infecciones de hongos en huevos de pez. Más específicamente, la invención se relaciona al uso de bronopol en el tratamiento o profilaxis de Saprolegnia parasítica. Un uso particular de la invención será en el tratamiento de huevos de pez salmónidos, particularmente trucha y salmón.

La invención también se extiende al uso de bronopol en la fabricación de un medicamento para tratar, huevos de pez que sufran de infecciones por hongos administrando bronopol en un baño de tratamiento en una cantidad farmacéuticamente eficiente. Preferiblemente el método incluye el paso de parar el flujo de agua mientras se administra el tratamiento, preferiblemente por un periodo de no menos de 30 minutos.

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Preferiblemente, la concentración de bronopol en el baño de tratamiento está en el rango de 1 mg.l-1(ppm) a 1000 mg.l-1 mas preferible 5 mg.l-1 a 200 mg.l-1, e idealmente 10 mg.l-1 to 100 mg.l-1. Bronopol es una sustancia sólida cristalina, y puede ser preparada convenientemente como una solución en un solvente polar, como agua o Dowanol (dipropileno glicol monoetileter).

Prueba 1 (abajo) fue conducida en condiciones ligeramente alcalinas (aproximadamente pH 7.4 a 7.5) y es posible que éstas condiciones sean favorables para la actividad anti-hongos demostrada por bronopol.

Durante las pruebas, bronopol fue probado contra varias enfermedades de los peces, y se encontró que es efectivo contra Ichthyobodo necatrix, el cual es un ectoparásito protozoario flagelado, Flavobacterio branquiofilo (el organismo que causa la enfermedad bacteriana de las branquias), y Cytophaga psychrophila, el cual es unA micobacteria y el organismo que causa el Síndrome de Arcoiris de Trucha, enfermedad de Agua Fría, Saddleback y enfermedad de Peduncle en peces salmónidos. La actividad contra Cytophaga indica la posible eficacia contra micobacterias en general, y la actividad contra Ichthyobodo sugiere eficacia contra flagelados en general, como también protozoarios ciliados como Ichthyophthirius multifiliis.

Por lo tanto, en otro aspecto la invención se extiende al uso de bronopol en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección protozoaria, tal como un flagelado (por ejemplo Ichthyobodo necatrix) o un ciliado (como Ichthyophthirius multifiliis) en peces u otros organismos acuáticos, particularmente peces salmónidos, y especialmente trucha.

En un aspecto alternativo, la invención se extiende al uso de bronopol, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de la enfermedad bacteriana de las branquias (por ejemplo Flavobacterium branchiophilum) en peces u otros organismos acuáticos, particularmente peces salmónidos, y especialmente trucha.

La invención también incluye el uso de bronopol en la fabricación de un medicamento para tratar tales infecciones de protozoarios o de flavobacterias en peces u otros organismos acuáticos administrando bronopol en un baño de tratamiento en una cantidad farmaceuticamente efectiva.

Preferiblemente, el bronopol es administrado en una concentración entre 1 a 500 mg,1-1, mas preferible entre 10 a 100 mg.1-1.

Es posible que bronopol también pueda ser efectivo tratando peces sufriendo de infecciones micobacterianas, y la invención por lo tanto también se extiende al uso de bronopol en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de infecciones micobacterianas (particularmente Cytophaga psychrophila) de peces u otros organismos acuáticos, particularmente peces salmónidos, y especialmente trucha.

La invención es de ahora en adelante descrita en más detalle por medio de ejemplos solamente, con referencia a las siguientes pruebas experimentales:

Prueba 1

Eficacia en vitro de bronopol contra Saprolegnia parasítica

Esta prueba fue realizada utilizando procedimientos descritos en el Journal of Fish Diseases (1982)5, 113-123, citados arriba.

Preparación de Inóculos

Un cultivo de Saprolegnia parasítica fue mantenido a 16ºC en agua de río, glucosa, agar de extracto de levadura (RGY), consistiendo de extracto de levadura (1 g), D(+) glucosa (5 g), y agar (12 g) en 11 agua de río. Placas de RGY fueron sembradas con el organismo de prueba y encubadas a 25ºC hasta que el crecimiento apenas cubría el diámetro completo de la placa (aproximadamente 72 horas). Discos fueron cortados de los 10 mm externos del cultivo, utilizando un punzón de 4-mm de diámetro (adaptado de un punzón de pozos de gel de cromatografía soldándole una manija) y después utilizado como un inocula stándar para pruebas.

Prueba 1A

Método

Bronopol fue probado para actividad contra los cultivos de Saprolegnia parasítica a diferentes concentraciones que varían entre 50 mg.l-1 a 100 mg.l-1, utilizando Protocolo II del antes mencionado artículo de J. Fish Diseases, como sigue. Membranas de filtro policarbonado de 0.2-\mum de porosidad y 25-mm de diámetro (Nuclepore; Sterlin) fueron esterilizados por autoclave y después colocados en la superficie de placas RGY (7 por 90-mm placa de petri). Un disco de inoculación estándar de 4-mm fue después colocado, invertido, en el centro del filtro. Los platos que contienen los filtros fueron luego encubados hasta que el tapete micelial resultante estaba casi por llegar a los bordes de los filtros. Los tapetes miceliales junto con los filtros que los soportan fueron levantados de la superficie del agar en los filtros, transferidos a placas de petri vacías, estériles y completamente sumergidas en la solución de bronopol a concentraciones seleccionadas. Al final del periodo de exposición de 1 hora, la solución de bronopol fue removida por aspiración y reemplazada por dos lavados de agua de río estéril (por 5 y 30 min, respectivamente) antes de que el tapete micelial y el filtro fueran transferidos, el filtro mas alto, a la superficie de una placa fresca de RGY. Después de la incubación a 16ºC por 24 h, cualquier nuevo crecimiento mas allá del borde del filtro fue medido en cuatro puntos alrededor del filtro, a intervalos de 90º.

El experimento fue realizado utilizando seis muestras de cultivo separadas, para cada concentración de bronopol, y fue repetido utilizando verde de malaquita en lugar de bronopol. Una prueba de control negativa sin utilizar un agente activo también fue realizada.

Los resultados son expuestos en la tabla abajo:

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TABLA 1A Crecimiento radial en mm a 24 h después de exposición a baño de prueba de concentración

Bronopol	Verde malaquita
Conc mg.l-1	Tiempo (min)	1	2	3	4	5	6	1	2	3	4	5	6
1000	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
500	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
100	10	3	3	2	2	1	2	0	0	0	0	0	0
50	10	3	3	3	3	2	2	0	0	0	0	0	0
50	5	5	2	2	3	3	4	0	0	0	0	0	0
10	10	6	7	7	6	7	6	0	0	0	0	0	0
10	5	7	7	7	6	8	8	0	0	0	0	0	0
Control	10	7	7	7	6	7	7

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Discusión

En esta prueba hongos desnudos hifa son expuestos a bronopol, el cual muestra tener un efecto inhibitorio tan bajo como 50 ppm por 5 minutos contra subsecuente crecimiento vegetativo. Exposición por 10 minutos a 500 ppm previene todo crecimiento vegetativo subsecuente con este método de prueba.

Prueba 1B

Método

En esta prueba, bronopol fue probado para eficacia contra Saprolegnia parasítica utilizando el Protocolo III mas exigente de los mencionados en el articulo de J. Fish Diseases, el método siendo el siguiente:

Cuatro discos inocula fueron colocados en cada compartimiento de una placa de replicación estéril (25 compartimientos en 5 filas; Sterilin). Cinco pruebas de concentración diferentes aplicadas a cinco tiempos de exposición diferentes podrían por lo tanto ser realizados en cuadruplicado en una placa. Las pruebas de concentración fueron añadidas asépticamente en volúmenes de 2.5 ml a cada compartimiento para los tiempos de exposición estándar, los cuales fueron 5, 10, 20, 40 y 80 mins. Al final de los tiempos de exposición individuales, las soluciones de prueba fueron removidas de los compartimientos por aspiración. Cada grupo de discos fue después lavado in situ en dos cambios de agua de río estéril (por 5 y 30 mins, respectivamente) y después encubado 2.5ml de aún más agua de río estéril, in situ, por 72 h a 16ºC. Subsecuentemente, los discos fueron examinados bajo un estereomicroscopio, utilizando iluminación transmitida de campo oscuro, y marcada por presencia o ausencia de nuevo crecimiento en la superficie del disco del agar. En todos los casos de duda, particularmente en la línea fronteriza entre crecimiento y no crecimiento, los discos fueron entonces transferidos a RGY para otras 72 h a 16ºC para determinar con precisión la viabilidad del micelio dentro del disco. La prueba fue repetida, sustituyendo oxalato de verde de malaquita por
bronopol.

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Los resultados fueron expresados en términos del efecto en zooesporulación y en términos del efecto en el crecimiento vegetativo, y están expuestos en las tablas de abajo:

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TABLA 1B (i) Bronopol - Efecto en zooesporulación (porcentaje de inhibición)

100%	100%	0	0	0	80	T
100%	100%	0	0	0	40	i
100%	100%	0	0	0	20	m
100%	100%	0	0	0	10	e
100%	100%	0	0	0	5	(min)
1000	100	10	1	0

Concentración (mg.l-1)

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TABLA 1B (ii) Oxalato de Verde de malaquita - Efecto en zooesporulación (porcentaje de inhibición)

100%	100%	100%	100%	0	80	T
100%	100%	100%	100%	0	40	i
100%	100%	100%	100%	0	20	m
100%	100%	100%	40-50%	0	10	e
100%	100%	100%	40-50%	0	5	(min)
1000	100	10	1	0

Concentración (mg.l-1)

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TABLA 1B (iii) Bronopol - Efecto en crecimiento vegetativo (porcentaje de inhibición)

100%	10-20%	0	0	0	80	T
100%	0	0	0	0	40	i
100%	0	0	0	0	20	m
10-20%	0	0	0	0	10	e
10-20%	0	0	0	0	5	(min)
1000	100	10	1	0

Concentración (mg.l-1)

TABLA 1B (iv) Oxalato de verde de malaquita - Efecto en el crecimiento vegetativo (porcentaje de inhibición)

100%	100%	100%	0	0	80	T
100%	100%	100%	0	0	40	i
100%	100%	100%	0	0	20	m
100%	100%	100%	0	0	10	e
100%	100%	100%	0	0	5	(min)
1000	100	10	1	0

Concentración (mg.l-1)

Discusión

Bronopol tiene un efecto marcado en zooesporulación inmediata con exposiciones de tan solo 5 minutos a concentraciones de 100 ppm o (posiblemente) menos. Esta prueba utiliza un método de agar, en el que el agar que contiene el micelio obviamente ofrece protección la hifa, pero bronopol aún penetra y a 20 minutos 1,000 ppm exposición previene todo crecimiento subsecuente, y esta concentración también tiene un efecto significativo en tan poco como 5 minutos. Aún más, la exposición mas baja 100 ppm por 80 minutos también parece tener un efecto inhibidor.

Prueba 2

Eficacia en vivo de bronopol contra infección de Saprolegnia parasítica en huevos de trucha

Aproximadamente 913,000 huevos de trucha arco iris fueron utilizados en esta prueba, la cual fue dividida entre tres fincas. En cada caso, los huevos fueron cuidadosamente medidos en incubadoras o bandejas y muy cuidadosamente sumergidos en agua a una temperatura constante, después de remover cualquier materia fecal, sangre o huevos blancos (muertos). Los huevos fueron monitoreados hasta que alcanzaron la etapa con ojos, y fueron después conmocionados al dejarlos caer en el agua de una altura de aproximadamente 0.5m. El propósito de la conmoción es matar cualquier huevo débil o infértil, los cuales se tornan blancos debido a la ruptura de la membrana interna. Huevos muertos fueron removidos y contados. La prueba fue continuada hasta que los huevos eclosionaran, tiempo en el cual los huevos muertos fueron nuevamente retirados y contados. Durante la prueba el grado de infección por hongos (atribuida a Saprolegnia) fue monitoreada. En la primera finca (Sitio 1) la prueba fue realizada con agua subterránea y los huevos fueron mantenidos en un sistema de fosa y bandeja desde la ruptura hasta eclosión. Volúmenes de las incubadoras eran 101 l, con una tasa de intercambio de agua de 40 l.min-1 (el tiempo para el intercambio de agua siendo 2.5 min). En el Sitio 2 también se utilizó agua subterránea. Desde ruptura hasta conmoción de los huevos fueron hechos en incubadoras verticales, de volumen de 20 l. La tasa de intercambio de agua fue 13.6 l.min-1 y el tiempo para en intercambio de agua 1.5 min. Desde la conmoción hasta la eclosión de los huevos, estos fueron mantenidos en un sistema de fosa y bandeja, los volúmenes de la incubadora siendo 145 l y la tasa de intercambio de agua 27 l.min-1 (el tiempo de intercambio de agua siendo 5.4 min). Los huevos en el Sitio 2 fueron divididos en 3 lotes los cuales fueron probados separadamente y en tiempos diferentes.

En el Sitio 3 se utilizó agua de río, y los huevos fueron mantenidos en un sistema de fosa y bandeja desde ruptura hasta la eclosión. Las incubadoras eran de un volumen de 190 l, con una tasa de intercambio de agua de 10 l.min-1 y un tiempo de intercambio de agua de 19 min.

En cada sitio (y por cada lote en Sitio 2), los huevos fueron divididos en tres grupos de tratamiento, uno recibiendo un tratamiento de bronopol, uno recibiendo un tratamiento de verde de malaquita, y uno sin recibir tratamiento (para actuar como un control negativo). El número de huevos en cada grupo fue como sigue:

TABLA 2A Número de huevos por grupo de tratamiento

Sitio	Bronopol	Verde de malaquita	Control Negativo
1	231,040	115,520	24,320
2	108,000	108,000	16,000
3	249,382	45,579	24,580

Bronopol a una concentración de 500 g.l-1 fue añadido en la parte de arriba de las incubadoras y distribuido por los huevos con el agua que entraba. El flujo de agua fue luego apagado cuando se estimó que el tratamiento estaba por la mitad de las fosas. Un baño de 30 minutos de duración fue formado en el cual la concentración de bronopol estaba generalmente en el rango de 1 mg.l-1 a 50 mg.l-1.

Verde de malaquita fue utilizada como un tratamiento con flujo. Fue administrada por la parte de arriba de la incubadora y se hizo fluir por los huevos con el agua que entraba (el flujo de agua no fue apagado). Este fue el método usual en todos los Sitios. La dosis variaba de sitio en sitio como sigue: Sitio 1 15 mgl-1; Sitio 2 40 mg.l-1; Sitio 3 5 mg.l-1.

Huevos en ambos grupos, bronopol y verde de malaquita fueron tratados todos los días desde ruptura hasta eclosión.

Crecimiento de hongos fue evaluado visualmente como el porcentaje de huevos cubierto por un crecimiento de hongos, en cada segundo día del estudio en los Sitios 1 y 2, y todos los días en el Sitio 3. Los resultados son expuestos gráficamente en las Figs. 1 a 3 y son resumidos en la Tabla 2B abajo:

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TABLA 2B Porcentaje de días de Tratamiento con grado de crecimiento de hongos

Porcentaje de crecimiento de hongos	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
0%	41.57%	46.63%	28.09%
0% a 10%	47.19%	36.52%	35.39%
11% a 25%	11.24%	16.85%	8.99%
26% a 50%	0.00%	0.00%	16.29%
51% a 100%	0.00%	0.00%	11.24%

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La Tabla 2B muestra que bronopol no ha resultado en ningún crecimiento de hongos por 46.63% de los días que los huevos fueron tratados. Esto puede ser comparado con 41.57% de Verde de malaquita y 28.09% cuando no se aplicó ningún tratamiento. Ambos, bronopol y Verde de malaquita previnieron que los huevos fueran cubiertos con mas de 25% de crecimiento de hongos.

Huevos muertos fueron contados y removidos en la conmoción y en la eclosión y los números de huevos muertos en cada caso son expuestos en Tablas 2C a 2K abajo. Tablas 2L & 2M muestran mortalidades totales en conmoción y eclosión, respectivamente. (Sitio 1 no reportó mortalidades durante eclosión, por consiguiente el valor original mas bajo en la tabla 2M).

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TABLA 2C Sitio 1 Número de huevos muertos después de la conmoción

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	115,520	231,040	24,320
No. de huevos muertos después de la conmoción	12,960	26,201	2,417
Porcentaje de huevos muertos	11.21%	11.34%	9.93%

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TABLA 2D Sitio 2 (Lote 1) Número de huevos muertos después de conmoción

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	13,800	16,560	5,060
Número de huevos muertos después de conmoción	650	2,000	223
Porcentaje de huevos muertos	4.7%	12.1%	4.4%

TABLA 2E Sitio 2 (Lote 2) Número de huevos muertos después de conmoción

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	43,240	43,320	10,120
Número de huevos muertos después de conmoción	6,360	8,464	1,700
Porcentaje de huevos muertos	14.7%	19.5%	16.8%

TABLA 2F Sitio 2 (Lote 3) Número de huevos muertos después de conmoción

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	57,120	52,020	5,100
Número de huevos muertos después de conmoción	6,855	3,640	665
Porcentaje de huevos muertos	12.0%	7.0%	13.0%

TABLA 2G Sitio 3 Número de huevos muertos después de conmoción

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	45,579	249,382	24,580
Número de huevos muertos después de conmoción	5,331	52,646	4,713
Porcentaje de huevos muertos	11.70%	21.11%	19.17%

TABLA 2H Sitio 2 (Lote 1) Número de huevos muertos después de eclosión

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	13,800	16,560	5,060
Número de huevos muertos después de conmoción	1,000	2,585	477
Porcentaje de huevos muertos	7.2%	15.6%	9.4%

TABLA 2I Sitio 2 (Lote 2) Número de huevos muertos después de eclosión

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	43,240	43,320	10,120
Número de huevos muertos después de conmoción	5,900	9,450	9,600
Porcentaje de huevos muertos	13.6%	22.3%	94.9%

TABLA 2J Sitio 2 (Lote 3) Número de huevos muertos después de eclosión

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	57,120	52,020	5,100
Número de huevos muertos después de conmoción	7,300	4,200	4,100
Porcentaje de huevos muertos	12.8%	8.1%	80.4%

TABLA 2K Sitio 3 Número de huevos muertos después de eclosión

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	45,579	249,382	24,580
Número de huevos muertos después de conmoción	8,487	47,539	7,203
Porcentaje de huevos muertos	18.62%	19.06%	36.26%

TABLA 2L Resumen de Número de huevos muertos después de conmoción

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	275,259	592,322	69,180
Número de huevos muertos después de conmoción	32,156	92,951	9,718
Porcentaje de huevos muertos	11.68%	15.70%	14.05%

TABLA 2M Resumen de Número de huevos muertos después de eclosión

	Verde de malaquita	Bronopol	Control Negativo
Número original de huevos	159,739	360,282	44,860
Número de huevos muertos después de conmoción	22,687	63,774	21,380
Porcentaje de huevos muertos	14.20%	17.70%	47.66%

Conclusión

Bronopol parece ser tan efectivo como la Verde de malaquita controlando infecciones de hongos en huevos de salmónidos. Las mortalidades totales al momento de eclosión para Verde de malaquita y bronopol son mas bajas que en el control negativo, con 14.20%, 17.20% y 47.66% de huevos muertos, respectivamente.

Prueba 3

Prueba de Referencia Eficacia en vivo de bronopol contra infección de Saprolegnia parasítica en Salmón Método

105 salmones Atlánticos (Salmón salar) de sexo mezclado, de edad aproximada de 8 meses y pesando aproximadamente 30 g en promedio, fueron divididos en tres grupos de tratamiento, cada uno con 35 peces. Cada grupo fue mantenido en agua fresca a 12.5ºC en un tanque de fibra de vidrio de 210 litros. Los peces fueron alimentados diariamente con 2% de su peso corporal en "Biomar" alimento de producción. Después de dos semanas de aclimatación, los tres grupos fueron infectados artificialmente con Saprolegnia parasítica, la fecha de infección siendo designada como "día 0" de la prueba. Los grupos fueron luego tratados, en días, 1, 3 y 5, como sigue:

Grupos	Tratamiento	Concentración de Tratamiento	Duración de Tratamiento
1	Ninguno	-	-
2	Verde de malaquita	2 mg.l-1	Baño 60 min
3	Bronopol	30 mg.l-1	Baño 15 min

En el día 8 de la prueba, todos los peces fueron seleccionados, y el grado de infección de cada pez fue evaluada de acuerdo al siguiente sistema de puntuación:

Grado de infección por hongos	Puntuación
Ninguno	1
Leve (hongo visible en <25% de la superficie del pez)	2
Moderado (hongo visible en 50% de la superficie del pez)	3
Severo (Lesión(es) en el pez)	4
Mortalidad*	5
(*Los peces muertos fueron retirados al ocurrir las muertes, para evitar contaminación del agua.)

Resultados

El número de peces en cada categoría del sistema de puntuación de arriba, y la puntuación total para cada grupo, fueron los siguientes:

Puntuación	Control	Verde de malaquita	Bronopol
Ninguno	1	18		25		23
Leve	2	3		1		6
Moderado	3	3		1		2
Severo	4	3		0		0
Mortalidad	5	8		8		4
Puntuación total	85		70		61

Los números acumulados de las mortalidades para cada día de la prueba son ilustrados gráficamente en Fig. 4.

Conclusión

Bronopol probó ser efectivo contra infección de Saprolegnia, y también redujo las mortalidades por un 50% comparado con los grupos de no-tratamiento y el tratamiento con verde de malaquita.

Prueba 4

Prueba de Referencia Eficacia en vivo de bronopol contra infección de Ichthyobodo necatrix en trucha arco iris Método

Trucha Arco iris (Oncorhyncus mykiss) teniendo un peso promedio de 15 g fueron utilizados para esta prueba, y antes del tratamiento fueron reducidas a un solo estanque con 6 individuos altamente infectados con Ichthyobodo. La infección de los individuos previamente sanos fue confirmada por microscopía después de 5 días por especímenes de branquias montadas. Tratamiento de bronopol fue administrado a un grupo de 20 peces utilizando el mismo método que en la Prueba 3. La Prueba fue repetida utilizando un grupo de 19 peces infectados tratados con formalina (un tratamiento estándar para Ichthyobodo), con otro grupo de 20 peces infectados que no recibieron tratamiento y que actuaron como control. A los 7 días después del tratamiento el número promedio de parásitos por filamento de las branquias fue evaluado en cada grupo (contando el número de parásitos en 10 filamentos de cada uno de 5 peces), y a los 14 días otro conteo fue realizado, con los peces individuales siendo categorizados por no tener infección, o colocándolos en una de cuatro categorías de infección de acuerdo al grado de infección.

Resultados

Días después del	Nivel de Infección	Grupo
Tratamiento		Bronopol	No tratamiento Control	Formalina
7	Número promedio de parásitos
	por filamento de las branquias	<0.5	2.0	0

14	Porcentaje en cada categoría:
	+ -	50	0	100
	+	43	29	0
	++	7	29	0
	+++	0	18	0
	++++	0	23	0
No ocurrieron muertes.

Conclusión

Se mostró que bronopol tiene buena actividad contra infección de Ichthyobodo en trucha arco iris. Aunque es menos efectivo que la formalina, su uso lleva menos riesgo. Se puede inferir que bronopol tendrá una eficacia similar contra infecciones de Ichthyobodo en otros salmónidos, y en peces y otros organismos acuáticos en general, y también sera útil en la profilaxis de la enfermedad.

Prueba 5

Eficacia en vitro de bronopol contra Cytophaga Psychrophila Método

Primero, la Concentración Mínima de Bactericida (MBC) para bronopol contra Cytophaga Psychrophila fue establecido al criar al organismo en caldo, y después añadiendo diferentes soluciones de bronopol para establecer que concentración mataría a Cytophaga.

Después basado en los resultados de MBC, los tiempos de contacto requerido para matar la Cytophaga fueron investigados. Un número conocido de bacteria viable fue añadido a agua destilada y expuestos a varias concentraciones de bronopol por 2-40 minutos. Después las bacterias fueron extraídas por filtración, y las bacterias extraidas fueron probadas para viabilidad investigando su crecimiento en un medio de cultivo midiendo su densidad óptica a 520 nm.

Resultados

Los resultados son expuestos gráficamente en Fig. 5. La concentración mínima de prueba que se mostró ser efectiva fue de 5 mg.l-1 (ppm), pero es probable que la actual concentración mínima efectiva este entre 1 mg.l-1 y 5 mg.l-1. También se encontró que un tiempo de exposición de hasta 40 mins era requerido para prevenir crecimiento bacteriano después de la re-inoculación a un medio fresco cuando concentraciones de entre 5 mg.l-1 y 400 mg.l-1 fueron utilizadas, con el tiempo de exposición necesario siendo reducido a alrededor de 4 minutos a una concentración de 1000 mg.l-1 y a alrededor de 2 minutos a 2000 mg.l-1.

Conclusión

Se mostró que bronopol es activo contra Cytophaga Psychrophila a concentraciones tan bajas como 5 mg.l-1. Cytophaga es un ejemplo de el grupo de bacteria conocido como micobacteria, las cuales son caracterizadas por una capa mucopolisacárida protectora, y las cuales son generalmente resistentes a desinfectantes (por ejemplo, la dosis de desinfectante yodofor requerida para matar Cytophaga es aproximadamente 2000 mg.l-1). Basado en los usos conocidos de bronopol, esta actividad es por lo tanto sorprendente, y puede indicar actividad contra micobacterias en general. Probablemente bronopol puede probar ser un tratamiento desinfectante adecuado para peceras y su equipo, y también puede ser útil en el tratamiento y/o profilaxis para varias enfermedades causadas por este organismo en trucha y otros salmónidos, y también (cuando estos ocurran) en otros peces y organismos acuáticos.

Prueba 6

Prueba de Referencia Eficacia en vivo de bronopol contra infección de Flavobacterium branchophilum en trucha arco iris

Fueron incluidos en este experimento, siete tanques de 150 truchas arco iris cada uno, a una densidad de abastecimiento de 100 g.l-1. Los peces tenían un promedio de 15 g en tamaño. La temperatura del agua era 11ºC y era volteada a un índice de una vez por hora. Un tanque de peces fue mantenido como un control negativo y no fue desafiado ni tratado. Un tanque adicional fue desafiado pero no tratado, para que actuara como control positivo. Dos tanques fueron tratados con cloramina-T (un tratamiento convencional) a una concentración de 10 mg.l-1. Tres tanques fueron tratados con bronopol, cada uno a las siguientes concentraciones: 5, 25 y 50 mg.l-1.

Los peces fueron desafiados en el día 0, y los tanques fueron tratado con cloramina-T o bronopol en los días 2 y 4 del experimento. Todos los 6 tanques que fueron experimentalmente infectados con F. branchiophilum fueron tratados con sus respectivos terapéuticos simultáneamente por una hora en un baño estático con aireación.

La eficacia de cada tratamiento fue evaluada por signos clínicos, niveles de antígenos bacteriales branquiales medidos por la inmunoensayo enzimático (BIA), índices de mortalidad y mortalidad acumulada y finalmente examen histológico.

Muestras de branquias para EIA fueron recolectadas de cinco peces de cada tanque antes de la infección experimental, y antes del tratamiento. Más muestras de branquias fueron recolectadas 6 y 36 horas después del tratamiento inicial, después de los cuales los grupos fueron tratados nuevamente con concentraciones idénticas del mismo terapéutico, en una forma idéntica. Muestras de branquias de cinco peces de cada tanque fueron nuevamente recolectadas 6 y 36 horas después del segundo tratamiento. La mortalidad en cada tanque fue anotada cada día. Los resultados son presentados gráficamente en Figs. 6 a 8. Basado en la mortalidad y los datos EIA, la menor concentración de bronopol (5 mg.l-1,
Fig. 5) se encontró que no era efectiva. Mortalidad era inversamente relacionada con la dosis de bronopol (Fig. 6).

Es evidente que la mortalidad corresponde estrechamente con los niveles bacteriales de antígenos detectados en las branquias, y que la EIA es una herramienta útil para monitorear la eficacia de la habilidad de los terapeutas para eliminar la bacteria de la superficie de las branquias. Como con la mortalidad, la concentración de los antígenos bacteriales en las branquias en la mayoría de los tiempos de muestreo, es inversamente proporcional a la dosis de terapéuticos (Fig. 8). Es claro que bronopol es efectivo contra Flavobacterium branchophilum, y que en la prueba bronopol a 25 mg.l-1 y 50 mg.l-1 redujo la mortalidad entre los peces infectados, comparado con los peces no tratados y con los peces tratados con cloramina-T.

Prueba 6

Prueba de Referencia Eficacia en vivo de bronopol contra Saprolegnia parasítica en trucha parda Método

Esta prueba es para evaluar la eficacia de bronopol en el tratamiento de trucha parda naturalmente infectada con Saprolegnia parasítica. 40 peces fueron utilizados en la prueba, y estos fueron dividos igualmente en dos grupos mantenidos en tanques separados. Un pez moribundo altamente infectado con Saprolegnia parasítica fue colocado en cada tanque, con la intención de infectar a los otros peces naturalmente. En los días 1, 3 y 5 de la prueba los peces de un grupo fueron tratados con un baño de 50 mg.l-1 de bronopol por 15 min, mientras los peces en el segundo grupo se dejaron sin tratamiento y actuaron como control. El grado de infección de los peces en ambos grupos fue evaluado en el día 7 de la prueba.

Resultados

En ambos grupos el pez moribundo murió en el día 1 de la prueba, pero en cada caso fue dejado en el tanque para asegurar una buena amenaza para los peces restantes. En el día 7 de la prueba todos los peces del grupo de control estaban severamente afectados por Saprolegnia, y fueron matados por razones humanitarias. En contraste, los peces en el grupo de tratamiento con bronopol estaban todos saludables y no tenían signos visuales de infección con Saprolegnia.

Conclusión

Tratamiento repetido con bronopol a una concentración de 50 mg.l-1 parece ser altamente efectivo como tratamiento para infección con Saprolegnia en trucha parda, y/o como profiláctico para prevenir infección.

Claims

1. El uso de bronopol (2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento para cualquiera de las siguientes enfermedades en huevos de peces: infecciones por hongos, infecciones por protozoarios flagelados, infecciones por protozoarios ciliados, enfermedad bacteriana de las branquias, e infecciones micobacterianas.

2. El uso de bronopol (2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de infecciones por Saprolegnia parasítica en huevos de peces.

3. El uso de acuerdo a la reivindicación 1 o 2 donde dichos huevos de peces son huevos de peces salmónidos.

4. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación precedente donde el bronopol es fabricado al reaccionar nitrometano con paraformaldehído en un ambiente alcalino seguido por brominación.

5. El uso de acuerdo a cualquier reivindicación precedente donde el bronopol es preparado como una solución en un solvente polar.