DE69922202T2

DE69922202T2 - Verfahren zur beseitigung von nanobakterien

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Publication number: DE69922202T2
Application number: DE69922202T
Authority: DE
Inventors: E. Olavi Kajander
Original assignee: NANOBAC KUOPIO Oy; NANOBAC Oy
Current assignee: NANOBAC KUOPIO Oy; NANOBAC Oy
Priority date: 1998-07-06
Filing date: 1999-07-01
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2019-07-02
Also published as: KR20010085283A; AU5029599A; ES2247817T3; WO2000001238A1; KR100661413B1; EP1094711A1; DE69922202D1; EP1094711B1; ATE282959T1; JP2002519363A

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Desinfektion von mit Nanobakterien infizierten Gegenständen und Verfahren zur Behandlung von mit Nanobakterien infizierten Patienten.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Die Bildung von einzelnen und organisierten anorganischen kristallinen Strukturen in makromolekularen extrazellulären Matrizen ist ein weit verbreitetes biologisches Phänomen, das im Allgemeinen als Biomineralisierung bezeichnet wird. Säugetierknochen und Zahnschmelz sind Beispiele für eine Biomineralisierung, die auf Apatitmineralien beruht. Apatitsteine aus der Umwelt haben fast dieselbe chemische Zusammensetzung wie in Knochen und Dentin. Vor kurzem sind Bakterien als Faktoren bei biogeochemischen Zyklen für die Mineralbildung in wässrigen Sedimenten ins Spiel gebracht worden. Der Hauptbestandteil von modernen authigenen Phosphatmineralien bei Meeressedimenten ist Carbonat(hydroxy)fluorapaptit Ca₁₀(PO₄)_6-x(CO₃)_x(F,OH)_2+x. Mikroorganismen sind in der Lage, Apatit außerhalb des thermodynamischen Gleichgewichts im Meerwasser abzulagern. Sie können Ca von Mg trennen sowie aktiv Carbonatapatit mittels bestimmter Oligopeptide bei Bedingungen von pH < 8,5 und [Mg]:[Ca] > 0,1 nukleieren. Solche Bedingungen liegen auch im menschlichen Körper vor.
Nanobakterien nähern sich der theoretischen Grenze des selbstreplizierenden Lebens mit einer Größe von nur einem Hundertstel von der gewöhnlicher Bakterien. Nanobakterien können aus dem Blut und Blutprodukten von Säugetieren isoliert werden (siehe US-Patent 5,135,851 von Kajander, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird). Eine energiedispersive Röntgenmikroanalyse und chemische Analyse zeigt, dass Nanobakterien an ihrer Zellhülle biogenes Apatit erzeugen. Die Apatitdicke hängt meist von den Kulturbedingungen der Nanobakterien ab. Nanobakterien sind die kleinsten, Apatit bildenden Bakterien mit Zellwand, die aus Blut und Blutprodukten von Säugetieren isoliert werden. Ihre kleine Größe (0,05–0,5 μm) und ihre einzigartigen Eigenschaften machen ihren Nachweis mit herkömmlichen mikrobiologischen Verfahren schwierig. Bei mit Nanobakterien infizierten Säugetierzellen zeigte eine Elektronenmikroskopie intra- und extrazelluläre nadelförmige Kristallablagerungen, die mit einer von Kossa-Färbung färbbar waren und Calcokügelchen („calcospherules") ähneln, die bei einer pathologischen Calcifizierung gefunden werden.
Die vorliegenden Erfinder haben Nanobakterien im Blut von Menschen und Kühen entdeckt, die in vitro und in vivo cytotoxisch sind. Sie sind bei der DSM, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer 5819–5821 hinterlegt. Die Nanobakterien von Menschen und Rindern wachsen ähnlich, teilen dieselben Oberflächenantigene und andere bestimmte Merkmale. Sie erzeugen auch beide Carbonatapatit. Nanobakterien besitzen außergewöhnliche Eigenschaften, wodurch ihr Nachweis mit herkömmlichen mikrobiologischen Verfahren schwierig ist. Obwohl sie üblicherweise Durchmesser von 0,2–0,5 μm aufweisen, existieren sie auch in winzigen Formen (0,05–0,2 μm), wie mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet wurde. Daher gelingt es Nanobakterien, durch Filter von 0,1 μm hindurchzugelangen. Nanobakterien sind schlecht zerstörbar, färbbar, fixierbar und außergewöhnlich widerstandsfähig gegenüber Wärme. Ihre Verdoppelungszeit beträgt etwa 3 Tage. Hohe Dosen an ☐-Strahlung oder Aminoglycosidantibiotika verhinderten ihre Vermehrung. Gemäß der 16S rRNA-Gensequenz (EMBL X98418 und X98419) fallen Nanobakterien unter die ☐-2-Untergruppe von Proteobakterien, was auch die Arten Brucella und Bartonella einschließt. Letztere Gattungen umfassen menschliche und tierische Pathogene, die Ähnlichkeiten mit Nanobakterien teilen, zum Beispiel einige derselben Antigene und cytopathische Wirkungen.
Der Wettkampf um lebensnotwendige Nährstoffe ist in natürlichen Umgebungen enorm, und es werden daher für ungünstige Zustände geschickte Adaptionen und Überlebensstrategien benötigt. Bakterien können Sporen, Zysten und Biofilme bilden, die ihnen helfen, ungünstige Zeiten zu überleben. Bakterien in solchen Formen haben signifikant niedrigere metabolische Funktionen, aber vegetative Zellen können ihren Metabolismus auch verlangsamen. Die erhöhte Resistenz von Bakterien im Biofilm oder als Sporen beruht nicht nur auf der langsameren metabolischen Rate. Die undurchlässigen Strukturen um den Organismus herum dienen als mechanische Barrieren, die das Eindringen von potentiell schädlichen Verbindungen blockieren. Es sind auch einige zusätzliche Mechanismen bekannt, die beim Überleben von Bakterien helfen. Der Wärmewiderstand von bakteriellen Sporen kann drei Hauptfaktoren zugeschrieben werden, bei denen es sich um die Protoplastdehydrierung, die Mineralisierung und die thermische Adaption handelt. Ein Strahlungswiderstand ist häufig mit anspruchsvollen DNA-Reparatursystemen verbunden. Eine Minimierung der metabolischen Rate und Vermehrung sind offensichtlich die Hauptvoraussetzungen für bakterielles Überleben, was Zeit für die Reparatur von DNA und anderen geschädigten zellulären Komponenten lässt. Ein sehr langsamer Metabolismus und die Fähigkeit, einen Biofilm zu bilden, sind auch Eigenschaften von Nanobakterien. Wegen ihrer kleinen Größe scheint das Vorhandensein von komplizierten Systemen für die Nukleinsäurereparatur in Nanobakterien sehr unwahrscheinlich zu sein. Eine mögliche Erklärung für den beobachteten Widerstand gegenüber gamma-Strahlung kann ihre kleine Größe und die Besonderheiten in ihrem Nukleinsäureaufbau sein.
Apatit kann bei der Bildung von Nierensteinen eine Schlüsselrolle spielen. Die kristallinen Komponenten von Harnwegssteinen sind Calciumoxalat, Calciumphosphat, Struvit, Purine oder Cystin. Die Mehrzahl der Harnsteine besteht aus Mischungen aus zwei oder mehreren Komponenten, wobei die Hauptbeimischung Calciumoxalat und Apatit ist. Weiterhin haben Fermentor-Modellstudien gezeigt, dass Calciumphosphatherde immer anfänglich gebildet werden und anschließend mit Calciumoxalat oder anderen Komponenten überzogen werden können. Eine Harnwegsinfektion, die eine Struvit- und Carbonatapatitbildung bewirkt, ist eine häufige Ursache für Nierensteine. Die herkömmliche Therapie besteht gewöhnlich aus dem operativen Entfernen des Steins in Verbindung mit einer kurzen antimikrobiellen Therapie. Eine solche Behandlung ist in etwa 50 % der Fälle heilend. Eine wiederkehrende Steinbildung und progressive Pyelonephritis tritt bei den nicht Geheilten auf. Die Morbidität und Kosten, die sich aus dieser Erkrankung ergeben, sind signifikant.
Eine Gewebecalcifizierung von Carbonatapatit ist in der Natur bei anderen Erkrankungen häufig, zum Beispiel erwachsen atherosklerotische Plaques aus Calciumphosphat. Wie mittels Immunoassay und immunohistochemisches Färben festgestellt wurde, enthielten 25 % der atherosklerotischen Plaques in menschlichen Aortaproben Nanobakterien. Hämodialysepatienten können eine ausgedehnte metastatische und tumorale Calcifizierung entwickeln. Eine akute Periarthritis ist eine Apatitarthropathie, die mit intratendinösen Calcifizierungen in Verbindung steht. Apatitkristalle bewirken auch eine Entzündung, wenn sie in den Synovialraum injiziert werden. Eine Gewebecalcifizierung wird auch bei mehreren Tumorarten gefunden.
Pulpasteine oder Dentikel sind polymorphe mineralisierte Körper von verschiedener Größe, die gelegentlich in dem Pulpabindegewebe von menschlichen Zähnen gefunden werden. Ihre Ätiologie bleibt unklar, obwohl sie oft mit dem Altern oder der Pathologie der Pulpa in Verbindung gebracht werden. Sie können auch in den bleibenden Zähnen vorhanden sein und diese lange Zeit ohne Symptomatik beeinträchtigen. Obwohl Pulpasteine morphologisch umfangreich untersucht wurden, ist ihr Ursprung noch nicht bekannt und man weiß wenig über ihre chemische Zusammensetzung. Eine histochemische Untersuchung von Pulpa-Calcifizierungen hat gezeigt, dass die organische Matrix aus retikulären Bindegewebsfasern und einer gemahlenen Substanz besteht, die Glycoproteine und Säurepolysaccharide enthält. Die mineralische Phase der Pulpa-Calcifizierung ist mit der energiedispersiven Röntgenspektrometrie und chemischen Analyse untersucht worden, und es wurde nachgewiesen, dass Calciumsalze in Form von Apatit, möglicherweise Carbonat enthaltendem Apatit, abgelagert werden. Tatsächlich gibt es keinen großen Unterschied zwischen dem chemischen Aufbau eines Zahns und von Dentikeln. Der Knochen- und Zahnbildung im Körper liegen ähnliche Mechanismen zugrunde, die viele Fragen unbeantwortet lassen. Die Apatitbildung im Körper (außer in den Zähnen und im Knochen) wird pathologische Biomineralisierung genannt, zum Beispiel dentale Pulpasteine, Nierensteine und Gelenk-Calcifizierungen.
Malakoplakie ist eine seltene chronische, entzündliche Erkrankung von unbekannter Ursache, die aber stark mit einem bakteriellen Faktor in Verbindung gebracht wird. Sie kann tödlich verlaufen. Diese Krankheit ist durch calcifizierte, laminierte oder zielgeformte Körper gekennzeichnet, die eine positive von Kossa Färbung zeigen und als Michaelis-Gutmann-Körperchen bezeichnet werden sowie aus Apatit gebildet sind. Der Aufbau dieser Calcokügelchen ähnelt stark den calcifizierten Nanobakterien.
Gewebecalcifizierungen werden bei mehreren Erkrankungen, wie beispielsweise serösen Ovarialtumoren, papillären Adenocarcinomen des Endometriums, Brustkrebs, papillärem Carcinom der Schilddrüse, duodenalem Carcinoidtumor und Craniopharyngiom, gefunden. Bei vielen malignen Tumoren werden nadelförmige Kristalle in Epithelzellen gefunden. Um diese Art der Calcifizierung nachzuweisen, ist es notwendig, die Elektronenmikroskopie zu verwenden, da die Kristalle zu klein sind, um mit dem Lichtmikroskop gesehen zu werden, und ihr Ursprung unbekannt ist. Viele maligne Zellen haben Rezeptoren für ein Anhaften von Nanobakterien. Sie könnten in den Tumor Nanobakterien unter anschließender Calcifizierung einführen. Außerdem können einige sich teilende Zellen bei Entzündungsreizen Rezeptoren zum Anhaften aufweisen, zum Beispiel bei atherosklerotischen Plaques, die bekanntermaßen eine Calciumphosphatanhäufung aufweisen. Obwohl die Elektronensondenanalyse zeigte, dass die Oberfläche und das Innere der mineralischen Ablagerung dieselbe chemische Zusammensetzung aufwies, zeigte bei dieser Erkrankung ein REM unterschiedliche Strukturarten, wie beispielsweise sphärische Teilchen und Fasern, die Nanobakterien ähneln. Gleichermaßen wird eine akute Periarthritis mit dem Vorhandensein von Hydroxyapatitkristallen in den Gelenken in Verbindung gebracht.
Alzheimer-Plaques können mit anti-nanobakteriellen polyklonalen Antikörpern markiert werden. Diese polyklonalen Antikörper enthalten einige Autoantikörper, und die vorliegenden Erfinder haben bei nanobakteriellen Immunisierungen auch einige monoklonale Autoantikörper erhalten. Es wurde angenommen, dass eine langsame bakterielle Infektion eine Rolle bei den Autoimmunerkrankungen spielt. Bei diesen Erkrankungen ist oft eine Gewebecalcifizierung vorhanden. Nanobakterien sind ein neues Beispiel für langsam wachsende Organismen, die den Menschen über lange Zeiträume infizieren. Apatitaufbau und anormale Nukleinsäuren können zu den Anomalien bei der Immunreaktion auf diese Infektion beitragen.
Mehrere Aspekte von biogener Apatitnukleation, Kristallwachstum und Morphologie sind sowohl in vivo als auch in vitro bestimmt worden. Allerdings bleiben viele Details ungelöst, inklusive die spezifische Natur der anfänglichen Fällungsphasen, der Mechanismus und die Faktoren, die den Einschluss von ionischen Verunreinigungen in das Kristallgitter steuern, Einzelheiten über die kristallographische Ultrastruktur und die Morphologie in mineralisierten Geweben (Knochen, Dentin) und das Verhältnis von anorganischen Komponenten zu der komplexen Matrix auf Kollagenbasis. Der Grund hinter der Calciumphosphatablagerung bleibt bei vielen Erkrankungen spekulativ. Es ist gezeigt worden, dass eine Anhäufung von Calcium in Mitochondrien, die vermutlich von dem Restsubstrat für die Energieerzeugung abhängt, eine Calcifizierung zu bewirken schien. Amorphes Calciumphosphat in Form von Sphäroiden und möglicherweise feinen Fibrillen und Körnchen scheint durch die Transformation zu Apatit auch eine Rolle bei der Calcifizierung zu spielen.
Kajander u.a. (Proc. SPIE-Int. Soc. Opt- Eng. (1997), 3111, Seite 420–428) zeigt Nanobakterien aus Blut und Blutprodukten und deren Beständigkeit gegenüber Wärme, gamma-Strahlung und Antibiotika. Es wird beschrieben, dass Aminoglycoside in hohen Konzentrationen bakteriostatisch sind. Weiter zerstört die Verwendung von 3 Megarad gamma-Strahlung Nanobakterien, stört der Calciumchelator EDTA das Wachstum und verhinderte ein Erwärmen auf 100°C über 30 Minuten das Wachstum von Serum-Nanobakterien, während serumfreie Nanobakterien, die über eine Stunde 100°C ausgesetzt waren, nicht abgetötet werden konnten. Schließlich stellen die Autoren fest, dass Nanobakterien in mineralischen Ablagerungen von Nierensteinen oder Harnsteinen vorkommen könnten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Sterilisieren von Gegenständen zur Verfügung, die mit Nanobakterien kontaminiert sind. Solche Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind zur Desinfektion und/oder Sterilisation von medizinischer Ausrüstung und Lösungen, die zur Behandlung und Diagnose von Patienten verwendet werden, besonders nützlich.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Verhindern einer nanobakteriellen Infektion und zum Behandeln von mit Nanobakterien infizierten Patienten zur Verfügung. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verhindern des Wiederauftretens von Nierensteinen bei einem Patienten zur Verfügung, der an Nierensteinen leidet, umfassend die Verabreichung eines Antibiotikums in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, dass das Wachstum und die Entwicklung von Nanobakterien gestört oder verhindert wird.
Anhand der vorangehenden und anderen Gegenstände, Vorteile und Merkmale der Erfindung, die nachfolgend deutlich werden kann, wird der Kern der Erfindung unter Bezugnahme auf die nachfolgende ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und auf die beigefügten Ansprüche besser verständlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Licht- und elektronenmikroskopische Bilder von Nanobakterien und ihre Analysen mit energiedispersiver Röntgenmikroanalyse (EDX). Differentielles Interferenzkontrastbild von am Boden anhaftenden Nanobakterien nach einer 2-monatigen Kulturdauer. (B) DNA-Färbung desselben Bereichs (x1600) mit dem modifizierten Hoechst-Verfahren. (C) Negatives Färben von Nanobakterien, die direkt aus fötalem Rinderserum isoliert wurden (Balken = 200 nm). (D) REM-Mikroaufnahme, die ihre variable Größe zeigt (Balken = 1 μm). (E) Ein sich teilendes Nanobakterium, das mit einer „haarigen" Apatitschicht bedeckt ist (Balken = 100 nm). (F) TEM-Mikroaufnahme von Nanobakterien, die nach einer 3-monatigen Kulturdauer in einer Apatitschicht vergraben sind (Balken = 1 μm), (G) bei stärkerer Vergrößerung (Balken = 200 nm). Weiße zentrale Bereiche in F sind aufgrund eines Verlusts der Mineralschicht beim Zerteilen Artefakte. (H) Energiedispersive Röntgen-Mikroanalyse von Nanobakterien in REM, die Ca- und P-Spitzen, die Hydroxyapatit ähnlich sind (I), zeigen.
2. Nanobakterielle Steinansammlungen und Vergleich mit Hydroxyapatit. (A) Ansammlungen auf modifiziertem Löffler-Medium in einer Platte von 10 cm. Die Ansammlungen haben das Medium durchdrungen und bilden steinige Säulen. Der Pfeil zeigt eine typische graubraune Ansammlung, die in B (x40) veranschaulicht ist. (C) Nadelförmige Kristallablagerungen in der Säule durch TEM gezeigt (Balken = 200 nm). (D) TEM-Bild von Bezugs-Apatitkristallen (Balken = 100 nm).
3. Nanobakterien, die unter SF-Bedingungen gezüchtet wurden, und ihre Wechselwirkung mit Zellen. (A) Lichtmikroskopische Mikroaufnahme, (B) DNA-Färbung desselben Bereichs mit der modifizierten Hoechst-Färbemethode. (C) Differentielle Interferenz-Konstrastbilder von Nanobakterien in einem gebräuchlichen Apatit-Schutzraum und (D) eine teilweise demineralisierte nanobakterielle Gruppe (A-D, x860). (E und F) REM-Mikroaufnahmen von nanobakteriellen Aufenthaltsorten, die aus dem Kulturgefäß entnommen wurden (Balken = 1 μm). (G) IIFS auf internalisierten mineralisierten Nanobakterien (weiße Pfeile) in 3T6-Zellen. (H) DNA-Färbung desselben Bereichs mit dem üblichen Hoechst-Verfahren (x540). (I-L) TEM-Mikroaufnahmen von intrazellulären Calcifizierungen in 3T6-Zellen, die durch SF-Nanobakterien bewirkt werden (Balken I und K = 2 μm, J = 500 nm, L = 200 nm).
4. Beispiele für eine extra- und intrazelluläre Calcifizierung durch Nanobakterien. (A) TEM-Mikroaufnahme von kultivierten Nanobakterien (Balken = 20 nm) aus fötalem Rinderserum und (B) ein Bakterium in einem Nierenstein nach der Demineralisierung (Balken = 50 nm). (C) IIFS desselben Nierensteins mit Anti-Nanobakterien mAb. (D und E) Die von Kossa-Färbungsergebnisse von 3T6-Zellen, die 24 Stunden lang SF-Nanobakterien ausgesetzt waren und (F) negative Kontrolle (x270).
5. Darstellung, die die Wirkung von Wärme auf das Wachstum von Serum-Nanobakterien zeigt. Nanobakterien wurden in PBS Wärme ausgesetzt und 16 Tage lang kultiviert. Ein Kochvorgang von nur 30 Minuten führte zu einer Inaktivierung von Nanobakterien. Bei allen anderen Behandlungen wurde ein exponentielles Wachstum beobachtet. Das Medium, das 10 % gamma-bestrahltes Serum (negative Kontrolle) enthielt, zeigte kein Wachstum.
6. Darstellung, die die Wirkung von Antibiotika auf nanobakterielles Wachstum zeigt. Das Wachstum wird mit dem von Nanobakterien verglichen, die ohne Antibiotika kultiviert wurden. Antibiotikadosen, die zehnmal höher als die zur Verwendung in Zellkulturen empfohlenen waren, waren notwendig, um das Wachstum von Nanobakterien zu verhindern.
7. REM-Bilder von Nanobakterien, die mit und ohne Antibiotika einen Monat lang in Medium, das 10 % fötales Rinderserum enthielt, kultiviert wurden. Balken = 1 μm. (A) Nanobakterien, die ohne Antibiotika kultiviert wurden. (B) Nanobakterien, die mit 100 μg/ml Gentamycin kultiviert wurden. Die Pfeile zeigen Änderungen der Morphologie.
8. REM-Bilder von Zähnen mit (A und B) und ohne (C und D) dentalen Steinen. Der in (A) gezeigte Zahn wurde wegen periodontaler Probleme und einer durch starke dentale Pulpasteinbildung bewirkten Knochendesorption extrahiert. Eine stärkere Vergrößerung des durch den Pfeil gezeigten Bereichs zeigt eine runde und fibröse Calcifizierung (B). Der in (C) dargestellte Zahn wurde wegen eines orthodontischen Problems extrahiert. Dieser Zahn wurde autoklaviert und für einen Monat unter einer Zellkulturbedingung einem DMEM-Kultumedium ausgesetzt. Es wurde auf der Oberfläche keine Kristallisation beobachtet. (D) Zeigt die stärkere Vergrößerung des Bereichs, die in (C) mit einem Pfeil markiert ist. Die vertikal geschnittene andere Hälfte desselben Zahns wurde für das in der 9 beschriebene Experiment verwendet.
9. REM-Mikroaufnahmen des gesunden Zahns der 8C und D nach Autoklavieren und Inkubation mit SF-Nanobakterien über einen Zeitraum von einem Monat unter Zellkulturbedingungen. (A) allgemeines Bild, das die Zahnoberfläche zeigt, eine stärkere Vergrößerung eines durch den Pfeil gezeigten Bereichs ist in (B) zu sehen. (C) Nanobakterien, die 3 Monate lang kultiviert wurden und an dem Zellkulturgefäß anhafteten; der Balken ist 1 μm. (D) Ein Bereich in demselben Zahn mit voluminösem Pulpastein, der einen Monat nach dem Aussetzen mit SF-Nanobakterien auftrat. (E) Eine stärkere Vergrößerung desselben Bereichs, der in (D) mit dem großen Pfeil gezeigt ist. Die kleinen Pfeile zeigen das Wachstum von SF-Nanobakterien an der Oberfläche von Steinen.
10. REM-Bilder von SF-Nanobakterien, die in dem Kulturmedium auf einem Stück Dolomit wachsen.
11. Energiedispersive Röntgen-Mikroanalyse von menschlichen dentalen Steinen (O) und SF-Nanobakterien (B).
12. Wechselwirkung von SF-Nanobakterien mit Fibroblasten (3T6-Zellen). (A) SF-Nanobakterien, die durch ein Fibroblast internalisiert sind (Pfeilkopf zeigt die Nanobakterien in einer Vakuole), (B) eine stärkere Vergrößerung, die den nadelförmigen Apatitaufbau der internalisierten SF-Nanobakterien zeigt, (C) von Kossa-Färbeergebnis der mit Nanobakterien infizierten Fibroblasten und (D) negative Kontrolle. Die Vergrößerung in (C und D) ist 270x. Der Pfeil in (C) zeigt gefärbte Nanobakterien nach dem Färben mit dem von Kossa-Verfahren, bei dem es sich um ein in der Pathologie verwendetes, übliches Calcifizierungsnachweisverfahren handelt.
13. TEM-Mikroaufnahmen eines menschlichen Carbonatapatit-Nierensteins und von Nanobakterien. (A) Ein Nierenstein vor der Demineralisierung. (B) SF-Nanobakterien, die einen Monat lang kultiviert wurden, (C) derselbe Nierenstein nach der Demineralisierung, (D) Nanobakterien, die 2 Monate lang in einem ein Serum enthaltendes Medium kultiviert wurden. Der Nierenstein (C) wurde durch Inkubation des zertrümmerten Steins in 1 N HCl 10 min lang bei Raumtemperatur demineralisiert, mit NaOH und Kaliumphosphatpuffer neutralisiert und in Epon eingebettet. Beide Nanobakterienkulturen (B und D) hafteten an dem Boden ihres Kulturgefäßes an.
14. TEM- (A) und FITC-Bilder (B) von demineralisierten Nanobakterien und Immunfluoreszenz-Positivität bei unterschiedlichen Arten von Nierensteinen (C-E). Nierensteine und Nanobakterien wurden mit bestimmten monoklonalen Anti-Nanobakterien-Antikörpern gefärbt, und zwar nach der Demineralisierung der Proben, wie in der 13 beschrieben. Die dicken Pfeile zeigen immunfluoreszenzpositive einzelne kokkenähnliche Partikel. Immunpositivität an der Oberfläche der kleinen Einheiten, die den Stein bilden, ist mit den kleinen Pfeilen gezeigt. Vergrößerungen: (B-D) 1600x; (E) 640x.
15. Darstellungen, die das nanobakterielle Wachstum in der Subkultur der demineralisierten, neutralisierten und sterilfiltrierten 20 unterschiedlichen menschlichen Nierensteine und Nanobakterien zeigen. * Zeigt kein Wachstum in den ersten 6 Tagen.
16: Trimethoprim-Wirkung auf Nanobakterien in 12 Tagen, ausgedrückt als minimale inhibitorische Konzentration (MIC).
17: Tetracyclin-Wirkung auf Nanobakterien in 12 Tagen, ausgedrückt als minimale inhibitorische Konzentration (MIC).
18: Nitrofurantoin-Wirkung auf Nanobakterien in 12 Tagen, ausgedrückt als minimale inhibitorische Konzentration (MIC).
19: Doxycylin-Wirkung auf Nanobakterien in 12 Tagen, ausgedrückt als minimale inhibitorische Konzentration (MIC).
20: Gentamycin-Wirkung auf Nanobakterien in 12 Tagen, ausgedrückt als minimale inhibitorische Konzentration (MIC).
21: Neomycin-Wirkung auf Nanobakterien in 12 Tagen, ausgedrückt als minimale inhibitorische Konzentration (MIC).
22: Kanamycin-Wirkung auf Nanobakterien in 12 Tagen, ausgedrückt als minimale inhibitorische Konzentration (MIC).
23: Vancomycin-Wirkung auf Nanobakterien in 12 Tagen, ausgedrückt als minimale inhibitorische Konzentration (MIC).
24: Zeitverlauf von Antibiotikawirkungen von 4 μg/ml Tetracyclin, Trimethoprim, Trimethoprim + sulph, Nitrofurantoin, Doxycyclin und positiven und negativen Kontrollen.
25: Wirkung von Tetracyclin auf menschliche Nanobakterien. Tetracyclin ist für menschliche Nanobakterienisolate ähnlich im Vergleich zu dem üblichen Rinder-Nanobakterienstamm wirksam.
26: Dosis/Reaktion und Zeitverlauf für Ampicillin.
27: Dosis/Reaktion und Zeitverlauf für Citrat.
28: Dosis/Reaktion und Zeitverlauf für EDTA.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfinder haben überraschend den ersten mit Mineralien überzogenen Organismus entdeckt, bei dem das Mineral einen Teil der Zellwand bildet, die für die Überlebensstrategie des Organismus wesentlich ist. Bei Nanobakterien ist dieses Mineral Carbonatapatit. Aufgrund dessen haben die vorliegenden Erfinder festgestellt, dass jedes therapeutische Mittel, das auf den Apatit abzielt, für die anti-nanobakterielle Therapie nützlich sein kann.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Desinfizieren eines Gegenstands, der mit Nanobakterien kontaminiert ist. Wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet, ist ein zu desinfizierender Gegenstand jeder Gegenstand, für den vollständige Sterilität gewünscht wird, einschließlich medizinische Geräte, operative Werkzeuge und medizinisches sowie operatives Zubehör, einschließlich Nadeln, Spritzen, Röhren und dergleichen. Vom Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Lösungen zur medizinischen Behandlung und zur Medikamentenformulierung umfasst, einschließlich steriles Wasser, Salzlösung, Ringersche und andere Lösungen. Jede Art von Mischung, zum Beispiel Lösung oder Suspension, kann durch das Verfahren sterilisiert werden, einschließlich alle Formulierungen für die medizinische Behandlung oder Diagnose, einschließlich – aber nicht ausschließlich – jedes Arzneimittel, das zur Verabreichung an einen Patienten, einschließlich Mensch oder Tier, gedacht ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Desinfizieren eines mit Nanobakterien kontaminierten Gegenstands zur Verfügung, umfassend das Aussetzen der Nanobakterien einer desinfizierenden Lösung. Eine desinfizierende Mischung gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine Mischung aus Kaliumpersulfat und Sulfaminsäure in Wasser, vorzugsweise destilliertem Wasser. Die Mischung kann eine Lösung, Suspension oder dergleichen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mischung eine Lösung von etwa 35 % bis etwa 70 % Kaliumpersulfat und etwa 1 % bis etwa 15 % Sulfaminsäure. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Mischung etwa 50 % Kaliumpersulfat und etwa 5 % Sulfaminsäure. Diese Mischung kann in voller Konzentration verwendet werden oder kann zur Verwendung unter physiologischen Bedingungen verdünnt werden, vorzugsweise auf eine Konzentration von etwa 0,1 % bis etwa 10 %, besonders bevorzugt eine Konzentration von etwa 1 %.
In einer alternativen Ausführungsform ist eine Desinfektionsmittelmischung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Mischung aus Formaldehyd, Glyoxal, Glyoxylsäure und Dimethylaurylbenzyl-Ammoniumchlorid in Wasser, vorzugsweise destilliertem Wasser. Die Mischung kann eine Lösung, Suspension oder dergleichen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mischung eine Lösung von etwa 1 % bis etwa 10 % Formaldehyd, etwa 5 bis etwa 10 % Glyoxal, etwa 0,1 % bis etwa 5 % Glyoxylsäure und etwa 3 % bis etwa 12 % Dimethylaurylbenzyl-Ammoniumchlorid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat die Mischung etwa 4,5 % Formaldehyd, etwa 6,8 % Glyoxal, etwa 1,5 % Glyoxylsäure und etwa 6 % Dimethylaurylbenzyl-Ammoniumchlorid. Diese Mischung kann in voller Konzentration verwendet werden oder kann zur Verwendung in physiologischen Verhältnissen verdünnt werden, vorzugsweise auf eine Konzentration von etwa 0,1 % bis etwa 10 %, besonders bevorzugt eine Konzentration von etwa 3 %.
Alternativ kann ein Gegenstand durch Demineralisierung der Nanobakterien und anschließendes Aussetzen einer desinfizierenden Chemikalie dekontaminiert werden. Die Demineralisierung kann durch Aussetzen der Nanobakterien einem niedrigem pH, vorzugsweise mit einer starken Säure, vorzugsweise Salzsäure, erzielt werden. Alternativ kann die Demineralisierung durch deren Aussetzen einem Calciumchelator erreicht werden. Geeignete Calciumchelatoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Zitronensäure und Citratverbindungen. In Verbindung mit der Demineralisierung kann jedes aus einem breiten Spektrum von desinfizierenden Chemikalien in geeigneter Weise verwendet werden. Eine besonders bevorzugte desinfizierende Mischung, die in Verbindung mit der Demineralisierung zu verwenden ist, umfasst eine oder mehrere der folgenden:
Nach der Demineralisierung entweder als Alternative zur Verwendung einer Desinfektionslösung oder als Zusatz zur Verwendung der Desinfektionslösung kann der Gegenstand wahlweise autoklaviert werden, und zwar vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens 121 °C, vorzugsweise mindestens 20 Minuten lang.
Alternativ kann nach einer Demineralisierung entweder als Alternative zur Verwendung einer Desinfektionslösung oder als Zusatz zur Verwendung einer Desinfektionslösung der Gegenstand einer ultravioletten Strahlung ausgesetzt werden, z.B. durch Aussetzen des Gegenstands einem ultravioletten Licht, das in etwa gleich dem Aussetzen einer UV-C-Lampe von mindestens etwa 15 W in einer Entfernung von etwa 60 cm oder weniger für mindestens etwa 1 Stunde, vorzugsweise mindestens etwa 3 Stunden, besonders bevorzugt mindestens über Nacht entspricht. Alternativ kann der Gegenstand mindestens etwa drei Megarad gamma-Strahlung ausgesetzt werden.
Nanobakterien können auch aus Flüssigkeiten mittels Ultraschallbehandlung beseitigt werden. Es kann jeder herkömmliche Sonikator verwendet werden; die Ultraschallbehandlungszeiten variieren je nach Leistung des Sonikators und dem Volumen und den Eigenschaften der zu desinfizierenden Flüssigkeit. Angemessene Ultraschallbehandlungszeiten können leicht durch den Fachmann ohne die Notwendigkeit übermäßigen Experimentierens bestimmt werden. Typischerweise reicht eine Ultraschallbehandlung der Proben von 5 bis 10 Minuten aus, um Nanobakterien aus den meisten Lösungen zu beseitigen. Eine Ultraschallbehandlung kann auf jeden Probenumfang angewendet werden, wenn die Ultraschallleistung und der Probenbehälter zueinander ein geeignetes Verhältnis haben. Hochleistungs-Ultraschallquellen ermöglichen auch kontinuierliche Abläufe. Das Verfahren ist bei der Behandlung jeder Lösung anwendbar. Für Proteine und andere subzelluläre Komponenten der Probe ist es schonend, wenn ein übermäßiges Erwärmen durch Kühlen der Lösung verhindert wird, und zwar entweder kontinuierlich (z.B. durch Austausch des Behälters, in dem die zu desinfizierende Lösung in einem kalten Wasserbad gehalten wird) oder durch periodisches Unterbrechen des Ultraschallverfahrens, um die Lösung zu kühlen (z.B. durch Stellen des Behälters, in dem die zu desinfizierende Lösung gehalten wird, in ein Eisbad).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Nanobakterien zerstört, indem der zu desinfizierende Gegenstand durch Erwärmen für mindestens etwa eine Stunde auf eine Temperatur von mindestens etwa 100°C getrocknet wird. Alternativ kann nach einer Demineralisierung, wie oben erörtert, der Gegenstand für mindestens etwa 15 Minuten, vorzugsweise mindestens etwa 30 Minuten, auf Temperaturen von mindestens 60°C, vorzugsweise mindestens etwa 100°C, erwärmt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter Gewebekulturmedien zur Verfügung, die so formuliert sind, dass sie frei von Nanobakterien sind. Die von Nanobakterien freien Gewebekulturmedien können alle Standardgewebekulturmedien sein, die dem Fachmann zur Verfügung stehen und die zusätzlich eine Nanobakterien-Antibiotikum-wirksame Menge an einem oder mehreren Antibiotika umfassen, die aus der Gruppe bestehend aus β-Lactamantibiotika, Aminoglycosidantibiotika, Tetracyclinantibiotika und Mischungen davon ausgewählt sind. Geeignete β-Lactamantibiotika zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Penicillin, Phenethicillin, Ampicillin, Azlocillin, Bacmpicillin, Carbenicillin, Cyclacillin, Mezlocillin, Piperacillin, Epicillin, Hetacillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Methicillin, Nafcillin, Oxacillin und deren Salze, sind aber nicht darauf beschränkt. Geeignete Aminoglycosid-Antbiotika zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Streptomycin, Kanamycin, Gentamycin, Amikacin, Neomycin, Pardomycin, Tobramycin, Viomycin und Salze davon, sind aber nicht darauf beschränkt. Geeignete Tetracycline umfassen Tetracyclin, Chlortetracyclin, Demeclocyclin, Doxycyclin, Methacyclin, Oxytetracyclin, Rolitetracyclin, Minocyclin, Sancyclin und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, sind aber nicht darauf beschränkt. Darüber hinaus wird vor der Verwendung ein Kulturmedium gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise gemäß einem der oben angeführten Verfahren sterilisiert. Der Durchschnittsfachmann kann das Sterilisationsverfahren auswählen, das für das bestimmte Kulturmedium am besten geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Verhindern von Calcifizierungen in vivo zur Verfügung, d.h. bei einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, umfassend das Verabreichen eines Antibiotikums einem Patienten in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, dass das Wachstum von Nanobakterien gestört oder verhindert wird. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung umfassen in vivo Calcifizierungen Nierensteine, Atherosclerose, akute Periarthritis, dentale Pulpasteine oder Dentikel, Malakoplakie, Alzheimer, Autoimmunerkrankungen, einschließlich Sklerodermie und metastatische und tumorale Calcifizierung, die bei Hämodialysepatienten gefunden wird, und Calciphylaxe, maligne Tumore, einschließlich seröser Ovarialtumor, papilläres Adenocarcinom des Endometriums, Brustkrebs, papilläres Karzinom der Schilddrüse, duodenaler Carcinoidtumor und Craniopharnygiom, sind aber nicht darauf beschränkt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein „Patient" ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch, der an einer Gewebecalcifizierung, insbesondere in Verbindung mit einer der oben angeführten Erkrankungen, leidet.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verhindern von Calcifizierungen in vivo bei einem Patienten zur Verfügung, der einer solchen Behandlung bedarf, umfassend das Verabreichen einer antibiotischen Nanobakterien-Antibiotika-wirksamen Menge an einem oder mehreren Antibiotika, die aus der Gruppe bestehend aus β-Lactamantibiotika, Aminoglycosidantibiotika, Tetracyclinen und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon und Mischungen davon ausgewählt sind. Geeignete β-Lactamantibiotika zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Penicillin, Phenethicillin, Ampicillin, Azlocillin, Bacmpicillin, Carbenicillin, Cyclacillin, Mezlocillin, Piperacillin, Epicillin, Hetacillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Methicillin, Nafcillin, Oxacillin und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, sind aber nicht darauf beschränkt. Geeignete Aminoglycosidantibiotika zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Streptomycin, Kanamycin, Gentamycin, Amikacin, Neomycin, Pardomycin, Tobramycin, Viomycin und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, sind aber nicht darauf beschränkt. Geeignete Tetracycline umfassen Tetracyclin, Chlortetracyclin, Demeclocyclin, Doxycyclin, Methacyclin, Oxytetracyclin, Rolitetracyclin, Minocycline, Sancyclin und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Antibiotika zusammen mit Citratverbindungen verabreicht.
In einer alternativen Ausführungsform können Vitamin K und/oder dessen Analoge für die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete Analoge von Vitamin K zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Menadion, Phytonadion (Vitamin K₁) und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, sind aber nicht darauf beschränkt. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird Vitamin K vorzugsweise in einer Konzentration von mindestens 1 μg/ml verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform können p-Aminosalicylsäure sowie andere Salicylsäurederivate für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Besonders bevorzugt ist Acetylsalicylsäure (d.h. Aspirin).
In einer weiteren Ausführungsform können Bisphosphonate für die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Als Familie sind Bisphosphonate pharmakologisch durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, die Knochenresorption zu hemmen, während sie pharmakokinetisch durch ihre Ähnlichkeit bezüglich der Absorption, Verteilung und Beseitigung eingeteilt sind.
Obwohl alle Bisphosphonate ähnliche physikochemische Eigenschaften aufweisen, unterscheidet sich ihre Antiresorptionswirksamkeit. Die Wirksamkeit ist dramatisch erhöht, wenn die Aminogruppe in der aliphatischen Kohlenstoffkette enthalten ist. Zum Beispiel ist Alendronat, ein Aminobisphosphonat, etwa 700-mal wirksamer als Etidronat, und zwar sowohl in vitro als auch in vivo. Im Allgemeinen werden Bisphosphonate wegen ihrer schlechten Lipophilizität schlecht vom Magen-Darm-Trakt absorbiert. Studien, die in vitro und in vivo durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass Bisphosphonate vom Magen-Darm-Trakt über den parazellulären Transport absorbiert werden. Systemisch verfügbare Bisphosphonate verschwinden sehr schnell aus dem Plasma und werden teilweise vom Knochen aufgenommen und teilweise durch die Nieren ausgeschieden. Der relative Beitrag dieser beiden Verfahren zur Gesamtplasmaentfernung ist unter den Bisphosphonaten unterschiedlich. Bis jetzt geben alle untersuchten Bisphosphonate keinen Hinweis auf einen Metabolismus. Eine Nierenausscheidung ist der einzige Weg, sie zu entfernen. Untersuchungen mit Alendronat bei Ratten zeigen, dass das Medikament aktiv durch ein uncharakteristisches Nierentransportsystem und nicht durch die anionischen oder kationischen Nierentransportsysteme ausgeschieden wird.
Bisphosphonate haben eine P-C-P-Bindung anstelle der P-O-P-Bindung von anorganischem Pyrophosphat, durch die sie gegenüber enzymatischem Abbau resistent werden und ihnen eine hohe Affinität für Hydroxyapatit verliehen wird. Sie sind potente Blocker einer osteoklastischen Knochenresorption und werden erfolgreich zum Behandeln von metabolischen Knochenerkrankungen verwendet, die eine erhöhte Knochenresorption umfassen. Es ist möglich, eine Anzahl von Bisphosphonaten durch Austausch des Wasserstoffs auf dem Kohlenstoffatom zu synthetisieren. Geeignete Bisphosphonate zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Alendronsäure, Etidronsäure, Clodronsäure, Oxidronsäure und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, sind aber nicht darauf beschränkt. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden Bisphosphonate vorzugsweise in einer Dosis von etwa 5–20 mg/kg/Tag verabreicht.
Ein noch weiterer Teil der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Stoffzusammensetzung, die zum Verhindern von Calcifizierungen in vivo geeignet ist und mindestens eine oder mehrere, oben angegebene Verbindungen, Mischungen davon und/oder pharmazeutische Salze davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür umfasst. Solche Zusammensetzungen werden in Übereinstimmung mit akzeptierten pharmazeutischen Verfahren hergestellt, wie sie zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausgabe, Hrsg. Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton PA (1985) beschrieben sind.
Zur therapeutischen Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein Antibiotikum oder sein Salz günstigerweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, die ein oder mehrere Antibiotika oder Salze davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür enthält. Geeignete Träger sind auf dem Fachgebiet bekannt und variieren je nach der gewünschten Form und Verabreichungsweise der pharmazeutischen Zusammensetzung. Zum Beispiel können sie Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe, wie beispielsweise Füllstoffe, Bindemittel, Netzmittel, Desintegratoren, oberflächenaktive Mittel, Gleitmittel und dergleichen aufweisen. Typischerweise kann der Träger ein fester, flüssiger oder verdampfbarer Träger oder Kombinationen davon sein. Jeder Träger muss in dem Sinne „akzeptabel" sein, dass er mit den anderen Inhaltsstoffen in der Zusammensetzung kompatibel ist und dem Patienten nicht schaden darf. Der Träger muss biologisch akzeptabel und inert sein, d.h. er muss die antibiotische(n) Verbindung(en) zulassen, um die Entwicklung von Nanobakterien und insbesondere von Apatitkristallen, die mit den Nanobakterien in Verbindung stehen, zu verhindern.
Antibiotische Verbindungen zur Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung oder Salze davon können zusammen mit dem Träger zu einer gewünschten Dosiseinheitsform formuliert werden. Typische Dosiseinheitsformen umfassen Tabletten, Pillen, Pulver, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Granulat, Kapseln und Suppositorien; wobei Tabletten und Kapseln besonders bevorzugt sind. Formulierungen umfassen diejenigen, die für die orale, rektale, nasale, topische (einschließlich bukkale und sublinguale), vaginale und parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intradermale und transdermale) Verabreichung geeignet sind, wobei Formulierungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, bevorzugt werden.
Zum Beispiel werden, um für die Injektion geeignete Formulierungen herzustellen, Lösungen und Suspensionen sterilisiert, die vorzugsweise isotonisch zum Blut sind. Bei der Herstellung von injizierbaren Präparaten können auch Träger, die üblicherweise auf diesem Gebiet verwendet werden, benutzt werden, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Propylenglycol, ethoxylierter Isostearylalkohol, polyoxylierter Isostearylalkohol, Polyoxyethylensorbit, Sorbitatester und dergleichen. In diesen Fällen können angemessene Mengen an isotonischen Einstellern, wie beispielsweise Natriumchlorid, Glucose oder Glycerol zugesetzt werden, damit die Präparate isotonisch werden. Die wässrigen sterilen Injektionslösungen können weiter Antioxidanzien, Puffer, Bakterostaten und ähnliche Zusätze, die für die parenteralen Formulierungen annehmbar sind, enthalten.
Die Formulierungen können günstigerweise in einer Dosiseinheitsform vorliegen und durch jedes auf dem Gebiet der Pharmazie bekannte Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren umfassen den Schritt des Inverbindungsbringens des Wirkstoffs mit dem Träger, der ein oder mehrere zusätzliche Zusatzstoffe umfassen kann. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichförmiges und inniges Inverbindungbringen des Wirkstoffs mit den flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beidem und, falls notwendig, anschließendes Formen des Produkts hergestellt. Verschiedene Einheitsdosis- und Mehrfachdosisbehälter, z.B. versiegelte Ampullen und Fläschchen, können verwendet werden, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist.
Zusätzlich zu den Inhaltsstoffen, die besonders oben erwähnt sind, können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung auch andere Mittel, die auf dem Fachgebiet für diese Art von pharmazeutischer Formulierung herkömmlich sind, umfassen.
Eine Verbindung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann in der Zusammensetzung in einem breiten Verhältnis zum Träger vorliegen. Zum Beispiel kann die Verbindung in einer Menge von 0,01 bis 99.9 Gew.-% und besonders bevorzugt in einer Menge von etwa 0,1 bis 99 Gew.-%, vorliegen. Noch weiter bevorzugt kann die Verbindung in einer Menge von etwa 1 bis 70 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegen.
Die Dosierung der Antibiotika, pharmazeutisch annehmbaren Salze davon oder Mischungen davon, die einem Patienten gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, variiert abhängig von mehreren Faktoren, die das Alter, das Gewicht, die Art des Patienten, die allgemeine Gesundheit des Patienten, die Heftigkeit der Symptome, ob die Zusammensetzung allein oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln verabreicht wird, das Auftreten von Nebenwirkungen und dergleichen umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Im Allgemeinen beträgt eine Dosis, die für die Anwendung beim Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist, etwa 0,001 bis 100 mg/kg Körpergewicht/Dosis, vorzugsweise etwa 0,01 bis 60 mg/kg Körpergewicht/Dosis und noch weiter bevorzugt etwa 0,1 bis 40 mg/kg Körpergewicht/Dosis pro Tag. Die gewünschte Dosis kann als 1 bis 6 oder mehr Unterdosen verabreicht werden, die in geeigneten Intervallen über den Tag verteilt gegeben werden. Die Antibiotikaverbindungen können wiederholt über einen Zeitraum von Monaten oder Jahren verabreicht werden, oder sie können langsam und konstant dem Patienten als Infusion gegeben werden. Es können auch höhere und niedrigere Dosen verabreicht werden.
Die tägliche Dosis kann zum Beispiel unter Berücksichtigung der oben angegebenen Anzahl von Parametern angepasst werden. Typischerweise können die vorliegenden Zusammensetzungen in einer Menge von etwa 0,001 bis 100 mg/kg Körpergewicht/Tag verabreicht werden. Allerdings können auch andere Mengen verabreicht werden. Um gute Plasmakonzentrationen zu erzielen, können die Antibiotika beispielsweise durch intravenöse Injektion einer etwa 0,1- bis 1%igen Lösung der Antibiotika, wahlweise in Salzlösung, gegeben werden oder oral als Bolus verabreicht werden.
Der Wirkstoff kann für die Therapie durch jeden geeigneten Weg verabreicht werden, einschließlich den topischen, oralen, rektalen, nasalen, vaginalen und parenteralen (einschließlich intraperitonealen, subkutanen, intramuskulären, intravenösen, intradermalen und transdermalen) Weg. Es ist davon auszugehen, dass der bevorzugte Weg mit dem Zustand und dem Alter des Patienten, der Natur der Störung und dem gewählten Wirkstoff, einschließlich anderer therapeutischer Mittel, variiert. Der orale Weg ist bevorzugt. Der intravenöse Weg ist auch bevorzugt. Allerdings können auch andere Wege verwendet werden, je nach dem Zustand des Patienten und der Behandlungsdauer.
Obwohl es möglich ist, dass das(die) Antibiotikum(a) allein verabreicht wird(werden), liegt es bevorzugt als pharmazeutische Formulierung vor. Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen mindestens ein Antibiotikum, wie oben angegeben, zusammen mit einem oder mehreren annehmbaren Trägern davon und wahlweise anderen therapeutischen Mitteln.
Das oben erwähnte Verfahren kann durch Verabreichung der Verbindungen als solches oder in Kombination mit anderen Antibiotika, einschließlich anderen therapeutischen Mitteln in einer pharmazeutischen Zusammensetzung durchgeführt werden. Andere therapeutische Mittel, die hier zur Verwendung geeignet sind, sind alle kompatiblen Medikamente, die durch dieselben oder andere Mechanismen für den beabsichtigten Zweck wirksam sind, oder Medikamente, die zu denen der oben angegebenen Antibiotika komplementär sind. Die in einer Kombinationstherapie verwendeten Medikamente können gleichzeitig entweder in getrennten oder kombinierten Formulierungen oder zu unterschiedlichen Zeiten im Hinblick auf die vorliegenden Verbindungen verabreicht werden, z.B. aufeinander folgend, so dass eine kombinierte Wirkung erzielt wird. Die Mengen und der Verabreichungsplan werden vom Arzt angepasst, indem vorzugsweise zuerst die Standarddosen reduziert und dann die erhaltenen Ergebnisse titriert werden. Das therapeutische Verfahren der Erfindung kann in Verbindung mit anderen Therapien verwendet werden, wie durch den Arzt bestimmt.
Da nunmehr die vorliegende Erfindung allgemein beschrieben ist, wird diese durch Bezug auf einige bestimmte Beispiele besser verständlich, die hier nur für die Zwecke der Veranschaulichung angegeben sind und die Erfindung oder eine Ausführungsform davon nicht einschränken sollen, wenn dies nicht spezifiziert ist.
BEISPIEL 1: Mineralisierung durch Nanobakterien
In dieser Untersuchung liefern die vorliegenden Erfinder den Nachweis, dass Nanobakterien als Kristallisationszentren (Herde) für die Bildung von biogenen Apatitstrukturen fungieren können. Das Mineralisierungsverfahren wurde in vitro mit einem Rinderisolat aus im Handel erhältlichem fötalem Rinderserum und mit einem menschlichen Isolat untersucht. Die Erkenntnisse sind in der Medizin von Bedeutung, weil eine nanobakterielle Bakterämie beim Menschen auftritt und ein nanobakterieller Herd eine pathologische Calcifizierung einleiten könnte.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Kulturverfahren für Nanobakterien
Nanobakterien wurden in DMEM (GIBCO) unter Säugetierzellkulturbedingungen (37°C, 5-10 % CO₂/90–95 % Luft) kultiviert. Das Serum wurde in einer 10%igen Endkonzentration als Ergänzung und Quelle für Nanobakterien verwendet, bei dem es sich um fötales Rinderserum (Sera Lab, Partie 901045) oder menschliches Serum von einem 29 Jahre alten Finnen handelte. Die Kulturen wurden mittels strenger aseptischer Verfahren in einer Zellkultureinrichtung hergestellt. Nanobakterielle Proben wurden vor dem Kultivieren durch 0,2 μm Filter filtriert. Subkulturen wurden entweder mit demselben Serum oder einem γ-bestrahlten fötalen Rinderserum (γ-FBS) als Kulturergänzung hergestellt. Fötales Rinderserum und Nanobakterien wurden γ-bestrahlt, wenn dies angezeigt war, und zwar mit einer minimalen Dosis von 30 kGy bei Raumtemperatur für etwa 16 Stunden durch Kolmi-Set (Ilomantsi, Finnland).
Die Subkultivierung von Nanobakterien in serumfreiem (SF) DMEM wurde fünf Jahre lang mit monatlichen Passagen 1:11 durchgeführt. SF-Nanobakterien haften fest am Boden des Kulturgefäßes an. Diese Kulturen wurden passagiert oder mit einem Gummischaber geerntet. Es wurden Kulturen auf einem Löffler-Medium eingerichtet, das mit 10 % konditioniertem Medium aus der nanobakteriellen Kultur ergänzt war, und DMEM ersetzte das Wasser in der Formel. Die Inkubationszeit betrug 6 Wochen unter Zellkulturbedingungen.
Es wurden nur reine nanobakterielle Kulturen verwendet. Eine positive Identifikation der Nanobakterien beinhaltete typische Wachstumsraten und optische Eigenschaften, eine spezifische Färbbarkeit mit Hoechst 33258 und mit indirekter Immunfluoreszenzfärbung (IIFS), wie nachfolgend beschrieben. Es wurden Kontrollexperimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine spontane Kristallisation in einem Kulturmedium auftreten könnte. Das Medium wurde mit oder ohne γ-FBS oder γ-bestrahlten Nanobakterien inkubiert. Es wurde selbst während der 6-monatigen Nachuntersuchung weder eine Mineralisierung noch eine Nanobakterienvermehrung beobachtet.
Herstellung und Infektion von 3T6-Zellen.
3T6-Zellen (ATCC CCL 96) wurden auf Deckgläsern kultiviert. SF-nanobakterielle Kulturen wurden abgeschabt und 100 μl-Portionen wurden den Zellkulturen zugesetzt und 24 h im Inkubator inkubiert. Den Kontrollexperimenten wurde nur DMEM zugesetzt. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), IIFS und DNA und von Kossa-Färbung wurden zur Beobachtung der Wechselwirkung zwischen Zelle und SF-Nanobakterien verwendet.
Nierensteine
Dreißig zufällig gesammelte Nierensteine (K-SKS, Stone Analysis Central Laboratory, Finnland) wurden in 1 N HCl demineralisiert und dann neutralisiert, bei 14.000 × g 15 min lang zentrifugiert, und die Pellets wurden für IIFS und TEM verwendet. Ein Teil der Pellets wurde in DMEM suspendiert, sterilfiltriert und in DMEM, das mit γ-FBS ergänzt war, unter nanobakteriellen Kulturbedingungen kultiviert.
Färbeverfahren
Es wurde eine DNA-Färbung mit Hoechst 33258 Fluorochrom, wie im Hoechst Stain Kit, Flow Laboratories beschrieben, durchgeführt, mit Ausnahme einer Erhöhung der Färbekonzentration von 0,5 μg/ml auf 5 μg/ml, wie angegeben. Die anti-nanobakteriellen monoklonalen Antikörper (mAb) der Klasse IgG1, Nb 8/0 und Nb 5/2, wurden bei der IIFS verwendet. Das Epitop des letzteren mAb wurde durch Inkubation in Natriumborhydrat inaktiviert (3 × 1 min; 0,5 mg/ml in PBS), wenn angegeben, um die Spezifität der Bindung zu testen. Die Proben wurden unter einem Nikon Microphot-FXA-Mikroskop mit Fluoreszenz- und differentieller Interferenzkontrast(DIC)-Optik betrachtet. Es wurde ein spezieller Calcifizierungsnachweis mit einer von Kossa-Färbung durchgeführt. Als Proben wurden 3T6-Zellen verwendet, die 48 h lang SF-Nanobakterien ausgesetzt waren.
Elektronenmikroskopie und energiedispersive Röntgenmikroanalyse.
Für eine negative Färbung wurden Nanobakterien durch Zentrifugation bei 40.000 g 1 h lang direkt aus fötalem Rinderserum, das in PBS 1:5 verdünnt war, isoliert. Ein mit Kohlenstoff beschichtetes 400 mesh-Kupfergitter wurde 1 min lang auf einen Tropfen der Nanobakterien-Suspension in PBS gelegt, mit Wasser gewaschen und 90 sec lang auf einem Tropfen von 1%iger Phosphowolframsäure gefärbt. Es wurden eine Rasterelektronenmikroskopie (REM) und TEM durchgeführt. Die topographischen Merkmale der Nanobakterien wurden mit einem REM, das mit einer energiedispersiven Röntgenmikroanalyse (EDX) ausgerüstet war, untersucht. Hydroxyapatit (Sigma, No-H-0252, St. Louis, MO) wurde als Referenz verwendet.
Fourier-Transformations-IR-Spektroskopie (FTIR), chemische Analyse und Enzymassays
Hydroxyl- und Carbonatgruppen in den Apatitmineralien wurden mittels FTIR durch K-SKS, Stone Analysis Central Laboratory, Finnland, nach Standardverfahren ermittelt. Die chemische Analyse von Nanobakterien wurde durch Analyse von Ureaseenzymaktivität und alkalischer Phosphatase (AP) mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat bei einem pH von 9,5 durchgeführt.
ERGEBNISSE
Kultureigenschaften, Morphologie und Apatitbildung durch Nanobakterien in Serum enthaltenden Medien.
Eine Lichtmikroskopie mit DIC zeigte nach etwa einer Woche Kulturdauer kaum nachweisbare Nanobakterien in der Nähe des Kulturgefäßbodens. Innerhalb von zwei Wochen traten Nanobakterien als Gruppen auf, die im Mikroskop leicht zu sehen waren. Nach einem Monat lagen viele in Klumpen vor und fingen an, sich am Boden des Kulturgefäßes anzuhaften. Nach Ablauf von zwei Monaten befanden sich die meisten in einem weiß gefärbten Biofilm, der mit dem bloßen Auge sichtbar war. Die Kriterien für eine reine nanobakterielle Kultur waren brüchige Anhäufungen von typischen kokkenförmigen Partikeln (1A), die eine DNA-Färbbarkeit (1B) nur mit dem modifizierten Verfahren zeigen, ein negatives Kulturergebnis auf Schafsblut-Agar und IIFS-Positivität mit anti-Nanobakterien mAbs.
Eine Negativfärbung von Nanobakterien in nicht kultiviertem fötalem Rinderserum zeigte 0,2 – 0,3 μm kokkenförmige Partikel (Figur IC). Nach einem Monat Kulturdauer, zeigte das REM eine ähnliche Kokkenform mit einem Durchmesser von 0,2 bis 0,5 μm (1D). Die unebenen Oberflächen ähnelten denen in TEM zu sehenden (1E–G). Während längerer Kulturdauern waren sie größtenteils an den Kulturgefäßen angeheftet und lagen schließlich in einer mineralischen Schicht vor (1F und G). Die chemische Analyse mittels EDX ergab ähnliche Ca- und P-Spitzen, wie für Hydroxyapatit ermittelt (1H und I). Kulturen des menschlichen Isolats führten zu identischen Ergebnissen (nicht gezeigt). Die chemische Analyse von Nanobakterien, die nach einer 3-monatigen Kulturdauer geerntet wurden, zeigte einen hohen Gehalt an anorganischem Material. Das Pellettrockengewicht schwankte von 23 % bis 39 % und bestand aus: N (1–1,3 %); P (12,3–14,6 %); Ca (23,4–23,5 %); Mg (1,4–1,9 %); K (0,1 %) und Na (1,2–1,4 %). FTIR zeigte, dass Carbonatapatit in Proben von allen Kulturaltern zwischen 7–180 Tagen sowohl in Nanobakterien vom Mensch als auch vom Rind vorlag. Kontroll-Hydroxyapatit wurde im Test korrekt identifiziert. Die analytischen Verfahren schließen das mögliche Vorhandensein von geringen Mengen an anderen Mineralphasen nicht aus. Um diese Möglichkeit auszuschließen, wird eine kristallographische Analyse benötigt. Nanobakterien erzeugten keine Urease- oder AP-Aktivität und ihr Kulturmedium blieb bei einem pH von 7,4.
Apatitbildung durch Nanobakterien im Löffler-Medium.
Makroskopische nanobakterielle Kolonien auf modifiziertem Löffler-Medium (2A und B) waren steinartig, graubraun, passierbar und durchdrangen die Mediumsschicht und hafteten nach 6-wöchiger Kultur am Boden des Kulturgefäßes an. IIFS mit anti-Nanobakterien mAbs (Daten nicht gezeigt) und TEM zeigten Nanobakterien, die mit nadelförmigen Apatitkristallen (2C) überzogen waren, ähnlich den Hydroxyapatitkristallen (2D).
Apatitbildung durch Nanobakterien im SF-Medium.
Beim Waschen wurden nanobakterielle Pellets oder SF-Nanobakterien in SF-DMEM subkultiviert, am Boden anhaftende kokkenförmige Organismen wurden innerhalb eines Tages beobachtet. Die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie zeigte eine mehrere μm dicke Mineralschicht um jedes Nanobakterium herum, die in einer Woche die Größe von Hefe erreichte (3A). Ihre Morphologie unterschied sich umfangreich von den kokkenförmigen Nanobakterien, aber es wurde eine ähnliche DNA-Färbbarkeit beobachtet (3B). Sie erzeugten Biomasse in etwa der halben Rate, die in Kulturen mit Serum beobachtet wurde. Die metabolische Einbringung von [³⁵S]-Methionin und [5-³H]-Uridin ist der Beweis, dass sie sich replizierten. Die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie zeigte eine nanobakterielle Vermehrung in den Mineralformationen (3C) Diese Apatitschutzräume hatten, wie im REM gezeigt, einen hohlen Innenraum und waren offensichtlich der Wohnplatz der Organismen (3E und F). Die Größe des Hohlraums hängt vermutlich von der Zahl der Nanobakterien ab, die er enthält (3F). Augenscheinlich lagen vor dem Abschaben die Öffnungen der Hohlräume gegenüber dem Kulturgefäßboden. Daher boten die Apatitschutzräume für die Organismen einen vollständigen Schutz. Die Kulturen konnten monatlich über 5 Jahre passagiert werden und folgten stets einem ähnlichen Wachstumsmuster. Nach der Zugabe von γ-FBS kehrten die nanobakteriellen Formationen wieder zu den Formen zurück, die in den Serumkulturen gefunden wurden (siehe 3D). Es wurde mittels EDX nachgewiesen, dass es sich bei den Schutzräumen von ihrer Natur her um Apatit handelte. Mittels FTIR wurde festgestellt, dass es sich um Carbonatapatit handelte. Das menschliche Isolat erzeugte ähnliche Gebilde.
Intra- und extrazelluläre Calcifizierung in Fibroblastkulturen.
3T6-Zellen, die 48 h lang mit SF-Nanobakterien infiziert wurden, zeigten eine veränderte Zellmorphologie, z.B. eine große Vakuolisierung mit internalisierten SF-Nanobakterien (3G). Kontrollzellen waren negativ (nicht gezeigt). Eine gewöhnliche DNA-Färbung der mit Nanobakterien infizierten Zellen zeigte keine normale Kontamination (3H). TEM zeigte gelegentlich SF-Nanobakterien, die an der Zelloberfläche anhafteten, meist befanden sie sich aber in verschiedenen Kammern innerhalb der Zellen (3I–L), einschließlich dem Kern (nicht gezeigt). Eine von Kossa-Färbung ergab eine intra- und extrazelluläre Calcifizierung in diesen Zellen (4D und E). Stark infizierte Zellen wiesen Kernabnormalitäten auf, z.B. einen Makronukleus, wie in der 4E gezeigt, sowie eine abnormale Kernform (3G, H, K und L). Kontrollzellen waren von Kossa-negativ und wiesen keine Kernabnormalitäten auf (4F).
Nachweis von nanobakteriellen Antigenen in Nierensteinen.
Die vorliegenden Erfinder leiteten eine Studie mit 30 menschlichen Nierensteinen, um zu versuchen, das Vorhandensein von Nanobakterien nachzuweisen. Nanobakterienspezifisches mAb zeigte in allen 30 demineralisierten Steinen mittels IIFS positive Kokken von Nanobakteriengröße in verschiedenen Konzentrationen. Ein Bild einer relevanten Probe ist in der 4C zu sehen. Die Ergebnisse wurden mit einem anderen nanobakterienspezifischen mAb, dem Nb 5/2, wiederholt, der ein Kohlenhydratepitop nachweist, und eine Antikörperbindung konnte mit einer Natriumborhydratbehandlung beseitigt werden, die die Kohlenhydratantigene zerstört. Die Spezifität wurde weiter mit negativen Färbungsergebnissen mit 4 unterschiedlichen mAbs (Klasse IgG1) nachgewiesen, die nicht relevante Antigene ermittelten (Daten nicht gezeigt). Bakterien von ähnlicher Größe und Morphologie (4B) wie Nanobakterien (4A) wurden mit TEM in stark positiven Steinen gefunden (4B und C). Unter nanobakteriellen Kulturbedingungen zeigten sterilfiltrierte Extrakte von allen Steinen Mikroorganismen, die die Wachstumsrate, Morphologie, Mineralisierung und Färbungseigenschaften von Nanobakterien aufwiesen.
DISKUSSION
Die vorliegenden Erfinder haben nanobakterielle Kultursysteme gefunden, die eine reproduzierbare Herstellung einer Apatitcalcifizierung in vitro ermöglicht. Je nach den Kulturbedingungen konnten winzige Partikel von Nanokolloidgröße, die mit Apatit bedeckt waren, oder Biofilm, Sand, Steine und das tumorartige Wachstum von Apatit erzeugt werden (Tabelle 1).
Tabelle 1. Kultivierbarkeit von Nanobakterien und Apatitbildung
Die Hauptvoraussetzung für eine Mineralisierung waren niedrige Niveaus an intaktem Serum im Kulturmedium. Das Serum enthält starke proteinöse Inhibitoren für die Apatitkristallbildung, Osteopontin, Osteocalcin und Fetuin, die die beobachtete Hemmung und sogar Auflösung der gebildeten Mineralien nach einem Nachfüllen des fötalen Rinderserums ausmachen können. In den Fällen von nanobakteriellen Kulturen in Serum enthaltendem Medium erlaubten die Inhibitoren nur am Rand eine Mineralisierung. Die Mineralisierung erhöhte sich parallel mit der Verdünnung des Serums im Zellkulturmedium. Im SF-Medium erfolgte schließlich eine Apatitbildung umfangreich und schnell. Obwohl modifiziertes Löffler-Medium 75 % Serum enthält, wurden die Serumproteine während der Sterilisationsschritte denaturiert. Daher wurde eine Apaptitbildung nicht gehemmt, was in 6 Wochen zu festen Apatitkolonien mit etwa 1–5 mm Durchmesser führte. Lebende Nanobakterien werden benötigt, um im nanobakteriellen Modell Apatit zu erzeugen. ☐-bestrahlte Nanobakterien vermehrten sich nicht und, obwohl sie auf sich Apatit ansammeln konnten, wurde selbst nach Inkubationen über 6 Monate hinweg keine erhebliche Calcifizierung erzeugt.
Eine chemische Analyse zeigte, dass die Gesamtzusammensetzung von Biofilm und fester Mineralbildung ähnlich der von Knochen war, abgesehen davon, dass Carbonatapatit gebildet wurde, wie bei den meisten extraskeletalen Gewebecalcifizierungen und Steinen, während im Knochen Hydroxyapatit die vorherrschende Form ist. Im nanobakteriellen Model wurde ohne ein Ergänzen des Mediums Apatit bei [Ca] 1,8 mM und [P₁] 0,9 mM oder weniger gebildet.
Es wurden in allen 30 menschlichen Nierensteinen, die von den Erfindern gescreent wurden, Nanobakterien gefunden. Früher wurden nur Struvitsteine (4–15 % von allen Nierensteinen), die aus Magnesiumammoniumphosphat und kleinen Mengen an Apatit aufgebaut sind, als von Bakterien stammend angesehen. Sie werden in vitro und wahrscheinlich in vivo durch Proteus, Staphylococci und E. coli gebildet, die Urease produzieren, wodurch der örtliche pH auf mehr lithogene Niveaus ansteigt. Alkalische Phosphatase kann die Lithogenizität erhöhen. Nanobakterien erzeugen keine Urease oder AP, sondern nukleieren bei einem pH von 7,4 Carbonatapatit direkt auf ihren Oberflächen, was das Vorhandensein von nukleierenden Molekülen nahe legt. Da Nanobakterien unter physiologischen Bedingungen in Medien kultivierbar sind, die eine ähnliche Zusammensetzung wie glomeruläres Filtrat haben, bieten Nanobakterien ein einzigartiges Modell für die Nierensteinbildung an.
BEISPIEL 2: Beseitigung von Nanobakterien
Die Auswahl eines geeigneten Tests für die nanobakterielle Desinfektion ist nicht einfach, und die akkuraten Vergleiche der Ergebnisse, die mit verschiedenen Tests erhalten wurden, sind aufgrund einer Anzahl von Faktoren, die die Desinfektion beeinflussen, problematisch. Die Faktoren beinhalten Dauer der Exposition, Anwesenheit einer organischen Ladung, Typ, Alter, Konzentration und Verdünnung eines Desinfektionsmittels, und Anzahl, Alter, Wachstumsform der anwesenden Mikroorganismen, und Temperatur. Gegenwärtig gibt es verschiedene Typen von Desinfektionstests, aber diese sind hauptsächlich für schnell wachsende Bakterien geeignet. Die Desinfektionstests langsam wachsender Mycobakterien, wobei einige von ihnen extrem resistent sind, haben lange unter einer geeigneten verlässlichen Standardisierung gelitten. Typischerweise wurden Zentrifugation oder sehr hohe Verdünnungen benutzt, um den Effekt von Restkonzentrationen an Desinfektionsmittel zu eliminieren. Nachfolgend wurde auf Agarmedium ausplattiert, um die Reduktion in der Lebensfähigkeit durch Zählen der Kolonien zu bestimmen. Für Nanobakterien sind solche Assays nicht geeignet. Die Wiedergewinnung von Nanobakterien durch Zentrifugation führt im Allgemeinen zu unvorhersehbaren Verlusten. Aufgrund ihrer langsamen Wachstumsrate führen hohe Verdünnungen zu sehr langen Inkubationszeiten, und die extrem schwache Kulturfähigkeit auf festen Medien macht die Bewertung einer Zählung von Nanobakterien unmöglich.
Die Mineralisierung ist die am meisten charakteristische Eigenschaft von Nanobakterien, und möglicherweise der Hauptmechanismus der Pathologie, die durch die Organismen ausgelöst wird. Das Mineral, das sich unter Standardkulturbedingungen bildet, ist Hydroxyl- oder Carbonatapatit, wie es durch verschiedene Methoden, einschließlich Energie-disperser Röntgenstrahlmikroanalyse oder Fourier-transformierter IR-Spektroskopie, herausgefunden wurde. Eine der primären Funktionen des Minerals könnte Schutz gegen rauhe Umweltbedingungen sein. Der Apatit könnte die Penetration gefährlicher Verbindungen in das Innere der Organismen verhindern. Abhängig von der Kulturzeit und den Kulturbedingungen wurden verschiedene Mineralisierungsgrade beobachtet.
Die Mineralisierung durch Nanobakterien, die ohne Serum kultiviert wurden (SF-Nanobakterien), ist sehr viel ausgeprägter als jene, die bei Nanobakterien bobachtet wurde, die in serum-haltigem Medium kultiviert wurden. Die Verdopplungszeit von Serum-Nanobaktertin und SF-Nanobakterien ist ungefähr 3 Tage bzw. 6 Tage, was durch Aminosäureneinbau gemessen wurde.
Desinfizierende Chemikalien wurden jetzt bei im allgemeinen üblichen Konzentrationen gegen kultivierte Nanobakterien getestet. Die ausgewählten Chemikalien repräsentieren eine breite Vielzahl von Mechanismen von denen bekannt ist, daß sie biologische Systeme beeinflussen. Das Überleben von Nanobakterien bei hohen Temperaturen, bei Trockenheit und bei UV-C-Bestrahlung wurde auch getestet. Es gibt verschiedene Mechanismen für die antibiotische Resistenz in Bakterien, die hier nicht diskutiert wurde. Die Erfinder haben den Effekt von vier Antibiotika gegen Nanobakterien getestet. Die Antibiotika sind solche, die allgemein in Zellkulturen verwendet werden.
EXPERIMENTELLE AUSFÜHRUNG
Nanobakterienkultur in serum-haltigem Medium
Nanobakterien wurden mit 10% fötalem Rinderserum in DMEM-Medium (Serum-Nanobakterien) für einen Monat bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ – 95% Luft kultiviert. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation geerntet. Für die Autoklaven-, UV-, Mikrowellen- und Trocknungsbehandlungen wurden die geerneten Nanobakterien in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4; PBS) suspendiert. Nach den Behandlungen wurden die Nanobakterien in 10% gamma-bestrahltem fötalem Rinderserum in DMEM-Medium subkultiviert. Das Wachstum der Serum-Nanobakterien wurde durch Lichtmikroskopie und Absorptionsmessung mit einem Spektrophotometer bei 650 nm verfolgt.
Nanobakterienkultur ohne Serum
SF-Nanobakterien wurden in DMEM-Medium für eine Woche bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ – 95% Luft kultiviert, und alle Kulturen hafteten fest an das Kulturgefäß. Die Kulturen wurden Desinfektionsmitteln nach Entfernen des Kulturmediums ausgesetzt. Für die Autoklaven-, UV-, Mikrowellen- und Trocknungsbehandlungen wurde das Medium entfernt und anstelle eine gleiche Menge an PBS verwendet. Für die Hitzebehandlungen wurden die SF-Nanobakterien durch Ausschaben des Kulturgefäßes geerntet, gefolgt von einer Zentrifugation des Mediums. Das erhaltene Pellet wurde in PBS suspendiert und in dem Test verwendet. Nach den Behandlungen wurden die SF-Nanobakterien in DMEM-Medium subkultiviert und das Wachstum durch Lichtmikroskopie verfolgt, um die Anhaftung und die typische Mineralisierung zu sehen.
Chemische Desinfektion für SF-Nanobakterien
Die Konzentrationen der verwendeten Chemikalien waren jene, die üblicherweise für Desinfektionen verwendet werden oder waren durch den Hersteller angegeben. Die Chemikalien beinhalteten 70% Ethanol, 2% Glutaraldehyd, 4% Formaldehyd, 0,5% Hypochlorit, 3% Wasserstoffperoxid, 1M Salzsäure (HCl), 1M Natriumhydroxid (NaOH), 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1% Tween 80, 1% Triton-X100, 3M Guanidiniumhydrochlorid, 3M Harnstoff, 1% Virkon^® (Antec International Ltd., Suffolk, England; 100% Produkt enthält 50% Kaliumpersulfat, 5% Sulfaminische Säure), 1,5% Erfinol^® (Orion OY, Finnland; 100% Produkt enthält < 5% NaOH, < 5% O-Benzyl-p-chlorphenol, 5–15% p-Chlor-m-kresol), 1% Klorilli^® (Orion OY, Finnland; 100% Produkt enthält Natriummetasilikat, Natrium-N-chlor-p-toluolsulfonamid-3-hydrat und 20000 ppm aktives Chlor) und 3% Buraton^® (Schülke & Mayr; Deutschland; 100% Produkt enthält 4,5% Formaldehyd, 6,8% Glyoxal, 1,5% Glyoxalsäure, 6% Dimethyllaurylbenzyl-ammoniumchlorid). Die zu verwendenten Verdünnungen wurden frisch an dem Tag der Einwirkung in sterilem destilliertem Wasser hergestellt. Als Positivkontrolle wurde nur Verdünnungsmittel verwendet. Die Negativkontrolle enthielt nur Kulturmedium.
Die SF-Nanobakterien wurden den Chemikalien für 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur nach Entfernen des Kulturmediums ausgesetzt. Nach der Einwirkung wurde die Desinfektionslösung entfernt und frisches Medium hinzugegeben (mit einem Neutralisisationsschritt im Fall von HCl und NaOH). Falls irgendein Ablösen stattfand, wurden die Nanobakterien durch Zentrifugation entfernt und subkultiviert. Die behandelten serumfreien Kulturen wurden 1:10 nach 48 Stunden passagiert und das Wachstum durch Lichtmikroskopie für drei Wochen verfolgt.
Autoklaven-, UV- und Trocknungsbehandlungen
Serum- und SF-Nanobakterien wurden in einem kleinen Volumen phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4 bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert. UV-Behandlungen wurden beiden Nanobakterien in PBS in einer laminaren Haube unter einer Philips 15 W UV-C Lampe für Zeiträume von 1 und 3 Stunden und über Nacht in Petrischalen mit entfernten Deckeln verabreicht. Die Distanz der Kulturen von der Lampe waren ungefähr 60 cm. Die Trockungsbehandlungen wurden durch Trocknen der Nanobakterien über Nacht bei Raumtemperatur oder durch Erhitzen für eine Stunde bei 100°C durchgeführt. SF-Nanobakterien wurden nur über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Die Mikrowellenbehandlung wurde so durchgeführt, daß die Proben zehnmal auf den Sidepunkt (100°C) in einem 1400 W Mikrowellenofen gebracht wurden.
Erhitzen der Nanobakterien
Der Effekt von Hitze auf das Überleben der Nanobakterien wurde bestimmt, indem die Nanobakterien als Pellets in PBS für 15 und 30 Minuten Temperaturen, die zwischen 60°C und 100°C variierten, ausgesetzt wurden. Die der Behandlung ausgesetzten SF-Nanobakterien wurden in DMEM-Medium kultiviert und das Wachstum wurde wie oben durch Lichtmikroskopie verfolgt. Das Wachstum der Serum-Nanobakterien wurde durch Lichtmikroskopie und Absorptionsmessung mit einem Spektrophotometer bei 650 nm verfolgt.
Antibiotika-Sensitivitätstest
Die Antibiotikasensitivität der Serum-Nanobakterien wurde mit einen Gemisch von Penicillin (β-Lactam) und Streptomycin (Aminoglycosid) (PS) bei 1x und 10x Konzentration (100 IU Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin = 1x), Kanamycin (Aminoglycosid) bei 1x und 10x Konzentration (100 μg/ml = 1x) und Gentamycin (Aminoglycosid) bei 1x Konzentration (100 μg/ml) getestet. Die 1x Konzentrationen waren jene, die für Zellkultur empfohlen werden. Nach 10 Tagen Kultur in 10% Serum-enthaltendem DMEM mit dem Antibiotikum wurde das Wachstum mit dem der Nanobakterienkulturen ohne vorhandenes Antibiotikum verglichen.
ERGEBNISSE
Chemische Desinfektion
Die SF-Nanobakterien zeigten eine weite Resistenz gegen die verwendeten Desinfektionsmittel. Nur Virkon war effektiv, SF-Nanobakterien nach dreißig Minuten zu töten. Salzsäurebehandlung löste die Apatitschicht der Nanobakterien, aber es wurde Remineralisierung nach Zusatz des Kulturmedium beobachtet. Die Guanidiniumhydrochlorid- und Buratonbehandlungen resultierten in einem Ablösen der SF-Nanobakterien, aber die Desinfektionseffizienz von Buraton war geringfügig geringer als die von Guanidiniumhydrochlorid. Die Ergebnisse der chemischen Behandlungen sind in Tabelle 2 gezeigt. Das Überleben wurde nach Subkultur durch Vergleich mit den Behandlungen mit nur Verdünnungsmittel bestimmt.
Tabelle 2. Resistenz von SF-Nanobakterien gegen chemische Desinfektionsmittel
Autoklaven-, UV- und Trocknungsbehandlungen
Trocknen bei einer Temperatur von 100°C tötete Serum-Nanobakterien, aber Trocknen bei Raumtemperatur tat dies nicht. Autoklavieren war nicht nachteilig für SF-Nanobakterien, aber es wurde eine merkliche Reduktion beim Überleben der Serum-Nanobakterien beobachtet. SF-Nanobakterien tolerierten UV-Licht mit keinem Effekt auf das Wachstum, aber Serum-Nanobakterien wurden signifikant inaktiviert. Nanobakterienproben trockneten während der UV-Behandlungen über Nacht und somit ergab sich ein zusätzlicher Stress für die Organismen. Trocknen hatte offensichtlich wenig oder keinen Effekt auf das Ergebnis, da das Überleben der Nanobakterien mit all den UV-Behandlungen ähnlich war. Wegen des Fehlens eines UV-Radiometers konnte keine UV-Dosierung berechnet werden, und es sollten genauere Tests mit Nanobakterien in Kulturmedium durchgeführt werden. Mikrowellenbehandlung war mehr eine Hitzeschockbehandlung als ein Sterilisationsschritt, wobei kurze Kochschritte völlig ineffektiv waren. Ergebnisse des Überlebens der Nanobakterien nach Autoklaven-, UV-, Mikrowellen- und Trocknungsbehandlungen sind in Tabelle 3 gezeigt. SF-Nanobakterien waren sehr viel resistenter als mit Serum kultivierte Nanobakterien. SF-Nanobakterien überlebten alle Testbedingungen ohne eine merkliche Reduktion in ihrer Lebensfähigkeit. Serum-Nanobakterien wurden durch Trocknen für eine Stunde bei 100°C getötet, und das Überleben war unter allen anderen Testbedingungen merklich reduziert.
Tabelle 3. Überleben von Nanobakterien nach Einwirken physikalischer Einflüsse
Hitzeresistenz von Nanobakterien
Nanobakterien sind sehr hitzeresistent. Fünfzehn Minuten Kochen war nicht genug, um Serum-Nanobakterien zu töten, aber dreißig Minuten inaktivierte sie. Wachstumskurven von Serum-Nanobakterien nach Hitzebehandlung sind in 5 gezeigt. Wichtigerweise war das Wachstum der Serum-Nanobakterien sehr ähnlich, ohne daß eine „lag"-Periode beobachtet werden konnte, sogar nach fünfzehn Minuten Kochen. Mikroskopische Beobachtungen der SF-Nanobakterienkulturen nach Hitzebehandlung zeigten, daß sie alle Testbedingungen einschließlich Kochen bei 100°C für 30 Minuten überlebten. Anfänglich wurde eine Reduktion in der Menge der lebenden SF-Nanobakterien bei den hohen Temperaturen beobachtet, aber nach zwei Wochen war kein Unterschied in den Testkulturergebnissen, verglichen mit denen der nicht-erhitzten Kontrollen, feststellbar.
Antibiotikaresistenz von Nanobakterien
Es wurde eine hohe Resistenz gegen die getesteten Antibiotika beobachtet. Es wurden zehnmal höhere Konzentrationen als die normalerweise in Zellkulturen verwendeten benötigt, um das Wachstum von Nanobakterien zu verhindern. 6 zeigt die Effekte von Antibiotika auf das Wachstum von Nanobakterien, die in serum-haltigem Medium kultiviert wurden. Interessanterweise gab es bei Konzentrationen von Antibiotika, die keinen Effekt auf das Wachstum hatten, einen deutlichen Effekt in der Morphologie der Nanobakterien, wie in SEM [=REM] (7A und 7B) gesehen werden kann. Dies legt nahe, daß Nanobakterien adaptive Wege haben, um sich selbst gegen schädliche Attacken zu schützen, z.B. durch Sekretieren von schleimigen Schichten.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Nanobakterien können harte Bedingungen extrem gut tolerieren. SF-Nanobakterien sind sehr viel resistenter als Nanobakterien, die in serum-haltigem Medium kultiviert wurden. Exteme in pH, oxidierende Mittel, freies Chlor und Chemikalien, die die Proteine beeinflussen, ebenso wie Bestrahlung, Hitze, Trocknen haben einen sehr kleinen Effekt auf SF-Nanobakterien. Dies zeigt an, daß die Mineralschicht dem Organismus einen Extraschutz verleiht. Außergewöhnliches Überleben der Nanobakterien wurde auch in Verbindung mit menschlichen Nierensteinen beobachtet. Lebende Nanobakterien wurden aus fast allen Nierensteinen durch Demineralisieren der Steine mit Salzsäure (siehe untern) gewonnen.
Ein effektiver Weg, um Nanobakterien mit desinfizierenden Chemikalien zu beseitigen, sollte einen Demineralisierungsschritt beinhalten. Apatit kann bei einem niedrigen pH oder mittels eines Calciumchelators, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), aufgelöst werden. Ein zweiter Schritt sollte dann das Töten des Organismus durch andere Mechanismen beinhalten. Virkon, das aus Peroxid-Verbindungen, Tensid, organischen Säuren und einem anorganischen Puffersystem zusammengesetzt ist, wurde als effektiv gegen Nanobakterien befunden, insbesondere wegen der Acidität (1% Lösung in Wasser hat pH 2,6) kombiniert mit anderen desinfizierenden Mechanismen.
Dosen von drei Megarad Gammabestrahlung werden benötigt, um die Zerstörung von Nanobakterien sicherzustellen. Gammabestrahlung ist wahrscheinlich die beste und am meisten zuverlässige Methode, um Nanobakterien zu töten. Trocknen bei erhöhten Temperaturen oder Kochen für einen ausgedehnten Zeitraum kann auch verwendet werden, um Nanobakterien zu beseitigen. Kochen für 30 Minuten ist am effektivsten gegen fast alle lebenden Organismen, außer solche mit Endosporen, insbesondere Sporen von Bacillus stearothermophilus und hyperthermische Archae, die 90°C oder mehr als optimale Wachstumstemperatur haben. Diese Behandlung ist auch nicht genug, um SF-Nanobakterien zu töten. Wichtigerweise war auch die normale Autoklavierprozedur (121°C für 20 min) nicht ausreichend, um Nanobakterien zu beseitigen.
Die Resistenz der Nanobakterien gegen die getesteten Antibiotika war sehr hoch. Zellkulturantibiotika, die in dieser Studie verwendet wurden, waren nur in hohen Konzentrationen effektiv. Ein möglicher Resistenzmechanismus ist die Produktion eines Schutzschleims, wie durch SEM gezeigt wurde. Modifikation der Zellwand ist eine gewöhnliche Strategie für viele Bakterien, um Resistenz gegen Antibiotika zu erwerben. Wenn ein Nanobakterium unvorteilhaften Bedingungen ausgesetzt ist, beginnt es Polymere zu sekretieren und bildet Mineral auf ihnen. Die getesteten Antibiotika waren hauptsächlich Aminoglykoside.
Die beobachtete Resistenz der Serum-Nanobakterien zeigt, daß sie zumindest so resistent sind wie Mycobacterien und Bacillus subtilis Sporen, welche die Modellorganismen für Desinfektionsresistenz sind. Die Resistenz von SF-Nanobakterien ist klar noch höher als diese.
Das Apatitmineral um den Organismus dient als ein erstes Abwehrschild gegen verschiedene Chemikalien und Bestrahlung. Das Überleben der Nanobakterien ist klar nicht nur aufgrund des Minerals, weil Behandlung mit 1 M Salzsäure die Nanobakterien nicht töten konnte und Remineralisierung später in der Kultur beobachtet werden konnte. Eine doppelte Verteidigung mit der Apatitschicht und der undurchlässigen Membran kombiniert mit einem sehr langsamen Metabolismus ist eine wahrscheinliche Erklärung für die beobachtete Resistenz der Nanobakterien. Die erhöhte Resistenz der SF-Nanobakterien ist wahrscheinlich aufgrund der ausgedehnten Mineralisierung, dem langsameren Metabolismus und der Anhaftung an Oberflächen. Die Resistenzmechanismen der Nanobakterien erscheinen multiplikativ: somit werden Nanobakterien mit einem Apatitüberzug, undurchlässiger Zellwand, langsamem Metabolismus und möglicherweise anderen noch unbekannten Mechanismen extrem resistent gegen die meisten Desinfektionsmethoden.
BEISPIEL 3: Durch Nanobakterien hervorgerufener Zahnstein
Der Zweck der in diesem Beispiel durchgeführten Experimente war zu erforschen, ob Nanobakterien bei der Zahnsteinbildung teilnehmen. Das Design der Studie war Nanobakterien auf einem gesunden Zahn ohne Zahnsteinbildung zu kultivieren und die Ergebnisse mit denen zu vergleichen, die mit einem Zahn mit Zahnsteinbildung erhalten worden waren. Mineralbildung wurde unter SEM beobachtet. Zusätzlich wurde ein epidemiologisches Screening auf eine mögliche Korrelation zwischen Zahnstein und Nierensteinerkrankung und andere Körpercalzifikationen unter Verwendung eines Fragenkatalogs bei 18 Patienten durchgeführt.
Korrelation zwischen Zahnstein und anderen Steinbildungen im Körper
18 Patienten wurden zufällig aus einer privaten Zahnarztpraxis in der Türkei ausgewählt, basierend auf ihren peridontalen Problemen, die durch starke Zahnsteinbildung hervorgerufen worden waren. Gesammelter Zahnstein wurde in PBS enthaltend 0,05% NaN₃ bei +4°C aufbewahrt. Die Proben wurden in 1N HCl für 10 Minuten bei Raumtemperatur demineralisiert, mit NaOH und Kaliumphosphatpuffer neutralisiert und unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Nanobakterien immungefärbt. Die Behandlung der Proben mit 1N HCl beeinflusste nicht die Epitope, die durch die in diesem Experiment verwendeten monoklonalen Antikörper erkannt wurden. Die Immunfärbung zeigte positive, kleine Kokken bei verschiedenen Konzentrationen in allen Proben. Die Spezifität der Färbung wurde weiter durch negative Färbeergebnissen mit drei verschiedenen monoklonalen Antikörpern, die nichtrelevante Antigene erkennen, überprüft.
Die aus dem Patientenfragebogen erhaltenen Ergebnisse zeigten eine hohe Inzidenz an Nierensteinen und Gallensteinen sowohl in den Patienten als auch ihren Eltern (Tabelle 4).
Tabelle 4. Vorhandensein von Kalzifikationen und Steinbildung in Patienten mit Zahnstein und bei ihren Eltern
Es gibt einen Anstieg bei der Steinbildung auf Zähnen unter Labortieren sobald gemeinsames Trinkwasser gegeben wurde, was nahelegt, daß die Flora von einem Tier zum anderen weitergegeben wird. Zusätzlich inhibiert Erythromycin die Steinbildung stark, während Chloramphenicol und Penicillin dies nicht tun. Dies legt nahe, daß die bei der Steinanhäufung beteiligten Organismen sehr spezifisch sind. Diese Befunde geben eine mögliche Erklärung für die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse, die eine hohe Inzidenz für Steinbildung und Calzifikation bei den Familienmitgliedern anzeigen.
Nanobakterien verursachen Zahnsteinbildung in vitro
In SEM-Beobachtungen eines Zahns mit Zahnstein (8A) wurden bei hoher Vergrößerung mineralisierte Fasern und zahlreiche kleine Kugelkörper nahe zu ihnen beobachtet (8B). Es wurden keine Kalkkörperchen bei den Kontrollzähnen beobachtet (8C und D).
Wenn die Erfinder einen gesunden Zahn einer SF-Nanobakterienkultur für einen Monat aussetzten, zeigte das SEM voluminöse Mineralbildung, die Zahnstein glich, auf der Oberfläche des Zahns (9A, B, D und E).
Die höhlenartige Struktur, die durch die großen Pfeile in 9 angezeigt wird, ist eine typische Struktur für SF-Nanobakterien (siehe oben). Es wird vorgeschlagen, daß die verschiedenen strukturellen Merkmale den verschiedenartigen Stadien der Mineralisierung von Zahnsteinen entsprechen.
Es gibt viele Ideen bezüglich des Grunds für Zahnsteinbildung, z.B. Diät und Alter. Tierexperimente haben gezeigt, daß der Zusatz von Ca und P zur Diät die Rate von Zahnsteinbildung erhöht. Die Erfinder haben gezeigt, daß Ca ein sehr notwendiges Element für die Produktion von Apatit durch Nanobakterien ist. Der Zusatz von sterilisierten Dolomitteilen zu der SF-Nanobakterienkultur vergrößert ihre Multiplikationsrate. SEM zeigte anhaftende sich auf der Dolomitoberfläche multiplizierende SF-Nanobakterien (10).
Chemische Zusammensetzung von Zahnsteinen
Die Merkmale von Kristallbestandteilen von menschlichen Zahnsteinen wurden dem molaren Ca/P-Verhältnis zugeschrieben: i) Calzifierte Formen von Mikroorganismen einschließlich Kokken und Stäbchen mit einem Ca/P-Verhältnis nahe an 1,7, carbonisiertes Hydroxyapatit, ii) Calcophoritische Calzifikationen und dichte Calzifikationen mit einem Ca/P-Verhältnis nahe 1,7, carbonisiertes Hydroxyapatit; iii) aggregierte Platten oder Cluster von Plättchen und flügelähnliche Aggregationen mit einem Ca/P-Verhältnis nahe 1,33; Octocalciumphosphat; iv) würfelförmige Formen variierender Größen mit einem Ca/P-Verhältnis nahe 1,4; Whitlockit. Die Konzentrationen einiger anderer Elemente in Zahnsteinen ist sehr viel geringer als die von Ca und P (0,88% F; 0,75% Na; 0,51% Mg). Die anderen analysierten Bestandteile (K, Cl, Mn, Zn, Fe) sind in Spurenkonzentrationen anwesend.
In Übereinstimmung mit dem Ziel dieser Studie wurden die EDX-Ergebnisse, wie in 11 zu sehen ist, passend gemacht, um den Zusammenhang zwischen Morphologie, chemischer Zusammensetzung des in Zahnstein enthaltenden Materials und Nanobakterien zu klären. Früher haben die Erfinder mit EDX und chemischer Analyse herausgefunden, daß alle Wachstumsphasen von Nanobakterien biogenen Apatit auf ihrer Zellhülle produzieren. Fourier-transformierte IR-Spektroskopie zeigte, daß das Mineral Carbonatapatit war.
Schlussfolgerung
Diese Daten zeigen, daß Zahnsteine mit Apatit-bildenden Nanobakterien assoziiert sind.
BEISPIEL 4: Steinbildung und Calzifikation durch Nanobakterien im menschlichen Körper
In diesen Experimenten stellen die Erfinder weitere Beweise dafür bereit, daß Nanobakterien als Kristallisationszentren (nidi) für die Bildung von biogenen Apatitstrukturen im Säugetierkörper und in Umweltquellen wirken.
Calzifikationen, die durch Nanobakterien in einem Zellkulturmodell verursacht werden Nanobakterien sind in vitro und in vivo toxisch. 3T6 fibroblastoide Zellen, die für 48 Stunden mit Nanobakterien (kultiviert in serumfreien Bedingungen, SF-Nanobakterien) zeigten eine geänderte Zellmorphologie aufgrund der aufgenommen SF-Nanobakterien (12A und B). Von-Kossa-Färbung zeigte intra- und extrazelluläre Calzifikation in den infizierten Zellen (12C). Heftig infizierte Zellen zeigten nukleäre Abnormalitäten, z.B. Makronukleus. Es gab keine Calzifikationen und nukleären Abnormalitäten in den Kontrollzellen, die mit der von-Kossa-Methode angefärbt worden waren (12D).
Nanobakterien und Nierensteine
Die kristallinen Bestandteile von Blasentraktsteinen sind von fünf Arten: Calciumoxalat, Calciumphosphat, Bakterien-verwandt, Purine oder Cystin. Die Mehrzahl von Blasensteinen sind ein Gemisch von zwei oder mehr Bestandteilen, wobei das hauptsächliche Gemisch Calciumoxalat mit Apatit ist. Die Lebensfähigkeit und die Lokalisation der Bakterien innerhalb der Infektionssteine (Struvit [MgNH₄PO × 6 H₂O] und/oder Carbonatapatit [Ca₁₀ (PO₄)₆CO₃] Steine) wurden untersucht. Es wurde gefunden, daß eine große Anzahl von bakteriellen Vertiefungen und Körpern in den Zwischenräumen existieren, die von Kristallen von Apatit und Struvit aus den Kernen zu den peripheren Schichten hin umgeben werden. Die Anwesenheit von bakteriellen Kolonien sogar im Kernteil der Steine legt nahe, daß die Bakterien bei der Steinbildung ebenso wie beim Wachstum der Infektionssteine teilnehmen. Bei der Arbeit der Erfinder wurden Bakterien ähnlicher Größe und Morphologie (13A und C) als Nanobakterien (13B und D) mit TEM in menschlichen Nierensteinen gefunden.
Die Erfinder screenten 60 menschliche Nierensteine unter Verwendung von Immunfluoreszenzfärbung und Kulturmethoden auf Nanobakterien. Nanobakterien zeigen eine dicke Apatit-Hüllschicht auf ihrer Oberfläche im TEM (14A). Demineralisierung unter harten Bedingungen (z.B. Inkubation mit 1 N HCl) beeinflusste ihre Epitope, die von den in diesem Experimenten verwendeten monoklonalen Antikörpern erkannt werden, nicht. Nanobakterien-spezifische monoklonale Antikörper zeigten positive, kleine Kokken in verschiedenen Konzentrationen in allen demineralisierten Steinproben (14C–E) und Nanobakterien (14B). Verschiedene Verteilungsmuster von Nanobakterien wurden in den Steinen beobachtet, z.B. zentrale und/oder periphere Lokalisation (14E) in den kleinen Steineinheiten oder zufällige Verteilung (14D). Die Spezifität der Färbung wurde weiter überprüft mit negativen Färberesultaten mit vier verschiedenen monoklonalen Antikörpern, die nichtrelevante Antigene detektieren.
Die demineralisierten, gescreenten Nierensteinproben wurden durch einen 0,2 μm Filter sterilfiltriert und unter Kulturbedingungen für Nanobakterien für 3 Wochen wie oben beschrieben kultiviert. Gamma-bestrahltes Serum mit einer 10%igen Konzentration wurde als ein Kulturzusatz verwendet. In jedem Experiment wurde nur gamma-bestrahlte Serumkultur als Negativkontrolle verwendet und es wurde kein Wachstum beobachtet.
Interessanterweise entdeckten die Erfinder in 90% der Steinproben trotz dem harten Demineralisierungschritt Wachstum von Nanobakterien. Zusätzlich wurden die Steine bei Raumtemperatur für mehr als einen Monat aufbewahrt bevor sie gescreent wurden. Die demineralisierten Kontroll-Nanobakterien, d.h die Positivkontrollen, vermehrten sich gut (15A und B). Nukleinsäurefärbung unter Verwendung von Hoechst (#33258)-Färbung zeigte, daß keine andere Art von bakteriellem Wachstum in den Kulturen vorhanden war. Als weiteren Beweis wurden 3T6-Zellen mit Nanobakterien, die aus Steinproben kultiviert worden waren, infiziert und mit monoklonalen Antikörpern gegen Nanobakterien angefärbt. Fünf verschiedene Arten von Nanobakterien-Zell-Interaktionen wurden beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Schlussfolgerungen
Nanobakterien sind neu aufkommende Pathogene und könnten mit kleinen mineralbildenden Bakterien verwandt sein, die in Sedimentsteinen gefunden werden, was die Medizin mit der Geologie verbindet. Sie produzieren biogenen Apatit in vitro und scheinen es auch in vivo zu tun. Da Apatit als Hauptherd angesehen wird, der die Bildung der meisten Nierensteine auslöst, scheinen Nanobakterien exzellente Kandidaten zur Triggerung dieses Prozesses zu sein. Es wurde gezeigt, daß Nanobakterien, die in den Blutkreislauf von Labortieren injiziert wurden, durch Nierensteine penetrieren und in den Urin übergehen. Im Urin wird die Apatitbildung durch Nanobakterien weiter vergrößert. Andere Mineralien können danach an diesen Herd binden.
BEISPIEL 5: Behandlung eines menschlichen Patienten, der mit Nanobakterien infiziert ist.
Die Erfinder haben jetzt eine 35 Jahre alte finnische Frau behandelt, die unter chronischem Ermüdungssyndrom durch nanobakterielle Infektion litt. Die Patientin war Nanobakterien-Positiv in drei Urin- und Blutproben, die gesammelt wurden, bevor die Tetracyclintherapie begonnen wurde. Sie erhielt 500 mg Tetracyclin-HCl 4 mal pro Tag über ein Monat, gefolgt von 500 mg zweimal am Tag über 5 Monate. Die Patientin war Nanobakterien-Negativ nach einmonatiger Therapie. Ihr Zustand verbesserte sich gleichzeitig und sie blieb negativ in monatlichen Proben.
BEISPIEL 6: Empfindlichkeit von Nanobakterien für Antibiotika
Antibiotika-Empfindlichkeitstests wurden durchgeführt durch Messen der minimalen Inhibierungskonzentration (MIC), eine allgemeine Praxis in der klinischen Mikrobiologie.
Methoden
Die Tests wurden durchgeführt in 96-Mikrotiterplatten. DMEM (kommerzielles Kulturmedium) enthaltend 10% gamma-bestrahltes fötales Rinderserum (FBS) (Dosis etwa 3 Mrds; diese Behandlung inaktiviert Nanobakterien im Serum, so dass das Basismedium steril ist) wurde als das Basismedium verwendet. Diese Komponenten sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Gibco. Die antibiotischen Stammlösungen wurden dann seriell verdünnt (in das Basalkulturmedium), um schließlich eine Startkonzentration von 0.5 mg/ml und 1:2 Verdünnungen davon, falls nicht anders angegeben, bereitzustellen. Für jedes Antibiotikum wurden drei parallele Tests, die alle Antibiotikaverdünnungen verwendeten, und zusätzliche negative und positive Kontrollexperimente durchgeführt. Positive Kontrollen hatten Nanobakterien ohne Antibiotikazugabe, während negative Kontrollen nur das Basismedium enthielten. Nanobakterien wurden von FBS kultiviert, einem humanen Serum von einem Patienten, der eine polycystische Nierenkrankheit (PKD) hatte, und von humanen Nierensteinen, wie in unserer früheren Arbeit beschrieben (Kajander and Ciftcioglu, PNAS 95: 8274–8279, 1998). 100 μl von Verdünnungen des Nanobakterium-Inokulums wurden allen Mikrotiterplatten zugegeben, ausgenommen die negativen Kontrollen. Die Platten wurden unter tierischen Zellkulturbedingungen inkubiert (37° Celsius, 5% Stickstoffdioxid, 95% Luftfeuchtigkeit). Die Absorptionswerte bei 650 nm wurden durch Verwendung eines ELISA-Lesers zu Beginn, und nach 4, 8, 12, 14 Tagen aufgezeichnet. Endgültige MIC-Werte (50% und 90% Inhibierung) wurden am 12. Tag berechnet. Die Berechnungen wurden basiert auf den Absorptionskurven, wobei die Absorption gegen die Konzentration des Antibiotikums gezeichnet wurde.
Ergebnisse
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5. Zusammenfassung der MIC 50 und MIC 90 Werte von ausgewählten Antibiotika (mg/l):
Wie in den in der Tabelle 5 gezeigten Ergebnissen gesehen werden kann, war die Trimethoprim-Sulphamethaxazol-Kombination nicht so effektiv wie Trimethoprim alleine (24). Das war irgendwie überraschend angesichts der Tatsache, dass diese Kombination breit in der Behandlung von Harnwegsinfektionen angewandt wird. Trimethoprim ist hocheffektiv, war aber nur in den in vitro Tests bakteriostatisch (16). Trimethoprim ist ein sehr potentielles, antinanobakterielles Medikament für humane und tierische Therapie.
Tetracyclin ist hoch effektiv und war bakterizid in den in vitro Tests (17, 25). Nierensteinpatienten behandelt mit 4 × 500 mg/Tag, die ursprünglich Nanobakterien-positive Urinkulturresultate hatten, begannen negative Urinkulturresultate während der Behandlung zu bekommen. Das zeigt, dass Tetracyclin-Behandlung effektiv in menschlichen und tierischen Behandlungen zur Beseitigung von Nanobakterien sein kann. Wie zuvor bemerkt, ist Tetracyclin gebunden und konzentriert an der Mineraloberfläche der Nanobakterien. Das kann erklären, warum Tetracyclin einen bakteriziden Effekt auf Nanobakterien hat. Dieser bakteriozide Effekt ist einzigartig bei Nanobakterien: andere Bakterien zeigen nur einen bakteriostatischen Effekt. Tetracycline sind deshalb potentielle Medikamente zum Eliminieren von Nanobakterien von Zellkulturen und biologischen Produkten. Weil das Medikament an Nanobakterien gebunden ist, haben sogar kurze Expositionszeiten einen substantiellen antinanobakteriellen Effekt.
Nitrofurantoin ist hoch effektiv, aber war bakteriostatisch in vitro (18). Diese Verbindung wird nur für Harnwegsinfektionen verwendet, da es rasch in das Urin eliminiert wird. Zusätzlich zu humanen und tierischen antinanobakteriellen Therapien kann Nitrofurantoin nützlich für die Eliminierung oder Reduzierung von Nanobakterien in Zellkulturen und biologischen Flüssigkeiten und Produkten sein.
Doxycyclin, das auch eine Tetracyclinverbindung ist, war effektiv zur Inhibierung des nanobakteriellen Wachstums (19). Diese Verbindung war nicht stabil unter den Testbedingungen. MIC Werte berechnet aus den 8 Tage Ergebnissen zeigten Effektivität bei etwa 1 mg pro Liter. Daher wäre Doxycyclin ein guter Kandidat für humane und tierische Therapien. Es sollte bemerkt werden, dass Tetracycline in der Therapie von pathologischen Kalzifizierungen und Autoimmunkrankheiten oft mit bemerkenswert guten Ergebnissen verwendet wurden.
Die Aminoglycosidantibiotika Gentamycin, Neomycin, Kanmycin (20–22), und Streptamycin zeigen alle antinanobakterielle, bakteriostatische Effekte bei hohen Antibiotikakonzentrationen. Solche Konzentrationen sind in lokalen Medikamentenformulierungen vorhanden, wie Hautcreme, Salbe, Pflaster oder Waschlösungen und in Ohren- sowie Augentropfen. Deren antinanobakterieller Effekt bietet eine neue Erklärung für die bekannte Effektivität von Gentamycin und Streptamycin in der Behandlung von Innenohr-Problemen, die pathologische Kalzifikation einschließen, wie Menier's Krankheit.
Vancomycin ist ein effektives Bakteriostatikum gegen Nanobakterien bei relativ hohen Konzentrationen (23). Solche Konzentrationen können in lokalen Therapien mit diesem Medikament vorhanden sein. Vancomycin wird nicht vom Gastrointestinaltrakt oder anderen mukosischen Oberflächen absorbiert, aber kann zur Behandlung von mukosalen, bakteriellen Befall verwendet werden. Daher kann Vancomycin effektiv in der Ausrottung von gastrointestinalen Nanobakterien oder in anderen lokalen Anwendungen sein.
Ampicillin ist ein Antibiotikum der Penicillingruppe mit weitem Wirkungsspektrum. Ampicillin zeigt einen schwachen bakteriostatischen Effekt auf Nanobakterien (26). Da Ampicillin und verwandte Medikamente in sehr hohen Dosen verabreicht werden und im Urin auf Niveaus konzentriert werden, die die beobachteten MIC Werte überschreiten, können sie nützlich in der Behandlung von nanobakteriellen Infektionen des Harnwegs sein.
Andere getestete Antibiotika ergaben MIC Werte, die 500 mg pro Liter überschritten. Diese Antibiotika sind deshalb wahrscheinlich nicht effektiv für die Ausrottung von Nanobakterien, wenn sie in einer Einzel-Therapeutikum Therapie verwendet werden, obwohl sie effektiv im Zusammenhang mit anderen Antibiotika in einer Multi-Therapeutika Behandlung effektiv eingesetzt werden könnten.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, sind Bisphosphonate, wie beispielsweise Chlodronat und Ethidronat, extrem effektive antinanobakterielle Agenzien, die einen bakteriziden Effekt ausüben auf Nanobakterien bei Konzentrationen, die viel kleiner sind als die bei mit dem Medikament behandelten Patienten gefunden wurden. Das ist eine neue Erkenntnis in der Mikrobiologie, da diese Medikamente nicht für antibakterielle Therapien verwendet wurden. Diese Medikamente sind in medizinischer Verwendung wegen ihrer Effekte auf Knochenresorption in Krebs oder Osteoporose. Kürzliche Veröffentlichungen deuten an, dass Bisphosphonate pathologische Calcifizierung reduzieren können, eine gegenteilige Reaktion zu ihrer anerkannten Verwendung in Atherosklerose. Atheriosklerose schließt Calcifizierung ein, deren Natur nicht verstanden wurde. Wir vermuten, dass Atheriosklerose teilweise eine infektiöse Krankheit sein könnte, die Nanobakterien als Co-Pathogene mit Chlamydia pneumoniae oder anderen Agenzien inkludiert, einschließlich lokalen, viralen Infektionen.
Tabelle 6. Zusammenfassung von MIC 50 und MIC 90 Werten für ausgewählte Ca-Chelatoren und andere Verbindungen:
Bisphosphonate können für die Eliminierung von Nanobakterien in Zellkulturen, biologischen Flüssigkeiten und Produkten verwendet werden. Sie sind konzentriert auf dem nanobakteriellen Apatit und töten die Nanobakterien relativ schnell, sogar nach einer einzigen Exposition. Daher sind sie nützlich in industrieller, nanobakterieller Elimination, beispielsweise von FBS. FBS oder andere Seren können bei niedrigen Niveaus, z.B., Mikrogramm bis Gramm pro Liter, eines Bisphosphonats exponiert werden, das Nanobakterien inaktivieren und deren Vervielfältigung verhindern wird, wenn das Serum für industrielle oder Forschungszwecke verwendet wird (z.B. in Gewebe- oder Zellkultur). Ein ähnlicher Ansatz kann zur Behandlung von humanen Blut- und Blutprodukten, Impfstoffen, Zellkultur-Produkten und biotechnologischen Produkten verwendet werden. Die Behandlungszeit kann von Minuten zu Tagen und Behandlungstemperatur von 0–100° Celsius sein. Die Behandlung kann in Lösungen mit einem pH 3–10 ausgeführt werden. Das Medikament ist harmlos zu Menschen und Tieren bei niedrigen Niveaus. Falls notwendig, kann das Medikament vom Serum oder Produkt nach der Exposition entfernt werden, z.B. durch Verwendung von Dialyse, oder reduzieren zu niedrigen Niveaus durch Absorption auf mineralischen Calciumphosphat Oberflächen (Apatit und andere Calciummineralien sind geeignet), z.B. durch Verwendung von Apatitfilter oder -partikel. Da Bisphosphonate ausgeschieden und in Urin hoch konzentriert werden, sind sie sehr potente Medikamente zur Behandlung nanobakterieller Krankheiten, wie Nierensteine.
Citrat ist ein effektives antinanobakterielles Agens bei Konzentrationen, die bei oralen oder intravenösen oder lokalen Behandlungen in Menschen oder Tieren erreicht werden können. Citrat chelatiert Calcium. Calcium ist ein Schlüsselelement für nanobakterielle Zellwandintegrität. Ähnlich sind andere kurzkettige, organische Säuren schwache Calcium-Chelatoren und können nützlich in der nanobakteriellen Ausrottung sein. Solche Säuren schließen ein Milchsäure, Essigsäure und natürliche Produkte enthaltend Säuren, wie z.B. Preiselbeersaft. Letzterer wurde verwendet zur Behandlung von Infektionen des Urinaltrakts. Jedoch scheint der Mechanismus der Wirkung gegen Nanobakterien die Schwächung der Apatitzellwand zu sein, während Preiselbeersaft die Adhäsion von gewöhnlichen Bakterien im Harnweg verhindern. Ähnliche Versuche mit Citrat zur Behandlung von Nierensteinen wurden durchgeführt, da Citrat das freie Calcium reduziert. Jedoch haben die Erfinder entdeckt, dass diese Säuren einen antinanobakteriellen Effekt ausüben (27). Am wichtigsten, Citrat ist viel effektiver als starke Säuren, z.B. HCl, zum Töten von Nanobakterien. Andere kurzkettige, organische Säuren wurden später getestet: Essigsäure, Milchsäure und Ascorbinsäure zeigten alle einen inhibitorischen Effekt auf Nanobakterien in Kulturtests. Deren MIC 50 Werte waren 10–50 mM, das auf ein Potential für antinanobakterielle Therapie hinweist.
EDTA und EGTA sind Calcium-Chelatoren, die antinanobakterielle Effekte ausüben (28). Sie können in der Patientenbehandlung wie dargestellt bei der Verwendung in divalenten Kationen eingesetzt werden, z.B. Blei, Vergiftung. Ferner können solche Agenzien in Medikamenten und biotechnologischen Präparationen verwendet werden, um nanobakterielles Wachstum zu vermeiden oder dieses zu inaktivieren.
Vitamin K ist toxisch für Nanobakterien bei Konzentrationen, die nicht schädlich für Säugerzellen sind. Die Verbindung wird von Apatit absorbiert und deshalb von Nanobakterien konzentriert. Vitamin K kann als antinanobakterielles Agens in der Behandlung von Serum oder biotechnologischen Produkten verwendet werden. Nach der Behandlung können überschüssige Mengen durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln oder lipophilen Filtern, hydrophober Chromatographie oder Affinitätschromatographie-Techniken, die Vitamin K bindende Affinitätsmatrizen verwenden oder ähnlichen Methoden, entfernt werden.
Vitamin D modifiziert den Calciummetabolismus und hat einen sehr schwachen inhibitorischen Effekt auf Nanobakterien.
Acetylsalicylsäure ist strukturell ziemlich ähnlich zur Para-Amino Salicylsäure, die als Antituberkuloseagens verwendet wird. Diese Verbindungen beeinflussen die Zellwand oder andere Ziele in Nanobakterien. Der Effekt ist schwach, aber solche Agenzien können in hohen Konzentrationen verwendet werden, die sie zu potentiellen Medikamenten gegen Nanobakterien machen. Wichtig ist, dass die in der Tuberkulosebehandlung verwendete Para-Aminosalicylsäure einen ähnlichen Effekt gezeigt hat: ihr MIC Wert war identisch mit dem der Acetylsalicylsäure. Das könnte für andere entzündungshemmende Medikamente mit einem kurzkettigen Säureanteil gelten.
Zahnsteine enthalten mineralischen Apatit in einer Biomatrix. Wir haben gezeigt, dass Nanobakterien in humanen Zahnstein gefunden werden und, dass Nanobakterien auf menschlichen Zähnen wachsen und identische Steine produzieren wie die natürlichen Zahnsteine. Es wurde gefunden, dass Fluoride nanobakterielle Steinbildung auf menschlichen Zähnen in einem in vitro Model, das eine in Zahnpasta typische Fluoridkonzentration verwendet, inhibieren.
Nanobakterien absorbieren also einige Schwermetalle. Nanobakterien können gut mit Silber oder Kupferverbindungen gefärbt werden. Darüberhinaus verhinderten Silber- und Kupferionen, die einem nanobakteriellen Kulurmedium auf submillimolarem Niveau zugegeben wurden, nanobakterielles Wachstum. Silber- und Kupferteile oder -überzüge auf Oberflächen, wie Katheder oder Stents, können einen antinanobakteriellen Effekt durch Verhinderung der nanobakteriellen Biofilmbildung bewirken. In in vitro Tests bildeten Nanobakterien heftig Biofilm auf zwei verschiedenen kommerziellen Stents, die aus einem kunststoffartigen Material gefertigt waren. Diese Biofilmbildung wurde durch die Zugabe von Silber- und Kupfersalzen zum Kulturmedium verhindert.
Medikamentenkombinationen
Das potenteste Antibiotikum, Tetracyclin, wurde in Kombination mit dem potentesten nicht-antibiotischen Medikament, Ethidronat, getestet. Es wurde gefunden, dass Kombinationen dieser Medikamente bei Konzentrationen, die bei Einzelanwendung nicht effektiv sind, einen deutlichen antinanobakteriellen Effekt. Der MIC 90 Wert war etwa 0.1 mg pro Liter für die Kombination, wobei individuelle Verbindungen wesentlich höhere MIC Werte hatten. Deshalb war ein synergistischer Effekt gegenwärtig. So ein Effekt kann für das Design von Medikamentenkombinationen für einen antinanobakteriellen Effekt sein. Insbesondere, ist die Therapie mit der Kombination eines Antibiotikums zusammen mit einem Bisphosphonats, eines Calcium Chelators, einer schwachen Säure (wie Zitronen-, Milch- oder Essigsäure), oder einem entzündungshemmenden sauren Medikaments (wie Aspirin) nützlich in der Behandlung einer nanobakteriellen Infektion, insbesondere pathologischer Kalzifikation und Steinen, wie Nierensteine und Speichelsteine. Zur Behandlung von Nanobakterien in Zahnstein können Fluoride in der Kombination enthalten sein. Die Medikamente können in der Form von Zahnpasta, Mundspülung oder als Zahnhaftbeschichtung verabreicht werden.
BEISPIEL 6: Empfindlichkeit von Nanobakterien für Ultraschall
Die Ausrottung von Nanobakterien in Lösungen wurde getestet durch die Verwendung von Ultraschall mit einem B.Braun Labsonic 2000 Ultraschallgerät. Die Probe, nanobakteriell-kontaminierte, kommerzielles FBS (fötales Rinderserum), wurde einem Ultraschall bei voller Leistung in 100 ml Proben unter Verwendung eines runden, konischen Containers (175 ml Nominalvolumen, Nalgene Cat. No 3143) unterzogen. Das Verfahren folgte den Herstellerinstruktionen des Ultraschallgeräts. Der Ultraschallsender wurde ausgewählt, um Hochleistungsultraschall zu produzieren, und wurde 1 cm oberhalb des Bodens des Röhrchens eingeführt. Ultraschall wurde mit 1 min Pulsen mit 1 min Pausen auf einem Eisbad, um die Erwärmung der Probe zu vermeiden, gegeben. Die echten Ultraschallzeiten waren 0, 1, 2, 3, 5, und 10 min. Danach wurden die Proben nanobakteriellen Standardkulturbedingungen unterzogen. Proben von 5 und 10 min Ultraschall ergaben keine kultivierbaren Organismen.
Während die Erfindung hierin beschrieben und illustriert wurde durch Verweis auf verschiedenes, spezifisches Material, Verfahren und Beispiele, ist es zu verstehen, dass die Erfindung nicht eingeschränkt ist auf spezielles Material, Materialkombinationen, und Verfahren ausgewählt für diesen Zweck. Vielzählige Variationen von solchen Details können vorausgesetzt werden und von Fachleuten verstanden werden.

Claims

Verfahren zur Desinfektion von mit Nanobakterien kontaminierten Gegenständen umfassend: (a) Aussetzen der Nanobakterien einer desinfizierenden Mischung, wobei die desinfizierende Mischung ist (a1) eine 1%-ige Mischung von 50%-igem Kaliumpersulfat und 5%-iger Sulfaminsäure in destillierten Wasser, oder (a2) eine 3%-ige Mischung von 4.5%-igem Formaldehyd, 6.8%-igen Glyoxal, 1.5%-iger Glyoxylsäure, und 6%-igem Dimethylaurylbenzyl-Ammoniumchlorid, oder (b) Demineralisieren der Nanobakterien, und dann Aussetzen des Gegenstands einer desinfizierenden Chemikalie; oder (c) Demineralisieren der Nanobakterien, und dann Autoklavieren des Gegenstandes bei einer Temperatur von zumindest 121 °C für zumindest 20 Minuten; oder (d) Demineralisieren der Nanobakterien, und dann Aussetzen des Gegenstandes einer ultravioletten Strahlung durch Aussetzen des Gegenstandes einer UV-C Lampe von zumindest 15 W in einem Abstand von 60 cm oder weniger für zumindest 1 Stunde; oder (e) Demineralisieren der Nanobakterien, und dann Erhitzen des Gegenstandes für zumindest 15 Minuten bei einer Temperatur von zumindest 60°C.
Verfahren nach Anspruch 1 (b), (c), (d) oder (e), wobei die Demineralisierung durch Aussetzen des Artikels einer Mischung mit niedrigem pH erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mischung mit niedrigem pH eine starke Säure ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die starke Säure Salzsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1 (b), (c), (d) oder (e), wobei die Demineralisierung erreicht wird durch Aussetzen des Gegenstandes einer effektiven Menge eines Calciumchelators oder einer organischen Säure von niedrigem, molekularem Gewicht, die Calcium bindet oder chelatiert, wobei die Säure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zitronensäure, Essigsäure, Milchsäure, Ascorbinsäure, Salicylsäure und ihre Acetyl- und Aminoacetylderivate.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Calciumchelator EDTA ist.
Verfahren nach Anspruch 1 (b), wobei die desinfizierende Chemikalie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethanol, Glutaraldehyd, Formaldehyd, Hypochlorit, Wasserstoffperoxid, Salzsäure, Natriumhydroxid, SDS, Tween 80, Triton-X-100, Guanidium-Hydrochlorid, Harnstoff, Virkon^®, Erifenol^®, Klorilli^®, Buraton^®, und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die desinfizierende Chemikalie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethanol (zumindest eine 70%-ige Lösung) Glutaraldehyd (zumindest eine 2%-ige Lösung) Formaldehyd (zumindest eine 4%-ige Lösung) Hypochlorit (zumindest eine 0.5%-ige Lösung) Wasserstoffperoxid (zumindest eine 3%-ige Lösung) Salzsäure (zumindest eine 1M Lösung) Natriumhydroxid (zumindest eine 1M Lösung) Natrium-Dodecyl-Sulfat (zumindest eine 1%-ige Lösung) Tween 80 (zumindest eine 1%-ige Lösung) Triton X-100 (zumindest eine 1%-ige Lösung) Guanidium-Hydrochlorid (zumindest eine 3M Lösung): Harnstoff (zumindest eine 3M Lösung); Virkon® (zumindest eine 1%-ige Lösung); Erifenol® (zumindest eine 1,5%-ige Lösung); Klorilli® (zumindest eine 1%-ige Lösung); Buraton^® (zumindest eine 3%-ige Lösung): und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 1 (b), weiter umfassend das Autoklavieren des Gegenstandes bei einer Temperatur von zumindest 121 °C für zumindest 20 Minuten.
Verfahren nach Anspruch 1 (b), ferner umfassend das Aussetzen des Gegenstandes einer ultravioletten Strahlung durch Aussetzen des Gegenstandes einer UV-C Lampe von zumindest 15 W in einer Distanz von 60 cm oder weniger für zumindest 1 Stunde.
Verfahren nach Anspruch 1 (e), wobei das Heizen für zumindest 30 Minuten bei einer Temperatur von zumindest 100°C erfolgt.
Verwendung eines Antibiotikums ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus β-Lactam-Antibiotika, Tetracyclin-Antibiotika, und pharmazeutisch geeignete Salze davon, und Mischungen davon, in einer ausreichenden Menge, um das Wachstum von Nanobakterien zu inhibieren oder zu verhindern, zur Herstellung einer antinanobakteriellen Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung von Calcifizierungen, die durch Nanobakterien in vivo in einem Patienten, der eine solche Prävention oder Behandlung braucht, verursacht werden.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die β-Lactam-Antibiotika ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Penicillin, Phenethicillin, Ampicillin, Azlocillin, Bacmpicillin, Carbenicillin, Cyclacillin, Mezlocillin, Piperacillin, Epicillin, Hetacillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Methicillin, Nafcillin, Oxacillin, und pharmazeutisch geeignete Salze davon.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Tetracyclin-Antibiotika ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Tetracyclin, Chlortetracyclin, Demeclocyclin, Doxycyclin, Methacyclin, Oxytetracyclin, Rolitetracyclin, Minocyclin, Sancyclin, und pharmazeutisch geeignete Salze davon.
Verwendung eines Antibiotikums ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus β-Lactam-Antibiotika, Aminoglycosid-Antibiotika, Tetracyclin-Antibiotika, pharmazeutisch geeigneter Salze davon, und Mischungen davon, in einer ausreichenden Menge zur Inhibierung oder Prävention des Wachstums von Nanobakterien zur Herstellung einer antinanobakteriellen Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung von Calcifizierungen verursacht durch Nanobakterien in vivo in einem Patienten, der eine solche Prävention oder Behandlung braucht, wobei das Antibiotikum zusammen mit einer Citratverbindung verabreicht wird.
Verwendung eines Bisphosphonats in einer ausreichenden Menge zur Inhibierung oder Verhinderung des Wachstums von Nanobakterien zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung von Calcifizierungen verursacht durch Nanobakterien in vivo in einem Patienten, der eine solche Verhinderung oder Behandlung braucht.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Bisphosphonat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alendronsäure, Etidronsäure, Clodronsäure, Oxidronsäure und pharmazeutisch geeignete Salze davon.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Bisphosponate mit einer Dosis von ungefähr 5–20 mg/kg/Tag verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Bisphosphonate zusammen mit einem Antibiotikum verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Antibiotikum ein Tetracyclin-Antibiotikum ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetracyclin, Chlortetracyclin, Demeclocylin, Doxycyclin, Methacyclin, Oxytetracyclin, Rolitetracyclin, Minocyclin, Sancyclin und pharmazeutisch geeignete Salze davon.
Verwendung eines wie in Anspruch 12 definierten Antibiotikums in einer effektiven Menge, um das Wachstum von Nanobakterien zu inhibieren oder zu verhindern, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung der durch Nanobakterien verursachten Entstehung von Nierensteinen in einem Patienten, der zuvor unter Nierensteinen gelitten hat.
Verfahren zur Ausrottung von Nanobakterien in flüssigen Materialien, umfassend das Beschallen der Flüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Flüssigkeit während dem Beschallen gekühlt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Flüssigkeit für zumindest etwa fünf Minuten beschallt wird.