PT1267925E - Tratamento de infecções fúngicas com anti-fúngicos inibidores de polieno ou beta glucano sintase combinados com anticorpos de hsp90 - Google Patents

Description

Descrição "Tratamento de infecções fúngicas com anti-fúngicos inibidores de polieno ou beta glucano sintase combinados com anticorpos anti HSP90" A >!;; ".íí invenção dia respeito Λ utilização de uma num ' -- de fabrico de um medicamento pàra o tratamento de infecções fúngicas, compreendendo a cdJSpçdidríic; um novo anticorpo ou um seu fragmento para ligação ao antigénio.

Infecções fúngicas são uma causa importanre do mortalidade em doentes em ucidades de cuidados intensivos e rnais geralmente em doentes imunocomprometidos e debilitados (Gold, J. W.M., 1984 , Am. S. Med. '7 6— : 458463;

Klein, R. S. et ai ., 1984, N. Engl. J. Med. 31 1: 354-357; Burnie, J. Hl 1997, Current Anaesthesia & Criticai Care 8: 180- 183). A presença e persistência de infecções fúngicas pode ser atribuída a pressão selectiva de anti-fúngicos de largo espectro, estadia frequentemente proionyada dos doentes em instalações, tais como uma unidade de cuidados intensivos, problemas em diagnosticar infecções e a falta de eficácia de agentes fúngicos utilizados em terapia. Enquanto que um controlo higiénico rigoroso pode resultar nalguma prevenção de infecções fúngicas num hospital ou noutro meio ambiente, os surtos de infecções permanecem um problema grave que precisa de 000 tratado. Infecções fúngicas sistémicas, tais como candidíase invasiva e aspergilose invasiva podem ser exemolo a espécie Catslidii vdrditesta C. albicans, C. e dc krusei e as especles menos virulentas C.

albicans ser o isolado illmòlct ms-is síosm s&oidè a partir de unidades de tratamento intensivo, sc:T.9óoP recentes indicam nun C. tropical is, C. gi u.i.tò/. ã, 11 p.;vrsv:po:ii.ccii·' e C. kruml Pttircsp&né&r agora c cerca de metade de tais isolados (Pfaller, M, A ei; al., 1998, J. Clin, w-í ·">··'·>1 jfc: ifli-iÍiioCf Pa^tWí P. et ai., 1999, Pathcl. Biol. 46:579-583). 0 aaieie de gapé&fes no n albicans implica a emergência de espécies Candida resistentes a terapia anti-fúngica convencional (Waish, T. J. et al., New Eng. J. Med. 340: 764-771).

Detecção e diagnóstico do patogenic fúngico responsável por uma infecção é critico para a terapia subsequente, porque agentes anti-fúngicos podem ser mais ofictttos contra determinadas estirpes. GB2240979 e EP0406029 (aqui incorporadas por referência no seu todo) revelam uma proteína de stress fúngico e seu anticorpo que poderia ser utiiizado num teste sensível e altamente específico para detectar patogenios fúngicos. 'Tradicionalmente, C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis têm sido tratadas pelo agente anti-fúngico anfotericina B, considerado como o "padrão de ouro" da terapia anti-fúngica sistémica (Burnie, J. 9,,1.937,. supra). Infelizmente a anfotericina B e ela própria muito tóxica e a sua utilização é asompanbaaa de efeitcs secundários incluindo arrepios, febre, mialgia, ou tromboflebites. Outros agentes anti-fúngicos incluem cs fármacos azois orais (m.iconazol, cetoconazol, -•.o;- c: -.-o · óop;: · '·'.v t.cis como C. trotei e T. glabrata são resistentes ao fluconazol, o estas especieç ocorram muitas vezes em doentes em este fármaco foi tOÍJti t t t S. t 0 p t t Z. .:. .;. ·:Ζ t pttp:::í; ": '' ;Z ., OOi. S !t ÓiSSO, iíO': reportadas estirpes resistentes ao fluconazol de C, 1997, apesar dos avanços recentes em fármacos terapêuticos tais como , itraconazol e variantes sistémicas baseadas em lipossomas da anfotericina B (Burnis, J. i., 1997, supra) a necessidade de agentes eficazes para o tratamento ae infecções fúngicam permanece ajuda. d presente iiiweccdlç d irespeito d necessidade simimO; identificada o uso de uma composição para c fabrico de mn medicamento que constitua uma melhoria significativa em rmíohâo a agentes fúngicos do estado da técnica para o tratamento de infecções fúngicas humanas ou animais. Um novo anticorpo pode ser incorporado na composição. & composição da presente invenção compreende anticorpo que pode ligar-se a um ou vários epitopos de uma proteína de stress fúngica, em combinação com agentes anti-fúngicos conhecidos. Os inventores constataram que surpreendentemente, a eficácia de agentes anti-fúngicos contra infecções fúngicas é significativamente melhorada, permitindo o tratamento com dosagens mais baixas ou um tratamento mais eficaz com a mesma dose, o que permite a redução de efeitos secundários indesejados. Além disso, o medicamento da presente invenção, permite o tratamento eficaz de infecções fúngicas que são inerentemente resistentes ao agente fúngico utilizado na composição.

De acordo com a presente IpvóusMp é disponibilizado g uso de uma sompbfiçid compreendendo um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénic específico em relação a um ou vários epitopos de um proteína de stress iÉtgidm e mo agente anti-fúngíco compreendendo pelo menos do grupo que consiste num agente anti-fúngico polieno •í Agoni e onii,rfdnglc-a rg:,n nnamtdi nm o mo maí ado da ΐίϊϋϊηοδ de :,;m medicamento aanaa o tratamento de a:aísa:nadnáá dúr;gdn:moí, st: gaa.? o fungo gum prnnnns r dila iníocóin dàdglnd é resistente ao agenre mati-dirgdoa oor si só. .PomOèm é aqui divulgado oma preparação combinada para uso srpvitfeçdg separado, ou sequencial nc tratamento de infecções fúngicas, compreendendo om f ou «o seu fragmento que se liga ao antigénío especí fico para um ou vários epitopos de qma proteína de stress fúncáco e um agente anti-fúngico o tstm r--1:.:1-:01-: ç pelo menos um do grupo que consiste num agente anti- í . : . C g pciieno e um agente anti-fúngico s> q :..· i Me i ao :( .esf em que o fungo que provoca a dita infecção fúngica é resistente ao agente anti-fúngico por si só. 0 anticorpo poae ser especifico para uma proteína de choque térmico de um membro dos géneros Candida ou Torulopsis. (Os géneros Candi da ou Torulopsis são yn:·'Vyrt*:·,·»". +· considerados como sendo sinónimos). Em particular, 0 anticorpo pode ser específico de uma proteína de choque térmico compreendendo hsp90 da Candida albicanSf como descrito na GB2240979 e EP0406029. 0 anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigenio pode ser específico para o epitopo que compreende a sequência da SEQ ID n°: 1.

Anticorpos, o seu fabrico e utilizações são bem conhecidos e divulgados por exemplo em Harlow, E. e Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. 1999.

Os anticorpos podem ser gerados utilizando métodos padrão conhecidos no estado da técnica. Exemplos de anticorpos incluem (mas não se encontram llSilxãdsã a) /mnoro-oa: policlonais, monoclcnais, quiméricos, ao cadeia simples, ftrdmettos Lab, fragmentos uma. biblioteca ut expressão Fab, e fragmentos .<ç ísii;.·.cvrmms: que se a antigénios.

Cs anticorpos podem ser produzidos numa gama de hospedeiros, por exemple cabras, coelhos, ratos,

Podem ser imunizados por ipqpd&lio com proteína de choque por calor do género Candida, por exemplo hsp90 de C. ou qualquer seu fragmento ct oligopéptído que possua propriedades imuncgénicas. Dependendo da espécie hospedeira, podem ser utilizados tltloo rolaVcmlot para aumentar a resposta imunológica. Taís áthru tos rol'.; to:, mas o se encontram limitados a «tos minerais de Freund, tais como hidróxido de alumínio, e substâncias tensioactivas tais como lisolecitina, poliois plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianina da lapa de buraco de chave, e dinitrofenol. Entre os adjuvantes utilizados em seres humanos, são particularmente úteis BCG (Bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Anticorpos monoclonais para a proteína de choque térmico ao género Candida, por exemplo hsp90 de C. albicans, ou qualquer seu fragmento ou oligopeptido pode ser preparado utilizando qualquer técnica que permite a produção de moléculas de anticorpos através de linhas celulares contínuas em cultura. Estas incluem, mas r.ão se encontram limitaaas a técnica de hibridomas, a técnica do hibridoma da célula B humana, e à técnica do hibridoma EBV (Koehler et al., 1975, Nature, 256: 495-497; Kosbor et al., 1983, Immunol, Today 4: 72; Cote et al., 1983, PNAS USA, 80:2026-2030; Cole et , 1985, Monoclonal

Antibodíes and Câncer Therapy, Máh R. Liss Tnç.. f Nova Iorque, pág. 77-96). f podem ser utilizadas técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos", a eoldo dos genes do anticorpo de ratinho com de anticorpo ηίΐϊίίΑό para obter orno poiPeiiâ com S':l: P 1 ií.:'.· 1:1 11 llsl íl 1: Ϊ UpiP: Ò í; 1 01 ii OOO 1113:¾ íi: Kí :1 d i V.i d d. Ο Ο ΐϊΐ: íljlOípi. Íp:·; liferbiscn 11 PU:, 1984 , Ιοί:·: Çqp, 31: - * : eo οι,,,, ΐοΐ-ρ: 3i:H:ciaF dlé: ioii^áPl; Takeda et ai., 4 985, fetíirw, 31¾ 2 452-454). dissíp, .ís,k técn i 3:-3:¾ descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples podem ser adaptadas, átd it.ttndt diétddto cothiSPlçísÉ no estado da técnica., para produzir ttcjiiu ίτηί; de cadeia simples especificas da proteína do cliDocs tctíMcc de Cístopiõd. Atlfitotptíí com ospçoi fíc .idcdc relacionada, ;tó.s com uma composição idiotipica distinta podem ser gerados, através ido.

PÍ.pXÍSt#P:ÒU imunogiobulina de combinações aleatórias fBiruxcrq D. R., 1991, m&S USA, 88:11120-11123).

Também podem ser produzidos anticorpos induzindo a produção in vivo na população linfocitica oa rasireando bibliotecas de imunoglobulinas recombmantes ou painéis de reaqentes de ligação altamente específicos (Orlandi et r 1 1989, ENAS USA, 86: 3833-3837; Winter, G. st ai., 1991, Nature, 349:293-299).

Também podem ser gerados fragmentos de ligação aos antigénios, por exemplo os fragmentos Fíabr)2 que podem ser produzidos por digestão com pepsina da molécula de Enicrtroo e pelos fragmentos Fab e podem ser gerados reduzindo as pontes dissulfidricas dos fragmentos F(ab')2. Alternativamente, as bibliotecas de expressão Fab podem ser construídas para permitir uma identificação rápida e fácil de fragmentos monoclonais Fab com a desejada especificidade íBcot et al., 1989, Science, 256: 1275-1281) .

Podem ser utilizados vários imunoensaios tara o tttittíõ í sçttrc de tttittootpdí que possuem a especi tieitiade desejada. 7t.rcétvtcií protocolos para •CS li.0: :VÇso ou ímunoradiométrícos ou mhc v- xá com ésmciii^i.úui4$ :t:;tfstoo;uín;;::ídtS õlo ítiú s do estado da Cêotis c, tais tipicam ente a csí.;.çeo da <·' v·'pví. ,; ti .¾1¾ vi entre c pmdtmina ::ító çhoqtt térmico do género Candida, por exemplo hsp90 de C. albicans, ou qualquer sou ou prmto e c seu anticorpo especifico. Pode ser itifli. cisdí:; u.::: ímunoensaío de dois locais baseado em anticorpo monocicruàd. utilizando anticorpos monoclonais cupcel. ticos para os epitopcs que não interferem da profçniuuú d-c choque t e de Candida, mas um ensaio de ligação competitivo pode também ser utilizado At oicu et ai., 1983, J. Exp. Mea., 158:1211-1216).

0 anticorpo pode compreender a sequência da toQ IS n°2 . 0 agente anti-fúngico polienc, pode por exemplo compreender a anfotericina E, um derivado da anfotericina E, ou nistatina. Podem ser utilizados derivados de anfotericina B que incluem formulações tais como AmBisome (fornecida por exemplo por NexStar Pharmaceuticals, Cambridge tuj , complexo lipidico de anfotericina B (Abelcet), dispersão coloídal de anfotericina B (Amphocil) e emulsão intralipidica de anfotericina B (Burnie, J.P., 1997, supra). A anfotericina E pode ser utilizada em combinação com outro agente anti-fúngico, 5-fluorocitosina (Burnie, J. P., 1997, supra). 0 agente anti-fúngico equínocandína, pode por exemplo ser Anidulafungin (LY3Q3366; Eli Lilly &Co., Indianapolis, . Equinocandinas são lipopéptidos cíclicos que inibem a síntese de β-l,3-glucano em fungos (Redding, J.A et i ., 1998, Antimicrob. Agtrstis Chemo.

Ther. 42(3): 1187-1191 j. A infecçâc fúngica que pode r tratada com a u rer :,ri cio ou preparação imamuúa pode ser AycoO: ύΐνν:'ou , ou a inf:ífcc:iç; pode ser provocada por um organismo mntíié®! Cryptococcus, Jkzp&cgiilus, Ov no estado da técnica como "Coccidiomicose", e c termo ·::e maneira análoga é eintmtmm de cm;r- . A :.;η:;η:·:::>· fúngica A resistente ao :;i3òt:te antí-fúngico por si só, i.e. infecções fúngicas que sãc não tratáveis par agentes ftiÇíntolii&ttí porque aquele agente especifico e ineficaz, quando tradicionalmente utilizado por si só. £ aqui revelado um mátede para preparação de um medicamento pâra o tratamento sis infecções fúngicas do zarpo humano ou animal, caracterizado pelo uso de uma composição ou de um» preparação combinada como descrito no presente documento. Métodos para fabrico de medicamentos râu bem conhecidos. Por exemplo, ϊμ medicamento pode compreender adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente ou excipiente (Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishmg Company, Easton, PA USA) .

Também é revelado um método de tratamento de infecções fúngicas do corpo humano ou animal compreendendo a administração de uma composição ou de um preparado combinado de acordo com o presente documento a m doente com necessidade do mesmo. A dose exacta (i.e. uma dose f armaceuticamente da composição ou preparado combinado para ser administrado a um doente pode ser facilmente determinada por rm perito no estado da técnica, por exemplo, através íis utilização Me experiências simples dê dose- resposta. A composição ou preparação pode ser admi nistrada oralmente. É ainda revelado um Kit que compreende atticorpo

um dos em eu mâriom épieépsú á« uma úrnieinás de sAr-isu-a fúnglom e um agente anti-fúngico compreendendo querquem- agentes do grupo constituído por um agente antí-fúngico COÍ i «;c o- e cí;:. rgrors anti-fúngico :iÍÚih:;bí'lérd. Hos0 kit pode ser utilizado para o tratamento de infecções ..· m :··.. em que o i c mgr que provoca a irlsdoeâ ò fúngica é resistente ao agente cri:, ivffcgido por si só. H anticorpo trc .1 revelado pode ter rrnrn 11 ϊ·· 1 :· ':r f' * jl/' '·; para diagnóstico. Assim, para uma utii .ização em •Hogn/o: o·' , O anticorpo podé ser utilizado para detectar se a proteína de stress se encontra presente num organismo hospedeiro, para confirmar se o hospedeiro possui uma determinada infecção fúngica, por exemplo Mucormicose, Blãstomicose, Coccidíoídoir.icose ou Paracoccidioídomicose, ou uma infecção devida a um Qrgdrtit&mp C and ida, Cryptoccccus, Histoplasma,

Aspergiilus, ou Torulopçis, ou por exemplo no diagnóstico de abcessos fúngicos, especialmente candidiase hepática, e/ ou para monitorizar o progresso do tratamento terapêutico de tais infecções. Métodos de diagnóstico deste tipo podem utilizar geralmente técnicas padrão, por exemplo métodos imunológicos, tais como métodos imunoadsorventes de enzima ligada, métodos rãdioimunitários, métodos de aglutinação de latex ou métodos de imunotransferência. 0 anticorpo aqui revelado pode ser marcado com uma marcação detectável ou pode ser conjugado com a molécula efectora por exemplo um fármaco, por ex. um agente anti-ioitgrct .· tal como anfotericina d ou f 1 uoroc i t.osina, ou uma toxina, sal como o rícino, ou uma enzima, stiiitàí-d··:'; procedimentos e a givoigxçlm estende-se a tais anticorpos marcados ou conjugados de anticorpos.

Também é àqm.i revelado ,s dc anticorpo cm do ' re pKpí&çs 11:-0 ri i:.íb;;çx l-jdj-gr ’ί T',:'': *>*j .1- >v :.T li .11 S+y-rs·j:11:: >'· 11--1.11 px. .1·: ’· x ;>i ;Ç; x r - .jb gi x:: kit. íicrsacrns, 0 drrgnbetir"; pode ser disponibilizado crr pode incluir instruções para utilização no diagnóstico de us-ss ou váritt infecçôes fúngicas.

Se desejado, podem ser utilizadas misturas de astdõcrpõfí no diagitilsfioo, cu 200 tratamento, por exemplo misturas de dois ou mais anticorpos que reconhecem diferentes epitopos de una proteína de stiess fúngico de acordo com a invenção, e/ >00 misturas de anticorpos de uma classe iiiiioloídoo, por e:<, aduaddidu de anticorpos de IqG e IgM que reconhece (m) o (s) mesmo (s) ou diferente (s) epitopo(s) da invenção. A presente invenção ser6 ainda evidente a partir da descrição seguinte que mostra apenas através de exemplos concretizações específicas da composição e respectiva experimentação.

Exemplos CXs exemplos descritcs abaixo investigaram o efeito anti-fúngico do anticorpo contra um antigénio hsp90 derivado de Candida albicans utilizado em combinação com anti-fúngicos, tal como a anfotericina B ou fluconazole. Os resultados mostram que nalguns casos, a combinação de anticorpo e agente anti-fúngico provoca um efeito anti-fúngico reforçado comparado comparado com cada um dos compostos isoladamente. Um efeito sinergistico surpreendentemente forte é demonstrado para a anfotericina B em combinação com c anticorpo anti-Candida aiiti vppp dspiG contra uma variedade de patogéneos íúpqiçpg problemáticos usuais. Este efeito sinergistico possui Ifatlippçdíps importantes no tratamento 0'' " 1 de dndvcçpds fúngicas. um tnamie pUpípp ::vvvpiuaá;pd:·;: quatro doentes que sadrtn de imís&pásps por

Estirpes : (Tabela 1) foram aplicadas m pi&mm de dextrcse agar de durante 24 horas. Â.s estirpes foram identificadas com o sistema API 20 C (BioMerieux, Marcy I/Etoile, França). Quando necessária, foram utilizados exames microscópicos da morfologia em agar de farinha dê milho (Oxoid) para confirmar a identiaade.

Isolados de Aspergíllus spp (Tabela 1) foram feitcs cresser em dextrose agar de Sabouraud (Oxoid, Basingstoke, RU) a durante 24 horas.

Tabela 1. Origem das estirpes Estirpe Referência 1. Candida albicans (surto.) B. M. J., 1985, 293: 746-748 1.. C. albicans (resistente ao fluconazole) Opportunistic Eathogens , 1997, 1: 27-31 3. C. Int. J. Systemic bactericl. 1996, 46:35-40 4 . C. tropicalis ÍNCPF #3111) C ; Nacional de Fungos Patcger.icos 5. C. parapsilosis Nacional de Fungos NCPF #3104· ; Patouénicos _IΓ 1.(4 ' ! Patogénícos 7. Aspergíllus fumígxtus j Coleoçild j?

Inoculo: íttro estirpes difãsttntts de Aspergillus, foram preparadas í: ?: :::c ro r bst:- de colónias 111Á vl.d:.!;.(diâmetro > . í; ;": 5 dò:rmt-.dãds: ό>;·: i X iu" cliU:!*.!,:' ri -.rr.: Ót ttt-v i ·£·.':λ do atrards; d« contagem ngrelha de .. . '........Para estirpes de diiiiiiiiti :.vem baixo:

Agentes anti-fúngicos: A anfotericina B foi adquirida a Sigma (Poole, Dorset) como um pó liofilizado para administração intravenosa (Fungizona). G fluconazole foi fornecido como uma solução para administração intravenosa (Diflucan) da Pfizer. A anfotericina E foi dissolvida em dimetilsulfóxido numa concentração de 1,2 mg/ml e o fluconazole foi dissolvido em 0,851 de solução saiina também numa concentração de 1,2 mg/ml. As soluções mães foram armazenadas a -70°C adi serem utilizadas. Foi utilizado no ensaio clinico Abeicet (anfotericina B lipossomal) fabricada por Bristol-Meyers Squib (EUA) e preparada de acorde com as instruções do fabricante.

Anticorpo: A sequência de ADN de um anticorpo formador para o epitopo de Candida albicans hsp90 rrtf&I&cto GB2240979 e EP0406029 foi ritliJ/ioadc 1::1:-.1 op-Lfmi.tt5r?;t; de ΟίΐόΙ,ό para ·:: expressão em Escherichia coli :C(çeròn 'luçirtç.:· ogiéi Inc., Aiò.::t&çi:g.i. CA, ii t: t ‘ e líitiit lóã: t am. vsittsT de oXpr siíoíIbCí E. coxi.. λ siriUídici a de aminoácidos do ftíitiiiiiPi 1.tf ot presente lov^oçáo compreende a sequência do SEQ ID rm 2 (incluí as domínios pesados, leves e espaçadores). 0 ísára 1 carpo èe ocdrdv con a presente reconhece o epitopo que , v : a sequência da SEQ ID N°: 1. n anticorpo htO^MÁxpéO ôti expresso num hospedeiro

Escherichía ce 1,: e depois :1.0-. p-uri.f Ιαχάο por imídazole o. té uma pureza de 95%. Foram utilizados protocolos padrão da biologia molecular (ver, por exemplo, Harlow % éxte., supra; Sambrook, 2. et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual 2" Edicãc Cold Spríng Harbor Laboratory Press, Colo. Spring Harbor, Nova Iorque; Sambrook, J & Russell, C., 2601, Molecular

Cloning: A Laboratory Manual 3a Edição, Cola Spring

Harbor Labcratory Press, Cold Spring Harbor).

Foram preparadas formulações de Kycograb cETfl) como se segue: um frasco contendo 10 ng de anticorpo anti-hsp90 puro, 150 mg de ureia de grau farmacêutico (Farm. Eur.) e 174 mg de L-Arginina (Farm Eur) foram reconstituídos em 5 mi de água.

Meio do Ensaio:

Meio RPMI foi preparado a partir de meio RPMI 1640 (Sigma R788Q) suplementado com 0,3 g de glutamina por litro, tamponado com 34,6 g de ácido morfolino propanosulfónico ' per litro e ajustado a pH 7,0.

Teste de microdiluição de Broth: FétAít preparadas diluições para metade (40 a 0,.021 mg ,0::1 para anfotericina B e 10 : a 0,4 :n0: Al oara o ·.·;· ; ;c em At lo 000:1 t tit do te ··'·::Y:t A: ••X· :c· x-:· .·>.· · ::·:\2:0 ·:ρ:.;:·. >v. -O ..p. ---- x- vMit: x·: ·-.·> 0.1 .2. 02 -1 -0 -.0 -.0·. ;· ·:· U·· ... 5 ,.\ b. -:b: b. : : 2 24,··- x·. .•.•x-.-x· ; 0 2 v; 0 ;· I •x- x·. ;·: : op::b..pâ:lot:0b . .. :·:· .1 >· 1 :,ί"' -.o: o::· x 0 x·: \s' .A 0.· x·. iXtdc to .jibnb.víí.i.;.: 2?· 0.2 v ΐ-ú.cSQLÍt.fúàC^õ, A isto foi adicionado 50 i do anti- c e depois 50 μΐ do anticorpo. O anticorpo ou foi

Idtiiltwdc puro (0,4 :0:0/:0.1(( os.; f3i diluído para 1/11: ou 1/100. Quando s anticorpo estava ausente, perfez-se .;:: uolund para 50 μΐ com RPMI. C volume total em cada poço íu de ϊ/ί μΐ. Concentrações finais de .osm.··:; auu experiências foram: 100 μς/ιτιΐ ("puro"), 10 μg/ml ("1/10 anticorpo"} de 1 \y: ("1/100 anticorpo").

Placas foram incubadas a 37°C de um dia para o outro e a concentração inibitória mínima (MIC- do inglês minlmum inhibitcry concentration) foi definida como a concentração mais baixa que inibe o crescimento.

Foi efectuada a contagem de colónias para os poços em que havia uma redução visual no crescimentc das leveduras. Os resultados foram representados como unidades formadoras de colónias por ml de meio (cfu/ml -do inglês colony forming uníts/ml).

Estudos com Aspergillus:

Isolados de Aspergillus fumigatus, Aspergillus fiavus e Aspergillus niger foram preparados em meio RPMI 1640. Foram preparadas suspensões para dar um idddulm final de 2xl04 conidia por ml e estas foram dispensadas em aliquotas ae 100 μΐ em placas microtítuladoras de fundo piano. Uma série de diluição dupla de anfotericina E que vai desde 250 pg/ml o 0,75 μρ/ιηΐ foi preparada « dispensada para os poçoc adequados. Foi adicionado a ccdò o™, destes poços ονοοαιοΡ numa final do Ido μο/οΡ em tampão de doood Lop/o, Foi t.-iódíám preparada odrie de ccntrcio para cada òpo/Mp que ocooo/oos apenas tipuç/v de bcoosodsopso. Os pratos foodo mtAc incubados a /5 ^d/d/dS i?:;s durante 18 heras e foram valores MIC para cada ιβοΙοΒϊ:· através da presença ou ausência de poços de crescimento.

Sinergia animal:

:··- >:: v V·· .'··: ί'-:'Ó ·:·,:ι ,s. >:i·. ·., .·. .· :· v % ·.·. .·; ·.·.· ,v .v _ p\ çsaç;:a p sp; corai:; l:ií? 25 foram ao ;;0Si0tiS0kfS com aís 0 ui de estirpe do surto de C. albicans (equivalente a . I>-.| x 107 cfuj a ορόν 2 0 (5 s;.0 0 ratinhos foram divididos em três grupos e injectados com: (A) Glaspa s 1 -.1/0 μΐ de solução de 10 mM de acetato de pH9) , seguido por 100 μΐ ae anfotericina B equivalente a 0,6 mg/kg numa solução de glucose a 5% (p/ v?; (B) Grupo 2 -100 μΐ de solução de 10 mM de (AAT; pHOd f contendo 500 \iq de anticorpo anti-hsp90, seguido por 100 μΐ de anfotericina B de anfotericina B equivalente a 0,6 mg/kg numa solução de glucose a 5% (p/ v); e (C) Grupo 3 -100 μΐ de solução de 10 mM de (AAT; pH9) , contendo 50 pg de anticorpo anti-hsp90, seguido por i30 μΐ de anfotericina E de anfotericina B equivalente a 0,6 mg/kg numa solução de glucose a 5% (p/ v); os âsistâss foram seleccionados após 48 h e foram èiosoémsáiís cotiO; ;psis em placas de Saboraud do tecido do slqttdoç baço e rim.

Ensaio Clínico:

IBS ··: S: S S; ί O O Si s 00 ivi S Mi p-S 00 paria : to O laosta íp; tio mstisdsop ;s-i; infecção por Candida foi eíectuado no Hospital Central Manchester Health Care TrèSt Hospital e no hospital de a: y c ct, ambos em rio RU, os doentes foram s;sM'òs:'n:í:lx'.;'S em relação a sinais de sépsia devido a Ssmmvt incluindo: ttlttrto ocoltiv .m·· d® C. «Ibicã.m a partir ae lugares múltiplos profundos ; temperatura alta ou oscilante piiãmiii ( ; pulso elevado {taquicárdia} e elevada de células brancas :ddCddd-; _ oc inglês wbits cell íõOdbtl . d seguir as tratamento convencional com Abeicet (anfotericina B lipossomal) e/ s:r fluconazol, aos doentes foi administrado adicionalmente virias doses de Mycograb, incluindo uma dose de teste opcional (0,1 mg/kg), e dose(s) terapêuticas de i mg/kg. Os doentes foram monitorizados, quanto a sinais clínicos e laboratoriais de infecção (parâmetros de laboratório testados incluem a química do sangue, hematoiogia e factores de coagulação) e testados os níveis de Mycograb no soro e na urina.

Experiências m vitro que examinam o efeito dâ combinação de um anticorpo anti-Candida albicans hsp90 ("anticorpo") e agentes anti-fúngicos são apresentados nãs tabelas 2 a 18. Resultados aas experiências em animais são apresentados na Tabela 19.

Experiências in vitro:

Composições contendo antieorpo e fluconazole:

1-:11.. c :í v [; 1; u ,i' ij i.ò Ώ 'i \) ti i: .1; ç; d d·'.·' & o df : í 'ό·. 'ίν -ν' íiolll 11:1 ii-ino 00- avaliado no teste de mor ό-όόΐύίιρίο: de Broth. Na presença :::110 :1í i;'; -i··:;: · t d £orpà- di-lo :i (ic ili bm-iiq o: Mi:::; psona a u 1 Ϊ' do :1:11.1:110 :iu C. albi cans foi reduzida am ifONitró vezes (1,56 μι; :-in.l o: ::.-(-:10 μο OS .0 1 1110:0000 1: 1 «:fi£iu::arí0.o que unui d.i 1 -A de 100 vezes do gil-í 0. o-ouço " Au 0:: u. ϊ; 'CíU nuíiis redução em do,0:.:0 vezes da MIC do fluconazole. uma lido ligeira na MIC do fluconazole foi observada para a estirpe resistente ao íluconazol de C. albicans e C. krusei na presença de anticorpo puro.

Contudo numa diluição de 1/10 e :1;:Ί.ΟΟ o anticorpo não teve nenhum efeito na MIC do fluconazole destas estirpes em comparação com a situação s:s;:k; anticorpo. No caso das restantes estirpes fúngicas, i.e. C. tropicalís, C. parapsilosis e S. glabrata, o anticcrpo Bnti C. albicans hsp90 não teve nenhum efeito discernível nas MICs do fluconazole.

Tabela 2 MICs do fluconazole MIC dooi/díl:! Fluconazole Fluconazole Fluconazole Fluconaz ole Sem Anticorpo Anticorpo Anticorpc anticorpo puro 1/10 c. / i v y [ICO Pf/siij ! pj: uq/od π mmi Estirpe do surto de Cu albicans 1,56 0, 39 ! 0, 39 0, 78 C. albicans 25 1 2 5 25 25 resistente ! :

77Γ7^Τ7ΓΓ777777777ΓΓΓΓΓΓΓ777ΓΓΓΓΓΓΓΓ7ΓΓΓΓΓΓ: : £'ç X 9'2 | r^ ; f:.γΐ ' 5 si ·· ',Λ''·· " ' · OOI/I odjoot^uv ,01 V cOi sí ε'ι -,οε χ v? > Íi;a:/5d oÕ ΤΪ o.i no |

Cfm/M) ap efâtat^ssuo^ 0|;<;sms0í>íV:|j o bj^uoo (oqins op ©daj^se) Bjsd wa) sp . £ $X#STO j '0 v i': ; ·.' ·-: ;'y

SI ;··· :':: v‘

Tabela 4. Contagem de colónias (em cfu/ml) da estirpe C. albicans resistente ao fluconazole Concentração de fluconazole (pg/ml) __I I 3 í! 1Õ7 i 1,3 JS IO7 i 3 K líf j 6 * ID" j jl.wiw.W.NNSwl^.-.-.^-.-.^-.^ísNNNNNNNNW.·.·. liili. dÇtddOf ^ ................-..............i............................. o...................................^............. η ç ΪΪ......í .·. U : s ; d* a ::¾ tu' : l \ H £> V .:. i.:.i - i 1ν·Α d' ! 1/1.:10 V- m/vú] '3·· ' :¾. 3. ';! ·: ; "> , ν' ΤΓϊ ' ί \ l Ϊ \ ............ ............ · t "í \?:. dl λ {' ...χ. Λ \·λ <·'· v .····· ··. /1 v f"': ’ ;·'-d::·:··· v':·.···ί.Ίΐd· i. v.:· .y .·» ·;·,·. ,·. ,·:

Anticorpo puro ou diluído não teve nenhum efeito anti-fúngico significativo contra C. krusei para as concentrações de fluconazole testadas (Tabela 5) . ; Tabela 5. Contagem de colónias (em cfu/ml) para C. krusei |contra o fluconazole

Concentração de fluconazole (μς/πιΐ)

Sem anticorpo 3,2 x 10' 1,6 x 10b Anticorpo puro [10/ pg/ml] 8,3 x 10b 6 x lOr Anticcrpo 1/100 1,3 x 10b 1,6 x 10° (Controlo i x 10' ou rsiíts a C. tropicalis não foi observado nenhum efeito marcado na taxa de sbbre-ílvisldia: psps csds uma das ççriçantiniiqidda de fluconazole examinadas na presença, áuufred s do anticorpo (Tabela 6) .

I | Tabela 6. Contagem de colónias (em cfu/ml) para C. ; tropicalis contra o fluconazole

Concentração de fluconazole (pg/ml) ·: : : :» · · : ··.·> ·.· .;· -X; .>' .>·. i&s£ 000:0:;:·|>0· i !i: » a. Kb pb.ríi | X íjs.í UÇÇ X: | i j : 1 /1x õ [1 paoõtlj i ! i ,·:^· õó. is1' t&z&trotO tri x ; 0' octç/xrU A tabela 7 mostra que a presença ou ausência do acticorpo não teve nenhum efeito na taxa de sobrevivência ?. ·; colónias de T. glabrata para cada uma das concentrações de fluconazole testadas.

Tabela 7. Contagem de colónias (em cfu/ml) para T. glabrata contra o fluconazole

Concentração de fluconazole ^g/ml) 0 0,78 1,56 1 x 10' 6 x 1 ΰ —... I Ό · 1 lí

Sem anticorpo 2 x 10 v d·' sn.; ! Iln t .l õô rp &' ; >«.

í ÇO

A pttt-v.tçt Dt t,;t àtctt dc Çn-.ltc::;.::: tSt: r.O::o A-?:;lhu?S ò ò.:.ir.a taxa de pattpsilosi* vaia as concentrações de indicadas na Tabela 8 iTabela 8. Contagem de colónias j p&Tápsílààâs contra o fluconazoie (em cfu/ml) para C. \ Concentração de fluconazoie (pg/ml) 0,78 1,56 a, la C, 25 | i -a ·'- :r - ·:Ρ a,-.· T ---:-¾ ; / ··-> :.>W afi :ÍV « a,a.a 10* a a XO" 1 Vá.' pano i ·:· ·· :·: Pa “"1 v .:: an® ? ã. « : n* 1 MlJ xf a t XX:Í ia® a laia aptana; 5 .··: * íp V I fV :: ·':· .··<. w ·.·;· c>. ·.<··>:· U i lib l i IX . ·;:· a <· ··:· ··.·· jl ua/a x| 1 -.Vá-:; r V >a,%: f:- : :'y-\ Ϊ

Composições com anticorpo e anfotericina B: A tabela 9 indica as concentrações mínimas de inibição de anfotericina B contra cs patogéneos fúngicos teste, na presença, ou na ausência do anticorpo •b: anti- C. albicans hsp90 para diferentes diluições, avaliadas de acordo com o teste de microdiluição de Broth.

Em contraste com os resultados obtidos para o fluconazoie (ver Tabelas 2-8 supra), todas as estirpes aqui testadas mostraram pelo menos uma redução de quatro vezes nas MIC da anfotericina B, quando o anticcrpo não diluído foi aaicionado ao meio de incubação (Tabela 9).

Além disso, em todas as estirpes examinadas, houve pelo í£:> vnas uma reduç ão de duas aaaaa na MIC aaíaísaP alma E, mesmo quando o anticorpo diluído vezes f :;a adicionado ao meie de Xrrcaaa :.:1::- paavvaatr À:: ';>·· X · ···:·:· < n <->p: P‘: : ·,· .· ·.·.· ·»»- *.-s ·>.·- ·.· · · - *. ·.·.·. ·.·,· ·.·.· v. ·Μ· -í ϊ··' Ç ·; ·:- ···..· , i 6 maior efeito da capam ni.qsa que compreende o aniiaaapa ™ O anfato aatXas S ta x tXu:::::::: Pa IIa Pa anfotericina B foi observada com a estirpe · ao O si t dê Õb :;iiá 1 ê:â U.V . O líZIUtS SK® 000:/:0¾ :: redução de 10 vezes na MIC da anfotericina B, c mesmo ccm dl l:l:dl:::dc de 100 vezes do anticorpo, a MIC da dívlétaírií^lo.as B foi reduzida aproximadamente avi 25% (Tabela 9).

Tabela §. HlCs su Antsjtencina & ...........MIC (Mg/aa?_—

Anfotericina Anfotericina Anfotericina Anfotericina $4t j ÇprpC A;vÇ·::·· rmo

Cem anticorpo

Anticorpo puro

0,156 de |Estirpe iUU_yí5 /!?!; 0',C39 C. albicans C. albicans resistente ao fluconazole 0,312 0, 039 0, 078 0, 0 7 8 $ C. krusei 0, 625 Ó, 1.56 Vi p'·:·:£: ! í/ .< P 1: .:!· 0, 039 ] 0,0 39 C. 0,078 0,019 .·! v tç.f. C $ 0,039 i j 0, 119 0, 625 \ 0,156 0,313 0,313 pãrapsilosis

Foram efectuadas experiências detalhadas que quantificaram o número de colónias de células qce sobrevivem com concentrações diferentes de anfotericina B com diluições diferentes do anticorpo anti- C. albicans hsp90 para cada tipo de estirpes fúngicas representadas na Tabela 9. A tabela 10 apresenta taxas de sobrevivência para a estirpe do surto de C. albicans incubada com anfotericina E na presença, ou na ausência de anticorpo. Foi efectuada pelo . , 1 ; uma rmdnçi .r dramática (dt pelo menos 10 vezes) no núrr. ero de colónias sobreviventes em todas as concentrações de a11 ot€ ;·; : u i ;a testadas. Per exemplo, para CpOdd μ.ρ/ν:1 da anf cirarioina d 01 LoAQ v;’.c :‘d' 10 .ν' d 11 v O d:·..,-; V. dõ atrdps «0 C 71 IIP .n i.·:.:, CÍ0 ' sy :ç ΓόΌ;: χνΐ •\ .> 11 7 d d O anticorpo diio; ido: 100 vezes, rr :a, d o c omp arado c oir. a c c: x ei de ocidrov ívíSc; oiò: da estirpe r o:;r anticorpo. C efeito •d ·,'·: d í\u y- / ·. v· ,;v.s, . do anticorDo diluído μα/χαΐ sovicrc ααοννααα. mu - lOS vezes para 0,078 ;.i\ i 3 foi equivalente à taxa orttipõ p ara P,ISa μα/aã. :r:.o:í . ... ir :·: ÍP:S0 : . ·??*·:·:';· d'1!:.···.· '·; '·'''··· ·-.· ···''·.·' ..R: o B capar aa s.Cecraàr uma ;::ea: ; ·; .·····. '··· i·* ·---·' oo qúiViiULUMiu φχι anfoterícina B necessária para se obter uma taxa de mortalidade especifica nesta estirpe. !Tabela 10. Contagem de colónias (em cfu/ml) para a estirpe

I do surto de C. albicans contra anfoterícina B o--.- | I Concentração de anfoterícina B (pf/ssl)

Sem anticorpo 1 x 1/· 1, 6 x PA 4,1 x 10b 1,3 x iiB Anticorpo puro [10Õ μσ/ml] 3 x 2 4,3 x Itr 5,3 x ll)b ΊΓχΤϊΡ Anticorpo 1/10 [10 μμ/μΐ] ': X IO" 3,0 x 102 3 x 101 Anticorpo j 1./1¾ D i \\\ μΡ:%1| 6,6 x 10° 3,¾ x 10b : : _^_! 8,0 x 10z i 1 xi 102 i ; i

L

.r tabela 11 apresenta a taxa de sobrevivência de colónias de C. albicans (estirpe resistente ao fl para diferentes concentrações de anfoterícina B e para diferentes diluições de anticorpo. Não foi observado nenhum efeito :? ·.· .%·.··.%; -.y · ··:·' -i .-. ‘w··. o do &Π* ·: CC ,Γ:Ον ou da anfoterícina B para Pi AaOri tr α q/ms ma is PaPaiaia ao aaaxaç αον. iviiàooiaa . Contudo, pala o/í/í i X ·./: Γ; t AP :Y íl/u aa is aue a .-x ;·· ·"·· / · ·..·· ·· : da Mio do α ία rce ivií V •V . \ w ..··> ···> ·:· Ç ···· ·· ·:··'··.·· ··;>: :· Câbej.3 9, i roi Cai α v.-···.· >·· · :··-.··. v·:···. ;··, ραχιαία um efe_„ .... ca aio na Γχ/1 ν'ο - C: ia da £.:oM::;jÍís Por exemple, a 0, 078 pg --:-.1 de anfotericina B, o anticcrpo numa diluição de 100 vezes provocou uma taxa de gídolevi vèí:·íii.ç desta e--u. i : re de 0,1% comparada c-rm a de ausência de anticorpo. iTabela 11. Contagem de colónias (em cfu/ml) para a estirpe i

i resistente ao fluconazole de C. albicans contra !anfotericina B

Concentração de anfotericina B (pg/ml) ·?. ··>'>·· - 0., /:?/:; Ae:t anticorpo Λ0 O H X VO K* sr 4,3 x 10b 6 x 10fc Anticorpo ouro [IDO μο/mj 5,3 x 10'' 3,0 x 10J 3 X 10" Anticorpo 1/10 [10 pg/ml] 2,2 x 10b 6,3 x ICC 1,6 x 10J Anticorpo 1/100 3,4 x 10" n O \—í X to t—1 o,3 λ 10* (Controlo 1,6 x 10'' cfu/ml)

As taxas de sobrevivência das colónias de C. krusei na presença de anfotericina B e diferentes quantidades de anticorpo são representadas na Tabela 12. Pode-se verificar que o anticcrpo é muitó eficaz contra esta estirpe para às concentrações mais elevadas da anfotericina E examinadas. Mesmo para una diltiplp de 100 vgçç;;:.: o tle colónias de C. krusei detestadas na .c:-u;;· ;·.:: :·. de 2,312 pg/ml de anfotericina B foi de OgOIi vi que tebtsítdVííit sem anticorpo. iTabela 12. Contagem de colónias (em cfu/ml( /contraanfoterieina B de C. krusei ! concentração de anfoterxcxna B (pg/ml) ! 0,078 1 ’ 0,156 3,312 Pôr?: : I A-11 : -:· í / d/ 9 x 13" λ'·<λΛ dal. ··.·.' .v >.v v.·: i ;; y 5 g:i: ϊ 6 A :0:: ' i .............. •dA : co r ¢: '-'v ,, v /v- -· .->· v>· c - . ··.::· -d o A v 1/11 ......... 1 Anticorpo i (Controlo 1 x : 0' cfu/ml) j

Para todas as concentrações de anfotericina testadas (gama de 0,019 - 0,156 μχ/Μ,'ί verificou-se que o anticorpo era eficaz na redução da taxa de sobrevivência das colónias de C. tropicalis (Tabela 13). 0 efeito foi reforçado para concentrações mais elevadas de anticorpo e anfotericina B.

Tabela 13. Contagem de colónias (em cfu/ml) de O tropicalis contra anfotericina B

Concentração de anfotericina B (pg/ml) 0,019 0,039 0, 078 0, i56 í Sem :;nt xorypo i lvh h; a IC>* s x? a :··; ru" 6,6 x 103 :· >· 1 !·>> ·;-> ··”·>”·: )·-·· :·· :-A ·-: ,>.· ·>.-:· ·ν··1^ ·ν ·. «·.· (ru tQ Í.W.Í^.ML x v ' . xr-X ,s >· .·>.·':·> ; -·· ,< '«· .····* -.·> y · : ' · ......'η............... .«·. :: ·'·.' > • ->'>'· · ->:··:-'«'A· £<* -···· ; ο .·' .···; .i. * iv ‘ i ã .; ·;> X / W "rl.....(Γ :1A '........ í ** Λ\. 3 X; 1 0 ' U · .....dl.../.....L : i i- jyll.y • ·.’ ;. ,·>. ,:·> * ··· cr - V* · : : · · ·:' ·»'- -· ··>· s ; 1....... ·Γ:>ν >-: :i-·- ·<·*·.·:··: 5 ;; V-.>·-·· y. v.· v.i.V ·:> ·: 1' x 10'" οχχ/χΐ} de sobrevivência a tabela 14 apresenta a tre:o de sobrevivência para glabrata na presença de várias ooreont .cã vier de anfotericina B e anticorpo. Observou-se que o anticorpo era sltamente eficaz para inibir e crescimento de T. pippiVVpií em todre 00 írtPvetf d:o tvèrOtericenP b- dv S:OÍ&tpr:;bcÍpS. p, S0 db testadas, re.c exemplo, numa diluição de 100 vezes do anticorpo, o crescimento desta estirpe foi inibido em Plpili S: PvvbP pq,0 p g / O 1 iíb a 1 i οι: ρ r i c .1P â :: .. Cl ’ . :C V -

Tabela 14. Contagem de colónias (em cfu/ml) de T. gíl^líxafcá contra anfotericina B

Concentração de anfotericina B ^g/ml) L,009 C,019 0,039 Sem anticorpo 1,1 x IO'' 9,6 x 10* l, 4 x jn* Anticorpo puro i100 ISM-kl............................ 8,6 x 10 8,3 x 10'" ç- C V- Anticorpo |p i< 1CB (6,3 x 10J 12,3 K UV 1/10 \ \ I Ílv pgdmi| | | 1 : : d, .,:.,vJdi £.-: v ·: : d .i \ :>*s |-.l μ-q/ml j <'< d ·.·'.· S:· d- ... -v··:·*·;.':· *>-: - .. ···: . .: V /: ; ··· í ·ί· o .i.v 1 .:. ;· ... Ο .' ·· ! ί ...............................__i............................................... L ................... :c;-i 1(0.; c 1 x .r of o/red A psbtreqirtnoio da estirpe fúngica de C. íiPtPPPrivvdb para diferentes níveis de anticorpo e srviobsvltibb B é rédiOPré na Tabela 15. rei oprerrepo que ::· vpticvrpv puro consegue a rreard.;· na taxa de sobrevivência desta estirpe em todos os níveis de que para as sc:fotw:ticd.nu 3 testados. Para Cvsnp&birírédvv mais baixas Pt ppPiCPredp o efeito foi ore-re breretiré:: do irelres estirpes examinadas. jTabela 15. Contagem de colónias (em cfu/ml) de C. J parapilosis contra anfotericina B i Concentração de anfotericina B (pg/ml) i X> :5:1.;. .ci. :Í. C· χί çi : ,·ϊ·. .·**· ;·: ; · ·:····: ·.· :·.· ··. .· :;x·· ·.·.· : ' • ·.··.:··:··>···.···:· ; ;·,·: ·..·· :: tc<:.rr:-v :: '· Ç; y':· 0 r 100 I,t4> 0 1.0: 1,0 ·>: u: ' ................ . . .vo ..... ww v 0,313 : -o 0 /-0-: : Λ .0 -vV. ã, 0: :&. 10:' ' : A*: ··:·· 1 lV/ :.f . ί o i o;5 0, o x 10 ;x : Λ;\ i : : ·: v- J-.C-1 j ' i 1 - p -1 1,1 x ;· : ; 3l;0 ή Kr ί iCtwaúa :;l -is: I0': soí&rmió i j

Composições com anticorpo mas sem agente anti-fúngico:

Numa outra experiência, foi testado o efeito de diferentes concentrações do anticorpo isolado anti- C. albicans hsp90 (sem agente anti-fúngico) nas diferentes estirpes fúngicas (utilizadas nas Tabelas 2-15 acima). Os resultados apresentados na Tabela 16 revelam que para a maior parte das estirpes utilizadas, o próprio anticorpo não possuía qualquer efeito na sua sobrevivência. Contudo, foi observada nas estirpes T. glabrataf C. tropicalis e C. parapsilosis alguma diminuição na taxa de sobrevivência que pode ser atribuída ao anticorpc sozinho. 21

21 gabela 16. Efeito do anticorpo por si só contra o crescimento de leveduras (expresso como cfu/ml) .1'' ·:· ·· .''Ο 1, :!t. 2- 2 ···*·' ' .:1- --0.1 Ò-. 11 ;·: > y, <.·. <···.·,> ·,.· ·. 11 2.1, .-1: 2- .:3.i3;··· sis (pç/ml) ’> M· .·.·. • .:/ /.:-:2 //v " .2: ao fluconazole 2 :///2-. ,:,.1:/ 1 jí | y : v < :· '· - -. 0. yy : 3 - SM2 M 0 -/1- ·· : \ i·: ·*: ·:··· · ·,· .··, 1 ··’ í ol M M-vl.M' λ:- >t ν.-Λ-,ί-.ν:· Mil :l; 1x./íí:/: % /t. :lf:i 2, :M.oí: ixi/i /,.2-:225 •ί 2v-:..; ·;1,1:' ->1>: 1.-.21,1,11 Λ iv..·,;!. :2 M.· . : / .·!··> 2.1o S. 'C.;-v — :-::3 V.·' j. 3 Λ .4 o 2 ,v / (· lil1: 7 . >" .> » y.>·, v .?i:' -.,,,:1 .Í37. , ..s.iví M * líf ;':È r. .1 X 1 :,i ' ÍÇ.X,:, :l' XXi/X ' y -, ,:-..¾ >··; . 1- : ·:·:·· -.V jV Wrf, y. V

Experiências com a esp. Aspergillus: A MIC do Aspergillus fumigatus em relação i anfotericina B foi de 2,5 μg/ml, Grn a adição de Mycograb a MIC desviou para 0,125 pg/ml (redução de duas vezes). A MTC do Aspergillus flavus em relação á anfotericina B foi ííís 2,5 Lig/m... Gcm a adição de 100 μα/ml a MIC desviou para 0,125 pg/ml (redução de duas vezes). A MIC do Aspergillus niger em relação a anfotericina B foi de 2?5 pg/ml. Gcm a adição de 100 pg/ml de Mycograb a MIC desviou para 0,125 pg/ml (redução de duas vezes).

Sumario des resultados in vitro:

> 2: /2 '

i- ’ o /: ii i·;; 1. J. il 22 ΐ/;ΐ' mmm. f·; r 2: ii :-/. S5. ^ '2 s? ·:··ι:·: li':.:··!. iv.iiCr/; ,333.1 11 1 :Ϊ!.Τί ÍlC5a mú- -l m ·'·. Ij :·' '· :·' ν'- : :- v w> MM i--,:,.·-;, :-1,1 , 3- 2:· // :/' :1.7.7 di! !: l':".M; i/iXi ii >7,3 l;/r|;3í:l 1/1::::3:1-:.77:3 , Γ ···;:··.: 3:1:1 . ..1111 ,:-. 1:1-1/ 2 '.· 21 7:7:3 3031313 3; 2:- .¾ 2; y . -: : " ·ν em com B. Este Siso·:; o :í-o r entre o anticorpo e a anfotericína E não é observado com outros agentes anti-fúngicos examinados: o tixo:vr;::ao:cv:;:e combinado com o ééti osép-é élr piumUééfu urn resultado significativo e potenciaimente útil.

Utilizando um critério de corte ae uma diferença de 4 vezes na melhoria da MIC, os dados na tabela z revelam t-r c éréoé::tr:ér ir combinado com anticorpo pero éiérO. φι too uéçéél) <tt tire diiuiçla· 0« 10 remei do anticorpo (concentração final de 10 μα /ml} foi eficaz apenas contra a estirpe do surto de C. albicans. Contudo, utilizando o mesmo critério, pode-se verificar a partir da Tabela 9 que a anfotericína B combinada com o anticorpo puro ou com uma diluição de 10 vezes do anticorpo foi eficaz contra todas as estirpes fúngicas testadas. Pode-se por isso concluir que existe uma sinergia forte entre a amfoterícina B e o anticorpo anti-C. albicans hsp90, medido através da melhoria na MIC.

Para as experiências em que as colónia fúngicas foram quantificadas para diferentes anti-fúngicos e tratamentos com anticorpo, (ver tabelas 3-8 e 10-15, supra), pode ser utilizado um critério de corte diferente que aefine uma queda logarítmica de dois, queda de (100 vezes) nas colónias sobreviventes para avaliar combinações potencialmente úteis de tratamentos.

Um sumário dos resultados para o fluconazole em combinação com c anticorpo anti- C. albicans fimyi é urtxt. udt na Tabela 17. Aqui é apresentada a cor icentração mais baixa dc fluconazole que resulta no mim : i v ' Λ·.·;.. Ϊ: Λ.. :í: ÇÇ a. orérraí;raçár m....i ãisriéi ué 11 is :/:-..1,. na experiência) ítoélOiiviémrrvé*: com uma ··;·. '·;-··;"· ή .···> ·:·. .···:·. 1- ..· 1 :.: .; cri té-rio de corte et: ser crérOguidr pelo »>.\.·· · ··>.·· .... . O :.; é. USéUs de 100 vezes na taxa de a fúéédéé. Cs resultados mostram que apenas a estirpe resistente ao fluconazole de C. quando '·.·!· ·.·:>.y .d.:· &*: ò-> :P: com o fluconazole de C. quando '·.·!· ·.·:>.y .d.:· &*: ò-> :P: com o produziu um efeito r : oel o e o anticorpo signif icar.ivo. I Tabela 17. Sumário dos resultados in vitro para o 1fluconazole ¥ 1 d coo· a-;; o Io An t r r o roo rabela pero . Λ í pgfgtl j i - V ' 1 ílditO- Q 0 Vi aIbicans i C. albicans 12,5 + 4 resistente ao :c. krusei 50 - 5 ............................. V, ir í";· -ú; ....................·Γ:Α.............. ::...................................... Á, ; I ______________________________________________________________ ..........................................,wW ................... ,J pr ddl.fi A O· ·'·'· ·:'· ·!;. ·ν· ;b. v rb .f ; d í? X vv 11:0 ; - S-Ad.fCS o ;·” -Γα-'β vi Γ i ·£: % ^.·χ y : >';··?’ x-;: ·>:· --:-1 i- Α·: A -1. L A-i- X AO OOitSí: p Ui redução de pelo menos 100 vezes na contagem de colónias)

Um sumário dos resuitados da anfotericina E combinada com anticorpo anti- C. albicans hsp90 é apresentado na tabela 18. Pode-se verificar que o critério de corte (redução de pelo menos 100 vezes no crescimento de colónias) é satisfeito com anticorpo puro para todas as estirpes fúngicas examinadas, com uma diluição de 10 vezes do anticorpo para C. albicans (estirpe do surto e estirpe resistente ac fluconazole), C. krusei e T. glabrata, e com uma redução de 100 vezes do anticorpo para a C. albicans (estirpe do seeicj e T. glabrata. É de salientar que a sinergia entre a anfotericina B e « anticorpo foi observada Ai contra as estirpes tActoiA-Ali: oo fluconazole de . . ..o

Tabela 18. Sumário dos resultados in vitro para ai

[ anfotericina B

C. I albícans \ resistente \ ao ! flucona- j zole l C. krusei l \C. parap- \ 1-0 1SS i " i - i! i silosis \ j ...................J ...................__ i ! (+ indica S -mi te:; xr da <.···/·: l'.e tâtist'Slt-Sí critério de ccrte rão satisfeito; critério de corte é í reduiffe de pelo menos 100 vezes na contagem de colónias)

Os resultados com a esp. Aspergillus mostram que htvit sinergia entre a anfotericina E e Kycograb in vitro cooort a espécie maís comam da esp. Aspergillus. (2) Experiências animais aCEi-dlEpÈG (Grupo 3} . Contagens de colónias . r.:. : ::··< ccciboc aos racinhcs após um período de de 48 horas são apresentadas na Tabela 19. Do resultados mosuram que os animais tratados oc·*; anfoterícina 3 e 5SG pg de anticorpo (Grupo 2i apresentavam uma rçdpçâí:; significativa (de pelo menos Lima ordem de grandeza) no cEcacrc de h:CU::tíípPPP de leveduras comparados com os cricicEo tratados com apenas anfoterícina E (Grupo I). Os animais traoados com anfoterícina B e 50 pg de anticorpo (Grupo 3j também mostraram contagens diminuídas de Leveduras comparadas com os animais tratados com apenas anfoterícina B (Grupo 1). Os dados in vivo corroboram por isso os dados in vitro e confirmam a sinergia entre o anticcrpo anti-hsp90 e o agente anti-fúngico anfoterícina B para o tratamento de infecções fúngicas.

Tabela 19. Contagens de colónias de C. albicans(estirpe do surto) em tecidos de grupos de ratinhos tratados Colónias (cfu/ml, em loglO I desvio padrão) i Grupo i Grupo 2 Grupo 3 ppi;....................................... jrifado : p . Ε·1·:·Π Pl !?: ( EaGJáP.pp i jí , c sac rr ·' ? ' ·' ·' ··, Λ ;í- ' ···.*.·.·>. f \· j '> ,* ο>'·Λ: Λ .· 1 .·/ : \ a, E E±1 f 4 E j 3 * 2 EiiO > :D;E 8 ( E ?,OÉ!> p fâ í> VA 1 * ' " - í ; ::: E f ' · hm , E ; (3) Ensaio Clínico: A quatro doentes com evidência de infecçãc por Candida que Sdc? estavam a responder ao tratamento anti-:: d:?ó CPCVpPCióP-tl foi EiÈEl EE.ES-E:t u;u νΓΡΧΕϊΕΕΕΕό combinado de éhti-:':fE;ríp:ihd>S e 'C':·. i?C.;·.cc tcUiVr-Eériu ca icrh-E de Mycograb rv-ev acima) e sc caca cv.::cEcc fcrs.;t· A;':í doente to. :ψΚ>& !AS;t:A:K; um diaanóstico A;':í doente to. :ψΚ>& !AS;t:A:K; um diaanóstico í :í. 0 roí pt,imitio de pancreatite ajuda e o doente possuía síndroma Auto li ν:Α;o pós.v..Opersí::d:írae ον adultos dó i ítui ia postoperatíve adult respiratory distress syndrome) necessitando de vyyH loyuio, sovo i-ts Ui i? lor reota. t uvirac®:! in voAro a partir os rtutsuo múltiplos incluindo o leito pancreático. C doente possuía une contagem muito elevada du glóbulos brancos (WBC) !78,4·, apesar disto ser altamente variável e poder não ter sido provocado unicamente pela sépsia. Fci iniciado c tratamento com Abelcet cim 1 mg/kg.

Cinco dias após a iniciação do tratamento com Abelcet, foi aado adicionalmente ao doente 1 una primeira dose teste de Mycograb a 0,1 mg/kg (Dia 1). No Dia 3, foi dado ao doente uma dose clinica de Mycograb de 1 mg/kg. Devido a vários factores, por exemplo uma pior contagem de plaquetas que tinha sido baixa pelo menos durante quatro dias, o tratamento com Abelcet e Mycograb foram descontinuados no Dii 3 após ter sido administrada uma dose clinica de Mycograb. Contudo, no doente 1 cresceu novamente C. albicans a partir de ascites seis dias mais tarde (Dia :5c e foi posto a fluconazole (400 muj . No dia seguinte (Dia 10) foi dado ao doente as duas doses clínicas finais de Mycograb a 1 mg/kg por dose.

Apesar do Doente 1 ter estado a Abelcet durante sete dias, entes do doente receber a dose clinica de Mycograb no Dia 3, a C. albicans continuava a crescer rio locai da ·:·νν y-Atcr· a-:-;v wv-vv < :a:cv-£

a do doente e o doente po s suia uma gfia · C tratamento combinado com âimi-tet e :.· fia Ai® 3 resultou num período de cinco o • .···: v 0 qual C. 1/.· i coo:cresceu. Não to ···· r Uv·:.·. .· mm r :00 0 :..:p?á e.: rs.Avr: r;·. ruissui vuudí::r os Mycuq y. imier QO m hematologia e (A \·Λ.·'N w. ·: «o ::C com v: 0 0 §' vz oepua epeo U- V i :j asop .,3 33 0 0 ‘ 8 . T Ό T Ό - 0 0 '9 KT* o VG / -r U l 0 0'v 0Ί E; '0 C ‘ 7 0 3 * O ¢--1 Γ- s‘z 0 0'l 0‘í 0 ’C 0 3 10 U 0 0 0 0 33C-P ρχ do do 33/Pd 3:í 3 Pp/Pd o‘l Pd/Pd I'0 (tf) oduiax - ei «τα οι «τα % ®T«3 I *?« ©q.uoop ou qt ep ura) oaos ou X i ΌΖ j eu ;!p oeu sopep) /d/Op: /d'/ aP sasop ma ap oaob’ ou &·'oi eTP °u açop epundas 3 6 seiaq-q. usa) ppp/iví uj roAçjasuoiuap ----o·

' (81 UIOO 3/ 3333X3 a spenb so eued sapanbe ujujc sx 3333 sapsa a 'OIOS OU 3:/3.: P Í33 3 3 30 nap ; j r x 33 ou CP OU PP p sv • 0305 ou 35933::333:3- W>;:: s/aATu e uiafiou ou Θ Ij. S O 4. ap asop 3 > 3/33/3 3 631 33:333: '3; mo.; nap • oe ap sasop O eu 53 Xg ap sasop ap òpòejuprpPtupJí· sode oduiap ap o gpx g ma / auuaop ou paiPuudg 33 ou os ou aouaop c o ou;: a / sepapep oppiuaxa iod isa; :;/./.r;'.39 303 3 33 SOp 33 3 3 33 Γ 3 333333 9p 61395 3 som a infecção associada a a temperatura flutuante (35, 8-38, X'?xi WBC sxxxxdx (11,4) o xxxfuixxyxXii ocasional Π lo) o Foi iniciado o tratamento com Abelcet com 3 xç

: rxXXxxXxx::· tom Abelcet, o doente 2 ainda rinha a reter x flutuante, obU elevada e taqui cárdia ocasional. F-si administrada ao doente uma dose de teste de 0,1 mg/kg de lyxxxxxx (Dia 1) . No d.La seguinte foi dado ao doente uma dose cxÂxxbX de i mg/ kg de Mycograb (Dia 2). A última dose de Abelcet fci «lia; dada no Dia 2 devido ss término de um progrâmn de tratamento de 5 dias. Dois dlxx mais tarde (Dia f o doente recebeu as duas doses clínicas finais de A;··toçttt, O Mycograb foi bem tolerado pelo doente. A dose clínica de Mycograb no Dia 2 estava associada com uma descida e estabilização de temperatura (38,2 a 31.» 7no Dia 2 após ter recebido a dose clínica mantendo-se em /6,1?ate ao Dia 3} e uma WBC em queda ( de 11,9 a 9,6). No dia 4, o doente parecia clinicamente melhor e não crescia C. albicans nas ascites, culturas de sangue, ou urina. Não foram observadas nennumas alterações relacionadas com Mycograb na química do sangue, nematologia e em factores de coagulação durante o tratamento. A recuperação posterior foi complicada por um episódio de sépsia bacteriana, mas esta respondeu ao antibiótico e o doente recuperou completamente. Níveis no soro de Mycograb no doente 2 em diferentes intervalos de tempo após a administração de doses de Mycograb são apresentadas na tabela 21. A dose de tbrté m Dia i não deu origem a xixxix mensuráveis nc soro. La fflH : . :: η V :' v; ::ib Cila 2 deu XXI XX X xi Atccxâvels no soro, e estes nlva : i x eram íosast Ixx:· i a T: ·'' =' ·.: para os a sinergia ' ' ' ' ' ]j7 era xxxx XXvXX.i x i V S: X X S&Dí; X. X X e 18) . XV ·: .x· ? X-;

κ* ύϊ: ί :;ta: ?s:;s.§ iSOíSeS Ί·" : :.: ?SCj:V:k = cr:; /·:· ç ;CSS •í a :,¾ . „.

Tabela 21. Níveis no soro (em μg/ml) de Mycograb no doente 2__ D i a 1 Dia 2 Dia 4 D i a 4 1 smpo n, 0,1 AC 1 s::s , mg/kg í 1 ,· 0 m:g /:k:g i1f D mg M :-P Ia aose hl /l.V Ι;" 3 c i C ! 3 0 0,5 0 i ... /. i \ Mi 1 IrP' ................O73........... , ó\ 0 ................' Ò;....... ......... l,o I ?: ·· Ϊ 2 f 0 0 0,1 ; Π : w f :·· 0. _________ i í:o ti η o : 0 0,1" 6,0 0 Ί..............c................... D': O co 0 | 3: 2a dose 0 f 1 dcicici entãc .....j............ $....................[...................i....................i.........................................I...................g..................... ...... ;>:ip h ΐ ii; : .............. ........................t........... ........... 0 doente 3 tinha uma história de seis semanas de pancreatite que conduziu a uma pancreotomia de 80%. O doente tinha níveis de LFT (teste da função do fígado -do inglês liver function test) moderadamente elevado, relacionado possivelmente com abuso do álcool, e era portador de um MRSA (Stsphylococcus aureus resistente a meticiiina ... do inglês Methicillin- resistant Staphylococcus aureus). C. albicans cresceu a partir de locais tiúlt.l pica do doente por isso, o doente fci tratado com fluconazole intravenoso. Doze dias mais tarde o doente nãc conseguiu responder ao fluconazole, e mudou *.?.«·>·· * 300 mq de Abelcet. Três dias mais tarde, c doente continuava ínitúrito {3I/S"C) >s D, uiiu u:rm cot: illtiivíiur h::ótan.su; ti:.'..;.: :3 ViS :.i v. . AU .A UC-íA à ; ui '·: v: íu 7U> --0 0000 C» fÚíSítfOCOpliK .1 Ç Ãi píU;' .iuÁÍ V de :Km/kin rpctxkrss 1) para ·: n de

No mesmo siS: em tsirsí 3. dose de oyovigrâu foi administrada, 2 áottttb 3 suúrso um episódio agudo de séptico dó tipo Sít&twjegacivo (temperatura elevada Na 3 9,5°C, :h:lpa't:a®ai';:to( .. devido a aaerdaaajvaa :Seru(tl:t.o*a.· que foi depois feita crescer no seu ore:··;·:; ptettèti.da, apesar de ele tartrét: fazer crescer Enterococcus faecalis a partir de culturas sanguíneas. Devido a es:e episódio não foram dadas mais doses de

Mycograb. O doente respondeu posteriormente a terapia com antibióticos (vancomicina e ceftazidima).

Devido as complicações bacterianas foi difícil avaliar o impacto da dose única de Mycograb no doente 3. Contudo foi verificaao que ele deixou de crescer C. aibicans (por exemplo, a partir do seu tubo da gastrostcmía e dreno da ferida) 48 horas após a dose e que se tornou apiréxíco no Dia 2 e no Dia 3. Não foram observadas nenhumas alterações reiacionadas com o

Mycograb nos parâmetros laboratoriais (química do sangue, hematologia e factores de coagulação) . No dia 4 o doente teve C. aibicans recorrente, enquanto ele estava ainda a Abelcet, mas recuperou completamente posteriormente. Os níveis de Mycograb no soro do doente 3 em diferentes intervalos de tempo após a administração da dose de Mycograb são indicados na Tabela 22. A dose única de 1,0 mg/kg no Dia 1 deu origem a níveis no soro detectáveis, e estes níveis são compatíveis com aqueles para a qual a sinergia com anfotericina rui demonstrada in vitro (ver tabelas S e 18). O /1; ::t g;;çç fel também detectado na ri.tu ,0 mg/ kg (dados não apresentados). ; Tabela 22. Níveis séricos (em pg/ml) de Mycograb no doente I 3 _ Dia 1

;

|

1,5 1,20,?

··>: í V

Ao doente 4 foi diagnosticado empiema de C. albícans, apesar do doente ter sido inicialmente admitido na UCI (unidade de cuidados intensivos) com um abcesso nos pulmões devido a Streptococcus milleri (isolado a partir de culturas sanguíneas). Foi feito crescer C. albícans a partir de dois espécimens de lavagem brônquica (pulmão esquerdo e direito) e três e quatro dias mais tarde de dois espécimens do fluido do empiema. O tratamento fci iniciado no dia seguinte com Abelcet (5 mg/kg) . Cinco dias após o início do tratamento com

Abelcet, foi notada alguma deterioração clínica e na manhã seguinte (Dia 1) isto foi associado com WBC elevubo (15,7:) e C. albícans cresceu novamente a partir dc 11 rd d c do in terces tal.

Foi dado Hycogtad t! mg/ kg cp) ao doente 4 às / h 30 mio ·. E >a 20 o 30 min. No 3iõ 5. Para Plám de um ·: u:···· t;:tmpdu« rio; a temperatura o a noite do 3ia 1, o suent-u το : ?' r. clinicamente . C. mÍ.b;::cooo> não co o ou a 00:0::.: u.; u.uoão;:; mo:o do fruído 00 rmpiçut cultivado no

Dia 3, e o úbimte ficou progressivamenoe melhor. 0 Mycograb foi bem tolerado peio doente 4. Não foram

Mvcograb nos p" ;·\·,········:·τlaboratoriais :gu mm to do sangue, hematologia o factores - , q ,:· M.tiís etbavu a fazer crescer C. ítíMttst.e a partir de s-s dreno no peito seis dias após o inicio do tratamento com itelíit': e c sua WBC era elevada (15, i mesmo antes de receber c primeira dcse de Mycograb, nas a seguir o doente ;í;sbhdroP progressivamente e αρίρρρ de crescer C.

Os níveis ae Mycograb no soro do doente 4 em aiferentes intervalos de tempo após a administração de doses dlf Mycograb são indicados na Tabela 23. As doses de 1 , \J <'·:·. ; ;<.<? no Dia 1 deram origem a níveis no soro detectá veis, e que eram compatíveis com aqueles para a qual a sinergia com anfotericina B foi demonstrada in vitro ( ver tabelas 9 e 18) . A seguir à segunda dose no

Dia 1, os níveis sériccs do Mycograb melhoraram indicando alguma acumulação de tecido a seguir à primeira dose. 0 Mycograb foi detectado na urina em doses de 1,0 (dados não apresentaaos).

Tabela 23. 4 Níveis no soro (em pg/ml) de Mycograb no doente Dia 1 (h) ?,0 mc Ikg i dose b"·' dose £ ·5ο 1 í 1 i lyi 1,4 11,0 :j 0.1-01 .Ι,Ί iv; y V .........................g——---------- 0 , 0 :0,t (continuação) jTabela 23. Níveis no soro (em pg/ml) de Mycograb no doente i I 4 j_ I Dia 1 i _I_ _i___ 13,0 Dada a i;· dose 1 0 -:¾

Os dados aqui apresentados demonstram claramente que existe orna sinergia surpreendente entre o anticorpo anti-Candída hsp90 e c agente ant.i-fúngico anfotericina B que provoca uma actividade anti-fúngica melhorada contra uma larga variedade de estirpes fúngicas patologicamente importantes. Estes resultados permitem a utilização de novas composições altamente eficazes para o tratamento de infecções fúngicas humanas ou animais, e também um novo anticorpo que pode ser incorporado na composição. A presente invenção possibilita dosagens de tratamento mais baixas, ou um tratamento mais eficaz para as mesmas dosagens reduzindo deste modo efeitos secundários indesej ados.

As implicações clinicas da presente invenção incluem: (i) a produção de uma combinação sinergistica de anfotericina R e de anticorpo anti-hsp90 para o tratamento de infecções disseminadas por leveduras que dsteerâ o tratamento preferencial. Isto conduzirá a usm redução na mortalidade e morbidez destas infecções. Os resultados do estudo clinico preliminar aqui disponibilizado confirma a eficácia da presente invenção em comparação o cs métodos existentes de >.» v. W. ..V. Çv ·:·· é'·. > a anfotericina 3 é um fármaco pe. particularmente nefrotóxico. A sinergia fornec; ser ,.;pses ps.':.* .berres de ar: ítc. er lai nr 5, ra:r::d:orda a edil diria .« rrab·:: bobo a toxicidade; e (xii) 0 de anfctericina a prdrror: ror rxplcabrts;: abada: para a:a rabo .riírico melhorado.

Listagem das Sequências <t-.i 1 &}' NeuTec Pharma pic c·1:' v Tratamento fie Infecções fúngicas 4¾ Patentln Ver. 2.1 <210>1 <212> PRT ·: 5v;!> Candida sp.

Leu Lys Vai Ile Arg Lys Asn Ile Vai 1 5 <210>2 248

s :'i PRT v * ' ^ sequência artificiai <220>

Descrição ds sequência, arllfícia!

His Met Ala Glu Vai Gin Leis Vai Glu Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 15 10 15

Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Cys Ile Ile 20 25 30

Ser Ser Tyr Trp Ile Ser Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Lys Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Ile Açn Tyr Ser 50 55 60

Pro Ser Phe Gin Gly His Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn 6 5 70 75 8 0

Thr Aia Tyr Leu Gin Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Arg Asp Phe Gly Asp Ser Phe Asp Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 Ser Pro Ser Phe Leu Ser 145 150 \yV'£ Arg Ala Ser Ser Gly 165 Ala Pro Gly Lys M-;s Pro 180 Gin Thr Gly Vai Pro Ser 195 Phe Thr Leu Thr Ile Asn 210 Tyr Cys Gin His Leu Asn 225 230 Lys Vai Asp Ile Lys Arg 245

u O

Gly Gly Ser Asp Vai Vãl Met Thr Gin 140

Phe Vai Gly Asp Arg He Thr lie Th j ;s 16

Ser Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 170 175

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu 185 190

Phe Ser Gly Ser 1;y Ser Gly Thr Gin 200 ‘ 205

Leu Gin Pro Glu Asd Phe Ala Thr Tyr 220

Tyr Pro Leu Thr Phe Glv Gly Gly Thar 235 24 O

Ala

Lisboa, 22 de Agosto de 2007

Claims (8)

1. Reivindicações 1· Uso de uma composição iaçao um : o t ; UoPpnp ou um IO! Uv t" y~ agmento se iPcpoao ac corPigê para um ou 1OB. epitopos de uma proteína de s tre s s fúngico e um agente antí-fúngico pelo menos a.m agente do t-C PiinavlP.uidft por um agente a polieno e um --ti-fúngico equinocandina ram método para o fabrico fe um medicamento para o tratamento de infecções fúngicas, ffit: que o fungo que provoca a dita infecção fúngica é resistente ao dito agente anti-fúngico por si só.
2. 2. Uso de uma composição de acorao com a reivindicação 1, caracterizado por o dito anticcrpo ser específico para uma proteína de choque térmico proveniente de um membro do género Candída ou Torulopsis.
3. 3. Uso de uma composição de acordo com a reivindicação 2, s ar acterizado por a dita proteína de choque térmico compreender hsp90 de Candída albicans. 6 Uso de uma ccmposição de acordo com qualquer uma das reivindicações ãnteriores, caracterizado por o dito anticorpo ou um seu fragmento que se liga ao antígénio ser específico para o epizopo que compreende a sequência da 5-J.3
4. 5. Use dê uma composição de acordo com a , ... OQI o dito aricttompo compreender a piSp:ttêttci.ã: de amgrdo: as a SEQ ID UU 2. um anti-fúnaicc polieno compreender anfotericina E derivado de anfotericina B.
5. 7. Uso de uma composição 3e acordo com a reivindicações anteriores, caracterizado por a dito aaente :S X ; » fO çqç IrXcmrXi 0 â 0 ίΟΟΡ 0 çç n Oti Γ Xv: i dç 1 s ϊ U n ttldt
6. 8. Uso de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a dita infecção EÚòçioa ser pelo menos uma seleccionada a partir do grupo compreendendo Mucormicose, Blastomicose, Coccidioidomicose, ou Paracoccidioidomicose, ou a dita infecção fúngica ser causada por pelo menos um organismo seleccionado a partir do grupo de organismos que compreende Candida, Cryptococcus, Hisíoplasma, Aspergillus, ou d X .1. ;d X XíiU ·:ϋ’ X :X sí
7. 9. Uso de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizade por o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio ser marcado com um marcador detectável.
8. 10. Uso de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações ou i, caracterizado por o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio estar conjugado c&m íí» molécula efectora.