CN1314450C - 多组分疫苗 - Google Patents

Abstract

提供协助预防和治疗葡萄球菌感染的多组分疫苗，其包括细菌结合蛋白质或其片段，或这些蛋白质或片段的抗体的某些选取的组合。通过仔细选取蛋白质，片段，或抗体，提供一种疫苗给予抵抗宽范围葡萄球菌菌株的保护和抵抗在对数生长曲线的不同阶段表达的蛋白质的保护。在本发明的一个实施方案中，提供一种组合物包括至少胶原结合蛋白质或肽(或其适当的位点定向突变序列)如CNA，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段，和血纤蛋白原结合蛋白质，较好的是丛生因子A(C1fA)或丛生因子B(C1fB)，或其有用片段，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段。本发明的疫苗和产品的优势在于它们反映了医学界对小分子抗体的替代物的迫切需要，其会快速失去效力，并提供大量以已知细菌表面附着因子的有效组合，能给予抵抗宽范围细菌感染的有效保护。

Description

多组分疫苗

本发明的完成部分源于美国农业部No.97-35204-5046拨款的支持。美国政府拥有本发明的某些权利。

本发明涉及治疗和诊断细菌感染的生物制品。

本发明的背景

葡萄球菌是革兰氏阳性球状细胞，通常以葡萄状不规则簇排列。一些葡萄球菌是人类粘膜和皮肤的正常菌群成员，而其他的会引起化脓，脓肿，及多种化脓感染，甚至会引起致命的败血症。致病的葡萄球菌常常使红细胞溶解，血浆凝固并产生大量细胞外酶和毒素。最常见的食物中毒是由热稳定的葡萄球菌肠毒素引起的。

葡萄球菌至少有30种。临床上很重要的三个主要品种是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)。金黄色葡萄球菌是凝固酶阳性的，这一点使它与其他品种区分开来。金黄色葡萄球菌是人类主要的致病菌。一生中几乎每个人会经历一些种类的金黄色葡萄球菌感染，严重程度从食物中毒或轻度皮肤感染到严重危及生命的感染。凝固酶阴性葡萄球菌是常见的有时引起感染的人类菌群，并常常与植入装置有关，特别在很年轻，年老及免疫系统损害的患者中。由凝固酶阴性葡萄球菌引起的感染中约75％是由表皮葡萄球菌引起的。由Staphylococcus warneri，Staphylococcus hominis及其他品种引起的感染较少见。在年轻的妇女中腐生葡萄球菌是相对常见的尿道感染病因。葡萄球菌产生过氧化酶，这一点使其与链球菌区别开来。

在关节腔内关节软骨(其中胶原是主要组分)上金黄色葡萄球菌的定居，可认为是促使浓毒性关节炎发展的重要因素。血流扩散细菌关节炎一直是严重的医学问题。这种发展快速并高度破坏性的关节疾病很难以根除。通常，不到50％的感染患者不能在没有严重关节损伤的情况下恢复。金黄色葡萄球菌是从患有血流扩散及二级骨髓炎的患者中分离出来的主要病原体。

在住院治疗患者中，葡萄球菌类细菌如金黄色葡萄球菌是感染的主要原因。伤口或留置医疗设备的初始局部感染能导致更严重的侵入性感染如败血症，骨髓炎，乳腺炎和心内膜炎。在与医疗设备有关的感染中，塑料和金属表面在移植后很短时间后就会被宿主血浆和基质蛋白质如血纤蛋白原和纤连蛋白覆盖。金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌类细菌能与这些蛋白质附着对感染的开始是很重要的。脉管移植体，静脉内导管，人造心脏瓣膜和助心设备会形成血栓并易于细菌定居。对于葡萄球菌类细菌，金黄色葡萄球菌通常是这种感染最具损伤性的病原体。

在金黄色葡萄球菌分离物中表现出对目前用来治疗感染的大多数抗体的耐药性的显著增长已在世界性范围的医院中观察到。青霉素对抗金黄色葡萄球菌的发展是对感染控制可治疗方面最大的进步。不幸的是，对青霉素有耐药性的生物体迅速出现，需要新型抗体是极为重要的。每当各种新型抗生素一出现，金黄色葡萄球菌就能以β-内酰胺酶抵抗，改变青霉素结合蛋白质，和突变的细胞膜蛋白质使得细菌可以具有抗性。因此，耐新青霉素I-金黄色葡萄球菌(MRSA)和具有多药抗药性的生物体已出现并在全世界的医院和看护房中有了立足之处(Chambers，H.F.，临床微生物学评述，1：173，1988；Mulligan，M.E.，等人Am JMed，94：313，1993)。今天，几乎半数的引发医院性感染的葡萄球菌菌株对除了万古霉素外所有的抗生素都有了耐药性，并且万古霉素也变成无效药物只是时间问题。

因此，强烈并快速增长地需要治疗葡萄球菌如金黄色葡萄球菌引发的感染的，并能有效对抗那些对抗生素有抗药性的细菌菌株的治疗法。美国国家健康研究所最近已指出，这个目标是当前国家最优先考虑的事。

                    MSCRAMM

当特异微生物表面附着因子，称为MSCRAMM(微生物表面组成识别附着基质分子)特异地识别并与细胞外基质(ECM)组成如纤连蛋白，血纤蛋白，胶原和弹性蛋白结合时，细菌对宿主组织的附着出现。已显示有许多致病细菌特异识别并以认为是代表宿主组织定居机理的相互作用方式与ECM的不同组成结合。这种附着作用包括细菌蛋白质组，称为MSCRAMM(Patti，J.，等人微生物学年刊，48：585-617，1994；Patti，J.，和Hook，M.，细胞生物学的当前观点，6：752-758，1994)。

在细菌细胞表面的MSCRAMM和宿主组织内配体以锁与钥匙方式相互作用产生细菌对宿主的附着作用。附着是细菌存活所需的，并帮助细菌逃避宿主防御机理和抗生素的威胁。一旦细菌成功地附着并定居在宿主组织上，它们的生理学会有巨大的改变，并分泌出损伤性组成如毒素和酶。并且，附着细菌常常产生生物膜并迅速对大多数抗生素的杀伤作用的有抵抗性。

细菌能表达识别不同基质蛋白质的MSCRAMM。在MSCRAMM中的配体结合位点被认为是由相当短的氨基酸序列(基元)邻接链限定的。因为在几种不同的细菌种类中可发现相似的基元，所以似乎这些功能基元是可以进行种类间转移(Patti，J.，和Hook，M.，细胞生物学的当前观点，6：752-758，1994)。此外，有时单一MSCRAMM可以与几种ECM配体结合。

                接种疫苗研究

历史上，对细菌附着的研究主要集中在革兰氏阴性细菌上，其在它们的细胞表面表达多种菌毛附着蛋白质(称为附着因子)(Falkow，S.，细胞，65：1099-1102，1991)。这些附着因子识别暴露在宿主细胞表面(特别是上皮层)的特异糖缀合物。在附着中使用类-凝集素结构使得微生物有效地定居在上皮表面。这提供给细菌很好的复制场所，并提供散布到邻近宿主组织的机会。已有论证说明使用菌毛附着因子免疫接种能产生对微生物攻击的保护，如在南美栗鼠模式中引起中耳炎的流感嗜血菌(Hemophilus influenza)(Sirakova等人，感染免疫，62(5)：2002-2020，1994)，在试验诱导感染性牛角膜结膜炎中的摩拉克氏菌(Moraxella bovis)(Lepper等人，Vet.微生物学，45(2-3)：129-138，1995)，诱导兔子中痢疾的E.Coli(McQueen等人，疫苗，11：201-206，1993)。在多数情况中，用附着因子免疫接种产生免疫抗体，通过抑制细菌附着和定居，以及增强对细菌的调理吞噬作用及依赖抗体的补体调节杀伤作用来预防感染。

使用调节致病微生物与宿主组织组成附着的分子作为疫苗组成作为发展未来疫苗的一个重要步骤出现。因为细菌附着作用是多数感染发展的至关重要的第一步，所以对于发展新型疫苗它是有吸引力的目标。对MSCRAMM和宿主组织组成间在分子水平上的相互作用的越来越多的了解加上重组DNA技术中的新技术，为新型的亚单位疫苗的产生打下了基础。MSCRAMM的全域或特异域，天然形式的或位点特异改变形式的，现在都能制备。并且，能从不同的微生物体混合并匹配MSCRAMM产生了设计单一疫苗防护多种细菌的可能性。

目前使用新型亚单位疫苗治疗哮喘性咳嗽的临床试验，其中除了灭活和百日咳毒素外还包括提纯的百日咳杆菌(Bordatellapertussis)MSCRAMM丝状红血球凝聚素和百日咳肌动蛋白，是这种方法一个重要的成功实例。几种新型非细胞疫苗已显示是安全的并且比含有完整细菌细胞的旧式疫苗更有效(Greco等人，N Eng J Med，334：341-348，1996；Gustaffson等人，N Eng J Med，334：349-355，1996)。

对金黄色葡萄球菌的自然免疫一直了解的很少。通常，健康的人和动物表现出对金黄色葡萄球菌的先天性的高度抵抗力。防护作用是由于完整的上皮及粘膜阻碍层和正常的细胞和体液反应。严重感染后抗体对金黄色葡萄球菌组成的滴定度提高(Ryding等人，医药微生物期刊，43(5)：328-334，1995)，然而，至今也没有在抗体滴定度和人类免疫之间相关的血清学上的证据。

在过去的几十年中，金黄色葡萄球菌细胞的活的，热致死的，以及福尔马林固定的制备品已作为预防葡萄球菌感染的疫苗进行了测试。多中心临床试验设计用来研究商业疫苗对包括腹膜炎，出口部位感染，和连续腹膜透析患者中的金黄色葡萄球菌鼻架的作用，疫苗包括葡萄球菌类毒素和完全杀死的葡萄球菌素(Poole-Warren等人，Clin Nephrol.，35：198-206，1991)。尽管用疫苗免疫接种得到增加量的对金黄色葡萄球菌的特异抗体，但对腹膜炎的影响没有作用。同样地，用金黄色葡萄球菌全细胞对兔子的免疫接种不能防护或改变试验性心内膜炎发展的任何阶段，不能减缓肾脏脓肿的影响或降低在感染肾脏中细菌的量(Greenberg，D.P.，等人，感染免疫，55：3030-3034，1987)。

目前还没有FDA认可的防护免受金黄色葡萄球菌感染的疫苗。然而，金黄色葡萄球菌疫苗(StaphVAX)，基于荚膜多糖的，目前正由NABI(北美生物有限公司)发展。这种疫苗包括与假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(rEPA)缀合的5型或8型类荚膜多糖。这种疫苗设计用来诱导类型-特异调理素抗体及增强调理吞噬作用(Karakawa等人，感染免疫，56：1090-1095，1988)。使用精细致死攻击鼠模式(Fattom等人，感染免疫，61：1023-1032，1993)，其显示5型荚膜多糖特异IgG的腹膜内给药降低了腹膜内用金黄色葡萄球菌接种的鼠的死亡率。5型荚膜多糖-rEPA疫苗已用来免疫接种17位患有终期肾病的患者(Welch等人，J Amer Soc Nephrol，7(2)：247-253，1996)。在第一次免疫接种后，5型缀合物的几何平均(GM)IgG抗体量增加13到17倍，然而，对于以后的注射，都不能检测到额外的增加。有趣的是，免疫接种患者几何平均IgM的量显著地低于对照个体。这一点得到动物研究的支持，目前该疫苗已在连续非固定的腹膜透析患者中完成了II阶段试验。临床试验显示疫苗是安全的，但对预防葡萄球菌感染效率很低(NABI SEC FROM10-K405，12/31/95)。对StaphVAX不能在疫苗接种患者中防护免受与腹膜透析有关的感染的两种可能的解释是，由于未达最佳标准的疫苗剂量，疫苗的免疫原性太低，或血流中的抗体不能影响某些解剖学上的区域的感染，如腹膜。

与革兰氏阳性细菌有关的脓血症在增加。事实上，全部脓血症病例的三分之一或一半是由革兰氏阳性细菌引起的，具体地有金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。在美国，估计今年有200,000患者会患与革兰氏阳性细菌有关的脓血症。

使用鼠模式(Bremell等人，感染免疫，59(8)：2615-2632，1991)，已明确论证用Col-结合MSCRAMM的M55域免疫接种能保护鼠免于脓血症导致的死亡。将鼠用M55或对照抗原(牛血清清蛋白)皮下免疫，然后用金黄色葡萄球菌静脉内攻击。83％的用M55免疫的鼠(35/42)存活，相比之下，用BSA免疫的鼠只有27％(12/45)的存活。这是3个独立研究的数据汇编。

Schennings等人证实用从金黄色葡萄球菌获得的纤连蛋白结合蛋白质免疫接种可防护田鼠免于试验性心内膜炎(微观病理学。15：227-236，l993)。田鼠用融合蛋白(gal-FnBP)免疫，融合蛋白(GAL-FnbP)包括β-牛乳糖和从金黄色葡萄球菌获得的决定与纤连蛋白结合的纤连蛋白-结合蛋白质的域。融合蛋白gal-FnBP的抗体显示在体外可阻断金黄色葡萄球菌与免疫的纤连蛋白的结合。在免疫的或未免疫的对照田鼠中，由经颈动脉插入的导管诱导心内膜炎，产生损伤的大动脉心脏瓣膜，心脏瓣膜覆盖着血纤蛋白原和纤连蛋白。然后将插入导管的田鼠用1×10⁵个金黄色葡萄球菌细胞静脉内感染。在感染攻击11/2天后，确定与大动脉瓣膜结合的细菌数量，然后观察到在免疫组和未免疫组之间细菌数量显著不同。

Mamo等人使用鼠乳腺炎模式(疫苗，12：988-992，1994)研究用在金黄色葡萄球菌获得的血纤蛋白原结合蛋白质(特别是FnBP-A)和胶原结合蛋白质疫苗接种对金黄色葡萄球菌攻击感染的影响。与对照鼠相比，用血纤蛋白原结合蛋白质疫苗接种的鼠显示降低的乳腺炎发病率。对受到攻击的鼠乳腺的总的测试显示，与对照鼠的腺体相比，用血纤维结合蛋白质免疫的鼠的腺体发展轻微的乳房内感染或没有病理学上的变化。与对照鼠相比，显著减少的细菌数量可能在从用血纤维结合蛋白质免疫的鼠获得的腺体中收复。然后Mamo发现，用FnBP-A和葡萄球菌α类毒素疫苗接种没有改进防护作用(Mamo等人，疫苗，12：988-992，1994)。接着，Mamo等人只用胶原结合蛋白质免疫鼠，其没有诱导对金黄色葡萄球菌攻击感染的防护作用。

在对进行腹膜透析的人的免疫研究中，包括了完全杀死的葡萄球菌(Poole-Warren等人，Clin.Nephrol，35：198-206，1991)。在这项临床试验中，购得的α-溶红血球素类毒素与完全杀死的细菌的悬浮液混合并经12个月肌肉内用药10次，对照患者只注射盐水。疫苗接种在腹膜液体中产生显著增加量的金黄色葡萄球菌的抗体，在血清中产生显著增加量的α-溶红血球素的抗体。然而，免疫接种没有在疫苗受体中减小腹膜炎，与导管有关的感染，或鼻内定居的发病率。在这项试验中缺少防护有效性是由于未达最佳标准的疫苗配方。

分泌性蛋白质已用作亚细胞疫苗的组分。α-毒素是最有效的葡萄球菌外毒素之一；它具有细胞溶解活性，能诱导组织坏死并杀死试验动物。用甲醛解毒的α-毒素免疫接种没有防护动物免于系统性或局部感染，尽管它能降低感染的临床严重性(Ekstedt，R.D.，葡萄球菌素，385-418，1972)。

有一项研究在葡萄球菌感染的试验模式中评定了金黄色葡萄球菌微荚膜的抗体的防护有效性(Nemeth，J.和Lee，J.C.，感染免疫，63：375-380，1995)。将鼠用杀死的，微荚膜化细菌主动免疫，或用对荚膜多糖特异的高滴定度兔抗血清被动免疫。对照动物用盐水注射，或用正常兔血清被动免疫。然后评定对用相同菌株静脉内攻击导致的导管诱导心内膜炎的防护作用。尽管抗荚膜抗体的量已增加，但免疫接种的动物易得葡萄球菌心内膜炎，免疫接种的和对照动物在血液中含有相似量的细菌。

如在本文下面本发明的详细描述中所描述的，许多专利和专利申请描述了纤连蛋白，血纤蛋白原，胶原，弹性蛋白和MHC II类似型结合蛋白质的基因序列。这些专利和专利申请的全文都通过在此引述而合并于本文。这些文献公开了蛋白质，片段，或与这些蛋白质或片段免疫反应的抗体可用在治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗接种中。PCT/US97/087210公开了用胶原结合蛋白质(M55片段)，纤连蛋白结合蛋白质(福尔马林处理的FnBP-A(D1-D3))和血纤蛋白原结合蛋白质(ClfA)的组合物疫苗对鼠的免疫。

迄今所看到的上述疫苗对葡萄球菌感染缺少充分的防护作用，可能是没有产生适当的免疫反应，及不适当的免疫方案或不适当的免疫途径的结果。其他也会导致过去的疫苗很差性能的因素可在下面的事实中反映出来，即，已观察到葡萄球菌如金黄色葡萄球菌可通过调节基因位点agr和sar暂时调节其大部分毒性因子的表达。如，金黄色葡萄球菌含有编码细胞表面血纤蛋白原结合蛋白质的两个基因，ClfA和ClfB。有趣的是，ClfA主要在指数生长早期表达，而ClfB在生长期晚期表达。因此，在体内入侵生物体提呈给宿主的抗原与使用在疫苗中的抗原可能不同。此外，不是每个金黄色葡萄球菌抗原在每个分离物中表达。如只有约50％的金黄色葡萄球菌临床分离物表达基因cna，该基因编码胶原结合MSCRAMM。为了产生对金黄色葡萄球菌有效的免疫治疗，疫苗必须是多组分的，含有跨越细胞生长期的抗原，并包括由多数金黄色葡萄球菌分离物表达的抗原。

尽管在用来治疗由葡萄球菌如金黄色葡萄球菌引起的感染的组合物方面有很多进展，但仍然需要提供一种更有效的产品，较好的是一种表现对不同葡萄球菌菌株的宽范围免疫作用的蛋白质，具体地是对在细菌生长期的不同阶段表达的蛋白质的有免疫作用的蛋白质。

因此，本发明的一个目的是提供一种新型对葡萄球菌如金黄色葡萄球菌引起的感染有免疫作用的治疗组合物。

本发明的另一个目的是提供一种疫苗，疫苗能提供对乳腺炎，关节炎，心内膜炎，败血症和骨髓炎，疖病，蜂窝织炎，脓血症，肺炎，脓皮病，伤口化脓，食物中毒，膀胱感染和其他感染性疾病的防护作用。

本发明的另一个目的是提供对葡萄球菌感染免疫的，增强细胞间葡萄球菌杀死量的，增加对葡萄球菌的吞噬速度的治疗组合物。

本发明的另一个目的是提供通过中和外毒素进一步防护宿主的组合物。

本发明的概述

已发现对葡萄球菌感染的治疗作用可通过用细菌结合蛋白质或其片段，或这些蛋白质或其片段的抗体的某些选定组合免疫接种来显著增强。蛋白质或片段能使用在主动疫苗中，抗体可使用在被动疫苗中。可替换地，这些组合可用来选择供体血库以制备用来被动免疫的血液制品。通过对蛋白质，片段，或抗体的仔细挑选，提供了传递抗广范围葡萄球菌菌株及抗在对数生长曲线的不同阶段表达的蛋白质的防护作用的疫苗。

本文所描述的疫苗和产品响应了医学界对快速失去效用的小分子抗生素的替代物的迫切需要。本发明的疫苗比先有技术有显著的改善，先有技术虽然教导了使用MSCRAMM传递免疫，但没有教导在大量已知MSCRAMM中的哪种组合可产生出众的防护作用。

在本发明的一个实施方案中，提供了这样一种组合物，其至少包括胶原结合蛋白质或肽(或其适当位点定向突变序列)如CNA，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段，结合血纤蛋白原结合蛋白质，较好的是丛生因子A(ClfA)或丛生因子B(ClfB)，或其有用的片段或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段。

在本发明的另一个实施方案中，提供了这样一种组合物包括与胶原结合蛋白质的胶原结合域结合的并抑制所说的胶原结合蛋白质与胶原结合的抗体，和与血纤蛋白原结合蛋白质的血纤蛋白原结合域结合的并抑制所说的血纤蛋白原结合蛋白质与血纤蛋白原结合的抗体；所述胶原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的M55；所述血纤蛋白原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的ClfA。

该组合物进一步包括与纤连蛋白结合蛋白质的纤连蛋白结合域结合的并抑制所说的纤连蛋白结合蛋白质与纤连蛋白结合的抗体；所述纤连蛋白结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的DUD4。

本发明的另一个实施方案包括该组合物在制备抑制微生物在动物中定居药物中的应用。

本发明的另一个实施方案中，提供一种疫苗，包括免疫有效量的胶原结合蛋白质的胶原结合域，和血纤蛋白原结合蛋白质的血纤蛋白原结合域，和药物可接受的载体或赋形剂；所述胶原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的M55；所述血纤蛋白原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的ClfA。

该疫苗进一步包括纤连蛋白结合蛋白质的纤连蛋白结合域；所述纤连蛋白结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的DUD4。

本发明的另一个实施方案包括该疫苗在制备抑制微生物在动物中定居药物中的应用。

本发明的另一个实施方案中，提供一种含免疫有效量的肽组合物的药物组合物在制备使动物产生免疫反应药物中的应用，其中所述肽组合物包括胶原结合蛋白质的胶原结合域和血纤蛋白原结合蛋白质的血纤蛋白原结合域；所述胶原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的M55；所述血纤蛋白原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的ClfA。

其中所述肽组合物进一步包括纤连蛋白结合蛋白质的纤连蛋白结合域；所述纤连蛋白结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的DUD4。

本发明的另一个实施方案中，提供一种疫苗，包括药物可接受的含编码胶原结合蛋白质的核酸，和编码血纤蛋白原结合蛋白质的核酸，和药物可接受的载体或赋形剂的配方；所述胶原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的M55；所述血纤蛋白原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的ClfA。

该疫苗进一步包括编码纤连蛋白结合蛋白质的核酸；所述纤连蛋白结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的DUD4。

在本发明的另一个实施方案中，提供了这样一种组合物，其至少包括纤连蛋白结合蛋白质或肽(或其适当位点定向突变序列)，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段，结合血纤蛋白原结合蛋白质，较好的是A或B(分别为ClfA或ClfB)，或其有用的片段或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段。

在第三个实施方案中，提供了这样一种组合物，其至少包括血纤蛋白原结合蛋白质A(ClfA)和血纤蛋白原结合蛋白质B(ClfB)，或其有用的片段或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段。

在第四个实施方案中，提供了这样一种组合物，其至少包括纤连蛋白结合蛋白质或肽(或其适当位点定向突变序列)，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段，结合血纤蛋白原结合蛋白质A和B(ClfA和ClfB)，或其有用的片段或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段；和(ii)胶原结合蛋白质或其有用的片段。

在另一个实施方案中，提供了这样一种组合物，其包括前面实施方案的组分，以及弹性蛋白结合蛋白质或肽或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段。

在另一个实施方案中，提供了这样一种组合物，其包括前面实施方案中的组分，以及MHC II类似蛋白质或肽或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段。

在另一个实施方案中，提供了这样一种组合物，其包括任何前述组合中的组分，以及增加对葡萄球菌吞噬速度的细菌组分。在一个这样的实施方案中，细菌组分包括荚膜多糖，如荚膜多糖5型和8型。

在另一个实施方案中，提供了这样一种组合物，其包括任何前述组合中的组分，以及细胞外基质结合蛋白质SdrC，SdrD，SdrE或共有序列或可变序列氨基酸基元，或其有用的片段或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段。

在另一个实施方案中，提供了这样一种组合物，其包括任何前述组合中的组分，以及细胞外基质结合蛋白质SdrF，SdrG，SdrH，或共有序列或可变序列氨基酸基元，或其有用的片段或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段。这个实施方案在发展用于凝固酶阴性葡萄球菌和凝固酶阳性葡萄球菌的疫苗中特别有效。

在另一个实施方案中，提供了这样一种组合物，其至少包括细胞外基质结合蛋白质SdrC，SdrD，SdrE或其有用的片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段。

另外，还提供了这样的一些组合物，其包括对所描述组分的选择组合免疫反应的单克隆或多克隆抗体。这些组合物可用在治疗由葡萄球菌感染的蛋白质的疫苗中。

在本发明的其他实施方案中，所描述的蛋白质，片段或抗体的组合使用在诊断试剂盒中。

如下面所描述的，使用在组合物中与血纤蛋白原，纤连蛋白，胶原，及弹性蛋白结合的蛋白质和肽是已知的。可替换地，人们可确定新型纤连蛋白，血纤蛋白原，胶原，及弹性蛋白结合蛋白质，或其抗原表位以使用在这些组合物中。鉴别与选取配体结合的结合蛋白质的结合域的肽的方法是已知的。如，人们可以在使得配体与结合蛋白的结合区域有效结合的条件下，将候选蛋白质或肽与配体接触，确定与配体结合的阳性候选肽。

与组合物蛋白质或肽的结合区域结合的抗体可通过给动物服用药物组合物产生，该药物组合物包括免疫有效量的蛋白质或肽的组合，即使肽不与ECM特异结合。

分离的，重组的或合成的MSCRAMM蛋白质，或其活性片段或其融合蛋白质的组合，也可用作科学工具来鉴别宿主ECM分子上的葡萄球菌结合位点，从而促进对细菌病理学机理的理解和抗细菌治疗的发展。并且，分离的，重组的或合成的蛋白质，或其抗原部分(包括携带抗原表位片段)，或其融合蛋白质可作为免疫原或抗原给动物服用，单独服用或与辅剂结合服用，以制备与MSCRAMM蛋白质反应的抗血清。此外，蛋白质可用来筛查可从中获得对蛋白质具有很高亲和力抗体的超免疫患者的抗血清。从抗血清中分离的抗体可用来特异检测葡萄球菌或结合蛋白质，也可用作研究工具，或用作对葡萄球菌感染的治疗工具。

蛋白质，或其活性片段，及蛋白质的抗体可用在凝固酶阴性葡萄球菌细菌感染的治疗和诊断中，如上面描述的金黄色葡萄球菌，或用来发展主动或被动免疫的抗-凝固酶阴性葡萄球菌疫苗。并且，当在体内或体外作为药物组合物给伤口服用或用来覆盖医疗设备或聚合生物物质时，蛋白质和抗体都用作阻断剂，与预防或抑制凝固酶阴性葡萄球菌与伤口或生物物质的结合。

较好地，抗体是修饰的，这样在服用抗体的患者体内其具有较小的免疫原性。如果患者是人，抗体可通过将杂交瘤衍生的抗体的互补体决定区域移植到人的单克隆抗体中“人化”，如在Jones等人，自然321：522-525(1986)中或Tempest等人生物技术9：266-273(1991)中所描述的。

本发明提供了用作诊断试剂来检测葡萄球菌感染的试剂盒。依据另一个实施方案，本发明的抗-MSCRAMM抗体和MSCRAMM多肽用作诊断试剂来检测由葡萄球菌引起的感染，因为多肽能与动物体内产生的抗体分子结合，包括受葡萄球菌如金黄色葡萄球菌感染的人，抗体还能与具体的葡萄球菌或其抗原结合。

试剂盒可包括诊断试剂，还包括使用说明和其他适当的试剂。试剂盒还包括评定检测产品的装置，如颜色表，数字参比表。多肽或抗体可用当与抗体结合时能检测MSCRAMM多肽的检测装置标记，或当与葡萄球菌结合时能检测抗-MSCRAMM多肽抗体的检测装置标记。

检测装置可以是荧光标记试剂如异氰酸荧光素(FIC)，异硫氰酸荧光素(FITC)等，酶如辣根过氧化物酶(HRP)，葡萄糖过氧化物酶等，能产生γ射线的放射性元素如¹²⁵I或⁵¹Cr，或放射正电子的放射性元素，其遇到测试溶液中的电子时产生γ射线，如¹¹C，¹⁵O，或¹³N。检测装置的连接在此领域中是众所周知的。如杂交瘤产生的单克隆抗-MSCRAMM多肽抗体分子可通过在培养基中掺入含放射性同位素氨基酸代谢标记。或多肽可通过活性功能基团与检测装置缀合或偶合。

本发明的诊断试剂盒可用来检测体液样品中如血清，血浆或尿液中葡萄球菌或抗-葡萄球菌抗体的存在量。因此，在较好的实施方案中，本发明的MSCRAMM多肽或抗-MSCRAMM多肽抗体组合物通常通过与水溶介质的吸附作用与固态支持体结合。有用的固态基质在此领域中是众所周知的，包括交联的右旋糖苷；琼脂糖；聚苯乙烯；聚氯乙烯；交联的聚丙烯酰胺；硝化纤维或尼龙基物质；试管，板或微量滴定板的壁。本发明的多肽或抗体可作为溶液形式的诊断试剂，或作为充分干燥的粉末，如冻干形式。

本发明示图的简单描述

图1是使用在例证性疫苗，MSCRAMM IV中的肽的示意图。图中显示胶原结合MSCRAMM CAN，血纤蛋白原结合MSCRAMM ClfA，血纤蛋白原结合MSCRAMM ClfB和纤连蛋白结合MSCRAMM FnBPA蛋白质的重要特征。MSCRAMM分区域表示，说明表达为重组蛋白质并用来在用MSCRAMM IV免疫接种的兔子中产生抗体。所有蛋白质用氨基末端组氨酸标记设计以便于通过金属螯合色谱法提纯。

图2是随着对MSCRAMM CAN，ClfA，ClfB和FnBPA的抗体滴定度的变化在MCSRAMM疫苗接种的恒河猴中的免疫反应的时间过程图，通过ELISA分析滴定度，并随着初始免疫接种抗原后六个月期间每个星期中的吸光度(定量在405nm)的变化来测量滴定度。

图3演示了编码从表皮葡萄球菌获取的SdrF基因的核酸序列和由其编码的氨基酸序列。

图4演示了编码从表皮葡萄球菌获取的SdrG基因的核酸序列和由其编码的氨基酸序列。

图5演示了编码从表皮葡萄球菌获取的SdrH基因的核酸序列和由其编码的氨基酸序列。

本发明的详细描述

提供了适于用作疫苗的组合物，其至少包括：

(i)胶原结合蛋白质，肽或域(或其适当位点定向突变序列)如CNA，或与其具有充分高度同源性的蛋白质，片段或域，结合血纤蛋白原结合蛋白质，较好的是丛生因子A(ClfA)或丛生因子B(ClfB)，或其有用的片段或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段；

(ii)纤连蛋白结合蛋白质或肽(或其适当位点定向突变序列)，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段，和血纤蛋白原结合蛋白质A和B(ClfA和ClfB)，或其有用的片段或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段；或

(iii)血纤蛋白原结合蛋白质A(ClfA)和血纤蛋白原结合蛋白质B(ClfB)，或其有用的片段或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段；或

(iv)纤连蛋白结合蛋白质或肽(或其适当位点定向突变序列)，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段，结合血纤蛋白原结合蛋白质A和B(ClfA和ClfB)，或其有用的片段或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段；以及胶原结合蛋白或其片段，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段；

(v)任何前面实施方案的组分，以及弹性蛋白结合蛋白质或肽或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段；或

(vi)任何前面实施方案中的组分，并结合MHC II类似蛋白质或肽或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段；或

(vi)任何前面实施方案中的组分，并结合增加对葡萄球菌如金黄色葡萄球菌吞噬速度的细菌组分；或

(vii)任何前面实施方案中的组分，并结合细胞外基质结合蛋白质SdrC，SdrD，或SdrE或其有用的片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段；或

(viii)任何前面实施方案中的组分，并结合细胞外基质结合蛋白质SdrF，SdrG，或SdrH，或其有用的片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段，这样，从所说的组分中产生的疫苗也可用来免疫患者抵抗凝固酶阴性细菌如表皮葡萄球菌以及凝固酶阳性细菌如金黄色葡萄球菌的感染；或

(ix)细胞外基质结合蛋白质SdrC，SdrD，和SdrE或其有用的片段，如共有序列或可变序列氨基酸基元，或与其具有充分高度同源性的蛋白质或片段。

从野生或天然产生的变体中分离的蛋白质片段，或从与野生，天然产生的变体，或与结合蛋白质的天然产生的结合区域不对应的引入突变相对应的合成的和重组的肽也可使用在这些实施方案中。

分离的肽应有足够长度，以能产生与分离的肽和结合区域都结合的，并阻断结合蛋白质与其配体结合的抗体。在某些情况中，较好地肽包括至少约5个，约6个，约7个，约8个，约9个，约10个，约11个，约12个，约13个，约14个，约15个，约16个，约l7个，约18个，约19个，约20个，约22个，约24个，约25个，约30个，约35个，约40个，约45个，或约50个邻接氨基酸。本发明其他较好的情况中，分离的肽包括至少约6个结合区域的野生序列中的邻接氨基酸。

在本发明的一个方面，分离的肽或抗体组合物用来在动物中产生免疫反应。在这个方面，组合物较好地进一步包括辅剂。许多已知的辅剂可使用在疫苗中并很容易配合组合物。分离的肽或蛋白质组合物较好地分散在药物可接受的赋形剂中。

分离的肽可与选取的氨基酸序列结合以制备融合蛋白质。作为一个非限制性实施例，融合蛋白质可制备包括至少与选取的氨基酸序列实施结合的结合蛋白质的结合区域的基肽。在一个实施方案中，如果肽是纤连蛋白结合区域，那么基肽不与纤连蛋白特异结合。在较好的情况中，基肽与选取的载体分子或氨基酸序列，包括但不限于匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)和牛血清清蛋白(BSA)结合。

免疫组合物，包括疫苗，以及其他含有选取的MSCRAMM蛋白质和编码如MSCRAMM蛋白质的DNA的药物组合物都被包括在本发明的范围内。使用此领域中的技术人员对疫苗已知的方法和物料，结合蛋白质，或其活性或抗原片段，或其融合蛋白质的组合可配制及包装，单独或与其他抗原组合物配制及包装。免疫反应可作治疗或预防应用，提供抗体免疫或细胞免疫，如由T淋巴细胞如细胞毒素T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞产生的免疫。

疫苗可制备用在主动及被动免疫接种中。较好地，抗原物质广泛地透析以除去不需要的小分子量分子，和/或冻干更方便配制到所需载体中。

I.定义

本文所定义的FnBP-A，FnBP-B蛋白质，ClfA蛋白质，ClfA蛋白质，SdrC蛋白质，SdrD蛋白质，SdrE蛋白质，SdrF蛋白质，SdrG蛋白质，SdrH蛋白质，CAN蛋白质，EbpS蛋白质和MHCII蛋白质分别包括FnBP-A，FnBP-B，ClfA，ClfA，SdrC，SdrD，SdrE，SdrF，SdrG，SdrH，CAN，EbpS和MHCII亚域，FnBP-A，FnBP-B，ClfA，ClfA，SdrC，SdrD，SdrE，SdrF，SdrG，SdrH，CAN，EbpS和MHCII蛋白质的活性或抗原片段，和与其有充分高度同源性的蛋白质或片段。FnBP-A，FnBP-B，ClfA，ClfA，SdrC，SdrD，SdrE，SdrF，SdrG，SdrH，CAN，EbpS和MHCII蛋白质的活性片段本文定义为能阻断葡萄球菌与宿主ECM结合的肽或多肽。FnBP-A，FnBP-B，ClfA，ClfA，SdrC，SdrD，SdrE，SdrF，SdrG，SdrH，CAN，EbpS和MHCII蛋白质的抗原片段本文定义为能产生免疫反应的肽或多肽。

本文所使用的“附着因子”包括自然产生及合成的或重组蛋白质及肽，其能与细胞外基质蛋白质结合和/或调节与宿主细胞的附着。

本文所使用的“氨基酸”包括自然产生及合成的氨基酸，包括但不限于丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸，蛋氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺酸，谷氨酸，天冬氨酸，赖氨酸，精氨酸和组氨酸。

“抗体”是任何与特异抗原表位结合的免疫球蛋白，包括其抗体和片段。本文所使用的抗体包括单克隆抗体，多克隆的，嵌合的，单链的，双特异性的，猴类的和人类的抗体以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产品。

本文所使用的各种表达方式的“抗体分子”包括完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。

本文所使用的“抗原功能等同物”蛋白质或肽是掺合一个与公开的具体MSCRAMM蛋白质(如FnB-B，FnB-A，FnBP-B和FnBP-A)衍生的一个或多个抗原表位或与公开的任何具体细菌组分衍生的一个或多个抗原表位免疫交叉反应的抗原表位的蛋白质或肽。抗原功能等同物，或抗原表位序列可被首先设计或预设定然后检测，或可简单地直接进行交叉反应性检测。

本文所使用的“pg”是微微克，“ng”是毫微克，“ug”或“μg”是微克，“mg”是毫克，“ul”或“μl”是微升，“ml”是毫升，“l”是升。

“细胞种系”是能在体外稳定生长许多代的原代细胞的无性繁殖体。

“无性繁殖体”是通过有丝分裂从单细胞或普通祖细胞衍生的细胞群。

DNA“编码序列”是双链DNA序列，当置于适当的调节序列的控制下时，其在体内可转录及翻译到多肽中。序列的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的的翻译终止密码子确定。编码序列包括，但不限于原核序列，从真核MRNA获取的cDNA，从真核(如哺乳动物)DNA获取的遗传DNA序列，和合成DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’端。“DNA分子”是指单链形式或双链螺旋状的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶)的聚合物形式。其仅指分子的一级基二级结构，不限于任何具体的三级结构。这样，此术语包括双链DNA，特别在线性DNA分子(如限制性片段)，病毒，质粒，和染色体中发现的双链DNA。讨论具体双链DNA分子结构时，本文按照常用惯例描述序列，仅以5’到3’方向沿着DNA的非转录链(即含有与mRNA同源的序列的链)给出序列。转录和翻译控制序列是“DNA调节序列”，如启动子，增强子，聚腺苷酸化信号，终止子等等，提供在宿主细胞中编码序列的表达。

“表达控制序列”是控制及调节另一个DNA序列转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录到mRNA中时，编码序列是在细胞中转录及翻译控制序列的控制下的，然后编码序列被翻译成由编码序列编码的蛋白质。

本文所使用的“细胞外基质蛋白质”，或ECM，是指大型分子的四个常见家族，胶原质，结构糖蛋白，蛋白多糖，弹性蛋白，包括纤连蛋白，血纤蛋白原，提供支持及调节分子行为。

“免疫有效量”意指能刺激B细胞和/或T细胞反应的量。

本文所使用的“体内疫苗”是指用蛋白质给动物免疫接种，以产生体液和细胞反应保护以后不受病原体的影响。

本文所使用的“配体”包括分子，包括在宿主组织内的致病细菌附着的分子。

本文所使用的“MHC II抗原”是指产生快速移植排斥的及向T细胞提呈抗原所需的细胞表面分子。

本文所使用的各种表达形式的“单克隆抗体”是指仅含一种能与具体抗原免疫反应的抗体结合位点的抗体。

本文所使用的“寡核苷酸”是指含有两个或更多个核苷酸，较好的是多于三个核苷酸的分子。其精确大小取决于很多因素，这些因素反过来又取决于寡核苷酸的最终作用和应用。

如本文所使用的“药物学可接受的”是指当给人类服用时，分子实体和组合物是生理学上可忍受的，并且通常不产生不可接受的过敏或类似不好的反应。

本文使用的“引物”是指寡核苷酸，不论是以纯的限制性酶切消化形式自然产生的或合成制备的，当其置于引物延伸产物的合成被诱导的条件下时，即在存在核苷酸和诱导试剂如DNA聚合酶，及适当的温度和pH条件下，其能作为合成启动的点，其中引物延伸产物可考虑是核酸链。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长以在存在诱导试剂的条件下引导所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度，引物来源和使用的方法。如对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多个核苷酸，尽管其可能含有较少的核苷酸。

本文的引物的选取要充分地与不同链的具体靶DNA序列互补。这意味着引物必须是充分地互补以与其各自的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板确切的序列。如非互补核苷酸片段可能附着在引物的5’端，引物序列的剩余部分与链互补。或者，非互补碱基或较长序列可以散布到引物中，只要引物序列与与其杂交的链的序列有充分的互补性，或与形成延伸产物的合成用模板的链的序列有充分的的互补性。

“启动子序列”是DNA调节区域，能在细胞内结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列的转录。为了定义本发明，启动子序列以其3’端转录起始位点为界，延伸上游(5’方向)包括在上述背景可检测到的水平上需要启动转录最小量的碱基或元素。在启动子序列内可发现转录启动位点(传统用核酸酶S1制图定义)，以及具有结合RNA聚合酶功能的蛋白质结合域(共有序列)。真核启动子常常，但不总是，含有“TATA”框和“CAT”框。原核启动子除了含有-10和-35共有序列外还有Shine-Dalgarno序列。

“复制子”是遗传元素(如质粒，染色体，病毒)，用作体内DNA复制的自主单元，即能在其自身控制下复制。

本文所使用的“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”是指细菌酶，每种酶在或邻近特异回文核苷酸序列上切断双链DNA。

“信号序列”可包括在编码序列前。这个序列编码信号肽，多肽的N-端，其给宿主细胞传达信息以指导多肽到细胞表面或将隐藏到介质中。在蛋白质离开细胞前，这种信号肽被宿主细胞剪去。发现这种信号序列与真核细胞和原核细胞自身的多种蛋白质有关。

本文所使用的术语“位点导向突变剂”指的是能够使在DNA分子内的某个位点发生突变的比率被提高的化合物。

当外源或同源DNA被引入到细胞中时，细胞已被外源或同源DNA“转化”。转化DNA可以被或不被整合(共价结合)到组成细胞基因组的染色体DNA中。在原核细胞中，如哺乳动物细胞中，转化DNA可以保持在附加型元素上如质粒上。对于真核细胞，稳定转化的细胞是其中转化DNA已经整合到染色体中的细胞，这样其通过染色体复制通过其子代细胞遗传。这种稳定性由真核细胞建立由含转化DNA的子代细胞群组成的细胞种系或克隆体的能力来说明。

“载体”是另一个DNA片段可附着的以促使附着片段复制的复制子，如质粒，噬菌体或粘粒。

本文所使用的“伤口”是指上皮细胞层，及组织上其他表面结构，被机械，化学或其他影响损伤。

“免疫有效量”是指能在受体动物中产生免疫反应的肽组合物的量。这包括产生抗体反应(B细胞反应)，和/或刺激细胞毒素免疫反应(T细胞反应)。产生这样的免疫反应可用在制备有用的生物试剂中，如CTL，更具体地，如反应性抗体，及用在诊断实施方案中。也可用在各种预防或治疗实施方案中。

在组合物中使用的细菌结合蛋白质或其片段的组合包括与纤连蛋白，血纤蛋白原，胶原，及弹性蛋白结合的蛋白质。任何这样的蛋白质，肽，其片段，或与其充分同源的序列都可使用在本发明中。演示实施例在下面提供。

II.纤连蛋白结合MSCRAMM

纤连蛋白(Fn)是在动物体液和ECM中发现的440kDa糖蛋白。纤连蛋白的基本生物学功能涉及其可作为细胞表达适当整联蛋白的附着底物。几种细菌种类已显示与纤连蛋白特异结合并与含纤连蛋白的底物附着。大多数金黄色葡萄球菌分离物与Fn结合，但以不同程度结合，这反映了表达在细菌细胞表面的MSCRAMM的数量的不同。Fn和金黄色葡萄球菌之间相互作用是高度特异性的(Kuusela，P.，自然，276：718-20，1978)。Fn结合由分子量为110kDa，称作FnBP-A和FnBP-A的两种表面暴露蛋白质调节。基本Fn结合位点包括35-40个氨基酸的基元，重复三到五次。它们的基因已经被克隆及测序(Jonsson，K.，等人欧洲生物化学期刊，202：1041-1048，1991)。

WO-A-85/05553公开了具有纤连蛋白，血纤维蛋白原，胶原，和或层粘连蛋白结合能力的细菌细胞表面蛋白质。

Hook等人的美国专利No.5,320,951和5,571,514中公开了纤连蛋白结合蛋白质A(FnBA)基因序列，以及基于这种序列的产物和方法。

Hook等人的美国专利No.5,175,096公开了FnbB的基因序列，基于这种序列的杂交DNA分子(FnbB)和生物学制品和方法。

美国专利No.5,652,217公开了具有结合能力的分离及提纯的蛋白质，蛋白质由从金黄色葡萄球菌的所定义的序列获得的杂交DNA分子编码。

美国专利No.5,440,014公开了金黄色葡萄球菌的纤连蛋白结合蛋白质的D3同源单元中的纤连结合肽，其可用在反刍动物抵抗由葡萄球菌感染引起的乳腺炎的疫苗接种中，用来治疗伤口，用来阻断蛋白质受体，用来免疫接种其他动物，或用在诊断测试中。

美国专利No.5,189,015公开了一种在哺乳动物中预防治疗能与纤连蛋白结合的金黄色葡萄球菌菌株的定居方法，包括给哺乳动物服用治疗需要的预防治疗有效量的具有纤连蛋白结合属性的蛋白质，以预防产生由能结合纤连蛋白的金黄色葡萄球菌菌株引起感染，其中蛋白质分分子量为87kDa到165kDa。

美国专利No.5,416,021公开了从链球菌(Streptococcusdysgalactiae)中获得的纤连蛋白结合蛋白质编码DNA，以及含有包括在E.Coli中的从链球菌(Streptococcus dysgalactiae)中获得的纤连蛋白结合蛋白质编码DNA，从链球菌(Streptococcusdysgalactiae)中获得的纤连蛋白结合蛋白质编码DNA及由从链球菌(Streptococcus dysgalactiae)中获得的编码纤连蛋白结合蛋白质的DNA转化的E.Coli微生物体的质粒。

已观察到，野生纤连蛋白结合蛋白质的抗体基本上不抑制金黄色葡萄球菌与纤连蛋白结合的能力，这样在体内就不表现出显著的治疗效果。PCT/US98/01222公开了阻断纤连蛋白与纤连蛋白结合蛋白质的结合的抗体。培养的抗纤连蛋白结合蛋白质的位点定向突变序列的抗体不与纤连蛋白结合。可以确定的是在体内有一个纤连蛋白与纤连蛋白结合蛋白质或片段的快速络合。不与纤连蛋白结合的肽表位，即使基于纤连蛋白结合蛋白质的纤连蛋白结合区域，也不在体内与纤连蛋白形成络合物。这样使得抗体可制成抗未络合肽表位的抗体，来抑制或阻断纤连蛋白与纤连蛋白结合蛋白质的结合。

III.胶原结合MSCRAMM

胶原是软骨的主要成分。胶原(Cn)结合蛋白质通常有葡萄球菌菌株表达。金黄色葡萄球菌的Cn结合MSCRAMM与软骨附着组成了葡萄球菌感染发病机理的重要部分(Switalski等人，分子微生物学，7(1)，99-107，1993)。金黄色葡萄球菌与Cn结合发现至少在，但不仅仅在关节炎及败血病中起了作用。已确定CAN的分子量为133,110和87kDa(Patti.J.，等人，生物化学期刊，267：4766-4772，1992)。不同分子量的菌株表达CAN在其Cn结合能力上没有不同(Switalski等人，分子微生物学，7(1)，99-107，1993)。

从诊断患有脓毒性关节炎或骨髓炎的患者中收复的葡萄球菌菌株几乎不变地表达CBP，而从伤口感染获取的明显少的分离物表达这种附着因子(Switalski等人，分子微生物学，7(1)，99-107，1993)。同样地，从患有骨髓炎的患者的骨头中分离出的金黄色葡萄球菌菌株常常含有MSCRAMM识别骨特异蛋白质，骨唾蛋白(BSP)(Ryden等人，Lancet，11：515-518，1987)。在关节腔内关节软骨上的金黄色葡萄球菌定居认为是造成脓毒性性关节炎发展的重要因素。

PCT WO 92/07002公开了包含从金黄色葡萄球菌中获得的编码具有胶原结合活性的蛋白质或多肽的核苷酸序列的杂交DNA分子以及含有核苷酸序列的质粒或噬菌体。还公开的有E.Coli菌株表达胶原结合蛋白质，由重组DNA转化的微生物体，制备胶原结合蛋白质或多肽的方法，以及胶原结合蛋白质或多肽的蛋白质序列。

对编码金黄色葡萄球菌CBP的基因cna的克隆，测序，和表达，已有报道(Patti，J.，等人，生物化学期刊，267：4766-4772，1992)。基因cna编码含有从革兰氏阳性细菌中分离出的表面蛋白质结构属性的133kDa附着因子。

最近，配体结合位点也已定位在半CBP的N-端内(Patti，J.，等人，生物化学期刊，32：11428-11435，1993)。通过分析对应MSCRAMM不同片段的重组蛋白质的Col结合活性，确定了具有可评估Col结合活性的168个氨基酸长度的蛋白质片段(对应氨基酸残基151-318)。在N或C末端这种蛋白质的短截断导致配体结合活性的损失，也产生如圆二色光谱学所指出的蛋白质构象的改变。

Patti等人(生物化学期刊，270：12005-12011，1995)公开了由cna基因编码的金黄色葡萄球菌附着因子中的胶原结合表位。在他们的研究中，作者合成了从所说的蛋白质的序列衍生的肽，并使用制备的肽制备抗体。这些抗体中有些抑制蛋白质与胶原的结合。

PCT/US97/08210公开了胶原结合蛋白质某些确定的抗原表位(M55，M33，M17)可用来产生保护性抗体。该申请中还公开了CBP的晶体结构，其为鉴别干扰，或完全阻断Col和CBP结合的组合物的需要提供了重要信息。在金黄色葡萄球菌CBP和25个氨基酸的肽中的配体结合位点特点在于直接抑制金黄色葡萄球菌与¹²⁵I标记的II类Col的结合。

IV.血纤蛋白原结合MSCRAMM

血纤蛋白是血栓的主要成分，血纤蛋白原/血纤蛋白是沉积在移植的生物物质上的主要血浆蛋白质中的一种。有相当多的证据显示细菌对血纤蛋白原/血纤蛋白的附着作用对涉及设备的感染的开始是很重要的。如，Vaudarx等人所示，金黄色葡萄球菌对体外以依赖-剂量方式用血纤蛋白原覆盖的整形体的附着(传染疾病期刊，160：865-875，1989)。此外，在模仿血栓或损伤心脏瓣膜的模式中，Herrmann等人论证了金黄色葡萄球菌通过血纤蛋白原桥急切地与附着在表面的血小板结合(传染疾病，167：312-322，1993)。金黄色葡萄球菌能与在体外形成的血栓中的血纤蛋白原直接结合，并且能通过从血浆中沉积的血纤蛋白原作为桥与培养的内皮细胞附着(Moreillon等人，感染免疫，63：4738-4743，1995；Cheung等人，临床研究，87：2236-2245，1991)。如Vaudaux等人和Moreillon等人所示，缺失血纤蛋白原结合蛋白质丛生因子(ClfA)的突变体表现出减小的对体外血纤蛋白原，对移植的导管，对血栓，及对心内膜炎鼠模式中损伤的心脏瓣膜的附着作用(Vaudaux等人，感染免疫，63：585-590，1995；Moreillon等人，感染免疫，63：4738-4743，1995)。

血纤蛋白原的附着因子，常常称为“丛生因子”，位于金黄色葡萄球菌细胞的表面。溶解状态的血纤蛋白原与细菌间的相互作用致使细菌细胞的瞬间丛生。在血纤蛋白原上的结合位点位于二聚血纤蛋白原糖蛋白的γ链的C-端。亲和力很大，丛生发生在低浓度血纤蛋白原中。科学家最近揭示丛生因子也促进对固态血纤蛋白原，对血栓，对损伤的心脏瓣膜的附着作用(McDevitt等人，分子微生物学，11：237-248，1994；Vaudaux等人，感染免疫，63：585-590，1995；Moreillon等人，感染免疫，63：4738-4743，1995)。

在金黄色葡萄球菌中已发现编码两种Fg结合蛋白质，ClfA和ClfB的基因，对clfa基因克隆测序发现编码92kDa的多肽。ClfA结合血纤蛋白原的链，ClfB结合链(Eidhin等人，分子微生物学，待出版，1998)。ClfB是与细胞壁相关蛋白质，预计分子量为88kDa，表观分子量为124kDa，可结合可溶和固定的血纤蛋白原，并可作为丛生因子。

对丛生因子蛋白质，称为ClfA的基因克隆，测序并进行分子水平的详细分析(McDevitt等人，分子微生物学，11：237-248，1994；McDevitt等人，分子微生物学，16：895-907，1995)。预计的蛋白质由933氨基酸组成。39个残基的信号序列出现在N-端，接着520残基区域(区域A)，其含有血纤蛋白原结合区域。接着308个残基区域(区域R)，由154个二肽丝氨酸-天冬氨酸重复单元组成。区域R序列由18个碱基对重复单元GAY TCN GAY TCN GAY AGY编码，其中Y是嘧啶，N是任何碱基。ClfA的C-端具有在革兰氏阳性细菌的许多蛋白质表面都存在的特点基元，如LPDTG基元，其用来将蛋白质锚定在细胞壁上，一个膜锚着点，C-端尽头的正电荷残基。

血小板整联蛋白αIIbβ3识别血纤蛋白原的γ链的C-端。这是在凝聚期间血栓开始形成中的的重要事件。ClfA和αIIbβ3表现精确识别血纤蛋白原的γ链上的相同位点，因为ClfA能阻断血小板聚集，对应γ链的C-端的肽(198-41 1)能阻断整联蛋白和ClfA与血纤蛋白原间的相互作用(McDevitt等人，欧洲生物化学期刊，247：416-424，1997)。αIIbβ3的血纤蛋白原结合位点靠近，或重叠称为“EF手”的Ca²⁺结合决定簇。ClfA区域A携带几个EF类手基元。浓度范围3-5mM的Ca²⁺阻断这些ClfA-血纤蛋白原间的相互作用，并改变ClfA的二级结构。影响ClfA EF手的突变减小或预防了与血纤蛋白原的相互作用。Ca²⁺和血纤蛋白原的γ链似乎与ClfA区域A中的相同位点结合或重叠。

白细胞整联蛋白的α链，αMB2，含有200个氨基酸的插入(A或I区域)，其产生配体结合活性。在I区域的新型依赖-金属离子的附着位点(MIDAS)基元是配体结合所需的。在识别的配体中是血纤蛋白原。在血纤蛋白原上的结合位点在γ链中(残基190-202)。最近报道，白色念珠菌含有表面蛋白质，αIntlp，其具有使人联想到真核细胞整联蛋白的性质。表面蛋白质含有与Mβ2的I区域同源的氨基酸序列，包括MIDAS基元，并且，Intlp与血纤蛋白原结合。

ClfA区域A还表现出与αIntlp一定程度的序列同源。对ClfA区域A序列的检测显示出潜在的MIDAS基元。在ClfA的MIDAS基元的D×S×S部分中推定阳离子调节的残基中的突变致使血纤蛋白原结合作用的显著减小。O’Connell等人已发现对应αMβ2γ链结合位点(190-202)的肽抑制ClfA-血纤蛋白原间的相互作用(O’Connell，生物化学期刊，出版中，1998)。因此可以认为，ClfA可与血纤蛋白原的γ链在两个不同的位点结合。ClfA上的配体结合位点与真核细胞整联蛋白所使用的相似，包括二价阳离子结合EF-手和MIDAS基元。

血纤蛋白原结合蛋白质，ClfB也是已知的。本文所使用的是蛋白质和蛋白质的抗体以及包括蛋白质或其抗体的诊断试剂盒。ClfB的预计分子量约为88kDa，表观分子量为约124kDa。ClfB是细胞壁相关蛋白质，可结合溶解及固定血纤蛋白质。此外，ClfB可结合血纤蛋白原的α和β链并作为丛生因子。

与细胞外基质结合的，与血纤蛋白原-结合ClfA和ClfB有关的蛋白质已被发现。SdrC，SdrD和SdrE蛋白质在初级序列和结构组织方面与ClfA和ClfB有关，并且也位于细胞表面。由于位于细胞表面上的这些蛋白质的区域A，蛋白质能与血浆，细胞外基质中的蛋白质相互作用，或与宿主细胞表面上的分子相互作用。SdrC能与细胞外基质蛋白质结合，如玻连蛋白。SdrE也能与细胞外基质结合，如SdrE与骨唾蛋白(BSP)结合。

经发现，在SdrC，SdrD，SdrE，ClfA，ClfB的A区域中有高度保留的氨基酸序列，能用来衍生共有序列TYTFTDYVD基元。该基元能用在多组分疫苗中以将广范围的免疫传递给细菌感染，并且也可用来产生单克隆或多克隆的传递广范围被动免疫的抗体。在一个可替换的实施方案中，从Sdr和Clf蛋白质家族中衍生出的可变序列基元的任何组合，(T/I)(Y/F)(T/V)(F)(T)(D/N)(Y)(V)(D/N)，可用来传递免疫或用来诱导保护性抗体。

V.弹性蛋白结合MSCRAMM

弹性蛋白的基本作用是赋于组织和器官可逆弹性属性(Rosenbloom，J.，等人FASEB J.，7：1208-1218，1993)。弹性蛋白最大量的表达在肺，皮肤及血管中，但对于金黄色葡萄球菌蛋白质广泛地表达在哺乳动物宿主中。金黄色葡萄球菌与弹性蛋白的结合发现是快速的，可逆的，高亲和力的及配体特异的。并且，将25kDa细胞表面弹性蛋白结合蛋白质(EbnS)分离，认为其调节金黄色葡萄球菌与富-弹性蛋白宿主ECM的结合。EbnS与弹性蛋白N-端的30kDa片段中的一个区域结合。

PCT/US97/03106公开了弹性蛋白结合蛋白质的基因序列。公开的DNA序列数据显示ebps开放读框含与606个碱基对，编码202个氨基酸的新型多肽。EbpS蛋白质的预计分子量为23,345道尔顿，pI为4.9。将EbpS表达在E.Coli中成为含有与N-端附着的聚组氨酸的融合蛋白。培养的抗重组EbpS的多克隆抗体与25kDa细胞表面EbpS特异相互作用，并抑制葡萄球菌弹性蛋白结合。并且，重组EbpS特异与固定弹性蛋白结合并抑制金黄色葡萄球菌与弹性蛋白的结合。然而，缺少分子的最初59个氨基酸的重组EbpS的降解产物和CNBr-裂解的重组EbpS的C-端片段不与弹性蛋白相互作用。这些结果有力地说明EbpS是调节金黄色葡萄球菌与弹性蛋白结合作用的细胞表面分子。重组EbpS的一些构建不与弹性蛋白相互作用说明，在EbpS中的弹性蛋白结合位点包含在分子最初的59个氨基酸中。

几个独立的标准说明EbpS是调节细胞弹性蛋白结合的表面蛋白质。首先，rEbpS与固定弹性蛋白特异结合并以依赖-剂量方式抑制金黄色葡萄球菌细胞与弹性蛋白的结合。这些结果说明EbpS是在溶解状态有功能活性的弹性蛋白结合蛋白质。其次，培养的抗rEbpS抗体识别表达在金黄色葡萄球菌细胞表面的25kDa的蛋白质。除了大小相似和抗体反应性外，显示在存在过量未标记的rEbpS情况下25kDa蛋白质与固定抗rEbpS IgG的结合作用受到抑制的试验提供了进一步的证据，说明这25kDa的蛋白质是细胞表面EbpS。最后，从抗-rEbpS抗体制备的，但不是从其预免疫对照物中制备的Fab片段抑制金黄色葡萄球菌与弹性蛋白的结合。这个结果说明表面EbpS的拓扑结构是这样的，弹性蛋白结合位点易于与配体相互作用(即弹性蛋白和抗-rEbpS Fab片段)，没有嵌在细胞壁和膜区域中。综合数据说明EbpS是影响金黄色葡萄球菌与弹性蛋白结合的细胞表面蛋白质。

当前和以前的发现显示，EbpS的功能活性40kDa细胞内前体形式在表面表达前需要在C-端加工。这个观点基于下列观察结果：(i)存在在细胞表面标记试验中从未测定到的细胞内40kDa弹性蛋白结合蛋白质，(ii)25kDa EbpS和40kDa弹性蛋白结合蛋白质具有相同的N-端序列，(iii)EbpS存在单一基因。因为ebps开放读框的大小不足以编码40kDa蛋白质，首先发明者放弃这种假设。然而，他们用EbpS作的研究显示，尽管重组蛋白质的实际大小是26kDa，但其在SDS-30PAGE中异常地作为45kDa蛋白质移动。这个发现显示天然EbpS的全长，预计大小位23kDa，可能在SDS-30PAGE中作为40kDa细胞内前体移动，说明EbpS的25kDa表面形式实际上是在C-端加工的分子的较小形式。尽管EbpS缺少N-端信号肽和其他已知的分类及锚定信号，这种拟定的细胞内加工事件可以解释有关EbpS是如何定向到细胞表面的一些问题。实际上，在几种细菌蛋白质中已鉴别出C-端信号肽(Fath，M.J.和Kolter，R.，微生物学评论，57：995-1017，1993)，在革兰氏阳性细菌中将蛋白质锚定到细胞表面的可替换的装置也已有报道(Yother，J.和White，J.M.，细菌学期刊，176：2976-2985，1994)。

使用重叠EbpS片段和重组构建，在EbpS中弹性蛋白结合位点定位在分子的氨基端区域(PCT/US97/03106)。然后使用跨越氨基酸14-34的重叠合成肽更好地限定结合区域。在这些肽中，对应残基14-23和18-34的肽特异抑制超过95％的弹性蛋白结合。所有活性合成肽和EbpS的蛋白酶解和重组片段共有的是六聚体序列¹⁸Thr-Asn-Ser-His-Gln-Asp²³。进一步证实这个序列对弹性蛋白结合是很重要的证据是当在对应残基18-34的合成肽中Asp²³被Asn取代时活性损失。然而，合成六聚体TNSHQD本身不抑制葡萄球菌与弹性蛋白的结合。这些发现说明，尽管存在TNSHQD序列对EbpS活性很重要，但N-或C-端方向的侧翼氨基酸和Asp²³的羧基侧链也是识别弹性蛋白所需的。

VI.MHC II-类似蛋白质(MAP)

除了血纤蛋白原，纤连蛋白，胶原和弹性蛋白，金黄色葡萄球菌菌株也与其他附着性真核蛋白质结合，其中许多属于附着性基质蛋白质家族，如玻连蛋白(Chatwal等人，感染免疫，55：1878-1883，1987)。美国专利No.5,648,240公开了DNA片段，包括编码金黄色葡萄球菌分子量约为70kDa的宽光谱附着因子的基因。附着因子能结合纤连蛋白或玻连蛋白，并包括约30个氨基酸的MHC II模拟单元。对这种蛋白质结合特异性的进一步分析显示，其在功能上类似于MHC II抗原，因为其结合合成肽。因此，除了调节细菌对ECM蛋白质的附着作用，它还通过抑制宿主免疫系统在葡萄球菌感染中起到作用。本专利进一步权利要求重组载体，包括特异的DNA序列，用载体转化的重组宿主细胞，以及与特异序列的DNA杂交的DNA。公开的还有包括由特异DNA序列编码的蛋白质或多肽的组合物，和在动物中诱导免疫反应的方法，包括服用含编码的蛋白质或多肽的免疫组合物。本专利也另外权利要求了制备MHC II抗原蛋白质类似物的方法，包括将特异DNA序列插入到适当的表达载体中的步骤，和在制备MHC II抗原蛋白质的条件下培养用载体转化的宿主细胞的步骤。

VII.从表皮葡萄球菌中获取SDR蛋白质

表皮葡萄球菌属于凝固酶阴性细菌，是人类皮肤常见的居住者及外源体感染的常见病因。由于生物体能与留置设备先附着，接着形成生物膜而促使致病，留置设备有如人造瓣膜，整形外科设备和静脉内和腹膜内导管。设备相关感染危及治疗的成功并大大增加了患者的发病率。因此，能发展出可以控制或预防表皮葡萄球菌感染发作的疫苗是很重要的，同样发展可以预防或治疗宽范围细菌感染，同时包括凝固酶阳性和凝固酶阴性细菌的多组分疫苗也是很重要的。

由表皮葡萄球菌表达的三种Sdr(丝氨酸-天冬氨酸(SD)重复区域)蛋白质被称为SdrF，SdrG和SdrH，这些蛋白质的氨基酸序列和它们的核酸序列分别在图3-5中演示。此外，对这些蛋白质的更全面的描述在共同待审的Foster等人以序列号No.60/098,443和60/117,119的临时申请为基础的美国专利申请中提供。这些申请参考收入本篇。

依据本发明，提供了用作疫苗的组合物，包括任何上述实施方案中的组分和SdrF，SdrG或SdrH蛋白质。此外，这些蛋白质的抗体可使用传统装置培养，SdrF，SdrG或SdrH蛋白质的抗体可使用在任何上述使用本文所讨论的其他附着因子的抗体的组合中。因此，包括Sdr蛋白质如SdrF，SdrG或SdrH的组合物和疫苗可用来治疗宽范围的细菌感染，包括由凝固酶阴性和凝固酶阳性细菌引起的感染。

VIII.细菌组分

在本发明的一个实施方案中，提供了组合物包括任何上述实施方案中的组分以及细菌组分，较好地是荚膜多糖5型或8型，以增加对金黄色葡萄球菌的调理和吞噬的速度。

葡萄球菌含抗原多糖，如荚膜多糖5型和8型，蛋白质以及其他在细胞壁结构中重要的物质。肽聚糖，或含联动亚基的多糖聚合物提供了细胞壁的硬外骨骼。肽聚糖被强酸或暴露到溶菌酶中破坏。它在感染的致病过程中是很重要的。它引起单细胞产生白细胞介素(内生致热原)和调理素抗体。它可以是多形核白细胞的化学引诱物，具有类-内毒素活性，产生局部Shwartzman现象，并激活补体。

磷壁酸，如脂磷壁酸，其是甘油或磷酸核糖的聚合物，与肽聚糖结合可以是抗原性的。通过凝胶扩散可检测的抗磷壁酸抗体可在患有金黄色葡萄球菌引起的活性心内膜炎的患者中发现。

蛋白质A是许多金黄色葡萄球菌菌株的细胞壁的组分，结合在除IgG3的IgG分子的Fc部分。与蛋白质A结合的IgG的Fab部分可任意与特异抗原结合。在免疫和诊断实验室技术中蛋白质A已成为重要的试剂；如蛋白质A与附着的直接对抗特异细菌抗原的IgG分子会粘着含那种抗原的细菌。

一些金黄色葡萄球菌含有荚膜，除非有特异抗体存在，其通过多形核白细胞抑制噬菌作用。金黄色葡萄球菌的大多数菌株在细胞壁表面含有凝固酶，或丛生因子；凝固酶非酶促地与血纤蛋白原结合，产生细菌集聚。

葡萄球菌素可通过其能在组织中繁殖并广泛传播以及通过能产生许多细胞外物质来产生疾病。这些物质中的一些是酶；其他的认为是毒素，尽管它们可能起酶的作用。许多毒素是在质粒的遗传控制下的；一些可能在染色体及染色体外遗传控制下；其他的遗传控制机理尚未确定。

A.过氧化氢酶：葡萄球菌素产生过氧化氢酶，其将过氧化氢转变成水和氧。过氧化氢酶测试可从区别葡萄球菌素，其是阳性的，和链球菌素，其是阴性的。

B.凝固酶：金黄色葡萄球菌产生凝固酶，一种类酶蛋白质，在许多血清中含有因子的情况下凝结草酸化或柠檬酸化的血浆。血清因子与凝固酶反应生成酯酶和凝结活性，方式类似于激活凝血素成凝血酶。凝固酶的活动包围正常的血浆凝结级联。凝固酶可以将血纤蛋白沉积在葡萄球菌表面，改变噬菌细胞对它们的吞噬或在这样的细胞内的对它们的破坏。凝固酶的产生认为与可能入侵病原是同义的。然而，凝固酶阴性细菌如金黄色葡萄球菌还是带来严重感染的威胁。

C.其他酶：葡萄球菌素产生的其他酶包括透明质酸酶，或扩散因子；葡萄球菌激酶致使纤维蛋白溶解，但比链激酶，蛋白酶，脂肪酶，β-内酰胺酶作用要慢的多。

D.外毒素：包括几种导致皮肤坏死，注射时对动物致命的毒素，含有能通过电泳分离的可溶的溶红血球素。α毒素(溶红血球素)是异类蛋白质能溶解红血球并损害血小板，可能与外毒素致命的及引起皮肤坏死的因子相同。α毒素对脉管平滑肌也有显著的影响。β毒素降解神经鞘磷脂并对多种细胞是有毒的，包括人类红血球细胞。这些毒素和两种其他的γ和Δ毒素是抗原独特的，与链球菌细胞溶解酶没有关系。用福尔马林处理的外毒素是非-有毒的但有抗原类毒性，但这对临床没有用。

E.杀白细胞素：金黄色葡萄球菌的这种毒素能杀死许多动物的曝露白细胞。在致病葡萄球菌中它的作用可能不是杀死白细胞，可能如非致病种类一样被有效地吞噬。然而，它们能在细胞内非常积极地繁殖，而非致病生物体在细胞内趋于死亡。杀白细胞素抗体可能在抵抗周期性发生的葡萄球菌感染时起作用。

F.剥落性毒素：金黄色葡萄球菌的这种毒素包括至少两种产生葡萄球菌鳞状皮肤病一般性剥落的蛋白质。特异抗体抵抗毒素的剥落性作用。

G.中毒性休克毒素：从患有中毒性休克症的患者中分离的大多数金黄色葡萄球菌菌株产生一种称为中毒性休克毒素-1(TSST-1)，它与肠毒素F和热原外毒素C相同。TSST-1是促使中毒性休克症变化无常表现的原型超抗原。在人类中，毒素引起发热，休克，涉及多系统，包括剥落性皮肤皮疹。在兔子中，TSST-1引起发热，增强对细菌脂多糖效应及类似于中毒性休克症的其他生物效应的易感染性，但皮疹和剥落没有出现。

H.肠毒素：约50％金黄色葡萄球菌产生至少六种(A-F)可溶毒素。如同TSST-1，肠毒素也是超抗原，其与MHC II类分子结合，产生T细胞刺激作用。肠毒素是热-稳定的(它们可抵抗沸煮30分钟)，并切对胃肠酶作用有抵抗力。当金黄色葡萄球菌在碳水化合物和蛋白质食物中生长时产生肠毒素，这是食物中毒的重要原因。产生肠毒素的基因可能在染色体上，但质粒可能携带调节活性毒素产生的蛋白质。人类或猴子摄入25ug的肠毒素会呕吐及患痢疾。肠毒素的促吐作用可能是毒素作用胃肠中神经感受器后中枢神经系统刺激(呕吐中枢)的结果。肠毒素可通过沉淀素测试检测(凝胶分散)。

葡萄球菌生物体还产生许多其他抗原蛋白质。这些蛋白质包括上面提及的MSCRAMM，以及：骨唾蛋白结合蛋白质，簇蛋白结合蛋白质，硫酸肝磷脂结合蛋白质，凝血栓蛋白结合蛋白质，铁转运蛋白结合蛋白质和玻连蛋白结合蛋白质。金黄色葡萄球菌进一步表达毒性因子如phophatidyl磷脂酶，毒素表达调节物如Rap蛋白。

IX.与本文所描述的蛋白质充分同源或等同功能的蛋白质和肽

本文公开的组合物可包括，如所需，全序列蛋白质，肽，蛋白质或肽片段，分离的抗原表位，融合蛋白质，或与靶ECM结合的任何可替换的蛋白质，不论是野生型的，位点定向突变体，或与其充分同源的序列。

当约70％的(较好的至少约为80％，最好至少约为90或95％)核苷酸在DNA序列限定长度上匹配时，两个DNA序列“基本上同源”。基本上同源的序列可通过比对序列确定，使用序列数据库的标准软件，或在如具体系统所限定的严紧条件下Southern杂交试验中确定。限定适当的杂交条件在此领域的技术范围内，参看如Maniatis等人的 分子克隆：实验室手册，1982；DNA克隆，I&II卷，supra； 核酸杂交，[B.D.Hames &S.J.Higgins编辑，(1985)]。

当使用在氨基酸序列中时，“基本上相似的”是指与公布的序列不同但产生具有相同功能和活性的蛋白质的氨基酸序列，或者，由于一个氨基酸被相似的氨基酸替代，或由于改变(不论其是取代，加成，缺失还是插入)没有影响蛋白质的活性位点。当约70％的(较好的至少约为80％，最好至少约为90或95％)氨基酸在序列限定长度上匹配时，两个氨基酸序列是“基本上相似的”。

应可以理解认为，本发明的每种MSCRAMM多肽可能是大型蛋白质的部分。如本发明的ClfA多肽可在其N-端或C-端与ClfB融合，或与非-血纤蛋白原结合多肽或其组合物融合。可用作这种目的的多肽包括从任何MSCRAMM蛋白质衍生的多肽，和上述任何蛋白质的血清型变体。可用作这种目的的非-MSCRAMM多肽包括上面描述的任何细菌组分。

在本发明的肽和编码肽的DNA片段的结构中可进行修饰或改变并可获得编码具有所需特性的蛋白质或肽的功能分子。下面是根据改变蛋白质的氨基酸而产生等同物，或甚至产生改进的第二代分子的讨论。依据表1，氨基酸的改变可通过改变DNA序列的密码子获得。此领域中的技术人员应认识到表1中说明的密码子是RNA序列的。DNA的相应密码子将T替换U。为与标准术语统一(生物化学期刊，243：3552-3559，1996)。氨基酸残基的缩写也在表1中列出。

表1

氨基酸	密码子
		丙氨酸半胱氨酸天冬氨酸谷氨酸苯基丙氨酸甘氨酸组氨酸异亮氨酸赖氨酸亮氨酸蛋氨酸天冬酰胺脯氨酸谷氨酰胺精氨酸丝氨酸苏氨酸缬氨酸色氨酸酪氨酸	Ala A GCA GCC GCG GCUCys C UGC UGUAsp D GAC GAU GAC GAUGlu E GAA GAGPhe F UUC UUUGly G GGA GCG GGG GGUHis H CAC CAUIle I AUA AUC AUULye K AAA AAGLeu L UUA UUG CUA CUC GUG GUUMet M AUGAsn N AAC AAUPro P CCA CCC CCG CCUGln Q CAA CAGArg R AGA AGG CGA CGC CGG CGUSer S AGC AGU UCA UCC UCG UCUThr T ACA ACC ACG ACUVal V GUA GUC GUG GUUTrp W UGGTyr Y UAC UAU

如，在与结构如抗体的抗原结合区域或底物分子上的结合位点的相互作用的结合能力没有可感知的损失的情况下，在蛋白质结构中某些氨基酸可以被其他氨基酸取代。因为它是定义蛋白质生物功能活性的蛋白质性质和相互作用能力，某些氨基酸序列取代可在蛋白质序列中进行，当然在其划线的DNA编码序列中进行，并且仍然获得具有相同性质的蛋白质。这样，发明者考虑认为，在公开组合物的肽序列中，或在没有可感知的其生物活性或用途损失情况下，在编码所说的肽的相应的DNA序列中可进行多种改变。

在进行这些改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。在讨论蛋白质的相互作用生物功能中，氨基酸亲水指数的重要性在此领域中被广泛理解(Kyte和Doolittle，分子生物学期刊，157(1)：105-132，1982，参考收入本篇)。已经接受的是，氨基酸相对的亲水特征导致合成蛋白质的二级结构，其反过来限定蛋白质与其他分子的相互作用，如酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原，等等。根据其疏水性和电荷特性，每种氨基酸都赋值了亲水指数(Kyte和Doolittle，supra，1982)，具体有：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯基丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

此领域中已知的是，某些氨基酸可被其他具有相似亲水指数或评定值的氨基酸取代，并仍产生具有相似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等同物蛋白质。在进行这样的改变时，其亲水指数在+-2内的氨基酸的取代是较好的，其亲水指数在±1内的氨基酸的取代是更好的，其亲水指数在±0.5内的氨基酸的取代是最好的。在此领域中也可理解认为，相似氨基酸的取代可以亲水性为依据有效地进行。美国专利4,554,101中说明了蛋白质的最大局部平均亲水性指数，取决于其邻近的氨基酸的亲水性指数，与蛋白质的生物特性有关，该专利参考收入本篇。

如在美国专利4,554,101中所描述的，下列氨基酸残基赋值了亲水性指数：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+1.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。可以理解认为，氨基酸可被另一个具有相似亲水性指数的氨基酸取代，即仍获得生物等同物，具体地是免疫等同物蛋白质。在进行这样的改变时，其亲水性指数在±2内的氨基酸的取代是较好的，其亲水性指数在+-1内的氨基酸的取代是特别推荐的，其亲水性指数在±0.5内的氨基酸的取代是更好的。

如上面所列出的，因此，氨基酸取代通常是根据氨基酸侧链取代基的相对相似性，如，它们的疏水性，亲水性，电荷，大小，等等。考虑了多种前述特性的示范取代对此领域中的技术人员是众所周知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。

本发明的多肽可通过化学合成。合成的多肽可使用已熟知的固相，液相技术，或肽缩合技术，或它们的任何组合来制备，合成多肽可包括自然的或非自然的氨基酸。用来合成肽的氨基酸可以是标准Boc(N^a-氨基保护的N^a-叔-丁氧基羰基)氨基酸树脂，使用Merrifield(J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154，1963)的固相技术的标准脱保护，中和，偶联和冲洗方案，或是由Carpino和Han(J.Org.Chem.，37：3403-3409，1972)首先描述的碱基-易发生变化的N^a-氨基保护的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc N^a-氨基保护的氨基酸都可从Fluka，Bachem，Advanced Chemtech，Sigma，Cambridge ResearchBiochemical，Bachem，或半岛实验室或其他从事此领域的人熟悉的化学公司获得。此外，本发明的方法也可与其他此领域中技术人员熟悉的N^a-氨基保护基团一起使用。固相肽合成可使用此领域中技术人员熟悉的技术实施，如在Stewart和Young的 固相合成中提供的，第二版，Pierce化学公司，Rochford，IL，1984；和Field和Noble 1990年Int.J.Pept.Protein Res.35：161-214中提供的，或使用自动合成器，如ABS所售的。这样，本发明的多肽可含有D-氨基酸，D-和L-氨基酸的组合，和多种“设计者”氨基酸(如β-甲基氨基酸，Cα-甲基氨基酸，和Nα-甲基氨基酸)以转达具体属性。合成氨基酸包括鸟氨酸合成赖氨酸，氟代苯基丙氨酸合成苯基丙氨酸，正亮氨酸合成亮氨酸或异亮氨酸。此外，在特殊偶联步骤排布特殊氨基酸，可制备α-螺旋，β-转角，β-折叠，γ-转角，及环状肽。

在另一个实施方案中，选取了提供有用的化学和结构属性的肽的亚基。如含D-氨基酸的肽在体内会对L-氨基酸-特异蛋白酶有抗性。此外，本发明预想制备具有更好的限定结构属性的肽，使用肽模拟学和肽模拟键，如酯键，制备具有新型属性的肽。在另一个实施方案中，可掺入还原的肽键即R₁-CH₂-NH-R₂制备肽，其中R₁和R₂是氨基酸残基或序列。还原的肽键可引入作为二肽亚基。这样的分子会对肽键水解如蛋白酶活性有抗性。这样的肽会提供具有独特功能和活性的配体，如由于对代谢衰弱或蛋白酶活性的抗性而在体内延长半衰期。并且，众所周知的是，在某些系统中约束肽表现出增强的功能活性(Hruby，生命科学，31：189-199，1982；Hruby等人，生物化学期刊，268：249-262，1990)。

下列非-典型氨基酸可掺入到肽中以引入特殊的构象基元：1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸酯(Kazmierski等人，J.Am.Chem.Soc.，113：2275-2283，1991)；(2S，3S)-甲基-苯基丙氨酸，(2S，3R)-甲基-苯基-丙氨酸，(2R，3S)-甲基-苯基丙氨酸和(2R，3R)-甲基-苯基丙氨酸(Kazmierski和Hruby，Tetrahedron Lett.，1991)；2-氨基四氢萘-2-羧酸(Landis，Ph.D.Thesis，亚利桑那大学，1989)；羟基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸酯(Miyake等人，J.Takeda Res.Labs.，43：53-76，1989)；β-咔啉(D和L)(Kazmierski，Ph.D.Thesis，亚利桑那大学，1988)；HIC(组氨酸异喹啉羧酸)(Zechel等人，Int.J.Pep.Protein Res.，43，1991)；和HIC(组氨酸环脲)(Dharanipragada)。

下列氨基酸类似物和肽模拟物可掺入到肽中以诱导或促成特异二级结构：LL-Acp(LL-3-氨基-2-propenidone-6-羧酸)，β-转角诱导二肽类似物(Kemp等人，J.Org.Chem.，50：5834-5838，1985)，β-折叠诱导类似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.，29：5081-5082，1988)；β-转角诱导类似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.，29：5057-5060，1988)；α-螺旋诱导类似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.，29：4935-4938，1988)；γ-转角诱导类似物(Kemp等人，J.Org.Chem.，54：109-115，1989)；由下列参考文献提供的类似物：Nagai和Sato，Tetrahedron Lett.，26：647-650(1985)；DiMaio等人，J.Chem.Soc.Perkin.Trans.，p.1687(1989)；以及Gly-Ala转角类似物(Kahn等人，Tetrahedron Lett.，30：2317，1989)；酰胺键等排体(Jones等人，Tetrahedron Lett.，29：3853-3856，1989)；四氮杂茂(Zabrocki等人，J.Am.Chem.Soc.，110：5875-5880，1988)；DTC(Samanen等人，Int.J.Protein Pep.Res.，35：501：509，1990)；和在Olson等人(J.Am.Chem.Sci.，112：323-333，1990)和Garvey等人(J.Org.Chem.，56：436，1990)中公开的类似物。β-转角和β-凸起的构象限制模拟物，和含它们的肽在1995年8月8日授予Kahn的美国专利No.5,440,013中公开。

X.MSCRAMM和抗体组合物的应用

本文公开的蛋白质组合物可用来治疗伤口，用来阻断蛋白质受体，或用来免疫接种(疫苗接种)。在后一种情况中，身体产生特异抗体，其能保护不受包括细胞表面蛋白质的细菌菌株入侵，由此抗体阻断细菌菌株对损伤组织的附着。

蛋白质组合物可分散在无菌，等渗盐水溶液中，任意地加入药物可接受的分散剂。不同种的辅剂可进一步用来持续在组织中的释放，将肽对身体的免疫抵抗系统曝露更长的时间。

蛋白质，核酸分子或抗体可用来干扰病原体和哺乳动物宿主之间的引发感染的初始物理相互作用，如细菌，特别是革兰氏阴性细菌对在留置设备上的哺乳动物细胞外基质蛋白质或伤口中细胞外基质蛋白质的附着；用来阻断蛋白质调节的哺乳动物细胞入侵；用来阻断哺乳动物细胞外基质蛋白质和调节组织损伤的细菌蛋白质之间的细菌附着；用来阻断不是由留置设备的植入或外科技术引发的感染病理的正常进展。用本文所描述的抗体，蛋白质及活性片段覆盖的医疗设备或聚合生物物质包括，但不限于，U形钉，缝合线，替换心脏瓣膜，助心设备，硬质及软质隐形眼镜，眼内晶体移植(室前，室后或相性)，其他移植如角膜镶嵌，角膜-假体，脉管扩张器，epikeratophalia设备，青光眼分流器，视网膜U形钉，虹膜扣，假牙，甲状腺整形设备，喉部整形设备，脉管移植体，软质和硬质组织假体包括，但不限于，泵，电动设备如刺激器，记录器，耳假体，起博器，人造喉，牙齿移植，乳房移植，阴茎移植，头部/面部腱，人造关节，腱，韧带，半月板和盘，人造骨，人造器官包括人造胰腺，人造心脏，人造肢，和人造瓣膜；扩张器，金属线，导引金属线，静脉内和静脉中心导管，激光和球形血管成形术设备，脉管及心脏设备(管，导管，球)，心室助器，血液透析组成，血液充氧器，尿道/输尿管/泌尿器设备(Foley导管，扩张器，管和球)，通风导管(气管内和气管造口术管和套箍)，肠饲食管(包括鼻饲，胃内和空肠管)，伤口倒流管，用于体腔排放的管如胸腔，腹腔，颅腔，心包腔排放管，血液袋，测试管，血液收集管，vacutainers，耳咽管，针头，吸液管，吸液管头和血液管。

本文所使用的“覆盖的”或“覆盖”是指将蛋白质，抗体或活性片段涂在设备的表面，较好地涂在会经历凝固酶阴性葡萄球菌感染的外表面。设备表面没有必要全部由蛋白质，抗体或活性片段覆盖。

XI.蛋白质，DNA和抗体的制备

技术人员读者可使用传统的分子生物学，微生物学及重组DNA技术制备本文所描述的蛋白质，肽，和抗体组合物。这样的技术在文献中作了全面解释。参看如，Sambrook等人的 分子 克隆：实验室手册(1989)； 分子生物学当前方案I-III卷(Ausubel，R.@-I编辑，1994)； 细胞生物学：实验室手册I-III卷(J.E.Celis编辑，1994)； 免疫学当前方案I-III卷(Goligan，J.E.编辑，1994)； 寡核苷酸合成(M.J.Gait编辑，1984)； 核酸杂交(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑，1985)； 转录和翻译(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑，1984)； 动物细胞培养(R.I.Freshney编辑，1，1986)； 免疫细胞和酶(IRL出版社，1986)；B.Perbal的 分子克隆的实用指导(1984)。

说明书全文中抗体包括所有多克隆和单克隆抗体，和其部分，单独的或与其他组分缀合。抗体部分包括Fab和F(ab)2片段和单链抗体。抗体可使用适合试验的动物体内制备或使用重组DNA技术体外制备。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。在一个较好的实施方案中，抗体是多克隆抗体。制备及定性抗体的装置在此领域中是众所周知的(参看如Harlow和Lane， 抗体： 实验室手册，冷泉港，纽约州，1988)。

简单地，多克隆抗体通过用含有本发明的多肽的免疫原及从免疫接种的动物收集的抗血清免疫接种动物来制备。很多种动物可用来制备抗体。通常用来制备抗-抗血清的动物包括兔子，鼠，田鼠，大颊鼠或几内亚猪。由于兔子的血液量相对大，兔子是制备多克隆抗体的较好选择。

对MSCRAMM抗原表位特异的多克隆和单克隆抗体，可使用传统的技术制备，如此领域中的技术人员已知的。含有特别结合MSCRAMM(合成肽，位点特异突变或截断的肽)的抗原表位的组合物可用来免疫接种一种或多种试验动物，如兔子或鼠，然后动物将产生抗含抗原表位MSCRAMM肽的特异抗体。

仅通过给动物放血基从所有血液中制备血清样品，在给出一段时间产生抗体后，即可获得多克隆抗体。

用来制备多克隆抗体的免疫原组合物的量取决于免疫原的性质，以及用来免疫接种的动物。有多种途径可用来服用免疫原(皮下，肌肉内，真皮内，静脉内和腹膜内)。多克隆抗体的制备可通过在免疫接种后不同点取样免疫动物的血液来监测。也可能进行第二此推进注射。重复推进和滴定过程直到获得适当的滴定度。当获得所需量的免疫原性时，免疫接种的动物可被放血，将血清分离储存。

本发明提供的重要特性之一是在抗体特异性方面多边血清是相对均一的。通常，多克隆抗血清是从多种不同克隆体，即不同种系的B-细胞衍生而来的。相反，定义为从具有相同B-细胞前体的产生抗体的细胞产生的，由此，它们是“单”克隆性的。

当肽用作抗原来培养多克隆血清时，人们希望血清的克隆性质比使用所有抗原时要少一些变化。不幸的是，如果存在抗原表位的不完全片段，肽会很充分地呈现多种(并且可能是非自然的)构象。这样，即使短肽也可产生具有多种特异性的多克隆抗血清，不幸的是，抗血清会不与自然分子反应或反应很差。

依据本发明的多克隆抗血清制备来抗预计包括全部，完整表位的肽。可以相信认为，因此，这些表位在免疫感受中更稳定，从而为免疫系统表达更一致的免疫目标。在这种模式下，会对这种肽反应的潜在B-细胞克隆体的数量相当少，因此，产物血清的均一性会比较高。在不同的实施方案中，本发明提供多克隆抗血清，其中克隆性，即与相同分子决定簇反应的克隆体的百分比，至少80％，甚至可以考虑更高的克隆性-90％，95％或更高。

为了获得单克隆抗体，人们还用MSCRAMM-衍生的含抗原表位的组合物初始免疫接种试验动物，较好的常常是鼠。然后，给出充分长的一段时间产生抗体后，人们从动物获取脾或淋巴细胞群。然后将脾或淋巴细胞与细胞种系融合，如人类或鼠的骨髓瘤菌株，以产生分泌抗体杂交瘤。分离杂交瘤获得个体克隆体，然后其可筛查来制备所需肽的抗体。接着免疫接种，将脾细胞移出，使用标准融合方案与浆细胞瘤融合，制备分泌MSCRAMM-衍生的抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤。产生选择抗原的单克隆抗体的杂交瘤使用标准技术鉴别，如ELISA和Western印迹法。杂交瘤克隆体可在液体介质中培养，培养物上清液统一提供MSCRAMM-衍生的表位特异单克隆抗体。

无限增殖抗体-产生细胞系也可通过除了融合法的技术制备，如用瘤原性DNA直接转化B淋巴细胞，或用Epstein-Barr病毒转染。参看如M.Schreier等人的 杂交瘤技术(1980)；Hammerling等人的 单克隆抗体和T细胞杂交瘤(1981)；Kennett等人的 单克隆抗体(1980)；还可参看美国专利No.4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,451,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；4,493,890。

建议本发明的单克隆抗体可使用在标准免疫化学过程中，如ELISA和Western印迹法，以及可能使用MSCRAMM表位特异抗体的其他过程中。此外，建议对具体MSCRAMM-衍生肽特异的单克隆抗体可使用在其他有用的应用中。如它们在免疫吸附方案中的应用可用来提纯天然或重组肽或肽的合成或天然变体。

通常，抗这些肽的多克隆和单克隆抗体都可使用在各种实施方案中。如，它们可使用在抗体克隆方案中，以获得编码本文所描述的肽或相关蛋白质的cDNA或基因。它们也可使用在抑制作用研究中，分析细胞内或动物体内MSCRAMM-衍生肽的效用。抗MSCRAMM表位抗体也可使用在免疫定位研究中，以分析在各种细胞事件中MSCRAMM的分布，如确定在不同生理条件下MSCRAMM肽的细胞或组织特异分布。这种抗体的特别有用的应用是提纯天然或重组MSCRAMM，如使用抗体亲和柱。根据本发明的公开，此领域中的技术人员将会了解所有这种免疫技术的操作。

制备单链抗体的技术多此领域中的技术人员是熟知的，如在美国专利No.4,946,778中作了描述，其可用来制备本文所描述的蛋白质的单链抗体。噬菌体展示技术可用来从进行含有MSCRAMM的抗体或原初文库筛查的人的淋巴细胞的PCR扩增基因中，选择对MSCRAMM具有结合活性的抗体基因，或其抗原部分。双特异抗体含有两个抗原结合域，其中每个域对着不同的抗原表位。

抗体都可用在鉴别及定量葡萄球菌如金黄色葡萄球菌中可检测到的标记直接标记。在免疫测定中使用的标记对此领域中的技术人员是已知的，通常包括酶，放射性同位素，荧光物质，发光酶和显色物质，包括着色颗粒如胶体金或乳胶珠。适当的免疫测定法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

或者，抗体可通过与对免疫球蛋白有亲和力的标记物质反应来间接标记。抗体可与第二物质缀合，用标记的对与抗体缀合的第二物质有亲和力的第三物质检测。如，抗体可与生物素缀合，然后使用标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白检测抗体-生物素缀合物。同样地，抗体可以与半抗原缀合，然后使用标记的抗-半抗原抗体检测抗体-半抗原缀合物。标记抗体和测定缀合物的这些和其他方法对此领域中的技术人员是众所周知的。结合蛋白质的抗体也可使用在制备设备实验室中，以分离额外量的蛋白质，如通过亲和色谱法。

一般，制备双特异抗体对在此领域中的技术人员也是已知的，如Glennie等人所示例的(免疫学期刊，139：2367-2375，1987)。双特异抗体已在临床中应用，如治疗癌症患者(Bauer等人，Vox Sang，61：156-157，1991)。制备双特异抗体的一种方法包括将对一种或多种纤连蛋白结合区域的不同表位有特异性的抗体制备品从一种或多种纤连蛋白结合蛋白质中分离。

虽然有多种制备双特异抗体的方法在此领域中是已知的，但Glennie等人的方法(1987上述的)包括从两种选取的抗体中制备胃蛋白酶F(ab’Y)2片段，接着还原每一个以提供单独的Fab’YSH片段。将在两个组成中的一个上的要偶联的SH基团用交联试剂如对-苯二顺丁烯二酰亚胺来烷基化，以在一个组成上提供自由的顺丁烯二酰亚胺基团。然后将这个组成用硫醚键方式与其他组成缀合，得到所需的F(ab’Y)2复共轭对配合物。

由于制备方便，高产量及高再现性，Glennie等人(1987，上述的)的方法常常是制备双特异抗体较好的方法，然而，发明者也考虑到并也能使用的许多其他方法。如已知的实施与SPDP或蛋白质A交联，或制备特异构建的其他技术(Titus等人，免疫学期刊，138：4018-4022，1987；Tutt等人，欧洲免疫学期刊，21：1351-1358，1991)。

制备双特异抗体的另一方法是融合两个杂交瘤形成四体瘤(Flavell的Br.癌症期刊，64(2)：274-280，1991；Pimm等人，J.Cancer Res Clin Oncol，118：367-370，1992；French等人，癌症研究，51：2358-2361，1991；Embleton等人，Br.癌症期刊，63(5)：670-674，1991)。如本文所使用的，“四体瘤”用来描述两个B细胞杂交瘤的生产性融合。使用现在标准技术，将两个产生抗体的杂交瘤融合产生子代细胞，然后选取保持两组纯系型免疫球蛋白基因的细胞。

产生四体瘤的较好的方法包括选取至少一个亲代杂交瘤的酶缺失突变体。然后将第一突变体杂交瘤的细胞系与第二杂交瘤的细胞融合，其中第二杂交瘤细胞用如碘乙酰胺作致命处理，除去其继续存活体。细胞融合使得第一杂交瘤通过从致命处理过的杂交瘤中获得基因补救其酶缺失，通过融合到第一杂交瘤中营救第二杂交瘤。较好的是，但不是必须，融合同种型但不同亚类的免疫球蛋白。如果对较好的四体瘤的分离进行检测，则可以使用混合亚类抗体。

更详细地，一种四体瘤发育及筛查的方法包括，获取分泌第一个选取mAB的杂交瘤系并使其缺失重要代谢酶，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。为了获得杂交瘤的缺失突变体，将细胞在增加浓度的8-氮鸟嘌呤(1×10M⁷到1×10M^-5)中培养。通过限制稀释亚克隆突变体，并测试它们的次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)敏感性。培养基质可包括，如补充10％FCS，2mM L-谷氨酰胺和1mM青霉素-链霉素的DMEM。

使用标准细胞融合技术(Galfre等人，酶学方法，73：1-46，1981)，或使用Clark等人描述的方案(Int J Cancer，2：15-17，1988)，产生第二个所需mAB的互补杂交瘤细胞系用来制备四体瘤。简单地，融合前，在冰上将4.5×10⁷HAT-敏感第一细胞与2.8×磷酸盐缓冲液盐水混合30分钟。使用聚乙二醇(PEG)诱导细胞融合，并将细胞置于96个微培养皿中。使用含Hat培养基选取四体瘤。使用如固相同种型特异ELISA和同种型特异免疫荧光染色来鉴别含双特异抗体的培养物。

在一个鉴别双特异抗体的实施方案中，微滴定板表面(Falcon，Becton Dickinson Labware)用特异与一种亲代杂交瘤抗体相互作用并且缺少与两种抗体交叉反应性的试剂涂覆。将板冲洗，成块，将要测试的上清液加到每个皿上。将板在室温下温育2小时，除去上清液，冲洗板，在室温经2小时将稀释的碱性磷酸酶-抗-抗体缀合物加入。冲洗板并将磷酸酶底物，如磷酸p-硝基苯酯(Sigma，St.Louis)加入到每个皿中。将板温育，在每个皿中加入3N氢氧化钠中止反应，使用ELISA读取仪确定OD₄₁₀值。

在另一个鉴别实施方案中，用聚-L-赖氨酸预处理的微滴定板用来将靶细胞中的一种与每个皿结合，然后将细胞固定，如使用1％的戊二醛，测试双特异抗体结合完整细胞的能力。此外，FACS，免疫荧光染色法，独特型特异抗体，抗原结合竞争测试法，和其他此领域中常用的抗体定性分方法都可结合本发明使用来鉴别较好的四体瘤。

接着分离四体瘤，将双特异抗体从其他细胞产物中提纯。这可以使用多种蛋白质分离方法，如此领域中技术人员已知的免疫球蛋白提纯方法来实施。制备和定性抗体的方法在此领域中是众所周知的(参看如，抗体：实验室手册，1988)。

如，从四体瘤中选取的上清液流经蛋白质A或蛋白质B琼脂糖柱以结合IgG(取决于同种型)。然后将结合抗体用如PH5.0柠檬酸盐缓冲液洗脱。含BsAb的洗脱组分用等渗缓冲液透析。或者，将洗出液也流经抗-免疫球蛋白琼脂糖柱。然后用3.5M氯化镁洗脱BsAb。然后测试用这种方式提纯的BsAb的结合活性，使用如同种型-特异ELISA法或靶细胞的免疫荧光染色测试法，如上所述。

提纯的BsAb和亲代抗体可通过SDS PAGE电泳法定性分离，接着用银或Coomassie染色。当亲代抗体中的一种比另一种分子量高时，这种情况是可能的，其中BsAb的带移到两个亲代抗体带的中间。样品的减少证实存在具有不同表观分子量的重链。

并且，现在重组技术也可用来制备抗体，通常用来制备编码具有所需双特异性的抗体的重组抗体基因(Van Duk等人，IntJ Cancer，43：344-349，1989)。因此，在选取具有最好结合特性的单克隆抗体后，可以分离这些抗体各自的基因，如通过噬菌体表达文库的免疫筛查(Oi和Morrison，1986；Winter和Milstein，1991)。然后，通过重排Fab编码区域，可方便地获得嵌合构建。

人化单克隆抗体是已被修饰的动物源抗体，使用遗传工程技术用人的序列替换C区域和/或可变区域构架序列，并维持源抗原的特异性。

这样的抗体一般从对人类抗原有特异性的啮齿动物抗体中衍生。这样的抗体通常用在体内治疗应用中。这种策略降低宿主对外源抗体的反应并可以选择人类效应子功能。

制备人化免疫球蛋白的技术对此领域中的技术人员是众所周知的。如美国专利No.5,693762公开了制备含有一个或多个互补决定区域(CDR)的人化免疫球蛋白和其组合物的方法。当人化免疫球蛋白结合到完整抗体中时，人化免疫球蛋白在人类中是充分非免疫原性的，并且保持与供体免疫球蛋白基本上相同的与抗原的亲和力，如含抗原表位的蛋白质或其他化合物。

公开了可应用在本发明中的抗体制备方法的其他美国专利都通过在此引述而合并于本篇，包括美国专利No.5,565,332，其描述了使用组合方法制备嵌合抗体；美国专利No.4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备法，No.4,867,973描述了抗体治疗试剂缀合物。

美国专利No.5,565,332描述了与亲代抗体具有相同结合特异性的但其具有增加的人类特性的抗体，或抗体片段的制备方法。人化抗体可通过链改组，或许使用噬菌体展示技术获得，由于这样的方法可使用在本发明中，所以美国专利No.5,565,332的全文通过在此引述而合并于本篇。

使用本文所描述的肽抗原，本发明还提供了产生免疫反应的方法，该方法通常包括给动物服用含有免疫有效量的MSCRAMM-衍生肽组合物的药物可接受的组合物。较好的动物包括哺乳动物，具体的是人类。其他较好的动物包括鼠科动物，牛，马，猪，犬科动物，猫科动物。组合物可包括从天然或重组源获得的，部分或显著提纯的MSCRAMM-衍生的肽表位，其蛋白质或肽是天然可获得的，或化学合成的，或从表达编码这种表位的DNA片段的重组宿主细胞中体外制备的。包括活性表位的小型肽，如约30个到约100个氨基酸长度的肽常常是较好的。如果需要，抗原蛋白质或肽也可与其他试剂组合，如其他葡萄球菌或链球菌或核酸组合物。组合物也可包括葡萄球菌产生的细菌组分，如上面所描述的，从天然或重组源获得的，其蛋白质是天然可获得的，或化学合成的，或从表达编码这种肽的DNA片段的重组宿主细胞中体外制备的。

本发明的免疫配方，不论是用来疫苗接种，治疗，或用来预防细菌对ECM组分如纤连蛋白，胶原，弹性蛋白，血纤蛋白原或玻连蛋白的附着作用，都包括从这些蛋白质获得的位点特异的突变，截断，或合成衍生的抗原肽片段。这样，本文所描述的肽和蛋白质的抗原功能等同物也包括在本发明的范围内。

发明者还考虑到的在动物体内产生免疫反应的方法包括，给动物或人类受试体服用含免疫有效量的编码肽表位的核酸组合物的药物可接受的组合物，或服用含免疫有效量的包括并表达这样的核酸组合物的减毒活生物体的药物可接受的组合物。

可表达DNA或引入到疫苗受体中的可转录RNA的量有很大的剂量范围，并取决于使用的转录和翻译启动子的强度。此外，免疫反应的大小取决于蛋白质表达的量及表达的基因产品的免疫原性。通常，可直接给肌肉组织服用的DNA的有效剂量范围在约1ng到5mg，100ng到2.5mg，1μg到750μg，较好地约为10μg到300μg。皮下注射，真皮内引入，皮肤压入，及其他服用方式如腹腔内，静脉内，或吸入给药也是适用的。本发明还考虑提供了推进器接种疫苗。下列用MSCRAMM多核苷酸免疫原疫苗接种，用MSCRAMM蛋白质免疫原如M55基因产品推进也考虑在本发明中。

多核苷酸可能是“裸的”，即不与影响受体免疫系统的任何蛋白质，辅剂或其他试剂结合。在这种情况下，需要多核苷酸要在生理上可接受的溶液中，如，但不限于，无菌盐水或无菌缓冲盐水。或者，DNA可与脂质体结合，如卵磷脂脂质体或此领域中已知的其他脂质体，成为DNA-脂质体混合物，或DNA可与此领域中已知的辅剂结合以促进免疫反应，如蛋白质或其他载体。对细胞吸收DNA有帮助的试剂如，但不限于钙离子也可使用。这些试剂本文通常称为转染促进试剂或药物可接受的载体。用多核苷酸涂覆微粒的技术在此领域中是众所周知的，也可用在本发明中。对于应用于人类的DNA，可将最终DNA产物置于药物可接受的载体或缓冲液中。药物可接受的载体或缓冲液在此领域中众所周知，包括在多种课本中所描述的，如Remington药物科学。

在另一个实施方案中，本发明是多核苷酸，其包括在体内将所说的多核苷酸引入到真核组织中时能表达制备基因产品的邻接核酸序列。编码的基因产品较好地用作免疫刺激剂或用作能产生免疫反应的抗原。这样，在这个实施方案中的核酸序列编码免疫原抗原表位，是细胞因子或T-细胞共同刺激因子，如蛋白质B7家族中的成员。

用基因而不是用其基因产品免疫接种有几种优势，首先是相对简单，天然或接近天然的抗原可被引入到免疫系统中。重组表达在细菌，酵母中的哺乳动物蛋白质，甚至哺乳动物细胞常常需要广泛的治疗以确保适当的抗原性。用DNA免疫接种的第二个优势是免疫原可能进入到MHC-I类途径中，并刺激细胞毒性T细胞反应。使用编码流感A核蛋白质(NP)的DNA免疫接种鼠产生对NP的CD8⁺反应，保护鼠不受异类流感菌株的影响(Montgomery，D.L.等人，细胞分子生物学，43(3)：285-92，1997和Ulmer等人，疫苗，15(8)：792-794，1997)。

细胞调节免疫对控制感染是很重要的。因为DNA免疫接种可刺激体液和细胞-调节免疫反应，所以其最大的优点是，它提供了相对简单的方法测定了大量金黄色葡萄球菌基因的疫苗潜能。

通过DNA注射免疫接种也可使用多组分亚基疫苗的完备组装。同时用多种流感基因疫苗接种最近已有报道(Donnelly等人，疫苗，55-59，1994)。其产物激活不同及多种免疫系统反应的金黄色葡萄球菌基因疫苗中的包含物也可提供对后来攻击的完全的保护作用。

进一步提供组合物包括编码结合蛋白质的结合区域的肽的分离的核酸区段，其中肽与其配体特异结合或不特异结合。还考虑到，减毒生物体可设计来表达重组MSCRAMM基因产品，或设计其自身为本发明的给药载体。较好的减毒细菌种类有如分枝杆菌(Mycobacterium)，具体地为(Mycobacterium bovis)分枝杆菌，(Mycobacterium smegmatis)分枝杆菌，或BCG。可替换地，痘病毒，脊髓灰质炎病毒，腺病毒，或其他病毒，细菌如沙门氏菌，志贺代菌，李斯特氏菌，链球菌也可结合用在本文公开的方法和组合物中。

裸DNA技术，常常称为基因免疫接种，已显示可用作抵抗传染性生物体的保护作用。这样的DNA片段可以多种形式应用，包括裸DNA和质粒DNA，并可给受试体以多种方式服用，包括非肠道用药，粘膜用药，和所谓的微粒-基的“基因枪”接种。由此，本发明的核酸组合物在这种免疫接种技术中的应用可建议用作抵抗至少链球菌和葡萄球菌感染的疫苗接种策略。

此领域中的技术人员会认识到，对于DNA疫苗接种用药法最理想的剂量方案包括5到6个之多，但较好的有3到5个，更好的1个到3个免疫实体用药法，间隔短的两到四周，长的五到十年，或甚至更长的间隔。

本发明的具体方面涉及使用质粒载体来克隆和表达重组肽，和包括天然或位点-特异突变结合位点表位的具体肽表位。制备重组载体，转化宿主细胞，表达重组蛋白质对此领域中的技术人员是众所周知的。原核宿主较好地用来表达本发明的肽组合物。较好的原核宿主实施例是E.Coli，具体地为E.Coli菌株ATCC69791，BL21(DE3)，JMIOI，XL1-Blue^TM，RRI，LE392，B，^X776(ATCC31537)和W3110(F，λ，原养型，ATCC273325)。可替换地，其他肠杆菌种类如鼠伤寒沙门氏杆菌和沙雷氏marcescens，或革兰氏阴性宿主包括多种假单胞杆菌种类也可使用在本文所描述的基因构建的重组表达中。其他宿主可包括众所周知的真核和原核宿主，如杆菌，链球菌菌株，真菌如酵母菌，动物细胞如CHO，R1.1，B-W和L-M细胞，非洲绿猴肾脏细胞(如COS1，COS7，BSC1，BSC40和BMT10)，昆虫细胞(如Sf9)，和组织培养物中的人类细胞和植物细胞。

很多种宿主/表达载体组合物可使用在表达DNA中。有用的表达载体可包括如，染色体，非染色体和合成DNA序列的片段。适用的载体包括SV40的衍生物和已知的细菌质粒，如E.Coli质粒col El，pCR1，pBR322，pMB9和它们的衍生物，质粒如RP4；噬菌体DNA，如噬菌体λ的大量衍生物，如NM989，和其他噬菌体DNA，如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2μ质粒或其衍生物；用在真核细胞中的载体，如用在昆虫或哺乳动物细胞中的载体；从质粒和噬菌体DNA的组合物中衍生的载体，如已作修饰以使用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等等。

如在此领域中众所周知的，DNA序列可通过实施将它们与表达控制序列在适当的表达载体中结合并使用那个表达载体转化适当的单细胞宿主来表达。将本发明的DNA序列与表达控制序列实施结合当然包括，启动密码子的提供，ATG，如果不已经是DNA序列的一部分，则在DNA序列的校正读框上游。

很多种表达控制序列-控制与其实施结合的DNA序列表达的序列-可使用在表达本发明DNA序列的载体中。这种有用的表达控制序列包括如，SV40早期或晚期启动子，CMV，疫苗，多瘤或腺病毒，lac系统，trp系统，TAC系统，TRC系统，LTR系统，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域，fd外被蛋白质的控制区域，3-磷酸一甘油酸酯激酶或其他糖分解酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子(如Pho5)，酵母交配因子的启动子，和其他已知控制原核或真核细胞或它们的病毒，以及它们的组合物的基因表达的序列。

可以理解认为，不是所有的载体，表达控制序列和宿主会功能等同地表达本发明的DNA序列。所有宿主都不会功能等同于相同的表达系统。然而，此领域中的技术人员能在不需要过分试验以获得所需的不背离本发明精神的表达的情况下，选择适当的载体，表达控制序列，和宿主。如，在选择载体中，一定要考虑宿主，因为载体必须在其中起作用。还要考虑载体的拷贝数，控制拷贝数的能力，由载体编码的任何其他蛋白质的表达，如抗生素标记。

在选择表达控制序列中，通常要考虑很多因素。这些因素包括如，系统的相当长度，其可控制性，其与要表达的具体DNA序列或基因的相容性，特别是涉及潜在二级结构的相容性。选择适当的单细胞宿主要考虑，如它们与选取的载体的相容性，它们的分泌特性，它们校正折叠蛋白质的能力和它们的发酵要求，以及对要表达的DNA序列编码产品的宿主的毒性，表达产品的提纯的方便性。考虑到这些和其他因素，此领域中的技术人员将能构建多种在发酵物上或大范围动物培养物中表达编码本发明组分的DNA序列的载体/表达控制序列/宿主组合。

在某些实施方案中，还考虑到本文所讨论的核酸区段可用来横断适当的宿主细胞。将DNA引入到细胞中的技术对此领域中的技术人员是众所周知的。已作描述的有四种将核酸区段传递到细胞中的常用方法：(1)化学法(Graham和VanDerEb，滤过性微生物学，54(2)：536-539，1973)；(2)物理法如微注射(Capecchi，细胞，22(2)：479-488，1980)，电穿孔法(Wong和Neuman，Biochim Biophys Res Commun，107(2)：584-587，1982；Fromm等人Proc Natl Acad Sci USA，82(17)：5824-5828，1985)和基因枪(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA，87：4144-4148，1990)；(3)病毒载体(Eglitis和Anderson，生物/技术，6(7)：608-614，1988)；(4)受体调节-机理(Wagner等人，Proc Natl Acad Sci USA，89(13)：6099-6103，1992)。

编码MSCRAMM的DNA序列可合成制备或克隆。DNA序列可设计带有MSCRAMM氨基酸序列的适当的密码子。通常，如果序列要用来表达，人们应选择预定宿主的较好的密码子。全序列从标准方法制备的重叠寡核苷酸中装配得到，并装配到完全编码序列中。参看如，Edge，自然，292：756(1981)；Nambair等人，科学，112：1299(1984)；Jay等人，生物化学期刊，259：6311(1984)。

合成DNA序列还提供了表达MSCRAMM类似物的基因的便利构建。可替换地，DNA编码类似物可通过天然MSCRAMM基因或cDNA的位点定向诱变来制备，类似物也可使用传统的多肽合成直接制备。将非自然氨基酸位点特异地掺入到蛋白质中的常用方法在Noren等人，科学，244：182-188(1989年4月)中作了描述。该方法也可使用非自然氨基酸制备类似物。

XII.反义寡核苷酸和核糖酶

本发明提供了可用来在翻译水平上千扰MSCRAMM表达的反义寡核苷酸和核糖酶的制备。该方法使用反义核酸和核糖酶阻断特异mRNA的翻译，或通过用反义核酸掩蔽mRNA，或用核糖酶切割mRNA。

反义核酸是与特异mRNA分子至少部分互补的RNA或DNA分子。在细胞中，它们与特异mRNA杂交，形成双链分子。细胞不翻译这种双链形式的mRNA。由此，反义核酸干扰mRNA表达到蛋白质中。与AUG启动密码子杂交的分子和约15个核苷酸的寡聚体会特别有效，因为，它们方便合成，并当它们引入到产生MSCRAMM细胞中时，它们可能比大型分子带来少一些的麻烦。反义方法已用来一种体外许多基因的表达(Marcus-Sekura，1988；Hambor等人，1988)。

核糖酶是具有用一定程度上类似DNA限制性内切酶的方式特异切割其他单链RNA分子能力的RNA分子。核糖酶是从观察某些mRNA能切除其自身内含子时发现的。通过修饰这些mRNA的核苷酸序列，研究者能设计出在RNA分子内识别特异核苷酸序列并切割它的分子(Cech，1988)。因为它们是序列特异的，只有带有特别序列的mRNA被灭活。

研究者已鉴别出两种核糖酶，四膜虫类和“锤头”类(Hasselhoff和Gerlach，自然，334(6183)：585-591，1988)。四膜虫类核糖酶识别四碱基序列，而“锤头”类识别11-到18-碱基序列。识别序列越长，其越可能排他地出现在目标mRNA种类中。由此，用来灭活特异mRNA种类时，“锤头”类核糖酶比四膜虫类核糖酶要好，18个碱基识别序列比短的识别序列要好。

由此，本文所描述的DNA序列可用来制备反义分子，和切割MSCRAMM和它们的配体的mRNA的反义核糖酶。

XIII.药物组合物

提供药物组合物，包括在药物可接受的赋形剂中，以治疗金黄色葡萄球菌感染有效量的，如上所述任意地与细菌组分组合的结合蛋白质，肽，抗体，或核酸。组合物通常用来制备任意地包括辅剂和其他惯用添加剂的免疫配方。组合物也可包括如本文所描述的诊断试剂盒。

制备含有多肽，类似物或活性片段作为活性成分的药物组合物的方法在此领域中是众所周知的。通常，这样的组合物制备成可注射的，或是液体溶液或悬浮液，然而，适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式也可制备。制备品也可以是乳化的。活性治疗成分常常与药物可接受的并与活性成分相容的赋形剂混合。适当的赋形剂有，如水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇，等等以及它们的组合物。此外，如果需要，组合物可含有少量增强活性成分有效性的辅助物质如湿润剂或乳化试剂，pH缓冲试剂。

多肽，类似物或活性片段可配制到治疗组合物中成为中性药物可接受的盐的形式。药物可接受的盐包括酸性加成盐(与多肽或抗体分子的游离氨基形成的盐)和与无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸形成的盐。从游离的羧基基团形成的盐也可从无机碱中衍生，如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙，或氢氧化铁，或从有机碱中衍生，如异丙基胺，三甲基胺，2-乙基氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等。

含治疗用多肽，类似物或活性片段的组合物传统上静脉内用药，如通过单位剂量注射。“单位剂量”当用在本发明的治疗组合物中时是指作为单一剂量适于人类的物理分散单位，每个单位含有预定量的与所需的稀释剂即载体或赋形剂一起计算产生所需治疗效果的活性物质。

组合物以与剂量配方相容的方式，以治疗上有效量服用。要服用的量取决于要治疗的个体，个体免疫系统利用活性成分的能力，和所需对MSCRAMM结合能力抑制或中和程度。需要给服的活性成分的精确量取决于实施者的判断，对每个个体是特殊的。然而，适当的剂量范围每天约为0.1到20，较好的为约0.5到约10，更好的为一到几个毫克活性成分每公斤个体体重，并取决于服用方式。适于初始服用及推进注射的用药法也是可变的，但特点在于初始服用接着在一或多个小时间隔通过随后的注射或其他用药法重复剂量。可替换地，足以维持血液中十毫微摩尔到十毫摩尔浓度的连续静脉内输入也考虑在本发明中。

治疗组合物进一步可包括有效量的MSCRAMM/MSCRAMM拮抗剂或其类似物，和一种或多种下列活性成分：抗生素，类固醇。

制备含肽序列作为活性成分的疫苗通常在此领域中是众所周知的，如美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；和4,578,770中所示例的，所有这些文献都通过在此引述而合并于本篇。一般，这样的疫苗制备为可注射的，为液体溶液或悬浮液，注射前适于溶解或悬浮在溶液中的固体形式也可制备。制备品也可以是乳化的。活性免疫原成分常常与药物可接受的并与活性成分相容的赋形剂混合。适当的赋形剂有，如水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇，等等以及它们的组合物。此外，如果需要，组合物可含有少量增强活性成分有效性的辅助物质如湿润剂或乳化试剂，PH缓冲试剂。

制备这种基本上不含内毒素的组合物可通过公开的方法实施，如美国专利4,271,147(参考收入本篇)公开了制备用在疫苗中的脑膜炎球菌膜蛋白质的方法。

免疫组合物如疫苗，和其他药物组合物可单独使用或与其他阻断剂一起使用，以保护人或动物不得由葡萄球菌如金黄色葡萄球菌引起的感染。具体地，组合物可用来保护人不得心内膜炎，或组合物也可保护人或反刍动物不得由葡萄球菌感染引起的乳腺炎。疫苗可进一步用来保护其他种类动物如犬科和马科动物不得类似的葡萄球菌感染。

为了增强免疫原性，蛋白质抗原与载体分子缀合。适当的免疫原性载体包括蛋白质，多肽或肽如清蛋白，血蓝蛋白，甲状腺球蛋白和它们的衍生物，具体地有牛血清清蛋白(BSA)和匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)，多糖，碳水化合物，聚合物，和固相。其他蛋白质衍生或非蛋白质衍生的物质对此领域中的技术人员是已知的。免疫原性载体通常分子量至少1,000道尔顿，较好地大于10,000道尔顿。载体分子常常含有活性基团以便于与半抗原缀合。羧酸基团或氨基酸的氨基基团或糖蛋白的糖基团常常以这种方式应用。缺少这些基团的载体可与适当的化学物质反应制备。较好地，当将免疫原注入动物如鼠，兔子，山羊，田鼠，绵羊，几内亚猪，鸡或其他动物中时，最好是鼠和兔子，免疫反应产生。或者，在没有使用载体时，含多种蛋白质或多肽，或抗原性或免疫性等同物多肽的多抗原肽具有充分抗原性以改善免疫原性。

MSCRAMM蛋白质或蛋白质，可以有效量与辅剂一起服用，以增强对缀合物的免疫原反应。这个时候，被广泛使用在人类中的唯一的辅剂是明矾(磷酸铝或氢氧化铝)。皂苷和其提纯组分Quil A，Freund的完全辅剂和其他使用在研究中和医兽用辅剂含有限制其在人类疫苗中应用的毒性。然而，化学定义的制备品如胞壁酰二肽，单磷酰基脂质A，磷脂缀合物如在Goodman-Snitkoff等人的免疫学期刊147：410-415(1991)中所描述的，其参考收入本篇，和蛋白磷脂体内封包的缀合物如在Miller等人的J.Exp.Med.，176：1739-1744(1992)中所描述的，其参考收入本篇，和在脂质囊中封包的蛋白质如Novasome脂质囊(微脉管系统有限公司，Nashua，NH)也可使用。

在某些实施方案中，发明者考虑使用脂质体和/或毫微荚膜将具体肽或核酸区段引入到宿主细胞中。具体地，本发明的丙二酰酪氨酰和磷酸酪氨酰可配制在含DMSO的溶液中或包在脂质体中。

这种配制方法对引入本文所公开的核酸，肽和/或抗体的药物可接受的配方是较好的。配方和脂质体的应用通常对此领域中的技术人员是已知的(参看如Couvreur等人，FFBS Lett，84：323-326，1997；Crit Rev Ther Drag Carrier Syst，5：1-20，1988，其中描述了在细胞内细菌感染和疾病的定向抗生素治疗中脂质体和毫微荚膜的应用)。最近，脂质体已经研制具有了改进的血清稳定性和循环半衰期(Gabizon和Papahadjopoulos，Proc NatlAcad Sci USA，85：6949-6953，1988；Allen和Choun，FEBS Lett，223：42-46，1987)。

脂质体已成功地与多种细胞一起使用，这些细胞常常抵抗其他方法包括T细胞悬浮，初级肝细胞培养物和PC12细胞的转染(Muller等人，DNA细胞生物学，9(3)：221-229，1990)。此外，脂质体不受DNA长度的约束，DNA长度约束是病毒基传递系统的特点。脂质体已有效地用来将基因，药物，放疗试剂，酶，病毒，转录因子和别构剂引入到各种培养的细胞种系和动物中。此外，几个检测脂质体-调节药物传递的成功临床试验也已完成(Lopez-Berestein等人，癌症药物评述。2(3)：183-189，1985；Sculier等人，Eur J Cancer Clin Oncol，24(3)：527-538，1988)。并且，几项研究表明在系统给药后，使用脂质体不会有抗免疫反应，毒性或性腺定位(Mori和Fukatsu，Epilepsia，33(6)：994-1000，1992)。

脂质体是从分散在水溶介质中并自然形成多层同心双层囊(也称为多层囊(MLV))的磷脂中形成的。MLV通常直径从25毫微米到4微米。MLV的超声波降解致使小的单层囊(SUVS)形成，直径范围为200到500A，在核心中含有水溶液。

脂质体有许多与细胞膜的相似处，考虑使用在本发明中作为肽组合物的载体。它们广泛适用，因为水溶和脂溶物质都能被截留，即分别在水溶空间内及在双层自身内。携带药物的脂质体也可通过选择性修饰脂质体配方用来位点特异传递活性试剂。

除了Couvreur等人公开的内容(FEBS Let，84：323-326，1997；Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，5：1-20，1988)，下列资料也可用来制备脂质体配方。当分散水中时，根据脂质和水的摩尔比率，磷脂能形成除脂质体外多种结构。在低比率时，脂质体是较好的结构。脂质体的物理性质取决于PH，离子强度和二价阳离子的存在。脂质体可以对离子和极性物质显示低通透性，但是在升高的温度下经历相过渡时，其显著地改变它们的通透性。相过渡包括从紧密排列，有序结构，已知的凝胶状态，到疏松排列，较混乱结构，已知的液体状态的转变。这种现象发生在特性相过渡温度下，并导致对离子，糖和药物的通透性增加。

除了温度，对蛋白质的曝露也可改变脂质体的通透性。某些可溶蛋白质如细胞色素C结合，分解并渗透双层，从而产生对通透性的改变。胆固醇通过将磷脂排列的更紧密来显著抑制这种蛋白质的渗透。考虑对抗生素和抑制剂传递的最有用脂质体配方将含有胆固醇。

截留溶质的能力随着脂质体的种类的不同而不同。如，MLV适中有效地截留溶质，但SUV几乎无效。SUV提供大小分布的均一性和再现性的优点，单大型单层囊(LUV)提供了大小和截留效率之间的折衷。它们通过酶蒸发制备，比MLV在溶质截留方面有效三到四倍。

除了脂质体的性质，截留化合物的重要决定因素是化合物本身的物理化学属性。极性化合物在水溶空间中截留，非极性化合物结合在囊的脂质双层。通过渗透或当双层破裂时，极性化合物释放，但非极性化合物保持与双层的亲和作用，除非被温度或向脂蛋白曝露破坏。两种类型都是在相过渡温度下时显示最大的流出率。

脂质体通过四种不同的机理与细胞相互作用：网状内皮组织系统的噬菌细胞如巨噬细胞和嗜中性粒细胞的内吞作用；通过非特异弱疏水或静电力，或通过与细胞表面组分的特异相互作用吸附细胞表面；通过将脂质体的脂质双层插入到质膜中，并同时释放脂质体内容物到细胞质中与浆细胞膜融合；通过将脂质体脂质转移到细胞或亚细胞膜中，或反过来，但不涉及任何脂质体内容物。常常很难确定那一种机理在实施，并且可能同时不止一种在实施。

静脉内注射的脂质体的命运和分布取决于它们的物理属性，如大小，流动性和表面电荷。它们可能在组织中存在数小时或数天，取决于它们的组成，在血液中的半衰期范围从数分钟到几小时。大型脂质体，如MLV和LUVS被网状内皮组织系统的噬菌细胞很快吸收，但循环系统的生理学在大多数部位限制存在这种大型种类。它们只存在于在毛细管内皮中有大的开口和孔的部位，如肝或脾的窦。由此，这些器官是主要的吸收部位。另一方面，SUC显示大范围组织分布，但仍然大量滞留在肝和脾中。通常，这种体内行为只限制脂质体对可接受它们大型尺寸的器官和组织的潜在定向。这些包括血液，肝，脾，骨髓和淋巴器官。

对于本发明而言，定向通常不是限制。然而，特异定向应是所需的，实施这种特异定向的方法是可以得到的。抗体可用来与脂质体表面结合，并将抗体和其药物内容物导向位于具体种类的细胞表面上特异抗体受体。碳水化合物决定簇(在细胞-细胞间识别，相互作用和附着中起作用的糖蛋白或糖脂类细胞组成)可用作为识别部位，因为它们具有将脂质体导向具体种类细胞的潜能。通常，考虑会使用静脉内注射脂质体制备品，但其他用药途径也是可能的。

可替换地，本发明提供本发明肽的药物可接受的毫微荚膜配方。毫微荚膜通常可用稳定及可再生的方式截留化合物(Henry-Michelland等人，Int J.Pharm，35：121-127，1987)。为了避免由于细胞内聚合物过载的副作用，这种极奇细小的颗粒(大小约为0.1微米)应使用能在体内降解的聚合物设计。满足这些要求的生物可降解的聚-腈基丙烯酸烷基酯毫微颗粒考虑使用在本发明中，这样的颗粒也容易制备，如Couvreur等人所描述的(如上，1977和1988)。

适当的用药方法包括但不限于，局部用药，口服用药，肛门用药，阴道用药，静脉内用药，腹腔内用药，肌肉内用药，皮下用药，鼻内用药，真皮内用药。

对于局部用药，组合物配制成药膏，霜剂，凝胶，洗剂，滴剂(如眼睛滴剂和耳滴剂)，或溶液(如漱口液)。伤口或外科敷裹物，缝合线，和汽雾剂也可充满组合物。组合物可含有传统的添加剂，如防腐剂，促进渗透的溶剂，和柔和剂。局部用药配方还可含有传统的载体如乳脂或软膏基质，乙醇，或油烯基醇。

在一个较好的实施方案中，疫苗包装在注射用药(即肌肉内注射，真皮内注射，皮下注射)或鼻咽用药(即鼻内用药)免疫接种的单一药剂中。疫苗最好通过肌肉注射到三角肌肌肉中。疫苗较好地与药物可接受的载体混合以便于服用。载体通常是水或缓冲盐水，含或不含防腐剂。疫苗也可是冻干的，在服用时重新悬浮或溶解。

可与蛋白质缀合的载体也可以是聚合物延迟释放系统。合成聚合物可特别应用在疫苗配方中以影响抗原的控制释放。如甲基丙烯酸甲酯聚合成直径小于1微米的球已由Kreuter，J.，在 医 学和药理学中的微荚膜和毫微颗粒，M.Donbrow(编辑)，CRC出版社，125-148页报道。

蛋白质的微囊化作用会产生控释。很多因素影响微囊化作用的具体聚合物的选择。必须考虑到的所有因素有：聚合物合成的再现性，微囊化作用方法，微囊化作用的物料和方法的成本，毒物学分布，可变释放动力学的要求，聚合物和抗原的生理学相容性。可使用的聚合物实例有聚碳酸酯，聚酯，聚亚胺酯，聚原酸酯，聚酰胺，聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和其他生物可分解的聚合物。在抗原的控释中使用PLGA由Eldridge等人在 微生物学和免疫学的当前课题，146：59-66(1989)中作了评述。

对于人类用药，较好的剂量为从0.01毫克/公斤到10毫克/公斤，推荐剂量为约1毫克/公斤。根据这个范围，对于较重体重的等同剂量可以确定。剂量应调节以适应给服组合物的个体，并且随着个体的年龄，体重和新陈代谢的不同而变化。疫苗可另外含有稳定剂或药物可接受的防腐剂，如thimerosal(乙基(巯基安息香酸盐-S)汞钠盐)(Sigma化学公司，St.Louis，MO)。

对此领域中的技术人员显而易见的是在没有背离本发明的精神和范围的情况下，对本文所描述的发明可作各种替换和修改。

XIV.试剂盒

本发明还包括试剂盒，其中包括用来检测和诊断由葡萄球菌如金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌引起的感染的抗-MSCRAMM抗体或MSCRAMM抗原。较好的试剂盒包括在约10分钟或更短时间中与样品中几乎所有抗原结合的充分量的抗体，或与MSCRAMM抗体结合的充分量的抗原。抗体或抗原抗原固定在固体支持物上，并能用可检测的试剂标记，如上所述。试剂盒任意地含有检测可检测试剂的装置。如果抗体或抗原是用荧光染料或放射性标记标记的，通常不提供检测试剂的装置，因为使用者将需要适当的分光光度计，闪烁计数器，或显微镜。如果可检测试剂是酶，则试剂盒可提供检测可检测试剂的装置，通常包括充分量的酶的底物以检测所有抗原-抗体复合物。检测可检测试剂的一个较好的装置是被酶转变成着色产品的底物。常见的实施例是使用含2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(ABTS)的酶山葵过氧化物酶。

试剂盒可任意地包括裂解体液样品中细胞的裂解试剂。适当的裂解试剂包括表面活性剂如Tween-80，Nonidet P40，和Triton X-100。较好地，裂解试剂与抗体一起免疫接种在固体支持物上。

试剂盒还可包括步骤间冲洗底物的缓冲液。缓冲液通常是生理学上的溶液如磷酸缓冲液，生理盐水，柠檬酸缓冲液，或Tris缓冲液。

试剂盒可任意地包括不同浓度的实施抗原以校准试验。试剂盒还可包括用作参考目的的在校准的标准测试中的抗原量的视觉或数量表示。如，如果使用的测试法产生着色产品，试剂盒可包括提供描述与抗原量不同有关的强度增加的表单。

试剂盒可任意地包括检测系统中的两种抗体。以少量存在的第一种抗体对要检测的抗原特异。大量提供的第二种抗体用来检测第一种抗体。如兔抗体可用来检测LOOH/胺抗原，然后抗-兔IgG抗体可用来检测结合的兔抗体。山羊抗体和抗-抗体也常使用。

作为非限制性实施例，提供检测患者脂质过氧化作用状况的试剂盒，其中包括对所需抗体特异的兔抗体，充分量的检测结合的第一种抗体的抗-兔IgG抗体，与第二种抗体缀合的酶，以及曝露给酶会改变颜色的酶的底物。此外，试剂盒可用一种或多种MSCRAMM抗原如胶原结合蛋白质和ClfA血纤蛋白原结合蛋白质的M55区域来制备，这样的试剂盒能检测含胶原结合MSCRAMM和血纤蛋白原结合MSCRAMM的抗体的样品。

实施例

下列实施例用来演示本发明较好的实施方案。此领域中的技术人员应理解认为，遵循现有技术的实施例中公开的技术被发明者发现在实施发明中起到很好的作用，因此，实施例中公开的技术可以认为组成了实施发明的较好模式。然而，根据本篇公开内容，此领域中的技术人员应理解认为在公开的具体实施方案中可以作出许多改变，但仍然可以获得相同或相似的没有背离本发明精神和范围的结果。

                    实施例1

            制备原型四组分MSCRAMM疫苗

将一组重组蛋白质，有胶原，Fn和Fbg-结合MSCRAMM的区域(图1)，超量表达在E.Coli中并通过金属螯合层析法亲和提纯，如上所述(参看如Joh等人，生物化学，33(20)：6086-6092，1994；Patti等人，生物化学期刊，270，12005-12011，1995；McDevitt等人，分子微生物学，11(2)：237-248，1994；Ni Eidhin等人，感染免疫学，已提交，1998)。使用下列物质：包含在重组胶原结合MSCRAMM中cna表达的氨基酸(M55，如在共同待审的美国专利申请08/856,253中公开的，其参考收入本篇)；包含在重组血纤蛋白原结合MSCRAMM中clfA表达的氨基酸(pCF40，如在美国专利申请No.08/293,728中所公开的，其参考收入本篇)；包含在重组血纤蛋白原结合MSCRAMM中clfB表达的氨基酸(区域A，如在美国申请No.09/200,650中所公开的，其参考收入本篇)；包含在重组纤连蛋白结合MSCRAMM中的氨基酸(DUD4，如在共同待审的美国专利申请No.09/101,317中所公开的，其参考收入本篇)。重组FN-结合MSCRAMM蛋白质DUD4在将其与M55，ClfA区域A和ClfB的区域A结合前用福尔马林(5％福尔马林，过夜，4℃)处理。

                    实施例2

        培养E.Coli菌株制备重组蛋白质实施例

隐含重组质粒的E.coli JM 101或TOP3细胞(Stratagene)的过夜培养物以1∶50稀释在含50毫克/毫升的氨卡青霉素的Luria肉汤(Gibco BRL)中。培养E.Coli细胞直到培养物达到OD₆₀₀为0.5-0.8。通过加入IPTG到最终浓度为0.2mM诱导重组蛋白质的表达。三小时诱导后，离心收集细胞，并悬浮在15毫升缓冲液A(5mM咪唑，0.5M氯化钠，20mM Tris-盐酸，pH7.9)中，通过以20,000lb/平方英寸两次流经French滤纸裂解。以50,000Xg离心10分钟除去细胞碎片，将上清液流经0.45μM滤膜。

                    实施例3

含pQE-30(Qiagen^；Qiagen有限公司，Chatsworth，CA)表达

    的重组蛋白质或PV-4基的重组蛋白质的HIS₆的提纯

通过固定金属螯合层析法提纯重组蛋白质，使用带Ni²⁺电荷(Porath等人，1975；Hochuli等人，1988)的亚氨基二乙酸/琼脂糖6B Fast Flow柱(Sigma，St.Louis，MO)。HIS₆标记的蛋白质通过固定金属螯合亲和层析法提纯。更具体地，与FPLC系统(Pharmacia)结合的，含亚氨基二乙酸/琼脂糖6B Fast Flow的柱，加入150mM Ni²⁺并用缓冲液A平衡(5mM咪唑，0.5M氯化钠，20mM Tris-盐酸，pH7.9)。平衡后，将细菌上清液加入到柱中，用10倍床层体积的缓冲液A冲洗柱。随后，用缓冲液B(200mM咪唑，0.5M氯化钠，20mM Tris，pH7.9)洗脱柱。通过在280nm处的吸光度测定洗出液中的蛋白质。峰值部分用SDS-PAGE分析。通过含1％Triton X-114的清洗剂提取物，接着通过金属螯合亲和层析柱及流经多粘菌素B-琼脂糖柱，除去内毒素。使用显色Limulus变形细胞裂解物(BioWhittaker，Walkersville，MD)测试法定量内毒素含量。

                    实施例4

用四组分MSCRAMM疫苗-MSCRAMM IV免疫接种动物

恒河猴：

将100μg的M55(1EU/毫克)，ClfA(2.5EU/毫克)，ClfA(＜1.0EU/毫克)，和DUD4(＜10EU/毫克)混合制成MSCRAMMIV疫苗。将混合物以1∶1比率与TiterMax Gold(CytRX，Norcross，GA)混合。两只雌性恒河猴，ID#495Z&664U(约9.4公斤)，在后腿四头肌中肌肉内用200μl的疫苗接种。28天后两直猴子肌肉内推进200μl相同配方疫苗。另外两只雌性猴子，ID#215W&203U(约8.0公斤)，用与氢氧化铝(2％Alhydrogel，Superfos，丹麦)1∶1混合的MSCRAMM IV疫苗接种。28天后两直猴子肌肉内推进200μl相同配方疫苗。

后面的临床用药如下描述。

第0天	15毫升预-免疫质粒样品，完全血液化学
		第1天第7天第14天第21天第28天第30天第35天第42天第49天第106天	用0.2毫升MSCRAMM IV后腿四头肌疫苗接种，注射部位检查，记录温度肝试验组，记录温度，注射部位检查15毫升质粒样品15毫升质粒样品完全血液化学，记录温度，15毫升质粒样品，肌肉内推进0.2毫升MSCRAMM IV(100μg)肝试验组，记录温度，注射部位检查肝试验组，记录温度，注射部位检查，15毫升质粒样品15毫升质粒样品15毫升质粒样品15毫升质粒样品

所有4只动物在初始免疫接种后血清转化。在初始疫苗接种后106天，通过ELISA可检测抗体含量比背景高3倍多。在研究过程的第21周四只动物接受另一次推进免疫接种。每只动物四次皮下注射125μl疫苗，总计推进600μl疫苗。在初始疫苗接种后189天，通过ELISA可检测抗体含量比背景至少高3倍多，最多比背景高15倍。参看图2。由兽医直接观察没有发现不利注射部位反应。此外，肝酶分布，CBC，和血液分布都在恒河猴正常范围内。

                    实施例5

通过ELISA分析从疫苗接种猴子中获取的血浆样品

将免疫-2-微滴定板(Dynex技术，Chantilly，VA)用10ug/毫升(50μl)的胶原结合MSCRAMM(M55)，血纤蛋白原结合MSCRAMM(ClfA；pCF44)，血纤蛋白原结合MSCRAMM(ClfB；区域A)，纤连蛋白结合MSCRAMM(DUD4)涂覆在4℃过夜。将50微升稀释的血浆样品加入到MSCRAMM涂覆的培养皿中，并在室温温育1小时。冲洗缓冲液由含有0.05％体积比的Tween-20的PBS组成，阻断溶液含1％重量/体积BSA，0.05％Tween-20的PBS溶液，抗体稀释缓冲液包括含0.1％BSA，0.05％Tween-20的PBS。在25℃用一级和二级结构抗原温育60分钟。二级抗体是碱性磷酸酶-缀合的山羊抗-猴免疫球蛋白G，(Rockland，Gilbertsville，PA)，在抗体稀释缓冲液中稀释3500倍。ELISA板在37℃用1毫克/毫升p-磷酸硝基苯酯(Sigma)的1M二乙醇胺溶液，0.5mM氯化镁，pH9.8显影30分钟，并在Perkin Elmer HTS 7000生物测定读取仪上在405nm定性。每种血浆样品在含0.05％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4的磷酸缓冲液盐水中稀释100倍。ELISA数据在图2中显示。

                    实施例6

                 抑制作用测定

抗2，6-二甲氧基苯青霉素金黄色葡萄球菌菌株601(Smeltzer，M.S.基因，196：249-159，1997)在均匀旋转下37℃BHI肉汤中培养15小时。过夜培养物的1∶100稀释液制成BHI，细菌在37℃生长到中指数期。离心收获细菌，用pH7.4的无菌PBS冲洗三次，然后重新悬浮到碳酸盐缓冲液(50mM碳酸氢钠，pH8.5)中。将细菌与1毫克/毫升FITC(Sigma；F-7250)在50mM碳酸氢钠pH8.5中混合，并在25℃在黑暗中连续温育1小时。通过离心细菌细胞中止FITC标记反应并除去含未反应的FITC的上清液。标记的细菌用PBS冲洗三次，以除去未掺入的FITC，标记细菌重新悬浮到PBS中，调节到约1×10⁸cfu/毫升并在-20℃储存在pH7.4的PBS中。

                    实施例7

            免疫接种猴子的IgG的提纯

在PROSEP-A高能树脂(生物工艺有限公司，Princeton，NJ)上通过亲和层析法将IgG从猴子血浆中提纯。简单地，将血浆解冻并流经0.45μ的滤膜。将血浆加入到含PROSEP-A高能树脂的台式柱中。未结合的物质通过用PBS广泛地冲洗柱而除去。用pH3.0的0.1M柠檬酸钠，将IgG从柱中洗脱。加入pH9.0的1M Tris，将洗脱的IgG的pH立刻中和到pH为6.8-7.4。然后将IgG透析到pH7.4的PBS中，浓缩并过滤杀菌。提纯的IgG的浓度通过在280nm的吸光度确定。

                    实施例8

                竞争性抑制ELISA

用10微克/毫升的含牛胶原，人类血纤蛋白原，和牛纤连蛋白的PBS溶液(pH7.4)的基质组分溶液涂覆Costar 96凹形黑板在4℃或室温过夜。涂在板上的基质蛋白质用PBS，0.05％Tween20冲洗三次，用PBS，1％BSA阻断。阻断的板用PBS，0.05％Tween20冲洗三次。将500微升等份FITC-标记的金黄色葡萄球菌细胞与PBS(0.05％Tween20，0.1％BSA)中增加量的提纯的猴子IgG混合，标记的细胞和IgG在连续摇晃器中在25℃混合1小时。将50微升的标记细胞/IgG混合物加入到微滴定板上的每个培养皿中，并在25℃在摇晃平台上温育。用PBS(0.05％Tween20)冲洗培养皿三次。在Perkin Elmer HTS7000生物测试读取仪上，使用设定在485nm的激发滤膜和设定在535nm的发射滤膜确定与固定基质蛋白质结合的细菌的量。

                    实施例9

                脓毒症的动物模式

使用脓毒症的鼠模式(Bremell，T.A.等人，感染免疫学，62(7)：2976-2985，1992)，我们已证实用用从MSCRAMM免疫接种的恒河猴中提纯的IgG被动免疫接种能保护鼠免于脓毒症诱导的死亡。5-8周大的首次用于试验的雄性NMRI鼠在第-1天用20毫克从MSCRAMM免疫接种的恒河猴中提纯的IgG免疫接种(n＝12)，或用从未免疫接种的恒河猴中获取的IgG免疫接种(n＝13)。在第0天，用2.4×10⁷CFU/鼠的金黄色葡萄球菌菌株LS-1攻击。三天后测定死亡率和体重变化。温育三天后在对照组中，3/13鼠(13％)死亡。在第13天对照组中的死亡率为53.8％(7/13)，MSCRAMM IV被动免疫组只有16.2％死亡率。与MSCRAMM IV IgG被动免疫的鼠相比，对照组显示出明显的体重下降(28.0+2.5％对21.3±3.1％；p＜0.01)。

                    实施例10

       含M55(胶原结合MSCRAMM)和ClfA(血纤结

            合MSCRAMM)的多组分疫苗

六只雌性瑞士Webster鼠经皮下注射接受总计50微克的卵清蛋白，M55(胶原结合MSCRAMM)或M55和ClfA(血纤结合MSCRAMM)蛋白质组合物。通过将抗原乳化到Freund完全辅剂中制备初始注射液。在初始注射14天后，鼠接受总计25微克蛋白质的第二次注射。在初始注射28天后，实施总计25微克蛋白质的PBS溶液的最后注射。最后注射后两周获取所有鼠的放血后样品，以确定对不同MSCRAMM蛋白质的抗体滴定度。然后通过单一静脉内注射用1.2×10⁸CFU金黄色葡萄球菌601攻击鼠(初始注射后第42天)。在攻击后第5天，将鼠杀死，获取它们的肾脏。然后将肾脏均匀化并置于血液琼脂板上，在37℃将板温育过夜，通过集落计数确定肾脏中负载的细菌。试验结果显示，在卵清蛋白组(7.03±0.93log CFU/克)和M55/ClfA组(4.83±3.04log CFU/克，p＝0.006)之间细菌负载的两个对数偏差。当与卵清蛋白组相比时，在M55组(5.86±3.42log CFU/克，p＝0.003)也观察到细菌负载的偏差。

如在上面说明书和实施例中所显示的，免疫组合物，包括疫苗，和其他含MSCRAMM蛋白质的药物组合物包括在本发明的范围内。使用此领域中的技术人员对疫苗已知的方法和物料，可以将一种或多种结合蛋白质，或其活性或抗原片段，或其融合蛋白质配制和包装，单独地或和其他抗原一起。免疫反应作治疗或预防应用，并可提供抗体免疫或细胞免疫，如由T淋巴细胞，如细胞毒性T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞产生的免疫。

Claims (16)

1.一种组合物，包括与胶原结合蛋白质的胶原结合域结合的并抑制所说的胶原结合蛋白质与胶原结合的抗体，和与血纤蛋白原结合蛋白质的血纤蛋白原结合域结合的并抑制所说的血纤蛋白原结合蛋白质与血纤蛋白原结合的抗体；

所述胶原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的M55；所述血纤蛋白原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的ClfA。

2.根据权利要求1的组合物，所述组合物进一步包括与纤连蛋白结合蛋白质的纤连蛋白结合域结合的并抑制所说的纤连蛋白结合蛋白质与纤连蛋白结合的抗体；所述纤连蛋白结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的DUD4。

3.依据权利要求1的组合物，进一步包括从含SdrF，SdrG，SdrH的蛋白质组中选取的蛋白质的抗体。

4.一种疫苗，包括免疫有效量的胶原结合蛋白质的胶原结合域，和血纤蛋白原结合蛋白质的血纤蛋白原结合域，和药物可接受的载体或赋形剂；所述胶原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的M55；所述血纤蛋白原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的ClfA。

5.根据权利要求4的疫苗，所述疫苗进一步包括纤连蛋白结合蛋白质的纤连蛋白结合域；所述纤连蛋白结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的DUD4。

6.依据权利要求4的疫苗，进一步包括从含SdrF，SdrG，SdrH的蛋白质组中选取的蛋白质。

7.一种含免疫有效量的肽组合物的药物组合物在制备使动物产生免疫反应药物中的应用，其中所述肽组合物包括胶原结合蛋白质的胶原结合域和血纤蛋白原结合蛋白质的血纤蛋白原结合域；所述胶原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的M55；所述血纤蛋白原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的ClfA。

8.根据权利要求7的应用，其中所述肽组合物进一步包括纤连蛋白结合蛋白质的纤连蛋白结合域；所述纤连蛋白结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的DUD4。

9.如权利要求1所述的组合物在制备抑制微生物在动物中定居药物中的应用。

10.权利要求2所述的组合物在制备抑制微生物在动物中定居的药物中的应用。

11.如权利要求4所述的疫苗在制备抑制微生物在动物中定居的药物中的应用。

12.如权利要求5所述的疫苗在制备抑制微生物在动物中定居的药物中的应用。

13.一种疫苗，包括药物可接受的含编码胶原结合蛋白质的核酸，和编码血纤蛋白原结合蛋白质的核酸，和药物可接受的载体或赋形剂的配方；

所述胶原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的M55；所述血纤蛋白原结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的ClfA。

14.根据权利要求13的疫苗，所述疫苗进一步包括编码纤连蛋白结合蛋白质的核酸；所述纤连蛋白结合蛋白质包括金黄色葡萄球菌的DUD4。

15.依据权利要求14的疫苗，所述疫苗进一步包括纤连蛋白结合蛋白质和药物可接受的载体或赋形剂。

16.依据权利要求15的疫苗，其中纤连蛋白结合蛋白质包括FnBP-A和FnBP-B。

Images