CN103402509A - 包含过氧α-酮羧酸的组合物及其生产方法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含过氧α-酮羧酸的组合物及其使用方法。在一些特定实施方案中，本发明的组合物还包含α-酮酯。

Description

包含过氧α-酮羧酸的组合物及其生产方法和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年2月17日提交的美国临时申请No.61/444,111和2011年12月2日提交的美国临时申请61/565,986的优先权，其全部通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及包含过氧α-酮羧酸的组合物及其使用和生产方法。在一些特定实施方案中，本发明的组合物还包含α-酮酯。
背景技术
皮肤是机体的最大器官，并且充当针对外界的主要保护性屏障。因此，对该器官的任何物理性破坏(即，伤口(wound))都必须被快速且高效地修复以恢复组织的完整性和功能。适当的伤口愈合经常被破坏性结果(例如，严重的病态、截肢或死亡)所削弱。在人和动物中，皮肤对机械损伤、化学危害和细菌侵染提供保护，这是因为表皮较厚并且覆盖有角蛋白。来自皮脂腺和汗腺的分泌物也有益于该保护性屏障。在破坏皮肤的保护性屏障的损伤事件中，机体触发称为伤口愈合的应答。
伤口愈合的经典模型一般分为连续而重叠的四期：(1)止血期、(2)炎性期、(3)增生期和(4)重塑期。止血期涉及血小板(凝血细胞)形成纤维蛋白凝块以控制活动性出血。炎性期涉及吞噬细胞迁移至伤口以杀伤微生物并释放后续信号因子从而参与增生期中所涉及的细胞迁移和分裂。增生期涉及用于血管发生的血管细胞产生、成纤维细胞分泌胶原蛋白和纤连蛋白从而形成胞外基质，以及上皮细胞再形成外部表皮。另外，肌成纤维细胞(myofibroblast)使伤口变得更小。最后，胶原蛋白重塑，并且不再需要的细胞通过程序性细胞死亡(即，凋亡)而被除去。
伤口愈合的过程可分为两个主要期：早期和细胞期。早期包括止血，其涉及血管收缩、血小板栓对破裂(break)的暂时性阻塞、以及血液凝固、或者形成使孔封闭直至组织修复的凝块。早期还包括产生刺激以引起诱发炎症所需的细胞应答。在炎症期，白细胞被血小板衍生生长因子(PDGF)吸引到伤口部位，免疫系统的这些细胞参与机体针对感染性疾病和异物(foreign material)的防御。
目前，存在18种参与炎性期的其他已知蛋白质，它们相互作用以调节该应答。例如，IL-4、IL-10和IL-13是B淋巴细胞的强效激活剂。但是，IL-4、IL-10和IL-13也是强效抗炎剂。吞噬细胞进行吞噬然后消化细胞碎片和病原体并且刺激淋巴细胞和另一些免疫细胞以针对该伤口区发生应答。一旦入侵微生物被控制住，则皮肤通过协调配合以修复损伤的生化事件的复杂级联而进入增生和重塑阶段。这涉及在数小时内形成痂(scab)。所述痂暂时地恢复表皮的完整性并限制微生物进入。在形成痂之后，基底层的细胞开始通过有丝分裂进行分裂并迁移到所述痂的边缘。损伤一周之后，伤口的边缘通过收缩而被拉到一起。当损伤广泛并且涉及下方的收缩性结缔组织之尺寸收缩时，收缩是愈合过程的重要部分，这使伤口边缘朝向彼此。在严重损伤中，如果上皮细胞迁移和组织收缩不能覆盖伤口，则可能需要将受损皮肤的边缘缝合在一起或者甚至用皮肤移植物代替失去的皮肤来恢复皮肤。由任意这些伤口愈合过程的破坏(breakdown)引起的该愈合过程的干扰将引起慢性伤口。取决于伤口的严重程度，伤口的增生期和最终成熟从而完成痂组织可经历数天至数年。
需要继续研究急性伤口、慢性伤口和烧伤伤口的伤口愈合过程中的分子事件。已发现，伤口愈合表现出极其复杂的一系列生化事件，其涉及细胞间事件和细胞内事件的受调节的级联。在伤口愈合研究中迅速发展的领域之一基于细胞生长因子和这些因子用于治疗伤口的用途。细胞水平的生化应答是涉及不同细胞功能(其包括能量产生)、结构蛋白质、生长因子和蛋白酶之间复杂相互作用的过程。用已知的细胞生长因子来治疗伤口具有通过刺激血管发生、细胞增殖、调节胞外基质的产生和降解、以及将炎性细胞和成纤维细胞吸引至伤口所涉及的细胞过程来帮助愈合伤口的潜力。虽然已发现了许多涉及伤口愈合的生化反应，但是在这一点上尚未完全理解伤口愈合的整个过程。
目前，许多伤口治疗方案涉及使用分子刺激剂，例如核苷酸、多糖和/或蛋白质(一般指生长因子)和抗氧化剂。这些细胞分子起到在伤口中引发细胞应答、基质应答、血管发生应答和另一些应答以促进愈合过程的作用。因为在伤口愈合过程中有许多代谢事件发生，所以一般认为常规的伤口愈合方法均未涵盖高效且安全的伤口愈合的解决方案。许多常规伤口愈合治疗的一些限制是无法高效地将这些化合物中的一些递送至伤口愈合中所涉及的深处的伤口细胞，无法用卫生消毒剂(sanitizer)和/或抗生素解决感染控制问题，和/或可负担得起的治疗计划的成本抗辩(costjustification)以及与抗炎药物的竞争。
另一些皮肤伤口涉及烧伤。严重烧伤是相对常见的损伤，就患者存活和恢复而言，其需要多学科治疗。估计在世界范围内，每年有大于30,000人死于与火相关的烧伤。还有更多人因烧伤而严重损伤、残疾或毁容。在过去的15年中，由于流体复苏、伤口清洁、皮肤置换(skin replacement)、感染控制和营养支持，在烧伤的医疗护理方面取得了重大进步。这些变化主要缘于使用早期烧伤伤口移动、早期充分营养、以及使用使血液和热的损失最小化的外科技术。因为烧伤的现代治疗已大大改进，所以脓毒症已成为烧伤后死亡的主要原因。目前，多抗生素抗性细菌是由烧伤受害者的脓毒症引起的大量死亡的原因，认为其病因学是由于伤口中的抗生素抗性细菌和生物膜形成以及外来的医院内感染。估计由于由黑曲霉(Aspergillus niger)感染引起的脓毒症在老年烧伤患者中占75％的死亡率。用于烧伤的常用抗菌治疗剂硫氢化银(silver sulfanide)不能杀伤烧伤伤口中的这些孢子，因此目前没有针对该问题的有效治疗。
伤口愈合的障碍包括缺氧、感染、碎片和坏死组织的存在、炎性药物的使用、维生素或矿物质或一般营养物的饮食缺乏、肿瘤、环境因素和代谢紊乱(例如糖尿病)。认为愈合急性伤口的主要障碍是缺氧、感染、伤口碎片和/或抗炎药物。护理伤口的典型标准一般涉及伤口清创、抗生素的敷用和施用(如果发生感染的话)。
虽然在伤口治疗方面取得了许多进步，但是仍持续需要新的用于治疗伤口的组合物。随着药物抗性脓毒症感染病例的增多，亟需可有效地治疗药物抗性脓毒症感染的组合物。
发明概述
本发明的一些方面提供包含α-酮酯与过氧α-酮羧酸(peroxyα-ketocarboxylic acid，PKCA)之混合物的组合物。在一些实施方案中，本发明的组合物还包含α-酮酸。在这些实施方案中，在一些实例中，所述α-酮酸是所述PKCA的脱羧α-酮酸。在另一些实施方案中，所述α-酮酯包含烷基α-酮酯。在这些实施方案中，在一些实例中，所述烷基α-酮酯是烷基丙酮酸酯。在另一些实施方案中，所述α-酮酯与所述PKCA的摩尔比为约0.02∶1至约10∶1。在另一些实施方案中，所述PKCA包含过氧α-酮丙酮酸(peroxy α-ketopyruvic acid)、过氧α-酮丁酸(peroxyα-ketobutyric acid)、过氧α-酮戊酸(peroxyα-ketovaleric acid)、或其混合物。在另一些实施方案中，所述组合物配制为凝胶、液体、洗剂、皮肤贴剂、冲洗凝胶(irrigation gel)、喷雾剂、或其组合。
本发明的另一些方面提供用于降低表面上微生物之量的方法。这样的方法通常包括使表面与包含有效量的α-酮酯与过氧α-酮羧酸之混合物的组合物相接触。在一些实施方案中，所述微生物包含营养性细菌(vegetative bacteria)。在另一些实施方案中，所述微生物包含芽孢细菌芽孢、分枝杆菌、革兰氏阴性细菌、营养性革兰氏阳性细菌、或其组合。
本发明的另一些方面提供用于降低基质(substrate)上的感染性营养性细菌之数目的方法。这样的方法一般包括使基质与包含有效量的α-酮酯与过氧α-酮羧酸之混合物的组合物相接触。
本发明的另一些方面提供用于在哺乳动物中预防和/或减轻由哺乳动物与受细菌感染之基质相接触引起的细菌相关疾病的方法。这样的方法包括使基质与包含有效量的α-酮酯与过氧α-酮羧酸之混合物的组合物相接触。
在本发明的另一些方面中提供用于在对象中治疗伤口的方法。这样的方法包括向对象的伤口区局部施用包含过氧α-酮羧酸的组合物。在一些实施方案中，这样的组合物还包含α-酮酯。
本发明的另一些方面提供用于在对象中预防由创伤引起之脓毒症的方法。这样的方法包括向对象的伤口局部施用包含有效量的过氧α-酮羧酸的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含α-酮酯。
附图简述
图1是示出PKCA化合物对艰难梭菌(Clostridium difficile)芽孢之效力的图。
图2是示出多种浓度PPA对生物膜形成进行处理之结果的照片。
图3是示出多种浓度PPA-EP对生物膜进行处理之结果的照片。
图4是示出多种浓度PPA和PPA-EP对清除所形成生物膜之结果的照片。
图5是示出不同浓度PPA对FBS中MRSA之效力的结果的图。
图6是示出不同浓度PPA对PBS中MRSA之效力的结果的图。
图7是示出不同浓度PPA对PBS中鲍氏不动杆菌(A baumannii)之效力的结果的图。
图8是示出不同浓度PPA对卵黄中假单胞杆菌(Pseudomonas)之效力的结果的图。
图9示出了在多种不同大小的可溶性膜中配制的本发明组合物。
图10示出用不同浓度PPA可溶性膜处理的血液琼脂板。
发明详述
伤口愈合拮抗物：感染
创伤性伤口感染
自然愈合的开放性伤口通常被皮肤菌群(例如，凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci))所污染。该菌群的分布和密度取决于多种因素，包括但不限于年龄和环境因素(例如温度和湿度)，其通常随地理区域而改变。由创伤引起的伤口通常被存在于发生创伤处表面上的皮肤微菌群和环境微菌群所污染。虽然并不通用，但是每克组织≥105个细菌的微生物负载被认为是感染。低于这些微生物水平时，使用术语“菌落”来描述伤口表面上非复制细菌的存在，这不引发显著的宿主免疫应答。
伤口感染一般被定义为伤口中微生物的入侵和增殖，其导致组织损伤并且诱发宿主免疫反应。不受任何理论的约束，一般认为当伤口中的微生物群体超过105个时，微生物的存在刺激显著的宿主免疫应答，形式为伤口愈合过程中的强炎性应答期。如果在早期未处理大体感染并且伤口中存在多药抗性生物(multi-drug resistant organism，MDRO)，则可发生炎性免疫应答的并发症，例如脓毒症、随后的病态(subsequent morbidity)、随后的截肢的慢性伤口、或者甚至死亡。
再次不受任何理论的约束，认为导致由感染引起的伤口愈合并发症的因素中的一些包括但不限于先前或目前的抗生素使用史、受感染的留置静脉内导管、先前的抗生素抗性细菌感染史、削弱或受损的免疫系统、以及连续的开放性伤口。目前，认为参与皮肤和软组织感染的最常见的病原体是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如，甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌或MRSA)、肠球菌属(Enterococus sp)、凝固酶阴性葡萄球菌属、大肠杆菌和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。这些细菌中的大多数是多药抗性生物(MDRO)。真菌孢子曲霉属(Aspergillus sp.)(其对现有治疗剂具有抗性)被认为是烧伤之后的脓毒症和死亡的首要原因。金黄色葡萄球菌和A组葡萄球菌属被认为是医院设置之外皮肤感染涉及最多的病原体。伤口感染通常导致长期护理，这对于患者、其家庭和医疗设施来说是重大的损失。
慢性伤口感染
估计在丹麦和美国有1％至2％的人群患有未愈合伤口。参与慢性伤口感染的主要微生物包括多种兼性厌氧菌，例如葡萄球菌、棒状杆菌(Corynebacterium)、假单胞菌、沙雷氏菌(Serratia)、拟杆菌(Bacteroides)；和厌氧菌普氏菌(Prevotella)、消化链球菌(Peptostreptococcu)和卟啉单胞菌(Porphyromonas)。在一些情况下，微生物形成生物膜，即，微生物的聚集体，其中细胞在表面上彼此贴附。形成生物膜的主要感染性生物中的两种是金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。生活在生物膜中的细菌受到针对抗生素和另一些抗微生物剂的非常良好的保护。除避免杀生物剂的根除以外，形成生物膜的细菌(例如，铜绿假单胞菌)可通过上调合成可除去宿主防御细胞(例如，多形核嗜中性白细胞(polymorphonuclear neutrophilic leukocyte，PMN))的分子来躲避机体的防御机制。
生活在生物膜中的细菌受到针对抗生素和另一些抗微生物剂的非常良好的保护。通常，如果在4周之后，伤口区未示出20％至40％的降低，则认为伤口是慢性的。一些人将慢性伤口定义为在3个月内未愈合的那些。伤口中微生物生物膜的形成是目前公知的。伤口中有许多细菌(高达95种)用保护性基质继续产生成熟生物膜并且继续成熟以增强针对抗微生物治疗方法(包括局部抗生素治疗)的存活。当现有伤口被无效地处理时，该伤口可发展为慢性伤口，其大小和严重程度可继续提高。
选择性手术的医院内延迟或手术之后的长期住院治疗与感染性并发症和死亡率的升高相关。近年来，医院中的医院内细菌感染发生率显著升高。据估计，外科手术之后的医院内感染或伴发性伤口每年每个医院发生大于5,000例。估计这样的医院内感染的医疗护理成本为接近100,000.00美元/例并且仍在升高。认为这些感染主要是由于创伤患者的伤口暴露于另一些受污染患者、受污染的手术室表面、受污染的医疗装置和/或医疗工作者、患者和访客的手提物品(hand carriage)。
如上所述，认为医疗护理设施中最成问题的微生物是抗生素抗性细菌，例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素抗性肠球菌(VRE)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、和细菌芽孢(例如艰难梭菌)。认为艰难梭菌可在医院环境中坚持数月，并且营养性形式可被某些杀菌剂(例如去污剂和次氯酸盐)诱导为芽孢形式。来自这些特定微生物的医院获得性感染在20年中使患者的花费提高了约60％并且使死亡率从百万分之5.7升高至百万分之23.7。伤口患者(尤其是慢性伤口患者)无疑是获得、携带和传播抗生素抗性生物的高风险组。交叉污染风险(医院内感染)包括患者暴露于患者、对被污染的无生命对象的操作、由健康护理人员的传播或携带、抗生素的长期使用(导致细菌抗性)和医院或疗养院中长时间停留，这提供了感染的可能性。事实上，一些研究已示出，由选择性手术的医院内延迟引起的感染在1天之后提高了6.68％并且在10天之后提高了20.56％。
伤口消毒处理
已采用了若干策略来对抗与伤口相关的显著感染性并发症的发生率。但是，到目前为止，这些策略主要限于改进外科无菌术、外科技术和手术期间全身性抗生素的施用方案和局部抗生素冲洗操作。医院正持续地开发新的方法，包括真空密封敷料、透明膜敷料、用抗微生物剂冲洗、使用端口(port)和帽(cap)、使用新的药剂(例如次卟啉(deuteroporphyrin)、γ干扰素(IFN-γ)、磺胺嘧啶银(silver sulfadiazone)水溶性凝胶)、地磁治疗和自然疗法例如小米油(milliacynic oil)和溶菌酶。遗憾的是，这些创新中只有少数对感染和致死率具有重要影响。但是，这些有效方法中的至少一些还示出具有细胞毒性问题。事实上，大多数新方法涉及将一些膏剂或敷料形式的抗微生物化合物递送至对其有抗性的多种伤口病原体。此外，这些治疗剂本身连续产生抗生素抗性细菌，这将不利地影响以后对抗抗性细菌的治疗，所述抗性细菌例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素抗性肠球菌(VRE)和鲍氏不动杆菌。据估计，鲍氏不动杆菌占美国重症监护设施中革兰氏阴性感染的6％，已报道死亡率高达54％。MDR不动杆菌的分离从1993年的6.7％升高至2004年的29.9％，这突显了对更新和更好的药物的需要。在所测试的1,040种抗生素中，只有20种(1.92％)表现出显著的抗微生物活性，并且只有5种化合物表现出对更强抗性的BAA-1605鲍氏不动杆菌的活性。当今，认为在世界的大多数地区中，MRSA和艰难梭菌是医院内感染的首要原因。在2003年，金黄色葡萄球菌是与皮肤和软组织感染相关的首要病原体。在最近的20年中，MRSA已从几乎仅为医院获得性病原体(hospital-acquired pathogen，HA-MRSA)转变成社区获得性病原体(community-acquired pathogen，CA-MRSA)。
伤口愈合和伤口的“良好”护理与微生物污染的局部预防和控制同义。当今主要的疗法涉及抗菌剂(antiseptic)局部施用的应用或抗生素的全身应用和局部应用。一般性观点是向伤口局部施用抗生素相对于使用另一些抗菌方法来说没有优势，并且伤口可通过在伤口中产生具有抗性的极端细菌(sovereign bacteria)而提高创伤愈合的风险。在慢性创伤和烧伤治疗中广泛地使用用于抗感染治疗的基于银的敷料伤口。这些中有若干是市售的，例如ActicoattTM、Foam、
Figure BDA0000367184110000083
Silver、
Figure BDA0000367184110000084
SSD。遗憾的是，这些含银的敷料不杀伤芽孢或生物膜并且需要长时间暴露(其可导致对患者自身细胞的细胞毒性)。细胞毒性作用将部分地解释使用某些局部银敷料之后延迟的伤口愈合或伤口上皮形成之抑制的临床观察结果。
当前FDA规定化合物需要能够破坏所有微生物(包括所有细菌芽孢)才能评定为消毒剂/灭菌剂。如果用于具有较短暴露时间的应用中，则消毒剂必须破坏所有病毒、营养性细菌、真菌、分枝杆菌和一些(但非全部)细菌芽孢。另外，消毒剂必须能够在复合物蛋白质基质(例如伤口环境中的那些)中满足这些杀死微生物的要求。如果化合物不满足这些标准，则其可登记为防腐剂，如果其可杀伤3log的特定细菌种属的话则这样标记。如本文所使用的，术语“杀伤”指降低微生物的量或水平。通常而言，术语“杀伤”指在15分钟之内、通常在10分钟之内、通常在5分钟之内、并且更通常在1分钟之内使微生物降低至少3log、通常为至少4log、通常为至少5log、并且更通常为至少6log。如本文所使用的，术语“x log”指10x。例如，如果陈述组合物杀伤6log的微生物，则意味着处理之后存在的微生物的量为微生物初始量(即，预处理或相对于对照)的1/106或更小。
可得的多种组合物(例如，手用卫生消毒剂(hand sanitizer))声称可杀伤表面和皮肤上的99.9％的MRSA和另一些营养性细菌以及一些芽孢。但是，受污染表面可包含数以百万计的细菌，其中的一些可包含在复合基质(例如，血滴)中，因而使其难以杀伤。另一些类型的细菌(例如，枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis)在用于插入机体的内诊镜和另一些医疗装置的表面上形成生物膜，其显著地降低大多数消毒剂的抗菌活性。这些消毒剂通常称为卫生消毒剂并且声称杀伤所存在细菌的99.9％。但是，通常而言，这些卫生消毒剂均无法杀伤所存在的所有细菌，尤其是细菌以密集群体(high population)存在、包含在复合基质中、作为生物膜存在、或以营养性形式或芽孢形式存在时。
目前，在市场上有数种用于治疗或减轻伤口中细菌感染的局部抗菌剂。这些包括Betadine(其为多种化合物(包括碘)的混合物)、聚盐酸己双胍(polyhexanide)
Figure BDA0000367184110000091
氯己定(chlorhexidine)、过氧化氢等。大多数抗菌剂不适于开放性伤口的持续治疗，因为他们阻止伤口愈合，这是由于其对角化形成细胞和成纤维细胞的细胞毒性作用。一般而言，现有的局部抗菌剂具有有限的杀菌作用(例如，在30分钟暴露中细菌仅降低3log)并且几乎所有都具有一些细胞毒性，该细胞毒性随浓度和施用时间而改变。硝酸银溶液术语抗菌剂类并且其细胞毒性是公知的。
当今，主要使用5种高水平的消毒剂/灭菌剂。这些包括戊二醛、邻苯二甲醛(orthopthalaldehyde)、次氯酸盐、过氧化氢和过氧乙酸。醛一般为高毒性，并且花费非常长的时间影响≥99.9999％(或6log杀伤)的芽孢。当今使用的最成功的高水平消毒剂看来是氧化剂，例如次氯酸盐、过氧化氢和过氧乙酸。认为通过氧化进行消毒的反应性优点是对微生物的所有组分(包括蛋白质、脂质和DNA)造成非特异性自由基损伤。因此，实际上，在溶液浓度足够高时，不存在微生物对氧化的抗性。安全且无毒浓度的过氧化氢不能杀伤微生物的密集群体。次氯酸由PMN通过髓过氧化物酶介导的氯离子的过氧化而形成，它容易在生理pH被亚硝酸盐(其为细胞一氧化氮(NO)代谢的主要终产物)中和，从而降低次氯酸的杀菌作用。至少部分由于该原位中和，已显示次氯酸不如磺胺嘧啶银有效(一种常用的局部伤口卫生消毒剂)。
一般性微生物感染
由机体的正常灭菌或物理屏障部分(例如，皮肤)的微生物入侵引起的全身性疾病称为“脓毒症”。因此，灭菌或物理屏障机体部分的任何开口(即，伤口)必须被迅速且有效地修复以恢复组织完整性和功能。适当的愈合经常被可导致严重病态以及可能致死的破坏性结果(例如，脓毒症)所削弱。一些研究表明，在美国，每年每1000人群体中有3例脓毒症发生，或者每年有约750,000例脓毒症。
非常少的病原体(寄生虫(例如疟疾)除外)首先在血流中扩增。因此，脓毒症一般源于宿主屏障系统完整性的缺口(breach)，和病原体直接穿透进入血流，产生脓毒状态，所述缺口为物理缺口(例如，对皮肤和完整解剖学系统的破坏或损伤)或免疫缺口(免疫系统有效识别和根除感染性微生物的故障)。
目前，没有迅速且可靠的技术用于区分全身性炎症的微生物与非微生物原因，并且没有用于容易地鉴定致病生物快速技术。虽然可获得对由伤口引起的全身性炎症之原因的迅速鉴定，但是广谱消毒剂和伤口愈合将允许伤口愈合而无需感染性生物的立即且明确的鉴定。
因此，需要这样的组合物：其具有广谱消毒剂和/或伤口愈合活性以降低由对象中伤口引起之脓毒症的发生率。
本发明的组合物
本发明的一些方面基于本发明人的令人惊讶且出人意料的发现：过氧α-酮羧酸(PKCA)可用于治疗伤口、促进伤口愈合，并且具有抗微生物特性。
用于本发明的合适PKCA的代表性实例公开于2009年11月13日提交的共有美国专利申请No.12/618,605和2010年4月15日提交的共有美国专利申请No.12/760,940以及2011年2月17日提交的共有美国临时专利申请No.61/444,111中，其全部通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含α-酮酯与PKCA的混合物。α-酮酯是酯类化合物，其中该分子的α-位(即，2-位或与酯官能团相邻的位)是羰基。在一些实例中，α-酮酯是烷基α-酮酯。烷基α-酮酯指其中酯官能团是烷基酯的α-酮酯。在这些实例中的一些情况中，烷基α-酮酯是乙基α-酮酯或烷基丙酮酸酯。在一个特定实例中，α-酮酯是丙酮酸乙酯。
令人惊讶且出人意料的是，本发明人发现α-酮酯本身具有抗微生物活性。此外，混合物中α-酮酯的存在增强PKCA的组织穿透性。在一些实例中，α-酮酯还消除细胞对病原体的毒性抗炎应答。更令人惊讶且出人意料的是，本发明人发现α-酮酯与PKCA的组合提供协同抗微生物活性以及对伤口治疗/愈合的协同作用和组织的协同穿透。
发现本发明的包含PKCA或PKCA与α-酮酯之混合物的组合物同时消毒、刺激免疫细胞代谢、降低细胞缺氧以及促进早期伤口清创，同时保护免受DNA损伤。在一些实施方案中，本发明的组合物还包含过氧化氢和相应PKCA的α-酮羧酸的羧酸根阴离子。认为这些化合物与PKCA平衡存在，因此期望它们存在于混合物中并发挥至少一些活性以根据其各自的代谢能力和细胞能力为伤口消毒以及使伤口愈合。不受任何理论的约束，认为α-酮酯(例如，所使用的PKCA的α-酮酯)的存在减轻通常由死亡细菌的副产物引起的细胞炎症。
已对丙酮酸酯PKCA化合物的消毒能力进行了测试并且示出为如由环保署(Environmental Protection Agency，EPA)所定义的消毒剂/灭菌剂。该测试是ASTM-E2197方法，其需要在10分钟或更短的时间内于非常高蛋白质的环境中杀伤不锈钢表面上的6log艰难梭菌的证据。不希望受到任何理论的约束，认为PKCA的抗微生物特性是由于过酸(peracid)官能团，因此期望PKCA消除或最小化微生物产生抗性的任何可能性。可存在于本发明组合物中的另一些化合物(例如，α-酮酯、过氧化氢、和/或羧酸等)可具有伤口愈合特性，但是它们本身还可具有抗微生物特性。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含PKCA和任选的PKCA的相应的α-酮酸和/或此类α-酮酸的阴离子。例如，如果过氧丙酮酸(即，式HOOC(＝O)C(＝O)CH3的化合物)是组合物中的PKCA，则所得组合物还可任选地包含丙酮酸和/或丙酮酸的阴离子。在下文中将该特定的PKCA组合物称为过丙酮酸(perpyruvic acid)或PPA。类似地，在本文中，有时将包含过氧α-酮丁酸作为PKCA的组合物简单地称为POKBA，并且在本文中，有时将包含过氧α-酮戊酸的组合物简单地称为POKVA。
在本发明的另一些方面中，本发明的组合物由PKCA、α-酮酯和任选的以下中的一种或更多种组成：PKCA的母体羧酸和/或其盐、PKCA的脱羧衍生物、以及过氧化氢。术语“PKCA的母体羧酸”指与PKCA具有相同的数目和碳原子连接但过氧(-OOH)部分被羟基(-OH)部分所取代的羧酸。术语“PKCA的脱羧衍生物”或“脱羧PKCA”或其他类似的术语在本文中可互换使用并且指其中末端过氧羧酸部分已例如通过水解除去的化合物。例如，过氧丙酮酸(HOOC(＝O)C(＝O)CH3)的脱羧衍生物指乙酸(HOC(＝O)CH3)。
α-酮酸阴离子
研究表明，在伤口的炎性期，细胞释放细胞毒性氧化剂。这些氧化剂被称为活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)并且包括单线态氧(singletoxygen)、过氧化物阴离子、过氧化氢、羟自由基(hydroxyl radical)和一氧化氮(NO)。认为ROS的主要功能之一是杀伤微生物污染。当对象遭受伤口时，多形核白细胞(PMN)聚集在伤口部位并释放ROS。认为ROS只参与杀伤伤口中的细菌。但是，如果伤口长时间暴露于这些ROS(例如，由于由感染引起的炎症)，则由于ROS对健康细胞的毒性使伤口愈合延迟。
通常而言，在损伤之后，伤口中所需的氧超过供给(缺氧)几天，并且α-酮丙酮酸酯以其针对缺氧的保护特性而著称。已示出丙酮酸酯以多种代谢方式改善对缺氧的适应性应答和抗性。例如，丙酮酸酯降低由从死细菌细胞膜释放脂多糖(LPS)(炎症)引起的氧化应激(氧化性分子的过量产生)。
认为丙酮酸酯是缺氧细胞能量的主要来源之一。还认为丙酮酸酯减轻缺氧条件期间的DNA损伤。乳酸是有氧糖酵解和丙酮酸酯还原的终产物，它可在细胞代谢、局部代谢和全身代谢中发挥作用。于是，缺氧细胞中的丙酮酸酯通过用于伤口愈合中的胶原蛋白沉积和血管发生的乳酸信号通路变为另一些细胞功能的间接代谢贡献者。此外，已示出丙酮酸酯和乳酸一起在用于伤口缺氧的血管发生应答的VEGF上调中发挥作用。
过氧化氢
在由伤口中的PMN细胞产生的所有细胞毒性氧化剂(例如单线态氧、过氧化物阴离子、羟自由基、一氧化氮和H2O2)中，已示出只有H2O2具有足够长的半衰期以在细胞的培养基中累积。还示出H2O2成为用于在某些条件下刺激伤口愈合过程所必需的化合物的代谢启动物。例如，已表明H2O2刺激人巨噬细胞释放高水平的血管内皮生长因子(VEGF)。还示出过氧化氢刺激伤口的再上皮化、嗜中性粒细胞的伤口凝固、以及单核细胞黏附至胞外基质和内皮细胞。另外，过氧化氢作为信使在刺激伤口愈合所需的生长因子中发挥作用，所述生长因子例如血小板衍生生长因子(PDGF)、组织生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。
已知额外添加高水平的H2O2以降低微生物感染对细胞具有毒性，因此不推荐连续使用。但是，细胞本身产生非常小的胞外H2O2浓度梯度。在本发明的一些实施方案中，本发明的组合物包含杀伤6log(即，106)细菌所需的足够量的H2O2，例如微摩尔浓度，这也是足以刺激伤口愈合的浓度。
α-酮酯
在一些方面中，本发明的组合物包含α-酮酯。α-酮酯是其中分子的α-位(即，2-位或与酯官能团相邻的位)是羰基的酯化合物。在一些实施方案中，α-酮酯是烷基α-酮酯。烷基α-酮酯指其中酯官能团是烷基酯的α-酮酯。在这些实施方案的一些实例中，烷基α-酮酯是乙基α-酮酯。在一个特定实施方案中，α-酮酯是丙酮酸乙酯。但是，应理解，本发明的范围不限于任何特定α-酮酯。本发明人发现α-酮酯净化PKCA的不良气味。不受任何理论的约束，还认为α-酮酯(例如，丙酮酸乙酯)通过稳定存在于溶液中的过氧化氢来稳定PKCA溶液。
在本发明的组合物中，相对于PKCA，α-酮酯的存在量通常为约0.1mol％至约20mol％、通常为约0.25mol％至约15mol％、并且更通常为约1mol％至约5mol％。或者，在本发明的组合物中α-酮酯的存在量为PKCA的按重量计约1％至按重量计约30％、通常为按重量计约1.5％至按重量计约15％、以及通常为按重量计约5％至按重量计约12％。
效用
常规地广泛使用的伤口抗菌剂并不经常杀伤促进伤口愈合所需之充足量的细菌或芽孢，并且在长期暴露时常常具有细胞毒性。一些研究已示出，用抗生素溶液清洗开放性骨折伤口与使用无菌肥皂溶液相比未提供显著的优势，并且实际上可提高细胞毒性并且抑制伤口愈合。并且使用局部和全身抗生素治疗有时可导致多药抗性生物。
目前，没有可用于治疗伤口的具有有效的广谱抗微生物活性和有效的增强的愈合特性这二者的充分合适的组合物。存在用伤口愈合刺激剂然后用细胞毒性抗菌剂或抗生素进性的治疗或者用伤口愈合刺激剂与细胞毒性抗菌剂或抗生素联合治疗。虽然可以将抗微生物化合物(例如，抗微生物核苷酸、多糖和/或蛋白质(一般称为生长因子))与抗氧化剂组合用作分子刺激剂用于伤口愈合，但是抗微生物化合物的生产成本比较昂贵并且在抗氧化剂的存在下难以稳定。
本发明的组合物是相对低成本且稳定的广谱抗微生物组合物，其基本没有细胞毒性，并且增强伤口愈合。另外，本发明的组合物有效对抗生物膜，例如在慢性伤口中形成的那些。本发明人开发了一系列PKCA用作营养性细菌、芽孢和生物膜的高水平消毒剂/灭菌剂，并且描述于上述通过引用并入并且共同转让的专利申请中。下表A举例说明了一种特定PKCA化合物在可接受被称为消毒剂和灭菌剂的浓度或量杀伤(即，降低其量或水平)营养性细菌和芽孢的能力。
表A.PPA的抗微生物活性
微生物 Log10杀伤 时间 浓度
铜绿假单胞菌 ≥6.0 ≤1分钟 500ppm
MRSA ≥6.0 ≤15秒 100ppm
鲍氏不动杆菌 ≥6.0 ≤15秒 100ppm
白色念珠菌(Candida albicans) ≥6.0 ≤15秒 100ppm
艰难梭菌芽孢 ≥6.0 ≤5分钟 1,500ppm
枯草芽胞杆菌生物膜 ≥5.0 ≤10分钟 4,000ppm
流感病毒 ≥5.0 ≤1分钟 300ppm*
类鼻疽伯克氏菌(Buckholder pseudomallei) ≥6.0 ≤1分钟 50ppm
曲霉孢子 ≥6.0 ≤10分钟 3,500ppm
＊较低浓度未测试
前三个是抗生素抗性细菌。
鲍氏不动杆菌对大多数抗生素是高度抗性的并且在战伤中流行。
白色念珠菌是在人中引起口腔感染和生殖器感染的真菌。
艰难梭菌芽孢是导致可致命的病原性感染的非常难以杀伤的细菌芽孢。
枯草芽胞杆菌是导致生物膜的非常难以杀伤的细菌芽孢。
流行性感冒病毒通常称为流感病毒。
类鼻疽伯克氏菌常常被认为是潜在的生物恐怖生物，其事实上将抗生素“吐”出。
曲霉孢子是作为烧伤高死亡率之原因的真菌孢子并且对大多数常规抗菌剂没有显著应答。
本发明人发现，不同于大多数其他过氧羧酸化合物，PKCA化合物不需要酸催化剂来进行高效合成。无需使用毒性催化剂来合成，当以治疗有效量使用时，本发明的组合物基本没有细胞毒性特性。在一些实施方案中，PKCA化合物可与相应的α-酮酸、过氧化氢和相应的脱羧羧酸相平衡，其中的一些有益于伤口的愈合。PKCA的母体化合物(例如，丙酮酸)中的许多存在于几乎所有活细胞中并且在基本细胞代谢中发挥重要作用。例如，过氧丙酮酸的母体化合物(即，丙酮酸)、过氧草酰乙酸酯的母体化合物(即，草酸)、过氧α-酮戊二酸酯的母体化合物(即，α-酮戊二酸)是TCA(即，三羧酸循环，也称为Krebs循环)(其为细胞代谢的主要能量产生机制)的关键化合物。过氧α-酮丁酸的母体化合物(即，α-酮丁酸)参与琥珀酰辅酶A的代谢产生，其也用于TCA循环。α-酮戊酸(过氧α-酮丁酸的母体化合物)是蛋白质合成和氨基酸(例如亮氨酸和缬氨酸)的生物合成中的重要中间体。α-酮戊酸还参与细胞中的糖异生。丙酮酸酯在伤口愈合过程中通过糖酵解参与为缺氧细胞产生能量。ROS的潜在有害作用可通过α-酮酸来介导。另外，在缺氧期间，丙酮酸酯还对DNA损伤具有保护作用，并且是伤口愈合中胶原蛋白沉积和血管发生的间接代谢贡献者。此外，丙酮酸促进伤口和烧伤中死皮肤的清创。
局部抗菌剂应对细菌具有毒性但对其下方的组织没有毒性，理想地，它们还应保持或增强针对感染的宿主防御。本发明的一些方面提供用于治疗伤口(例如，手术伤口、创伤性伤口、慢性伤口和烧伤伤口)的方法。在一些实施方案中，本发明的方法包括愈合和迅速杀伤(即，降低其水平和/或量或者完全消除)微生物，所述微生物例如但不限于病毒、营养性细菌、真菌、细菌(例如，分枝杆菌)和芽孢/孢子。不同于当今可得到的另一些常规抗菌剂，在一些实施方案中，本发明的组合物基本消除所有微生物并且促进伤口愈合过程。应理解，在对治疗伤口中所使用的PKCA和/或α-酮酯的最佳需求中，每种伤口类型都可以是独一无二的。本发明组合物的一些治疗用途包括但不限于：(i)用作创伤或急性伤口的早期治疗过程中的冲洗溶液；(ii)用作外科手术完成之后的冲洗溶液；(iii)预防手术和急性伤口治疗之后的医院内感染；(iv)治疗其中生物膜菌落和/或抗生素抗性感染已导致或预计导致缓慢愈合或慢性伤口的伤口；(v)用于清创、抗微生物治疗和/或烧伤(包括化学烧伤)的愈合；(vi)治疗受感染的褥疮性溃疡(decubitus ulcer)；(vii)治疗足部溃疡；(viii)治疗静脉溃疡；以及(ix)治疗由激光治疗引起的任何类型的伤口，例如，用于除去瘢痕和皱纹。一般而言，可以使用本发明组合物来治疗任何种类的皮肤或组织损伤，包括但不限于晒伤、擦伤、手术伤口、刺伤等。
本发明组合物的治疗有效量一般是足以预防和/或减轻对伤口之进一步损伤和/或提高伤口之愈合速度的量。用于伤口治疗的治疗剂任选地还可包括另一些伤口治疗化合物，例如代谢生长因子、抗生素和/或抗霉菌剂(antimycotic)和刺激剂。可使用载体溶液来施用本发明的组合物。示例性的合适的载体溶液包括但不限于生理pH缓冲液、等张液体和介质。本发明的组合物还可被配制为乳膏、凝胶、软膏、洗剂、贴剂等。软膏和乳膏可例如用水性或油性基质同时添加合适的增稠剂和/或胶凝剂来配制。洗剂可以用水性或油性基质来配制并且一般还将包含一种或更多种乳化剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、增稠剂或着色剂。
本发明的组合物还可配制成用于气雾剂施用，特别是作为喷剂施用。所述组合物一般具有小粒径，例如约5微米或更小。这样的粒径可通过本领域中已知的方法来获得，例如通过微粉化(micronization)。所述组合物可与合适的抛射剂例如氯氟烃(chloroflurocarbon，CFC)(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)或二氧化碳或其他合适的气体以加压包装(pressurized pack)提供。气雾剂还可方便地包含表面活性剂(例如卵磷脂)。可以通过计量阀或简单地通过喷射时间的量来控制组合物的剂量。
用于伤口治疗的组合物的量可根据很多种因素改变，这些因素包括但不限于被治疗伤口的类型和状况、伤口的大小、对象的年龄、存在于伤口中的污染的量、对象的重量、施用形式和所选择的特定PKCA和α-酮酯(如果存在的话)等。一般而言，医师可容易地确定本发明组合物的最适于患者的特定伤口治疗的量。
例如，与创伤性伤口相比，较高浓度的本发明组合物可更适于治疗慢性伤口。因此，所使用的组合物的量将根据伤口需求而不同。在一些实施方案中，本发明组合物中PKCA的量为0.01mM至约1M，通常为约1mM至约0.5M，通常为约10mM至约250mM。一般而言，对于所有类型的伤口，本发明所使用的组合物中PKCA的量为约0.1mM至约200mM。在用于治疗所有类型的伤口的一个特定实施方案中，本发明组合物中PKCA的量为约0.96mM至约192mM。
就慢性伤口治疗而言，本发明组合物中PKCA的浓度通常为约0.1mM至1M，通常为约1mM至约0.5mM，并且更通常为约10mM至约250mM。在慢性伤口治疗的一个特定实施方案中，本发明组合物中的PKCA浓度为约115mM至约154mM。在另一实施方案中，本发明组合物中PKCA的浓度为约82mM至约96mM。在另一些实施方案中，本发明组合物中PKCA的浓度为约38mM至约76mM。
就非慢性伤口治疗而言，本发明组合物中PKCA的浓度通常为约0.01mM至约1M，通常为约0.1mM至约500mM，并且更通常为约0.1mM至约250mM。在非慢性伤口治疗的一个特定实施方案中，本发明组合物中PKCA的浓度为约38mM至约77mM。在另一实施方案中，本发明组合物中的PKCA浓度为约19mM至约38mM。在另一实施方案中，本发明组合物中PKCA的浓度为约4.2mM至约8.5mM。在另一些实施方案中，本发明组合物中PKCA的浓度为约0.96mM至约2.1mM。
如上所述，在一些实施方案中，PKCA的母体α-酮酸和/或其阴离子可存在于本发明的组合物中。当存在时以及如果存在，则PKCA的母体α-酮酸和/或其阴离子的量通常为平衡浓度量。或者，当存在时以及如果存在，则存在于本发明组合物中的PKCA的母体α-酮酸和/或其阴离子通常为约0.01mM至约10mM。在一个特定实施方案中，存在于本发明组合物中的PKCA的母体α-酮酸和/或其阴离子的量为约12.4mM至约7,352mM。在另一实施方案中，存在于本发明组合物中的PKCA的母体α-酮酸和/或其阴离子的量为约2.5mM至约6.2mM。在另一实施方案中，存在于本发明组合物中的PKCA的母体α-酮酸和/或其阴离子的量为约0.62mM至约1.2mM。而在另一实施方案中，存在于本发明组合物中的PKCA的母体α-酮酸和/或其阴离子的量为约0.062mM至约0.31mM。
如上所述，在一些实施方案中，过氧化氢也可存在于本发明的组合物中。当存在时以及如果存在，则过氧化氢的量通常为平衡浓度量。或者，当存在时以及如果存在，则本发明组合物中过氧化氢的量为约0.01mM至约10M，通常为约0.1mM至约5M，以及通常为约1mM至约5M。在一个特定实施方案中，存在于本发明组合物中的过氧化氢的量为4.9mM至约2940mM。在另一实施方案中，存在于本发明组合物中的过氧化氢的量为约586.4mM至约785.3mM。在另一实施方案中，存在于本发明组合物中的过氧化氢的量为约418.2mM至约489.6mM。而在另一实施方案中，存在于本发明组合物中的过氧化氢的量为约193.8mM至约387.6mM。
就治疗非慢性伤口而言，在一个特定实施方案中，存在于本发明组合物中的过氧化氢的量为约193.8mM至约392.7mM。在另一实施方案中，存在于本发明组合物中的过氧化氢的量为约43.3mM至约96.9mM。在另一实施方案中，存在于本发明组合物中的过氧化氢的量为约4.9mM至约21.4mM。
本发明的一些方面提供除PKCA以外还包含α-酮酯的组合物。在这样的组合物中，α-酮酯的量为约0.01mM至约1M，通常为约0.1mM至约0.5M，通常为约0.5mM至约250mM。在一个特定实施方案中，α-酮酯的量为约0.72mM至约172mM。
就慢性伤口治疗而言，本发明组合物中α-酮酯的量为约0.1mM至约500mM，通常为约1mM至约250mM，以及通常为约10mM至约100mM。在一个特定实施方案中，本发明组合物中α-酮酯的量为约34mM至约46mM。在另一实施方案中，本发明组合物中α-酮酯的量为约23mM至约28.6mM。在另一实施方案中，本发明组合物中α-酮酯的量为约11.5mM至约17.2mM。
就非慢性伤口治疗而言，本发明组合物中α-酮酯的量为约0.01mM至约500mM，通常为约0.05mM至约250mM，通常为约0.1mM至约100mM。在一个特定实施方案中，本发明组合物中α-酮酯的量为约10mM至约11.5mM。在另一实施方案中，本发明组合物中α-酮酯的量为约7.2mM至约8.6mM。在另一实施方案中，本发明组合物中α-酮酯的量为约4.3mM至约6.4mM。在另一实施方案中，本发明组合物中α-酮酯的量为约0.29mM至约2.6mM。
在一些实施方案中，本发明的组合物可以约5,000ppm或更小的浓度在10分钟内杀伤至少105的量的微生物，通常以约5,000ppm的浓度在10分钟内杀伤至少106的量的微生物，所述微生物包括微生物芽孢/孢子和生物膜中的微生物。如本文所使用的，术语“微生物”包括细菌、病毒、真菌、藻类、朊病毒(prion)和本领域技术人员已知的其他病原性生物。通常而言，术语微生物指细菌、病毒和真菌。
在另一些实施方案中，本发明的组合物具有以4,000ppm的浓度在10分钟内、通常在5分钟内以及通常在1分钟内至少log5的微生物杀伤活性。在另一些实施方案中，本发明的组合物具有以4,000ppm的浓度在10分钟内、通常在5分钟内以及通常在1分钟内至少log6的微生物杀伤活性。在另一些实施方案中，本发明的组合物具有以约4,000ppm、通常以3,000ppm、通常以1,000ppm、以及更通常以500ppm的浓度在10分钟内至少log6的微生物杀伤活性。
令人惊讶且出人意料的是，本发明人发现本发明的组合物还可杀伤微生物芽孢/孢子和生物膜，包括但不限于本文所公开的那些。参见，例如，上表A。常规的抗菌剂/去污剂通常不能以有效的方式杀伤微生物芽孢/孢子和/或生物膜。相比之下，本发明的组合物具有广谱活性并且可以约5,000ppm的浓度在10分钟内有效地杀伤生物膜中的至少70％、通常至少80％、通常至少90％、更通常至少95％、以及更通常基本全部细菌。
本发明的其他目的、优势和新特征将基于其下述实施例的检验而对于本领域技术人员而言变得明显，所述实施例不旨在限制。在所述实施例中，建设性地简化用于实施的方法以现在时描述，而已在实验室中实施的方法以过去时给出。
实施例
实施例1
医疗装置上芽孢的消毒
该实施例使用ASTM E-2197规程中描述的方法表明PKCA化合物在干、高蛋白质环境中的杀芽孢效力。图1举例说明过氧α-酮丙酮酸(PPA)、过氧α-酮戊酸(POKVA)和过氧α-酮丁酸(POKBA)的杀芽孢活性。这些溶液中的每一种均挑战了在高蛋白质环境下在10分钟内杀伤6log的艰难梭菌芽孢。就PPA和POKVA而言，所需浓度为1000ppm(8.5mM)，就POKBA而言为500ppm(4.2mM)。另外，用浓度为750mm(6.3mM)的PPA和POKVA以及浓度为250ppm(2.1mM)的POKBA杀伤了3log的艰难梭菌。PKCA的这些浓度相当于12.4mM(1000ppm)、9.3mM(750ppm)和3.1mM(250ppm)的α-酮酸浓度。
实施例2
医疗装置上生物膜的消毒
通过AO AC966.04规程测试了PKCA对抗表面生物膜形成的效力。该规程测试了候选消毒剂对抗干燥至陶瓷小圆柱体(penicylinder)上的枯草芽孢杆菌芽孢(可在其上形成生物膜)。简言之，制备终浓度等于1～4×107CFU/mL的灭菌蒸馏水中的芽孢悬液的稀释液。使用灭菌环，将灭菌小圆柱体置于所制备的稀释液中并混合均匀，然后将其孵育10至15分钟。随后，移动圆柱体置于灭菌培养皿(petri dish)中的灭菌屏(sterilizedscreen)上，然后在干燥器中放置至少12至24小时或者直至使用。就消毒剂测试而言，将被污染的小圆柱体和未被污染的对照圆柱体置于含PKCA混合物的小瓶中，使其凝固10分钟。随后，通过将单个圆柱体置于10mL的厌氧性布鲁氏菌肉汤(Brucella broth)中，超声，并且根据期望的计数在琼脂板上制备合适的稀释液(通常为1∶1000稀释的螺旋板50μL)来计算芽孢的数目。圆柱体应包含106cfu/圆柱体，并且暴露于PKCA混合物的后续计数损失反映对芽孢的log杀伤。结果表明三种包含浓度为169mM(2000ppm)的PPA、POKBA和POKVA的PKCA溶液中的每一种均能够在15分钟之内杀伤干燥陶瓷圆柱体上≥5.0log的枯草芽孢杆菌。
实施例3
材料和方法
菌株和生长条件
将铜绿假单胞菌PAO1(ATCC编号：BAA-47)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)V583(ATCC编号：700802)和金黄色葡萄球菌(ATCC编号：700699)在37℃下于胰蛋白酶大豆肉汤(tryptic soy broth)(TSB，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)培养基中培养，同时搅拌16小时。
对生物膜形成的化学处理
使用Bolton肉汤(Oxoid Ltd，Basingstock，Hampshire，England)和牛血浆(Biomeda，Foster City，CA，USA)进行多物种生物膜形成。将培养在TSB琼脂板上的铜绿假单胞菌PAO1、粪肠球菌V583和金黄色葡萄球接种到TSB肉汤中，并在37℃下于振荡器中培养16小时。将每一单独细菌类型的等量份在TSB肉汤中稀释为一系列稀释度。将经稀释的细菌进行平板接种以对菌落形成单位(CFU)进行计数。将它们进一步稀释为1×106cfu/mL，并相等地混合为接种体。将具有50％血浆的Bolton肉汤用作生物膜形成培养基。对有盖的玻璃16×150mm测试管进行高压灭菌，将7ml生物膜形成培养基无菌地分配在各管中。混合三种细菌的归一化培养物，将10μl的合并的和归一化的培养物1×106cfu/mL接种到玻璃管中。其通过将移液吸头射入管中来完成。移液吸头充当生物膜形成的表面。向管中添加0ppm、400ppm和4000ppm的PPA/PPA-EP，并在37℃于振动器中以150rpm培养24小时。主观地观察生物膜形成并收集生物膜。将具有生物膜的一组管在烘箱中于80℃放置48小时以得到干重。作为总重量减去使用前测量的空管重量的差而测量生物质干重。就每个处理组而言，测试进行一式三份。一式三份的各组管用于下文所述的DNA提取和定量PCR分析。
对所形成的生物膜进行PPA和PPA-EP孵育
将所形成的生物膜清洗3次，然后用8000ppm和16000ppm PPA和具有丙酮酸乙酯(EP)的PPA进行处理，在37℃孵育并振荡(150rpm)1小时。同样使用细菌板计数来评价PPA和PPA-EP孵育对所形成的生物膜的作用。清洗生物膜，超声10分钟，并进行涡旋。将该过程再重复一次。然后，将上清液梯度稀释用于细菌板计数。
设计3种细菌的特异性引物
从NCBI网站下载铜绿假单胞菌PAO1(Genebank编号：AE004091)、粪肠球菌V583(Genebank编号：AE016830)和金黄色葡萄球菌(Genebank编号：BA000017)的基因组序列。通过使用Wnd-BLAST将每个基因组序列用于针对所公开的整个微生物基因组序列进行BLAST。使用无hit基因来设计特异性引物。
实时PCR分析
通过使用Qiagen TissueLyser(QIAGEN，Santa Clara，CA，USA)将生物膜样本均匀化。将灭菌的5mm钢珠和500μL0.1mm玻璃珠添加到具有500μl TE缓冲剂的管中，并以30Hz运行5分钟。然后，通过使用QIAamp DNA小提试剂盒(QIAGEN)提取生物膜样本中的细菌DNA。使用Nanodrop分光光度计(Nyxor Biotech，Paris，France)对DNA样本进行定量，并稀释为20ng/μl。再将来自三种单独细菌的DNA稀释为20ng/μl作为阳性对照。使用实时定量PCR来测定各种细菌的特异性基因水平来表示生物膜样本中三种细菌之比。通过使用Roche LightCycler480(Roche，Mannheim，Germany)来检测基因水平。使用LightCycler480SYBR Green I Master Kit(Roche)进行20μl实时PCR反应。将每个样本测定3次。计算每个样本的相对基因水平并进行分析。简言之，在实时定量PCR反应之后获得不同样本中靶基因的阈循环(Ct值)。从目的Ct的基因(靶基因)中减去归一化DNA Ct值从而产生样本的dCt值。从其余每种样本中减去校准剂(具有最高dCt值的样本)的dCt值从而产生ddCt值。对每个样本取2的-ddCt次幂(2-ddCt)作为相对基因水平。各细菌的基因表达水平表示给定DNA提取样本中各种细菌的相对比值。
结果
最初，使用400ppm、1000ppm、4000ppm、8000ppm和12000ppm的PPA和PPA-EP浓度测试用于对生物膜形成进行进一步多重化学处理的准确浓度(图2和3)。PPA和PPA-EP对生物膜形成示出明显并且显著的抑制作用。因此，使用400ppm和4000ppm作为用于测定的终浓度。对生物膜形成进行主观观察，并且还测量了生物膜生物质干重以提供更客观的测量结果。所有的处理表现出与对照生物膜相比较低的生物质形成(基于干重)，和与生物膜形成的可见降低相关的生物质降低(表1)。添加400ppm的PPA和PPA-EP，生物膜生物质干重降低了42.2％和52.8％。添加4000ppm的PPA和PPA-EP，未观察到生物生长。细菌板计数进一步证实，4000ppm PPA和PPA-EP完全抑制细菌生长。
为了进一步表征化学品对多物种生物膜中单一细菌群体的作用，开发了实时PCR测定。使用该测试来将未经处理对照与经PPA和PPA-EP处理的基质进行比较，结果表明PPA和PPA-EP在400ppm未完全抑制三种细菌的生长，但在4,000ppm完全地抑制了三种细菌的生长。参见表1。
表1.对生物膜预防进行化学处理的数据归纳(N/A＝没有计数)
Figure BDA0000367184110000221
为了评价PPA/PPA-EP在消除所形成生物膜中的作用，将24小时形成的生物膜用8000ppm和16000ppm的PPA/PPA-EP处理60分钟。通过主观观察，PPA/PPA-EP确实示出消除所形成生物膜的作用(图4)。所有处理表现出与对照生物膜相比更多的生物膜降解(基于干重)，以及与生物膜的可见降低相关的生物质降低(表2)。添加8000ppm的PPA和PPA-EP，生物膜生物质干重降低了62.4％和60.8％。添加16000ppm的PPA和PPA-EP，生物膜生物质干重降低了49.6％和64.2％。细菌板计数进一步证实8000ppm、16000ppm的PPA和PPA-EP完全地消除了细菌生长。为了进一步表征化学品对多物种生物膜中单独细菌群体的作用，开发了实时PCR测定。该测试用于将未经处理对照与经PPA和PPA-EP处理的基质进行比较，结果示出PPA和PPA-EP未选择性地消除这3种细菌(表2)。
表2.用PPA和PPA-EP处理所形成的生物膜的数据归纳
Figure BDA0000367184110000231
结论
PPA和PPA-EP抑制细菌生长的范围广泛。在8,000ppm，PPA和PPA-EP在60分钟内消除所形成的生物膜。在较低浓度(例如400ppm至4,000ppm)，PPA和PPA-EP对生物膜形成具有抑制作用。
实施例4
该实施例表明PKCA溶液杀伤模拟伤口溶液环境中的细菌。将包含PPA的PKCA溶液在50mM磷酸盐缓冲液中调节为6.0的合适生理pH，并测试其在10％胎牛血清(FBS)存在下杀伤甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的能力。示出100ppm(0.85mM)的含PPA的PKCA溶液在一分钟内杀伤了FBS溶液中6log的MRSA。
针对营养性细菌的所有其他PKCA效力研究通过标准浸渍测试进行。该方法涉及制备可比得上0.5M McFarland标准品的灭菌稀释剂中受试生物的悬液(1～2×108CFU/mL)。将等量份的悬液移入PKCA混合物中从而以1∶100的比例(例如，30μl悬液到3mL的消毒剂混合物中)进行评价，并充分混合物。在期望的暴露间隔从PKCA混合物中除去等量份，并在中和肉汤中稀释为1∶10(例如，0.4mL到3.6mL中)的比例，然后螺旋平板接种用于计数。该方法提供了6log CFU/ml降低的理论量。
实施例5
为了确定PKCA混合物在蛋白质环境中的性能，就在高蛋白质环境中的性能和就伤口环境的简单模拟而言，测试PPA混合物对MRSA的杀微生物效力。通过如上所述的浸渍测试来测试PPA混合物对抗悬浮在10％胎牛血清(FBS)中的MRSA。当暴露于200ppm的PPA时，PPA混合物在15秒内杀伤10％胎牛血清中的6log的MRSA(图5)。这是在15秒内杀伤悬浮于水中的MRSA所需PPA浓度的一倍。因此，在高蛋白质环境中需要提高浓度，但在高蛋白质环境中杀伤密集群体的MDRO的活性仍然快速且有效。
实施例6
还对PPA混合物对抗悬浮在磷酸盐缓冲液中的MRSA进行了测试以确定不同pH的PKCA混合物的缓冲液是否可用于伤口愈合过程的不同阶段。该测试结果表明，50ppm的PPA将在60秒钟内杀伤pH6.0的磷酸缓冲液中6log的MRSA并且在100ppm时为在15秒内(图6)。
实施例7
还对PPA混合物对抗悬浮在磷酸盐缓冲液中的鲍氏不动杆菌进行了测试以确定不同pH的PKCA混合物的缓冲液是否可用于伤口愈合过程的不同阶段。该测试结果表明，50ppm的PPA将在60秒钟内杀伤6log的鲍氏不动杆菌，并且在100ppm时为在仅15秒内(图7)。
实施例8
针对PPA对悬浮在柠檬酸盐缓冲液(pH6.8)中的20％卵黄中的铜绿假单胞菌的杀生物效力进行了实验。结果表明，500ppm的PPA将在1分钟内杀伤缓冲的高蛋白质环境中的铜绿假单胞菌，但在该浓度的一半时花费60分钟杀伤6log的铜绿假单胞菌(图8)。
目前在感染性伤口愈合方面真正的挑战包括假丝酵母和曲霉菌真菌和霉菌。烧伤伤口中的曲霉孢子在具有深烧伤伤口的老年患者中导致75％的死亡率。PPA已示出杀伤溶液中的这些孢子。上表2示出PPA将在小于10分钟内杀伤这些真菌，因此示出在烧伤伤口中的这些感染变为全身性之前对其进行消毒的能力。
这些研究示出PKCA混合物在不同pH值于高蛋白质和缓冲液中的杀生物效力。另外，它们示出体外模拟慢性伤口的预防和破坏。合同研究机构(contract research facility)指出，在测试了数百种化合物之后，除次磷酸盐以外，PKCA溶液是它们发现的具有完全广谱杀伤细菌并且预防和溶解生物膜的唯一化合物。所有这些实施例和化学理论研究表明，可根据最佳pH来配制PKCA化合物以促进伤口愈合并且仍然对伤口进行消毒。近来已提出调节pH来添加治疗化合物是缩短伤口愈合时间的有效方法。
总之，这些实施例表明PKCA溶液可杀伤生物膜和高蛋白质环境中的高水平的细菌和芽孢。在许多实例中，PKCA溶液还包含母体α-酮羧酸。α-酮酯为伤口治疗液提供组织渗透能力和抗炎能力。因此，本发明的组合物是目前仅有的对伤口进行消毒并且同时促进愈合的简单有机化学品。
实施例9
该实施例示出α-酮过酸(即，过氧α-酮羧酸)化合物在干燥的高蛋白质环境中的杀生物效力。按照ASTM E-2197规程中所述的方法进行该实验。图1示出三种α-酮过酸溶液的结果，这三种溶液各自包含过氧α-酮丙酮酸(PPA)、过氧α-酮戊酸(POKVA)或过氧α-酮丁酸(POKBA)。这些溶液挑战在高蛋白质环境中于10分钟内杀伤6log的艰难梭菌。就PPA和POKVA而言，所需浓度为1000ppm(8.5mM)，就POKBA而言，为500ppm(4.2mM)。另外，用浓度为750ppm(6.3mM)的PPA和POKVA和浓度为250ppm(2.1mM)的POKBA杀伤了3log的艰难梭菌芽孢。α-酮过酸的这些浓度相当于12.4mM(1000ppm)、9.3mM(750ppm)和3.1mM(250ppm)的α-酮酸浓度。
实施例10
该实施例示出α-酮过酸溶液可杀伤生物膜。使用AOAC966.04规程中所述的方法来确定α-酮过酸化合物对生物膜的杀生物效力测试。结果示出，浓度为169mM(2000ppm)的三种α-酮过酸溶液(包含PPA、POKBA和POKVA)中的每一种均能够在15分钟内杀伤干燥陶瓷圆柱体上的≥5.0log的枯草芽孢杆菌。
实施例11
该实施例示出α-酮过酸溶液可在模拟伤口溶液环境中杀伤细菌。将包含PPA的α-酮过酸溶液在50mM磷酸盐缓冲液中调节到6.0的合适的生理pH，并且测试其在10％胎牛血清(FBS)存在下杀伤甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的能力。示出100ppm(0.85mM)的包含PPA的α-酮过酸溶液在1分钟内杀伤FBS溶液中6log的MRSA。
这些实施例表明α-酮过酸溶液可杀伤生物膜中和高蛋白质环境中的高水平的细菌和芽孢。在一些实例中，本发明的组合物包含α-酮过酸和母体α-酮羧酸二者。α-酮羧酸是见于几乎所有活细胞中的天然化合物，并且示出潜在地促进伤口愈合。通过提供α-酮酸和这些α-酮酸的过氧形式，本发明的一些组合物为细胞提供协同益处。
实施例12
在上文中公开的PKCA化合物公开于共同转让的美国专利申请和临时专利申请中。这些PKCA化合物已被开发用作营养性细菌、芽孢和生物膜的高水平消毒剂/灭菌剂。本发明人已示出PKCA化合物有效用于在可接受被称为灭菌剂/消毒剂的水平杀伤营养性细菌和芽孢。
在该研究中，向PKCA溶液中添加丙酮酸乙酯(EP)以确定杀生物效力是否受EP的添加影响。向包含PKCA化合物的溶液中添加浓度为2％的EP。所使用的EP的量在基本消除PKCA气味方面有效。作为对照，以与PKCA-EP混合相同的方式测试水中2％EP的抗微生物特性。出乎意料地，发现2％EP对照也杀伤细菌。这些测试的实施例示于下文中。
将MRSA制备为在可比得上0.5McFarland标准品的灭菌稀释剂中的悬液(1至2×106CFU/mL)。将等量份的MRSA悬液以1∶100的比例添加到PKCA-EP混合物和EP对照溶液中(例如，30μL悬液到3mL的测试溶液中)，并通过涡旋彻底混合。10分钟之后，将各受试样本的等量份在中和Letheen肉汤中以1∶10的比例稀释(例如，0.4mL到3.6mL中)。该方法提供4log单位降低的理论量并且检测到按cfu/ml计5log单位的降低。将PKCA-EP和EP对照溶液以50μL各受试样本平板接种到合适的琼脂上以适用于获得可计数的稀释剂。另外，在合适的气氛和温度下，将受试样本的各中和管和琼脂板孵育过夜。确定细菌计数之后，将细菌已暴露于EP的受试样本管再孵育24小时。如果在这些管中未观察到细菌悬液，则表示发生了完全消除污染。板计数结果示于下表中。
Log降低
对照 5.9
PKCA化合物 4.9
2％丙酮酸乙酯 4.9
如上表中的数据所示，PKCA溶液中浓度为2％的丙酮酸乙酯未抑制PKCA化合物的杀生物效力。令人惊讶且出人意料的结果是丙酮酸乙酯本身还杀伤4.9log单位的MRSA。
类鼻疽伯克氏菌(B.pseudomallei)和鼻疽伯克氏菌(B.mallei)分别为类鼻疽(melioidosis)和鼻疽(glanders)的致病物。这些是革兰氏阴性病原体，并且不同于MRSA(革兰氏阳性菌)，它们在世界的许多地方流行。不受任何理论的约束，认为这些细菌对许多(若并非大多数)抗生素有抗性，这是因为它们使用主动运输系统将抗生素泵出(即，移除)它们的细胞的能力。虽然在大多数国家，这些病原体的天然获得是罕见的，但是这些细菌因其作为生物恐怖试剂的潜力近来获得了大量关注。
在另一研究中，测试了丙酮酸乙酯以确定2％丙酮酸乙酯对类鼻疽伯克氏菌的作用。就该研究而言，将类鼻疽伯克氏菌1026b接种到3mL的Letheen肉汤中，并在37℃孵育过夜。次日，将20μL的过夜培养物添加到2mL的具有0.1％硫代硫酸钠的Letheen肉汤中以获得约107cfu/mL。随后，将该溶液稀释为约104cfu/mL的工作溶液。准备两个具有5mL的2％丙酮酸乙酯的测试管，并且准备两个具有5mL灭菌水的管作为对照。将100μL的类鼻疽伯克氏菌1026b的约104cfu/mL储液直接添加到一个包含5mL的灭菌水的阳性对照管中，并且将100μL的类鼻疽伯克氏菌1026b的约104cfu/mL储液直接添加到一个包含5mL2％丙酮酸乙酯的管中。将这些管在37℃孵育20～24小时，然后观察生长(+)还是不生长(-)。在24小时的孵育之后，在接种有类鼻疽伯克氏菌1026b的丙酮酸乙酯管中没有可见生长，而在阴性对照中有显著生长。这表明丙酮酸乙酯具有抗菌活性，甚至对抗对广谱抗生素具有高度抗性的细菌。
尽管不太可能，但是，认为潜在水解产物乙醇是丙酮酸乙酯的抗微生物活性的可能来源。为了确定乙醇是否是抗微生物活性的来源，进行了分析实验以确定随时间发生的水解是否产生乙醇。
获得了在室温孵育1小时、16小时和60天的50％过氧化氢溶液中30％丙酮酸乙酯的傅立叶变换红外(即，FTIR)扫描。这些FTIR扫描的研究示出在过氧化氢溶液中进行孵育的过程中未产生乙醇，即使在60天之后也是如此。该结果表明丙酮酸乙酯在PKCA溶液中是稳定的，因为这些溶液中过氧化氢的浓度仅约为在50％过氧化氢溶液中的一半。
通过FTIR和气相色谱分析了在室温下孵育7天的丙酮酸乙酯与过氧化氢的等量混合物。混合物中未发现乙醇。该结果进一步表明在过氧化氢的存在下丙酮酸乙酯的稳定性。
通常而言，使用70％的乙醇溶液进行消毒。因此，很可能2％乙醇(如果所有丙酮酸乙酯均水解的话)的浓度将在10分钟的时间内杀伤细菌。不受任何理论的约束，可能是细菌中的酯酶可水解丙酮酸乙酯从而在原位产生乙醇导致所观察到的抗菌活性。另一可能性是，抗微生物作用是因由丙酮酸释放引起的pH降低。
实施例13
在该实施例中，将本发明的组合物配制在绷带材料中或者作为可溶性膜(图9)，使得当存在水分时释放活性组合物。绷带和膜可配制用于长时间释放，从而长时间为伤口提供本发明的组合物。可以使用不同的绷带材料，例如它们可以是透气的或基本不透气的或密封的。另外，包含本发明组合物的绷带和膜可以与另一些常规绷带材料一起制备然后以干燥形式储存用于例如撤退过程中的战场应用以及2至4级运输。就本发明组合物而言另一些可能的制剂包括但不限于：凝胶、洗剂、乳膏或可直接施用于伤口的其他合适制剂。在一些实施方案中，本发明组合物的制剂使得有效的时间释放成为可能。通常而言，这样的制剂是可直接施用于伤口的重量轻且稳定形式的伤口敷料材料。在一些实施方案中，本发明的组合物配制为使得它们在暴露于伤口时释放。这些制剂通常随时间溶解释放本发明的组合物。这样的制剂对军事群体和平民群体都具有广泛应用。例如，用于军事用途的此类制剂包括但不限于在伤口愈合过程的整个过程中基于初始分类的直接现场应用。
图10示出用本发明的包含PPA的组合物(其并入可溶性膜中)(参见图9)来处理血液琼脂板上MRSA的结果。如该结果所示，对照膜盘(disc)完全过生长，而包含本发明组合物的可溶性膜杀伤了与PPA浓度相对成比例的MRSA。
出于说明和描述的目的，已示出了本发明的前述讨论。前述不旨在将本发明限于本文所公开的形式。虽然本发明的描述包括了对一个或更多个实施方案以及某些变化和修改的描述，但是其他变化和修改也在本发明的范围内，例如，如在理解本公开的内容之后可在本领域技术人员的技术和知识范围内。旨在获得这样的权利：在许可程度上包括替选实施方案，包括所要求保护的那些的替选的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤，无论是否为本文所公开的这些替选的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤，并且不旨在公开地贡献于任何可取得专利权的主题。

Claims (20)

1.组合物，其包含α-酮酯与过氧α-酮羧酸(PKCA)的混合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述混合物还包含α-酮酸。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述α-酮酸是所述PKCA的脱羧α-酮酸。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述α-酮酯包含烷基α-酮酯。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述烷基α-酮酯是烷基丙酮酸酯。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述α-酮酯与所述PKCA的摩尔比为约0.02∶1至约10∶1。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PKCA包含过氧α-酮丙酮酸、过氧α-酮丁酸、过氧α-酮戊酸、或其混合物。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物配制为凝胶、液体、洗剂、皮肤贴剂、冲洗凝胶、喷雾剂、敷料、膜、珠、盘、织物、纤维或其组合。
9.用于降低表面上微生物之量的方法，所述方法包括使所述表面与包含有效量的α-酮酯与过氧α-酮羧酸之混合物的组合物相接触。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述微生物包含营养性细菌。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述微生物包含细菌芽孢、分枝杆菌、革兰氏阴性细菌、营养性革兰氏阳性细菌、病毒、或其组合。
12.用于降低基质上感染性营养性细菌之数目的方法，所述方法包括使所述基质与包含有效量的α-酮酯与过氧α-酮羧酸之混合物的组合物相接触。
13.用于在哺乳动物中预防和/或减轻由所述哺乳动物与被微生物感染之基质相接触引起的微生物相关疾病的方法，所述方法包括使所述基质与包含有效量的α-酮酯与过氧α-酮羧酸之混合物的组合物相接触。
14.用于在对象中治疗伤口的方法，所述方法包括向所述对象的所述伤口区局部施用包含过氧α-酮羧酸的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物还包含α-酮酯。
16.用于在对象中预防由伤口引起之脓毒症的方法，所述方法包括向所述对象的所述伤口局部施用包含有效量的过氧α-酮羧酸的组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述组合物还包含α-酮酯。
18.组合物，其基本上由以下组成：过氧α-酮羧酸(PKCA)、α-酮酯、任选的PKCA之母体羧酸和/或其盐、任选的PKCA之脱羧衍生物、以及任选的过氧化氢。
19.用于降低生物膜中微生物的方法，所述方法包括使所述生物膜与有效量的包含过氧α-酮羧酸(PKCA)、α-酮酯、或其组合的组合物相接触。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述组合物还包含PKCA的母体羧酸和/或其盐、PKCA的脱羧衍生物、过氧化氢、或其组合。
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