CN112625935A - Mrs固体培养基、抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

Mrs固体培养基、抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种MRS固体培养基、抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂及其制备方法，所述MRS固体培养基，包括如下质量份的各组分：蛋白胨8g～12g、牛肉浸粉4g～7g、酵母浸粉2g～6g、葡萄糖17g～25g、吐温800.5g～2g、磷酸氢二钾1g～3g、乙酸钠3g～7g、柠檬酸三铵1g～4g、硫酸镁0.1g～0.9g、硫酸锰0.02g～0.1g、琼脂11g～20g；而抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法采用了所述MRS固体培养基对菌种进行培养，并且制备得到的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂不仅抑菌效率高，对金黄色葡萄球菌的抑菌率大于等于99％，且生物安全性好，对环境友好，且不易产生耐药性，无毒副作用以及生产成本低廉。

Description

MRS固体培养基、抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂及其 制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种MRS固体培养基、抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂及其制备方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，最适宜生长温度为37℃，pH为7.4，耐高盐，可在盐浓度接近10％的环境中生长，因此，该菌广泛存在于自然环境中，空气、污水等环境中也无处不在，成为一种常见的食源性致病微生物。金黄色葡萄球菌可分泌多种毒性蛋白质，是常见的引起医院、社区感染的主要病原菌，其致病力较高，可造成严重感染，导致菌血症、败血症等，甚至导致死亡。最近几年的临床研究报告指出，金黄色葡萄球菌已成为医院内感染首位的革兰氏阳性致病菌，其产物被认为是导致皮肤和软组织严重感染的毒力因子。
为了防治金黄色葡萄球菌引起的疾病，可以从临床上治疗和环境中预防两个方面减少该菌的危害。在临床治疗方面，主要是应用抗生素治疗。但是，近年来随着抗生素类药物在临床治疗中用量、频次及范围的增加，金黄色葡萄球菌耐药菌变异程度加重，且耐药时间不断缩短，原抗生素的治疗效果大大降低，而该菌的耐药种类增多、耐药性亦增强，导致金黄色葡萄球菌耐药菌株的感染率居高不下。鉴于金黄色葡萄球菌的生存分布环境广泛，控制环境中的金黄色葡萄球菌的数量和存活是从源头预防该菌感染的有效途径。因此，环境消毒对减少此类病原微生物的感染非常重要。目前，环境中病原菌的消毒主要采用化学消毒剂进行，还有采用酶法抑菌、应用具有抑菌活性的抑菌微生物等对金黄色葡萄球菌进行抑制。
然而，常用的化学消毒剂例如季铵类化合物、酚类、醛类、氧化类、胍类消毒剂等已经历数十年的发展，细菌逐渐产生对消毒剂的抵抗力，且这类化学试剂需要提取，制备工艺复杂、成本高，存在提取废液、化学副产物等污染环境的风险，并不绿色环保；酶法抑菌生产工艺苛刻复杂和在应用中成本过高；而应用具有抑菌活性的微生物对金黄色葡萄球菌进行抑制，即“以菌治菌”，是一种经济有效的办法。抑菌微生物可以通过产生抗菌物质、有机酸、空间和营养竞争、形成抑菌生物膜等多种方式抑制金黄色葡萄球菌等病原菌的生存。不像抗生素的单一作用机制，抑菌微生物作用靶点多，作用机制多样复杂，不易产生抗药性。此外，抑菌微生物具有来源丰富、产生活性多样的抑菌物质、易生产、周期短等优点。然而，现有的能够抑制金黄色葡萄球菌的微生物或者复合菌剂的抑菌率较低，或者还要搭配其他的化学制剂或植物提取物使用，工艺复杂、制备成本较高以及环保性能较差。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足之处，提供一种MRS固体培养基、抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂及其制备方法，该抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂不仅抑菌效率高，生物安全性好，对环境友好，且不易产生耐药性，无毒副作用以及生产成本低廉。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种MRS固体培养基，包括如下质量份的各组分：蛋白胨8g～12g、牛肉浸粉4g～7g、酵母浸粉2g～6g、葡萄糖17g～25g、吐温800.5g～2g、磷酸氢二钾1g～3g、乙酸钠3g～7g、柠檬酸三铵1g～4g、硫酸镁0.1g～0.9g、硫酸锰0.02g～0.1g、琼脂11g～20g。
一种抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
制备LB液体培养基及LB固体培养基；
制备所述MRS固体培养基以及MRS液体培养基；
将枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S划线接种至所述LB固体培养基，37℃恒温培养箱培养12h～24h，进行菌种活化，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落；
将玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z划线接种至所述MRS固体培养基，37℃恒温培养箱培养24h～48h，进行菌种活化，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落；
在无菌条件下，将活化后的所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落接种至含有LB液体培养基的试管，置于37℃、150rpm的摇床上培养12h～24h，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液；
在无菌条件下，将活化后的所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落分别接种至含有MRS液体培养基的试管，置于37℃、30rpm的摇床培养24h～48h，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液；
将所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液进行混合培养操作，得到抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂。
在其中一个实施例中，所述LB固体培养基包括如下质量份的各组分：酵母提取物3g～6g、蛋白胨8g～12g、氯化钠8g～12g、琼脂13g～17g。
在其中一个实施例中，所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z的有效菌浓度比例为(1～3)：(1～2)。
在其中一个实施例中，所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z的最适生长温度为37℃。
一种抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂，，采用所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法制备得到，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HMJZ-B1005S和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)HMJZ-L2001Z，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HMJZ-B1005S已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020237，所述玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)HMJZ-L2001Z已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020238。
在其中一个实施例中，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂在抑制金黄色葡萄球菌、甲型H1N1流感病毒、绿脓杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、痢疾志贺氏菌和溶血性链球菌中的应用。
在其中一个实施例中，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂对金黄色葡萄球菌的抑制率大于等于99％。
在其中一个实施例中，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂在消毒剂、抑菌液去味液中的应用。
在其中一个实施例中，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂在环保、农业生产和日用品中的应用。
上述MRS固体培养基，包括如下质量份的各组分：蛋白胨8g～12g、牛肉浸粉4g～7g、酵母浸粉2g～6g、葡萄糖17g～25g、吐温800.5g～2g、磷酸氢二钾1g～3g、乙酸钠3g～7g、柠檬酸三铵1g～4g、硫酸镁0.1g～0.9g、硫酸锰0.02g～0.1g、琼脂11g～20g；而抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法采用了所述MRS固体培养基对菌种进行培养，并且制备得到的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂不仅抑菌效率高，对金黄色葡萄球菌的抑菌率大于等于99％，且生物安全性好，对环境友好，且不易产生耐药性，无毒副作用以及生产成本低廉。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
1、生物抑菌剂安全性好
作为本发明的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂活性成分的枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z都是生物安全菌，广泛应用于食品发酵、生物医药、饲料加工、动物养殖、环境治理等行业，对人畜无害，安全性高。
2、不易产生耐药性
现有的应用于金黄色葡萄球菌防治的化学消毒剂类已经使用多年，病菌产生了耐药性。应用本发明的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂，作用靶点多，抑菌机制多样复杂，抑菌效果好，不容易产生耐药性。
3、环境友好
与化学消毒剂相比，本发明的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂无毒副作用、绿色环保、对环境友好。化学消毒剂的生产制备缺点是化学物质需要提取、化学合成等，制备工艺复杂、成本高，从环保的角度来看，不符合绿色环保生产要求，还存在提取废液、化学副产物等污染环境的风险。
4、抑菌率高
本发明提供的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂采用的枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z均表现出对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，组合成复合菌剂后，对金黄色葡萄球菌的抑菌率得到了大大提高，对金黄色葡萄球菌抑制率大于等于99％，对其他致病菌例如甲型H1N1流感病毒、绿脓杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、痢疾志贺氏菌和溶血性链球菌也有非常高的抑制作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明一实施例的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法流程图；
图2为本发明一实施例的枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图；
图3为本发明另一实施例的枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图；
图4为本发明一实施例的玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一实施方式中，一种MRS固体培养基，包括如下质量份的各组分：蛋白胨8g～12g、牛肉浸粉4g～7g、酵母浸粉2g～6g、葡萄糖17g～25g、吐温800.5g～2g、磷酸氢二钾1g～3g、乙酸钠3g～7g、柠檬酸三铵1g～4g、硫酸镁0.1g～0.9g、硫酸锰0.02g～0.1g、琼脂11g～20g。如此，通过采用上述组分及配比，使得所述MRS固体培养基能够更好地培养所需菌种，利于后续制备得到性能更加优异的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂。
请参阅图1，一实施方式中，抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S110、制备LB液体培养基及LB固体培养基。
通过制备LB液体培养基及LB固体培养基，能够用于后续对枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S进行培养和活化。为了获得活性更好的枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S，例如，在其中一个实施例中，所述LB固体培养基包括如下质量g的各组分：酵母提取物3g～6g、蛋白胨8g～12g、氯化钠8g～12g、琼脂13g～17g。又如，在其中一个实施例中，所述LB固体培养基包括如下质量g的各组分：酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂15g。如此，能够使制得的LB固体培养基更好的培养枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S。
S120、制备所述MRS固体培养基以及MRS液体培养基。
通过制备MRS液体培养基及MRS固体培养基，能够用于后续对玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z进行培养和活化。为了获得活性更好的玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z，例如，在其中一个实施例中，所述MRS固体培养基包括如下质量g的各组分：蛋白胨8g～12g、牛肉浸粉4g～7g、酵母浸粉2g～6g、葡萄糖17g～25g、吐温800.5g～2g、磷酸氢二钾1g～3g、乙酸钠3g～7g、柠檬酸三铵1g～4g、硫酸镁0.1g～0.9g、硫酸锰0.02g～0.1g、琼脂11g～20g。又如，在其中一个实施例中，所述MRS固体培养基包括如下质量g的各组分：蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、酵母浸粉4g、葡萄糖20g、吐温801g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂15g。如此，能够使制得的MRS固体培养基更好的培养玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z。
S130、将枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S划线接种至所述LB固体培养基，37℃恒温培养箱培养12h～24h，进行菌种活化，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落。
通过将枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S划线接种至所述LB固体培养基，37℃恒温培养箱培养12h～24h，能够对枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S进行活化，利于获得活性更好的枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落。
S140、将玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z划线接种至所述MRS固体培养基，37℃恒温培养箱培养24h～48h，进行菌种活化，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落。
通过将玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z划线接种至所述MRS固体培养基，37℃恒温培养箱培养24h～48h，能够对玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z进行活化，利于获得活性更好的玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落。
S150、在无菌条件下，将活化后的所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落接种至含有LB液体培养基的试管，置于37℃、150rpm的摇床上培养12h～24h，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液。
通过在无菌条件下，将活化后的所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落接种至含有LB液体培养基的试管，置于37℃、150rpm的摇床上培养12h～24h，能够获得活性更好的枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液，用于后续制备抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂。
S160、在无菌条件下，将活化后的所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落分别接种至含有MRS液体培养基的试管，置于37℃、30rpm的摇床培养24h～48h，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液。
通过在无菌条件下，将活化后的所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落分别接种至含有MRS液体培养基的试管，置于37℃、30rpm的摇床培养24h～48h，能够获得活性更好的玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液，用于后续制备抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂。
S170、将所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液进行混合培养操作，得到抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂。
通过将所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液进行混合培养操作，能够得到抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌。
一种抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂，包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HMJZ-B1005S和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)HMJZ-L2001Z，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)HMJZ-B1005S已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020237，所述玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)HMJZ-L2001Z已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020238。
需要说明的是，通过在自然界中分离纯化得到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)HMJZ-B1005S和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)HMJZ-L2001Z，并将它们进行保藏，本发明通过应用这两株微生物对金黄色葡萄球菌的抑菌方面进行开发应用，通过实验证实这两株微生物菌株均对金黄色葡萄球菌表现出较好的抑制作用，尤其是将这两种微生物组合成复合菌剂后，大大提高了对金黄色葡萄球菌的抑制率。这是由于所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z能够在空间营养上对病原菌形成竞争优势，同时，还能够代谢产生大量的有机酸，如乙酸、丁酸和乳酸等，以及产生大量的抑菌因子，如抗菌肽、乳酸菌素等，对金黄色葡萄球菌等致病菌进行杀灭。尤其需要说明的是，本发明通过采用特定配比的MRS固体培养基，能够使得采用所述MRS固体培养基进行培养的菌种获得更好的生长，而所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法正是通过采用上述培养基对菌株进行培养，利于获得活性更好的菌株，进而利于制备得到抑菌效果更好的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂。
为了提高所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂对致病菌的抑菌率，例如，在其中一个实施例中，所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z的有效菌浓度比例为(1～3)：(1～2)。如此，通过采用特定的配比，能够使得所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z发挥最优的协同配合作用，从而能够大大提高所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的抑菌性能；又如，在其中一个实施例中，所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z的有效菌浓度比例为1：1，如此，通过采用特定的配比，能够进一步提高所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂对致病菌的抑菌率。再如，在其中一个实施例中，所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z的最适生长温度为37℃。通过将所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z在37℃温度条件下进行培养以作为所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的有效活性成分，能够获得更好的抑菌效果。
所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂能够在工业应用中进行很好的应用，例如，在其中一个实施例中，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂在抑制金黄色葡萄球菌、甲型H1N1流感病毒、绿脓杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、痢疾志贺氏菌和溶血性链球菌中的应用。又如，在其中一个实施例中，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂对金黄色葡萄球菌的抑制率大于等于99％。又如，在其中一个实施例中，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂在环保、农业生产和日用品中的应用。再如，在其中一个实施例中，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂在消毒剂、抑菌液去味液中的应用。
上述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂，包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HMJZ-B1005S和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)HMJZ-L2001Z，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HMJZ-B1005S已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020237，所述玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)HMJZ-L2001Z已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020238。所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂不仅抑菌效率高，对金黄色葡萄球菌的抑菌率大于等于99％，且生物抑菌剂安全性好，对人畜无害，安全性高，对环境友好，与化学消毒剂相比，微生物菌剂无毒副作用、绿色环保，作用靶点多、抑菌机制多样复杂、抑菌效果好、不易产生耐药性。
下面是具体实施例部分。
实施例1
制备LB液体培养基及LB固体培养基：将酵母提取物5g，蛋白胨10g和氯化钠10g溶解在1L离子水中，将pH值调为7.2，得到LB液体培养基；LB固体培养基是向LB液体培养基加入琼脂粉15g进行加热溶解获得，将LB液体培养基及LB固体培养基在121℃下灭菌20min后备用。
制备MRS固体培养基以及MRS液体培养基：将蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、酵母浸粉4g、葡萄糖20g、吐温801g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵2g、硫酸镁0.2g和硫酸锰0.05g溶解在1L离子水中，将pH值调为6.8，得到MRS液体培养基；MRS固体培养基是向MRS液体培养基加入琼脂粉15g进行加热溶解获得，将MRS液体培养基及MRS固体培养基在121℃下灭菌20min后备用。
将枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S划线接种至所述LB固体培养基，37℃恒温培养箱培养24h，进行菌种活化，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落，其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HMJZ-B1005S已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020237。
将玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z划线接种至所述MRS固体培养基，37℃恒温培养箱培养48h，进行菌种活化，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落，其中，玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)HMJZ-L2001Z已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020238。
在无菌条件下，将活化后的所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落接种至含有LB液体培养基的试管，试管用硅胶塞塞住，置于37℃、150rpm的摇床上培养12h，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液；
在无菌条件下，将活化后的所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落分别接种至含有MRS液体培养基的试管，试管用硅胶塞塞住，置于37℃、30rpm的摇床培养24h，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液；
将所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液以有效菌浓度比例为1:1接种于同一支含LB液体培养基的试管中，装液量3mL，硅胶塞，在37℃、50rpm的摇床进行混合培养12h后，得到实施例1的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂。
实施例2
制备LB液体培养基及LB固体培养基：将酵母提取物3g，蛋白胨8g和氯化钠8g溶解在1L离子水中，将pH值调为7.2，得到LB液体培养基；LB固体培养基是向LB液体培养基加入琼脂粉13g进行加热溶解获得，将LB液体培养基及LB固体培养基在121℃下灭菌20min后备用。
制备MRS固体培养基以及MRS液体培养基：将蛋白胨8g、牛肉浸粉4g、酵母浸粉2g、葡萄糖20g、吐温800.5g、磷酸氢二钾1g、乙酸钠3g、柠檬酸三铵1g、硫酸镁0.1g和硫酸锰0.02g溶解在1L离子水中，将pH值调为6.8，得到MRS液体培养基；MRS固体培养基是向MRS液体培养基加入琼脂粉11g进行加热溶解获得，将MRS液体培养基及MRS固体培养基在121℃下灭菌20min后备用。
将枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S划线接种至所述LB固体培养基，37℃恒温培养箱培养12h，进行菌种活化，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落，其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HMJZ-B1005S已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020237。
将玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z划线接种至所述MRS固体培养基，37℃恒温培养箱培养24h，进行菌种活化，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落，其中，玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)HMJZ-L2001Z已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020238。
在无菌条件下，将活化后的所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落接种至含有LB液体培养基的试管，试管用硅胶塞塞住，置于37℃、150rpm的摇床上培养18h，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液；
在无菌条件下，将活化后的所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落分别接种至含有MRS液体培养基的试管，试管用硅胶塞塞住，置于37℃、30rpm的摇床培养30h，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液；
将所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液以有效菌浓度比例为1:2接种于同一支含LB液体培养基的试管中，装液量3mL，硅胶塞，在37℃、50rpm的摇床进行混合培养18h后，得到实施例2的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂。
实施例3
制备LB液体培养基及LB固体培养基：将酵母提取物6g，蛋白胨12g和氯化钠12g溶解在1L离子水中，将pH值调为7.2，得到LB液体培养基；LB固体培养基是向LB液体培养基加入琼脂粉17g进行加热溶解获得，将LB液体培养基及LB固体培养基在121℃下灭菌20min后备用。
制备MRS固体培养基以及MRS液体培养基：将蛋白胨12g、牛肉浸粉7g、酵母浸粉6g、葡萄糖25g、吐温802g、磷酸氢二钾3g、乙酸钠7g、柠檬酸三铵4g、硫酸镁0.9g和硫酸锰0.1g溶解在1L离子水中，将pH值调为6.8，得到MRS液体培养基；MRS固体培养基是向MRS液体培养基加入琼脂粉20g进行加热溶解获得，将MRS液体培养基及MRS固体培养基在121℃下灭菌20min后备用。
将枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S划线接种至所述LB固体培养基，37℃恒温培养箱培养24h，进行菌种活化，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落，其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HMJZ-B1005S已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020237。
将玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z划线接种至所述MRS固体培养基，37℃恒温培养箱培养48h，进行菌种活化，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落，其中，玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)HMJZ-L2001Z已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020238。
在无菌条件下，将活化后的所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落接种至含有LB液体培养基的试管，试管用硅胶塞塞住，置于37℃、150rpm的摇床上培养24h，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液；
在无菌条件下，将活化后的所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落分别接种至含有MRS液体培养基的试管，试管用硅胶塞塞住，置于37℃、30rpm的摇床培养48h，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液；
将所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液以有效菌浓度比例为2:3接种于同一支含LB液体培养基的试管中，装液量3mL，硅胶塞，在37℃、50rpm的摇床进行混合培养24h后，得到实施例3的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂。
实施例4
抑菌实验。
准备致病菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)AGCC 6528P，购自宁波明舟生物科技有限公司。
将金黄色葡萄球菌AGCC 6528P划线接种至LB固体培养基，37℃恒温培养箱培养24h，进行菌种活化。
挑取活化后的金黄色葡萄球菌AGCC 6528P单菌落，接种于LB液体培养基是试管中，试管用硅胶塞盖住，置于37℃、150～200rpm摇床中培养12h，试管装液量3mL，通过显微镜观察检测确认没有发生污染，获得相应的金黄色葡萄球菌AGCC 6528P测试菌液。
取300μL新鲜培养好的金黄色葡萄球菌AGCC 6528P测试菌液分别接种于含有实施例1-3的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的LB液体培养基的平板中，置于37℃、150rpm摇床中培养24h后，利用抑菌圈法直接观察实施例1-3的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂分别对金黄色葡萄球菌菌株AGCC6528P的抑制效果，可参阅图2-图4，另外还以金黄色葡萄球菌AGCC 6528P单独培养的平均菌落数为对照组数值(CK)，通过平板生长菌落的活菌计数法进行抑菌率的测定。
对比例1
取300μL新鲜培养好的金黄色葡萄球菌AGCC 6528P测试菌液接种于含有枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液的LB液体培养基的平板中，置于37℃、150rpm摇床中培养24h后，利用抑菌圈法直接观察枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S对金黄色葡萄球菌菌株AGCC 6528P的抑制效果，可参阅图2-图4，另外还以金黄色葡萄球菌AGCC 6528P单独培养的平均菌落数为对照组数值(CK)，通过平板生长菌落的活菌计数法进行抑菌率的测定。
对比例2
取300μL新鲜培养好的金黄色葡萄球菌AGCC 6528P测试菌液接种于含有玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液的LB液体培养基的平板中，置于37℃、150rpm摇床中培养24h后，利用抑菌圈法直接观察玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z对金黄色葡萄球菌菌株AGCC 6528P的抑制效果，可参阅图2-图4，另外还以金黄色葡萄球菌AGCC 6528P单独培养的平均菌落数为对照组数值(CK)，通过平板生长菌落的活菌计数法进行抑菌率的测定。
活菌计数方法：挑取实施例4中含有实施例1-3的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的三个平板及对比例1-2中的两个平板中的菌悬液，摇匀后，用无菌生理盐水按10倍逐步稀释法，分别将其稀释成104倍稀释液，各取0.1L稀释液接种于LB液体培养基的平板中，重复3次，置37℃恒温箱中进行培养，24h后菌落计数，获得实验组的平均菌落数值X病菌，以金黄色葡萄球菌AGCC 6528P单独培养的平均菌落数为对照组数值(CK)，进行菌落确认和计数。
抑菌率计算公式如下:抑菌率(％)＝(CK-X病菌)/CK×100％。
以下表1是实施例1-3的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂以及对比例例1-2对金黄色葡萄球菌AGCC 6528P的抑菌率。
表1
Figure BDA0002696521860000141
Figure BDA0002696521860000151
通过表1的结果可知，本发明的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂对金黄色葡萄球菌的抑菌率非常高，尤其是实施例1的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂对金黄色葡萄球菌的抑菌率高达99.5％，抑菌效果显著；而单纯的枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S对金黄色葡萄球菌的抑菌率为72.6％，单纯的玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z对金黄色葡萄球菌的抑菌率为59.7％，故本发明的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂能够有效抑制金黄色葡萄球菌的繁殖，进而能够降低引起相关感染疾病的风险，且在环保、农业、日用品比例消毒剂和抑菌液中都能应用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种MRS固体培养基，其特征在于，包括如下质量份的各组分：蛋白胨8g～12g、牛肉浸粉4g～7g、酵母浸粉2g～6g、葡萄糖17g～25g、吐温80 0.5g～2g、磷酸氢二钾1g～3g、乙酸钠3g～7g、柠檬酸三铵1g～4g、硫酸镁0.1g～0.9g、硫酸锰0.02g～0.1g、琼脂11g～20g。
2.一种抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备LB液体培养基及LB固体培养基；
制备如权利要求1所述的MRS固体培养基以及MRS液体培养基；
将枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S划线接种至所述LB固体培养基，37℃恒温培养箱培养12h～24h，进行菌种活化，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落；
将玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z划线接种至所述MRS固体培养基，37℃恒温培养箱培养24h～48h，进行菌种活化，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落；
在无菌条件下，将活化后的所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S单菌落接种至含有LB液体培养基的试管，置于37℃、150rpm的摇床上培养12h～24h，获得枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液；
在无菌条件下，将活化后的所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z单菌落分别接种至含有MRS液体培养基的试管，置于37℃、30rpm的摇床培养24h～48h，获得玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液；
将所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S菌悬液和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z菌悬液进行混合培养操作，得到抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂。
3.根据权利要求2所述的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述LB固体培养基包括如下质量份的各组分：酵母提取物3g～6g、蛋白胨8g～12g、氯化钠8g～12g、琼脂13g～17g。
4.根据权利要求2所述的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z的有效菌浓度比例为(1～3)：(1～2)。
5.根据权利要求2所述的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌HMJZ-B1005S和所述玉米乳杆菌HMJZ-L2001Z的最适生长温度为37℃。
6.一种抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂，其特征在于，采用如权利要求2所述的制备方法制备得到，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HMJZ-B1005S和玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)HMJZ-L2001Z，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HMJZ-B1005S已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020237，所述玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)HMJZ-L2001Z已于2020年6月28日保藏于武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020238。
7.根据权利要求6所述的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂，其特征在于，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂在抑制金黄色葡萄球菌、甲型H1N1流感病毒、绿脓杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、痢疾志贺氏菌和溶血性链球菌中的应用。
8.根据权利要求6所述的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂，其特征在于，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂对金黄色葡萄球菌的抑制率大于等于99％。
9.根据权利要求6所述的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂，其特征在于，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂在消毒剂、抑菌液去味液中的应用。
10.根据权利要求6所述的抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂，其特征在于，所述抑制金黄色葡萄球菌的微生物复合菌剂在环保、农业生产和日用品中的应用。
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