CN101926830A

CN101926830A - 一种抗菌剂

Info

Publication number: CN101926830A
Application number: CN2010102504052A
Authority: CN
Inventors: 丁贤; 周世宁; 殷波; 江世贵
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2010-08-10
Filing date: 2010-08-10
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2030-08-10
Also published as: CN101926830B

Abstract

本发明属于卫生学领域，涉及一种抗菌剂，由以下有效成分构成：四环素和枯草芽孢杆菌。抗菌剂中四环素和枯草芽孢杆菌的含量比例为0.18～6.0μg∶2.0～6.0×10⁶cfu，可以应用于抑制和杀灭金黄色葡萄球菌、弧菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、变形菌属细菌、镰刀菌等。本发明所提供的抗菌剂首次应用了枯草芽孢杆菌抑制细菌群体感应分子的功能，与四环素配合产生协同作用，大大提高了抗菌剂杀灭细菌的能力；该抗菌剂显著降低了四环素的有效剂量阈值，避免抗菌过程中的耐药性问题；在达到有效抗菌效果的同时，对环境负面影响小，毒副作用小。

Description

一种抗菌剂

技术领域

本发明属于卫生学领域，涉及一种抗菌剂，具体涉及一种生物-化学复合抗菌剂。

背景技术

抗菌剂(anti-bacterial means)指能够在一定时间内，使某些微生物(细菌、真菌、酵母菌、藻类及病毒等)的生长或繁殖保持在必要水平以下的物质，具有抑菌和杀菌功能。传统的抗菌剂采用化学物质作为有效成分，但是这种抗菌剂容易使细菌产生抗性，负面影响较大。

陆续被应用于临床，并已成为应用最多，最广泛的广谱抗菌素了。但在1956年，有人发现了四环素会使牙齿变色的副作用，随后还发现了它甚至会使指甲和巩膜变色。而在我国直至70年代中期才引起重视。现在已有大量资料证实，长期使用四环素，有可能影响牙齿的发育和形成，引起牙釉质发育不良(牙齿表面不光滑，出现小凹陷)或牙齿畸形。据国内的调查报告，四环素引起的乳牙变色发病率为49.40％，恒牙的发病率则高达75.63％。

除此，由于四环素的大量使用，目前常见致病菌对四环素类耐药现象严重，仅在病原菌对本品呈现敏感时，方有指征选用该类药物。由于溶血性链球菌多对本品呈现耐药，四环素不宜用于该类菌所致感染的治疗，也不宜用于治疗溶血性链球菌感染和任何类型的葡萄球菌感染。

生物抗菌剂是近年来问世的一种新型抗菌剂，与传统的抗菌剂不同，其利用生物作为抗菌活性成分。如一种防治枯萎病的生物抗菌剂，是采用从农作物的根际土壤中筛选出的功能细菌，能广谱抑制各种农作物病原真菌，防治枯萎性病害防治效果达75％左右，能基本控制枯萎性病害的发生。生物抗菌剂具有生物农药高效、低毒、低残留、与环境相容性好的特点。但是，目前的生物抗菌剂的种类非常有限，使用对抗的病原菌仅为一小部分，生物抗菌剂作为一种较为安全和环保的抗菌剂，善待进一步研究和开发。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种抗菌剂，为一种新型的生物-化学复合抗菌，可以有效抑制和杀灭有害病菌，同时使用安全可靠。

发明通过以下技术方案实现上述目的：

发明提供了一种抗菌剂，由以下有效成分构成：四环素和枯草芽孢杆菌。

在该抗菌剂中，四环素和枯草芽孢杆菌的含量比例为0.18～6.0μg∶2.0～6.0×10⁶cfu。可以使用以下浓度的抗菌剂，直接应用于灭菌处理：四环素在抗菌剂中的含量为0.18～6.0μg/g；枯草芽孢杆菌在抗菌剂中的含量为2.0～6.0×10⁶cfu/g。

利用这种抗菌剂，可以应用于抑制和杀灭金黄色葡萄球菌、弧菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、变形菌属细菌、镰刀菌等。

抗菌剂可以根据需要，添加辅料水、增稠剂或填充剂等，制备成为外用药膏、外用液体药剂、口服药片、口服液、消毒剂、清洁剂或水质改良剂等。

本发明所提供的抗菌剂不仅可以用于对抗四环素敏感型的细菌，还可以用于对抗金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，可引起多种严重感染，有“嗜肉菌″的别称。虽然现有的研究认为四环素不宜用于葡萄球菌感染，但是本发明将低剂量的四环素与枯草芽孢杆菌复合使用，发现枯草芽孢杆菌的加入可以大大降低四环素的有效阈值，达到非常明显的抗菌效果。

通过对抗菌剂机理的研究发现，该抗菌剂显著的抗菌效果来源于枯草芽孢杆菌对细菌生物膜形成的抑制和抗生物的四环素的协同性杀菌作用。本发明发现，枯草芽孢杆菌可以降解细菌群体感应信号，及其抑制细菌生物膜形成。试验表明枯草芽孢杆菌可降解具群体感应细菌的信号分子，干扰细菌的群体感应系统，从而使细菌无法有效启动群体感应相关基因的表达和调控其生理生化特性(如生物膜的形成和致病因子的表达)，因而降低了致病活性，并提高了宿主免疫系统。

该抗菌剂可以用于防治具群体感应细菌引起的动物的体内、外微生物感染，或者对养殖水体相关细菌的抑制，或者对植物的相关病原菌的防治。用枯草芽孢杆菌制备的药物用于防治细菌引起的各种健康问题，包括肠道细菌感染、人和动物的其它细菌感染、防治植物的病原菌，还可以调节机体肠道微生态，促进消化和机体生长，改善水产养殖环境。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明所提供的抗菌剂首次应用了枯草芽孢杆菌抑制细菌群体感应分子的功能，与四环素配合产生协同作用，大大提高了抗菌剂杀灭细菌的能力。

2.本发明所提供的抗菌剂显著降低了四环素的有效剂量阈值，避免抗菌过程中的耐药性问题。

3.本发明所提供的抗菌剂在达到有效抗菌效果的同时，对环境负面影响小，毒副作用小。

4.本发明提供的抗菌剂，使用安全，且其生产成本非常低廉，适于推广使用。

5.本发明将有利于研究具群体感应细菌的生物防控，探讨防治具群体感应细菌的新技术。

6.本发明有利于从机制方面解决具群体感应细菌由于大量使用抗生素而产生的耐药性问题，发展非抗菌素类为主的致病菌生态防控新技术。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

枯草芽孢杆菌的筛选、分离和纯化：

2216E平板30度培养2-3天，多次划线分离和纯化，接种斜面，4度保存备用。

实施例2

枯草芽孢杆菌降解细菌信号分子的初筛实验：

初筛实验使用信号分子为OOHL分子，指示菌为WCF47。

96孔板初筛：

1)从平板挑取待测菌，在96孔培养板A中用相应液体培养基200μl培养至生长对数晚期，设立阴性对照(LB+AHL)和阳性对照(Bt+AHL)。

2)向96孔培养板B的每个孔中加入100μl MM液体培养基，0.2μl信号分子AHL(1mg/ml)，用移液枪从96孔培养板A取待测菌100μl到96孔培养板B对应的孔中，混匀。30℃共培养4hr。

3)向96孔培养板C的每个孔中加入130μl MM液体培养基，20μl指示菌WCF47菌液，1μl X-Gal。用移液枪从96孔培养板B取共培养物50μl到96孔培养板C对应的孔中，混匀。

4)30℃过夜培养。在16hr左右可以观察结果。

实验结果：信号分子被降解后，指示菌落呈白色，否则呈蓝色。根据颜色反应，初步筛出具有降解信号分子AHL的枯草芽孢杆菌微生物菌株。

实施例3

枯草芽孢杆菌降解细菌信号分子的复筛实验：

琼脂条复筛：

将涂有X-gal的MM培养基平板切成条状，在细条一测加入待测菌与AHLs抽提物的混合物，在另一测依次加指示菌WCF47，30℃培养18h后观察实验结果。LB或ddH₂O和AHL的混合物作为阴性对照，以AiiA活性菌B.thuringiensis培养物与AHL的混合物为阳性对照。

实验结果：根据颜色反应，阴性对照呈蓝色，阳性对照和枯草芽孢杆菌呈白色，表明枯草芽孢杆菌具有降解AHLs信号分子的活性。

实施例4

枯草芽孢杆菌抑制溶藻弧菌和鳗弧菌生物膜形成的实验：

在2ml塑料离心管中分别加入975μl过夜培养的溶藻弧菌和鳗弧菌菌液，25μl 40％的甘油，1μl(10⁵)的枯草芽孢杆菌。以不加枯草芽孢杆菌的处理作为阴性对照。37℃静置培养3天。小心倾去离心管中的液体，用灭菌的蒸馏水轻轻冲洗离心管数次，确保冲洗掉离心管内游离的细菌。等离心管内壁的水珠蒸发后，加入1ml 0.5％的结晶紫溶液，室温静置30分钟。将结晶紫倒掉，用灭菌的蒸馏水轻轻冲洗离心管数次，确保没有吸附在生物膜上的结晶紫被冲掉。待离心管内壁水珠蒸发后，加入1ml 95％乙醇，室温静置15分钟。最后将离心管内乙醇倒入比色皿内，在分光光度计中以570nm波长测OD值。OD值越低，说明溶藻弧菌和鳗弧菌形成的生物膜越少。

实验结果表明：枯草芽孢杆菌在10⁵浓度即可抑制溶藻弧菌和鳗弧菌生物膜的形成。但不直接抑制溶藻弧菌和鳗弧菌的生长，表明抑制作用可能是通过抑制细菌的群体感应系统达到的。

实施例5

枯草芽孢杆菌抑制铜绿假单胞菌生物膜的实验：

在2ml塑料离心管中加入975μl过夜培养的绿脓杆菌菌液，25μl 40％的甘油，1μl 10⁶的枯草芽孢杆菌。以不加枯草芽孢杆菌的处理作为阴性对照。37℃静置培养3天。小心倾去离心管中的液体，用灭菌的蒸馏水轻轻冲洗离心管数次，确保冲洗掉离心管内游离的细菌。等离心管内壁的水珠蒸发后，加入1ml0.5％的结晶紫溶液，室温静置30分钟。将结晶紫倒掉，用灭菌的蒸馏水轻轻冲洗离心管数次，确保没有吸附在生物膜上的结晶紫被冲掉。待离心管内壁水珠蒸发后，加入1ml 95％乙醇，室温静置15分钟。最后将离心管内乙醇倒入比色皿内，在分光光度计中以570nm波长测OD值。OD值越低，说明铜绿假单胞菌形成的生物膜越少。

实验结果表明：枯草芽孢杆菌在10⁶浓度即可抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，但不直接抑制铜绿假单胞菌的生长，表明枯草芽孢杆菌可能干扰了细菌的群体感应系统而抑制生物膜的形成。

实施例6

抗菌剂的制备：将枯草芽孢杆菌菌液和四环素加水混合成为抗菌剂，枯草芽孢杆菌在抗菌剂中的含量为4.0×10⁶cfu/ml，四环素的质量分数为0.36μg/ml。

抗菌试验：

设置实验组(抗菌剂)、对照组1(四环素)，将实验组和对照组分别加入等体积金黄色葡萄球菌菌液中，在37℃培养16小时。

实验结果表明：对照组1四环素对金黄葡萄球菌的最低致死量是4μg/ml，当菌液中加入枯草芽孢杆菌培养上清液时(实验组)，四环素的最低致死量降低到0.18μg/ml以下。

实验结果显示，枯草芽孢杆菌和抗生素有联合作用，枯草芽孢杆菌和四环素等抗生素同时作用于耐抗生素的金黄葡萄球菌的杀菌效果明显优越于单独使用四环素等抗生素的效果。表明在枯草芽孢杆菌的存在下致病菌因失去生物膜的保护而对抗生素的耐受能力大大降低。

实施例7

枯草芽孢杆菌降解群体感应受体蛋白TraR的实验

TraR蛋白是根农杆菌群体感应系统信号分子的受体蛋白，与绿脓杆菌的LasR蛋白同属LuxR蛋白家族，它们活性位点区域的同源性高达70％，因此，对TraR蛋白起作用的抑制剂往往也会对LasR蛋白有抑制作用。LuxR蛋白在群体感应抑制剂如卤化呋喃酮的作用下，变得极不稳定，会在短时间(约30分钟)内被细菌自身的蛋白酶迅速水解掉，导致LuxR蛋白的浓度下降。因此，通过检测LuxR蛋白与抑制剂作用后的浓度是否下降，可知抑制剂是否有抑制活性，以及抑制活性的高低。

用PCR的方法获得TraR蛋白的基因trar。将该基因片断用双酶切的方法插入表达载体PET-17b中构建pETtrar质粒，再将该质粒用钙转方法转化到大肠杆菌BL21中，最后获得高效表达TraR蛋白的工程菌。该工程菌用IPTG诱导4个小时后，离心收集菌体，再用无菌水重悬细菌，加入枯草芽孢杆菌培养的粗提抗菌液，37℃培养35分钟。最后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测菌体TraR蛋白浓度。

实验结果表明，枯草芽孢杆菌在35分钟内即可明显降低群体感应受体蛋白TraR的浓度。TraR浓度降低后，将无法有效启动群体感应相关基因的表达(如生物膜的形成和致病因子的表达)，因而降低了致病活性。该实验从分子水平证明了枯草芽孢杆菌是一个有效潜在的群体感应抑制剂。

实施例8

抗菌剂的制备：将枯草芽孢杆菌菌液和四环素加水混合成为抗菌剂，枯草芽孢杆菌在抗菌剂中的含量为4.0×10⁶cfu/ml，四环素的质量分数为0.72μg/ml。

抗菌试验：

设置实验组(抗菌剂)和对照组(四环素)，将实验组和对照组分别加入等体积大肠埃希菌菌液中，在37℃培养14小时。

实验结果表明：对照组四环素对大肠埃希菌的最低抑菌浓度6μg/ml，当菌液中加入枯草芽孢杆菌培养上清液时(实验组)，四环素的最低抑菌浓度0.36μg/ml以下。

实验结果显示，枯草芽孢杆菌和抗生素有联合作用，枯草芽孢杆菌和四环素等抗生素同时作用于耐抗生素的大肠埃希菌的杀菌效果明显优越于单独使用四环素等抗生素的效果。表明在枯草芽孢杆菌的存在下致病菌因失去生物膜的保护而对抗生素的耐受能力大大降低。

实施例9

抗菌剂的制备：将枯草芽孢杆菌菌液和四环素加水混合成为抗菌剂，枯草芽孢杆菌在抗菌剂中的含量为4.0×10⁶cfu/ml，四环素的质量分数为0.64μg/ml。

抗菌试验：

设置实验组(抗菌剂)和对照组(四环素)，将实验组和对照组分别加入等体积副溶血弧菌菌液中，在28℃培养18小时。

实验结果表明：对照组四环素对副溶血弧菌的最低抑菌浓度5μg/ml，当菌液中加入枯草芽孢杆菌培养上清液时(实验组)，四环素的最低抑菌浓度0.32μg/ml以下。

实验结果显示，枯草芽孢杆菌和抗生素有联合作用，枯草芽孢杆菌和四环素等抗生素同时作用于耐抗生素的副溶血弧菌的杀菌效果明显优越于单独使用四环素等抗生素的效果。表明在枯草芽孢杆菌的存在下致病菌因失去生物膜的保护而对抗生素的耐受能力大大降低。

实施例10

抗菌剂的制备：将枯草芽孢杆菌菌液和四环素加水混合成为抗菌剂，枯草芽孢杆菌在抗菌剂中的含量为4.0×10⁶cfu/ml，四环素的质量分数为0.8μg/ml。

抗菌试验：将抗菌剂加入等量金黄色葡萄球菌菌液中，在37℃培养16小时。抗菌剂的抑菌率达100％。

实施例11

抗菌剂的制备：将枯草芽孢杆菌菌液和四环素加水混合成为抗菌剂，枯草芽孢杆菌在抗菌剂中的含量为8.0×10⁶cfu/ml，四环素的质量分数为9μg/ml。

实施例12

抗菌剂的制备：将枯草芽孢杆菌菌液和四环素加水混合成为抗菌剂，枯草芽孢杆菌在抗菌剂中的含量为12×10⁶cfu/ml，四环素的质量分数为4μg/ml。

抗菌试验：将抗菌剂加入等量金黄色葡萄球菌菌液中，在37℃培养16小时抗菌剂的抑菌率达100％。

Claims

1.一种抗菌剂，其特征在于由以下有效成分构成：四环素和枯草芽孢杆菌。

2.如权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于所述的四环素和枯草芽孢杆菌的含量比例为0.18～6.0μg∶2.0～6.0×10⁶cfu。

3.如权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于所述的四环素在抗菌剂中的含量为0.18～6.0μg/g；枯草芽孢杆菌在抗菌剂中的含量为2.0～6.0×10⁶cfu/g。

4.如权利要求1所属的抗菌剂，其特征在于抗菌剂应用于抑制和杀灭金黄色葡萄球菌、弧菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、变形菌属细菌、镰刀菌等。

5.如权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于所述的抗菌剂为外用药膏、外用液体药剂、口服药片、口服液、消毒剂、清洁剂或水质改良剂。

6.如权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于所属的抗菌剂还含有辅料，辅料是水、增稠剂或填充剂。