CN101563087B

CN101563087B - 均二苯代乙烯衍生物用于治疗和预防水生霉菌感染的用途

Info

Publication number: CN101563087B
Application number: CN200780031852.5A
Authority: CN
Inventors: 伊扎克·波拉奇克; 西蒙·迪恩曼; 拉玛·福克
Original assignee: Israel Ministry Of Agriculture & Rural Development Agricultural Research Organization; Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Israel Ministry Of Agriculture & Rural Development Agricultural Research Organization; Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 2006-06-27
Filing date: 2007-06-27
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2027-06-27
Also published as: AU2007264670A1; US20090252768A1; EP2043657A2; WO2008001368A3; WO2008001368A2; US8377934B2; BRPI0713792A2; CN101563087A; BRPI0713792A8; EP2043657A4

Abstract

本发明涉及治疗和预防水生生物的水生霉菌感染的方法和消毒用于饲养水生生物的装置的方法。所述方法包括使用一种或多种均二苯代乙烯衍生物，所述衍生物包括4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物。

Description

均二苯代乙烯衍生物用于治疗和预防水生霉菌感染的用途

发明领域

本发明涉及均二苯代乙烯衍生物(stilbene derivative)的组合物，其用于治疗和预防水生生物如鱼和鱼卵的霉菌感染的方法。

发明背景

卵菌(oomycete)(水霉)如水霉属(Saprolegnia)、鳃霉属(Branchiomyces)和丝囊霉属(Aphanomyces)是造成水产养殖、养鱼场和兴趣鱼池(hobby fishtank)中的鱼毁坏性感染的主要原因。

水霉属的成员引起水霉病(saprolegniosis)，这种疾病的特征为淡水鱼的身体或鳍上可见的丝状菌丝体(filamentous mycelium)的白斑或灰斑。如果不进行治疗，则水霉菌(Saprolegnia species(spp.))的感染通过血液稀释导致死亡。水霉菌还通过粘附卵膜和穿透卵膜而感染鱼卵。水霉菌被认为是腐生菌(saprophyte)型机会致病菌。感染时常在冬季发生，经常导致大规模“冻死”流行。促进水霉菌及其传染性游动孢子繁殖的条件包括水温的突然下降和高密度鱼养殖活动，并且也表现为由于增加的生理学应激和免疫系统抑制致使鱼易受感染。

寄生水霉(Saprolegnia parasitica)是最具经济破坏性的鱼病原体之一，在全世界每年引起数百万美元的损失，特别是在鲑鱼和鳟鱼市场中。除是机会致病菌之外，一些寄生水霉菌株为高致病性的并且引起原发性感染。

鳃霉病是另一种在淡水鱼中、主要是在鲤鱼和鳗鱼中发生的感染。它是由血鳃霉(Branchiomyces sanguinis)和穿移鳃霉(B.demigrans)引起的，其中受影响的鱼显示明显的鳃坏死和呼吸窘迫。这种疾病最通常在有机物质丰富和高氨水平的池塘中发生。

寄生虫感染在商业性鱼养殖环境中经常并发或伴有卵菌感染。这种寄生虫感染包括由多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifilis)、车轮虫(Trichodinaspp.)、指环虫(Dactylogyrus spp.)和三代虫(Gyrodactylus spp.)引起的那些感染。

包括水霉菌和鳃霉菌在内的卵菌是丝状真核微生物，它们具有很多真菌样(fungus-like)的特性，但不是真正的真菌。像真正的真菌一样，它们以腐物为食，并且生长成具有无隔菌丝的分枝丝状体。但是，它们的细胞壁不是(如在真正的真菌中)主要由甲壳质组成，而是主要由纤维素化合物和其他β-葡聚糖的混合物组成。此外，卵菌具有未在真菌中发现的几种明确定义的发育阶段。但是，最近的分子研究显示在卵菌和真菌之间共享紧密相关的毒性组分。

用于治疗包括水霉病和鳃霉病在内的致病性卵菌感染的现有技术方法具有各种缺点。已经公开化学品敌草快(除草剂)、苯扎氯铵、硫酸铜和高锰酸钾都可用于治疗鳃霉病。但是美国食品与药品管理局没有批准这些化学品中的任何一个用于食用鱼的疾病控制。

US 6,160,023公开了溴硝丙二醇(2-溴-硝基丙烷-1，3-二醇)用于治疗和预防鱼的寄生水霉感染以及用于消毒用来饲养鱼的装置的用途。这种化合物主要有效抵抗存在于鱼卵中、而不是在鱼中出现的感染。此外，它对商业上重要的鱼种类具有相当的毒性。

孔雀绿(4-[(4-二甲氨基苯基)-苯基-甲基]-N，N-二甲基-苯胺)之前广泛用于控制水霉病。尽管这种有机染料在杀死寄生水霉的方面非常有效，但是由于其致癌性、致畸性和毒理学性质，它自2002年后在全世界已遭禁用。这已导致在商业环境中水霉属感染急剧增加。因此，迫切需要治疗水霉病的新型替代方法。

还已知控制鱼的寄生虫感染的方法。US 5,464,837和US 5,188,832公开了三嗪二酮化合物的用途；US 5,313,911公开了过氧化氢的用途；US6,054,454公开了噁二嗪衍生物的用途；US 6,982,285公开了苯甲酰脲衍生物的用途；US 6,117,457公开了过氧乙酸的用途；US 5,593,678公开了原钒酸盐的用途；US 5,504,081公开了硝基亚甲基衍生物的用途。已知这些方法中没有一个可用于同时控制卵菌感染和寄生虫感染。

均二苯代乙烯衍生物(包括4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物)是已知的荧光增白剂，其与含有β-糖苷键的多糖(包括纤维素和甲壳质)结合。这类化合物显示抗真菌活性，可能是因为其与甲壳质微纤维相互作用并破坏这种甲壳质微纤维，而所述甲壳质微纤维构成真菌细胞壁的主要结构成分(Roncero等(1985)J.Bacteriol.163：1180-1185)。已在其细胞壁包含甲壳质的真正的真菌中证明了荧光增白剂的抗真菌作用，所述真正的真菌包括植物致病性真菌(Seppanen等(2004)Plant Cell.Rep.22：584-593)、人致病性真菌样酵母(Roncero等(1988)J.Bacteriol.170：1950-54)、皮肤真菌(Inamori等(1985)Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)33：2904-9)和红藻(Belliveau等(1990)Stain Technol.65：303-311)，但在其细胞壁包含纤维素而不是甲壳质的水生霉菌中未证明荧光增白剂的抗真菌作用。

US 4,723,034公开了用作用于植物保护和木材防腐的杀真菌剂的2-乙烯基均二苯代乙烯衍生物。

US 5,359,131和US 5,852,015公开了具有抗病毒作用的均二苯代乙烯衍生物。

US 5,879,674公开了通过使用均二苯代乙烯衍生物诱导体表附生的病毒感染保护植物农作物免遭昆虫攻击的方法。

US 6,919,452和美国专利申请公布第US 2005/0230662号公开了4，4’-双(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物及其作为荧光增白剂的用途。现有技术中没有任何地方教导或表明均二苯代乙烯衍生物可用于治疗水生霉菌感染。

发明概述

本发明提供有效预防和治疗水生生物的卵菌感染的方法。有利地，本发明的方法涉及包含已知化合物的组合物的用途，所述组合物具有可忽略的毒性作用并且甚至在供人消费的水生物种中使用是可接受的。特别是，本发明提供使用均二苯代乙烯衍生物来治疗和预防卵菌感染的新型方法。本发明部分基于意外的发现，即包括4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物的均二苯代乙烯衍生物可有效预防和治疗在包括鱼和鱼卵在内的水生生物中出现的卵菌感染如水霉病。本发明的方法既可有效用于临床病征可能并不明显的感染早期，也可有效用于建立感染(established infection)的感染晚期。不希望受任何具体理论或作用机制束缚，这种活性可以是由于这种化合物干扰卵菌的细胞壁合成的能力。

根据第一方面，本发明提供预防或治疗水生生物的卵菌感染的方法，所述方法包括将所述水生生物与有效量的至少一种下式(I)的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物及其盐、水合物、溶剂合物和多晶型物接触的步骤：

式(I)

其中R₁和R₂是相同或不同的且各自独立选自由SO₃H、SO₃Na、SO₃K、SO₃NH₄和H组成的组；并且其中R₃至R₁₀是相同或不同的，且选自由下列基团组成的组：H；直链或支链C₁-C₆烷基；直链或支链C₂-C₆链烯基，其中所述烷基或链烯基各自独立为未取代的或被羟基、羧基或甲酰胺基取代；苯基；和被R₁或R₂取代的苯基，其中R₁和R₂如上所定义；或者R₃和R₄、R₅和R₆、R₇和R₈或R₉和R₁₀中的一个或多个与连接它们的氮一起形成杂环，所述杂环可进一步包含选自N、O和S的一个或多个另外的杂原子。

根据另一个方面，本发明提供消毒用于饲养水生生物的装置的方法，其中所述装置被卵菌污染，所述方法包括将所述装置与有效量的至少一种式(I)的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物接触的步骤。

在本发明方法的特定实施方案中，R₃、R₄、R₇和R₈中的两个或更多个是相同的并且选自由CH₂CH₂OH、CH₂CHOHCH₃、CH₂CH₂CONH₂、CH₃和H组成的组；或者R₃和R₄、R₇和R₈中的一个或多个与连接它们的氮一起形成吗啉基环。在其他的实施方案中，R₅、R₆、R₉和R₁₀中的两个或更多个是相同的并且选自由苯基和被SO₃Na取代的苯基组成的组。在其他的实施方案中，R₁和R₂是相同的并且选自SO₃H和SO₃Na。在还有其他的实施方案中，R₁和R₂是不同的并且选自SO₃H、SO₃Na、SO₃K、SO₃NH₄和H。

在本发明方法的特定实施方案中，4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物选自4，4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸；

4，4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸二钠；

4，4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸钾钠；

2，2’-均二苯代乙烯二磺酸，4，4’-双-(4-苯胺基-6-((2-羟乙基)甲氨基)-顺-三嗪-2-基)氨基)-，二钠盐(2，2′-stilbenedisulfonic acid，4，4′-bis-(4-anilino-6-((2-hydroxyethyl)methylamino)-s-triazin-2-yl)amino)-，disodium salt)；

4，4’-双[(4-苯胺基-6-吗啉基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸二钠；

4，4’-双[[4-[双(2-羟乙基)氨基]-6-(4-磺酸苯胺基(sulfonatoanilino))-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸四钠；

4，4’-双[[4-[双(2-羟丙基)氨基]-6-[(4-磺酸苯基)氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]-均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸四钠；

和2，2’-均二苯代乙烯二磺酸，4，4’-双-[[4-[(2-氨基甲酰基乙基)(2-羟乙基)氨基]-6-(对磺基苯胺基)-顺-三嗪-2-基]氨基]-，四钠盐(2，2′-stilbenedisulfonic acid，4，4′-bis-[[4-[(2-carbamoylethyl)(2-hydroxylethyl)amino]-6-(p-sulfoanilino)-s-triazin-2-y1]amino]-，tetrasodiuni salt)。

在本发明方法的特定实施方案中，所述卵菌选自水霉菌、丝囊霉菌和鳃霉菌。在更具体的实施方案中，所述卵菌为寄生水霉。

在本发明方法的特定实施方案中，所述至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物以溶液供给。在其他特定的实施方案中，所述至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物以约20至约200mg/L的浓度存在于溶液中。根据优选的实施方案，至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物以约25mg/L的浓度存在于溶液中。

在本发明方法的特定实施方案中，所述水生生物选自鱼、鱼卵和水生有壳类动物。在特定的实施方案中，所述鱼选自澳洲肺鱼(barramundi)、鲈鱼(bass)、鳊鱼(bream)、鲤鱼(carp)、鲶鱼(catfish)、鲢鱼(chub)、鳗鱼(eel)、幼鳗(elver)、比目鱼(flounder)、乌颊鱼(gilthead)、虹鳉(guppy)、大比目鱼(halibut)、锦鲤(koi)、狼鲈(labrax)、鲻鱼(mullet)、白鲟(paddlefish)、鲽鱼(plaice)、鲳鲹(pompano)、红鱼(redfish)、红鼓鱼(red-drum)、鲑鱼(salmon)、鳎(sole)、鲟鱼(sturgeon)、罗非鱼(tilapia)、鳟鱼(trout)、金枪鱼(tuna)和白鲑(whitefish)。

在本发明方法的特定实施方案中，所述接触步骤持续约2至约16小时的时间。在优选的实施方案中，所述接触步骤持续约8小时的时间。在其他的实施方案中，所述接触步骤以48小时的间隔重复。

在预防或治疗水生生物的卵菌感染的方法的一个实施方案中，所述卵菌感染并发或伴有寄生虫感染。在另一个实施方案中，所述寄生虫感染由选自由下列寄生虫组成的组的至少一种寄生虫引起：淀粉卵圆虫(Amyloodinium spp.)、鱼虱(Argulus spp.)、凹管线虫(Ascocotyle spp.)、头槽绦虫(Bothricephalus spp.)、驼形线虫(Camallanus spp.)、毛细线虫(Capillariaspp.)、棘带吸虫(Centrocestus spp.)、斜管虫(Chiloonella spp.)、球虫(Coccidia spp.)、对盲囊线虫(Contracaecum spp.)、隐鞭虫(Cryptobia spp.)、隐核虫(Cryptocaryon spp.)、指环虫、肤胞虫(Dermocystidium spp.)、大角鱼虱(Ergasilus spp.)、Euclinostomum spp.、三代虫、六鞭毛虫(Hexamita spp.)、鱼波豆虫(Ichtyobodo spp.)、小瓜虫(Ichtyophtirius spp.)、锚头鳋(Lernaeaspp.)、后囊蚴(Metacercarius spp.)、微孢子虫(Microsporidia spp.)、粘孢子虫(Myxosporea spp.)、卵圆虫(Oodinium spp.)、血居吸虫(Sanguinicola spp.)、无柄虫(Sessiline spp.)、旋核鞭毛虫(Spironucleus spp.)、四膜虫(Tetrahymenaspp.)、车轮虫、小车轮虫(Trichodinella spp.)和三分虫(Tripartiella spp.)。

在消毒用于饲养水生生物的装置的方法的一个实施方案中，所述装置进一步被至少一种寄生虫污染。在另一个实施方案中，所述至少一种寄生虫选自由下列寄生虫组成的组：淀粉卵圆虫、鱼虱、凹管线虫、头槽绦虫、驼形线虫、毛细线虫、棘带吸虫、斜管虫、球虫、对盲囊线虫、隐鞭虫、隐核虫、指环虫、肤胞虫、大角鱼虱、Euclinostomum spp.、三代虫、六鞭毛虫、鱼波豆虫、小瓜虫、锚头鳋、后囊蚴、微孢子虫、粘孢子虫、卵圆虫、血居吸虫、无柄虫、旋核鞭毛虫、四膜虫、车轮虫、小车轮虫和三分虫。

应明确理解，本发明的范围包括本领域已知的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物的变体，如其盐、水合物、溶剂化物和多晶型物，条件是这些变体必须保持预防和治疗本发明上下文中的水生生物的卵菌感染的能力。

本发明的其他目标、特征和优点根据下列描述和附图将变得清楚。然而，应理解，尽管详细的描述和特定实施例指示本发明优选的实施方案，但是其仅是作为说明而被提供的，因为根据这些详细的描述，本发明的精神和范围内的各种变化和变更对本领域技术人员来说将变得明显。

附图简述

图1说明了各种化合物在罗非鱼中的毒性。MG，孔雀绿；AmB，两性霉素B制剂；En，恩康唑(enilconazole)；Det，洗涤剂和消毒剂；CS，硫酸铜；Py，

FA，甲醛；SPC，过碳酸钠；HP，过氧化氢；BA，

BA。

图2说明了

BA(包含4，4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸钾钠)和孔雀绿(4-[(4-二甲氨基苯基)-苯基-甲基]-N，N-二甲基-苯胺)在罗非鱼-水霉病早期感染模型系统中的疗效。罗非鱼在接触水霉菌后第2、4和6天用

BA 100mg/L(◆)或200mg/L(●)、或者用孔雀绿0.25mg/L(▲)治疗。对照，(■)。

图3说明了

BA、甲醛和孔雀绿在罗非鱼-水霉病早期感染模型系统中的疗效。罗非鱼在接触水霉菌后第2、4和6天用 BA25mg/L(▲)或50mg/L(◆)、孔雀绿0.25mg/L()或甲醛50mg/L(●)治疗。在另外的实验中，罗非鱼在接触后第2和9天用 BA 50mg/L(△)治疗、或者在接触后第2天用

BA 100mg/L(◇)治疗。对照，(■)。

图4说明了

BA在罗非鱼-水霉病已建立感染的模型系统中的疗效。罗非鱼在接触水霉菌后第3和8天用

BA 100mg/L(△)、50mg/L(○)或25mg/L(▲)治疗。对照，(◆)。

图5显示用(A组)和未用(B组)

BA治疗的水霉菌细胞壁的扫描电子显微术。放大倍数：3000×。

图6说明了如经¹⁴C-吸收所测定的接触

BA(100mg/L)()对小球藻属(Chlorella)(C)、微囊藻属(Microcystis)(M)、多甲藻属(Peridinium)(P)和直链藻属(Melosira)(Me)的纯培养物和来自基尼烈湖(Lake Kinneret)(LK)的样品的光合活性的影响。对照，(■)。

发明详述

依照本发明，提供用于预防和治疗在包括鱼和鱼卵在内的水生生物中出现的卵菌感染的方法，以及消毒用于饲养水生生物的装置的方法，其中所述装置被卵菌污染。

在其他的实施方案中，R₅、R₆、R₉和R₁₀中的两个或更多个是相同的并且选自由苯基和被SO₃Na取代的苯基组成的组。在其他的实施方案中，R₁和R₂是相同的并且选自SO₃H和SO₃Na。在还有其他的实施方案中，R₁和R₂是不同的并且选自SO₃H、SO₃Na、SO₃K、SO₃NH₄和H。

用于本发明的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物的实例包括但不限于4，4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸；4，4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸二钠；4，4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸钾钠；2，2’-均二苯代乙烯二磺酸，4，4’-双-(4-苯胺基-6-((2-羟乙基)甲氨基)-顺-三嗪-2-基)氨基)-，二钠盐；4，4’-双[(4-苯胺基-6-吗啉基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸二钠；4，4’-双[[4-[双(2-羟乙基)氨基]-6-(4-磺酸苯胺基)-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸四钠；4，4’-双[[4-[双(2-羟丙基)氨基]-6-[(4-磺酸苯基)氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]-均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸四钠；和2，2’-均二苯代乙烯二磺酸，4，4’-双-[[4-[(2-氨基甲酰基乙基)(2-羟乙基)氨基]-6-(对磺基苯胺基)-顺-三嗪-2-基]氨基]-，四钠盐。

当上述化合物包括一个或多个手性中心时，这些手性中心的立体化学可独立是R或S构型，或者两者的混合物。所述手性中心可进一步指定为R或S或R，S或d，D、l，L或d，l、D，L。

定义

本文所用的术语“C₁至C₆烷基”是指饱和基团，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、叔戊基、己基及类似基团。优选的C₁至C₆烷基是甲基、乙基和丙基。所述C₁至C₆烷基任选地独立被羟基、羧基或甲酰胺基取代。优选的取代基是羟基和甲酰胺基。示例性的取代的C₁至C₆烷基是羟乙基、羟丙基和乙基甲酰胺基(ethylcarboxamido)。在本发明的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物的特定实施方案中，R₅、R₆、R₇和R₈各自为羟乙基。在其他具体的实施方案中，R₅或R₆和R₇或R₈中的两个是羟乙基并且另两个是H。在还有其他的实施方案中，R₅、R₆、R₇和R₈各自为羟丙基。在还有其他的实施方案中，R₅或R₆和R₇或R₈中的两个是乙基甲酰胺基并且另两个是羟乙基。

本文所用的术语“C₂至C₆链烯基”是指诸如在任何合适的碳位连接的乙烯基、烯丙基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基及类似基团的未饱和基团以及直链或支链的二烯和三烯。所述C₂至C₆链烯基任选地被羟基、羧基或甲酰胺基取代。

4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物可任选地在R₃至R₁₀中的任何一个或多个处被苯基或被被R₁或R₂取代的苯基取代，其中所述R₁和R₂如上所定义。在特定的实施方案中，R₃或R₄、和R₉或R₁₀中的两个是苯基并且另两个是H。

本文所用的术语“被R₁或R₂取代的苯基”是指被选自由SO₃H、SO₃Na、SO₃K、SO₃NH₄和H组成的组的一个或多个部分取代的苯基。在特定的实施方案中，R₃或R₄、和R₉或R₁₀中的两个是被SO₃Na取代的苯基并且另两个是H。

本文所用的术语“可进一步包含选自N、O和S的一个或多个杂原子的杂环”是指任选取代的五元环至八元环，其可含有与氮环原子连接的1个至4个杂原子如氮、氧和/或硫，特别是氧。这些五元环至八元环可以是饱和的、完全不饱和的、部分不饱和的或芳香族的，其中优选完全饱和的环。根据本发明的杂环包括但不限于吗啉代、哌啶基、哌嗪基、咪唑基、2-氨基-咪唑基、吡咯基、庚基亚甲基亚氨基、噻唑、三唑、四唑吡咯烷、吡唑、咪唑、吡啶、硫代吗啉、噁唑和嘧啶。

本文所用的术语“有效量”是指在与至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物接触某一时段后有效治疗、预防、保护、修复、解毒或消毒水生生物以抵抗卵菌感染或者治疗、预防、保护、修复、解毒或消毒装置以抵抗卵菌感染的本发明的至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物的量。

4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物

用于本发明方法的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物包括已知的已用于纺织、洗涤剂和造纸工业的增白剂。这类化合物通常被称为C.I.荧光增白剂(具有各种数字后缀)，并且包括例如C.I.荧光增白剂28、C.I.荧光增白剂113、C.I.荧光增白剂28/113、C.I.荧光增白剂220、C.I.荧光增白剂235、C.I.荧光增白剂260和C.I.荧光增白剂263。C.I.荧光增白剂具有共同的骨架分子结构，但是关于与苯环和三嗪环的任一个或两者连接的取代基以及关于盐或酸衍生物的性质不同。进一步，C.I.荧光增白剂以各种商标名销售，并且一种化合物可有很多不同的别名。例如，4，4’-双-(6-苯胺基-1，4-双)2-羟乙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸二钠已知的通用名是C.I.荧光增白剂28，并且除其他商标名之外已经以商标名

和

销售。C.I.荧光增白剂以水溶液或粉末制剂供给。例如，

BA Liquid(Lanxess)是包含混合盐4，4’-双-(6-苯胺基-4-双)2-羟乙基)氨基)-1，3，5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸钾钠的水溶液。

还预想了其他的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物，并且它们可通过改变与苯环和三嗪环的任一个或两者连接的取代基和/或盐衍生物而产生。它们可以是以盐、混合盐、游离酸及其混合物的形式。这些衍生物可被本领域技术人员容易设计和合成。

用于本发明方法的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物可以以各种制剂如水溶液或用水重建的粉末制剂供给。水性制剂可包含有助于溶解性的试剂。粉末制剂可包含分散剂或除尘剂(dedusting agent)。这些赋形剂应略溶于水且对活生物和环境无毒。

用于本发明方法的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物可略溶于水。一般而言，如本领域技术人员已知，水溶性可通过增加亲水取代基如磺酸盐和羟基的数目而增加。

用于本发明方法的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物对水解稳定，但是可在水气中遭受光降解，这是由于其在水中有340至360nm之间的最大UV吸收。它们可能是或可能不是易生物可降解的；在后者的情况下，它们优选被吸附在废水处理系统中的淤泥上。

用于本发明方法的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物对活生物和环境的影响极小。例如，已证明C.I荧光增白剂28、 220、235、260和263的整体相对安全性。据报道，这些化合物对鱼、环节动物和细菌有低毒性，并对水生无脊椎动物和藻类有低至中等毒性。就哺乳动物而言，它们具有低急性或重复剂量口服毒性，不诱变或诱裂，不是生殖或发育毒剂，并且通常不会刺激皮肤和眼睛或使它们过敏(于2005年10月6日经由ETAD荧光增白剂工作组向美国环境保护署提交的Stilbene Fluorescent Whitening Agents Category(均二苯代乙烯荧光增白剂分类))。

推测的作用机制

不希望受任何具体理论或作用机制的束缚，本发明的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物抗卵菌的疗效和预防效能可归因于这类化合物破坏卵菌细胞壁的能力。已知各种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物与如以纤维素(β-(1，4)连接的D-葡萄糖单元聚合物)存在的含有β-糖苷键的多糖结合。卵菌细胞壁通常包含纤维素和其他β-葡聚糖聚合物，例如β-(1，2)连接的和β-(1，6)连接的D-葡萄糖单元聚合物，作为主要结构元件。尽管这些聚合物的比例和连接(linkage)在不同的卵菌属和种中不同，但是这些大分子是本发明的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物的可能的靶点。这些化合物向完全形成的和/或新生的β-糖苷聚合物的嵌入损害细胞壁的整体性，最终导致细胞溶解。

这种作用机制可类似于或类同于4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物对真正的真菌产生的作用机制，在真正的真菌中甲壳质(β-(1，4)连接的N-乙酰-D-葡糖胺单元聚合物)是细胞壁的主要结构组分。

卵菌病原体和水生生物的疾病

本发明的方法有效抵抗攻击包括鱼和水生有壳类动物在内的水生生物的致病卵菌。卵菌包括但不限于绵霉菌(Achyla spp.)、丝囊霉菌、鳃霉菌、短杆真菌(Brevilegnia spp.)、肤胞虫、网囊霉菌(Dictyuchus spp.)、鱼孢霉菌(Ichthyophonus spp.)、异绵霉菌(Isoachyla spp.)、细囊霉菌(Leptolegnia spp.)、细丝菌(Leptomitus spp.)、原绵霉菌(Protoachyla spp.)、腐霉菌(Pythium spp.)、水霉菌和破囊霉菌(Thraustotheca spp.)。

水霉属的生物、特别是寄生水霉导致水霉病，在鱼中出现的最常见且重要的卵菌感染之一。和所有腐生卵菌一样，水霉菌通过将降解酶类分泌在与其粘附的表面上，从而促使营养素如蛋白质和碳水化合物的吸收而饲养。水霉病经常在由寄生虫、病毒、细菌感染和擦伤(abrasion)引起的鱼体被(integument)(皮肤和腮)损伤后以继发感染出现。其他患病因素包括过度拥挤、密集处理和水污染。偶尔，水霉菌可充当感染还未遭受体被损伤的鱼的原发性病原体的角色。这种攻击是温度依赖性的，通常在低温下发生，这可能是由于免疫反应下降。除对鱼有危险之外，水霉菌还感染鱼卵。

水霉病以像棉絮丛的灰/白斑出现在皮肤或腮上。在后期当这些斑捕获沉积物或藻类时，它们可变成棕色或绿色。如果将鱼从水中移开，那么真菌以粘性粗糙块(slimy matted mass)出现。水霉菌通常建成小的病灶感染，然后病灶感染快速扩散至机体或腮上。随着它的扩散，健康组织被破坏。经常很少发炎，除非有潜在的细菌感染。显微镜检查显示粗的无隔菌丝，典型的卵菌。

绵霉菌引起类似于水霉病并且在类似条件下的疾病。

鳃霉病或“烂腮(gill rot)”由血鳃霉和穿移鳃霉引起。这两物种在遭受环境应激如低pH、低溶解氧、高藻华或高氨水平的鱼中出现。受影响的鱼变得嗜睡的且鳃为有条纹状的(striated)或有斑纹的(marbled)，其中苍白区域表示受感染和垂死的组织。

卵菌感染通过从受感染组织释放的传染性游动孢子在鱼中传染。

水生生物

根据本发明，预防或治疗卵菌感染的方法可用于被卵菌病原体感染或处于受卵菌病原体感染的危险的多种水生生物。水生生物包括但不限于鱼及其卵。所述鱼包括所有年龄的在商业性鱼养殖环境中饲养的经济上可用的鱼以及养殖鱼、观赏鱼和装饰鱼，它们生活在淡水和海水中。所述鱼包括但不限于澳洲肺鱼、鲈鱼、鳊鱼、鲤鱼、鲶鱼、鲢鱼、鳗鱼、幼鳗、比目鱼、乌颊鱼、虹鳉、大比目鱼、锦鲤鱼、狼鲈、鲻鱼、白鲟、鲽鱼、鲳鲹、红鱼、红鼓鱼、鲑鱼、鳎、鲟鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼和白鲑。水生生物进一步包括但不限于水生有壳类动物(贝类和甲壳动物)，例如鲍鱼、蛤、蟹、陆蛤(geoduck)、贻贝(mussel)、龙虾、牡蛎、对虾、小虾(shrimp)和海胆(urchin)。

用于饲养水生生物的装置

根据本发明，消毒用于饲养水生生物的装置的方法涉及用于容纳、饲养、处理和治疗水生生物如鱼的装置。在水生生物中检测到卵菌疾病充分指示装置通过直接与受感染的藏匿菌丝体(hyphal mycelia)的水生生物接触或者与散布的游动孢子接触而被污染。所述装置需要消毒以便消除例如患有卵菌疾病且已根据本发明治疗的成熟鱼中的复发性感染的可能性，或者引入或接触所述装置的幼鱼或卵的新感染的可能性。所述装置包括养鱼缸(aquarium)、盆(basin)、槽(bath)、盒(cage)、过滤器、网状物(mesh)、网(net)、水库(pond)、池塘(pool)、池(tank)、转移设备(transfer apparatus)、沟(trough)、温度计及类似装置。

寄生虫感染

寄生虫感染经常并发或伴有卵菌感染，例如在商业性鱼养殖环境和兴趣养鱼缸中。遭受应激和/或不利环境条件的鱼由于免疫系统抑制可易受这种并发感染。寄生虫感染包括由下列寄生虫引起的那些感染：淀粉卵圆虫、鱼虱、凹管线虫、头槽绦虫、驼形线虫、毛细线虫、棘带吸虫、斜管虫、球虫、对盲囊线虫、隐鞭虫、隐核虫、指环虫、肤胞虫、大角鱼虱、Euclinostomum spp.、三代虫、六鞭毛虫、鱼波豆虫、小瓜虫、锚头鳋、后囊蚴、微孢子虫、粘孢子虫、卵圆虫、血居吸虫、无柄虫、旋核鞭毛虫、四膜虫、车轮虫、小车轮虫和三分虫。

本发明的发明人令人惊奇地发现用根据本发明的至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物治疗有效用于治疗与鱼的卵菌感染并发的至少一种寄生虫感染。

本发明的应用

本文所述的预防或治疗卵菌感染的方法可用于多种情况，包括：(1)预防性(prophylactic)预防商业性鱼养殖环境中的季节病爆发；(2)介入和治疗性治疗受感染的鱼；(3)在预期的应激条件如水质量的变化(包括温度下降)前的治疗；(4)在转移和/或运输鱼后的预处理和治疗；(5)治疗家庭业余爱好者的“患病”鱼；和6)保持小规模和大规模、家庭和商业养殖以及科学实验的的鱼健康。本发明的方法既可有效用于临床病征可能并不明显的感染早期，也可有效用于建立卵菌感染且引起高死亡率的感染晚期。

为了预防或治疗卵菌感染，将水生生物与有效量的至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物接触。所述接触步骤可通过将水生生物如商业性环境中的鱼或水生有壳类动物，从它们的原始容纳设施(containment facility)如水库或池转移至容纳有效量的至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物的新容纳设施而进行。当已经在例如鱼的身体上检测到卵菌感染从而需要适当的介入和治疗性治疗时，优选这种方法。对于这种治疗性治疗，新容纳设施中的鱼的密度可以保持在与原始容纳设施中的比率相同的比率，或可优选降低，以缓解应激条件。

可选地，所述生物可保持在它们的原始容纳设施中，向该原始容纳设施中加入有效量的至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物。当本发明的方法以常规程序或在预想到预期的应激条件下用于预防卵菌感染时，由于经济原因可优选这种方法。

在本文所述的用于预防或治疗卵菌感染和用于消毒装置的方法中，所述接触步骤用可以多种形式供给的至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物进行。通常优选溶液，但是也预想了其他形式，例如在接触水后释放活性物质或者适于直接应用至被污染装置的溶解片、凝胶和浸渍材料(impregnated material)。

当使用溶液时，范围为约20至约200mg/升水的浓度可适于大多数应用。优选实现抵抗卵菌感染或污染的预防性、治疗性或消毒效能的最低浓度，以便使成本和释放进入废水系统的化合物的量降到最低。优选的浓度可进一步取决于治疗的持续时间以及治疗的水生生物的年龄和状态。例如，已发现将罗非鱼与25mg/升的

BA接触8小时可有效预防和治疗罗非鱼的水霉病。

至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物的有效量是实现如适当的预防性(preventative)(预防性)、治疗性或消毒效能的量。所述有效量可在预实验中确定。用于预防卵菌感染的有效量是指与水生生物接触以使在所述水生生物易感的卵菌病原体的存在下预防所述水生生物免遭感染的量或浓度。例如，认为预防性治疗在下列情况下有效，其中在攻击前用4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物预处理的鱼中由于卵菌病原体攻击造成的死亡率的百分比显著减少，例如减少未预处理的鱼中观察到的比率的25至100％。用于治疗卵菌感染的有效量是指与被卵菌病原体感染的水生生物接触以保护所述水生生物免遭与所述卵菌病原体相关的感染、疾病或死亡的发展或进展的量或浓度。例如，认为治疗性治疗在下列情况下有效，其中首先用卵菌病原体攻击、随后用4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物治疗的鱼中的死亡率的百分比显著减少，例如减少受感染、未治疗的鱼中观察到的比率的25至100％。用于消毒被卵菌污染的装置的有效量是指与所述装置接触以使所述装置不再藏匿卵菌菌丝体或游动孢子的量或浓度。例如，认为消毒处理在下列情况下有效，其中监控已消毒的装置在消毒处理后卵菌菌丝体和/或游动孢子的存在，并且发现卵菌菌丝体和/或游动孢子的百分比显著减少，例如减少在消毒处理前观察到的百分比的25至100％。

水生生物和/或受污染装置与至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物的接触可在约2小时至约16小时的时间内进行。例如，已发现约8小时的时间在受感染的鱼中有效。如果时间有限度，那么可任选与较高浓度的至少一种4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物使用相对较短的时间。如果时间不是限制因素，那么可以使用较长的时间，并且较长的时间可以是消毒装置优选的。进一步，所述接触时间可以以有规律的间隔例如第一接触时间结束后48小时重复以确保完全根除卵菌感染或污染。

特定实施方案的先前描述如此完全地揭示本发明的一般性质，以致他人可通过运用现有知识、在不需过多实验和不偏离品牌(brand)概念的情况下容易变更和/或修正这些特定实施方案用于各种应用，因此，这种修正和变更应该并且旨在包含于所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应理解，本文所用的措辞或术语是用于描述而不是限定的目的。进行各种所公开的功能的方法(means)、材料和步骤可在不偏离本发明的情况下采用多种替代形式。

提供下列实施例以便更完全地说明本发明的某些实施方案。然而，它们决不应该解释为限制本发明的宽广范围。本领域技术人员可在不偏离本发明的范围下容易作出本文所公开的原理的很多变化和变更。

实施例

实施例1

寄生水霉的易感性试验

寄生水霉T-1和寄生水霉CBS 540.67对各种化合物的体外易感性通过琼脂稀释法(agar-dilution)和肉汤宏量稀释法(broth macrodilution)来确定。

材料与方法

寄生水霉分离物

寄生水霉T-1分离物从垂死的显示水霉病征兆的罗非鱼上的皮肤损伤物(skin lesion)中获得。为了分离，将小部分被菌丝覆盖的皮肤和鳞片干燥，用无菌手术刀片切割，然后放置在含有3g/l葡萄糖、1g/l蛋白胨、痕量微量营养物和250mg/l青霉素-G及250mg/l硫酸链霉素的葡萄糖-蛋白胨-青霉素-链霉素(GP-PS)板上，并且在18℃下温育。

温育3～4天后，将真菌菌落的边缘的一大块琼脂切下并放置在含有重蒸馏水和无菌苜蓿种子(Clover seed)的无菌佩特里培养板中，以获得新的无细菌的菌落。分子鉴定由Alexandra Riethmueller博士(University of Kassel，Germany)通过测序18S rDNA的ITS区域而进行。

在18℃下将该分离物保持在GP-PS板上，并且每月将其转移一次。寄生水霉CBS 540.67是可公开获得的菌株。

试剂

测试抵抗寄生水霉的活性的化合物总结于表1中。

易感性试验

使用两种方法，每种方法适用于水霉菌的无性生命周期的不同阶段：i)肉汤宏量稀释法，其用于确定游动孢子和胞囊(cyst)的易感性；和ii)琼脂稀释法，其用于确定丝状菌丝的易感性。每种化合物在每种方法中均测试三次。使用孔雀绿作为阳性对照。

肉汤宏量稀释法

此方法是根据EUCAST 7.1(欧洲抗生素易感性试验委员会)和CLSI/NCCLS M27-A2(临床实验标准研究所/国家临床实验标准委员会)的用于霉菌的方法的变更。对于接种物制备，在18℃下将寄生水霉分离物与无菌苜蓿种子在GP-PS上培养7天。将被菌丝体覆盖的苜蓿种子(～20)去除，并加至40ml RPMI-1640肉汤培养基(Sigma；根据NCCLS说明书制备)，然后在18℃下温育4～7天。收集从菌丝释放的胞囊和游动孢子，并将在RPMI中制备通过血球计数器计数测量的～10³CFU/ml的接种物。所测试的化合物的储备溶液在水或在DMSO中制备，如表2中所示。荧光增白剂28储备溶液通过如下方法制备：将40％KOH逐渐加至水中的10mg/ml溶液直至它澄清，然后将它通过0.2μm醋酸纤维素无热原无菌过滤器(Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)过滤两次。

所得储备溶液的两倍连续稀释以0.1ml体积的RPMI-1640培养基进行。试管中的最终药物浓度范围为1×10⁴至0.01mg/L。将0.9ml的接种物加至每个含有0.1ml连续稀释的药物的无菌管。两个含有无药培养基的管和两个含有无药接种物的管用作对照。将接种管在室温下(15～20℃)温育24小时。然后目测评价每种管中的生长。MIC-0定义为导致可见生长的完全抑制的最低药物浓度。

琼脂稀释法

此方法是由Bailey(Bailey，T.A.(1983)Prog.Fish Cult.45：24-27)提供的方法的变更，并且用于水霉菌菌丝的易感性试验。两倍连续稀释物在双重蒸馏无菌水中制备，最终药物浓度范围为10,000至0.01mg/L，最终体积1.0ml。熔化的(56℃)RPMI-1640琼脂培养基(Sigma)根据NCCLS说明书来制备，然后加至含有药物或水对照的每个管。将混合物涡旋，并倾入至小板中。琼脂固化后，将小的经测量的碎片(取自GP-PS培养基上的寄生水霉T-1的7～10天老培养物)颠倒放置在每个板上。将所述板在室温下(15～20℃)温育24小时。然后目测评价每个板中的生长，MIC值定义为与不含药的对照相比，导致可见生长的完全抑制的最小浓度。

表1.测试抵抗寄生水霉的化合物

结果

用于确定寄生水霉的体外易感性的这两种方法是高度重现的(分别98％和95％)。对于所测试的每种化合物，使用两种寄生水霉分离物获得的MIC值是类似的，并且它们之间的差异统计上没有显著性。所测试的化合物的MIC值在表2中提供，其中每个结果表示三个独立试验的几何平均数。最低的MIC值一致地用孔雀绿(0.06mg/L)获得。显示抵抗寄生水霉的高体外活性(MIC＜10mg/L)的其他化合物如下：荧光增白剂28、所有测试的阳离子洗涤剂、洋地黄皂苷(非离子型洗涤剂)、过碳酸钠和过氧化氢。最低活性是用天然油、Tween-20和氯化钠(MIC＞200mg/L)检测的。尽管用荧光增白剂28观察到高体外活性(两种方法中的1mg/L和5mg/L的MIC值)，但是由于它的成本极其高，所以将其从随后关于体内活性、毒性和疗效的研究中剔除。

表2.各种化合物的MIC值(mg/L)

实施例2

罗非鱼的毒性试验

进一步评价于实施例1中评价的化合物在罗非鱼中的毒性作用。

材料与方法

LC₅₀值作为罗非鱼的相对急性致死毒性的量度通过静态短期试验(static short-term test)来测定(Standard methods for the evaluation of waterand wastewater(用于评价水和废水的标准方法)(1985)第16版，AmericanPublic Health Association，Washington，D.C.第689-819页)。

在通过将测试化合物加至每个池而启动实验前，平均重量为20g的杂交罗非鱼(尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)×奥利亚罗非鱼(Oreochromisaureus))以每10升1尾鱼的密度在21℃的恒温下保持在100升聚乙烯池中3周。还在18℃和15℃下评价过氧化氢、过碳酸钠和 BA的毒性。对于后者的实验，在将测试化合物加至池中前使鱼适应所需的温度3周。鱼用根据每种化合物的MIC值确定的5种不同浓度的每种测试化合物治疗。

记录鱼的死亡率一直到96小时。在整个实验中监控水参数(O₂、NH₄ ⁺、NO₂ ^-、pH和Cl^-)，并且保持在可接受的限度内。所得的结果是两个单独实验的平均值。

护理和治疗鱼的所有程序依照Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals(实验室动物的护理和使用的指南)(Hebrew Universityof Jerusalem，Israel)并且得到实验室动物的护理和使用的道德行为委员会的批准。

结果

确定的各种化合物的LC₅₀值在图1中显示。选择具有比它们各自MIC值高5至10倍的LC₅₀值的化合物用于罗非鱼-水霉病模型中的疗效的进一步研究。

硫酸铜、

和所有测试的消毒剂、洗涤剂和抗真菌剂的LC₅₀值都较低，类似于它们各自的MIC值或与它们各自的MIC值无显著差异，因此将它们从疗效研究中剔除。证明孔雀绿、甲醛、过氧化氢、过碳酸钠和

BA具有显著更高的差异，即LC50值与MIC值之间的比率为＞20。在18℃下具有低毒性的一些化合物还在较低的温度(15℃)下进行测试。结果在表3中显示并且清楚表明过氧化氢以及过碳酸钠(达到更高的程度)的毒性在15℃下显著增加。相反，

BA的LC₅₀值即使在较低温度下也保持高位，表明其对罗非鱼相对缺乏毒性。

表3.在各种温度下罗非鱼中化合物的毒性(LC₅₀)

实施例3

在各种鱼种中的的毒性实验

材料与方法

在各种鱼种中的LC₅₀值按实施例2确定，除了在启动实验前使鱼适应21℃3周、然后适应15℃另一个2周之外。适应15℃后，将

BA(100、200、500、1,000或2,000mg/L)加至池中，记录鱼的死亡率一直到96小时。在整个实验中监控水参数(O₂、NH₄ ⁺、NO₂ ^-、pH和Cl^-)，并且保持在可接受的限度内。所得的结果是两个单独实验的平均值。所用的鱼有：平均重量为20g的杂交罗非鱼(尼罗罗非鱼×奥利亚罗非鱼)；平均重量为70g的灰色鲻鱼(grey mullet，Mugil cephalus))；平均重量为25g的普通鲤鱼(common carp，Cyprinus carpio))；平均重量为25g的杂交有条纹的鲈鱼(条纹鲈(Morone saxatilis)×白鲈(M. chrysops))和平均重量为25g的草鱼(grass carp，Ctenopharyngodon idella)。

结果

观察到的所测试鱼种的LC₅₀都大于2000mg/L。这些结果与实施例2中显示的结果一致并且支持结论：本发明的化合物如

BA对包括具有商业重要性的那些鱼种在内的多种鱼种无毒。

实施例4

BA在水霉病的早期感染模型中的疗效

材料与方法

平均重量为20g的杂交罗非鱼(尼罗罗非鱼×奥利亚罗非鱼)在实验前两周使用25μg/ml甲醛(37％v/v)治疗抵抗体外寄生虫，并且在100升聚乙烯池中保持于21℃的恒温。在10天的时间内将水池从21℃的起始温度冷却至14℃。将水保持于14℃的恒温并且使鱼适应4天。然后通过在塑料网(30×20cm)内搅动40尾鱼10秒钟，应用磨损的物理性应激。之后，将含有被寄生水霉T-1的菌丝(在18℃下GP-PS培养基上的7天老培养物)覆盖的60粒苜蓿种子的无菌不锈钢茶壶(tea infuser)加至每个池中，其中鱼密度为每100升20尾鱼。这种治疗持续48小时并且允许所产生的游动孢子的分散。水中的游动孢子的密度根据下述方法测定，并且估计为每升5×10²～2×10³个游动孢子。然后将鱼转移至不同池中，并在13～14℃下用

BA(200、100、50或25mg/L)或孔雀绿(0.25mg/L)治疗8小时，其中每100L水10尾鱼。所述治疗在启动实验后第2、4和6天应用。监控鱼被菌丝覆盖的任何损伤的存在(表明水霉感染)14天。用显微镜(10×和40×放大倍数)检查患病的和垂死的鱼的皮肤活组织。每天监控发病率和死亡率。在实验期间将垂死的和/或死亡的鱼从所有池中移除。

水中的游动孢子密度的测定根据Willoughby，L.G.(1994)Fungi andfish diseases(真菌和鱼疾病)，Pisces Press，Stirling，Scotland第57页来进行。

简要地，将取自100升池的1升水样品在无菌佩特里皿中分为1ml和10ml等份。将每种样品用水稀释以得到20ml的终体积，然后加入一颗无菌苜蓿种子以吸引和供养游动孢子。所有水样品在室温下温育72小时以使孢子萌发。游动孢子的密度根据被可见菌丝体覆盖的种子数目来确定。

结果

根据已测的MIC值，受水霉菌感染的鱼用不同浓度(100和200mg/L)的

BA治疗。在启动感染后第2、4和6天进行治疗，并且每次治疗持续8小时的时间。用0.25mg/L孔雀绿治疗的鱼用作阳性治疗对照。将鱼监控14天。临床上评价所有死亡的鱼，并且如用显微镜确定和通过水霉菌的阳性培养证实，它们显示显著的水霉菌损伤。用

BA治疗的结果总结于图2中，并且显示

BA在使水霉菌感染后的鱼能存活方面与孔雀绿一样有效。所有用Blankophor BA治疗的鱼在启动感染后存活至少10天，相反，未治疗的鱼从第3天开始逐渐死亡。由于用100mg/L

BA治疗的高效能，使用较低浓度的

BA(50和25mg/L)进行另外实验。如在前述实验中，受感染的鱼在启动感染后第2、4和6天在含有不同浓度的化合物的池中治疗。此外，加入两个另外的治疗方案，即50mg/L(在启动感染后第2和9天施用)和100mg/L(在启动感染后第2天施用)。结果总结于图3中，并且显示

BA在预防和治疗罗非鱼的早期水霉病感染中高度有效，即使以低至25mg/L的浓度。

用高剂量(50和100mg/L)的

BA治疗的鱼的临床观察显示样品免于损伤(典型的临床病征)，而且在水霉菌的培养后为阴性。此外，鳞和鳍材料的活组织检查表明从用

BA 25(mg/L)治疗的鱼中移除的水霉菌菌丝与从未治疗鱼中移除的水霉属菌丝比较有显著性差异。特别地，前者显示“正常的”水霉属菌丝结构，而后者显示严重损害且明显更细长的菌丝。

还在罗非鱼-水霉病模型中测试了福尔马林(37％甲醛v/v)。在100mg/L的浓度(在启动感染后第2、4和6天施用)下，70％鱼在14天内死亡(数据未显示)。在50mg/L的浓度下，观察到疗效类似于

BA的疗效(图3)。然而福尔马林不是可行的水霉病的治疗方法，因为甲醛对动物和环境有很多严重的有害作用。例如，它是人神经毒素和可能的致癌物；它降低水中的溶解氧浓度，并且是一种灭藻剂。

实施例5

BA在建立的水霉病感染模型中的疗效

材料与方法

如实施例4中所述，将罗非鱼接触寄生水霉并且用

BA(100、50和25mg/L)治疗，除了

BA治疗在启动感染后第3天开始且在第8天重复之外。不迟于

BA治疗的开始点，约50％的鱼已经建立感染，如由白色皮肤损害的存在和约30％的死亡率所示。

结果

图4显示了在这种建立的水霉病的模型中，用

BA(50和100mg/L)的治疗在促进受感染鱼的存活中非常有效。未治疗对照与荧光增白剂治疗的鱼之间的差异非常显著(p＜0.01)。

实施例6

用于并发的卵菌和寄生虫疾病的

BA治疗的非随机现场试验

将2000尾杂交罗非鱼(20～30g)转移至水泥池(1×10⁵L，21℃至25℃)后，在鱼的身体和鳍上观察到丝状菌丝体的白斑，在大多数情况下覆盖约80％的身体表面。菌丝体在转移约4天后出现，这很可能因为处理应激(handling stress)后水霉菌的机会感染。记录到每天有20至30尾鱼死亡。所有死亡鱼被表示水霉菌的特征的菌丝体覆盖，并且还发现那些鱼被寄生虫三代虫和车轮虫感染。

将池塘的水容量减少至3×10⁴L，并启动用

BA(50mg/L)的治疗。使用3次治疗(每次8小时)且治疗之间间隔48小时的方案。

观察到水霉病的流行和强度在第一治疗后显著减少；没有记录到进一步的死亡并且所述鱼恢复它们的正常行为。在结束治疗2天后，目测和用显微镜检查所述鱼，发现所述鱼不含水霉菌以及寄生虫三代虫和车轮虫。

实施例7

BA对寄生水霉的作用的扫描电子显微术分析

材料与方法

将5天RPMI-1640肉汤培养的寄生水霉T-1菌丝和胞囊与不同浓度的

BA(10、25、100或1,000mg/L)接触不同时段。将样品在2％戊二醛中固定过夜，然后在室温下用1％OsO₄固定2小时，并将样品在增加的浓度(25～100％)的乙醇中脱水并干燥。样品用Leo 982光学扫描电子显微镜在6kV的加速度下观察。

结果

寄生水霉菌丝和胞囊的扫描电子显微术(SEM)显示用

BA(1,000mg/L)治疗导致高度变形、起皱以及塌陷的细胞壁(图5A)，而未治疗对照显示完好的细胞壁(图5B)。这些结果强烈支持

BA破坏水霉菌的细胞壁的完整性的结论。因此， BA的作用机制可涉及卵菌细胞壁的一个或多个特异性靶点。

实施例8-10描述为证实本发明的化合物为对非靶生物没有毒性所进行的一组生物毒性研究。

实施例8

BA对小鼠的毒性

材料与方法

在5％右旋糖中以不同浓度制备

BA，并且经穿过无菌0.2μm孔径醋酸纤维素过滤器(Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)而过滤灭菌。用不同剂量的

BA通过尾静脉注射雄性白化ICR小鼠(重～30g)。对10只小鼠的组，每10分钟以单次弹丸注射(bolus injection)0.1ml的相同剂量静脉内施用每种剂型，直到观察到死亡。将接受最大耐受剂量(MTD)的小鼠的存活监控8天。

结果

发现在ICR小鼠中

BA的最大耐受剂量(MTD)为＞1g/kg，从而证实它是安全的化合物，如先前确定(于2005年10月6日经由ETAD荧光增白剂工作组向美国环境保护署提交的Stilbene Fluorescent WhiteningAgents Category(均二苯代乙烯荧光增白剂分类))。

实施例9

BA对浮游动物的毒性

水蚤(Daphnia sp.)是小的(长度为0.2至5mm)浮游甲壳生物，通常用作水生毒性的模型。

材料与方法

将水蚤(～1,000细胞/L水)与100和1,000mg/L

BA接触。本实验在装备有空气供给的带盖烧瓶(100ml/每烧瓶)中进行。将该烧瓶在室温下温育48小时，并且记录水蚤运动性(motility)。

结果

48小时温育后，观察到与

BA接触的水蚤和未接触的对照组之间没有差异性，这表明 BA对这种生物没有毒性。

实施例10

BA对浮游植物的毒性

延迟荧光激发光谱学(DFES)法用于定性和定量评价

BA对浮游植物的天然群体和特定藻株的影响。延迟荧光是光合活性细胞的独特特性，因为它是在黑暗下类囊体(thylakoid)中发生的重组的结果(YacobiY.Z.，V.Gerhardt，Y.Gonen-Zurgil和A.Sukenik.1998.Delayed fluorescenceexcitation spectroscopy：a rapid method for the qualitative and quantitativeassessment of natural population of phvtoplankton(延迟荧光激发光谱学：定性和定量评价浮游植物的天然群体的快速方法).Wat.Res.00：1-6)。

材料与方法

将来自基尼列湖的样品和多甲藻菌(Peridinium sp.)和微囊藻菌(Microcystis sp.)的纯培养物与

BA(100mg/L)接触几分钟，并且根据所检查的激发光谱(范围为400～730nm)确定叶绿素a的浓度。此外，用¹⁴C技术评价经接触的和未接触的样品的碳吸收。

结果

因为与接触前4.6μg/L(平均值)相比，总叶绿素浓度为9.2μg/L(平均值)，所以在接触

BA(100mg/L)后，基尼列湖水样品的光合活性并未有害地受影响。类似地，当微囊藻菌的纯培养物与

BA(100mg/L)接触时，观察到与未治疗样品相比光合活性没有差异。

图6中所示的¹⁴C-碳吸收研究的结果与DFES实验一致，并且表明与

BA接触并未减少各种藻种(小球藻菌、微囊藻菌、多甲藻菌和直链藻菌)的纯培养物的光合活性，也未减少基尼列湖的总藻类群体的光合活性。放在一起来看，这些初步发现支持

BA对浮游植物没有毒性的结论。

结论

为了鉴定水霉病的有效治疗以代替危险的现有技术治疗如孔雀绿，评价了很多抗微生物剂和抗真菌剂、洗涤剂和消毒剂(表4)。根据在各种分析系统中所获得的结果以及动物安全性、环境影响和成本的参数的组合，给定每种化合物一个效用指数(UI)。在这些充分评价的化合物中，

BA具有最大的UI。这强烈表明如通过

BA供给的4，4’-双-(1，3，5-三嗪基氨基)均二苯代乙烯-2，2’-二磺酸衍生物可用作孔雀绿的治疗上有效的、安全的和经济的替代物。

表4.各种化合物抵抗水霉菌的效用

¹毒性定义为：高＝50ppm；中等＝50～200ppm；且低＝＞1000ppm。

²效用指数(UI)：通过考虑毒性、疗效和成本的参数而测量化合物的有用性的指数。

尽管已经说明和描述了本发明的某些实施方案，但是应清楚，本发明并不限于本文所述的实施方案。在不偏离如随后的权利要求所述的本发明的精神和范围下，很多变更、改变、变化、置换和等同物对本领域技术人员是明显的。

Claims

1.4,4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2,2’-二磺酸盐在用于制备预防或治疗水生生物的卵菌感染的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述盐选自由4,4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2,2’-二磺酸二钠和4,4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2,2’-二磺酸钾钠组成的组。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述卵菌选自由水霉菌、丝囊霉菌和鳃霉菌组成的组。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述卵菌是寄生水霉。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述水生生物选自由鱼、鱼卵和水生有壳类动物组成的组。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述鱼选自由澳洲肺鱼、鲈鱼、鳊鱼、鲤鱼、鲶鱼、鲢鱼、鳗鱼、比目鱼、乌颊鱼、虹鳉、狼鲈、鲻鱼、鲽鱼、鲳鲹、红鱼、红鼓鱼、鲑鱼、鳎、鲟鱼、罗非鱼、鳟鱼和金枪鱼组成的组。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述鱼选自由白鲟、锦鲤鱼、幼鳗、大比目鱼和白鲑组成的组。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述盐以溶液供给。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述盐以20至200mg/L的浓度存在于所述溶液中。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述盐以25mg/L的浓度存在于所述溶液中。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物施用时，所述盐与所述水生生物接触2至16小时的时间。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述药物施用时，所述盐与所述水生生物接触8小时的时间。

13.根据权利要求11所述的用途，其中所述药物施用时，所述盐与所述水生生物以48小时间隔重复接触。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述卵菌感染并发或伴有寄生虫感染。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述寄生虫感染由选自由下列寄生虫组成的组的至少一种寄生虫引起：淀粉卵圆虫、鱼虱、凹管线虫、头槽绦虫、驼形线虫、毛细线虫、棘带吸虫、斜管虫、球虫、对盲囊线虫、隐鞭虫、隐核虫、指环虫、肤胞虫、大角鱼虱、Euclinostomum spp.、三代虫、六鞭毛虫、鱼波豆虫、小瓜虫、锚头鳋、后囊蚴、微孢子虫、粘孢子虫、卵圆虫、血居吸虫、无柄虫、旋核鞭毛虫、四膜虫、车轮虫和三分虫。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述寄生虫感染由小车轮虫引起。

17.一种消毒用于饲养水生生物的装置的方法，其中所述装置被卵菌污染，所述方法包括将所述装置与有效量的4,4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2,2’-二磺酸盐接触的步骤。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述盐选自由4,4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2,2’-二磺酸二钠和4,4’-双-(6-苯胺基-4-(双(2-羟乙基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)均二苯代乙烯-2,2’-二磺酸钾钠组成的组。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述卵菌选自由水霉菌、丝囊霉菌和鳃霉菌组成的组。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述卵菌是寄生水霉。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述水生生物选自由鱼、鱼卵和水生有壳类动物组成的组。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述鱼选自由澳洲肺鱼、鲈鱼、鳊鱼、鲤鱼、鲶鱼、鲢鱼、鳗鱼、比目鱼、乌颊鱼、虹鳉、狼鲈、鲻鱼、鲽鱼、鲳鲹、红鱼、红鼓鱼、鲑鱼、鳎、鲟鱼、罗非鱼、鳟鱼和金枪鱼组成的组。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述鱼选自由白鲟、锦鲤鱼、幼鳗、大比目鱼和白鲑组成的组。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述盐以溶液供给。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述盐以20至200mg/L的浓度存在于所述溶液中。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述盐以25mg/L的浓度存在于所述溶液中。

27.根据权利要求17所述的方法，其中所述接触步骤持续2至16小时的时间。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述接触步骤持续8小时的时间。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述接触步骤以48小时间隔重复。

30.根据权利要求17所述的方法，其中所述装置进一步被至少一种寄生虫污染。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述至少一种寄生虫选自由淀粉卵圆虫、鱼虱、凹管线虫、头槽绦虫、驼形线虫、毛细线虫、棘带吸虫、斜管虫、球虫、对盲囊线虫、隐鞭虫、隐核虫、指环虫、肤胞虫、大角鱼虱、Euclinostomum spp.、三代虫、六鞭毛虫、鱼波豆虫、小瓜虫、锚头鳋、后囊蚴、微孢子虫、粘孢子虫、卵圆虫、血居吸虫、无柄虫、旋核鞭毛虫、四膜虫、车轮虫和三分虫组成的组。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述至少一种寄生虫是小车轮虫。