CN1283798C - 凝固酶阴性葡萄球菌的多肽及多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

提供了用来预防及治疗由凝固酶阴性葡萄球菌如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)引起的感染的分离的蛋白质，称为SdrF，SdrG，和SdrH，以及它们相应的氨基酸和核酸序列。SdrF，SdrG，和SdrH蛋白质是与细胞壁相关的特异结合宿主蛋白质的蛋白质，每种含有其共有序列为TYTFTDYVD的高度保留基元。蛋白质，其抗原部分，和抗-SdrF，-SdrG，和-SdrH抗体也可用来鉴别和诊断凝固酶阴性葡萄球菌感染。具体地，由于蛋白质可用作疫苗组分或其抗体，所以它们是有价值的，它们可以给伤口服用或用来涂覆生物物质以作为阻断试剂，预防或抑制凝固酶阴性葡萄球菌与伤口或生物物质的结合。

Description

凝固酶阴性葡萄球菌的多肽及多核苷酸
本发明的领域
本发明涉及微生物学及分子生物学领域，具体地涉及预防，治疗或诊断人或动物的凝固酶阴性葡萄球菌感染的生物学制品。
本发明的背景
葡萄球菌是革兰氏阳性球状细胞，通常以葡萄状不规则簇排列。一些葡萄球菌是人类粘膜和皮肤的正常菌群成员，而其他的会引起化脓，脓肿，及多种化脓感染，甚至会引起致命的败血症。致病的葡萄球菌常常使红细胞溶解，血浆凝固并产生大量细胞外酶和毒素。最常见的食物中毒是由热稳定的葡萄球菌肠毒素引起的。葡萄球菌至少有30种。临床上很重要的三个主要品种是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Stephylococcus epidermidis)，腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)。金黄色葡萄球菌是凝固酶阳性的，这一点使它与其他品种区分开来。金黄色葡萄球菌是人类主要的致病菌。一生中几乎每个人都会经历一些种类的金黄色葡萄球菌感染，其严重程度包括食物中毒或轻度皮肤感染到严重危及生命的感染。
凝固酶阴性葡萄球菌是常见的有时引起感染的人类菌群，并常常与植入装置有关，特别在很年轻，年老及免疫系统损害的患者中。由凝固酶阴性葡萄球菌引起的感染中约75％是由表皮葡萄球菌引起的。由Staphylococcus warneri，Staphylococcushominis及其他品种引起的感染较少见。在年轻的妇女中腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)是相对常见的尿道感染病因。葡萄球菌产生过氧化酶，这一点使其与链球菌区别开来。
金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌都有在修复医疗装置部位，包括血管内导管，脑脊髓液体分流管，血液透析分流器，血管移植，及长期配戴的隐形眼镜处入侵皮肤和相邻组织的特征性倾向。在48到72小时内，在这些外源物插入部位可鉴定到相当大量的葡萄球菌[Archer，G.L.，Remington，J.S.，等人，“在传染疾病中最新临床课题”，McGraw-Hill，NY，25-46，1986)。
表皮葡萄球菌是人类皮肤上无致病力的共生生物体，是外周及中心静脉导管，修复心脏瓣膜，人造关节和其他修复装置感染的主要病因介质。已经得到论证是，表皮葡萄球菌细胞附着并在导管内或外表面增殖-与导管的组成无关-无论是它们是聚乙烯，聚氯乙烯，聚氟乙烯还是聚酯基的。
留置医疗装置的初始定位感染会引发更严重的入侵性感染如败血症，骨髓炎和心内膜炎。当微生物进入到这些装置，然后其就进入血流，通过由皮肤表面向下移动到导管的经皮部分时，导管就可认为被感染了。在涉及医疗装置的感染中，在移植后很短时间中塑料和金属表面被宿主血浆和基质蛋白质覆盖，如血纤蛋白原，玻连蛋白，纤连蛋白。表皮葡萄球菌菌血症会导致额外8天的住院，这是相当昂贵的。
尽管凝固酶阴性葡萄球菌的致病力在存在外源物时被增强了，但使得这些正常皮肤共生物变成疾病病原体的微生物因素还没有很好地被进行说明。凝固酶阴性表皮葡萄球菌附着这些蛋白质的能力是初始感染的重要因素。因为认为附着是凝固酶阴性葡萄球菌外源物感染的发病机理中重要的第一步，注意力已集中在可能调节对聚合物修复物质的附着并集落化的这些生物体的表面特性上。
有很多因素影响生物体附着修复物质的能力。这些因素包括微生物和生物物质的特性和周围环境的性质。生物体和宿主之间的初始吸引作用受到非特异力的影响，如表面电荷，极性，范德华力和疏水作用。附着作用的重要阶段包括细胞表面附着因子和固定宿主蛋白质之间的特异作用。目前，有关表皮葡萄球菌对生物物质的附着作用的研究已首先涉及了细胞外多糖或胞外被多糖，也称为粘液的作用。然而，尽管进行了集中研究，被提议的疾病的发病机理中粘液的作用或其组成仍然有争论(Drewry等人，临床微生物学28：1292-1296，1990)。目前所认为的是，在感染的持续及附着的晚期阶段中细胞外粘液起着作用。其可能作为离子交换树脂而优化局部营养环境，阻止抗生素渗入到大型集落中或保护细菌不受噬菌宿主防卫细胞的影响。Peters等人通过电子显微镜研究已发现，细胞外多糖出现在附着作用的晚期阶段，在附着作用的初始阶段并不存在(J.Infect.Dis.，65146：479-482，1982)。Hogt等人认为通过反复冲洗除去细胞外粘液层没有消除表皮葡萄球菌对生物物质的附着能力(J.Gen.Microbiol.129：2959-2968，1983)。
迄今，对细胞外多糖的研究对预防细菌的初始附着作用没有什么帮助。几种其他研究已确定了表皮葡萄球菌其他可能的附着因子，包括有Tojo等人(J.Infect.Dis.，157：317-722，1988)观察到的多糖附着因子(PS/A)和Christensen等人(Infect.Immun.，58：2906-2911，1990)发现的粘液伴随抗原(SAA)。
已论证的是PS/A是阻断PS/A附着产生表皮葡萄球菌菌株的单糖附着因子的复合混合物。在对抗PS/A的心内膜炎抗体的动物模式中是保护性的。然而，这种保护性作用是否是特异性的，是否涉及抗体的抗附作用，或是否由于血液生细菌的调理噬菌作用的效率的更广泛的增加还不清楚。已假设认为，每种附着因子在有着一种或多种决定初始吸引作用的这些附着因子的附着过程的不同阶段中起着作用，而其他的是大型集落中聚集作用必需的。
尽管进行了许多研究，对涉及表皮葡萄球菌对生物物质的初始附着作用的因素仍然没有很多了解。进一步不为人所知的是对预防感染的第一步，即附着或粘着有实际应用意义的方法。因此，需要对细菌附着因子蛋白质和编码蛋白质的基因进行发现和描述。
因此，本发明的一个目的是提供凝固酶阴性葡萄球菌的细胞壁伴随胞外基质结合蛋白质。
本发明的另一个目的是提供凝固酶阴性葡萄球菌表面蛋白，其能够抑制葡萄球菌与固定化的胞外基质的粘着或抑制植入生物物质表面存在的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供凝固酶阴性葡萄球菌疫苗，产生对凝固酶阴性葡萄球菌蛋白质的抗血清和抗体，分离凝固酶阴性葡萄球菌的抗体。
本发明的另一个目的是提供在临床和实验室设置中检测及区别凝固酶阴性葡萄球菌生物体的改进物质和方法。
本发明的另一个目的是提供针对凝固酶阴性葡萄球菌的核酸探针和特异性引物。
本发明的另一个目的是提供对凝固酶阴性葡萄球菌敏感及特异的细菌感染的检测，诊断，治疗或监测治疗进展的方法。
看过下列对公开实施方案的详细描述及所附权利要求书后，本发明的这些及其他目的，特性及优点会变得明显可见。
本发明的概述
本发明提供了从凝固酶阴性葡萄球菌分离的蛋白质和它们相应的氨基酸和核酸序列。蛋白质称为SdrF，SdrG和SdrH。SdrF的DNA序列和蛋白质SdrF的氨基酸序列(粗体)以及它们的侧翼序列在图2中给出。SdrG的DNA序列和蛋白质SdrG的氨基酸序列(粗体)以及它们的侧翼序列在图3中给出。最后，SdrH编码区域包括DNA和氨基酸序列在图4中给出。
已经发现的是，在SdrF和SdrG的A区域中有高度保留的氨基酸序列，能用来衍生共有序列TYTFTDYVD基元。该基元能用在多组分疫苗中以产生对细菌感染的广谱免疫，并且也可用来产生具有广谱被动免疫的单克隆或多克隆抗体。在一个可替换的实施方案中，从Sdr蛋白质家族中衍生出的可变序列的任何组合，(T)(Y)(T)(F)(T)(D/N)(Y)(V)(D)，可用来产生免疫性或用来诱导保护性抗体。蛋白质或其抗原部分被用来制备诊断凝固酶阴性葡萄球菌细菌感染的抗体，或用来为主动或被动免疫作用制备发展抗-凝固酶阴性葡萄球菌疫苗。当给伤口服用或在体内及体外用来覆盖聚合生物物质时，蛋白质和其抗体都可用作阻断剂，以预防或抑制凝固酶阴性葡萄球菌与伤口部位或与任何生物物质的结合。SdrF，SdrG和SdrH蛋白质可进一步用作科学研究工具，以了解细菌病理学的机理和抗细菌治疗的发展。
SdrF，SdrG和SdrH基因序列可用作核酸探针，以检测及鉴别凝固酶阴性葡萄球菌细胞表面蛋白质。核酸序列还可插入到载体中并置于微生物中以制备重组SdrF，SdrG和SdrH蛋白质。这些Sdr蛋白质的氨基酸序列在制备合成的SdrF，SdrG和SdrH蛋白质或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元中也是有用的。
本发明也提供了培养的抗SdrF，SdrG和SdrH蛋白质或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元的抗血清和抗体，和含蛋白质的疫苗或其他药物组合物。
此外，本发明也提供了含核酸分子，蛋白质，培养的抗SdrF，SdrG和SdrH或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元的抗体或抗血清的工具，以及与样品反应的适当的试剂的诊断试剂盒。
在本发明第一个实施方案中，多核苷酸包括编码含图2中所示序列的SdrF多肽的区域或其变体。
根据本发明的这个方面，提供了编码表达表皮葡萄球菌菌株9491的成熟多肽的分离核酸分子。
在本发明第二个实施方案中，多核苷酸包括编码含图3中所示序列的SdrG多肽的区域或其变体。
根据本发明的这个方面，提供了编码表达表皮葡萄球菌菌株K28的成熟多肽的分离核酸分子。
在本发明第三个实施方案中，多核苷酸包括编码含图4中所示序列的SdrH多肽的区域或其变体。
根据本发明的这个方面，提供了编码表达表皮葡萄球菌菌株9491的成熟多肽的分离核酸分子。
在本发明第四个实施方案中，有从含如图2中所示的SdrF氨基酸序列的表皮葡萄球菌获得的新型蛋白质或其变体。
在本发明第五个实施方案中，有从含如图3中所示的SdrG氨基酸序列的表皮葡萄球菌获得的新型蛋白质或其变体。
在本发明第六个实施方案中，有一种从含如图4中所示的SdrH氨基酸序列的表皮葡萄球菌获得的新型蛋白质或其变体。
根据本发明的第四，第五和第六个实施方案，提供了编码SdrF，SdrG或SdrH蛋白质，特别是表皮葡萄球菌蛋白质的分离核酸分子，包括mRNA，cDNA，基因组DNA。本发明这个方面的其他实施方案包括其在生物学，诊断学，预防学，临床学，或治疗学上有用的变体，以及包括这些变体的组合物。
在本发明第七个实施方案中，提供了本发明的多核苷酸在以治疗或预防为目的方面的应用，特别是基因免疫接种应用。
在本发明第八个实施方案中是SdrF，SdrG和SdrH多肽或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元的变体，由SdrF，SdrG或SdrH基因的自然产生的等位基因编码。
根据本发明的这个实施方案，提供了表皮葡萄球菌的新型多肽，本文称为SdrF，SdrG或SdrH或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元，以及其生物学，诊断学，预防学，临床学或治疗学上有用的变体，和含有这些变体的组合物。
在本发明第九个实施方案中，提供了制备前面提及的SdrF，SdrG或SdrH多肽或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元的方法。
在本发明第十个实施方案中，提供了抗SdrF，SdrG或SdrH多肽或多核苷酸或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元或编码这些基元核酸的抗体。
在本发明第十一个实施方案中，提供了与SdrF，SdrG或SdrH多核苷酸序列或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元杂交的多核苷酸，特别是在严谨严格条件下。
在本发明第十二个实施方案中，提供了给细胞或给多细胞生物体服用的含有SdrF，SdrG或SdrH多核苷酸或SdrF，SdrG或SdrH多肽或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元的组合物。
在本发明公开的精神和范围内的各种变化和修正对阅读下列描述及阅读本公开的其他部分的此领域中的技术人员将是明显可见的。
本发明附图的简述
图1表示表皮葡萄球菌菌株K28的SdrG蛋白质。区域沿着构建的顶部标记，所公开的蛋白质的每个区域中发现的氨基酸数目在示图中相应区域下标记。
图2是SdrF的DNA序列和SdrF蛋白质的氨基酸序列(粗体)以及它们的侧翼序列。
图3是SdrG的DNA序列和SdrG蛋白质的氨基酸序列(粗体)以及它们的侧翼序列。
图4是SdrH编码区域的DNA序列和SdrH蛋白质的氨基酸序列。
图5表示金黄色葡萄球菌的Sdr蛋白质和表皮葡萄球菌的Sdr蛋白质之间的关系。图5A是前面描述的金黄色葡萄球菌Sdr蛋白质的示意图；图5B是SdrF，SdrG和SdrH的示意图，表示它们的信号序列(S)，区域As(A)，区域B重复(Bn)，SD-重复区域(SD)，区域C(C)(只对SdrH)，和壁/膜跨越区域(WM)的相对位置和/或大小；图5C表示SdrF，SdrG和SdrH的C-端氨基酸序列，表示SD重复序列，LPXTG基元(下划线)，疏水膜-跨越区域(粗体)，和带电终端残基的位置。
图6给出了表皮葡萄球菌菌株的Sdr基因，并演示了含有与编码(A)SD-重复区域；(B)SdrH区域A；(C)SdrG区域A；(D)SdrG和SdrF区域As的DNA探针杂交的表皮葡萄球菌基因组DAN的Southern印迹。菌株如下：1道，ATCC14990；2道，KH11；3道，K28；4道，RP62a；5道，TU3298；6道，9142；7道，1457；8道，8400；9道，N910308；10道，N910160；11道，N910102；12道，N910173；13道，N910191；14道，N910231；15道，N950249；菌株9491没有演示。千碱基(kb)大小标记在A-D图面左边显示。
图7显示了重组Sdr区域A蛋白质和它们分别的抗血清的特异性，如下：(A)用来培养兔多克隆抗血清的纯蛋白质的考马斯染色SDS-PAGE。1道和2道，分别为组氨酸标记的SdrFA和SdrGA；3道，GST标记的SdrHA；(B)左图面：混合抗-SdrFA，-SdrGA和-SdrHA抗血清对表达GST-标记的SdrFA(1道)，SdrGA(2道)，SdrHA(3道)的E.coli溶胞物的反应性。中间和右图面：抗-SdrFA，和-SdrGA抗血清分别对相同蛋白质的反应性；(C)左图面：抗-组氨酸单克隆抗体对表达组氨酸-标记的SdrFA(1道)，SdrGA(2道)和全长SdrH(3道)的E.coli溶胞物的反应性。右图面：抗-SdrHA抗血清对相同蛋白质的反应性。千道尔顿(kDa)大小标记在A，B和C图面左边显示。
图8显示了表皮葡萄球菌Sdr蛋白质表达的免疫印迹分析，包括：(A)抗SdrFA抗血清对表皮葡萄球菌9491溶胞物的反应性。1道，免疫抗血清；2道，免疫前抗血清；3道，SdrFA吸收的免疫抗血清；(B)抗SdrGA免疫(1道)，免疫前(2道)，和SdrGA吸收的免疫(3道)抗血清对表皮葡萄球菌菌珠K28溶胞物的反应性；(C)抗SdrHA免疫(1道)和SdrHA吸收的免疫(2道)抗血清对表皮葡萄球菌9491溶胞物的反应性。kDa大小标记在A，B和C图面左边显示。
图9显示了表皮葡萄球菌中SdrH蛋白质大小变异的基因分析。包括：(A)抗SdrHA抗血清对不同表皮葡萄球菌菌株的在SdrH分子团中显示菌珠变异的溶胞物的反应性。1-3道：分别为菌株9491，9400，和KH11；(B)PCR产物，表示编码SdrH SD-重复区域(1-3道)或相同菌珠区域Cs(4-6道)的DNA。kDa和kb大小标记分别在A和B图面显示。
图10显示了在细胞壁提取物和原生质体中对Sdr蛋白质的分析，包括：(A)抗-SdrFA抗血清对表皮葡萄球菌菌株9491溶胞物(1道)，细胞壁提取物(2道)，和纯原生质体(3道)的反应性；(B)和(C)分别是抗-SdrGA和-SdrHA抗血清对相同样品的反应性。kDa大小标记分别在A，B和C的左图面显示。
图11显示了从表皮葡萄球菌感染中逐渐康复的患者获取的IgG对涂覆在ELISA微量滴定板中的重组SdrFA(空白柱)，SdrGA(灰色柱)和SdrHA(黑色柱)的反应性。从两岁大儿童获取的混合IgG用作对照物。误差柱表示标准偏差。
本发明的详细描述
本文描述了分离的Sdr蛋白质和它们相应的氨基酸和核酸序列。蛋白质称为SdrF，SdrG和SdrH。SdrF的DNA序列和蛋白质SdrF的氨基酸序列(粗体)以及它们的侧翼序列在图2中演示。SdrG的DNA序列和蛋白质SdrG的氨基酸序列(粗体)以及它们的侧翼序列在图3中演示。最后，SdrH编码区域包括DNA和氨基酸序列在图4中演示。
SdrF，SdrG和SdrH蛋白质在初级序列和结构组织方面与从金黄色葡萄球菌获取的胞外基质-结合Sdr蛋白质家族有关，并位于细胞表面。SdrF，SdrG和SdrH蛋白质是与细胞壁相关的蛋白质，带有在N端的信号序列和LPXTG基元，疏水域和C端的正电荷残基。每种还有SD重复区，其包括使配体结合域区域A在细胞表面有效表达的足够长的R区域。由于SdrF，SdrG和SdrH蛋白质的A区域位于细胞表面，蛋白质可与血浆，细胞外基质或与宿主细胞的表面分子相互作用。如，SdrG结合血纤蛋白原N端的一半β链。
公开的细胞外基质结合蛋白质共有独特的二肽重复区域(区域R)，主要包括天冬氨酸和丝氨酸残基。这种DS重复区域由18个带有共有序列GAY TCN GAY TCN GAY AGY的核苷酸重复单元编码，TCN作为第一个和第二个丝氨酸密码子，AGY作为第三个丝氨酸密码子。R区域邻近蛋白质的C端，通常含有40到300个DS残基，或更具体地，含多于60，80，100，120，150，200或250个重复单元，其中大于90，95或98％的重复单元是氨基酸D或S。R区域DS重复单元的长度随着蛋白质的不同而变化，而且虽然区域R本身不结合细胞外基质蛋白质，但R区域能使蛋白质结合区域在金黄色葡萄球菌的细胞表面存在。这样，编码DS重复单元的共有序列DNA的探针(参阅上述)能用来鉴别其他编码不同结合蛋白质的基因，特别是使金黄色葡萄球菌附着宿主组织的结合蛋白质。R区域的抗体也可用来鉴别其他这样的结合蛋白质。
已经发现的是，在SdrF和SdrG的A区域中有高度保留的氨基酸序列，能用来衍生共有序列TYTFTDYVD基元。该基元能用在多组分疫苗中获得对细菌感染的广谱免疫性，并且也可用来产生广谱被动免疫的单克隆或多克隆的抗体。在一个可替换的实施方案中，从Sdr蛋白质家族中衍生出的可变序列的任何组合，(T)(Y)(T)(F)(T)(D/N)(Y)(V)(D)，可用来产生免疫性或用来诱导保护性抗体。
还发现，SdrG有一个编码有913个氨基酸残基的蛋白质的2736个核苷酸的开放读框。蛋白质有一个30个氨基酸的信号序列，542个氨基酸的配体结合A区域，和两个重复基元称为B区域。B1有113个氨基酸，B2有110个氨基酸，R区域有77个氨基酸。B区域含有表示Ca++结合的EF手基元，与在其他Ca++结合蛋白质如调钙蛋白和中肌钙蛋白中发现的相似。另一个更退化形式的EF手基元在SdrG的A区域中残基459-471之间发现。在EDTA存在的情况下，可注意到SdrG A与血纤蛋白原的结合显著减少，这说明结合对金属离子有依赖。
I.定义
本文定义的“SdrF蛋白质”，“SdrG蛋白质”和“SdrH蛋白质”包括SdrF，SdrG和SdrH亚域和SdrF，SdrG和SdrH的活性或抗原片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元。
本文所使用的“pg”是微微克，“ng”是毫微克，“ug”或“μg”是微克，“mg”是毫克，“ul”或“μl”是微升，“ml”是毫升，“l”是升。
本文所定义的SdrF，SdrG和SdrH蛋白质的“活性片段”，是能阻断凝固酶阴性葡萄球菌与固定或可溶宿主蛋白质结合的肽或多肽。
本文所使用的“附着因子”包括自然产生及合成的或重组蛋白质及肽，它们能与细胞外基质蛋白质结合和/或调节与宿主细胞的附着。
本文所使用的“氨基酸”包括自然产生及合成的氨基酸，包括但不限于丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸，蛋氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺酸，谷氨酸，天冬氨酸，赖氨酸，精氨酸和组氨酸。
“抗体”是任何与特异抗原表位结合的免疫球蛋白，包括其抗体和片段。本文所使用的该术语包括单克隆抗体，多克隆的，嵌合的，单链的，双特异性的，猴类的和人类的抗体以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产品。
本文所使用的各种表达方式的“抗体分子”包括完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。
本文所定义的SdrF，SdrG和SdrH蛋白质的“抗原片段”是能产生免疫反应的肽或多肽。
本文所使用的“抗体功能等同物”蛋白质或肽是掺合一个与一个或多个公开的具体蛋白质的抗原表位免疫交叉反应的抗原表位的蛋白质或肽。抗原功能等同物，或抗原表位序列可被首先设计或预定然后检测，或可简单地直接进行交叉反应性检测。
“细胞种系”是能在体外稳定生长许多代的无性繁殖系原代细胞。
“无性繁殖系”是通过有丝分裂从单细胞或普通祖细胞衍生的细胞群。
DNA“编码序列”是双链DNA序列，当置于适当的调节序列的控制下时，其在体内可转录及翻译多肽。序列的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的的翻译终止密码子确定。编码序列包括但不限于原核序列，从真核MRNA获取的cDNA，从真核(如哺乳动物)DNA获取的遗传DNA序列，和合成DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’端。
“DNA分子”是指单链形式或双链螺旋状的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶)的聚合物形式。这个术语仅指分子的一级基二级结构，不限于任何具体的三级结构。这样，此术语包括发现的双链DNA分子，特别是线性DNA分子(如限制性片段)，病毒，质粒，和染色体中发现的双链DNA分子。讨论具体双链DNA分子结构时，本文按照常用惯例描述序列，仅以5’到3’方向沿着DNA的非转录链(即含有与mRNA同源的序列的链)给出序列。
转录和翻译控制序列是“DNA调节序列”，如启动子，增强子，聚腺苷酸化信号，终止子等等，提供在宿主细胞中编码序列的表达。
“表达控制序列”是控制及调节另一个DNA序列转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录到mRNA中时，编码序列是在细胞中转录及翻译控制序列的控制下的，然后编码序列被翻译成有编码序列编码的蛋白质。
本文所使用的“细胞外基质蛋白质”，或ECM，是指大型分子的四个常见家族，胶原质，糖蛋白，蛋白多糖，弹性蛋白，包括纤连蛋白，血纤蛋白原，提供支持及调节分子行为。
本文所使用的“宿主细胞”是已被转化或转染的细胞，或能被外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。
“一致性”，如在此领域中已知的，是两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系，如通过对比序列确定的关系。在此领域中，“一致性”也指多肽或多核苷酸之间的序列相关程度，如情况可能，是通过这些序列之间的匹配确定。
“一致性”和“相似性”可通过已知的方法(计算分子生物学，Lesk，A.M.，编辑，牛津大学出版社，纽约，1988；生物学计算：信息学及基因组测序计划，Smith，D.W.，编辑，学术出版社，纽约，1993)方便地计算。虽然有很多计算两个序列间的一致性和相似性的方法，这两个术语对本领域技术人员是众所周知的。通常用来确定序列间一致性或相似性的方法包括但不限于在Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)中所公开的。确定一致性的较好的方法设计给出测试序列间的最大匹配。确定一致性和相似性的方法可编成公众可购到的计算机程序。确定两个序列间一致性和相似性的较好的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等人，核酸研究12(1)：387，1984)，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Atschul等人，J.分子生物学，215：403-410，1990)。BLASTX程序是公众可从NCBI和其他途径(BLAST手册，Altschul等人，NCBI NLM NIH Bethesda，Md，20894；Altschul等人，J.分子生物学，215：430-410，1990)购到的程序。
“免疫有效量”意指肽组合物的量能在受体动物中产生免疫反应。这包括产生抗体反应(B细胞反应)，和/或刺激细胞毒素免疫反应(T细胞反应)。产生这样的免疫反应即能用来制备有用的生物试剂如CTL，更具体地是使用在诊断实施方案中的活性抗体，也能用在多种预防或治疗实施方案中。
本文所使用的“体内疫苗”是指用蛋白质给动物免疫以产生保护以后不受病原体的影响的体液和细胞反应。
本文所定义的“分离的”是指从至少一些和其一起自然产生的组分中分离出来。本文所使用的“分离的”还指“通过人的手”从其自然状态中改变，即，如果它产生在自然界中，它已被从其原生环境中改变或移出，或改变和移出。如，自然存在于有生命的生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但从其自然状态共存物质中分离出的相同的多核苷酸或多肽是“分离的”，如本文所使用的这个术语。
本文所使用的“配体”包括分子，包括在宿主组织内的致病细菌附着的分子。
本文所使用的各种表达形式的“单克隆抗体”是指仅含一种能与具体抗原免疫反应的抗体结合位点的抗体。
本文所使用的“寡核苷酸”是指包括有两个或多个核苷酸，较好的是多于三个核苷酸的分子。其精确大小取决于很多因素，这些因素进而叉取决于寡核苷酸的最终作用和应用。
如本文所使用的“药物可接受的”是指当给人类服用时，分子实体和组合物是生理学上可忍受的，并且通常不产生不可接受的过敏或类似不好的反应。
“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可能是未经修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”没有限制地包括单链或双链DNA，单链和双链区域混合物，或单链、双链及三链区域混合物DNA，单链和双链RNA，和单链和双链区域混合物RNA，含有可能是单链或，更常见的，双链，或三链，或单链和双链区域混合物的DNA和RNA的杂交分子。此外，本文所使用的“多核苷酸”是指含有RNA或DNA、或RNA和DNA的三链区域。这种区域中的链可以来自相同分子或来自不同分子。区域可包括所有一个或多个分子，但更常见的是包括一些分子的仅一个区域。三链-螺旋区域分子中的一个常常是寡核苷酸。如本文所使用的，“多核苷酸”包括上面描述的含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。这样，带有为稳定性或为其他原因修饰的主链的DNA或RNA是本文所描述的“多核苷酸”。并且，包含不常见碱基如次黄嘌呤核苷，或修饰的碱基如三苯甲基化碱基(仅是指出的两个实施例)的DNA或RNA也是本文所定义的多核苷酸。应该理解的是，许多为多种有用目的对DNA和RNA作出的修饰对本领域技术人员是已知的。本文所使用的“多核苷酸”也包括多核苷酸这种化学上的，酶催化的或代谢的修饰形式，以及有病毒和细胞特点的DNA和RNA的化学形式，包括如简单细胞及复合细胞。“多核苷酸”还包括常常称为寡核苷酸的短的多核苷酸。
“多肽”是指含有两个或多个通过肽键或修饰的肽键彼此连接的氨基酸。“多肽”即指短链，常常称为肽、寡肽和寡聚体，而长链常常称为蛋白质。多肽可以包括除了20个遗传编码氨基酸以外的氨基酸。“多肽”还包括通过自然过程修饰的多肽，如加工及其他翻译后修饰，也包括通过本领域已知的化学修饰技术修饰的多肽。这样的修饰过程在基础课本中，在更详细的专论中以及在多数研究著作中作了详细的描述。应该理解的是，同样类型的修饰能以相同或不同程度存在于给定的多肽中的不同位点。同样，给定的多肽可含有多种修饰。修饰可发生在多肽的任何部位，包括肽的主链，氨基酸侧链及氨基酸或羧基端。修饰包括乙酰基化作用，酰基化作用，ADP-核糖基化作用，酰胺化作用，四羟酮醇的共价附着作用，亚铁血红素组成的共价附着作用，核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着作用，脂质或脂质衍生物的共价附着作用，磷脂酰肌醇的共价附着作用，交联作用，环化作用，二硫化物键形成，脱甲基作用，共价交联形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，公式化，γ-羧酸化作用，糖基化作用，GPI-锚形成，羟基化作用，碘化作用，甲基化作用，豆蔻酰化作用，氧化作用，蛋白水解过程，磷酸化作用，异戊二烯化作用，外消旋化作用，糖基化作用，脂质附着作用，用硫酸处理，谷氨酸残基的γ-羧酸化作用，羟基化作用和ADP-核糖基化作用，硒化作用，用硫酸处理，氨基酸与蛋白质的转运RNA调节加成作用如精氨酰化作用，遍在蛋白化作用。参阅，如Seifter等人的Meth.Emzymol.182：624-646，1990和Rattan等人的Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992。多肽可以是支链的或环状的，有或没有支链。环状，支链及支链环状多肽可从翻译后自然过程得到，也可完全通过合成方法制备。
本文使用的“引物”是指寡核苷酸，不论是以纯的限制性酶切消化形式自然产生的或合成制备的，当其置于引物延伸产物的合成被诱导的条件下时，即在存在核苷酸和诱导试剂如DNA聚合酶，及适当的温度和PH条件下，其能作为合成启动的点，其中引物延伸产物是核酸链的互补。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长以在存在诱导试剂的条件下引导所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度，引物来源和使用的方法。如对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多个核苷酸，尽管其可能含有较少的核苷酸。
本文的引物的选取要充分地与不同链的具体靶DNA序列互补。这意味着引物必须是充分地互补以与其各自的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板确切的序列。如非互补核苷酸片段可能附着在引物的5’端，引物序列的剩余部分与链互补。或者，非互补碱基或较长序列可以散布到引物中，只要引物序列同与其杂交的链的序列有充分的互补性，并从而形成延伸产物的合成用模板。
“启动子序列”是DNA调节区域，能在细胞内结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列的转录。为了定义本发明，启动子序列以其3’端转录起始位点为界，向上游(5’方向)延伸，包括在背景以上可检测到的水平上启动转录所需的最小量的碱基或元素。在启动子序列内可发现转录启动位点(可用核酸酶S1制图来方便地定义)，以及具有结合RNA聚合酶功能的蛋白质结合域(共有序列)。真核启动子常常，但不总是，含有“TATA”框和“CAT”框。原核启动子除了含有-10和-35共有序列外还有Shine-Dalgarno序列。
“复制子”是遗传元素(如质粒，染色体，病毒)，用作体内DNA复制的自主单元，即能在其自身控制下复制。
本文所使用的“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”是指细菌酶，每种酶在或邻近特异回文核苷酸序列上切断双链DNA。
“信号序列”可包括在编码序列前。这个序列编码信号肽，多肽的N-端，其给宿主细胞传达信息以指导多肽到细胞表面或将其分泌到介质中。在蛋白质离开细胞前，这种信号肽被宿主细胞剪去。这种信号序列被发现常与真核细胞和原核细胞自身的多种蛋白质有关。
当外源或同源DNA被引入到细胞中时，细胞已被外源或同源DNA“转化”。转化DNA可以被或不被整合(共价结合)到组成细胞基因组的染色体DNA中。例如，在原核细胞、酵母、和哺乳动物细胞中，转化DNA可以保持在附加型元素上如质粒上。对于真核细胞，稳定转化的细胞是其中转化DNA已经整合到染色体中的细胞，这样其通过染色体复制而被其子代细胞继承。这种稳定性由真核细胞建立由含转化DNA的子代细胞群组成的细胞种系或集落的能力来说明。
本文所使用的“变体”是多核苷酸或多肽，与参比多核苷酸或多肽不同，但保持有重要的特性。多核苷酸的典型变体在核苷酸序列上与别的多核苷酸，参比多核苷酸不同。变体核苷酸序列上的变化可能有或没有改变由参比多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可能导致在由参比序列编码的多肽中氨基酸的取代、加成、缺失、融合或截断，如下所述。多肽的典型变体在氨基酸序列上与别的，参比多肽不同。通常，区别是有限的，这样参比多肽和变体的序列总体是很接近的，在很多区域是一致的。变体和参比多肽可能在氨基酸序列的任何组合形式的一个或多个取代、加成或缺失上不同。取代的或插入的氨基酸残基可能是或不是由遗传密码编码的氨基酸。多核苷酸或多肽的变体可以是自然发生的如等位基因变体，或它可能是自然发生的变体内所不了解的变体。多核苷酸和多肽的非自然发生变体可由诱变技术，通过直接合成，及通过本领域技术人员已知的重组方法制成。
“载体”是另一个DNA片段可附着的以促使附着片段复制的复制子，如质粒，噬菌体或粘粒。
II.核酸和氨基酸序列
编码SdrF，SdrG和SdrH(分别在图2-4中给出)或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元的核酸序列，可用来制备重组蛋白质或用在有高度敏感性和特异性的样品或试验物中作为检测凝固酶阴性葡萄球菌蛋白质的核酸探针。探针可用来检测样品中凝固酶阴性葡萄球菌的存在，诊断疾病的感染，确定样品中凝固酶阴性葡萄球菌的量，或监测用来治疗感染的治疗过程的进展。核酸和氨基酸序列也可用作实验室研究工具以研究生物体和监测疾病或发展对疾病的治疗。
本领域的技术人员应该理解的是，SdrF，SdrG或SdrH蛋白质也可由与序列清单中提供的核酸序列基本上相同的序列编码。当约70％或更多的(较好的至少约为80％，最好至少约为90或95％)核苷酸在DNA序列限定长度上匹配时，两个DNA序列基本上相同。基本上相同的序列可通过比对序列确定，使用序列数据库的标准软件，或在如具体系统所限定的严紧条件下Southern杂交试验中确定。限定适当的杂条件在此领域的技术范围内，参看如Maniatis等人的 分子克隆：实验室手册，1982；DNA克隆，I&II卷，supra； 核酸杂交，[B.D.Hames & S.J.Higgins编辑，(1985)]。“基本上相似的”还指由于遗传密码的简并，DNA序列与在图2-4中所示的任何序列不同，但其仍然编码相同的氨基酸序列；或者，由于一个氨基酸被相似的氨基酸替代，或由于改变(不论其是取代，加成，缺失还是插入)没有影响蛋白质的活性位点，DNA序列编码不同的但保持蛋白质活性的氨基酸序列。当约70％或更多的(较好的至少约为80％，最好至少约为90或95％)氨基酸在序列限定长度上匹配时，两个氨基酸序列或两个核酸序列是“基本上相似的”。
在本发明的肽和编码肽的DNA片段的结构中可进行修饰或改变并可获得编码具有所需特性的蛋白质或肽的功能分子。下面是根据改变蛋白质的氨基酸而产生等同物，或甚至产生改进的第二代分子的讨论。依据表1，氨基酸的改变可通过改变DNA序列的密码子获得。本领域技术人员应理解的是，表1中的说明的密码子是RNA序列的。相应的DNA密码子将以T替换U。为与标准术语统一(J.Biol.Chem.，243：3552-3559，1996)。氨基酸残基的缩写也在表1中列出。
                    表1
 氨基酸   密码子
 丙氨酸    Ala半胱氨酸  Cys天冬氨酸  Asp谷氨酸    Glu苯基丙氨酸Phe甘氨酸    Gly组氨酸    His异亮氨酸  Ile赖氨酸    Lye亮氨酸    Leu蛋氨酸    Met天冬酰胺  Asn脯氨酸    Pro谷氨酰胺  Gln精氨酸    Arg丝氨酸    Ser苏氨酸    Thr缬氨酸    Val色氨酸    Trp酪氨酸    Tyr   A GCA GC  GCG GCUC UGC UGUD GAC GAU GAC GAUE GAA GAGF UUC UUUG GGA GCG GGG GGUH CAC CAUI AUA AUC AUUK AAA AAGL UUA UUG CUA CUC GUG GUUM AUGN AAC AAUP CCA CCC CCG CCUQ CAA CAGR AGA AGG CGA CGC CGG CGUS AGC AGU UCA UCC UCG UCUT ACA ACC ACG ACUV GUA GUC GUG GUUW UGGY UAC UAU
例如，在与结构如抗体的抗原结合区域或底物分子上的结合位点的相互作用的结合能力没有可感知的损失的情况下，在蛋白质结构中某些氨基酸可以被其他氨基酸取代。因为正是蛋白质性质和相互作用能力定义着蛋白质生物功能活性，所以某些氨基酸序列取代可在蛋白质序列中进行，当然也可在其根本的DNA编码序列中进行，并且仍然获得具有相同性质的蛋白质。这样，发明者考虑认为，在公开组合物的肽序列中，或在编码所说的肽的相应的DNA序列中，可进行多种改变，并且不发生其生物活性或用途的可感知的损失。
在进行这些改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。在探察蛋白质的相互作用生物功能中氨基酸亲水指数的重要性方面，本领域已经有了广泛的理解(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157(1)：105-132，1982，通过在此引证而合并于本文)。已经接受的是，氨基酸相对的亲水特征与结果蛋白质的二级结构有关，其进一步限定蛋白质与其他分子的相互作用，如酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原，等等。根据其疏水性和电荷特性，每种氨基酸都赋值了亲水指数(Kyte和Doolittle，supra，1982)，具体有：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯基丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域中已知的是，某些氨基酸可被其他具有相似亲水指数或评定值的氨基酸取代，并仍产生具有相似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等同物蛋白质。在进行这样的改变时，其亲水指数在±2内的氨基酸的取代是较好的，其亲水指数在±1内的氨基酸的取代是更好的，其亲水指数在±0.5内的氨基酸的取代是最好的。在本领域中还应该理解的是，相似氨基酸的取代可依据亲水性而有效地进行。美国专利4,554,101中说明了蛋白质的最大局部平均亲水性指数，取决于其邻近的氨基酸的亲水性指数，与蛋白质的生物特性有关，该专利通过在此引述而合并于本文。
如在美国专利4,554,101中所描述的，下列氨基酸残基赋值了亲水性指数：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+1.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。还应该理解的是，氨基酸可被另一个具有相似亲水性指数的氨基酸取代，并仍获得生物等同物，具体地是免疫等同物蛋白质。在进行这样的改变时，其亲水性指数在±2内的氨基酸的取代是较好的，其亲水性指数在±1内的氨基酸的取代是特别推荐的，其亲水性指数在±0.5内的氨基酸的取代是更好的。
如上面所列出的，因此，氨基酸取代通常是根据氨基酸侧链取代基的相对相似性，如，它们的疏水性，亲水性，电荷，大小，等等。考虑了多种前述特性的示范取代对本领域技术人员是众所周知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。
本发明的多肽可通过化学合成。合成的多肽可使用已熟知的固相，液相技术，或肽缩合技术，或它们的任何组合来制备，合成多肽可包括自然的或非自然的氨基酸。用来合成肽的氨基酸可以是标准Boc(Na-氨基保护的Na-叔-丁氧基羰基)氨基酸树脂，使用Merrifield(J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154，1963)的固相技术的标准脱保护，中和，偶联和冲洗方案，或由Carpino和Han(J.Org.Chem.，37：3403-3409，1972)首先描述的碱基-易发生变化的Na-氨基保护的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc Na-氨基保护的氨基酸都可从Fluka，Bachem，Advanced Chemtech，Sigma，Cambridge ResearchBiochemical，Bachem，或Peninsula Labs或其他从事本领域的人所熟悉的化学公司获得。此外，本发明的方法可与其他本领域技术人员熟悉的Na-氨基保护基团一起使用。固相肽合成可使用本领域中技术人员熟悉的技术实施，如在Stewart和Young的《固相合成》中提供的，第二版，Pierce化学公司，Rochford，IL，1984；和Field和Noble 1990年Int.J.Pept.Protein Res.35：161-214中提供的，或使用自动合成器，如ABS所售的。这样，本发明的多肽可含有D-氨基酸，D-和L-氨基酸的组合，和多种“设计者”氨基酸(如β-甲基氨基酸，Cα-甲基氨基酸，和Nα-甲基氨基酸)以转达具体属性。合成氨基酸包括鸟氨酸合成赖氨酸，氟代苯基丙氨酸合成苯基丙氨酸，正亮氨酸合成亮氨酸或异亮氨酸。此外，在特殊偶联步骤排布特殊氨基酸，可制备α-螺旋，β-转角，β-折叠，γ-转角，及环状肽。
在另一个实施方案中，选取了提供有用的化学和结构属性的肽的亚基。如含D-氨基酸的肽在体内会对L-氨基酸-特异蛋白酶有抗性。此外，本发明预想制备具有更好的限定结构属性的肽，使用肽模拟学和肽模拟键，如酯键，制备具有新型属性的肽。在另一个实施方案中，可制备掺入了还原的肽键即R1-CH2-NH-R2的肽，其中R1和R2是氨基酸残基或序列。还原的肽键可作为二肽亚基引入。这样的分子会对肽键水解如蛋白酶活性有抗性。这样的肽会提供具有独特功能和活性的配体，如由于对代谢衰弱或蛋白酶活性的抗性而在体内延长半衰期。并且，众所周知的是，在某些系统中约束肽表现出增强的功能活性(Hruby，生命科学，31：189-199，1982；Hruby等人，Biochem.J.，268：249-262，1990)。
下列非典型氨基酸可掺入到肽中以引入特殊的构象基元：1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸酯(Kazmierski等人，J.Am.Chem.Soc.，113：2275-2283，1991)；(2S，3S)-甲基-苯基丙氨酸，(2S，3R)-甲基-苯基-丙氨酸，(2R，3S)-甲基-苯基丙氨酸和(2R，3R)-甲基-苯基丙氨酸(Kazmierski和Hruby，Tetrahedron Lett.，1991)；2-氨基四氢萘-2-羧酸(Landis，Ph.D.Thesis，亚利桑那大学，1989)；羟基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸酯(Miyake等人，J.Takeda Res.Labs.，43：53-76，1989)；β-咔啉(D和L)(Kazmierski，Ph.D.Thesis，亚利桑那大学，1988)；HIC(组氨酸异喹啉羧酸)(Zechel等人，Int.J.Pep.Protein Res.，43，1991)；和HIC(组氨酸环脲)(Dharanipragada)。
下列氨基酸类似物和肽模拟物可掺入到肽中以诱导或促成特异二级结构：LL-Acp(LL-3-氨基-2-propenidone-6-羧酸)，β-转角诱导二肽类似物(Kemp等人，J.Org.Chem.，50：5834-5838，1985)，β-折叠诱导类似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.，29：5081-5082，1988)；β-转角诱导类似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.，29：5057-5060，1988)；α-螺旋诱导类似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.，29：4935-4938，1988)；γ-转角诱导类似物(Kemp等人，J.Org.Chem.，54：109-115，1989)；由下列参考文献提供的类似物：Nagai和Sato，Tetrahedron Lett.，26：647-650(1985)；DiMaio等人，J.Chem.Soc.Perkin.Trans.，p.1687(1989)；以及Gly-Ala转角类似物(Kahn等人，Tetrahedron Lett.，30：2317，1989)；酰胺键等排体(Jones等人，Tetrahedron Lett.，29：3853-3856，1989)；四氮杂茂(Zabrocki等人，J.Am.Chem.Soc.，110：5875-5880，1988)；DTC(Samanen等人，Int.J.Protein Pep.Res.，35：501：509，1990)；和在Olson等人(J.Am.Chem.Sci.，112：323-333，1990)和Garvey等人(J.Org.Chem.，56：436，1990)中公开的类似物。β-转角和β-凸起，和含它们的肽的构象限制模拟物在1995年8月8日授予Kahn的美国专利No.5,440,013中公开。
本文还提供了凝固酶阴性葡萄球菌细菌如本文所描述的表皮葡萄球菌的与编码血纤蛋白原-结合蛋白质或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元的核酸分子选择性杂交的核酸分子序列，或它们的互补序列。“选择性”或“选择地”是指不与其他核酸杂交的序列。这样促进了SdrF，SdrG或SdrH的特异检测。因此，在设计杂交核酸时，选择性将取决于存在于样品中的其他组成。杂交核酸应与和其杂交的核酸片段有至少70％的互补性。如本文用来描述核酸的术语“选择地杂交”不包括偶然随机地杂交核酸，因此，与“特异杂交”含有相同的意义。本发明的选择性杂交核酸与和其杂交的序列片段可有至少70％，80％，85％，90％，95％，97％，98％和99％的互补性。
本发明考虑到了选择性地与本文具体提供的编码DNA或DNA的互补链，或相对应链杂交的序列，探针和引物。只要功能种类-特异杂交能力保持，与核酸的特异杂交可与核酸内小的修饰或取代-起发生。“探针”是在为了检测或扩增互补序列进行的与互补活性序列选择性杂交中能用作探针或引物的核酸序列，其探针长度可从约5个核苷酸到100个核苷酸变化，或较好地从约10个到50个核苷酸变化，或更好地从约18到24个核苷酸变化。因此，本文所使用的“探针”或“探针们”包括“引物”。本文提供了分离的核酸，其与种类-特异核酸在严紧条件下选择性杂交，并且应含有至少5个核苷酸与有兴趣的序列互补，如Sambrook等人在 分子克隆：实验室手册中所描述的，1989第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约。
如果用作引物，组合物较好地包括至少两个与靶分子的不同区域杂交的核酸分子以扩增所需区域。根据探针或引物的长度，靶区域范围可以在70％互补碱基到全部碱基互补之间并仍在严格条件下杂交。如为了诊断存在表皮葡萄球菌，杂交核酸(探针或引物)和与杂交核酸杂交的序列(如从样品获取的凝固酶阴性葡萄球菌DNA)之间的互补性程度至少应足以将核酸的杂交从其他细菌中区别开来。
编码SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其部分，如共同序列或可变序列氨基酸基元的核酸序列可插入到载体中，如质粒，或重组表达在有生命的生物体中以制备重组SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其片段。例如，制备重组SdrF，SdrG和SdrH的DNA分子已依据本发明在质粒中制备。
重组蛋白质可用本领域技术人员已知的方法制备。克隆载体，如质粒或噬菌体DNA用限制性酶切开，将编码SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其片段，如共同序列或可变序列氨基酸基元插入到切口部位并连接。然后将克隆载体插入到宿主中以制备由SdrF，SdrG或SdrH编码DNA编码的蛋白质或其片段。适当的宿主包括细菌宿主如大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，酵母及其他细胞培养物。可使用已知的分子生物学技术实施及增强基因产品的制备和提纯。
III.Sdr核酸的应用
本文提供了使用本文所描述的核酸检测及鉴别存在凝固酶阴性葡萄球菌的方法。这些方法可用于诊断凝固酶阴性葡萄球菌感染和其他相关疾病如与导管相关的感染，与生物物质相关的感染，上呼吸道感染(如耳炎，气管炎，会厌炎，甲状腺炎，)，下呼吸道感染(如肺气肿，肺脓肿)心脏感染(如感染性心内膜炎)，胃肠感染(如分泌器官痢疾，脾脓肿，腹膜后脓肿)，中枢神经系统感染(如脑脓肿)，眼睛感染(如眼睑炎，结膜炎，角膜炎，内眼炎，preseptal及眼窝蜂窝织炎，darcryocystitis)，肾及尿道感染(如附睾炎，肾内和肾周脓肿，毒性休克症)，皮肤感染(如脓包病，毛囊炎，皮肤脓肿，蜂窝织炎，伤口感染，细菌肌炎)，骨及关节感染(如脓毒性关节炎，骨髓炎)，牛乳腺炎，犬齿脓皮病。
该方法包括获取可能含有凝固酶阴性葡萄球菌样品步骤。样品可从个体中获取，如从个体的血液，唾液，组织，骨，肌肉，软骨，或皮肤中获取。然后可将细胞裂解，提取，沉淀并扩增DNA。从凝固酶阴性葡萄球菌中检测DNA可通过将扩增的DNA与探针杂交来实施，凝固酶阴性葡萄球菌探针选择性地与DNA杂交，如在本发明的详细描述部分中所描述的。杂交检测指示存在凝固酶阴性葡萄球菌。
较好地，使用可检测的组成促进核酸(如探针或引物)杂交检测。如探针可用生物素标记并使用在链霉抗生物素蛋白涂覆的微量滴定板测试中。其他可检测的组成包括放射性标记，酶标记，和荧光标记。
DNA可直接进行检测，或可在分析前使用聚合酶链反应(PCR)或其他扩增技术进行酶促扩增。RNA或cDNA可进行相似的检测。SdrF，SdrG或SdrH表达的增加或减少可使用任何本领域中众所周知的定量核酸分子的技术测定，如扩增，PCR，RT-PCR，RN酶保护，Northern印迹，及其他杂交技术。
对SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元，或抗-SdrF，SdrG或SdrH抗体的诊断检测也可用来测定表皮葡萄球菌感染的存在。在样品中鉴别蛋白质或抗体含量的检测技术对本领域技术人员是已知的，包括方法如放射免疫测定，Western印迹分析及ELISA测定。
IV.Sdr蛋白质或抗体的应用
分离的，重组的或合成的蛋白质，或其抗原部分(包括带有抗原表位片段)，或其融合蛋白质可给动物服用作为免疫原或抗原，单独服用或与辅剂组合服用，以制备与SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元反应的抗体。此外，蛋白质可用来筛查从中可获取对蛋白质有很高亲和力的特异抗体的超免疫患者的抗体或抗血清。
可用来传递被动免疫的SdrF，SdrG或SdrH或其片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元的抗体可用来预防凝固酶阴性葡萄球菌感染，用来治疗正在进行的感染或用来作为研究工具。本文所使用的“抗体”包括包括单克隆，多克隆，嵌合的，单链的，双特异性的，猴类的和人类的抗体以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产品。制备任何这些类型抗体或抗体片段对本领域技术人员是已知的。
单克隆抗体可通过本领域技术人员熟知的方法制备。较好的方法是Kearney等人J.Immunol.123：1548-1558(1979)的方法的修订版，该文献通过在此引述而合并于本文。简单地讲，将动物如鼠或兔子用在辅剂中的免疫原接种，收获脾细胞并与骨髓瘤细胞种系混合，如P3X63Ag8,653。通过加入聚乙烯乙二醇诱导细胞融合。通过将细胞铺排在含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的选择性培养基中以化学方法选择杂种细胞。随后对杂种细胞进行制备抗-SdrF，SdrG或SdrH单克隆抗体能力的筛查。将制备抗体的杂种细胞克隆，扩展及冷冻保存作将来制备使用。
制备单链抗体的技术是本领域技术人员熟知的，在美国专利No.4,946,778中作了描述，可用来制备本文所描述的蛋白质的单链抗体。噬菌体展示技术可用来从进行SdrF，SdrG或SdrH或原初文库抗体筛查的人的淋巴细胞的PCR扩增基因中，选择对SdrF，SdrG或SdrH，或其抗原部分如共有序列或可变序列氨基酸基元具有结合活性的抗体基因。双特异抗体含有两个抗原结合域，其中每个域对着不同的抗原表位。
任何上述抗体都可用在鉴别及定量凝固酶阴性葡萄球菌中可检测的标记直接标记。在免疫测定中使用的标记对本领域技术人员是已知的，通常包括酶，放射性同位素，荧光物质，发光酶和显色物质，包括着色颗粒如胶体金或乳胶珠。适当的免疫测定法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
或者，抗体可通过与对免疫球蛋白有亲和力的标记物质反应间接标记。抗体可与第二物质缀合，用标记的对与抗体缀合的第二物质有亲和力的第三物质检测。如，抗体可与生物素缀合，然后使用标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白检测抗体-生物素缀合物。同样地，抗体可以与半抗原缀合，然后使用标记的抗-半抗原抗体检测抗体-半抗原缀合物。标记抗体和测定缀合物的这些和其他方法对本领域中的技术人员是众所周知的。
细胞外基质-结合蛋白质SdrF，SdrG或SdrH或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元的抗体，也可用在生产设施或实验室中以分离附加量的蛋白质，如通过亲和层析。如，血纤蛋白原-结合蛋白质SdrG的抗体可用来分离附加量的血纤蛋白原。
蛋白质，或其活性片段，及蛋白质的抗体可用在凝固酶阴性葡萄球菌细菌感染的治疗和诊断中，如上面描述的有关诊断方法，或用来发展主动或被动免疫的抗-凝固酶阴性葡萄球菌疫苗。并且，当在体内或体外作为药物组合物给伤口服用户用来覆盖医疗设备或聚合生物物质时，蛋白质和抗体都用作阻断剂，与预防或抑制凝固酶阴性葡萄球菌与伤口或生物物质的结合。较好地，抗体是修饰的，这样在服用抗体的患者体内其具有较小的免疫原性。如果患者是人，抗体可通过将杂种细胞衍生的抗体的互补体决定区域移植到人的单克隆抗体中“人化”，如在Jones等人，自然321：522-525(1986)中或Tempest等人生物技术9：266-273(1991)中所描述的及在本文上面所提及的。
用本文所描述的抗体，蛋白质及活性片段覆盖的医疗设备或聚合生物物质包括但不限于U形钉，缝合线，替换心脏瓣膜，助心设备，硬质及软质隐形眼镜，眼内晶体移植(室前或室后)，其他移植如角膜镶嵌，角膜-假体，脉管扩张器，epikeratophalia设备，青光眼分流器，视网膜U形钉，虹膜扣，假牙，甲状腺整形设备，喉部整形设备，脉管移植体，软质和硬质组织假体，包括但不限于泵，电动设备如刺激器，记录器，耳假体，起博器，人造喉，牙齿移植，乳房移植，阴茎移植，头部/面部腱，人造关节，腱，韧带，半月板和盘，人造骨，人造器官包括人造胰腺，人造心脏，人造肢，和人造瓣膜；扩张器，金属线，导引金属线，静脉内和静脉中心导管，激光和球形血管成形术设备，脉管及心脏设备(管，导管，球)，心室助器，血液透析组成，血液充氧器，尿道/输尿管/泌尿器设备(Foley导管，扩张器，管和球)，通风导管(气管内和气管造口术管和套箍)，肠饲食管(包括鼻饲，胃内和空肠管)，伤口倒流管，用于体腔排放的管如胸腔，腹腔，颅腔，心包腔排放管，血液袋，测试管，血液收集管，vacutainers，耳咽管，针头，吸液管，吸液管头和血液管。
本领域中的技术人员应该理解的是，本文所使用的“覆盖的”或“覆盖”是指将蛋白质，抗体或活性片段涂在设备的表面，较好地涂在会经历凝固酶阴性葡萄球菌感染的外表面。设备表面没有必要全部由蛋白质，抗体或活性片段覆盖。
V.药物组合物
免疫组合物，包括疫苗，和其他含SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元的药物组合物包括在本发明的范围内。使用疫苗领域中技术人员已知的物料和方法，一种或多种SdrF，SdrG或SdrH蛋白质，或活性或抗原片段，单独地或与其他抗原一起制成配方或包装。免疫反应可作治疗或预防应用，并能提供抗体免疫或分子免疫，如由T淋巴细胞提供。
免疫组合物如疫苗，和其他药物组合物可单独使用或与其他阻断剂一起使用，以保护人或动物不得由凝固酶阴性葡萄球菌引起的或加剧的感染。具体地，组合物可用来保护人不得心内膜炎，毒性休克症，骨髓炎，附睾炎，蜂窝织炎或许多其他感染。组合物也可保护人或反刍动物不得由凝固酶阴性葡萄球菌感染引起的乳腺炎。疫苗可进一步用来保护其他种类动物如犬科和马科动物不得类似的凝固酶阴性葡萄球菌感染。
为了增强免疫原性，蛋白质抗原可与载体分子缀合。适当的免疫原性载体包括蛋白质，多肽或肽如清蛋白，血蓝蛋白，甲状腺球蛋白和它们的衍生物，具体地有牛血清清蛋白(BSA)和匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)，多糖，碳水化合物，聚合物，和固相。其他蛋白质衍生或非蛋白质衍生的物质对本领域中的技术人员是已知的。免疫原性载体通常分子量至少1,000道尔顿，较好地大于10,000道尔顿。载体分子常常含有活性基团以便于与半抗原缀合。羧酸基团或氨基酸的氨基基团或糖蛋白的糖基团常常以这种方式应用。缺少这些基团的载体可与适当的化学物质反应制备。较好地，当将免疫原注入动物如鼠，兔子，山羊，田鼠，绵羊，豚鼠，鸡或其他动物中时，最好是鼠和兔子，免疫反应产生。或者，在没有使用载体时，含多种蛋白质或多肽，或抗原性或免疫性等同物多肽的多抗原肽，可具有充分抗原性以改善免疫原性。
SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元，或蛋白质组合物可以有效量与辅剂一起服用，以增强对缀合物的免疫原反应。这个时候，被广泛使用在人类中的唯一的辅剂是明矾(磷酸铝或氢氧化铝)。皂苷和其提纯组分Quil A，Freund的完全辅剂和其他使用在研究中和医兽用辅剂含有限制其在人类疫苗中应用的毒性。然而，化学定义的制备品如胞壁酰二肽，单磷酰基脂质A，磷脂缀合物如在Goodman-Snitkoff等人的J.Immunol.147：410-415(1991)中所描述的，和蛋白磷脂体内封包的缀合物如在Miller等人的J.Exp.Med.，176：1739-1744(1992)中所描述的，和在脂质囊中封包的蛋白质如Novasome脂质囊(微脉管系统有限公司，Nashua，NH)也可使用，这些文献通过在此引述而合并于本文。
本文所使用的“疫苗”包括给患者服用的药物组合物中的DNA疫苗，其中核酸分子编码SdrF，SdrG或SdrH，或其抗原片段，如任何共有序列或可变序列氨基酸基元。为了基因免疫接种，本领域技术人员已知的适当的给药方法包括直接将质粒DNA注射到肌肉中(Wolff等人，Hum.Mol.Genet.1：363，1992)，将DNA与特异蛋白质载体混合给药(Wu等人，J.Bio.Chem.264：16985，1989)，用磷酸钙共沉淀DNA(Benvenisty和Reshef.Proc.Natl.Acad.Sci.83：9551，1986)，将DNA封包在脂质体中(Kaneda等人，科学243：375，1989)，粒子轰击(Tang等人，自然，356：152，1992和Eisenbraun等人，DNA分子生物学，12：791，1993)，及使用克隆的逆转录病毒载体体内感染(Seeger等人Proc.Natl.Acad.Sci.81：5849，1984)。
在另一个实施方案中，本发明是多核苷酸，其包括在体内将所说的多核苷酸引入到真核组织中时能表达制备基因产品的邻接核酸序列。编码的基因产品较好地用作免疫刺激剂或作用能产生免疫反应的抗原。这样，在这个实施方案中的核酸序列编码免疫原抗原表位，是细胞因子或T-细胞共同刺激因子，如蛋白质B7家族中的成员。
用基因而不是用其基因产品免疫接种有几种优势，首先是相对简单，天然或接近天然的抗原可被引入到免疫系统中。哺乳动物蛋白质重组表达在细菌，酵母中，甚至哺乳动物细胞常常需要广泛的治疗与确保适当的抗原性。用DNA免疫接种的第二个优势是免疫原可能进入到MHC-I类途径中，并刺激细胞毒性T细胞反应。使用编码流感A核蛋白质(NP)的DNA免疫接种鼠产生对NP的CD8+反应，保护鼠不受异类流感菌株的影响(Montgomery，D.L等人，细胞分子生物学，43(3)：285-92，1997和Ulmer等人，疫苗，15(8)：792-794，1997)。
细胞调节免疫对控制感染是很重要的。因为DNA免疫接种可刺激体液和细胞-调节免疫反应，所以其大的优点是，它提供了相对简单的方法测定了大量表皮葡萄球菌基因的疫苗潜能。
VI.服用方法及药物组合物剂量
含SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元，或核酸分子，抗体，或它们的片段的药物组合物可调配在药物载体中，如盐水，葡萄糖，甘油，乙醇，其他治疗用化合物，和它们的组合。配方应适于服用方式。组合物可用来干扰，调节，或抑制凝固酶阴性葡萄球菌和宿主细胞上的血纤蛋白原之间的结合。
可表达DNA或引入到疫苗受体中的可转录RNA的量有很大的剂量范围，并取决于使用的转录和翻译启动子的强度。此外，免疫反应的大小取决于蛋白质表达的量及表达的基因产品的免疫原性。通常，可直接给肌肉组织服用的DNA的有效剂量范围在约1ng到5mg，100ng到2.5mg，1μg到750μg，较好地约为10μg到300μg。皮下注射，真皮内引入，皮肤压入，及其他服用方式如腹腔内，静脉内，或吸入给药也是适用的。本发明还考虑提供了推进器接种疫苗。下列用多核苷酸免疫原接种疫苗，用蛋白质免疫原如SdrH基因产品推进也考虑在本发明中。
多核苷酸可能是“裸的”，即不与影响受体免疫系统的任何蛋白质，辅剂或其他试剂结合。在这种情况下，需要多核苷酸在生理上可接受的溶液中，如但不限于，无菌盐水或无菌缓冲盐水。或者，DNA可与脂质体结合，如卵磷脂脂质体或此领域中已知的其他脂质体，成为DNA-脂质体混合物，或DNA可与本领域中已知的辅剂结合以促进免疫反应，如蛋白质或其他载体。对细胞吸收DNA有帮助的试剂，如但不限于钙离子也可使用。这些试剂本文通常称为转染促进试剂或药物可接受的载体。用多核苷酸涂覆微粒的技术在本领域中是众所周知的，也可用在本发明中。对于应用于人类的DNA，可将最终DNA产物置于药物可接受的载体或缓冲液中。药物可接受的载体或缓冲液在本领域中众所周知，包括在多种课本中所描述的，如Remington药物科学。
本领域中的技术人员应该认识到，对于DNA疫苗接种用药法最理想的剂量方案包括5到6个之多，但较好的有3到5个，更好的1个到3个免疫实体用药法，间隔少的两到四周，长的五到十年，或甚至更长的间隔。
本申请中公开的任何药物组合物的适当的用药方法包括，但不限于局部用药，口服用药，肛门用药，阴道用药，静脉内用药，腹腔内用药，肌肉内用药，皮下用药，鼻内用药，真皮内用药。
对于局部用药，组合物配制成药膏，霜剂，凝胶，洗剂，滴剂(如眼睛滴剂和耳滴剂)，或溶液(如漱口液)。伤口或外科敷裹物，缝合线，和汽雾剂也可充满组合物。组合物可含有传统的添加剂，如防腐剂，促进渗透的溶剂，和柔和剂。局部用药配方还可含有传统的载体如乳脂或软膏基质，乙醇，或油烯基醇。
在一个较好的实施方案中，疫苗以对注射用药(即肌肉内注射，真皮内注射，皮下注射)或鼻咽用药(即鼻内用药)免疫接种为一次剂量的形式包装。疫苗最好通过肌肉注射到三角肌肌肉中。疫苗较好地与药物可接受的载体混合以便于服用。载体通常是水或缓冲盐水，含或不含防腐剂。疫苗也可是冻干的，在服用时重新悬浮或溶解。
蛋白质的微囊化作用会产生控释。很多因素影响微囊化作用的具体聚合物的选择。必须考虑到的所有因素有：聚合物合成的再现性，微囊化作用方法，微囊化作用的物料和方法的成本，毒物学分布，可变释放动力学的要求，聚合物和抗原的生理学相容性。可使用的聚合物实例有聚碳酸酯，聚酯，聚亚胺酯，聚原酸酯，聚酰胺，聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和其他生物可分解的聚合物。在抗原的控释中使用PLGA由Eldridge等人在 微生物学和免疫学的当前课题，146：59-66(1989)中作了评述。
对于人类用药，较好的剂量为从0.01毫克/公斤到10毫克/公斤，推荐剂量为约1毫克/公斤。根据这个范围，对于较重体重的等同剂量可以确定。剂量应调节以适应给服组合物的个体，并且随着个体的年龄，体重和新陈代谢的不同而变化。疫苗可另外含有稳定剂或药物可接受的防腐剂，如thimerosal[乙基(巯基安息香酸盐-S)汞钠盐](Sigma化学公司，St.Louis，MO)。
VII.蛋白质标记缀合物
当用可检测的生物分子或化化学物质标记时，本文所描述的血纤蛋白原结合蛋白质可用来如在体内和体外诊断葡萄球菌感染，或检测凝固酶阴性葡萄球菌。通过使用这样的Sdr蛋白质标记缀合物也可促进实验室研究。多种标记和将标记与蛋白质缀合的方法对本领域中的技术人员是已知的。下面列出几种特异标记。当与蛋白质如抗体或受体缀合时这些标记特别有用。例如，蛋白质可与放射性标记如，但不限于32P，3H，14C，35S，125I，或131I缀合。对标记的检测可使用如闪烁计数法，γ射线光谱测定法，放射自显影法。
生物荧光标记，如萤火虫虫荧光素的衍生物也可使用。通过传统方法将生物荧光物质与蛋白质共价结合，当酶如荧光素酶催化与ATP的反应时，产生生物荧光分子发出光子，标记的蛋白质被检测出来。
荧光团也可用来标记蛋白质荧光团的实例包括荧光素及衍生物，藻红蛋白，藻青蛋白，同分异构藻青蛋白，玫瑰精，和Texas红。荧光团通常有荧光检测器检测。
另外，蛋白质也可用显色物质标记以提供酶或亲和标记。如蛋白质可被生物素化，这样蛋白质可用在生物素-抗生物素蛋白反应中，其也可与标记如酶或荧光团偶联。如蛋白质可用过氧化物酶，碱性磷酸酶或其他酶标记，在加入的底物上产生显色或荧光团反应。添加剂如5-氨基-2，3-二氢-1，4-phthalazinedione(也称为发光氨)(Sigma化学公司，St.Louis，MO)和速度增强剂如p-羟基二苯基(也称p-苯基苯酚)(Sigma化学公司，St.Louis，MO)也可用来通过发光反应扩增酶如山葵过氧化物酶；酶底物的发光或荧光团的dioxetane衍生物也可使用。这样的标记可用酶联免疫测定法(ELISA)或通过分光光度计检测颜色改变来测定。此外，依据本领域中技术人员熟知的方法，蛋白质可用胶体金标记以使用在免疫电镜术中。
细胞中配体的定位可通过标记抗体(如上所述)及检测标记来鉴别，依据本领域中的技术人员熟知的检测标记的方法，如使用由Warren和Nelson所描述的方案(分子细胞生物学，7：1326-1337，1987)的免疫荧光显微镜法。
VIII.治疗应用
除了上面描述的治疗组合物和方法外，SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元，核酸分子或抗体可用来干扰病原体和哺乳动物宿主之间的引发感染的初始物理相互作用，如细菌，特别是革兰氏阴性细菌对在留置设备上的哺乳动物细胞外基质蛋白质或伤口中细胞外基质蛋白质的附着；用来阻断SdrF，SdrG或SdrH蛋白质调节的哺乳动物细胞入侵；用来阻断用来阻断哺乳动物细胞外基质蛋白质和调节组织损失的细菌SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元之间的细菌附着；用来阻断不是由留置设备的植入或外科技术引发的感染病理的正常进展。
IX.筛查方法
SdrF，SdrG或SdrH蛋白质，或其片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元可用在筛查化合物以确定抑制凝固酶阴性葡萄球菌与宿主分子结合的化合物的方法中。根据这种方法，将有兴趣的化合物与一种或多种SdrF，SdrG或SdrH蛋白质或其片段结合，测定或观察蛋白质与血纤蛋白原或其他细胞外基质蛋白结合程度。如果存在的蛋白质产生对蛋白质-血纤蛋白原结合的抑制作用，那么该化合物可用来在体内或体外抑制凝固酶阴性葡萄球菌。该方法可同样用来鉴别促进凝固酶阴性葡萄球菌与宿主分子相互作用的化合物。
该方法特别可用来鉴别具有抑制细菌或杀菌属性的化合物。
如，为了筛查凝固酶阴性葡萄球菌激动剂，或拮抗剂，将合成反应混合物，细胞区室(如膜，细胞外膜或细胞壁)含有一种或多种SdrF，SdrG或SdrH蛋白质，或其片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元，和蛋白质的标记的底物或配体，在存在或不存在所研究的化合物的情况下温育。化合物激动或拮抗蛋白质的能力由标记配体结合现象的减少或底物产物的产量减少显示。结合好的并且增加底物产物形成速度的化合物是激动剂。对底物产物生产量或速度的检测可通过使用报道基因系统来增强，如转变成产物的比色标记底物，对SdrF，SdrG或SdrH核酸或蛋白质活性的改变敏感的报道基因，和本领域中技术人员熟知的结合测定法。也可使用竞争性抑制测定法。
可能的拮抗剂包括小型有机分子，肽，多肽，和与SdrF，SdrG或SdrH核酸分子或蛋白质或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元结合，从而抑制它们的活性的抗体，或与结合分子(如血纤蛋白原)结合抑制SdrF，SdrG或SdrH核酸分子或蛋白质与其配体结合的抗体。如，抑制SdrF，SdrG或SdrH活性的化合物可以是与SdrF，SdrG或SdrH蛋白质结合并占据结合位点从而阻止与细胞结合分子的结合抑制正常生物活性的小型分子。小型分子的实例包括但不限于，小型有机分子，肽或类肽分子。其他可能的拮抗剂包括反义分子。较好的拮抗剂包括与SdrF，SdrG或SdrH蛋白质，或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元有关的化合物，以及SdrF，SdrG或SdrH蛋白质，或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元的变体或衍生物。
本文所描述的核酸分子也可用来筛查抗细菌活性的化合物。
X.凝固酶阴性葡萄球菌的检测试剂盒
本发明进一步涉及含有一种或多种SdrF，SdrG或SdrH-特异核酸探针的试剂盒，它能用来在样品中检测凝固酶阴性葡萄球菌或凝固酶阴性葡萄球菌Sdr蛋白质或其部分，如共有序列或可变序列氨基酸基元，或用来诊断凝固酶阴性葡萄球菌的感染。这种试剂盒也可含有适当试剂用来将探针与样品杂交并检测结合探针。
在一个可替换的实施方案中，试剂盒含有对一种或多种SdrF，SdrG或SdrH蛋白质，或其片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元特异的抗体，它可用来检测凝固酶阴性葡萄球菌。
在另一个实施方案中，试剂盒含有一种或多种SdrF，SdrG或SdrH蛋白质，或其活性片段，它可用来检测样品中凝固酶阴性葡萄球菌生物体或凝固酶阴性葡萄球菌Sdr蛋白质的抗体。
本文所描述的试剂盒可另外含有用来安全地获取样品的设备，存放试剂的容器，计时装置，稀释样品的缓冲液，比色计，放射计，或测定颜色变化的对比标准。
在一个较好的实施方案中，试剂，包括蛋白质或抗体是冻干的，最好放在单一容器中。向容器中加入水溶样品产生冻干试剂的溶液，使它们起作用。最好的是，依据本领域中的技术人员熟知的方法，将试剂顺序地在单一容器中冻干，以使加入样品前试剂的反应最小化。
实施例
下列实施例用来演示本发明较好的实施方案。本领域中的技术人员应理解的是，遵循发明者发现的技术的在实施例中公开的技术，在实施发明中起到很好的作用，因此，实施例中公开的技术可以认为组成了实施发明的较好模式。然而，本领域中的技术人员应理解的是，根据本篇公开内容，在公开的具体实施方案中可以作出许多改变，在没有背离本发明精神和范围的情况下，仍然可以获得相同或相似的结果。
实施例I
在凝固酶阴性葡萄球菌中识别Sdr编码基因
在含有二肽天冬氨酸和丝氨酸(DS)的金黄色葡萄球菌中已识别出五种基因(clfA，clfB，sdrC，sdrD，sdrF)，由18kb重复基元GAY TCN GAY TCN GAY AGY编码，其中Y＝嘧啶，N＝任何碱基。这个家族的蛋白质因丝氨酸-天冬氨酸重复单元已经被命名为Sdr蛋白质。所有5种金黄色葡萄球菌sdr基因编码蛋白质都含有使它们在革兰氏阳性细菌中成为表面相关蛋白质的属性；即在N-端有分泌信号，在C-端有(i)作为蛋白质分泌终止信号的几个正电荷残基，(ii)疏水跨膜区域，(iii)细胞壁中精确分类及修正蛋白质取向所需的带有LPXTG基元的壁-跨越区域。为了在凝固酶阴性葡萄球菌中鉴别编码细胞表面蛋白质的新型基因，我们使用clfA的DS编码区域作为基因探针来鉴别是否在不同种类的凝固酶阴性葡萄球菌中存在同系物。我们描述的凝固酶阴性葡萄球菌菌种有(1)S.Lugdunensis，(2)S.Haemolyticus，(3)S.Schleiferi，(4)表皮葡萄球菌。每种菌在下面列出。
从Jerome Etienne(里昂，法国)获取S.Lugdunensis，S.Haemolyticus，S.Schleiferi和表皮葡萄球菌每种十个菌株。此外，Timothy Foster博士的菌株收集中含其他研究者捐助的表皮葡萄球菌。使用从所有凝固酶阴性葡萄球菌菌株中分离出的基因组DNA实施Southern杂交分析。将染色体DNA用HindIII酶切，clfA的DS编码区域进行DIG标记(Boehringer)并用作探针。对全部十个S.Lugdunensis菌株的Southern杂交分析显示9kb的单一HindIII片段与clfA的DS编码区域杂交。用clfA的DS编码序列对S.Haemolyricus菌株的分析显示了不同大小的片段。在测试的十个菌株之中，有6个菌株在18kb到10kb之间表现出强烈杂交带。在HindIII片段上存在不止一个DS编码区域的可能性是存在的。放射自显影图长时间曝光后，四个保留菌株显示与clfA的DS编码区域较弱杂交。clfA探针没有在从S.Schleiferi获取的基因组DNA中检测到DS编码区域。所有测试的表皮葡萄球菌菌株显示出在至少两个HindIII片段上与clfA的DS编码区域杂交。
测试菌株：
S.Lugdunensis菌株
1.S.Lugdunensis N940113
2.S.Lugdunensis N940164
3.S.Lugdunensis N940135
4.S.Lugdunensis N950232
5.S.Lugdunensis N920143
6.S.Lugdunensis N930432
7.S.Lugdunensis N940084
8.S.Lugdunensis N940025
9.S.Lugdunensis N910319
10.S.Lugdunensis N910320
表皮葡萄球菌菌株：
1.表皮葡萄球菌ATCC1499O(Kloos)
2.表皮葡萄球菌KH11
3.表皮葡萄球菌K28
4.表皮葡萄球菌TU3298
5.表皮葡萄球菌9142
6.表皮葡萄球菌1457
7.表皮葡萄球菌8400
8.表皮葡萄球菌RP62a
9.表皮葡萄球菌N910102
10.表皮葡萄球菌N910173
11.表皮葡萄球菌N910191
12.表皮葡萄球菌N910231
13.表皮葡萄球菌N910249
14.表皮葡萄球菌N910275
15.表皮葡萄球菌N950190
16.表皮葡萄球菌N950329
17.表皮葡萄球菌N910308
18.表皮葡萄球菌N910160
S.haemolyticus菌株：
1.S.Haemolyticus N97061
2.S.Haemolyticus N960512
3.S.Haemolyticus N910106
4.S.Haemolyticus N91024
5.S.Haemolyticus N920160
6.S.Haemolyticus N910287
7.S.Haemolyticus N92018
8.S.Haemolyticus N930100
9.S.Haemolyticus N950252
10.S.Haemolyticus N93016
S.Schleiferi菌株：
1.S.Schleiferi JCM7430
2.S.Schleiferi N920247
3.S.Schleiferi N910245
4.S.Schleiferi N910017
5.S.Schleiferi N960518
6.S.Schleiferi N950242
7.S.Schleiferi N920162
8.S.Schleiferi N92017
9.S.Schleiferi N930047
10.S.Schleiferi N920260
在其他表皮葡萄球菌菌株中的sdrF同系物
通过Southern杂交测定17个表皮葡萄球菌菌株是否存在sdrF基因。个体菌株的染色体DNA用HindIII酶切，并用sdrF的区域A编码序列作为探针探测。这种DNA探针通过PCR使用pC5(在实施例2中作进一步描述)作为模板进行DIG-标记。sdrF基因存在于HindIII片段上，从4到10kb变化，并且在测试的16个菌株中的12个中存在。使用clfA的区域R编码序列作为探针也鉴别出相同大小的带，说明在其他表皮葡萄球菌菌株中的sdrF同系物也含有区域R编码序列。
在其他表皮葡萄球菌菌株中的sdrG同系物
测试16个表皮葡萄球菌菌株是否存在sdrG基因，使用设计探测sdrG的区域A编码序列的探针。Southern杂交分析显示sdrG存在于16kb的HindIII片段上，并且在全部测试的表皮葡萄球菌中存在。用作sdrG的区域A编码序列扩增的引物序列如下：
F1-sdrG：5’GATGATGAATTATCAGAC3’
R.-sdrG：5’CAGGAGGCAAGTCACCTTG3’
(包含sdrG的配位点195到1795)
在表皮葡萄球菌菌株中的DS-编码区域同系物
用HindIII酶切染色体DNA，将clfA的DS-编码区域进行DIG标记(Boehringer)并用作探针。Southern杂交分析显示至少两个HindIII片段与clfA的DS-编码区域杂交。十个菌株与三个HindIII片段杂交。
实施例2
研究凝固酶阴性葡萄球菌中的Sdr基因，并鉴别，分离，测序及表达SdrF，SdrG和SdrH
总述
表皮葡萄球菌菌株可表达三种不同的含丝氨酸-天冬氨酸二肽重复单元的与细胞表面相关蛋白质。蛋白质SdrF和SdrG在序列上和结构组织上与金黄色葡萄球菌的Sdr蛋白质相似。它们在它们的N-端分别包括625和548个残基独特区域A，接着可变数量的110-119个残基区域B，一个SD重复区域，以及与肽聚糖共价锚定的C-端的LPXTG基元和表面蛋白质特有的疏水域。相对照，SdrH包括在N-端的较短的60个残基区域A，接着一个SD重复区域，一个独特的277个残基区域C，和C-端疏水域。SdrH缺少LPXTG基元。编码SdrF，SdrG和SdrH的每个区域A的DNA克隆到E.Coli的表达载体中，表达并提纯重组蛋白质。在兔子中培养特异抗血清并用来鉴别用表皮葡萄球菌表达的Sdr蛋白质。从生长到指数期的细胞的溶-葡萄球菌酶产生的原生质体中只释放出SdrF。SdrG和SdrH保持与原生质体部分结合，因此没有分类并与肽聚糖结合。在Southern杂交分析中，SdrG和SdrH在测试的全部十六个菌株中都存在，而SdrF只在十二个菌株中存在。从已经从表皮葡萄球菌感染恢复的十五个患者中获取的抗血清含有与SdrF，SdrG和SdrH的重组区域A反应的抗体，这说明这些蛋白质在感染期间被表达了。
背景
表皮葡萄球菌是人类皮肤常见的居住者并是外源物感染的常见病因。由于生物体能与留置设备先附着，接着形成生物膜而促使致病，留置设备有如人造瓣膜，整形外科设备和静脉内和腹膜内导管。设备相关感染危及治疗的成功并大大增加了患者的发病率(11)。
表皮葡萄球菌对合成表面的附着作用与表面的疏水性和细胞表面蛋白质有关(2，13)。表皮葡萄球菌的蛋白酶治疗已显示降低了疏水性和附着作用(24)，与表皮葡萄球菌的220kDa细胞表面蛋白质反应的单克隆抗体能部分阻断细菌对聚苯乙烯的附着作用(30)。由ica操纵子表达的多糖对形成生物膜是至关重要的。一种观点认为，多糖附着因子(PS/A)同时影响附着作用和与生物膜形成的累积时期有关的细胞与细胞间的相互作用。另一种观点认为，附着作用是由表面相关蛋白质调节，而多糖只影响积累时期(5，12，19)。
如同表皮葡萄球菌一样，金黄色葡萄球菌也可与医疗植入设备附着，但这种附着作用主要由对植入后短时间覆盖生物物质表面的宿主血纤蛋白原和纤连蛋白原特异的细菌受体调节。调节这些相互作用的金黄色葡萄球菌附着因子包括血纤蛋白原结合蛋白质，ClfA和ClfB，纤连蛋白原结合蛋白质，FnbpA和FnbpB[在(3)中作了评述]。尽管表皮葡萄球菌有可能与血纤蛋白原，纤连蛋白原，玻连蛋白，层粘连蛋白(6，25，29)，但对有关调节这些相互作用的特异附着因子及这些相互作用如何影响细菌对由宿主蛋白质覆盖的生物物质附着作用了解很少。
金黄色葡萄球菌的血纤蛋白原结合从生因子蛋白质(或ClfA)(如图1A)特点在于存在丝氨酸-天冬氨酸(SD)二肽重复区域(在以前的研究中称为区域R)，位于配体结合区域A和C-端序列之间，并与对细胞壁的附着作用有关(16，17)。SD-重复区域预计跨越细胞壁并从细菌表面延伸到配体结合区域(4)。ClfA是在金黄色葡萄球菌中发现的SD-重复(Sdr)蛋白质家族的前体。其他成员包括ClfB(第二血纤蛋白原结合从生因子)，SdrC，SdrD和SdrE(图5A)(8，21)。SdrC，SdrD和SdrE蛋白质含有其他重复单元，称为区域B重复单元，位于区域A和SD重复单元之间。每个B重复单元长度为110-113个氨基酸并含有推定的Ca2+结合，EF-手基元。Ca2+结合已经显示是区域B重复单元结构完整所需的(9)。SdrC，SdrD和SdrE的功能还不了解，但蛋白质假定通过它们的区域A与宿主基元分子相互作用。
这个实施例描述了由表皮葡萄球菌表达的三种Sdr蛋白质。两种含有与金黄色葡萄球菌的Sdr蛋白质相同的结构组织及相似的序列，而SdrH是不同的。编码这些蛋白质的基因在表皮葡萄球菌菌株中是普遍的。在康复期患者中存在对每种Sdr区域A反应的抗体说明在感染期间蛋白质被表达。
材料和方法
细菌菌株和生长条件
E.coli XL-1蓝或JM109用作为重组宿主菌株。菌株XL-1蓝或TOPP3(Stratagene，La Jolla，CA)细胞用作蛋白质表达。细菌在补充有100μg/ml的氨卡青霉素(USB，Cleveland，OH)的Luria肉汤或琼脂(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中常规生长。表皮葡萄球菌菌株(表2)在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或琼脂(TSA)(Difco，Detroit，MI)中生长。
Sdr基因的克隆和测序
从表皮葡萄球菌菌株9491中克隆SdrF基因。长度范围为6.5到7.5kb的HindIII-DNA片段从琼脂糖凝胶中分离并连接到用HindIII消化的pBluescript SK+克隆载体(Stratagene)中，用小牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)(Promega，Madison，WI)处理。使用朝向ClfA的编码SD-重复区域的DNA的引物(P3和P4引物，表3)，通过PCR筛查(27)确定一个重组质粒，pC5。
从用已用Sau3A部分消化并连接到λGem-11(Promega)的半位点XhoI臂中的DNA制备的表皮葡萄球菌菌株K28的λGem-11文库克隆SdrG基因。包装后，通过表示ClfA SD-重复单元区域的DNA探针的杂交作用鉴别阳性噬菌体，称为E6-2。然后将从E6-2中获取的SacI-KpnI DNA片段亚克隆到E.Coli质粒载体，pZero(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。然后将克隆用限制性内切核酸酶定位，将含与编码SD-重复单元氨基酸序列的DNA相同的DNA的3.5kb的EcoRI-KpnI片段亚克隆pUC18(Amersham Pharmacia Biotech，piscataway，NJ)中以制备pE6-2。
下面克隆SdrH基因。从表皮葡萄球菌菌株9491基因组DNA中获取的HindIII片段按大小分级在5-20％蔗糖梯度上。将从含1.5-2.5kb片段的组分中获取的DNA连接到用HindIII消化及用CIAP(Promega)脱磷酸化的pBluescript中。通过集落印迹杂交，使用制作用来探测编码ClfA SD-重复单元区域DNA的DIG标记(Boehringer，Mannheim，Indianapolis，IN)探针筛查含连接产物的E.Coli转化体。
在两条克隆的DNA链上实施自动双脱氧-DNA测序。在大多数情况中，使用引物行走实施DNA序列在给定克隆体上的延伸。然而，这种方法不能覆盖编码SdrF的SD-重复单元的重复DNA的长度。因此，DNA的这个区域用Sau3A从pC5中切除，并连接到pBluescript中，用作构建核酸外切酶缺失衍生物(Erase-a-base，Promega)。两条链上的适当缺失(未显示)通过PCR筛查和选择性制图确定。
    表2使用在这项研究中的表皮葡萄球菌
  菌株   注释和属性   来源或参比
KH11K28RP62aTU3298914214578400N910308N910160N910102N910173N910191N910231N910249 SdrG原型菌株可转化菌株生物膜模型参比菌株，法国，里昂参比菌株，法国，里昂参比菌株，法国，里昂参比菌株，法国，里昂参比菌株，法国，里昂参比菌株，法国，里昂参比菌株，法国，里昂   □□9491□SdrF和SdrH原型菌株□ATCC菌株□□ATCC14990□参比菌株P.VaudauxP.VaudauxF.GotzD.MackD.MackJ.EtienneJ.EtienneJ.EtienneJ.EtienneJ.EtienneJ.EtienneJ.Etienne
表3使用在DNA探针和蛋白质表达构建的PCR扩增中的引物
  扩增区域   序列   指定载体   模板DNA
  ClfA SD重复SD重复SdrF区域ASdrG区域ASdrH全长SdrF区域ASdrG区域ASdrH区域A   F：GCC GGATCCCCAATTCCAGAGGATTCAR：GCC AAGCTTATTGTTAGAACCTGACTCP3：GATTCAGATAGCCATTCP4：CTGAGTCACTGTCTGAGF：CCC GGATCCGCTGAAGACAATCAATTAGR：CCC AAGCTTAATTATCCCCCTGTGCTGF：CCC GGATCCGAGGAGAATACAGTACAAGACGR：CCC GGTACCTAGTTTTTCAGGAGGCAAGTCACCF：CCC GGATCCGAAGGTAATCATCCTATTGACR：CCC AAGCTTACTTTTTTCTAAAGATATATAGTCCF：如上R：CCCGAATTCAATTATCCCCCTGTGCTGTTGF：如上R：CCC GAATTCTAGTTTTTCAGGCAAGTCACCF：GGC GGATCCGAAGGTAATCATCCTATTGR：GGC AAGCTTCTAAATATGTGTCATTTTC   NaNaPQE30PQE30PQE30PGEX-2TPGEX-2TPGEX-KG   PCF48Sdr克隆菌株9491菌株K28菌株9491菌株9491菌株K28菌株9491
Na：不可适用
下划线：用来克隆的限制性内切核酸酶位点
Southern杂交
其他地方已经对Southern印迹转移和杂交进行了描述(8)。DNA探针从编码ClfAd SD重复区域或编码SdrF，SdrG和SdrH的每个区域A(表3)的PCR产物制备。使用Taq DNA聚合酶(Gibco BRL)制备PCR产物，探针是异羟基洋地黄毒苷配基(Boehringer Mannheim)或荧光素(Amersham)标记的。
蛋白质表达和提纯以制备抗血清
使用适当的引物(表3)，通过从表皮葡萄球菌菌株9491或K28中获取的基因组模板DNA的PCR扩增，获得编码重组SdrF，SdrG或SdrH区域A的DNA。SdrF区域A构建缺少末端残基，脯氨酸。PCR使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)；说明书中已作了描述(7)。PCR产物用适当的限制性内切核酸酶消化，并连接到表达载体PQE30(Qiagen，Valencia，CA)中以制备组氨酸-标记蛋白质，或连接到PGEX-2T(Pharmacia)或PGEX-KG中以制备GST-标记蛋白质。通过培养4升重组生物体到光学密度(OD600)到0.5并用0.3mM异丙基-1-硫βD-半乳糖苷(IPTG)(Gibco BRL)诱导两个小时，将蛋白质表达到E.Coli中。将细胞收获在PBS(150mM氯化钠，4.3mMNa2HPO4，1mM NaH2PO4)中并在-80℃冷冻。E.coli流经French滤纸，这些裂解物的上清液通过0.45μm的膜过滤。存在于上清液中的溶解的组氨酸-标记蛋白质通过金属螯合色谱法进行初始提纯。将上清液加在5毫升带Ni2+-电荷的HiTrap螯合柱(Pharmacia Biotech有限公司)中，用200毫升线性梯度的0-200mM咪唑的4mM Tris-盐酸，100mM氯化钠溶液，pH7.9，以流速5毫升每分钟洗脱结合蛋白质。含重组蛋白质的组分通过SDS-PAGE(如下)确定，混合，并用25mM Tris-盐酸，pH 8.0透析。将透析蛋白质浓缩，并用离子交换色谱法通过将样品加到5毫升HiTrap Q柱(Pharmacia Biotech有限公司)中，用200毫升线性梯度的0-0.5M氯化钠的25mM Tris-盐酸，pH 9.0，以流速5毫升每分钟洗脱结合蛋白质进一步提纯。含重组蛋白质的组分通过SDS-PAGE确定。从如上获得的E.Coli溶胞物中提纯GST标记的蛋白质。在重力作用流动下，溶胞物流经10毫升的谷胱甘肽-琼脂糖柱，并用五倍柱体积的PBS冲洗。用新鲜制备的5mM还原的谷胱甘肽(Sigma)的50mM Tris-盐酸溶液，pH 8.0从柱上将蛋白质洗脱。提纯的蛋白质用来在新西兰白兔中培养抗血清，使用由HTI Bioproducts(Romano，CA)或由爱尔兰国立大学生物学核心实验室(爱尔兰，都柏林)公开的标准方案。
SDS-PAGE和Western印迹转移
SDS-PAGE使用含10％丙烯酰胺的trycine凝胶(28)。使用半干转移细胞(Bio-Rad，实验室，Hercules，CA)，将分离的蛋白质转移到PVDF膜(Immobilon-P，Millipore，Bedford，MA)上。在还原条件下将所有蛋白质加热变性。提纯的蛋白质(每种1ug)用SDS-PAGE处理并用Coomassie亮蓝染色。获取E.Coli溶胞物或溶胞物组分，如下：IPTG诱导，重组E.Coli培养到OD600为2.0，冲洗并重新悬浮到初始体积量的PBS中，制备SDS-PAGE。将10μl的每种制备物装入各自的含丙烯酰胺的培养皿中。表皮葡萄球菌菌株在含有1.25U每10毫升内切蛋白酶抑制剂α2-巨球蛋白(Boehringer Mannheim)的TSB中培养到早期稳定期。将细胞调节到OD600为2.0，冲洗并重新悬浮到一半初始体积量中。在溶葡萄球菌酶(100μg/ml)和溶解酵素(100μg/ml)前加入蛋白酶抑制剂(4mM苯基甲基磺酰氟，1mM N-乙基-顺丁烯二酰亚胺，和25mM氨基己酸)和DNA(10μg/ml)。在37℃摇晃下实施酶促消化30分钟。使用相同的条件，在存在30％蜜三糖的情况下从原生质体中分离细胞壁蛋白质。用如处理E.Coli的方式处理表皮葡萄球菌溶胞物或溶胞物组分。将30μl等分样品置于含丙烯酰胺的培养皿中。
免疫测定法
如下实施Western免疫测定法：将Western印迹在含有1％无脂肪干奶的PBS中温育1小时。然后用抗血清(稀释在PBS-奶中)将印迹温育1小时。单克隆，抗组氨酸抗体(Clonetech，Palo，Alto，CA)稀释到1∶3000。抗SdrFA抗血清(免疫，预免疫，和抗原吸收的)稀释到1∶30,000；抗-SdrGA抗血清稀释到1∶2000，抗-SdrHA抗血清稀释到1∶1000。抗血清吸收已作了描述(14)。简单地讲，抗-SdrFA和抗-SdrGA抗血清分别被存在于已被超声波降解然后离心的诱导E.coli不溶组分中的GST标记的SdrGA和SdrFA蛋白质广泛地吸收。这种方法用来除去存在于每种抗血清中可能的交叉反应抗体。通过使用分别含有GST标记的SdrFA，SdrGA和SdrHA的E.coli溶胞物吸收每种抗血清来除去免疫反应的抗-SdrFA，-SdrGA和-SdrHA抗体。接着温育抗血清，用PBS冲洗Western印机三次，并用与碱性磷酸酶(Bio-Rad实验室)缀合的山羊，抗-兔或抗-鼠IgG的1∶2000稀释液温育30分钟。冲洗印迹，然后在显色底物(150μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯p-甲苯胺盐和300μg/ml的p-硝基蓝四唑氯的重碳酸盐缓冲液)中显影10到15分钟。
康复期患者IgG对重组蛋白质的反应性已有描述(1)。收集从表皮葡萄球菌感染恢复的15名个体的抗血清，使用蛋白质-A琼脂糖凝胶层析法提纯IgG。酶联免疫吸附测定法(ELISA)用来演示IgG(每个培养皿2μg)对涂覆在微量滴定板上的重组蛋白质(每个培养皿1μg)的反应性。
结果
SdrF，SdrG和SdrH基因的鉴别
对表皮葡萄球菌的初步Southern杂交分析显示存在几个与编码金黄色葡萄球菌Sdr蛋白质家族(未公开观察结果)的SD重复单元的DNA杂交的位点。为了进一步描述这些位点，我们克隆了从表皮葡萄球菌菌株9491和K28获取的三个DNA片段。通过直接将HindIII-DNA片段连接到E.Coli质粒载体中从菌株9491获得两个克隆体，pC5和pC28。第三个克隆体，E6-2从由菌株K28制备的λGem-11基因组文库中获得。E6-2插入DNA的片段亚克隆到E.eoli质粒载体中形成pE6-2。pC5，pE6-2和pC28发现分别有6.8，6.0，和2.0kb的DNA插入(未显示)。
DNA序列分析显示在每个质粒中存在单一开放读框(ORF)。ORP，称为SdrF，SdrG和SdrH，分别有5199，2793和1461个碱基对。亮氨酸，而不是蛋氨酸，密码子预计作为SdrG的翻译起始密码子。可能的核糖体结合位点(GGAG)确定为每个ORF5’的7到12个碱基对。drF，SdrG和SdrH ORF的侧翼500到1000个碱基对的DNA序列不同，说明它们不象金黄色葡萄球菌的SdrC，SdrD和SdrE基因那样衔接结合(数据未显示)。
SdrF，SdrG和SdrH的推导氨基酸序列
表皮葡萄球菌SdrF和SdrG蛋白质的氨基酸结构组织与金黄色葡萄球菌的Sdr蛋白质的相似，因此具有典型的共价锚定革兰氏阳性细菌的肽聚糖的细胞表面蛋白质的特性。这些细胞表面特性包括在疏水膜跨越区域后C端尽头的正电荷残基，LPXTG基元。SD重复区域位于LPXTG基元的N-端并认为贯穿细胞壁(4，10)。SdrF和SdrG在它们的N-端含有预定的信号序列(分别为52和50个残基)，在它们的C-端含有与细胞壁连接有关的残基(图5B和5C)。SdrF和SdrG的SD重复区域(如下)分别终止7个和13个残基，最接近LPXTG基元。SdrF和SdrG的SD重复区域分别含有558和56个残基(图5B)。SdrG的二肽组合物没有从丝氨酸和天冬氨酸偏离，而在SdrF中，在SD重复区域内出现26个丙氨酸。成熟蛋白质(损失信号序列)的预计分子量对于SdrF为179kDa，对于SdrG为97.6kDa。
金黄色葡萄球菌的Sdr蛋白质每种具有结构性特点，在它们的N-端有已知的或推定的配体结合域，称为区域A(8，16，21)。成熟SdrF和SdrG的N-端分别有625和548个氨基酸区域A。成对地比较显示SdrF和SdrG区域A的氨基酸序列彼此有22％相同，与金黄色葡萄球菌的Sdr蛋白质的区域A有20-35％(平均23％)相同。
在金黄色葡萄球菌Sdr蛋白质的区域A内已报道有氨基酸序列基元，这些基元包括在ClfB内的推定的Ca2+结合EF-手基元，在ClfB内的阳离子调整MIDAS基元，和常见的Sdr蛋白质基元，TYTFDYVD，不了解功能(8，23)。SdrF和SdrG区域A都含有TYTFDYVD基元，在SdrG的区域A中发现EF-手基元(DYSEYEDVTNDDY)。
金黄色葡萄球菌的三种Sdr蛋白质(SdrC，SdrD和SdrE)含有可变数量的110-113个氨基酸的片段，称为区域B(图5A)，每个重复单元含有推定的Ca2+结合EF-手基元(8，9)。同样地，SdrF含有四个区域B重复单元(119，110，111和111个残基)，SdrG含有两个区域B重复单元(113和111个残基)(图5B)。每个重复单元含有推定EF-手基元，带有共有序列DX(N/D)X(D/N)GXX(D/N/G)XX(E/D)。SdrF和SdrG区域B重复单元彼此有43-58％相同，与在金黄色葡萄球菌Sdr蛋白质中发现的区域B有39-73％(平均54％)相同。
SdrH的结构组织与SdrF和SdrG的结构组织在氨基酸序列量上相当不同。在其N-端的可能的30残基信号序列后，SdrH有独特的60残基链(区域A)，接着120-残基SD重复区域和277-残基片段，区域C，在其C-端含有疏水序列，但缺少适当定位的LPXTG基元。然而，在疏水区域内出现LGVTG序列(图1B，1C)。SdrH不含区域B重复单元。SdrH的区域A和区域C不含与其他已知的Sdr蛋白质或各种数据库中的蛋白质相同的氨基酸序列。与其他Sdr蛋白质相同的基元也没有发现。SdrH的成熟分子量预计为50.5kDa。
总之，这些结果说明表皮葡萄球菌能表达两种与金黄色葡萄球菌Sdr蛋白质家族有关的蛋白质，并且能表达具有新型结构的第三中Sdr蛋白质。
表皮葡萄球菌菌株中SdrF，SdrG和SdrH的分布
在Southern杂交分析中，表现ClfA的SD重复单元编码区域的DNA探针与几种基因组HindIII片段在十六个表皮葡萄球菌菌株中杂交(如图6A)。在大多数菌株中观察到三个杂交片段，推测为SdrF，SdrG和SdrH基因。为了证实推测并确定在这些菌株中基因的频率，用对编码每个区域A的DNA特异的探针实施其他分析测定法。SdrH探针在全部菌株内与1.8-6.5kb片段杂交(图6B)。SdrG探针在全部菌株内与16kb片段杂交(图6C)。此外，在16个菌株的4个(KH11，K28，RP62a，和N910102)中探针与3.4kb的HindIII片段杂交。然而，同样的3.4kb片段不与对编码SD重复单元的DNA特异的探针杂交(图6A)，说明存在的与SdrG区域A相同的基因没有SD重复区域。图6D显示了用SdrG和SdrF区域A DNA探测的Southern印迹。SdrF探针在16个菌株中的12个中与4.5kb-10kb间的HindIII-DNA片段杂交(菌株K28，RP62a，N910173，和N910191缺少杂交带)。这些结果说明SdrF，SdrG和SdrH基因在表皮葡萄球菌中是普遍的。
表皮葡萄球菌中SdrF，SdrG和SdrH的表达
使用免疫法测定是否表皮葡萄球菌表达SdrF，SdrG和SdrH。培养特异兔抗血清重组表现不同区域A的融合蛋白质(称为SdrFA，SdrGA和SdrHA)。将SdrFA和SdrGA与聚组氨酸(Hisn)融合，SdrHA与GST融合(图7A)。通过一组含不同蛋白质融合物的重组蛋白质证实抗血清的单特异性。具体地，培养的Hisn-SdrFA和-SdrGA的抗血清分别不与GST-SdrGA和-SdrFA交叉反应(图7B)。此外，这些相同的抗血清不与GST-SdrHA交叉反应(图7B)。培养的Hisn-SdrHA抗血清与全长Hisn-SdrH蛋白质反应，但不与Hisn-SdrFA或-SdrGA蛋白质反应(图7C)。
通过Western免疫印迹法，区域A特异抗血清可用来在其同类表皮葡萄球菌的裂解物中确定原生SdrF，SdrG和SdrH。抗-SdrFA抗血清与菌株9491的230kDa带反应(图8A)。在用Western印迹与预免疫抗血清或与已经用表达GST-SdrFA融合蛋白质的E.coli溶胞物吸附的抗-SdrFA抗血清反应时，这条带没有出现(图gA)。抗-SdrGA抗血清与表皮葡萄球菌菌株K28的裂解物中的170kDA带反应。在与预免疫抗血清或与已经用表达GST-SdrGA融合蛋白质的E.coli溶胞物吸附的抗-SdrGA抗血清反应时，这条带没有出现(图8B)。SdrHA的抗血清在菌株9491中识别出75kDa的带，这种反应性可通过用存在于E.coli溶胞物中的重组SdrH吸附抗血清来除去(图8C)。抗-SdrFA，-SdrGA和-SdrHA免疫反应带的表观分子量比从推导氨基酸序列推定的分子量(分别为179，97，和50kDa)要大。在SDS-PAGE上减少的移动已被解释为两种金黄色葡萄球菌Sdr蛋白质，ClfA和ClfB，其中观察到多达50％-100％的预计分子量增加。Sdr蛋白质的酸性属性建议用来解释这些观察结果。
在表皮葡萄球菌中SdrH分子量的不同
Western免疫印迹分析，不同菌株的表皮葡萄球菌含有具有不同表观分子量的SdrH，表观分子量在60到75kDa之间变化(图9A)。ClfA分子量的不同认为与SD重复区域的长度有关(15)。对从上面使用的表皮葡萄球菌菌株获取的SdrH基因的PCR分析显示，编码SD重复区域的DNA大小的不同与在Western印迹上SdrH蛋白质的分子量的不同有关。相反，编码每个SdrF区域C的DNA的PCR产物大小是相似的(图9B)。
在细胞壁提取物和原生质体中分析SdrF，SdrG和SdrH
在SdrF和SdrG中都存在LPXTG基元说明，这些蛋白质是锚定在细胞壁上的，因此这些蛋白质也存在于溶葡萄球菌酶处理的表皮葡萄球菌的细胞壁提取物中。在使用抗-SdrFA抗血清，进行稳定期早期的Western印迹分析中，溶葡萄球菌酶消化的表皮葡萄球菌菌株9491表现出，在完整细胞溶胞物和细胞壁提取物中都存在230kDa的SdrF带，但在原生质体部分中不存在(图10A)。相对照的是，在使用抗-SdrGA抗血清对同样样品进行的分析中表现出，在溶胞物和原生质体部分中存在着SdrG(170kDa)，但在细胞壁提取物中不存在(图10B)。在使用含有溶葡萄球菌酶处理的菌株K28的印迹时可以观察到相似的结果(未显示)。使用抗-SdrHA抗血清对9491溶葡萄球菌酶部分进行进一步分析，在细胞壁裂解物和原生质体部分中都显示出免疫活性带(图10C)。这些结果说明，在体外条件下，SdrF位于并锚定在细胞壁上，这些结果也说明SdrG(除了其LPXTG基元)和SdrH或者与细胞质膜相连或者位于细胞内部。
康复期患者SdrF，SdrG和SdrH的抗血清的反应性
目前，从金黄色葡萄球菌感染恢复的患者的IgG显示与纤连蛋白结合蛋白质(FnbpA)反应，这说明在感染期间金黄色葡萄球菌表达FnbpA(1)。这里，通过ELISA法，使用重组SdrF，SdrG和SdrH区域A蛋白质，测试从不同的表皮葡萄球菌感染中恢复的15名患者的抗血清中提纯的IgG的反应性。图11表示与从混合的儿童抗血清中提纯的IgG相比，患者抗血清的IgG具有对SdrFA，SdrGA和SdrHA较高的滴定度。患者的IgG常常对SdrGA和SdrHA比对SdrFA有更大的反应活性。这说明在表皮葡萄球菌感染期间Sdr蛋白质在人类中表达。
讨论
人类表皮葡萄球菌的感染与当引入患者体内时很快被基质蛋白质覆盖的外源体设备有关(26)。尽管已提出一些机理调节未被覆盖的聚合物表面的附着作用和生物膜形成，但调节被宿主蛋白质覆盖的表面的附着作用的具体因素还没有确定。在表皮葡萄球菌中存在Sdr蛋白质说明，表皮葡萄球菌可以与金黄色葡萄球菌相似的方式结合蛋白质-覆盖基质设备，即使用ClfA和ClfB调节与被血纤蛋白原覆盖的整形设备的附着作用(21，31)。在这方面，克隆的表皮葡萄球菌DNA表达的并与SdrG相似的重组蛋白质，已显示与血纤蛋白原结合(22)。
在不考虑初始附着的情况下，表皮葡萄球菌在致病过程中起到重要的作用。试验显示纤连蛋白结合的蛋白质，Fnbp从金黄色葡萄球菌的表面的蛋白酶解产生可溶的活性蛋白质，并切这种酶解作用已建议认为启动了金黄色葡萄球菌从固-相纤连蛋白的释放和分发(18)。类似地，在体外培养不存在蛋白酶抑制剂的条件下，天然的SdrF和SdrG经历快速降解(未公开观察结果)，这种蛋白酶解过程可提供细菌能从底物分离的机理。
通过溶葡萄球菌酶消化作用释放的细胞壁锚定蛋白质SdrF部分化，说明其存在于细胞表面。相反，SdrG，其含有LPXTG-与SdrF相似的细胞壁分类基元，发现只存在于原生质体部分中。在细胞壁部分中明显缺少SdrG可能受到细菌生长时期的影响，或受到蛋白酶在不同生长期期间表达的影响。如，在早期指数期中，在菌株K28的溶胞物中发现没有或减少的SdrG。此外，在大量生长到晚期稳定期的表皮葡萄球菌中确实在细胞壁提取物中含有SdrG，而其他菌株(包括K28和9491)只含有SdrG可能的降解产物(未公开结果)。有必要进一步研究以细化有关SdrG对细胞壁的锚定和在细胞表面定位的规则。同样地，也需要对有细胞壁蛋白质属性但缺少明显的LPXTG基元的SdrH的进行研究。
如上面所提及，与SdrG相似的蛋白质(称为Fbe)已确定为能结合血纤蛋白原的表皮葡萄球菌蛋白质(22)。据报道，Fbe有直接与SD重复区域相邻的区域A，但与其他B相似的结构没有描述。我们发现Fbe含有两个区域B重复单元，有99％的氨基酸与SdrG的区域B重复单元相同(未公开结果)。在报道的Fbe序列中，这些重复单元在氨基酸601开始在SD-重复单元开始处终止。Fbe的原始区域A报道在残基269到599间含有最小的血纤蛋白原结合区域。有关新确定的区域B重复单元，最小的血纤蛋白原结合区域会位于区域A的C-端尽头。这一点与在C-端含有最小血纤结合区域的ClfA相似(McDeitt，1995)。Fbe和SdrG的区域A在氨基酸序列上有93％相同，预计的最小结合区域有98％相同。
在八种所描述的Sdr蛋白质家族(金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)成员中SdrH是最独特的，因为它具有趋异推定域组织。在N-端SD-重复区域的位置，新型区域C，和缺少确定的细胞壁相关序列说明这种蛋白质在功能上不同于已知的SdrMSCRAMM。对SdrH的细菌定位和配体结合可能的进一步研究在进行中。
SdrF和SdrG的SD-重复区域代表了八种已知Sdr蛋白质中最长和最短的SD重复区域(分别为558和56个残基)。尽管SD-重复单元没有参与血纤蛋白原的结合，但功能ClfA表达的野生型标准发现需要含多于40个残基的SD重复区域(区域A末端的72个残基到LPXTG基元)。氨基酸的区域假定跨越细胞壁并产生功能区域A。尽管SdrG含有从区域B重复单元的末端到LPXTG基元的73个残基，但两个区域B重复单元也可能影响配体结合区域A的结构和功能。在SdrF中存在极大SD重复区域的用途还不了解。给定SD重复区域与细胞壁间的相互作用，SdrF和SdrG之间SD重复区域长度的不同可能与在这些蛋白质的细胞壁部分中观察到的定位的不同有关。在SdrH中SD重复单元长度的变化已作了描述。从KH11中获取的SdrH蛋白质(观察到最小的SdrH)通过DNA序列分析发现含有64个残基(未公开结果)。在SdrH中SD重复单元的作用还不了解，但我们推测这个区域，象其他Sdr蛋白质一样，可能部分地与细胞壁有关。
编码表皮葡萄球菌的Sdr蛋白质的基因存在于大多数目前测试的临床分离物中。这些菌株是从不同地理位置的患者中宽范围的疾病中分离获得。此外，从各种表皮葡萄球菌感染中恢复的患者在他们的抗血清中含有SdrF-，SdrG-和SdrH-反应性IgG。相似的特性也在报道的金黄色葡萄球菌的五种Sdr蛋白质中观察到[(8，17)未公开结果]。这些研究说明Sdr蛋白质在表皮葡萄球菌感染性及生长方面是重要的要素。有趣的是，与编码SD重复区域的DNA同源的位点在S.Haemolyticus，S.Lugdunensis，S.Intermedius和能在人类和其他动物中产生疾病的其他葡萄球菌菌株中也普遍存在(未公开结果)。
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Claims (38)

1.一种分离的核酸分子，其中，所述核酸分子编码SdrF、SdrG或者SdrH蛋白，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
2.依据权利要求1的分离的核酸，其中，所述核酸分子编码的蛋白质具有图2中所示的氨基酸序列。
3.依据权利要求1的分离的核酸，具有图2中所示的核酸序列。
4.依据权利要求1的分离的核酸，具有与图2中所示的核酸序列选择性杂交的序列。
5.一种载体，包含依据权利要求1的分离的核酸。
6.依据权利要求5的载体，在有生命的生物体中表达分离的核酸。
7.一种分离的核酸分子，其中，所述核酸分子编码SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A，所述的SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A具有图5中所示的相应的氨基酸序列，所述核酸分子编码SdrF的区域A对应于编码为157-2031的SdrF基因的SdrF蛋白质的氨基酸残基53-677；所述核酸分子编码SdrG的区域A对应于编码为151-1794的SdrG基因的SdrG蛋白质的氨基酸残基51-598；所述核酸分子编码SdrH的区域A对应于编码为编码为91-270的SdrH基因的SdrH蛋白质的氨基酸残基31-90。
8.依据权利要求7的分离的核酸，其中所述核酸所编码的蛋白质的氨基酸序列选自图2-4中所示氨基酸序列。
9.依据权利要求7的分离的核酸，包括选自图2-4中所示核酸序列。
10.依据权利要求7的分离的核酸，包括与选自图2-4中所示的核酸序列选择性杂交的序列。
11.一种载体，包含依据权利要求7的分离的核酸。
12.依据权利要求11的载体，在有生命的生物体中表达分离的核酸。
13.一种分离的、重组的或合成的Sdr蛋白质，所述蛋白质选自由SdrF、SdrG或者SdrH蛋白所构成的组，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
14.依据权利要求13的蛋白质，其中蛋白质具有图2中所示的氨基酸序列。
15.一种分离的、重组的或合成的蛋白质，所述蛋白质包含SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A，所述的SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A具有图5中所示的相应的氨基酸序列，所述核酸分子编码SdrF的区域A对应于编码为157-2031的SdrF基因的SdrF蛋白质的氨基酸残基53-677；所述核酸分子编码SdrG的区域A对应于编码为151-1794的SdrG基因的SdrG蛋白质的氨基酸残基51-598；所述核酸分子编码SdrH的区域A对应于编码为编码为91-270的SdrH基因的SdrH蛋白质的氨基酸残基31-90。
16.依据权利要求15的蛋白质，其中蛋白质的氨基酸序列选自图2-4中所示氨基酸序列。
17.依据权利要求15的蛋白质，编码所述蛋白质的核酸序列与编码图2-4中所示氨基酸序列的核酸序列杂交。
18.依据权利要求15的蛋白质，其在有生命的生物体中从载体表达，其中载体含有包括从图2-4中所示核酸序列组中选取的序列的核酸序列。
19.一种药物组合物，其中包含权利要求13的蛋白质以及药学上可接受的载体。
20.一种药物组合物，其中包含权利要求15的蛋白质以及药学上可接受的载体。
21.一种固定相，其中包含固定于其上的权利要求13的蛋白质。
22.一种固定相，其中包含固定于其上的权利要求15的蛋白质。
23.一种抗Sdr蛋白质的抗体和抗血清，其中所述的Sdr蛋白质选自由SdrF、SdrG或者SdrH蛋白所构成的组，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
24.一种抗蛋白质的抗体和抗血清，其中所述蛋白质包含SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A，所述的SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A具有图5中所示的相应的氨基酸序列，所述核酸分子编码SdrF的区域A对应于编码为157-2031的SdrF基因的SdrF蛋白质的氨基酸残基53-677；所述核酸分子编码SdrG的区域A对应于编码为151-1794的SdrG基因的SdrG蛋白质的氨基酸残基51-598；所述核酸分子编码SdrH的区域A对应于编码为编码为91-270的SdrH基因的SdrH蛋白质的氨基酸残基31-90。
25.一种包括Sdr蛋白质的诊断试剂盒，其中所述的Sdr蛋白质选自由SdrF、SdrG或者SdrH蛋白所构成的组，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
26.一种包括蛋白质的诊断试剂盒，其中所述蛋白质包含SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A，所述的SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A具有图5中所示的相应的氨基酸序列，所述核酸分子编码SdrF的区域A对应于编码为157-2031的SdrF基因的SdrF蛋白质的氨基酸残基53-677；所述核酸分子编码SdrG的区域A对应于编码为151-1794的SdrG基因的SdrG蛋白质的氨基酸残基51-598；所述核酸分子编码SdrH的区域A对应于编码为编码为91-270的SdrH基因的SdrH蛋白质的氨基酸残基31-90。
27.一种诊断试剂盒，其中包含与蛋白质反应的抗体，所述蛋白质选自由SdrF、SdrG或者SdrH蛋白所构成的组，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
28.一种诊断试剂盒，其中包含与蛋白质反应的抗体，所述蛋白质包含SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A，所述的SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A具有图5中所示的相应的氨基酸序列，所述核酸分子编码SdrF的区域A对应于编码为157-2031的SdrF基因的SdrF蛋白质的氨基酸残基53-677；所述核酸分子编码SdrG的区域A对应于编码为151-1794的SdrG基因的SdrG蛋白质的氨基酸残基51-598；所述核酸分子编码SdrH的区域A对应于编码为编码为91-270的SdrH基因的SdrH蛋白质的氨基酸残基31-90。
29.一种诊断试剂盒，其中包含核酸分子，所述核酸分子编码的蛋白质选自由SdrF、SdrG或者SdrH蛋白所构成的组，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
30.一种诊断试剂盒，其中包含核酸分子，所述核酸分子编码的蛋白质包含SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A，所述的SdrF、SdrG或者SdrH蛋白的区域A具有图5中所示的相应的氨基酸序列，所述核酸分子编码SdrF的区域A对应于编码为157-2031的SdrF基因的SdrF蛋白质的氨基酸残基53-677；所述核酸分子编码SdrG的区域A对应于编码为151-1794的SdrG基因的SdrG蛋白质的氨基酸残基51-598；所述核酸分子编码SdrH的区域A对应于编码为编码为91-270的SdrH基因的SdrH蛋白质的氨基酸残基31-90。
31.含有蛋白质的药物组合物在制备治疗凝固酶阴性葡萄球菌感染的药物中的应用，其中所述蛋白质选自由SdrF、SdrG、SdrH蛋白及其活性片段所构成的组，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
32.依据权利要求31的应用，其中的感染是败血症，骨髓炎或心内膜炎。
33.含有蛋白质的药物组合物在制备预防凝固酶阴性葡萄球菌感染的药物中的应用，其中所述蛋白质选自由SdrF、SdrG、SdrH蛋白及其活性片段所构成的组，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
34.含有抗蛋白质的抗体的药物组合物在制备预防凝固酶阴性葡萄球菌感染的药物中的应用，其中所述蛋白质选自由SdrF、SdrG、SdrH蛋白及其活性片段所构成的组，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
35.含有蛋白质的组合物在涂覆留置医疗设备中的应用，所述蛋白质选自由SdrF，SdrG，和SdrH，以及它们的片段所构成的组，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
36.依据权利要求35的应用，其中医疗设备从脉管移植体，脉管扩张器，静脉内导管，人造心脏瓣膜和助心设备中选取。
37.含有蛋白质的药物组合物在制备诱导患者免疫反应的药物中的应用，其中所述蛋白质选自由SdrF、SdrG、SdrH蛋白及其活性片段所构成的组，SdrF蛋白的氨基酸序列如图2所示，SdrG蛋白的氨基酸序列如图3所示，SdrH蛋白的氨基酸序列如图4所示。
38.一种鉴别抑制凝固酶阴性葡萄球菌化合物的方法，包括将化合物与含有从SdrF，SdrG，和SdrH蛋白质组中选取的蛋白质混合，测定蛋白质与结合分子的结合，其中如果与结合分子的结合被抑制那么化合物就抑制凝固酶阴性葡萄球菌。
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