KR20010085283A - 나노박테리아 박멸 방법 - Google Patents

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Abstract

나노박테리아는 인간 및 동물의 체내 병리학적 석회화에 기여한다. 여기에는 신장 결석, 침샘 결석, 치수 결석 및 죽상경화증 같은 질병이 포함된다. 본 발명은 나노박테리아로 오염된 물품을 멸균하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 나노박테리아에 감염된 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 항생제, 비스포스포네이트, 또는 칼슘 킬레이트화제를 단독으로 또는 조합하여 나노박테리아의 성장 및 발달을 억제 또는 예방하기에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 신장 결석을 앓았던 환자에서 신장 결석의 재발을 방지하는 방법을 제공한다.

Description

나노박테리아 박멸 방법 {Methods For Eradication Of Nanobacteria}
거대 분자 세포외 기질내에 뚜렷이 구별되고 조직화된 결정 구조가 형성되는 것은 일반적으로 생무기질화(biomineralization)라고 칭하는 널리 퍼져 있는 생물학적 현상이다. 포유 동물의 뼈 및 치아 에나멜은 인회석 무기질이 관계하는 생무기질화의 일례들이다. 환경적 인회석 결석은 뼈 및 상아질과 거의 동일한 화학적 조성을 갖는다. 최근에, 박테리아가 수성 침전물에서 무기질이 형성되는 생화학적 순환의 인자로 암시되었다. 해양 침전물내 현생 자생 인산염 무기질의 주성분은 카보네이트 (히드록시)플루오르인회석 Ca10(PO4)6-x(CO3)x(F,OH)2+x이다. 미생물은 인회석을 해수에서의 열역학적 평형 밖에 배치할 수 있다. 미생물은 Mg로부터 Ca를 분리시키고, pH<8.5 및 [Mg]:[Ca]>0.1의 조건하에서 특이적인 올리고펩티드에 의해 카보네이트 인회석을 활발히 핵생성시킨다. 그러한 조건은 인체에 존재할 수도 있다.
나노박테리아는 자기 복제 생명체의 이론적 한계에 접근하여 크기가 보통 박테리아의 백분의 일 밖에 안된다. 나노박테리아는 포유류의 혈액 및 혈액 생성물로부터 분리될 수 있다(카잔데르(Kajander)의 미국 특허 제 5,135,851호 참조; 이 내용을 본원에 참고로 인용한다). 에너지 분산성 X-선 미량 분석 및 화학적 분석 결과는 나노박테리아가 세포외막 위에 생체 인회석을 생성한다는 것을 보여준다. 인회석의 두께는 주로 나노박테리아의 배양 조건에 좌우된다. 나노박테리아는 포유류 혈액 및 혈액 생성물로부터 분리되는, 세포벽이 있는 것 중 가장 작은, 인회석 형성 박테리아이다. 그 작은 크기(0.05-0.5㎛), 및 독특한 특성으로 인해 통상의 미생물학적 방법으로는 이들을 찾아내기가 어렵다. 나노박테리아에 감염된 포유류 세포에서, 전자 현미경 결과는 세포내 및 세포외 뾰족한 결정 침착물을 보여주는데, 이 침착물은 폰 코사(von Kossa) 염색법에 의해 염색할 수 있고 병리학적 석회화에서 발견되는 석회소구를 닮았다.
본 발명자들은 인간 및 소 혈액에서 생체외 및 생체내 세포 독성이 있는 나노박테리아를 발견하였다. 이를 접근 번호 5819-5821로 DSM(독일 브라운슈바이크 소재)에 기탁하였다. 인간 및 소의 나노박테리아는 유사하게 성장하고, 표면 항원이 동일하다는 점 및 다른 특별한 특징들을 함께 한다. 둘다 카보네이트 인회석도 생성한다. 나노박테리아는 보통의 미생물학적 방법으로는 찾아내기 어려운 특이한 특성을 갖고 있다. 전형적으로 직경이 0.2-0.5 ㎛이지만, 투과 전자 현미경(TEM)을 이용하여 관찰되는 바와 같이 아주 작은 형태(0.05-0.2 ㎛)로도 존재할 수 있다. 따라서, 나노박테리아는 0.1 ㎛ 필터를 그럭저럭 통과한다. 나노박테리아는 분단이 잘 안되고, 염색할 수 있고, 고정할 수 있으며, 열에 특히 저항력이 있다.나노박테리아의 배가 시간은 약 3일이다. γ선 또는 아미노글리코사이드 항생제를 많이 투여하면 번식을 방지하였다. 16S rRNA 유전자 배열(EMBL X98418 및 X98419)에 따르면, 나노박테리아는 프로테오박테리아의 α-2 서브그룹에 들어가며, 프로테오박테리아에는 브루셀라(Brucella) 및 바토넬라(Bartonella) 종도 포함된다. 후자 속(genera)에는 인간 및 동물 병원체가 포함되며 이들은 나노박테리아와의 유사성을 공유하는데, 예를 들면, 동일한 항원 및 세포 변성 효과 중 일부가 있다.
생명에 필요한 영양소에 대한 경쟁은 자연 환경에서 엄청나게 일어나고 있으며 따라서 불리한 조건에 영리하게 적응하고 생존해 나가는 전략이 필요하다. 박테리아는 포자, 포낭 및 생물막을 형성할 수 있으며, 이들은 박테리아가 불리한 기간에 살아남을 수 있도록 도와 준다. 그러한 형태를 한 박테리아는 훨씬 더 느린 대사 기능을 갖지만, 영양 세포는 물질 대사도 늦출 수 있다. 생물막내의 또는 포자로서의 박테리아의 저항력이 증가하는 것은 대사 속도가 더 늦기 때문만은 아니다. 유기체 주위의 불투과성 구조는 잠재적으로 해로운 화합물들이 들어오는 것을 막는 기계적 방어벽 역할을 한다. 박테리아의 생존에 도움이 되는 몇가지 추가의 메카니즘도 알려져 있다. 박테리아 포자의 열 저항력은 세 가지 주요 인자 때문이며, 이것은 원형질체 탈수, 석회화 및 열적 적응이다. 방사선 저항력은 보통 정교한 DNA 복구 시스템과 관련이 있다. 대사 속도 및 번식을 최소화하는 것이 박테리아의 생존에 주요한 필수 조건임이 분명하며, 이는 DNA 및 다른 손상된 세포 성분을 복구하는데 시간을 주기 때문이다. 아주 느린 물질 대사, 및 생물막을 형성하는 능력은 나노박테리아의 특징이기도 하다. 미세한 크기 때문에, 나노박테리아에핵산 복구를 위한 복잡한 시스템이 존재할 가능성은 아주 적어 보인다. 감마선 저항력이 관찰되는 것은 나노박테리아의 아주 작은 크기, 및 핵산 구조의 특이성으로 설명이 가능할 수 있다.
인회석은 신장 결석의 형성에 중요한 역할을 할 수 있다. 요로 결석의 결정 성분은 옥살산칼슘, 인산칼슘, 스트루바이트, 퓨린, 또는 시스틴이다. 요로 결석의 대부분은 둘 이상 성분의 혼합물이고, 주요 혼합물은 옥살산칼슘 및 인회석이다. 게다가, 발효기 모델 연구는 인산 칼슘 병소가 항상 초기에 형성되고 이어서 옥살산칼슘 또는 다른 성분으로 도포될 수 있다는 것을 보여준다. 요로 감염은 스트루바이트 및 카보네이트 인회석을 형성시키고 신장 결석의 일반적인 원인이 된다. 통상적인 요법은 보통 단기간의 항균 요법과 함께 결석을 외과적으로 제거하는 것으로 이루어졌다. 그러한 치료는 약 50%의 경우에 치료 효과가 있다. 재발성 결석 형성 및 진행성 신우신염이 치료가 되지 않은 환자들에게 발생한다. 이 질병으로부터 초래되는 이환 및 댓가는 상당하다.
카보네이트 인회석의 조직 석회화는 실제로 다른 질병에서 흔하다. 예를 들면, 죽상경화 플라크는 인산칼슘을 축적시킨다. 면역학적 분석 및 면역조직화학적 염색에 의해 인간 대동맥 표본에서의 죽상경화 플라크 중 25%가 나노박테리아를 함유하는 것이 발견되었다. 혈액 투석 환자의 경우 광범위한 전이성 및 종양성 석회화가 발전될 수 있다. 급성 관절주위염은 건내 석회화에 관련된 인회석 관절병증이다. 또한 인회석 결정이 윤활 공간 속으로 주입되면 염증을 일으킨다. 여러 종류의 암에서도 조직 석회화가 발견된다.
치수 결석 또는 소치는 인간 치아의 치수 결합 조직에서 때때로 발견되는 다양한 크기의 무기질화된 다형성체이다. 이들은 노화 또는 치수의 병리학과 종종 관련이 되었지만, 그 병원학은 아직 불분명한 상태이다. 이들은 또한 오랫동안 병리학 없이 매복된 영구치에도 존재할 수 있다. 치수 결석이 형태학적으로 광범위하게 연구되어 왔지만, 그 기원은 여전히 불분명하고 그 화학적 조성에 대해서 거의 알려진 것이 없다. 치수 석회화의 조직화학적 연구는 유기 기질이 세망 결합 조직 섬유, 및 당단백질과 산 다당류를 함유하는 무형질로 구성되어 있음을 보여준다. 치수 석회화의 무기질상은 X-선 에너지 분산성 분광법 및 화학적 분석으로 연구되었으며, 칼슘염이 인회석 형태(인회석을 함유하는 카보네이트 형태일 수도 있음)로 침착된다는 것을 입증하였다. 사실, 치아와 소치의 화학적 구조 사이에는 큰 차이가 없다. 신체내 뼈 및 치아의 형성은 메카니즘이 유사하고, 미해결 문제가 많이 남아있다. (치아 및 뼈를 제외한) 신체내 인회석 형성을 병적 생무기질화(pathologic biomineralization)라고 부르며, 예를 들면, 치수 결석, 신장 결석, 및 관절 석회화가 있다.
연반증은 원인이 알려지지 않은 희귀한 만성 염증성 질병이지만, 박테리아 인자가 강하게 암시되었다. 이 질병은 치명적일 수 있다. 이 질병은 인회석으로 구성된 마이클-구트만체(Michaelis-Gutmann bodies)라고 칭하는, 폰 쿠사 염색 양성의, 석회화된 적층형 또는 표적 모양의 물체가 특징이다. 이 석회소구의 구조는 석회화된 나노박테리아를 많이 닮았다.
조직 석회화는 난소 장액 종양, 자궁내막의 유듀상선암종, 유방 암종, 갑상선의 유두상암종, 십이지장 암종 종양, 및 두개인두종 같은 여러 질병에서 발견된다. 많은 악성 종양에서, 바늘 모양의 결정이 상피 세포에서 발견된다. 이 종류의 석회화를 찾아내기 위해서 전자 현미경을 사용할 필요가 있는데, 이는 결정이 너무 작아서 광학 현미경으로는 볼 수 없고 그 기원이 알려져 있지 않기 때문이다. 많은 악성 세포는 나노박테리아 부착을 위한 수용체를 갖고 있다. 이들은 종양 속으로 나노박테리아를 도입할 수 있고 이어서 석회화가 진행된다. 게다가, 예를 들면, 인산칼슘 축적이 있는 것으로 알려진 죽상 경화 플라크에서, 염증성 자극하의 일부 분할 세포는 부착을 위한 수용체를 가질 수 있다. 이러한 질병에서, 전자 탐침 분석 결과는 무기질 침착물의 표면 및 내부가 동일한 화학적 조성을 갖는다는 것을 보여주었지만, SEM에 의하면 나노박테리아를 닮은 구형 입자 및 섬유와 같이 상이한 종류의 구조체를 보여주었다. 유사하게, 급성 관절주위염은 관절내에 수산화인회석이 존재하는 것과 관련되었다.
알쯔하이머 플라크는 항나노박테리아 다중클론성 항체로 표지될 수 있다. 이 다중클론성 항체는 일부 자가항체를 함유하고, 본 발명자들은 또한 나노박테리아 면역법에서 일부 단일클론성 자가항체도 얻었다. 느린 박테리아 감염이 자가면역 질병에서 역할을 하는 것으로 제안되었다. 조직 석회화가 이러한 질병에 존재하는 경우가 종종 있다. 나노박테리아는 느리게 성장하는 유기체의 새로운 일례이며, 장기간 동안 사람을 감염시킨다. 인회석 구조 및 이상 핵산이 이 감염에 대한 면역 반응에서 비정상의 원인이 될 수 있다.
생체 인회석 핵생성, 결정 성장 및 형태의 몇가지 점이 생체내에서 및 생체외에서 결정되었다. 하지만, 많은 세부 사항들은 해결되지 않은 상태로 남아있으며, 이에는 초기 침착 단계의 특이한 성질, 이온성 불순물이 결정 격자 속으로 혼입되는 것을 조절하는 메카니즘 및 인자, 무기질화된 조직(뼈, 상아질)에서의 결정 미세 구조 및 형태의 상세 내용, 및 무기 성분과 복잡한 콜라겐 기재 기질의 관계가 포함된다. 많은 질병에서 인산칼슘이 침착되는 것 이면에 숨은 이유는 이론적인 것으로 남아 있다. 미토콘드리아에서 칼슘이 축적되는 것(이는 아마도 에너지 생성을 위한 잔여 기질에 좌우되는 듯 함)이 석회화를 일으키는 것으로 알려졌다. 회전타원체 형태(미세한 피브릴 및 과립 형태일 수도 있음)를 한 무정형 인산칼슘도 인회석으로 변형됨으로써 석회화에 역할을 하는 것으로 보인다.
발명의 요약
본 발명은 나노박테리아로 오염된 물품을 멸균하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 그러한 방법은 환자 치료 및 진단에 사용되는 의료 장비 및 용액을 소독 및(또는) 멸균하는데 특히 유용할 것이다.
본 발명은 또한 나노박테리아 감염을 예방하고 나노박테리아에 감염된 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 나노박테리아의 성장 및 발달을 억제 또는 예방하는데 효과적인 양의 항생제를 투여하는 단계를 포함하는, 신장 결석을 앓았던 환자에게 신장 결석이 재발하는 것을 예방하는 방법을 제공한다.
이후에 명백해질 본 발명의 전술한 목적 및 다른 목적, 잇점 및 특징과 함께, 본 발명의 성질이 본 발명의 바람직한 실시태양에 대한 하기의 상세한 설명 및 첨부한 청구항을 참고로 보다 더 분명히 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 나노박테리아에 감염된 물품의 소독 방법, 및 나노박테리아에 감염된 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
도 1. 나노박테리아의 광학 현미경과 전자 현미경 이미지 및 에너지 분산성 X-선 미량 분석법(EDX)에 의한 분석 결과. (A) 2개월의 배양 기간 후 바닥에 붙은 나노박테리아의 미분 간섭 콘트라스트 이미지. (B) 수정된 훽스트(Hoechst) 방법에 의한 동일한 영역(x1600)의 DNA 염색. (C) 태아 소 혈청으로부터 직접 분리한 나노박테리아의 음성 염색(막대 = 200 nm). (D) 가변성 크기를 보여주는 SEM 현미경 사진(막대 = 1 ㎛). (E) '털이 많은' 인회석층으로 덮인 분할 나노박테리아(막대 = 100 nm). (F) 3개월의 배양 기간 후 인회석층에 묻힌 나노박테리아의 TEM 현미경 사진(막대 = 1 ㎛). (G) 보다 높은 배율로 찍은 것(막대 = 200 nm). F에서의 흰색 중앙 영역은 절단시 무기층이 손실된데 따른 인공산물이다. (H) 에너지 분산성 X-선 미량 분석. 나노박테리아의 SEM에서 Ca 및 P 피크가 수산화인회석(I)에 유사한 것을 보여준다.
도 2. 나노박테리아의 결석성 콜로니, 및 수산화인회석과의 비교. (A) 10 cm 평판내 변형된 뢰플러(Loeffler) 매질 위의 콜로니. 콜로니가 매질 속으로 침투하여 결석성 필러를 형성하였다. 화살표는 B(x40)에 나타낸 전형적인 회갈색 콜로니를 보여준다. (C) TEM에 의해 나타낸, 필러내 바늘 모양의 결정 침착물(막대 = 200 nm). (D) 참조 인회석 결정의 TEM 이미지(막대 = 100 nm).
도 3. SF 조건하에서 배양된 나노박테리아, 및 세포와 이들의 상호 작용. (A) 광학 현미경 사진, (B) 수정된 훽스트 염색 방법에 의한 동일한 영역의 DNA 염색. (C) 공통 인회석 쉘터(shelter) 내부의 나노박테리아 미분 간섭 콘트라스트 이미지, 및 (D) 부분적으로 탈염된 나노박테리아 그룹(A-D, x860). (E 및 F) 배양 용기에서 떼어낸 나노박테리아 서식지의 SEM 현미경 사진(막대 = 1 ㎛). (G) 3T6 세포에서 세포내이입된 무기질화된 나노박테리아(흰색 화살표)의 IIFS. (H) 표준 훽스트 방법에 의한 동일한 영역의 DNA 염색(x540). (I-L) SF-나노박테리아에 의해 유발된 3T6 세포에서의 세포내 석회화의 TEM 현미경 사진(막대, I 및 K = 2 ㎛, J = 500 nm, L = 200 nm).
도 4. 나노박테리아에 의한 세포외 및 세포내 석회화의 예. (A) 태아 소 혈청으로부터 배양된 나노박테리아의 TEM 현미경 사진(막대 = 20 nm), 및 (B) 탈염 후 신장 결석에서의 박테리아. (C) 항-나노박테리아 mAb가 있는 동일한 신장 결석의 IIFS. (D 및 E) SF-나노박테리아에 24 시간 동안 노출된 3T6 세포의 폰 코사 염색 결과, 및 (F) 음성 대조(x270)
도 5. 혈청 나노박테리아의 성장에 대한 열의 영향을 보여주는 그래프. PBS에서 나노박테리아를 열에 노출시키고 16일 동안 배양하였다. 30분만 끓여도 나노박테리아가 비활성화되었다. 지수적 성장이 모든 다른 처리에서 관찰되었다. 10%의 감마 조사된 혈청을 함유하는 매질(음성 대조)은 아무런 성장을 보이지 않았다.
도 6. 나노박테리아 성장에 대한 항생제의 영향을 나타내는 그래프. 항생제 없이 배양한 나노박테리아의 성장과 비교하였다. 세포 배양에서의 사용에 권장되는 양보다 10배 높은 항생제 투여량이 나노박테리아 성장을 방지하는데 필요하였다.
도 7. 항생제가 있는 경우와 없는 경우에 10%의 소 태아 혈청을 함유하는 매질에서 한달 동안 배양한 나노박테리아의 SEM 이미지. 막대 = 1 ㎛. (A) 항생제 없이 배양한 나노박테리아. (B) 100 ㎍/㎖의 젠타마이신으로 배양한 나노박테리아. 화살표는 형태의 변화를 나타낸다.
도 8. 치석이 있는 경우(A 및 B)와 없는 경우(C 및 D)에 치아의 SEM 이미지. (A)에 나타낸 치아는 치주 문제 때문에 빼낸 것이고, 심각한 치수 결석 형성에 의해 골탈착이 발생하였다. 화살표로 나타낸 영역을 더 크게 확대한 것은 원형 및 섬유상의 석회화를 나타낸다(B). (C)에 나타낸 치아는 치과 교정 문제 때문에 빼낸 것이다. 이 치아를 오토클레이빙시키고 세포 배양 조건에서 한달 동안 DMEM 배양액에 노출시켰다. 표면에 아무런 결정화도 관찰되지 않았다. (D)는 (C)에서 화살표로 표시한 영역을 더 크게 확대한 것이다. 동일한 치아의 수직으로 잘린 다른 반쪽은 도 9에 기술된 실험에 사용되었다.
도 9. 오토클레이빙, 및 세포 배양 조건에서 한달 동안 SF-나노박테리아로 배양시킨 후, 도 8C 및 D에 나타낸 건강한 치아의 SEM 현미경 사진. (A) 치아의 표면을 나타내는 전체적 이미지. 화살표로 나타낸 영역을 더 크게 확대한 것은 (B)에 나타내었다. (C) 3달 동안 배양시킨 후, 세포 배양 용기에 부착된 나노박테리아; 막대 = 1 ㎛. (D) 한달 동안의 SF-나노박테리아 노출 후 나타난 다량의 치수 결석을 갖는 동일한 치아내 영역. (E) (D)에 큰 화살표로 나타낸 동일한 영역을 더 크게 확대한 것. 작은 화살표는 치석 표면 위에 SF-나노박테리아가 성장하는 것을 보여준다.
도 10. 배양액 중 돌로마이트 조각 위에서 성장하는 SF-나노박테리아의 SEM 이미지.
도 11. 인간 치석(O) 및 SF-나노박테리아(B)의 에너지 분산성 X-선 미량 분석.
도 12. SF-나노박테리아와 섬유모세포(3T6 세포)의 상호 작용. (A) 섬유모세포에 의해 세포내이입된 SF-나노박테리아(화살표 머리는 액포 내부의 나노박테리아를 나타낸다), (B) 세포내이입된 SF-나노박테리아의 바늘 모양 인회석 구조를 보여주는 고배율 확대, (C) 나노박테리아 감염된 섬유모세포의 폰 코사 염색 결과, 및 (D) 음성 대조. (C 및 D)의 배율은 270x이다. (C)에서의 화살표는 병리학에서 사용되는 표준 석회화 탐지법인 폰 코사 방법으로 염색한 후의 염색된 나노박테리아를 나타낸다.
도 13. 카보네이트 인회석 인간 신장 결석 및 나노박테리아의 TEM 현미경 사진. (A) 탈염 전의 신장 결석, (B) 한달 동안 배양된 SF-나노박테리아, (C) 탈염 후 동일한 신장 결석, (D) 혈청 함유 매질에서 두달 동안 배양된 나노박테리아. 신장 결석 (C)는 실온에서 10분 동안 1N HCl에서 분쇄된 결석을 배양함으로써 탈염시키고, NaOH 및 인산칼륨 완충액으로 중화한 후, 에폰(epon)을 심었다. 나노박테리아(B 및 D)의 두 배양물 모두 배양 용기의 바닥에 부착되었다.
도 14. 상이한 종류의 신장 결석(C-E)에서 탈염된 나노박테리아 및 면역형광의 TEM(A) 및 FITC 이미지(B). 신장 결석 및 나노박테리아는 도 13에 기술된 바와 같이 샘플을 탈염시킨 후 특이적인 항-나노박테리아 단일클론 항체를 이용하여염색하였다. 두꺼운 화살표는 면역형광-양성인 개별 코코이드 (coccoid) 입자를 나타낸다. 결석을 구성하는 작은 유닛 표면 위의 면역 양성은 작은 화살표로 나타내었다. 배율: (B-D) 1600x; (E) 640x.
도 15. 탈염, 중화 및 멸균 여과된 20개의 상이한 인간 신장 결석, 및 나노박테리아의 계대 배양에서 나노박테리아의 성장을 보여주는 그래프. *은 첫 6일 후 아무런 성장이 없음을 보여준다.
도 16. 최소 억제 농도(MIC)로 나타낸, 12일 후 나노박테리아에 대한 트리메토프림의 영향.
도 17. 최소 억제 농도(MIC)로 나타낸, 12일 후 나노박테리아에 대한 테트라사이클린의 영향.
도 18. 최소 억제 농도(MIC)로 나타낸, 12일 후 나노박테리아에 대한 니트로푸란토인의 영향.
도 19. 최소 억제 농도(MIC)로 나타낸, 12일 후 나노박테리아에 대한 독시사이클린의 영향.
도 20. 최소 억제 농도(MIC)로 나타낸, 12일 후 나노박테리아에 대한 젠타마이신의 영향.
도 21. 최소 억제 농도(MIC)로 나타낸, 12일 후 나노박테리아에 대한 네오마이신의 영향.
도 22. 최소 억제 농도(MIC)로 나타낸, 12일 후 나노박테리아에 대한 카나마이신의 영향.
도 23. 최소 억제 농도(MIC)로 나타낸, 12일 후 나노박테리아에 대한 반코마이신의 영향.
도 24. 4 ㎍/㎖의 테트라사이클린, 트리메토프림, 트리메토프림+술파메탁사졸, 니트로푸란토인, 독시사이클린, 및 양성 및 음성 대조의 항생 효과의 시간 추이.
도 25. 인간 나노박테리아에 대한 테트라사이클린의 영향. 테트라사이클린은 소의 나노박테리아 표준 균주와 비교하여 인간 나노박테리아 분리균에 유사하게 효과적이다.
도 26. 암피실린에 대한 투여량/반응 및 시간 추이.
도 27. 시트르산염에 대한 투여량/반응 및 시간 추이.
도 28. EDTA에 대한 투여량/반응 및 시간 추이.
본 발명자들은 놀랍게도 무기질이 유기체의 생존 전략에 필수적인 세포벽의 일부를 구성하는 제 1 무기질 도포된 유기체를 발견하였다. 나노박테리아에서 이 무기질은 카보네이트 인회석이다. 결과적으로, 본 발명자들은 인회석을 표적으로 한 임의의 치료제가 항나노박테리아 치료에 유용할 수 있다는 것을 발견하였다.
보다 구체적으로, 본 발명은 나노박테리아로 오염된 물품을 소독하는 방법에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여 사용된 바와 같이, 소독할 물품은 멸균을 원하는 임의의 물품이며, 이에는 의료 기기, 외과 도구, 및 바늘, 주사기, 튜빙 등을 포함하는 의료 및 외과 공급물이 포함된다. 또한 본 발명의 범위에는 의학적 치료용, 및 약물 제제용 용액이 포함되며, 이에는 살균수, 식염수, 링거액 및 다른 용액이 포함된다. 의학적 치료 또는 진단용의 임의의 제제(인간 또는 동물을 포함하는 환자에게 투여하기 위한 임의의 약제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않음)를 포함하여 임의 형태의 혼합물, 예를 들면, 용액 또는 현탁액을 상기 방법에 의하여 멸균시킬 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 나노박테리아를 소독액에 노출시키는 단계를 포함하는, 나노박테리아로 오염된 물품을 소독하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 소독 혼합물은 물, 바람직하게는 증류수 중의 과황산칼륨 및 술파미노산의 혼합물이 바람직하다. 상기 혼합물은 용액, 현탁액 등일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 혼합물은 약 35% 내지 약 70%의 과황산칼륨 및 약 1% 내지 약 15%의 술파미노산의 용액일 것이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 혼합물은 약 50%의 과황산칼륨 및 약 5%의 술파미노산일 것이다. 이 혼합물은 최고 농도로 사용할 수도 있고, 또는 생리학적 조건에서 사용하도록 희석시킬 수 있는데, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 10%의 농도, 가장 바람직하게는 약 1%의 농도이다.
다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 소독 혼합물은 물, 바람직하게는 증류수 중의 포름알데히드, 글리옥살, 글리옥실산, 및 염화디메틸라우릴벤질-암모늄의 혼합물이다. 상기 혼합물은 용액, 현탁액 등일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 혼합물은 약 1% 내지 약 10%의 포름알데히드, 약 5 내지 약 10%의 글리옥살, 약 0.1% 내지 약 5%의 글리옥실산, 및 약 3% 내지 약 12%의 염화디메틸라우릴벤질-암모늄의 용액일 것이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 혼합물은 약 4.5%의포름알데히드, 약 6.8%의 글리옥살, 약 1.5%의 글리옥실산, 및 약 6%의 염화디메틸라우릴벤질-암모늄일 것이다. 이 혼합물은 최고 농도로 사용될 수도 있고, 또는 생리학적 조건에서 사용하도록 희석시킬 수 있는데, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 10%의 농도, 가장 바람직하게는 약 3%의 농도이다.
다르게는, 나노박테리아를 탈염시킨 후 소독 약품에 노출시킴으로써 물품에서 오염을 제거할 수 있다. 탈염은 나노박테리아를 낮은 pH에 노출시킴으로써, 바람직하게는 강산으로, 바람직하게는 염산으로 달성될 수 있다. 다르게는, 탈염은 칼슘 킬레이트제에 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 킬레이트제에는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산, 및 시트르산염 화합물이 포함된다. 탈염과 관련하여, 넓은 범위의 소독 약품 중 임의의 것을 적당히 사용할 수 있다. 탈염과 관련하여 사용되는 특히 바람직한 소독 혼합물은 하기 항목 중 하나 이상을 포함한다:
약제 허용가능한 농도 바람직한 농도
에탄올 >50% >70%
글루타르알데히드 >0.1% >2%
포름알데히드 >1% >4%
하이포아염소산염 >0.1% >0.5%
과산화수소 >0.1% >3%
염산 >0.1M >1M
수산화나트륨 >0.1M >1M
도데실황산나트륨(SDS) >0.1% >1%
Tween 80 >0.1% >1%
Triton X-100 >0.1% >1%
구아니듐 HCl >1M >3M
우레아 >1M >3M
Virkon >0.1% >1%
Erifenol >0.1% >1.5%
Klorilli >0.1% >1%
Buraton >0.1% >3%
탈염에 이어서, 소독액 사용에 대한 대안으로서, 또는 소독액 사용에 부가하여, 임의적으로 물품을 오토클레이빙시킬 수 있는데, 바람직하게는 121℃ 이상의 온도에서, 바람직하게는 20 분 이상 동안 한다.
다르게는, 탈염에 이어서, 소독액 사용에 대한 대안으로서, 또는 소독액 사용에 부가하여, 물품을 자외선에 노출시킬 수 있는데, 예를 들면, 약 60 cm 이하의 거리에서 약 1 시간 이상 동안, 바람직하게는 약 3 시간 이상 동안, 더욱 바람직하게는, 적어도 밤새동안, 약 15W 이상의 UV-C 램프에 물품을 노출시킨다. 다르게는, 약 3 메가래드 이상의 감마선에 물품을 노출시킬 수 있다.
또한 초음파 처리를 이용함으로써 액체로부터 나노박테리아를 박멸시킬 수 있다. 임의의 통상적인 초음파 처리기를 이용할 수 있다; 초음파 처리 시간은 초음파 처리기의 출력 및 소독할 액체의 부피와 특성에 따라 변할 것이다. 적합한 초음파 처리 시간은 지나친 실험을 할 필요없이 당해 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자가 용이하게 결정할 수 있다. 전형적으로, 5-10 분 동안 샘플을 초음파 처리하면 대부분의 용액으로부터 나노박테리아를 박멸시키는데 충분할 것이다. 초음파 출력 및 샘플 용기가 서로 적합한 비율을 갖는다면 임의의 샘플 스케일에 초음파 처리를 적용할 수 있다. 고출력 초음파 공급원의 경우 연속 흐름 적용도 가능하다. 상기 방법은 임의의 용액 처리에 적용할 수 있다. 연속적으로(예를 들면, 소독할 용액을 넣는 용기를 냉수조에 둠으로써) 또는 주기적으로 초음파 처리 중간에 용액을 냉각시킴으로써(예를 들면, 소독할 용액을 넣는 용기를 빙조 속에 둠으로써) 용액을 냉각하여 과도한 가열을 방지하면 샘플의 단백질 및 다른 세포 구성 성분에 순할 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 약 100℃ 이상의 온도에서 약 1 시간 이상 동안 가열함으로써 소독할 물품을 건조시켜 나노박테리아를 파괴한다. 다르게는, 상술한 바와 같은 탈염에 이어서, 약 60℃ 이상, 바람직하게는 약 100℃ 이상의 온도로 약 15 분 이상, 바람직하게는 약 30 분 이상 동안 물품을 가열할 수 있다.
본 발명은 나노박테리아가 없도록 제형된 조직 배양액을 추가로 제공한다. 상기 나노박테리아가 없는 조직 배양액은 β-락탐 항생제, 아미노글리코사이드 항생제, 테트라사이클린 항생제, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 나노박테리아 항생 효과가 있는 양의 하나 이상의 항생제를 추가로 포함하는, 기술자들이 구할 수 있는 임의의 표준 조직 배양액일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 β-락탐 항생제에는 페니실린, 페네티실린, 암피실린, 아즐로실린, 배큼피실린, 카베니실린, 실클라실린, 메즐로실린, 피페라실린, 에피실린, 헤타실린, 클록사실린, 디클록사실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 및 이들의 염이 포함되지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기에 적합한 아미노글리코사이드 항생제에는 스트렙토마이신, 카나마이신, 젠타마이신, 아미카신, 네오마이신, 파도마이신, 토브라마이신, 비오마이신, 및 이들의 염이 포함되지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 적합한 테트라사이클린에는 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린, 옥시테트라사이클린, 롤리테트라사이클린, 미노사이클린, 산사이클린, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염이 포함된다. 추가로, 사용하기 전에, 본 발명에 따른 배양액을 상기한 방법들 중 하나에 따라 멸균하는 것이 바람직하다. 통상의 기술자는 특정 배양액에 가장 적합한 멸균 방법을 선택할 수 있다.
본 발명은 또한 생체내에서, 즉 치료가 필요한 환자에서, 나노박테리아 성장을 억제 또는 예방하기에 효과적인 양의 항생제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 생체내 석회화 발달 방지 방법을 제공한다. 본 발명과 관련하여, 생체내 석회화에는 신장 결석, 죽상경화증, 급성 관절주위염, 치수 결석 또는 소치, 연반증, 알쯔하이머병, 피부경화증을 포함하는 자가면역 질병, 및 혈액 투석 환자 및 저항성 칼슘 형성에서 발견되는 전이성 및 종양성 석회화, 난소 장액 종양, 자궁내막의 유두상선암종, 유방 암종, 갑상선의 유두상암종, 십이지장 암종 종양, 및 두개인두종을 포함하는 악성 종양이 포함되지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 본 발명과 관련하여, "환자"는 임의의 포유류, 바람직하게는 조직 석회화, 특히 상기한 질병들 중 하나와 관련된 조직 석회화를 앓고 있는 인간이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 β-락탐 항생제, 아미노글리코사이드 항생제, 테트라사이클린 항생제, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 나노박테리아 항생 효과가 있는 양의 하나 이상의 항생제를 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 환자에서 생체내 석회화 발달을 방지하는 방법을 제공한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 β-락탐 항생제에는 페니실린, 페네티실린, 암피실린, 아즐로실린, 배큼피실린, 카베니실린, 실클라실린, 메즐로실린, 피페라실린, 에피실린, 헤타실린, 클록사실린, 디클록사실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염이 포함되지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기에 적합한 아미노글리코사이드 항생제에는 스트렙토마이신, 카나마이신, 젠타마이신, 아미카신, 네오마이신, 파도마이신, 토브라마이신, 비오마이신, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염이 포함되지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 적합한 테트라사이클린에는 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린, 옥시테트라사이클린, 롤리테트라사이클린, 미노사이클린, 산사이클린, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염이 포함된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 항생제를 시트르산염 화합물과 함께 공동 투여한다.
다른 실시태양에서, 비타민 K 및(또는) 그 유사체를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 비타민 K 유사체에는 메나디온, 피토나디온(비타민 K1), 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염이 포함되지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용할 경우, 비타민 K를 1 ㎍/㎖ 이상의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
추가의 실시태양에서, p-아미노 살리실산 뿐만 아니라 다른 살리실산 유도체도 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 아세틸살리실산(즉, 아스피린)이 특히 바람직하다.
추가의 실시태양에서, 비스포스포네이트를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 하나의 군으로서, 비포스네이트는 골흡수를 억제하는 능력이 약리학적으로 특징인 반면, 약동학적으로는, 흡수, 분포, 및 제거에 있어서의 유사성에 의해 분류된다.
비록 모든 비스포스포네이트가 유사한 물리화학적 특성을 갖지만, 이들의 항흡수 활성은 상이하다. 아미노기가 지방족 탄소쇄내에 함유될 때 활성이 극적으로 증가한다. 예를 들면, 아미노비스포스포네이트인 알레드로네이트는 생체외 및 생체내 모두 에티드로네이트보다 약 700 배 더 효과가 있다. 일반적으로, 비스포스포네이트는 친유성이 불량한 결과로 위장관으로부터 흡수가 잘 안된다. 생체외 및 생체내 연구는 비스포스포네이트가 파라셀룰라 트랜스포트(paracellular transport)를 통해 위장관으로부터 흡수된다는 것을 보여주었다. 조직적으로 입수가능한 비스포스포네이트는 혈장으로부터 매우 빨리 흡수되며, 부분적으로는 뼈에 의해 흡수되고 부분적으로는 신장에 의해 배설된다. 전체적인 혈장 제거에 대한 이 두 과정의 상대적인 기여도는 비스포스포네이트 사이에 상이하다. 지금까지, 연구된 모든 비스포스포네이트는 아무런 대사 작용의 증거를 보여주지 않는다. 신장 배설이 유일한 제거 경로이다. 래트에서의 알레드로네이트 연구는 음이온 또는 양이온 신장 전달계에 의해서가 아니라 특성화되지 않은 신장 전달계에 의해 약물이 활성적으로 분비된다는 것을 보여준다.
비스포스포네이트는 무기 파이로포스페이트의 P-O-P 결합 대신에 P-C-P 결합을 갖고 있으며, 이로 인해 효소 분해에 저항성을 갖게 되고 수산화인회석에 높은 친화성을 갖는다. 비스포스포네이트는 파골성 골흡수의 유력한 방어제이며 골흡수증가와 관련한 대사성 뼈 질병을 치료하는데 성공적으로 사용되었다. 탄소 원자상의 수소를 치환시킴으로써 다양한 비스포스포네이트를 합성할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 비스포스포네이트는 알렌드론산, 에티드론산, 클로드론산, 옥시드론산, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염이 포함되지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하는 경우, 하루에 약 5-20 mg/kg의 투여량으로 비스포스포네이트를 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또다른 추가 부분은 상기 화합물 중 적어도 하나 이상, 이들의 혼합물, 및(또는) 이들의 약학적 염, 및 이들에 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 생체내 석회화 방지에 적합한 약학 조성물이다. 그러한 조성물은 약학적으로 허용된 절차를 따라, 예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, ed. Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA(1985)]에 기재된 바와 같이 제조한다.
본 발명의 방법에 치료적으로 사용하는 경우, 하나 이상의 항생제 또는 그의 염, 및 이들에 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물 형태로 항생제 또는 그의 염을 편리하게 투여할 수 있다. 적합한 담체는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며 약학 조성물의 원하는 형태 및 투여 방식에 따라 변한다. 예를 들면, 희석제, 또는 충진제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제 등과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 전형적으로 담체는 고체, 액체, 또는 휘발성 담체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 각 담체는 조성물내 다른 성분과 적합하고 환자에게 해롭지 않다는 점에서 "허용가능"해야 한다. 담체는 생물학적으로 허용가능하고불활성이어야 한다. 즉, 항생제 화합물이 나노박테리아, 및 특히 나노박테리아와 관련한 인회석 결정의 발달을 억제하도록 해야 한다.
본 발명의 방법에 사용하는 항생제 화합물, 또는 이들의 염을 담체와 함께 제조하여 임의의 원하는 단위 투여 형태로 만들 수 있다. 전형적인 단위 투여 형태에는 정제, 환, 분말, 용액, 현탁액, 유탁액, 과립, 캡슐, 및 좌약이 포함되며, 정제 및 캡슐이 특히 바람직하다. 제제에는 경구, 직장, 비강, 국부(구강 및 혀 아래 포함), 질 및 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 내피, 및 경피) 투여에 적합한 것들이 포함되며, 경구 투여에 적합한 제제가 바람직하다.
예를 들면, 주사에 적합한 제제를 제조하기 위하여, 용액 및 현탁액을 멸균하고 바람직하게는 혈액에 등장화시킨다. 주사용 제제를 제조할 때, 본 분야에 흔히 사용하는 담체, 예를 들면, 물, 에틸 알코올, 프로필렌 글리콜, 에톡실레이트된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥실레이트된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 소르비테이트 에스테르 등도 사용할 수 있다. 이 경우에, 적당한 양의 등장성 조절제, 예를 들면, 염화나트륨, 글루코스 또는 글리세린을 첨가하여 제제를 등장화시킬 수 있다. 수성 살균 주사액은 추가로 산화방지제, 완충액, 제균제 등과 같은 주사용 제제에 허용가능한 첨가제를 함유할 수 있다.
제제는 편리하게 단위 투여 형태로 만들 수 있으며 약학 기술 분야에서 알려진 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 그러한 방법은 활성 성분을 하나 이상의 부속 성분을 포함할 수 있는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 활성 성분을 균일하고 밀접하게 액체 담체 또는 미세하게 나누어진 고체 담체 또는둘다와 결합시키고, 이어서 필요하다면 생성물을 형성화함으로써 제제를 제조한다. 당해 기술 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 다양한 단위 투여 및 다중 투여 용기, 예를 들면, 봉합된 앰퓰 및 바이앨을 사용할 수 있다.
특히 상기한 성분들 외에, 본 발명의 제제는 이런 형태의 약학 제제에 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 다른 약제를 포함할 수도 있다.
본 발명에 사용하는 화합물은 담체에 대한 넓은 비율로 조성물내에 존재할 수 있다. 예를 들면, 0.01 내지 99.9 중량%의 양으로, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 99 중량%로 존재할 수 있다. 더더욱 바람직하게는, 조성물의 약 1 내지 70 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따라 환자에게 투여되는, 항생제, 약학적으로 허용가능한 그의 염, 또는 그 혼합물의 투여량은 여러 가지 인자에 따라 변할 것이다. 여기에는 연령, 체중, 및 환자의 종, 환자의 전반적 건강 상태, 증상의 중증도, 조성물을 단독으로 투여하는가 아니면 다른 치료제와 함께 투여하는가, 부작용의 발생 등이 포함되지만, 여기에 제한되는 것은 아니다.
일반적으로, 본 발명의 방법에 적용하기에 적합한 투여량은 각 투여당 체중 kg당 약 0.001 내지 100 mg, 바람직하게는 각 투여당 체중 kg당 약 0.01 내지 60 mg, 더더욱 바람직하게는 각 투여당 체중 kg당 약 0.1 내지 40 mg이다. 원하는 투여량을 하루동안 적당한 간격으로 투여하는 1 내지 6 이상의 분할 투여량으로 투여할 수 있다. 항생제 화합물을 수개월 또는 수년의 기간에 걸쳐 반복적으로 투여하거나, 천천히 및 일정하게 환자에게 투여할 수 있다. 더 많거나 더 적은 양도 투여할 수 있다.
예를 들면, 상기 다양한 파라미터를 고려하여 일일 투여량을 조절할 수 있다. 전형적으로, 본 조성물을 하루에 체중 kg당 약 0.001 내지 100 mg의 양으로 투여할 수 있다. 하지만, 다른 양도 투여할 수 있다. 우수한 혈장 농도를 달성하기 위해, 항생제를, 예를 들면, 임의적으로 식염수 중의 항생제 약 0.1 내지 1%의 용액을 정맥내 주사함으로써 투여할 수 있고, 또는 대형 환제로 경구 투여할 수 있다.
국부, 경구, 직장내, 비강내, 질내 및 비경구(복강내, 피하, 근육내, 정맥내, 내피, 및 경피 포함) 경로를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 치료 목적으로 활성 성분을 투여할 수 있다. 바람직한 경로는 환자의 상태 및 연령, 질환의 성질 및 다른 치료제를 포함하여 선택된 활성 성분에 따라 변할 것이라는 점을 이해할 것이다. 경구 경로가 바람직하다. 정맥내 경로도 바람직하다. 하지만, 환자의 상태 및 치료를 얼마동안 지속하는가에 따라 다른 경로를 이용할 수도 있다.
항생제를 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 약학 제제로 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명의 제제는 위에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 항생제와 함께 하나 이상의 허용가능한 이들의 담체 및 임의적으로 다른 치료제를 포함한다.
상기 방법은 상기 화합물 단독으로, 또는 약학 조성물내의 다른 치료제를 포함하여 다른 항생제와 함께 투여함으로써 실행될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 치료제는 동일하거나 다른 메카니즘에 의해 의도한 목적에 효과적인 임의의 적합한 약물, 또는 상기한 항생제를 보충하는 약물이다. 결합 치료법에 이용되는 화합물은 분리된 또는 결합된 제제로 동시에 투여하거나, 또는 본 화합물과는 다른 시점에, 예를 들면, 순차적으로 투여하여 결합된 효과가 달성되도록 할 수 있다. 투여의 양 및 섭생은 의사에 의해, 바람직하게는 초기에 그 표준량을 낮추고 이어서 얻어진 결과를 적정함으로써 조절될 것이다. 본 발명의 치료 방법은 의사에 결정된 다른 치료법과 함께 사용될 수 있다.
본 발명을 개괄적으로 설명했기 때문에, 동일한 내용이 특정 실시예를 참고로 하여 보다 잘 이해될 것이다. 명시하지 않았으면, 이는 설명의 목적으로만 본원에 포함되며, 본 발명 또는 임의의 그의 실시태양을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1: 나노박테리아에 의한 무기질화
본 연구에서, 본 발명자들은 나노박테리아가 생체 인회석 구조체의 형성에 결정화 중심으로 작용할 수 있다는 증거를 제공한다. 무기질화 과정은 상업적 태아 소 혈청으로부터 얻은 소의 분리균 및 인간 분리균으로 생체외 연구를 하였다. 나노박테리아성 균혈증이 인간에게서 발생하고 나노박테리아성 병소가 병리학적 석회화를 일으킬 수 있기 때문에 이 발견은 의학에서 중요한 것이다.
재료 및 방법
나노박테리아의 배양 방법.
포유류 세포 배양 조건(37℃; 5-10% CO2/90-95% 공기)하에서 나노박테리아를DMEM(GIBCO)에서 배양하였다. 나노박테리아 공급물 또는 공급원으로서 혈청을 10% 최종 농도로 사용하였는데, 혈청은 태아 소 혈청(Sera Lab, 롯트 901045), 또는 29세의 핀란드 남성으로부터 얻은 인간 혈청이었다. 배양물은 세포 배양 기기에서 엄격한 무균 조제법을 이용하여 제조하였다. 배양하기 전에 0.2 ㎛ 필터를 통하여 나노박테리아 샘플을 여과하였다. 동일한 혈청 또는 γ-조사된 태아 소 혈청(γ-FBS)를 배양 공급물로 사용하여 계대배양물을 제조하였다. 필요할 때, 30 kGy의 최소 투여량으로 실온에서 약 16 시간 동안 Kolmi-Set(Ilomantsi, 핀란드 소재)에 의해 태아 소 혈청 및 나노박테리아를 γ-조사시켰다.
5년 동안 달마다 1:11로 계대접종시키면서 혈청이 없는(SF) DMEM에서 나노박테리아 계대배양을 실시하였다. SF-나노박테리아는 배양 용기 바닥에 단단히 붙는다. 이 배양물을 고무 스크레이퍼로 계대접종 또는 회수하였다. 배양물을 나노박테리아 배양물로부터 10% 조절된 배양액으로 보완된 뢰플러 배양액을 완성하였고, DMEM이 처방에서 물을 대신하였다. 배양 기간은 세포 배양 조건에서 6주였다.
순수한 나노박테리아 배양물만 사용하였다. 하기하는 바와 같이, 나노박테리아의 양성 동정에는 전형적인 성장 속도 및 광학 특성, 훽스트 33258 및 간접 면역형광 염색(IIFS)에서의 특이적인 염색성과 관련되었다. 대조 실험을 수행하여 자발적인 결정화가 배양액에서 일어날 수 있는지 결정하였다. γ-FBS 또는 γ-조사된 나노박테리아가 있는 경우와 없는 경우에 배양액을 배양하였다. 6개월 동안 추적 검사하여도 무기질화와 나노박테리아 복제 어느 것도 관찰되지 않았다.
3T6 세포의 제조 및 감염.
3T6 세포(ATCC CCL 96)를 커버슬립에서 배양하였다.
SF-나노박테리아 배양물을 스크레이프하고 100 ㎕ 부분을 세포 배양물에 첨가한 후 24 시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. DMEM만 대조 실험에 추가하였다. 투과 전자 현미경(TEM), IIFS, 및 DNA 및 폰 코사 염색을 사용하여 세포와 SF-나노박테리아 사이의 상호작용을 관찰하였다.
신장 결석.
무작위로 모은 30개의 신장 결석(K-SKS, Stone Analysis Central Laboratory, 핀란드 소재)을 1N HCl에서 탈염시키고 이어서 중화하고 14,000 x g에서 15분 동안 원심분리한 후, 펠렛을 IIFS 및 TEM에 사용하였다. 펠렛의 일부는 DMEM에서 부유하였고, 멸균-여과하고 나노박테리아 배양 조건에서 γ-FBS로 보완된 DMEM에서 배양하였다.
염색 방법.
훽스트 33258 형광색소에 의한 DNA 염색을 훽스트 염색 키트(Hoechst Stain Kit, Flow Laboratories)에 기재된 대로 수행하되, 필요한 경우, 염색 농도를 0.5 ㎍/㎖에서 5 ㎍/㎖로 증가시켰다. lgG1 클래스 항-나노박테리아 단일클론 항체(mAb), Nb 8/0 및 Nb 5/2를 IIFS에서 사용하였다. 필요한 경우, 결합의 특이성을 테스트하기 위하여, 후자 mAb의 에피토프를 나트륨 보로하이드레이트(3 x 1 분; PBS에서 0.5 mg/㎖)에서 배양하여 불활성화시켰다. 형광 발광 및 미분 간섭 대조(DIC) 광학에 의해 Nikon Microphot-FXA 현미경하에서 샘플을 보았다. 폰 코사 염색으로 특이적인 석회화 감지를 수행하였다. 48 시간 동안 SF-나노박테리아에 노출된 3T6 세포를 샘플로 사용하였다.
전자 현미경 및 에너지 분산 X-선 미량 분석.
음성 염색의 경우, 40000 g에서 1 시간 동안 원심분리하여 PBS에서 1:5로 희석된 태아 소 혈청으로부터 나노박테리아를 직접 분리하였다. 탄소 코팅된 400 메쉬의 구리 격자를 1 분 동안 PBS에서 나노박테리아의 현탁액 방울 위에 놓고, 물로 세척하고, 1% 포스포텅스트산의 방울에서 90초 동안 염색하였다. 주사 전자 현미경(SEM) 및 TEM을 수행하였다. 나노박테리아의 토포그래프 특징은 에너지 분산 X-선 미량 분석(EDX)이 갖춰진 SEM으로 조사하였다. 수산화인회석(Sigma, No-H-0252, 미주리주 세인트루이스 소재)을 참고로 사용하였다.
푸리에 변환 IR 분광법(FTIR), 화학 분석, 및 효소 분석.
인회석 무기질에서 히드록실기와 카보네이트기를 표준 방법을 따라 K-SKS (Stone Analysis Central Laboratory, 핀란드 소재)에 의해 FTIR을 이용하여 검출하였다. pH 9.5에서 p-니트로페닐포스페이트를 기질로 하여 우레아제 효소 활성 및 알칼린 포스파타제(AP)를 분석함으로써 나노박테리아의 화학 분석을 수행하였다.
결과
배양물 특성, 형태, 및 혈청 함유 배양액 중의 나노박테리아에 의한 인회석 형성.
DIC에 의한 광학 현미경으로 약 1 주일의 배양 기간 후 배양 용기의 바닥 근처에서 간신히 찾을 수 있는 나노박테리아를 밝혀내었다. 2 주 후, 나노박테리아는 현미경으로 쉽게 볼 수 있는 그룹으로 나타났다. 한달 후, 많은 나노박테리아가 덩어리 형태가 되었고 배양 용기의 바닥에 붙기 시작하였으며, 2개월 말에서는, 대부분이 육안으로 볼 수 있는 흰색 생물막 형태로 되었다. 순수한 나노박테리아 배양물에 대한 판단은 전형적인 코코이드 모양 입자의 굴절성 덩어리(도 1A)로 하는데, 이는 수정된 방법만으로의 DNA 염색성, 양혈 한천에 대한 음성 배양 결과 및 항-나노박테리아 mAb와의 IIFS 양성을 보여준다.
미배양된 태아 소 혈청에서의 나노박테리아 음성 염색은 0.2-0.3 ㎛의 코코이드 입자들을 보여 주었다(도 1C). 한달 동안의 배양 기간 후, SEM은 직경 0.2 내지 0.5 ㎛의 유사한 코코이드 모양을 보여 주었다(도 1D). 거친 표면은 TEM에서 보이는 것을 닮았다(도 1E-G). 더 긴 배양 기간 동안, 대부분 배양 용기에 달라붙고 결국 무기질층 형태를 하였다(도 1 F 및 G). EDX를 이용한 화학 분석으로 수산화인회석에서 검출되는 것과 유사한 Ca 및 P 피크를 얻었다(도 1 H 및 I). 인간 분리균의 배양물도 동일한 결과를 나타내었다(도시하지 않았음). 3개월의 배양 기간 동안 수확한 나노박테리아의 화학 분석은 고함량의 무기 물질을 보여주었다. 펠렛의 건조 중량은 23%부터 39%까지 변화하였고, N(1-1.3%); P(12.3-14.6%); Ca(23.4-23.5%); Mg(1.4-1.9%); K(0.1%); 및 Na(1.2-1.4%)로 구성되었다. FTIR은 카보네이트 인회석이 인간 및 소의 나노박테리아 모두에서 7-180 일 사이의 모든 배양 기간으로부터 얻은 샘플에서 존재한다는 것을 보여주었다. 대조 수산화인회석은 테스트에서 정확히 동정하였다. 분석 방법은 다른 무기층의 미량의 존재하는 가능성을 배제하지 않는다. 그러한 가능성을 배재하기 위해서는, 결정학적 분석이필요하다. 나노박테리아는 우레아제 또는 AP 활성을 생성하지 않았고, 그 배양액은 pH 7.4로 남아 있었다.
뢰플러 배양액에서 나노박테리아에 의한 인회석 형성.
변형된 뢰플러 배양액에서의 거시적 나노박테리아 콜로니(도 2A 및 B)은 돌모양이고, 회갈색이며, 계대접종할 수 있고, 6주의 배양 후 배양액 층을 관통하여 배양 용기의 바닥에 달라 붙었다. 항-나노박테리아 mAb의 IIFS(데이타는 표시하지 않음), 및 TEM은 수산화인회석 결정(도 2D)과 유사한 바늘 모양의 인회석 결정으로 코팅된 나노박테리아를 보여주었다(도 2C).
SF-배양액에서 나노박테리아에 의한 인회석 형성.
세척한 나노박테리아 펠렛 또는 SF-나노박테리아를 SF-DMEM에서 계대배양하면, 바닥에 붙은 코코이드 유기체가 하루내에 관찰되었다. 미분 간섭 대조 현미경은 1주일 이내에 효모 크기에 이르는 각 나노박테리아 주위에 수 마이크로미터 두께의 무기층을 보여주었다(도 3A). 그 형태는 코코이드 나노박테리아와는 크게 달랐지만, 유사한 DNA 염색성이 관찰되었다(도 3B). 이들은 혈청 함유 배양물에서 관찰되는 속도의 약 절반 속도로 바이오매스를 생성하였다. [35S]메티오닌 및 [5-3H]우리딘의 대사성 혼입은 이들이 복제하고 있다는 증거이다. 미분 간섭 대조 현미경은 무기질 형성물 내부의 나노박테리아 복제를 보여주었다(도 3C). 이 인회석 쉘터(SEM에서 중공 내부를 가지는 것으로 나타남)는 분명히 유기체의 서식지였다(도 3E 및 F). 공동의 크기는 아마도 함유하는 나노박테리아의 수에 좌우될것이다(도 3F). 분명히, 공동의 개구는 스크레이핑 전에 배양 용기의 바닥을 향하고 있었다. 따라서, 인회석 쉘터는 유기체에 완벽한 보호를 제공하였다. 배양물은 5년에 걸쳐 달마다 계대 접종할 수 있었고 항상 유사한 성장 패턴을 따랐다. γ-FBS를 가한 후, 이 나노박테리아 형성물은 혈청 배양물에서 발견된 형태로 돌아왔다(도 3D 참고). 상기 쉘터가 성질상 인회석이라는 것은 EDX에 의해 입증되었다. FTIR로 그것이 카보네이트 인회석이라는 것을 결정하였다. 인간 분리균은 유사한 형성물을 생성하였다.
섬유모세포 배양에서 세포내 및 세포외 석회화
SF-나노박테리아로 48 시간 동안 감염시킨 3T6 세포는 변형된 세포 형태, 예를 들면, 세포내 이입된 SF-나노박테리아가 있는 큰 액포화 현상을 보여준다(도 3G). 대조 세포는 음성이었다(도시하지 않았음). 나노박테리아 감염된 세포의 표준 DNA 염색은 아무런 통상의 오염을 보여주지 않았다(도 3H). TEM은 종종 세포 표면에 부착된 SF-나노박테리아를 보여주지만, 대개 핵(도시하지 않았음)을 포함한 세포(도 3I-L)내 여러 부분에 있었다. 폰 코사 염색은 이런 세포들에서 세포내 및 세포외 석회화를 보여주었다(도 4D 및 E). 크게 오염된 세포는 핵의 비정상, 예를 들면, 도 4E에 나타낸 바와 같은 거대핵, 및 비정상적인 핵 형상(도 3 G, H, K 및 L)을 보여주었다. 대조 세포는 폰 코사 음성이었고 핵의 비정상을 나타내지 않았다(도 4F).
신장 결석에서 나노박테리아 항원의 검출.
본 발명자들은 나노박테리아의 존재를 검출하고자 30개의 인간 신장 결석에대힌 조사를 감독하였다. 나노박테리아 특이적인 mAb는 IIFS를 이용하여 30개의 탈염된 결석 모두에서 다양한 농도에서 양성의 나노박테리아 크기의 구균을 보여주었다. 관련된 이미지는 도 4C에 나타내었다. 탄수화물 에피토프를 검출하는 또다른 나노박테리아 특이적인 mAb, Nb 5/2로 결과를 반복하여 얻었고, 항체 결합은 탄수화물 항원을 파괴하는 나트륨 보로하이드레이트로 처리하여 없앨 수 있었다. 무관한 항원을 검출하는 4개의 상이한 mAb(lgG1 클래스)를 이용한 음성 염색 결과로 특이성을 추가로 입증하였다(데이타는 나타내지 않았음). 나노박테리아(도 4A)와 유사한 크기와 형상의 박테리아가 강한 양성의 결석에서 TEM으로 발견되었다(도 4 B 및 C). 나노박테리아 배양 조건에서, 모든 결석의 멸균 여과된 추출물은 나노박테리아의 성장 속도, 형태, 무기질화, 및 염색 특성을 갖는 미생물을 보여주었다.
토론
본 발명자들은 생체외 인회석 석회화의 재생성 생성을 가능하게 하는 나노박테리아 배양 시스템을 발견하였다. 배양 조건에 따라, 인회석으로 덮힌 아주 작은 나노콜로이드 크기의 입자, 또는 생물막, 모래, 결석 및 종양 모양의 인회석 성장을 생성시킬 수 있었다(표 1).
나노박테리아의 배양성 및 인회석 형성
배양 조건 복제 크기 인회석 및 그 형태
혈청 + S +, 나노콜로이드
DMEM 중 10-50% 혈청 + S ++, 나노콜로이드
DMEM + L +++, 모래
50% DMEM - 50% 소변 + L +++, 모래
소변 +/- n.e. n.e.
변형된 뢰플러 배양액 + L +++, 종양 모양
S, 작은 크기(200-400 nm); L, 큰 크기(1 ㎛ 내지 1 mm, 무기질 포함);n.e., 결정 형성 때문에 평가하지 않음. 마지막 열의 +는 양을 나타낸다.
무기질화의 주요한 필수 조건은 배양액 중 낮은 수준의 손상되지 않은 혈청이었다. 혈청은 인회석 결정 형성, 오스테오폰틴, 오스테오칼신 및 페투인의 강력한 단백질성 억제제를 함유하는데, 이것이 태아 소 혈청의 보충 후 형성되는 무기질의 억제 및 심지어 용해가 관찰되는 것을 설명할 수 있다. 배양액을 함유하는 혈청에서 나노박테리아 배양을 하는 경우, 억제제가 최소한의 무기질화만 허용하였다. 무기질화는 세포 배양액 중 혈청이 희석됨에 따라 증가하였다. 마지막으로, SF-배양액에서, 인회석 형성은 광범위하고 빨랐다. 변형된 뢰플러 배양액이 75%의 혈청을 함유하지만, 혈청 단백질은 멸균 단계 동안에 변성되었다. 따라서, 인회석 형성이 억제되지 않고 6주 후 직경 약 1-5 mm의 고체 인회석 콜로니가 생성되었다. 나노박테리아 모델에서 인회석을 생성시키는데 살아있는 나노박테리아가 필요하다. γ-조사된 나노박테리아는 복제하지 않았고, 비록 그 위에 인회석을 모을 수는 있었지만, 6개월의 배양 후에도 상당한 크기의 석회화는 생성되지 않았다.
화학 분석은 생물막의 전체적 조성 및 고체 무기질 형성이 카보네이트 인회석이 형성된다는 점을 제외하고 뼈의 그것과 유사하다는 것을 보여주었다. 대부분의 골격외 조직 석회화 및 결석에서는 카보네이트 인회석이 형성되지만, 뼈에서는 수산화인회석이 우세한 형태이다. 나노박테리아 모델에서, 배양액의 보충 없이 [Ca] 1.8 mM 및 [Pi] 0.9 mM 이하에서 인회석이 형성되었다.
본 발명자들이 스크린한 30개의 인간 결석 모두에서 나노박테리아가 발견되었다. 이전에는, 마그네슘 암모늄 포스페이트 및 적은 양의 인회석으로 구성된 스트루바이트 결석(모든 신장 결석의 4-15%)만이 박테리아로부터 유도된다고 여겨졌다. 우레아제를 생성하여 국부적인 pH를 보다 결석 형성이 잘 되는 수준으로 높이는 프로테우스(Proteus), 스타필로코키(Staphylococci) 및 이. 콜리(E. Coli)에 의해 스트루바이트 결석이 생체외 및 아마도 생채내에서도 형성된다. 알칼리성 포스포타제는 결석 형성을 증가시킬 수 있다. 나노박테리아는 우레아제 또는 AP를 생성하지 않지만, pH 7.4에서 그 표면 위에 직접 카보네이트 인회석 핵을 형성하는데, 이는 핵을 생성하는 분자가 존재함을 암시한다. 나노박테리아는 사구체 여액과 조성이 유사한 배양액에서 생리학적 조건하에서 배양할 수 있기 때문에, 나노박테리아는 신장 결석 형성을 위한 독특한 모델을 제공한다.
실시예 2: 나노박테리아의 박멸
나노박테리아 소독을 위한 적절한 테스트의 선택은 수월하지 않으며, 소독에 영향을 주는 인자의 수 때문에 상이한 테스트로부터 얻은 결과의 정확한 비교가 문제가 된다. 이 인자들에는 노출 지속 시간, 유기 로드(load)의 존재, 소독제의 형태, 수명, 농도 및 희석제, 및 존재하는 미생물의 수, 수명, 성장 형태, 및 온도가 포함된다. 현재 여러 가지 형태의 소독 테스트가 있지만, 이들은 주로 빨리 성장하는 박테리아에 적합하다. 느리게 성장하는 미코박테리아(Mycobacteria)(이들 중 일부는 극히 저항력이 있음)의 소독 테스트는 적합하고 믿을만한 표준화가 부족하여 오랫동안 어려움을 겪어왔다. 전형적으로, 원심분리나 매우 높은 희석을 이용하여 소독제의 잔여 농도 효과를 제거해왔다. 결과적으로, 생존 능력의 감소를 평가하기 위해 콜로니 수 산정을 위한 한천 배양액 위에 플레이팅을 한다. 나노박테리아의 경우 그러한 분석법은 적합하지 않다. 원심분리에 의한 나노박테리아의 회수는 일반적으로 예측할 수 없는 손실을 가져온다. 느린 성장 속도 때문에, 높은 희석은 배양 시간을 매우 길게 하고, 고체 배양기에서의 극히 불량한 배양성은 나노박테리아 수 평가를 불가능하게 한다.
무기질화는 나노박테리아의 가장 특징적인 특성이고, 아마도 유기체에 의해 발생하는 병리학의 주요 메카니즘일 것이다. 표준 배양 조건하에서 형성되는 무기질은 에너지 분산 X-선 미량 분석법 및 푸리에 변환 IR 분광법을 포함한 여러 방법에 의해 밝혀진 바와 같이 수산화인회석 또는 카보네이트 인회석이다. 무기질의 주요 기능 중 하나는 거친 환경 조건에 대한 보호일 수 있다. 인회석은 해로운 화합물이 유기체의 내부로 침투하는 것을 방지할 수 있다. 배양 시간 및 배양 조건에 따라서, 다양한 정도의 무기질화가 발견되었다. 혈청(SF-나노박테리아) 없이 배양된 나노박테리아에 의한 무기질화는 혈청 함유 배양액으로 배양한 나노박테리아에서 발견되는 것보다 훨씬 더 광범위하다. 혈청 나노박테리아 및 SF-나노박테리아의 배가 시간은 아미노산 혼입법에 의해 측정하여 각각 약 3일 및 6일이다.
일반적으로 사용되는 농도의 소독 약품을 배양된 나노박테리아에 대해 이제 테스트하였다. 선택한 약품은 생물학적 시스템에 영향을 주는 것으로 알려진 매우 다양한 메카니즘을 나타낸다. 고온에서, 건조에서 및 UV-C 조사하에서의 나노박테리아 생존도 테스트하였다. 박테리아의 항생 저항에 대한 여러 가지 메카니즘이 있지만 본원에서는 설명하지 않았다. 본 발명자들은 나노박테리아에 대한 4 가지 항생제의 효과를 평가하였다. 항생제는 세포 배양에서 흔히 사용되는 것들이다.
실험 설계
혈청 함유 배양액에서의 나노박테리아 배양
5% CO2- 95% 공기의 분위기하에서 37℃에서 한달 동안 DMEM 배양액(혈청 나노박테리아)에서 10% 태아 소 혈청으로 나노박테리아를 배양하였다. 배양물을 원심분리에 의해 수확하였다. 오토클레이빙, UV, 마이크로파, 가열 및 건조 처리를 위해 수확한 나노박테리아를 인산염 완충된 식염수(pH 7.4; PBS)에 부유시켰다. 처리 후, DMEM 배양액에서 10% 감마 조사된 태아 소 혈청에서 나노박테리아를 계대배양하였다. 혈청 나노박테리아의 성장에 이어 광학 현미경 측정 및 650 nm의 분광 측광기에 의한 흡광도 측정을 하였다.
혈청이 없는 경우 나노박테리아 배양
5% CO2- 95% 공기의 분위기하에서 37℃에서 1주일 동안 DMEM 배양액에서 SF-나노박테리아를 배양하였고, 모든 배양물은 배양 용기에 단단히 부착되었다.배양액을 제거한 후 배양물을 소독제에 노출시켰다. 오토클레이빙, UV, 마이크로파, 및 건조 처리를 위해 배양액을 제거하고 같은 양의 PBS를 대신 사용하였다. 가열 처리를 위해, 배양 용기를 스크레이핑한 후 배양액을 원심분리하여 SF-나노박테리아를 수확하였다. 얻어진 펠렛을 PBS에 부유시키고 테스트에 사용하였다. 처리 후, SF-나노박테리아를 DMEM 배양액에서 계대배양하고 광학 현미경으로 성장을 추적하여 부착 및 전형적인 무기질화를 관찰하였다.
SF-나노박테리아의 화학 소독
사용한 약품의 농도는 소독에 흔히 사용되는 것이거나 제조업자의 지시에 따른 것이었다. 상기 약품은 70%의 에탄올, 2%의 글루타르알데히드, 4%의 포름알데히드, 0.5%의 하이포아염소산염, 3%의 과산화수소, 1M의 염산(HCl), 1M의 수산화나트륨(NaOH), 1%의 도데실황산나트륨(SDS), 1%의 Tween 80, 1%의 Triton X-100, 3M의 구아니듐-염산염, 3M의 우레아, 1%의 Virkon(Antec International Ltd., 잉글랜드 서폴크(Suffolk) 소재; 100% 생성물은 50%의 과황산칼륨, 5%의 술파미노산을 함유함), 1.5%의 Erifenol(핀란드 오리온 OY 소재; 100% 생성물은 5% 미만의 NaOH, 5% 미만의 o-벤질-p-클로로페놀, 5-15%의 p-클로로-m-크레졸을 함유함), 1%의 Klorill(핀란드 오리온 OY 소재; 100% 생성물은 나트륨 메타실리케이트, 나트륨 N-클로로-p-톨루엔술폰아미드-3-하이드레이트 및 20,000 ppm의 활성 염소를 함유함), 및 3%의 Buraton(독일 Schulke & Mayr 소재; 100% 생성물은 4.5%의 포름알데히드, 6.8%의 글록살, 1.5%의 글리옥실산, 6%의 염화디메틸라우릴벤질-암모늄을 함유함)을 포함하였다. 사용할 희석액은 멸균 증류수에 노출하는 날에 새롭게 제조하였다. 양성 대조로서, 희석제만 사용하였다. 음성 대조는 배양액만 함유하였다.
배양액을 제거한 후 실온에서 10분 및 30분 동안 SF-나노박테리아를 약품에 노출시켰다. 노출 후, 소독액을 제거하고 새로운 배양액을 추가하였다(HCl 및 NaOH의 경우 중화 단계와 함께). 상당한 탈착이 발생하면, 원심분리에 의해 나노박테리아를 회수하고 계대배양하였다. 노출된 무혈청 배양물을 48 시간 후에 1:10으로 계대접종하고 3주 동안 광학 현미경으로 성장을 추적하였다.
오토클레이빙, UV, 및 건조 처리
혈청 나노박테리아 및 SF-나노박테리아를 작은 부피의 pH 7.4의 인산염 완충된 식염수 (PBS)에서 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙시켰다. 라미나 후드에서 Philips 15 W UV-C 램프하에서 1 시간 및 3 시간 및 밤새 동안 뚜껑을 제거한 페트리 접시에서 PBS 중의 두 나노박테리아를 UV 처리하였다. 램프로부터 배양물의 거리는 약 60 cm이었다. 실온에서 밤새 나노박테리아를 건조함으로써 또는 100℃에서 1 시간 동안 가열함으로써 건조 처리를 수행하였다. SF-나노박테리아는 실온에서 밤새 동안만 건조하였다. 1400 W 마이크로파 오븐에서 샘플을 10회 비점(100℃)으로 가져감으로써 마이크로파 처리를 하였다.
나노박테리아의 가열
60℃와 100℃ 사이의 변화하는 온도에서 15분 및 30분 동안 PBS 중의 펠렛으로서 나노박테리아를 노출시킴으로써 나노박테리아의 생존에 대한 열 효과를 결정하였다. 노출된 SF-나노박테리아를 DMEM 배양액에서 배양하고 상기한 바와 같이 현미경으로 성장을 추적하였다. 광학 현미경 및 650 nm의 분광 측정기로 흡광도를 측정함으로써 혈청 박테리아 배양물의 성장을 추적하였다.
항생 감도 테스트
1x 및 10x 농도의 페니실린(β-락탐) 및 스트렙토마이신(아미노글리코사이드)(PS)의 혼합물(100 IU 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 = 1x), 1x 및 10x 농도의 카나마이신(아미노글리코사이드) 및 1x 농도(100 ㎍/㎖)의 젠타마이신(아미노글리코사이드)로 혈청 나노박테리아의 항생 감도를 테스트하였다(100 ㎍/㎖=1x). 1x 농도는 세포 배양에 권장되는 농도이다. 항생제와 함께 DMEM을 함유하는 10% 혈청에서 10일간 배양한 후, 항생제가 없는 경우의 나노박테리아 배양물과 성장을 비교하였다.
결과
화학 소독
SF-나노박테리아는 사용한 소독제에 넓은 저항성을 나타내었다. 30분 후에 Virkon만이 SF-나노박테리아를 죽이는데 효과적이었다. 염산 처리로 나노박테리아의 인회석층을 용해시켰지만, 배양액을 첨가한 후 재무기질화가 발견되었다. 구아니듐-염산염 및 Buranton 처리로 SF-나노박테리아를 탈착시켰지만, Buranton의 소독 효과가 구아니듐-염산염의 소독 효과보다 약간 더 작았다. 화학 처리의 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 희석제만으로 처리한 것과 비교함으로써 계대배양한 후의 생존을 결정하였다.
화학 소독제에 대한 SF-나노박테리아의 저항성
약품 노출 시간
10 분 30 분
70% 에탄올 +++ +++
2% 글루타르알데히드 +++ +++
4% 포름알데히드 +++ +++
0.5% 하이포아염소산염 +++ +++
3% H2O2 +++ +++
1M HCl n.d. ++*
1M NaOH +++ +++
1% SDS +++ +++
1% Tween 80 +++ +++
1% Triton X-100 +++ +++
3M 구아니듐 HCl n.d. 0
3M 우레아 +++ +++
1% Virkon n.d. -*
1.5% Erifenol +++ +++
1% Klorill +++ +++
3% Buranton n.d. ++*
+++: 효과 없음; ++: 생존 감소; +: 뚜렷한 생존 감소; -: 생존 없음;* = 노출시 부분적 또는 전반적 탈착; n.d. = 결정 안됨
오토클레이빙, UV, 및 건조 처리
100℃의 온도에서 건조시키면 혈청 나노박테리아가 죽지만, 실온에서 건조시킬 경우 그렇지 않았다. 오토클레이빙은 SF-나노박테리아에 해롭지 않았지만, 혈청 나노박테리아 생존의 뚜렷한 감소가 관찰되었다. SF-나노박테리아가 UV광에는 내성을 보여 성장에 아무 영향이 없었지만, 혈청 나노박테리아가 상당히 불활성화되었다. 나노박테리아 샘플이 밤새 UV 처리 동안 건조되었고, 따라서 유기체에 추가적인 압박이 되었다. 모든 UV 처리에 있어 나노박테리아의 생존이 유사했기 때문에 분명히 건조는 결과에 거의 또는 전혀 영향이 없었다. UV 라디오미터가 부족해서 UV 투여량을 계산할 수 없었고, 배양액에서 나노박테리아로 더 정확한 테스트를 수행해야 한다. 짧은 끓임은 아무 효과가 없기 때문에 마이크로파 처리는 멸균 단계보다 열 쇼크 처리에 더 가깝다. 오토클레이빙, 마이크로파 및 건조 처리를 한 후 나노박테리아 생존을 추적한 결과를 하기 표 3에 나타내었다. SF-나노박테리아가 혈청으로 배양한 나노박테리아보다 훨씬 더 저항력이 강했다. SF-나노박테리아는 생존 능력의 뚜렷한 감소없이 모든 테스트 조건에서 생존하였다. 혈청 나노박테리아는 100℃에서 1 시간 동안 건조함으로써 죽었고, 모든 다른 테스트 조건에서 생존이 뚜렷이 감소하였다.
물리적 노출 후 나노박테리아의 생존
처리 혈청 나노박테리아의 생존 무혈청 나노박테리아의 생존
오토클레이빙 + +++
UV 조사(1 시간) + +++
UV 조사(3 시간) + +++
UV 조사(밤새) + +++
마이크로파 +++ +++
건조(실온) + +++
건조(100℃) - n.d.
+++: 효과 없음; ++: 생존 감소; +: 뚜렷한 생존 감소; -: 생존 없음;* = 노출시 부분적 또는 전면적 탈착; n.d. = 결정 안됨
나노박테리아의 열 저항성
나노박테리아는 열 저항력이 매우 가했다. 15분 동안 끓여도 혈청 나노박테리아를 죽이기에 충분하지 않았지만, 30분 동안 끓이면 불활성화되었다. 열처리 후 혈청 나노박테리아의 성장 곡선을 도 5에 나타내었다. 중요한 것은 혈청 나노박테리아의 성장이 지연 기간이 관찰되지 않고 15분 동안 끓인 후에도 매우 유사했다는 점이다. 열처리 후 SF-나노박테리아 배양물의 현미경 관찰은 100℃에서 30분동안 끓이는 것을 포함하는 모든 테스트 조건에서 생존했다는 것을 보여주었다. 초기에, 온도가 높아짐에 따라 생존할 수 있는 SF-나노박테리아의 양이 감소하는 것이 관찰되었지만, 2주 후 열처리 하지 않은 대조군과 비교하여 테스트 배양 결과에 아무런 차이가 없었다.
나노박테리아의 항생 저항성
테스트한 항생제에 대한 높은 저항력이 관찰되었다. 나노박테리아의 성장을 막는데 세포 배양에서 보통 사용되는 것보다 10 배 더 높은 농도가 필요하였다. 도 6은 혈청 함유 배양액으로 배양한 나노박테리아의 성장에 대한 항생제의 영향을 보여준다. 흥미로운 것은 성장에 아무 영향이 없는 항생제 농도에서, SEM에서 관찰되는 바와 같이(도 7A 및 7B) 나노박테리아의 형태에 큰 영향이 있었다는 점이다. 이는 나노박테리아가, 예를 들면, 끈적끈적한 층을 분비함으로써, 해로운 공격으로부터 자신을 보호하는 적응 방식을 갖고 있다는 것을 암시한다.
결론
나노박테리아는 험한 조건을 극히 잘 견딜 수 있다. SF-나노박테리아는 혈청 함유 배양액에서 배양된 나노박테리아보다 훨씬 더 저항력이 높았다. 극한의 pH, 산화제, 자유 염소, 및 단백질에 영향을 주는 약품 뿐만 아니라 조사, 열 및 건조도 SF-나노박테리아에 거의 아무 영향이 없다. 이는 무기층이 유기체에 특별한 보호를 제공함을 나타낸다. 인간 신장 결석과 관련하여 나노박테리아의 예외적 생존도 관찰되었다. 결석을 염산으로 탈염시킴으로써 거의 모든 신장 결석으로부터 생존가능한 나노박테리아가 회복되었다(아래 참조).
소독 약품으로 나노박테리아를 박멸하는 효과적인 방법은 탈염 단계를 포함해야 한다. 인회석은 낮은 pH에서 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 같은 칼슘 킬레이트제에 의해 용해될 수 있다. 이어서 또다른 메카니즘에 의해 유기체를 죽이는 두번째 단계를 포함시켜야 한다. 과산소 화합물, 계면활성제, 유기산 및 무기 완충계로 이루어진 Virkon은 나노박테리아에 대해 효과적임이 입증되었는데, 다른 소독 메카니즘과 결합된 산성(물 중의 1% 용액이 pH 2.6을 가짐) 때문이라는 것이 가장 가능성있는 이유일 것이다.
나노박테리아 파괴를 확실히 하기 위해 3 메가래드의 감마선 투여가 필요하다. 감마선은 아마도 나노박테리아를 죽이는 가장 좋고 가장 믿을만한 방법일 것이다. 승온에서의 건조나 장기간의 끓임도 나노박테리아 박멸에 사용될 수 있다. 30분 동안 끓이는 것은 일부 내생포자, 특히 최적 성장 온도가 90℃ 이상인 바실루스 스테아로서모필루스 및 친고온성 원시 생물의 포자를 제외하고는 거의 모든 살아있는 유기체에 대해 효과적이다. 이 처리도 또한 SF-나노박테리아를 죽이는데는 충분하지 않다. 중요한 것은 보통의 오토클레이빙 과정(121℃, 20분)도 나노박테리아를 박멸하는데 불충분하였다는 점이다.
테스트한 항생제에 대한 나노박테리아의 저항력은 매우 높았다. 본 연구에 사용된 세포 배양 항생제는 매우 높은 농도에서만 효과가 있었다. 가능한 저항 메카니즘은 SEM에 의해 밝혀진 바와 같은 보호용 점액을 생성하는 것이다. 세포벽을 변형하는 것은 많은 박테리아들이 항생제에 대한 저항력을 얻는 흔한 전략이다. 나노박테리아가 불리한 조건을 마주할 때, 나노박테리아는 중합체를 분비하고 그위에 무기질을 형성하기 시작한다. 테스트한 항생제는 주로 아미노글리코사이드였다.
혈청 나노박테리아를 관찰한 결과 혈청 나노박테리아가 적어도 소독 저항력의 모델 유기체인 미코박테리아 및 바실루스 서브틸리스 포자 만큼 저항력이 있다는 것을 보여준다. SF-나노박테리아의 저항력은 이들보다 분명히 우수하다.
유기체 주위의 인회석 무기질은 다양한 약품 및 조사에 대한 일차 보호막으로 작용한다. 나노박테리아의 생존은 분명히 무기질 때문만은 아니다. 1M 염산 처리로 나노박테리아를 죽일 수 없었고 배양물에서 재무기질화가 이후에 관찰될 수 있었기 때문이다. 매우 느린 물질 대사와 결합된 인회석층 및 불투과성 막에 의한 이중 보호는 나노박테리아의 관찰된 저항성에 대한 가능한 설명이다. SF-나노박테리아의 저항력이 증가하는 것은 아마도 광범위한 무기질화, 더욱 느린 물질 대사 및 표면에의 부착 때문일 것이다. 나노박테리아의 저항 메카니즘은 다중성이 있는 것으로 보인다; 이를테면, 인회석 코팅, 불투과성 세포벽, 느린 물질 대사 및 아마도 아직 알려지지 않은 다른 메카니즘을 갖는 나노박테리아는 대부분의 소독 방법에 매우 높은 저항력을 갖게 된다.
실시예 3: 나노박테리아에 의해 형성된 치수 결석
본 실시예에서 수행된 실험의 목적은 나노박테리아가 치수 결석 형성에 관여하는지 조사하는 것이다. 본 연구의 설계는 치수 결석이 없는 건강한 치아 위에 나노박테리아를 배양하고 그 결과를 치수 결석이 있는 치아로부터 얻은 결과와 비교하는 것이다. SEM하에서 무기질 형성이 관찰되었다. 추가로, 18명의 환자에서질문표를 이용하여 치수 결석과 신장 결석 질병 및 다른 신체 석회화 사이의 가능한 상관 관계에 대한 역학 스크리닝을 수행하였다.
치수 결석과 신체내 다른 결석 형성 사이의 상관 관계
심한 치수 결석 형성에 의해 발생한 치주 문제를 기초로 터어키의 개인 치과 병원으로부터 18명의 환자를 무작위로 선택하였다. 모아진 치수 결석을 +4℃에서 0.05%의 NaN3을 함유하는 PBS에 저장하였다. 샘플을 실온에서 10분 동안 1N HCl에서 탈염시키고, NaOH 및 인산칼륨 완충액으로 중화한 후 항-나노박테리아 단일클론 항체를 이용하여 면역염색하였다. 1N HCl에 의한 샘플 처리는 본 실험에 사용된 단일클론 항체에 의해 인식된 에페토프에 영향을 주지 않았다. 면역염색으로 모든 샘플에서 다양한 농도의 양성, 소형 구균이 밝혀졌다. 무관한 항체를 검출하는 3개의 상이한 단일 클론 항체에 의한 음성 염색 결과로 염색의 특이성이 추가로 입증되었다.
환자 질문서로부터 얻은 결과는 환자들과 그 부모에게서 모두 신장 결석 및 담석의 발생율이 높음을 보여주었다(표 4).
치수 결석이 있는 환자 및 그 부모에서 석회화 및 결석 형성의 존재
환자(9M + 9F) 어머니 아버지
신장 결석 5/18 (28%) 3/18 (17%) 6/18 (33%)
요사 6/18 (33%) 1/18 (6%) 0/18 (0%)
담석 2/18 (11%) 7/18 (39%) 3/18 (17%)
조직 석회화 1/18 (6%) 5/18 (28%) 1/18 (6%)
보통의 식수를 먹을 때마다 실험실 동물 중에서 치아에 결석 형성이 증가하였다. 이는 한 동물에서 다른 동물로 플로라가 전이된다는 것을 암시한다. 게다가, 에리트로마이신이 결석 형성을 강하게 억제하는 반면, 클로람페니콜 및 페니실린은 그렇지 않다. 이는 결석 축적에 관계된 유기체가 매우 특이적일 수 있다는 것을 암시한다. 이러한 발견은 가족 구성원 중에 결석 형석 및 석회화의 발생율이 높은 것을 나타내는 상기 표 4에 나타난 결과에 대한 가능한 설명을 제공한다.
나노박테리아가 생체외 치석 형석을 유발함
치수 결석이 있는 치아에 대한 고배율 SEM 관찰 결과(도 8A)에서, 무기질화된 섬유 및 그 주위의 수많은 작은 구형체들이 관찰되었다(도 8B). 대조 치아에서는 석회소구가 관찰되지 않았다(도 8C 및 D).
본 발명자들이 건강한 치아를 한달 동안 SF-나노박테리아 배양물에 노출시켰을 때, SEM 결과는 치아 표면 위에 치수 결석을 닮은 부피가 큰 무기질이 형성된 것을 보여주었다(도 9 A, B, D, 및 E).
도 9의 큰 화살표로 나타낸 공동 모양의 구조체는 SF-나노박테리아에 매우 전형적인 구조체이다(위 참조). 이는 상이한 구조적 특징은 치수 결석의 다양한 무기질화 단계에 상응한다는 것을 암시한다.
치아 결석 형성의 이유에 대해, 예를 들면, 음식 및 연령과 같은 많은 의견들이 있다. 동물 실험은 음식에 Ca 및 P를 첨가하면 치아 결석 형성을 증가시킨다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 Ca이 나노박테리아에 의한 인회석 생성에 매우 필수적인 성분이라는 것을 보여주었다. 멸균된 돌로마이트 조각을 SF-나노박테리아 배양물에 첨가하면 복제 속도가 증가하였다. SEM 결과는 돌로마이트 표면 위에 부착되어 복제하고 있는 SF-나노박테리아를 보여주었다.
치수 결석의 화학 조성
인간 치아 결석의 결정 성분의 특징은 Ca/P 몰비에 기인한다고 생각되었다: i) 1.7에 가까운 Ca/P 비율에서 구균 및 간균을 포함하는 미생물의 석회화된 형태, 탄산염화된 수산화인회석; ii) 1.7에 가까운 Ca/P 비율에서 칼코포리트성 석회화 및 조밀한 석회화, 탄산염화된 수산화인회석 iii) 1.33에 가까운 Ca/P 비율에서 덩어리진 판 또는 작은 판의 덩어리 및 부채 모양의 덩어리, 옥타칼슘 포스페이트; iv) 1.4에 가까운 Ca/P 비율에서 다양한 크기의 입방형 형태, 휘틀로카이트. 치수 결석내 일부 다른 성분의 농도는 Ca 및 P보다 훨씬 낮다(0.88% F; 0.75% Na; 0.51% Mg). 다른 분석된 성분(K, Cl, Mn, Zn, Fe)는 아주 작은 농도로 존재한다.
본 연구의 목적에 따라, 치아 결석내 물질의 형태, 화학적 조성과 나노박테리아 사이의 관계를 규명하기 위하여, 도 11에 나탄낸 바와 같이 EDX 결과들을 서로 맞추었다. 이전에, 본 발명자들은 EDX 및 화학 분석으로 나노박테리아의 모든 성장 단계에서 세포외막 위에 생체 인회석이 생성된다는 것을 확인하였다. 푸리에 변환 IR 분광 결과는 카보네이트 인회석으로서의 무기질을 보여주었다.
결론
이 데이타는 치수 결석이 인회석 형성 나노박테리아와 관련이 있음을 나타낸다.
실시예 4: 인체내에서 나노박테리아에 의한 치석 형성 및 석회화
본 실험에서, 본 발명자들은 나노박테리아가 포유류 신체 및 환경적 공급원에서 생체 인회석 구조체의 형성에 대한 결정화 중심(병소)으로 작용할 수 있다는 추가의 증거를 제공한다.
세포 배양 모델에서 나노박테리아에 의해 발생하는 석회화
나노박테리아는 생체외 및 생체내에서 세포 독성이 있다. 48 시간 동안 나노박테리아에 감염된 3T6 섬유모세포는 세포내 이입된 SF-나노박테리아에 의한 변형된 세포 형태를 보여준다(도 12A 및 B). 폰 코사 염색 결과는 감염된 세포에서 세포내 및 세포외 석회화를 보여주었다(도 12C). 크게 감염된 세포는 핵의 비정상, 예를 들면, 거대핵을 보여주었다. 폰 코사 방법으로 염색한 대조 세포에서는 석회화 및 핵의 비정상이 없었다(도 12D).
나노박테리아 및 신장 결석
요도 결석의 결정 성분은 다섯 가지 형태가 있다: 옥살산칼슘, 인산칼슘, 박테리아 관련 물질, 퓨린 또는 시스틴. 대부분의 요도 결석은 2 이상 성분의 혼합물이며, 주요 혼합물은 옥살산칼슘과 인회석과의 혼합물이다. 감염된 결석(스트루바이트 [MgNH4PO·6H2O] 및(또는) 카보네이트 인회석 [Ca10(PO4)6CO3] 결석)내 박테리아의 생존 능력 및 위치를 조사하였다. 많은 수의 박테리아 흔적 및 덩어리가 핵 내지 주변층의 인회석 및 스트루바이트의 결정에 둘러싸인 틈새에 존재한다는 것이 발견되었다. 박테리아 콜로니가 결석의 핵 부분에도 존재한다는 것은 박테리아가 감염된 결석의 성장 뿐만 아니라 초기 결석 형성에도 관여한다는 것을 암시한다.본 발명자들의 연구에서, 나노박테리아(도 13 B 및 D)와 유사한 크기 및 형태의 박테리아(도 13 A 및 C)가 인간 신장 결석의 TEM 결과에서 발견되었다.
본 발명자들은 면역형광 염색 및 배양 방법을 이용하여 60개의 인간 신장 결석을 스크린하여 나노박테리아를 얻었다. 나노박테리아는 TEM에서 그 표면 위에 두꺼운 인회석 외막층을 보여준다(도 14A). 거친 조건(예를 들면, 1N HCl을 이용한 배양)하의 탈염은 본 실험에서 사용한 단일클론 항체에 의해 인식된 에피토프에 영향을 주지 않았다. 나노박테리아 특이적인 단일클론 항체는 모든 탈염된 결석 샘플(도 14C-E) 및 나노박테리아(도 14B)에서 다양한 농도에서 양성의 작은 구균을 보여주었다. 결석에서 상이한 나노박테리아 분포 패턴이 관찰되었는데, 예를 들면, 작은 결석 유닛에서의 중심 및(또는) 주변 위치(도 14E), 또는 랜덤 분포(도 14D)가 있다. 무관한 항원을 검출하는 4개의 상이한 단일클론 항체를 이용한 음성 염색 결과로 염색의 특이성을 추가로 입증하였다.
탈염시키고 스크린한 신장 결석 샘플을 0.2 ㎛ 필터를 통하여 멸균 여과시키고, 상기한 바와 같이 3주 동안 나노박테리아 배양 조건하에서 배양하였다. 10% 농도의 감마 조사된 혈청을 배양 보충물로 이용하였다. 각 실험에서, 감마 조사된 혈청 배양물만 음성 대조로 이용하였고, 성장은 관찰되지 않았다.
흥미로운 것은 본 발명자들이 거친 탈염 단계에도 불구하고 결석 샘플의 90%에서 나노박테리아가 성장하는 것을 발견하였다는 점이다. 게다가, 스크린 전에 결석을 한달 넘게 실온에서 저장했었다. 양성 대조인 탈염된 대조 나노박테리아는 잘 번식하였다(도 15 A 및 B). 훽스트(#33258) 염색을 이용한 핵산 염색은 다른어떤 종류의 박테리아 성장도 배양물에 존재하지 않는다는 것을 입증하였다. 추가 입증을 위해, 결석 샘플로부터 배양한 나노박테리아로 3T6 세포를 감염시키고, 항-나노박테리아 단일클론 항체로 염색하였다. 5개의 상이한 종류의 나노박테리아-세포 상호 작용이 관찰되었다(데이타는 나타내지 않았음).
결론
나노박테리아는 신규하게 나타나고 있는 병원체이고, 퇴적암에 발견되는 작은 무기질 형성 박테리아에 관련될 수 있으며, 이는 의학을 지질학에 연결하는 것이다. 나노박테리아는 생체외에서 생체 인회석을 생성하고 또한 생체내에서도 그러한 것으로 보인다. 인회석은 대부분의 신장 결석 형성을 일으키는 주요 병소라고 여겨지기 때문에, 나노박테리아는 이 과정을 유발하는 우수한 후보자인 것으로 보인다. 실험실 동물의 혈액 순환에 주입된 나노박테리아는 신장 세포에 침투하여 소변 속으로 지나가는 것으로 나타났다. 소변에서, 나노박테리아에 의한 인회석 형성이 더욱 증가한다. 다른 무기질이 그 후에 이 병소에 결합할 수 있다.
실시예 5: 나노박테리아에 감염된 인간 환자의 치료
본 발명자들은 이제 나노박테리아 감염으로 만성 피로 증상을 앓고 있는 35세의 핀란드 여성을 치료하였다. 이 환자는 테트라사이클린 치료를 시작하기 전에 모은 3개의 소변 및 혈청 샘플에서 나노박테리아 양성이었다. 이 여성은 한달 동안 하루에 4번 500 mg의 테트라사이클린 HCl을 복용한 후, 5개월 동안 하루에 두번씩 500 mg을 복용하였다. 이 환자는 한달 치료 후 나노박테리아 음성이었다. 상태가 동시에 호전되었고 매달 받은 샘플에서 그대로 음성이었다.
실시예 6: 나노박테리아의 항생제 감수성
임상 미생물학에서 흔히 실시하는 최소 억제 농도(MIC)를 측정함으로써 항생제 감도 테스트를 수행하였다.
방법
96-웰 플레이트에서 테스트를 수행하였다. 10%의 감마 조사된 태아 소 혈청 (FBS)(약 3 Mrads 투여; 이 처리는 혈청내 나노박테리아를 불활성화시켜 기초 배양액을 멸균시킨다)을 함유하는 DMEM(상업적 세포 배양액)을 기초 배양액으로 사용하였다. 이 성분들은, 예를 들면, Gibco로부터 상업적으로 구할 수 있다. 항생제 원액을 0.2 마이크로미터 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 이어서 원액을 (기초 배양액으로) 순차적으로 희석하여 최종 출발 농도 0.5 mg/㎖ 및 그로부터 (다르게 명시하지 않으면) 1:2의 희석액을 얻었다. 각각의 항생제에 대하여 모든 항생제 희석액을 이용하여 3번의 평행 테스트, 및 추가로 양성 및 음성 대조 실험을 실시하였다. 양성 대조는 항생제 첨가 없이 나노박테리아가 있었고, 음성 대조는 기초 배양액만 있었다. 본 발명자들의 이전 연구에서와 같이(Kajander 및 Ciftcioglu의 문헌[PNAS 95:8274-8279, 1998]), FBS, 다낭성 신장 질병(Polycystic Kidney Disease; PKD)이 있는 환자로부터 얻은 혈청, 및 인간 신장 결석으로부터 나노박테리아를 배양하였다. 100 ㎕의 나노박테리아 접종물 희석액을 음성 대조를 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 포유류 세포 배양 조건(37℃, 5% 이산화탄소, 95% 습한 공기)에서 플레이트를 배양하였다. 650 nm에서의 흡광도 값을 출발점 및 4, 8, 12, 14 일에 ELISA 판독기를 이용하여 기록하였다. 최종 MIC 값(50% 및 90% 억제)을12일 시점에서 계산하였다. 계산은 흡광도 곡선을 기초로 하고 흡광도를 항생제 농도에 대해 플롯하였다.
결과
본 실험의 결과를 하기 표 5에 요약하였다.
선택된 항생제에 대한 MIC 50 및 MIC 90 값의 요약 (mg/ℓ):
화합물 MIC 50 MIC 90
트리메토프림-술파메탁사졸 15 >500
트리메토프림 0.7 5
테트라사이클린 0.3 1.3
독시사이클린 50 80
니트로푸란토인 0.6 1.5
젠타마이신 60 250
네오마이신 16 30
카나마이신 50 200
반코마이신 130 250
암피실린 500
세푸록신 >500
피라진아미드 >500
에탐부톨 >500
메트로니다솔 >500
시프로플록사신 >500
리팜피신 >500
클라리트로마이신 >500
클린다마이신 >500
스펙티노마이신 >500
스트렙토마이신 >500
세팔로틴 >500
에리트로마이신 >500
린코마이신 >500
클로람페니콜 >500
페니실린 >500
폴리믹신 B >500
표 5에 나타난 결과로부터 알 수 있듯이, 트리메토프림-술파메탁사졸 조합은 트리메토프림 단독만큼 효과적이지 않았다(도 24). 이 조합이 요도 감염 치료에 너리 사용되고 있다는 사실에서 볼 때 이것은 다소 놀라운 것이었다. 트리메토프림은 매우 효과적이지만 생체외 테스트에서 정균적일 뿐이었다(도 16). 트리메토프림은 인간 및 동물 치료용으로 매우 가능성있는 항나노박테리아 약물이다.
테트라사이클린은 매우 효과적이고 생체외 테스트에서 살균성이 있었다(도 17, 25). 하루 4 x 500 mg으로 치료한 신장 결석 환자는 초기에 나노박테리아 양성 소변 배양물 결과를 보였지만, 치료 동안 음성 소변 배양물 결과를 보이기 시작했다. 이는 테트라사이클린 치료가 인간 및 동물에서 나노박테리아 박멸에 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다. 전술한 바와 같이, 테트라사이클린은 나노박테리아의 무기질 표면에 결합 및 농축된다. 이는 테트라사이클린이 나노박테리아에 살균 효과가 있는지를 설명할 수 있다. 이러한 살균 효과는 나노박테리아에 특유한 것이다; 다른 박테리아는 정균적 효과만 나타냈다. 따라서 테트라사이클린은 세포 배양물 및 생물학적 생성물로부터 나노박테리아를 제거하는데 가능성있는 약물이다. 약물이 나노박테리아에 결합하기 때문에, 짧은 기간만 노출시켜도 실질적인 항나노박테리아 효과가 있다.
니트로푸란토인은 매우 효과적이지만 생체외에서 정균적이었다(도 18). 이 화합물은 소변 속으로 빨리 제거된다는 이유만으로 요도 감염에 사용된다. 인간 및 동물의 항나노박테리아 치료 외에, 니트로푸란토인은 세포 배양물 및 새울학적 유체 및 생성물에서 나노박테리아의 수를 제거하거나 줄이는데 유용할 수 있다.
독시사이클린도 테트라사이클린 화합물로서 나노박테리아 성장 억제에 효과가 있었다(도 19). 이 화합물은 테스트 조건하에서 안정적이지 못했다. 8일 결과로부터 계산한 MIC 값은 리터당 약 1 mg에서 효과를 나타냈다. 따라서 독시사이클린도 인간 및 동물 치료에 좋은 후보일 것이다. 테트라사이클린이 병리학적 석회화 및 자가면역 질병에 사용되어 종종 눈에 띄게 좋은 결과를 냈다는 것은 특기할 점이다.
아미노글리코사이드 항생제인 젠타마이신, 네오마이신, 카나마이신(도 20-22), 및 스트렙토마이신은 모두 높은 항생제 농도에서 항나노박테리아 정균 효과를 나타낸다. 그러한 농도는 국부 약물 형태, 예를 들면, 스킨 크림, 연고, 경고제 또는 세척액, 및 귀 및 눈 점적제에 존재한다. 이들의 항나노박테리아 효과는 메니에르병 같이 병리학적 석회화와 관련된 속귀 문제 치료에서 젠타마이신 및 스트렙토마이신의 알려진 효과를 신규하게 설명해 주는 것이다.
반코마이신은 비교적 높은 농도에서 나노박테리아에 대해 효과적인 정균제이다(도 23). 그러한 농도는 이 약물을 이용한 국부 치료에 존재할 수 있다. 반코마이신은 위장관 또는 다른 점막면으로부터 흡수되지 않지만, 점막성 박테리아 침입을 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서 반코마이신은 위장관 나노박테리아의 박멸 또는 다른 국부 적용에 효과적일 수 있다.
암피실린은 넓은 범위의 페니실린 그룹 항생제이다. 암피실린은 나노박테리아에 약한 정균 효과를 나타낸다(도 26). 암피실린 및 관련 약물은 매우 높은 투여량으로 투여되고 관찰된 MIC 값을 넘는 수준으로 소변 속으로 농축되기 때문에, 요도 나노박테리아 감염의 치료에 유용할 수 있다.
테스트한 다른 항생제는 리터당 500 mg을 넘는 MIC 값을 갖는 것이 발견되었다. 따라서 이 항생제들은 다중 약물 치료 섭생에서 다른 항생제와 함께 효과적으로 사용될 수 있을지라도, 단일 약물 치료에 사용할 때는 나노박테리아 박멸에 효과적이지 않은 것으로 보인다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 본원에서 클로드로네이트 및 에티드로네이트로 예시된 비스포스포네이트는 이 약물로 치료하는 환자에서 발견되는 농도보다 훨씬 작은 농도에서 나노박테리아에 살균 효과를 나타내는 극히 효과적인 항나노박테리아 약제이다. 이 약물들은 항균 치료에 사용된 적이 없기 때문에, 이것은 미생물학에서 신규한 발견이다. 이 약물들은 암 또는 골다공증에서 골흡수에 효과가 있기 때문에 의학적으로 사용되고 있다. 최근의 간행물은 죽상경화증에서 이들의 허용된 용도에 대한 반대 작용으로서 병리학적 석회화를 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 죽상경화증에는 석회화가 관계하지만, 그 성질은 아직 이해되지 못했다. 본 발명자들은 죽상경화증이 국부 바이러스성 감염을 포함하여, 클라미디아 (Chlamydia) 폐렴균 또는 다른 감염원과 함께 공동 병원균으로서 나노박테리아가 관여하는 부분적으로 전염병일 수 있다는 것을 제안한다.
선택된 Ca 킬레이트제 및 다른 화합물에 대한 MIC 50 및 MIC 90 값의 요약
화합물 MIC 50 MIC 90
클로드로네이트 0.1 mg/ℓ 0.5 mg/ℓ
에티드로네이트 0.1 mg/ℓ 0.5 mg/ℓ
시트르산염 0.2 mM 1 mM
EDTA 0.3 mM 2.5 mM
비타민 K (메나디온) 2 mg/ℓ
비타민 D >0.025 mM
아세틸살리실산 0.5 g/ℓ
비스포스포네이트를 세포 배양물, 생물학적 유체 및 생성물에서 나노박테리아를 제거하는데 사용할 수 있다. 비스포스포네이트는 나노박테리아 인회석에 농축되어 한번의 노출 후에도 나노박테리아를 비교적 빨리 죽인다. 따라서 비스포스포네이트는, 예를 들면, FBS로부터 나노박테리아를 공업적으로 제거하는데 유용할 수 있다. FBS 또는 다른 혈청을 낮은 수준, 예를 들면, 리터당 마이크로그램 내지 그램의 비스포스포네이트에 노출시킬 수 있으며, 이는 혈청을 공업적 또는 연구 목적(예를 들면, 조직 또는 세포 배양)에 사용할 때 나노박테리아를 불활성화시키고 번식을 예방할 것이다. 인간 혈액 및 혈액에서 유도된 생성물, 백신, 세포 배양 생성물 및 생물공학적 생성물을 처리하는데 유사한 접근법을 사용할 수 있다. 처리 시간은 수분 내지 수일일 수 있고 처리 온도는 0-100℃이다. pH 3-10인 용액에서 처리를 수행할 수 있다. 이 약물은 낮은 수준에서 인간이나 동물에 무해하다. 필요하다면, 노출 후, 예를 들면, 투석을 이용하여 혈청이나 생성물로부터 약물을 제거하거나, 인산칼슘 무기질 표면상에 흡수시켜(인회석 및 다른 칼슘 무기질이 그럴 것이다), 예를 들면, 인회석 필터 또는 입자를 이용함으로써 약물을 낮은 수준으로 줄일 수 있다. 비스포스포네이트는 배설되고 소변에 고농축되기 때문에, 신장 결석 같은 나노박테리아 질병을 치료하는데 매우 유력한 약물이다.
시트르산염은 인간 또는 동물의 경구 또는 정맥내 또는 국부 치료에 의해 도달할 수 있는 농도에서 효과적인 항나노박테리아 약제이다. 시트르산염은 칼슘을 킬레이트화한다. 칼슘은 나노박테리아 세포벽의 완전성을 위해 중요한 성분이다. 유사하게, 다른 단쇄 유기산은 약한 칼슘 킬레이트화제이고 나노박테리아 박멸에 유용할 수 있다. 그러한 산에는 락트산, 아세트산 및 그러한 산을 함유하는 천연생성물, 예를 들면, 넌출월귤 쥬스가 포함된다. 후자는 요로 감염을 치료하는데 사용되어 왔다. 하지만, 나노박테리아에 대한 작용의 메카니즘은 인회석 세포벽을 약화시키는 것으로 보이는 반면, 넌출월귤 쥬스는 보통 박테리아가 요로에 부착되는 것을 방지하는 것으로 생각된다. 유사하게, 시트르산염이 자유 칼슘 수준을 낮추기 때문에, 신장 결석의 치료에 시트르산염을 이용한 시도도 있었다. 하지만, 본 발명자들은 이 산들이 항나노박테리아 효과를 나타내는 것을 발견하였다(도 27). 가장 중요한 것은 시트르산염이 나노박테리아를 죽이는데 있어서 강산, 예를 들면, HCl보다 훨씬 더 효과적이라는 점이다. 이후에 다른 단쇄 유기산들도 테스트하였다: 아세트산, 락트산, 및 아스코르브산 모두 배양 테스트에서 나노박테리아에 억제 효과를 나타냈다. 이들의 MIC 50 값은 10-50 mM이며, 이는 항나노박테리아 치료에 대한 가능성을 나타낸다.
EDTA 및 EGTA는 항나노박테리아 효과를 나타내는 칼슘 킬레이트화제이다(도 28). 이들은 2가 양이온(예를 들면, 납) 중독에 사용되는 것으로 예시되는 바와 같이 환자 치료에 사용될 수 있다. 게다가, 그러한 약제는 나노박테리아 성장을 방지하거나 불활성화하는 약물 및 생물공학적 제제에 사용될 수 있다.
비타민 K는 포유류 세포에 해롭지 않은 농도에서 나노박테리아에 독성이 있다. 이 화합물은 인회석에 의해 흡착되어 나노박테리아에 의해 농축된다. 비타민 K는 혈청 또는 생물공학적 생성물의 처리에서 항나노박테리아 약제로 사용될 수 있다. 처리 후에 과도한 량은 유기 용매를 이용한 추출 또는 친유성 필터, 소수성 크로마토그래피 또는 비타민 K와 결합하는 친화성 기질을 이용하는 친화성 크로마토그래피 기술 또는 다른 방법에 의해 제거할 수 있다.
비타민 D는 칼슘 대사를 수정시키고 나노박테리아에 매우 약한 억제 효과가 있다.
아세틸살리실산은 항결핵제로 사용되는 파라-아미노살리실산과 구조적으로 비교적 유사하다. 이 화합물들은 나노박테리아의 세포벽이나 다른 표적에 영향을 준다. 효과는 약하지만 나노박테리아에 대해 가능성있는 약제로 만드는 높은 농도에서 그러한 약제를 사용할 수 있다. 중요한 것은 결핵 치료에 사용되는 파라-아미노살리실산이 유사한 효과를 갖는 것이 발견되었다: MIC 값이 아세틸살리실산과 동일하였다. 이를 단쇄 산 부분을 갖는 다른 항염증 약물에 적용할 수 있다.
치수 결석은 생체 기질에 인회석 무기질을 함유한다. 나노박테리아는 은 또는 구리 화합물로 잘 염색될 수 있다. 게다가, 나노박테리아 배양액에 밀리몰 아래 수준으로 첨가한 은 및 구리 이온은 나노박테리아 성장을 방지하였다. 카테테르 또는 스텐트 같은 표면상의 은 및 구리 부분이나 플레이팅은 나노박테리아 생물막 형성을 방지함으로써 항나노박테리아 효과를 제공할 수 있다. 생체외 테스트에서, 플라스틱형 물질로 만들어진 두개의 상이한 상업적 스텐트 위에 나노박테리아가 격렬하게 생물막을 형성하였다. 이 생물막 형성은 은 또는 구리 염을 배양액에 첨가함으로써 방지되었다.
약물 조합
가장 유력한 항생제인 테트라사이클린을 가장 유력한 비항생제 약물인 에티드로네이트와 조합하여 테스트하였다. 이 약물들의 조합은 단독으로 투여할 때 효과가 없는 농도에서 뚜렷한 항나노박테리아 효과를 나타냈다. MIC 90 값은 상기 조합에 대해 리터당 약 0.01 mg인 반면, 개별 화합물의 MIC 값은 훨씬 더 높았다. 따라서, 상승 효과가 존재하였다. 그러한 효과는 항나노박테리아 효과를 위한 약물 조합을 설계하는데 유용할 수 있다. 구체적으로, 항생제와 비스포스포네이트, 칼슘 킬레이트화제, 약산(예를 들면, 시트르산, 락트산, 또는 아세트산), 또는 항염증 산성 약물과의 조합에 의한 치료는 나노박테리아 감염, 특히 신장 결석 및 침결석 같은 병리학적 석회화 및 결석을 치료하는데 유용하다. 치수 결석에서의 나노박테리아를 치료하기 위해선 플루오르화물을 상기 조합에 포함시킬 수 있다. 상기 약물들은 치약, 구강 세척 또는 치아 접착 코팅의 형태로 투여할 수 있다.
실시예 6: 초음파 처리에 대한 나노박테리아의 감수성
B.Braun Labsonic 2000 초음파 발생 장치를 이용해서도 용액내 나노박테리아의 박멸을 테스트하였다. 샘플인 나노박테리아 오염된 상업용 FBS(태아 소 혈청)를 둥근 원뿔형 용기(175 ㎖ 명목 부피, Nalgene Cat. No 3143)을 이용하여 100 ㎖ 부분에서 최대 출력으로 초음파 처리하였다. 순서는 초음파 발생 장치 제조업자의 지시를 따랐다. 고출력 초음파를 발생하도록 사운드 팁을 선택하였고, 튜브 바닥 1 cm 위에 도입하였다. 샘플의 가열을 방지하기 위해 빙조 위에서 초음파를 1분 펄스로 주고 1분 멈추었다. 실제 초음파 처리 시간은 0, 1, 2, 3, 5 및 10분이었다. 그 후에, 샘플을 표준 나노박테리아 배양시켰다. 5분 및 10분의 초음파 처리에서 얻은 샘플은 배양할 수 있는 유기체가 없음을 보여주었다.
본원에서 본 발명을 여러 가지 구체적인 물질, 절차 및 실시예를 참고로 하여 기술하고 설명하였지만, 본 발명은 특정 물질, 물질의 조합, 및 그 목적을 위해 선택된 절차에 제한된 것이 아니라고 생각된다. 그러한 구체적인 내용의 수많은 변형들을 내포할 수 있으며 당해 기술 분야의 기술자들이 이해할 것이다.

Claims (41)

  1. 나노박테리아를 소독 혼합물에 노출시키는 단계를 포함하는, 나노박테리아로 오염된 물품을 소독하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 소독 혼합물이 증류수 중 50%의 과황산칼륨 및 5%의 술파미노산의 1% 혼합물인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 소독 혼합물이 4.5%의 포름알데히드, 6.8%의 글리옥살, 1.5%의 글리옥실산, 및 6%의 염화디메틸라우릴벤질-암모늄의 3% 혼합물인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 소독 혼합물이 칼슘을 결합 또는 킬레이트화하는 저분자량 유기산인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 산이 시트르산, 아세트산, 락트산, 아스코르브산, 및 살리실산 및 그 아세틸 및 아미노아세틸 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  6. 나노박테리아를 탈염시키고 이어서 물품을 소독 혼합물에 노출시킴으로써 나노박테리아로 오염된 물품을 소독하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 물품을 낮은 pH의 혼합물에 노출시킴으로써 탈염을 달성하는 것인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 낮은 pH의 혼합물이 강산인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 강산이 염산인 방법.
  10. 제 6 항에 있어서, 물품을 효과량의 칼슘 킬레이트제에 노출시킴으로써 탈염을 달성하는 것인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 칼슘 킬레이트제가 EDTA인 방법.
  12. 제 6 항에 있어서, 소독 약품이 에탄올, 글루타르알데히드, 포름알데히드, 하이포아염소산염, 과산화수소, 염산, 수산화나트륨, SDS, Tween 80, Triton X-100, 구아니듐-염산염, 우레아, Virkon, Erifenol, Klorilli, Buranton, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  13. 제 6 항에 있어서, 소독 약품이 에탄올(적어도 70% 용액), 글루타르알데히드(적어도 2% 용액), 포름알데히드(적어도 4% 용액), 하이포아염소산염(적어도 0.5% 용액), 과산화수소(적어도 3% 용액), 염산(적어도 1M 용액), 수산화나트륨(적어도 1M 용액), 도데실황산나트륨(적어도 1% 용액), Tween 80(적어도 1% 용액), Triton X-100(적어도 1% 용액), 구아니듐-염산염(적어도 3M 용액), 우레아(적어도 3M 용액), Virkon(적어도 1% 용액), Erifenol(적어도 1.5% 용액), Klorilli(적어도 1% 용액), Buranton(적어도 3% 용액), 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  14. 제 6 항에 있어서, 121℃ 이상의 온도에서 20분 이상 동안 물품을 오토클레이빙하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 나노박테리아를 탈염시키고 이어서 121℃ 이상의 온도에서 20분 이상 동안 물품을 오토클레이빙함으로써 나노박테리아로 오염된 물품을 소독하는 방법.
  16. 제 6 항에 있어서, 60 cm 이하의 거리에서 1 시간 이상 동안 15 W 이상의 UV-C 램프에 물품을 노출시킴으로써 물품을 자외선에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 나노박테리아를 탈염시키고, 이어서 60 cm 이하의 거리에서 1 시간 이상 동안 15 W 이상의 UV-C 램프에 물품을 노출시켜 물품을 자외선에 노출시킴으로써 나노박테리아로 오염된 물품을 소독하는 방법.
  18. 물품을 3 메가래드 이상의 감마선에 노출시키는 단계를 포함하는, 나노박테리아로 오염된 물품을 소독하는 방법.
  19. 100℃ 이상의 온도에서 1 시간 이상 동안 물품을 가열함으로써 나노박테리아로 오염된 물품을 소독하는 방법.
  20. 나노박테리아를 탈염시키고, 이어서 60℃ 이상의 온도에서 15분 이상 동안 물품을 가열함으로써 나노박테리아로 오염된 물품을 소독하는 방법.
  21. 나노박테리아를 탈염시키고, 이어서 100℃ 이상의 온도에서 30분 이상 동안 물품을 가열함으로써 나노박테리아로 오염된 물품을 소독하는 방법.
  22. β-락탐 항생제, 아미노글리코사이드 항생제, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항생제를 나노박테리아 항생 효과가 있는 양으로 포함하는, 나노박테리아가 없도록 제조된 조직 배양액.
  23. 제 22 항에 있어서, β-락탐 항생제가 페니실린, 페네티실린, 암피실린, 아즐로실린, 배큼피실린, 카베니실린, 실클라실린, 메즐로실린, 피페라실린, 에피실린, 헤타실린, 클록사실린, 디클록사실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 및 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조직 배양액.
  24. 제 23 항에 있어서, 아미노글리코사이드 항생제가 스트렙토마이신, 카나마이신, 젠타마이신, 아미카신, 네오마이신, 파도마이신, 토브라마이신, 비오마이신, 및 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조직 배양액.
  25. 나노박테리아의 성장을 억제 또는 예방하기에 효과적인 양의 항생제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 예방 또는 치료가 필요한 환자에서 생체내 석회화 발달을 예방 또는 치료하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 항생제가 β-락탐 항생제, 아미노글리코사이드 항생제, 테트라사이클린 항생제, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염, 및 이들의 혼합물으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, β-락탐 항생제가 페니실린, 페네티실린, 암피실린, 아즐로실린, 배큼피실린, 카베니실린, 실클라실린, 메즐로실린, 피페라실린, 에피실린, 헤타실린, 클록사실린, 디클록사실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 아미노글리코사이드 항생제가 스트렙토마이신, 카나마이신, 젠타마이신, 아미카신, 네오마이신, 파도마이신, 토브라마이신, 비오마이신, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  29. 제 26 항에 있어서, 테트라사이클린 항생제가 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린, 옥시테트라사이클린, 롤리테트라사이클린, 미노사이클린, 산사이클린, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  30. 제 26 항에 있어서, 항생제를 시트르산염 화합물과 함께 공동 투여하는 방법.
  31. 나노박테리아의 성장을 억제 또는 예방하기에 효과적인 양의 비스포스포네이트를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 예방 또는 치료가 필요한 환자에서 생체내 석회화 발달을 예방 또는 치료하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 비스포네이트가 알렌드론산, 에티드론산, 클로드론산, 옥시드론산, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 비스포스포네이트를 하루에 약 5-20 mg/kg의 투여량으로투여하는 방법.
  34. 제 31 항에 있어서, 비스포스포네이트를 항생제와 함께 공동 투여하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 항생제가 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린, 옥시테트라사이클린, 롤리테트라사이클린, 미노사이클린, 산사이클린, 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 테트라사이클린 항생제인 방법.
  36. 나노박테리아의 성장을 억제 또는 예방하기에 효과적인 양의 항생제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이전에 신장 결석을 앓았던 환자에서 신장 결석의 발달을 예방하는 방법.
  37. 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 나노박테리아에 의해 발생한 상태 또는 질병 상태를 예방 또는 치료하기에 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함하는, 나노박테리아에 의해 발생한 임의의 상태 또는 질병 상태를 예방 또는 치료하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 상태 또는 질병 상태가 만성 피로 증상인 방법.
  39. 액체를 초음파 처리하는 단계를 포함하는, 액체 물질로부터 나노박테리아를박멸하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 액체가 초음파 처리 동안 냉각되는 방법.
  41. 제 39 항에 있어서, 상기 액체를 약 5분 이상 동안 초음파 처리하는 방법.
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