CN101962688B - 一种用于鉴定纳米细菌的特异性引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于鉴定纳米细菌的特异性引物及其应用，该引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列中的至少一种。本发明还涉及用上述的引物扩增获得的纳米细菌的标签序列。本发明还提供由该引物制备的检测用基因芯片和/或试剂盒。根据本发明提供的鉴定纳米细菌的特异性引物，可以特异性地扩增获得一段纳米细菌的标签序列。本发明所述的特异性引物还可以制备成检测用基因芯片和/或试剂盒，由于使用流程简单，操作简便，用时短、灵敏性高、具备实际可操作性，因此能够方便、快速地鉴定纳米细菌。

Description

一种用于鉴定纳米细菌的特异性引物及其应用

技术领域

本发明涉及一种特异性引物，尤其涉及一种用于鉴定纳米细菌的特异性引物及其应用。

背景技术

纳米细菌(Nanobacteria)是新发现的具有矿化功能的人类新致病菌。1992年，芬兰科学家Kajander等在进行哺乳动物细胞培养时发现部分细胞生长繁殖不佳，发生空泡样变性、溶解或凋亡，于是对这些细胞进行透射电镜观察，发现细胞内存在一种原核微生物，其直径较小，约50～200nm。Kajander等将之命名为纳米细菌。

根据目前Genbank中仅有的一条纳米细菌16SrRNA基因片段(Genbankaccession number：X98419)分析，它可能与蛋白细菌家族(Proteobacteria)A2亚群的布鲁氏菌、巴尔通菌同属，所以该基因片段的特异性不高，不能做为鉴定纳米细菌的特异性指标。

纳米细菌在普通的微生物培养条件下不能生长，而在培养哺乳动物细胞的RPMI 1640培养基中能够生长，加入10％胎牛血清能促进其生长；该菌生长缓慢，3天左右繁殖一代，1月左右才能出培养结果；抵抗力强是纳米细菌的又一重要特性，高剂量的γ射线(25～35kGy)在室温下照射16小时才能抑制其生长，对许多抗菌素耐药，但对四环素敏感。特别引人注目的是，在生理性钙、磷浓度条件下，纳米细菌生长过程中能形成羟磷灰石碳酸盐结晶，产生坚硬的矿化外壳覆盖于菌体周围，使细菌耐受高温和强酸，即使在90℃高温或1N HCl中也能存活。

该菌能感染人体内多种细胞，导致被感染细胞发生骨骼外钙化，同时释放毒素引起组织炎症，引起组织器官的狭窄、阻塞和硬化，现有证据表明纳米细菌与人多种疾病，如肾结石、慢性前列腺炎、胆囊结石、动脉粥样硬化的发生、发展密切相关，这就为人类多种疾病的发生机制研究提供了全新的切入点，引起了国内外学者的广泛关注。

纳米细菌是迄今发现的唯一能产生羟磷灰石矿物沉积于人体的病原菌，这既是该菌重要的生理特性，也是其致病的物质基础。目前对纳米细菌的鉴定主要通过形态学和免疫学手段进行，对纳米细菌的遗传背景了解甚少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性引物，利用PCR技术，快速、有效地检测纳米细菌。

本发明所述鉴定纳米细菌的特异性引物，其具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列中的至少一种(包括：潜在点突变造成的个别碱基差异的这些序列)。

本发明的优选实施例中，SEQ ID NO：3所示的纳米细菌的标签序列是通过SEQ ID NO：2所示的引物从纳米细菌核酸中特异性扩增得到。

本发明所述的SEQ ID NO：2所示的特异性引物可以用于制备鉴定纳米细菌用的基因芯片和试剂盒。

本发明还提供一种鉴定纳米细菌的方法，其主要包括步骤：

a.制备上述的特异性引物；

b.提取纳米细菌的DNA模板；

c.将各待测样本放入PCR仪，与a和b中所得引物和模板混合后进行PCR反应；

d.电泳结果判读，是否已扩增出预期的纳米细菌的标签序列。

其中，步骤c包括进行PCR反应时，退火温度选择56±5℃。

其中，步骤d包括对SEQ ID NO：3所示的一段纳米细菌的标签序列的判读。

本发明还提供一种鉴定纳米细菌的基因芯片，其具有SEQ ID NO：2所示的特异性引物。

本发明还提供一种鉴定纳米细菌的试剂盒，其包具有SEQ ID NO：2所示的特异性引物。其还可以进一步地包含PCR扩增的反应液。

反应液包括：Tag聚合酶、10×Tag无Mg²⁺缓冲液、dNTP、MgCl₂，ddH₂O。具体地，反应液可以为：5U/μl Tag聚合酶，10×Tag Buffer(Mg²⁺Free)，2.5mMdNTP each，25mM MgCl₂，ddH₂O。

根据本发明提供的鉴定纳米细菌的特异性引物，可以特异性地扩增获得一段纳米细菌的标签序列。本发明所述的特异性引物还可以制备成检测用基因芯片和/或试剂盒，由于使用流程简单，操作简便，用时短、灵敏性高、具备实际可操作性，因此能够方便、快速地鉴定纳米细菌。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为肉眼观察纳米细菌的菌群特征；

图2A和图2B为双向电泳寻找差异性蛋白点；

图3为质谱分析及数据库查询结果；

图4为电泳检测设计的上、下游引物扩增出的纳米细菌基因片段，其中的泳道1，2，3，4为扩增的片段，中间泳道为Marker 2000，扩增片段约在200bp附近；

图5为质粒的双酶切鉴定纳米细菌的基因片段，其中的泳道1，2为质粒双酶切后的片段，中间泳道为Marker III，双酶切后的目的片段约在200bp附近；

图6为纳米细菌基因片段的测序峰图；

图7为纳米细菌基因片段在NCBI数据库中的比对结果；

图8为电泳检测上游引物与随机引物配对扩增出的纳米细菌基因片段，其中的泳道1为扩增的片段，中间泳道为Marker 2000，扩增片段约在200bp附近；

图9为电泳检测下游引物与随机引物配对扩增出的纳米细菌基因片段，其中的泳道1为扩增的片段，中间泳道为Marker 2000，扩增片段约在700bp附近；

图10为质粒的双酶切鉴定下游引物与随机引物配对扩增出的纳米细菌基因片段(标签序列)，其中的泳道1，2为质粒双酶切后的片段，中间泳道为MarkerIII，双酶切后的目的片段约在700bp附近；

图11为纳米细菌标签序列的测序峰图；

图12为纳米细菌标签序列在NCBI数据库中的比对结果；

图13为纳米细菌DNA提取流程图；

图14为试剂盒检测纳米细菌标签序列，其中的泳道1，2，3，4为扩增的片段，中间泳道为Marker 2000，扩增片段约在700bp附近。

具体实施方式

以下仅以中国地区感染纳米细菌的慢性前列腺炎患者前列腺液标本为例而进一步说明本发明，而不应视为对本发明的限制。

试剂

RMPI 1640培养基                     Hyclone(北京)公司

胎牛血清(FBS)                       美国GIBCO公司

PMD-19T载体                         大连宝生物公司

DNA提取试剂盒                       北京法特捷生物技术发展中心

质粒小提试剂盒                      北京康为世纪生物科技有限公司

普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒         北京天根生化科技有限公司

PCR反应体系                         大连宝生物公司

双向电泳相关试剂                    美国Bio-Rad公司

引物合成                            上海生物工程公司

DNA测序                             大连宝生物公司

氯仿(分析纯)                        成都科龙化工试剂厂

异丙醇(分析纯)                      重庆川东化工试剂厂

无水乙醇(分析纯)                    重庆川东化工试剂厂

琼脂糖                    美国Sigma公司

溴化乙锭                  美国Sigma公司

实施例1纳米细菌的分离、培养

第一步，收集标本

取在西南医院门诊就诊的慢性前列腺炎患者的前列腺液1ml，用生理盐水稀释5倍，经0.45um滤器过滤，4℃离心40分钟(20,000×g)，弃上清，留取管底1ml充分混匀，再用无菌生理盐水稀释5倍，经0.22um滤器过滤，4℃离心40分钟(20,000×g)，弃上清，留取管底沉淀。

第二步，标本的培养

向上述管底沉淀加入3～4ml含10％γ-FBS(在第三军医大学辐射技术研究所经30kGy γ-射线照射16小时处理)的RPMI1640培养基，在37℃、pH7.4、5％CO2和95％空气条件下培养。分别用含10％γ-FBS的RPMI 1640(不加标本)、生理盐水加RPMI 1640进行阴性对照培养。每周观察并记录纳米细菌的生长情况。培养4周后，可见培养管底部出现紧贴管壁生长的白色沉淀，摇晃培养管后白色沉淀仍紧紧粘附于管底。请参照图1(具体为箭头所指)。

实施例2双向电泳及质谱分析

第一步，蛋白样品的制备

①收集上清蛋白细菌培养液离心后取上清，加入4倍体积的丙酮(-20℃预冷)，充分混匀，-20℃过夜。

②浓缩蛋白将-20℃过夜的混合液离心，弃上清后静置，使丙酮彻底挥发。向离心管中加入Lysis Buffer充分溶解管底蛋白。

第二步，双向电泳

80μg蛋白与水化液(8mol/L urea，2％CHAPS，18mmol/L DTT，0.5％IPGbuffer，0.002％bromophenol blue)混匀，上样总体积为450μL。将IPG胶条(24cm，pH 3-10，NL)再水化，并于其上覆盖矿物油。等电聚焦程序设置为30V 6h→60V 6h→500V 1h→1000V 1h→8000V 10h，总电压时间乘积为64000Vh。

等电聚焦结束后，将胶条取出，置于平衡液(50mmol/L Tris-HCl pH8.8、6mol/L urea、2％SDS、30％glycerol)中进行2次平衡，第1次每10mL平衡液中加入100mg DTT，振荡平衡15min，第2次每10ml平衡液中加入250mg IAA，振荡平衡15min。平衡完成后，将胶条水平置于预先制好的12.5％SDS凝胶顶部，加入琼脂糖封胶液固定并排除气泡，在Ettan DALTII垂直平板电泳系统上行第2向凝胶电泳。待溴酚蓝跑至凝胶底部时，停止电泳。为了减小误差，每份蛋白样品重复电泳3次。

每块凝胶置于500ml固定液(含200ml无水乙醇，50ml乙酸)中固定1h，然后加入500ml敏化液(含1.57g硫代硫酸钠，34g NaAC，150ml乙醇)致敏30min。去离子水洗3遍，每次5min，再加入500ml银染液(含1.25g硝酸银、400μL甲醛)反应20min。再次水洗3遍，每次2min，然后置于500ml显色液(含碳酸钠12.5g、甲醛200μL)中显色2-5min，显色完成后立即置于500ml终止液(含甘氨酸2g)中终止反应。请参照图2A和图2B，图2B中箭头所指即为双向电泳寻找到的差异性蛋白点。

第三步，胶内酶解及质谱分析

将得到的差异点从胶上切下，反复冲洗，并加入脱色工作液脱色。每个蛋白点先加入50μL ACN在室温下进行脱水，然后加入50μL含10mmol/L DTT的还原液在56℃下还原1h，再用50μL含55mmol/L碘乙酰胺的溶液室温条件下在暗处烷基化45min。结束后，蛋白点用50μL ACN再脱水，干燥后加入5μL胰蛋白酶再水化30min，然后加入10μL 25mmol/L的碳酸氢铵，在37℃条件下酶解过夜。加入10μL 2％的甲酸终止反应，并用Millipore的Zip Tip^TMC18对样品进行脱盐。样品与a-HCCA充分混合后，上样于不锈钢点样板上，待其自然风干后，置于Reflex IV上进行操作分析。

第四步，数据库查询

将获得的肽片段图谱，用Mascot搜索引擎(http://www.Matrixscience.com)在SwissProt数据库进行查询。参数设置如下：每个肽允许有1个不完全裂解位点，肽片段分子量最大容许误差为±100ppm，模式设置为Monoisotopic。蛋白质匹配分数＞54分，并综合评估其分子量和等电点的匹配程度，确定蛋白名称。质谱分析及数据库查询结果请参照图3。

实施例3引物制备(人工合成)

根据质谱分析提供的同源蛋白的核酸序列，设计一对引物如下(委托上海生工生物工程有限公司进行合成)：

上游引物SEQ ID NO：1

5’CGAGTAGGC GAAACC CTGATGATC 3’(2OD)

下游引物SEQ ID NO：2

5’CGC AAC CGG CTC GTC ACC G 3’(2OD)

实施例4模板提取及反应体系

第一步，收集标本

取在西南医院门诊就诊的慢性前列腺炎患者的前列腺液1ml，用生理盐水稀释5倍，经0.45um滤器过滤，4℃离心40分钟(20,000×g)，弃上清，留取管底1ml充分混匀，再用无菌生理盐水稀释5倍，经0.22um滤器过滤，4℃离心40分钟(20,000×g)，弃上清，留取管底沉淀，加入1当量盐酸0.5ml混匀，37℃放置30分钟；加入1M Tris 0.5ml中和，22000×g离心40分钟，留沉淀备用。

第二步，获取纳米细菌DNA

(1)模板提取(请参照图13)

①向收集到的菌体沉淀中加入200μl缓冲液DS，用漩涡振荡器剧烈振荡直至菌体彻底悬浮。

对于较难破壁的革兰氏阳性菌，需加入溶菌酶消化细胞壁后，再进行基因组DNA的提取。具体方法为：向步骤1收集到的菌体中，加入180μl缓冲液(20mM Tris，pH8.0，2mM EDTA，1.2％Triton100)和终浓度为20mg/ml的溶菌酶，振荡混匀。37℃处理30min以上。如需要去除RNA，加完消化缓冲液DS或溶菌酶后，加入4μl RNase A(100mg/ml)溶液，震荡混匀，室温放置5min。

②加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

③加入220μl裂解液MS，漩涡振荡混匀，直至形成均一的悬浮液。65℃温浴10min。溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

④加入220μl无水乙醇，上下颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀，将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12,000rpm离心1min，弃滤液。

⑤加入500μl去蛋白液PS，将硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质洗脱。12,000rpm离心1min，弃滤液。

⑥加入500μl漂洗液PE。12,000rpm离心1min，弃滤液。

⑦加入500μl漂洗液PE。12,000rpm离心1min，弃滤液。

⑧12,000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

⑨将纯化柱置于新的1.5ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空加入30-100μl洗脱液TE。室温放置2min。于12,000rpm离心2min，管底即为高纯度基因组DNA。-20保存。

(2)PCR反应体系

实施例5PCR反应与检测

按上述反应体系，将各样本放入PCR仪(Bio-rad IQ cycler)，扩增条件如下：

94℃5分钟

72℃10分钟

结果判定：反应结束后取6μl反应产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果(请参照图4)，扩增片段约在200bp附近。

实施例6载体连接、克隆和质粒的抽提、酶切

第一步，载体连接、克隆

1)在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。

1μl

Insert DNA       0.1pmol～0.3pmol

ddH₂O            up to 5μl

2)加入5μl(等量)的Solution I。

3)16℃反应30分钟。

4)全量(10μl)加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5)42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6)加入890μl SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。

7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。

8)挑选白色菌落，摇菌过夜。

第二步，质粒抽提

1)取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，＞8000rpm离心3分钟，尽量吸弃上清。

2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl Buffer P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

3)向离心管中加入250μl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4-6次，使菌体充分裂解。此时菌液应变得清亮粘稠。所用时间不应超过5分钟，以免质粒受损伤。

4)向离心管中加入350μl Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀4-6次，此时出现白色絮状沉淀。

5)13,000rpm离心10分钟，吸取上清，加入到已装入Collection Tube的SpinColumn CM中，注意不要吸出沉淀。

6)13,000rpm离心30-60秒，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin ColumnCM放回Collection Tube中。

7)向Spin Column CM中加入700μl Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，13,000rpm离心30-60秒，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin ColumnCM重新放回收Collection Tube中。

8)向Spin Column CM中加入500μl Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，13,000rpm离心1分钟，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CM重新放回收Collection Tube中。

9)13,000rpm离心1分钟，倒掉废液。将Spin Column CM置于室温数分钟，以彻底晾干吸附膜上残余的Buffer PW。

10)将Spin Column CM置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100μl Buffer EB，室温放置1-2分钟，13,000rpm离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。

第三步，质粒的双酶切

双酶切体系

Sma I                 1μl

Hind III              1μl

10×T Buffer          2μl

0.1％BSA              2μl

DNA                  ≤1μg

ddH₂O                up to 20μl

以上双酶切体系在30℃下反应2小时，反应结束后加入2μl的10×LoadingBuffer，进行电泳(请参照图5)。质粒双酶切后，目的片段约在200bp附近。

实施例7测序及blast

将提取的质粒送至大连宝生物公司进行测序，测序峰图请参照图6。将目的片段的核酸序列与NCBI的database中的已知序列进行比对，结果发现设计的上、下游引物扩增出的纳米细菌基因片段特异性不高(请参照图7)。

实施例8模板提取及反应体系

第一步，收集标本，具体步骤同实施例4；

第二步，获取纳米细菌DNA

(1)模板提取(请参照图13)，具体步骤同实施例4；

(2)PCR反应体系

注明：由于使用设计的上、下游引物扩增出的PCR产物特异性不高，为了获得更特异的PCR产物，发明人将上、下游引物分别与随机引物配对进行扩增。选择的是6碱基随机引物，于大连宝生物公司购得。

实施例9随机引物PCR反应与检测

按上述反应体系，将各样本放入PCR仪(Bio-Rad IQ cycler)，扩增条件如下：

94℃5分钟

72℃10分钟

结果判定：反应结束后取6μl反应产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果(请参照图8和图9)。

由于上游引物和随机引物配对扩增出的PCR产物，与上下游引物配对扩增出的PCR产物相同，而下游引物和随机引物配对扩增出的PCR产物是一段新的基因片段。因此发明人针对这一段新的基因片段进行了载体连接、克隆，质粒的抽提、酶切，测序和blast。

实施例10载体连接、克隆和质粒的抽提、酶切

具体步骤同实施例6，结果请参考图10。

实施例11测序及blast

将提取的质粒送至大连宝生物公司进行测序，测序峰图请参照图11。将目的片段的核酸序列与NCBI的database中的已知序列进行比对，未发现有相似结果(请参照图12)，说明该目的片段是纳米细菌一段特异性很高的基因片段(标签序列)，同时发明人根据测序结果发现该目的片段两端引物的核酸序列可以反向互补，说明设计的下游引物可以单独做为检测纳米细菌的特异性引物。

实施例12试剂盒的制备和检测

试剂盒包含特异性引物：5’CGC AAC CGG CTC GTC ACC G 3’及PCR反应液，PCR反应液包括：Tag聚合酶、10×Tag无Mg²⁺缓冲液、dNTP、MgCl2、ddH2O。用实施例4中制备的纳米细菌DNA为模板进行检测。

PCR反应体系：

PCR反应条件：

94℃5分钟

72℃10分钟

结果判定：反应结束后取6μl反应产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果(请参照图14)，扩增片段约在700bp附近。

Claims (8)

1.一种用于鉴定纳米细菌的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

2.用权利要求1所述的引物扩增获得的纳米细菌的标签序列，其特征在于，其核苷酸序列或其互补核苷酸序列中的至少一种如SEQ ID NO：3所示。

3.权利要求1所述的特异性引物在制备鉴定纳米细菌用的基因芯片和/或试剂盒中的应用。

4.一种用于鉴定纳米细菌的基因芯片，其特征在于，具有权利要求1所述的特异性引物。

5.一种用于鉴定纳米细菌的试剂盒，其特征在于，具有权利要求1所述的特异性引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于还包含PCR反应液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述PCR反应液包括：Tag聚合酶、10×Tag无Mg²⁺缓冲液、dNTP、MgCl₂、ddH₂O。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述PCR反应液包括：5U/μlTag聚合酶、10×Tag无Mg²⁺缓冲液、2.5mM dNTP、25mM MgCl₂、ddH₂O。

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