KR20010085745A - 다성분 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다성분 백신에 관한 것으로서, 포도상구균의 감염을 예방 및 치료에 유용하고 박테리아의 결합 단백질 또는 이들의 단편, 또는 이들 단백질 또는 단편에 대한 항체의 선택된 혼합물을 포함하는 다성분 백신을 제공한다. 단백질, 단편, 또는 항체를 신중하게 선택함으로써, 광범위한Staphylococcus박테리아 균주 및 대수적 생장곡선의 상이한 단계에서 발현되는 단백질에 대한 방어능력을 제공하는 백신을 제공한다. 본 발명의 한 구현예에서는, 피브리노겐 결합 단백질, 바람직하게는 응집 인자 A("ClfA") 또는 응집 인자 B("ClfB"), 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, CNA와 같은 적어도 하나의 콜라겐 결합 단백질 또는 펩타이드(또는 이들의 적절한 자리 특이적 돌연변이 서열), 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편을 포함하는 조성물이 제공된다. 본 명세서에 기재된 백신 및 제품은, 유효성을 쉽게 상실하는 작은 분자 항생제의 대체물에 대한 의학계의 절실한 요구에 부응하며, 광범위한 박테리아의 감염에 대해 효과적으로 방어할 수 있는 다수의 공지된 박테리아 표면 부착인자로 구성된 유효한 혼합물을 제공한 다는 점에서 유용하다.

Description

다성분 백신 {MULTICOMPONENT VACCINES}
포도상구균(staphylococci)은 일반적으로 포도형의 불규칙적인 세포군으로 배열되는 그란-양성의 구형 세포이다. 이들 중 일부는 사람의 피부 및 점막의 정상적인 세균총이고, 나머지는 화농, 농양 형성, 다양한 화농성 감염, 및 심지어는 치명적인 패혈증을 유발한다. 종종, 병원성 포도상구균은 혈액을 용혈시키고, 혈장을 응집시키며, 다양한 세포외 효소 및 독소를 생산한다. 가장 보편적인 유형의 식중독은 열-안정성 포도상구균의 내독소에 의하여 유발된다.
Staphylococcus속에 속하는 종은 적어도 30여 종 이상이 있다. 임상적으로 중요한 3개의 종은Staphylococcus aureus,Staphylococcus epidermidis, 및Staphylococcus saprophyticus이다.Staphylococcus aureus는 응고효소-양성으로서 다른 종들과 구별된다.S. aureus는 사람에 대한 주요 병원체이다. 거의 모든 사람이 일생동안 몇 가지 유형의S. aureus에 감염되고, 그 감염의 경중은 식중독 또는 경미한 피부 감염으로부터 생명을 위협하는 심각한 감염에까지 이른다. 응고효소-음성의 포도상구균은 특히 어린이, 노인 및 면역기능이 손상된 환자 내에서종종 이식기구와 관련된 감염을 일으키기도 하는 정상인의 세균총이다. 응고효소-음성 포도상구균에 의하여 유발되는 감염의 대략 75%는S. epidermidis에 의해 초래된다.Staphylococcus wavneri, Staphylococcus hominis, 및 그 밖의 종들에 의하여 유발되는 감염은 이보다는 덜 보편적이다.S. saprophyticus는 젊은 여성들에게서 발생하는 비뇨기관 감염의 보편적인 원인이다. 포도상구균은 연쇄상구균과 구별되는 카탈라아제를 생산하며, 이것이 연쇄상구균과 포도상구균의 분류기준이다.
콜라겐이 주요 성분인 관절 영역내 관절 연골의S. aureus의 군집 형성은 패혈성 관절염의 발생에 기여하는 중요 인자인 것 같다. 혈액원성의 후천적인 박테리아성 관절염은 의학적으로 심각한 문제로 남아 있다. 이러한 신속한 진행성의 고도로 파괴적인 관절 질환은 근절하기 어렵다. 통상적으로, 감염된 환자의 50% 이하는 심각한 관절 손상 없이는 회복되기 어렵다.S. aureus는 혈행성의 2차 골수염을 가지는 성인 환자로부터 분리되는 우세한 병원체이다.
입원 환자에서는,S. aureus와 같은Staphylococcus박테리아가 감염의 주요 원인이다. 상처 또는 내재 의학기구의 국부적인 초기 감염은 패혈증, 골수염, 유선염, 및 심장 내막염과 같은 심각한 침해성 감염을 유발할 수 있다. 의학 기구와 관련된 감염에서, 플라스틱 및 금속 표면은 이식 직후, 피브리노겐 및 피브로넥틴과 같은 숙주의 혈장 및 매트릭스 단백질로 코팅된다. 이러한 단백질에 부착되는S. aureus및 그 밖의 포도상구균성 박테리아의 능력은 감염의 개시에 있어 필수적이다. 도관 이식조직, 정맥내 카테터, 인공 심장 판막, 및 심장 보조기구는 응혈성으로서 박테리아성 콜로니를 형성하는 경향이 있다. 포도상구균성 박테리아 중 하나인S. aureus는 일반적으로 이러한 감염에서 가장 파괴적인 병원체이다.
현재 감염 치료에 이용 가능한 대부분의 항생제에 대하여 내성을 나타내는S. aureus분리균의 현격한 증가가 전세계의 병원에서 발견되었다.S. aureus를 박멸하는 페니실린의 개발은 감염 통제 및 치료에 있어 큰 진전이었다. 그러나, 페니실린-내성 유기체가 빠르게 출현하였고 새로운 항생제에 대한 필요가 우세해졌다. 새로운 모든 항생제의 주입에 대하여,S. aureus는 β-락타마아제에 대항할 수 있었으며, 페니실린-결합 단백질을 변형시키고, 세포막 단백질을 돌연변이시킴으로써 박테리아를 존속시킬 수 있었다. 결과적으로, 메티실린-내성의S. aureus(MRSA) 및 여러 가지 약제에 대하여 내성을 가지는 유기체 출현하였으며, 세계 도처의 병원 및 요양원은 이들의 주요 온상이 되었다(Chambers, H. F.,Clin Microbiol Rev, 1:173, 1988; 및 Mulligan, M. E.,et al.,Am J Med, 94:313, 1993). 오늘날, 병원(病院) 감염을 유발하는 포도상구균성 균주의 거의 절반이 반코마이신을 제외한 모든 항생제에 내성이며, 반코마이신 역시 효과가 없어지는 것은 시간문제인 것 같다.
S. aureus와 같은 포도상구균으로부터의 감염을 치료하기 위한 항생제 내성의 박테리아 균주에 대한 효과적인 치료법이 절실하게 요구되고 있다. 미국 국립건강기구는 최근 이러한 목표가 현재 국가의 우선 문제임을 지적하였다.
MSCRAMMs
박테리아의 숙주 조직 부착은 MSCRAMM(Microbial Surface ComponentsRecognizing Adhesive Matrix Molecules)라 불리는 특정 미생물 표면의 부착인자(adhesin)가 피브로넥틴, 피브리노겐, 콜라겐, 및 엘라스틴과 같은 세포외 매트릭스(ECM) 성분을 특이적으로 인식하고 결합하는 경우에 발생한다. 많은 병원성 박테리아는 숙주 조직의 군집 형성 메커니즘을 반영하는 상호작용에서 다양한 EMC 성분을 특이적으로 인식하고 이들 성분에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 부착은 MSCRAMM라 불리는 박테리아성 단백질 군과 관련된다(Patti, J.,et al.,Ann. Rev. Microbiol., 48:585-617, 1994; Patti, J. and Hook, M.,Cur. Opin. Cell Biol., 6:752-758, 1994).
박테리아 세포 표면상의 MSCRAMM와 숙주 조직 내의 리간드는 열쇠와 자물쇠 방식으로 상호 작용하고, 그 결과 박테리아가 숙주에 부착된다. 종종, 부착은 박테리아의 생존에 요구되며, 숙주의 방어 메커니즘 및 항생제 투여로부터 박테리아를 보호한다. 박테리아가 숙주 조직에 성공적으로 부착하여 콜로니를 형성하면, 이들의 생리가 급격하게 변화되고 독소 및 효소와 같은 손상 성분이 분비된다. 더욱이, 부착성 박테리아는 종종 생체막을 생산하고, 대부분의 항생제의 살균작용에 대하여 신속하게 내성을 가지게 된다.
박테리아는 다양한 매트릭스 단백질을 인식하는 MSCRAMM를 발현시킬 수 있다. MSCRAMM 내의 리간드-결합 자리는 비교적 짧은 인접 아미노산 서열 영역(모티브)에 의하여 한정되는 것 같다. 상이한 여러 종의 박테리아에서 유사한 모티브를 발견할 수 있기 때문에, 이러한 기능성 모티브는 종간 전이되는 것 같다(Patti and Hook,Cur. Opin. Cell Biol., 6:752-758, 1994). 또한, 단일 MSCRAMM는 때로여러 개의 ECM 리간드와 결합할 수 있다.
백신접종 연구
역사적으로, 박테리아 부착에 대한 연구는 주로 그람-음성 박테리아에 집중되어 왔다. 이들 그람-음성 박테리아는 이들의 세포표면 상에서 매우 다양한 섬모성 부착 단백질(부착인자라 명명됨)을 발현시킨다(Falkow, S.,Cell, 65:1099-1102, 1991). 이러한 부착인자는 숙주 세포의 표면(특히, 상피층) 상에 노출된 특정 당접합체를 인식한다. 부착에 렉틴형 구조를 사용하면 미생물이 상피표면을 효과적으로 인식하게 할 수 있다. 이는 박테리아에 복제에 우수한 자리 및 이웃하는 숙주 조직으로 확산될 기회를 제공한다. 필러스 부착인자를 면연접종하면 미생물 투여, 예를 들면, 친칠라 모델 내에서Hemophilus influenza에 의하여 유도되는 이염 매개체(Sirakovaet al.,Infect Immun., 62(5):2002-2020, 1994),Moraxella bovis에 의하여 실험적으로 유도되는 소의 감염성 각막 결막염(Lepperet al.,Vet. Microbiol., 45(2-3):129-138, 1995), 및 토끼 내에서E. Coli에 의하여 유도되는 설사(McQueenet al.,Vaccine, 11:201-206, 1993)를 예방할 수 있음이 입증되었다. 대부분의 경우, 부착인자를 면역접종하면, 박테리아 부착 및 군집 형성을 억제할 뿐 아니라 박테리아의 옵신-식균작용 및 항체-의존성 보완물-매개의 박멸을 촉진하여 감염으로부터 방어하는 면역 항체의 생산이 유도된다.
백신 성분으로서 병원성 미생물의 숙주 조직 성분으로의 부착을 매개하는 분자의 용도는 미래의 백신 개발에 있어 중요한 단계로 부상하고 있다. 박테리아의 부착은 대부분의 감염의 전개에 있어서 결정적인 첫 단계이기 때문에, 이는 신규한백신의 개발에 대한 흥미로운 표적이다. MSCRAMM와 숙주 조직 성분간의 상호작용에 대한 재조합 DNA 기술분야의 새로운 기술과 결합된 분자 수준에서의 이해 증진은 새로운 서브유닛 백신 생산에 대한 토대가 되었다. 현재는 천연 형태 또는 자리-특이적으로 변형된 형태의 전체 MSCRAMM 또는 MSCRAMM의 특정 부위가 생산 가능하다. 게다가, 상이한 미생물 유래의 MSCRAMM을 혼합 및 배합하는 능력은 다수의 박테리아에 대항하는 단일 백신의 제작을 가능하게 하였다.
불활성화 백일해 독소 외에도, 정제된Bordatella pertussisMSCRAMM 필라멘트성 헤마글루티닌 및 퍼탁틴(pertactin)으로 이루어지는 백일해에 대항하는 새로운 서브유닛 백신을 사용한 최근의 임상 실험은 이러한 유형의 연구성과의 가장 중요한 실례이다. 몇몇 이형의 새로운 무세포성 백신이 박테리아 세포 전체를 함유한 기존의 백신보다 안전하고 효과적임이 밝혀졌다(Grecoet al.,N. Eng. J. Med., 334:341-348, 1996; Gustaffsonet al.,N. Eng. J. Med., 334:349-355, 1996).
S. aureus감염에 대한 자연면역에 대해서는 알려진 적다. 통상적으로, 건강한 사람 및 동물은S. aureus감염에 대하여 선천적으로 높은 내성을 나타낸다. 방어는 온전한 상피와 점막의 차단 및 정상적인 세포반응과 체액반응에 기여한다. 심한 감염 후에는S. aureus성분에 대한 항체의 역치가 증가하지만(Rydinget al., J Med Microbiol, 43(5):328-334, 1995), 데이터 상으로 항체 역치와 인간 면역성간의 상호관계에 대한 혈청학적 증거는 없다.
지난 십여 년에 걸쳐,S. aureus의 생균, 사균, 및 포르말린 고정 제제가 포도상구균 감염을 방지하는 백신으로서 테스트되어 왔다. 연속적인 복막 투석 환자 사이의 복막염 발병률, 퇴거 자리 감염, 및S. aureus의 비강 통과에 대한 포도상구균의 변성독소 및 전체 사균 포도상구균으로 이루어지는 시판 백신의 효과를 연구하기 위하여 다중심 임상 실험이 구상되었다(Polle-Warrenet al.,Clin. Nephrol., 35:198-206, 1991). 백신 면역접종은S. aureus에 대한 특정 항체의 수치를 증가시켰지만, 복막염의 발병률에는 영향을 주지 못하였다. 마찬가지로,S. aureus전체 세포로 토끼를 면역화한 경우에도 실험용 심장 내막염의 어떠한 단계도 방지 또는 변화시킬 수 없었으며, 신장의 농양 발병률을 감소시키거나 감염된 신장 내의 박테리아의 부하를 낮출 수 없었다(Greenberg, D.P.,et al.,Infect Immun, 55:3030-3034, 1987).
현재,S. aureus의 감염을 예방하기 위한 용도로 FDA에 의하여 인가된 백신은 없다. 그러나, 최근 NABI(North American Biologicals Inc.)에 의하여 캡슐 다당류로 이루어지는S. aureus백신(Staph VAX)이 개발되었다. 이 백신은Pseudomonas aeruginosa외독소 A(rEPA)와 접합된 5형 또는 8형의 캡슐 다당류로 이루어진다. 상기 백신은 유형-특이성 옵신 항체를 유도하고 옵신 식균작용을 촉진하도록 구상되었다(Karakawaet al.,Infect Immun., 56:1090-1095, 1988). 정제된 치명적인 투여 마우스 모델(Fattomet al.,Infect Immun., 61:1023-1032, 1993)을 사용하여, 5형 캡슐 다당류 특이성 IgG의 복막내 주입하면,S. aureus가 복막내 접종된 마우스의 사망률이 감소된다는 것을 알았다. 5형 캡슐 다당류-rEPA 백신 또한 말기 신장 질환을 가지는 17명의 환자를 백신접종하는 데사용되었다(Welchet al.,J. Amer. Soc. Nephrol., 7(2)247-253, 1996). 1차 접종 후, 5형 접합체에 대한 IgG의 등비중항(geometric mean: GM) 수준이 13배 내지 17배 증가하였지만, 추가 접종 감염 후에는 부가의 증가가 검출되지 않았다. 흥미롭게도, 백신접종된 환자의 IgG의 GM 수준은 대조군 환자보다 상당히 낮았다. 동물 연구에 의하여 입증되었듯이, 연속적으로 복막 투석 중인 외래환자를 대상으로 상기 백신에 대한 Ⅱ단계의 임상 실험이 최근 완료되었다. 임상실험 결과, 상기 백신이 안전하기는 하지만, 포도상구균의 감염을 예방하는 데는 효과가 없는 것으로 밝혀졌다(NABI SEC FORM 10-K405, 12/31/95). 백신접종된 환자 내의 복막 투석과 관련된 감염을 예방하지 못하는 Staph VAX의 능력에 대해 가능한 두 가지 해석은 최적이하의 백신 투여량으로 인해 백신의 면역원성이 너무 낮았거나, 혈류 내의 항체가 복막과 같은 몇몇 해부학상 영역에서의 감염에 영향을 줄 수 없었다는 것이다.
그람-양성 박테리아와 관련된 패혈증이 증대되고 있는 추세이다. 사실, 모든 패혈증 환자의 1/3 내지 1/2은 그람-양성 박테리아, 특히S. aureus및S. epidermidis에 의하여 유발된다. 미국에서는 올해 200,000명 이상의 환자가 그람-양성 박테리아와 관련된 패혈증을 나타낼 것으로 추정된다.
마우스 모델(Bremellet al.,Infect Immun, 59(8):2615-2623, 1991)을 사용하여, 콜라겐-결합 MSCRAMM의 M55 부위를 활성 면역접종하면 패혈증에 의한 마우스의 사망을 예방할 수 있음이 명백하게 입증하였다. 마우스에게 M55 또는 대조 항원(소의 혈청 알부민)을 피하내 면역접종한 뒤,S. aureus를 정맥내 투여하였다.BSA 면역접종된 마우스의 27%(12/45)만이 생존한 것에 비하여, M55로 면역화된 마우스의 83%(35/42)가 생존하였다. 이는 3개의 개별적인 연구를 조합한 것이다.
Schennings 등은S. aureus유래의 피브로넥틴 결합 단백질을 면역접종하면 래트의 실험용 심장 내막염이 방지된다는 사실을 입증하였다(Micro Pathog, 15:227-236, 1993). 피브로넥틴과의 결합을 담당하는S. aureus유래의 피브로넥틴 결합 단백질의 부위 및 베타-갈락토시다아제를 포함하는 융합 단백질(gal-FnBP)로 래트를 면역접종하였다. 융합 단백질 gal-FnBP에 대한 항체는 시험관내에서 고정된 피브로넥틴과S. aureus의 결합을 방해하는 것으로 밝혀졌다. 우측 경동맥을 통해 카테터를 삽입하여 면역화 래트 및 비면역화 대조군 래트 내에서 심장 내막염을 유도한 결과, 피브리노겐 및 피브로넥틴으로 피복된 손상된 대동맥의 심장판막을 얻을 수 있었다. 이어서, 카테터-삽입 래트에 1×105개의S. aureus세포를 정맥주사로 감염시켰다. 추가 접종 감염 후, 2일 동안 11회 대동맥 판막과 결합된 박테리아의 수를 측정한 결과, 면역접종 군과 비면역접종 군 사이의 박테리아 수에서 현격한 차가 나타났다.
Mamo 등은S. aureus추가 접종 감염에 대한S. aureus유래의 피브리노겐 결합 단백질(특히, FnBP-A) 및S. aureus유래의 콜라겐 결합 단백질의 백신접종 효과를 연구하기 위하여 마우스의 유선염 모델을 사용하였다(Vaccine, 12:988-992, 1994). 피브리노겐 결합 단백질로 백신접종된 마우스는 대조군에 비하여 유선염 래트의 수가 감소된 것으로 나타났다. 추가 접종 감염된 마우스의 유선을 총체적으로 조사한 결과, 피브리노겐 결합 단백질로 면역접종된 마우스의 유선이 대조군 마우스 유래의 유선에 비하여 경미한 유방내 감염을 나타내거나, 병리학적 변화를 전혀 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다. 대조군에 비하여, 피브리노겐 결합 단백질로 면역화된 마우스 유래의 유선 내에서 현격하게 감소된 박테리아 수가 발견되었다. Mamo는 포도상구균의 알파 변성독소와 혼합된 FnBP-A의 백신접종이 방어능력을 개선시키지 못한다는 사실을 발견하였다(Mamoet al.,Vaccine, 12:988-992, 1994). 다음, Mamo 등은 콜라겐 결합 단백질만으로 면역화된 마우스에서는S. aureus의 추가 접종 감염에 대한 방어가 유도되지 못한다는 사실을 발견하였다.
복막 투석 중인 사람을 대상으로 한 백신 연구에서 전체 사균 포도상구균이 사용되었다(Polle-Warrenet al.,Clin. Nephrol., 35:198-206, 1991). 이러한 임상 실험에서, 염수 주사액을 수여 받은 대조군 환자와 함께, 전체 사균 박테리아의 현탁액과 혼합된 알파-헤모리신 변성독소의 시판용 백신을 12개월에 걸쳐 10회 근육내 투여하였다. 백신접종은 복막액 내의S. aureus세포에 대한 항체 수준 및 혈청 내의 알파-헤모리신에 대한 항체의 수준을 현저하게 증가시켰다. 그러나, 면역접종은 백신 수여자 중의 복막염, 카테터-관련 감염 또는 비강내 세균의 군집 형성의 발생을 저하시키지 못하였다. 이러한 실험에서, 보호 효과의 결여는 최적이하의 백신 제형에서 기인하였다.
분비된 단백질은 비세포 백신의 성분으로서 연구되어 왔다. 알파 독소는 세포용해 활성을 가지며, 조직의 괴사를 유발하여 실험 동물을 죽이는 포도상구균의 가장 강력한 외독소 중의 하나이다. 포름알데하이드로 해독된 알파 독소를 사용한면역접종은 감염의 임상 피해도는 낮출 수 있지만, 전신 또는 국부 감염으로부터 동물을 보호하지 못한다(Ekstedt, R. D., inThe Staphylococci, 385-418, 1972).
포도상구균 감염의 실험 모델 내에서S. aureus마이크로캡슐에 대한 항체의 보호효능을 평가하는 연구가 이루어졌다(Nemeth, J. and Lee, J.C.,Infect. Immun.,63:375-380, 1995). 래트에 마이크로캡슐화 사균 박테리아를 면역접종하거나, 캡슐 다당류에 대하여 특이적인 고역치의 토끼 유래 항혈청을 수동 면역접종하였다. 대조군 동물에는 염수를 주입하거나 정상적인 토끼의 혈청을 수동 면역접종하였다. 그런 다음, 동일한 균주를 정맥내 재투여하고, 이로 인한 카테터-유발 심장 내막염에 대한 보호효과를 평가하였다. 항캡슐 항체의 수준이 증가되었음에도 불구하고, 면역화 동물은 포도상구균성 심장 내막염에 대하여 감수성이었으며, 대조군 동물도 혈액 내에 비슷한 수의 박테리아 수를 가지고 있었다.
하기 발명의 상세한 설명에 설명된 바와 같이, 많은 특허 및 특허 출원에는 피브로넥틴, 피브리노겐, 콜라겐, 엘라스틴, 및 MHC Ⅱ 유사체 유형의 결합 단백질에 대한 유전자 서열이 개시되어 있다. 이들 특허 및 특허 출원은 모두 본 발명에 참고로 인용되었다. 이들 문헌에는 단백질, 단편, 또는 이러한 단백질 또는 단편에 대하여 면역 반응성인 항체가S. aureus감염을 치료하기 위한 백신접종에 사용될 수 있음이 개시되어 있다. PCT/US97/087210호에는 콜라겐 결합 단백질(M55 단편), 피브로넥틴 결합 펩타이드(포물린 처리된 FnBP-A(D1-D3)), 및 피브리노겐 결합 펩타이드(ClfA)의 혼합물을 사용한 마우스의 백신접종이 개시되어 있다.
상기에 개시된 백신으로부터 얻어진 데이터에 나타난 포도상구균의 감염에대한 적절한 보호의 결여는 부적절한 면역접종 스케줄 또는 부적절한 면역접종 루트와 함께, 적절한 면역반응을 유도하는 데 실패하였기 때문인 것 같다.과거 백신의 저조한 성능에도 기여하는 부가의 인자는S. aureus와 같은 포도상구균 박테리아가 agr 및 sar 조절 유전자 자리를 통하여 이들 대부분의 병독성 인자의 발현을 일시적으로 조절하는 것으로 관찰되었다는 점에서 반영될 수 있다. 예를 들면,S. aureus는 세포 표면의 피브리노겐 결합 단백질인 ClfA 및 ClfB를 코딩하는 두 개의 유전자를 함유한다. 흥미롭게도, ClfA는 초기의 지수적 생장기에 우세하게 발현되는 반면, ClfB는 생장 말기에 발현된다. 따라서, 침입 유기체가 숙주에 제공하는 항원은 백신에 사용된 것과 동일한 것일 수 없다. 또한, 모든S. aureus항원이 모든 분리균 상에서 발현되는 것은 아니다. 예를 들면,S. aureus임상 분리균의 약 50%만이 콜라겐 결합 MSCRAMM을 코딩하는cna유전자를 발현시킨다.S. aureus에 대항하는 효과적인 면역치료제를 얻기 위해서는, 백신이 다성분이어야 하고 성장주기에 걸치는 항원을 함유할 뿐 아니라, 대부분의S. aureus분리균에 의하여 발현되는 항원을 포함해야 한다.
S. aureus와 같은 포도상구균 박테리아의 감염을 치료하기 위한 조성물 관련 분야의 발전에도 불구하고, 보다 효과적인 제품, 바람직하게는 다양한 균주의 포도상구균 박테리아에 대한 광범위한 면역 효과를 나타내는 제품, 특히 박테리아 성장기의 상이한 단계에서 발현될 수 있는 특정 단백질이 요구된다.
따라서, 본 발명의 목적은S. aureus및S. epidermidis와 같은 포도상구균 박테리아의 감염에 대한 면역접종용 치료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유선염, 관절염, 심장 내막염, 패혈증, 및 골수염, 절종증, 봉와직염(Cellulitis), 농혈, 폐렴, 농피증, 상처의 화농, 식중독, 방광 감염, 및 기타 감염성 질환에 대한 방어효과를 제공하는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 포도상구균 감염에 대한 면역성을 주고, 포도상구균 박테리아의 세포내 사멸량을 높이고, 포도상구균 박테리아에 대한 식균작용 속도를 증가시키는 치료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 외독소를 중화하여 숙주를 추가 보호하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 박테리아 감염의 치료 및 진단을 위한 생물학적 제제 분야에 관한 것이다.
도 1은 예시적인 백신 MSCRAMM Ⅳ에 사용되는 펩타이드의 개략도로서, 콜라겐 결합 MSCRAMM CNA, 피브리노겐 결합 MSCRAMM ClfA, 피브리노겐 결합 MSCRAMM ClfB, 및 피브로넥틴 결합 MSCRAMM FnBPA 단백질의 필수 구조를 개략적으로 도시한 것이다. MSCRAMM는 재조합 단백질로 발현되고 MSCRAMM Ⅳ로 면역접종된 토끼 내에서 항체 생산에 사용되는 것으로 표시된 부위로 나타내었다. 모든 단백질은 금속 킬레이팅 크로마토그래피에 의한 정제를 용이하기 위하여 아미노 말단 히스티딘 표지를 가지도록 구상되었다.
도 2는 MSCRAMM 백신접종된 붉은 털 원숭이 내에서의 시간경과에 따른 면역반응의 그래프로서, MSCRAMM의 CNA, ClfA, ClfB, 및 FnBPA 각각에 대한 항체의 역치 변화를 나타낸 것이다. 역치는 ELISA에 의하여 분석되었으며, 최초 항원 면역접종 후, 6개월에 걸쳐 매주의 흡광도 변화값으로 측정되었다.
도 3은S. epidermidis유래의 sdrF 유전자에 대한 핵산 서열 및 이들에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 4는S. epidermidis유래의 sdrG 유전자에 대한 핵산 서열 및 이들에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 5는S. epidermidis유래의 sdrH 유전자에 대한 핵산 서열 및 이들에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도시한 것이다.
선택된 몇몇 박테리아 결합 단백질 또는 이들의 단편, 또는 이들 단백질 또는 단편에 대한 항체의 혼합물을 면역접종하면 포도상구균성 감염의 치료효과가 상당히 높아질 수 있음이 발견되었다. 상기 단백질 또는 단편은 활성 백신에 사용될 있으며, 수동 백신 내의 항체로도 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 조성물은 수동 면역접종용의 정제된 혈액 제품을 제조하기 위한 도너 혈액 푸울(pool)을 선별하는 데 사용될 수 있다. 단백질, 단편, 또는 항체를 신중하게 선택하면, 광범위한Staphylococcus박테리아 균주 및 대수적 생장곡선의 상이한 단계에서 발현되는 단백질에 대한 방어능력을 제공하는 백신이 제공된다.
본 명세서에 기재된 백신 및 제품은 유효성을 빠르게 상실하고 있는 작은 항체 분자의 대체물에 대한 의학계의 절실한 요구에 부응한다. 상기 백신을 종래 기술 이상으로 상당히 개선된 것이다. 즉, 종래 기술에서는 면역화를 제공하기 위한MSCRAMM의 용도가 일반적으로는 역설되었지만, 공지된 다수의 MSCRAMM의 혼합물이 우수한 보호능력을 제공하는 데 사용되리라고는 생각하지 못하였다. 상기 백신은 종래 기술을 능가하는 상당히 개선된 것이다.
본 발명의 한 구현예에서는, 피브리노겐 결합 단백질, 바람직하게는 응집 인자 A("ClfA") 또는 응집 인자 B("ClfB"), 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, CNS와 같은 적어도 하나의 콜라겐 결합 단백질 또는 펩타이드(또는 이들의 적절한 자리 특이적 돌연변이 서열), 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 구현예에서는, 피브리노겐 결합 단백질, 바람직하게는 응집인자 A 또는 B(각각 ClfA 또는 ClfB), 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, 적어도 하나의 피브로넥틴 결합 단백질 또는 펩타이드(또는 이들의 적절한 자리 특이적 돌연변이 서열), 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편을 포함하는 조성물이 제공된다.
제3의 구현예에서는, 적어도 하나의 피브리노겐 결합 단백질 A(ClfA) 및 피브리노겐 결합 단백질 B(ClfB), 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편을 포함하는 조성물이 제공된다.
제4의 구현예에서는, (i) 피브리노겐 결합 단백질 A 및 B(ClfA 및 ClfB), 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질또는 단편; 및 (ii) 콜라겐 결합 단백질 또는 이들의 유용한 단편과 함께, 적어도 하나의 피브로넥틴 결합 단백질 또는 펩타이드(또는 이들의 적절한 자리 특이적 돌연변이 서열), 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편을 포함하는 조성물이 제공된다.
부가의 구현예에서는, 엘라스틴 결합 단백질 또는 펩타이드 또는 이들에 대하여 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, 상기 구현예들의 성분을 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 예에서는, MHC Ⅱ 유사 단백질 또는 펩타이드 또는 이들에 대하여 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, 상기 구현예들의 성분을 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 예에서는, 포도상구균의 식균작용의 속도를 증가시키는 박테리아 성분과 함께 임의의 혼합물의 성분을 포함하는 조성물이 제공된다. 이 예에서, 박테리아 성분은 5형 또는 8형의 캡슐 다당류와 같은 캡슐 다당류를 포함한다.
또 다른 예에서는, 세포외 세포간질-결합 단백질인 SdrC, SdrD, SdeE 또는 공통 또는 가변 서열 아미노산 모티브, 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, 위의 임의의 혼합물을 포함하는 조성물이 제공된다.
다른 예에서는, 세포외 매트릭스-결합 단백질인 SdrF, SdrG, SdeH 또는 공통 또는 가변 서열의 아미노산 모티브, 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, 위의 임의의 혼합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 이 구현예는 응고효소-양성 및 응고효소-음성의 포도상구균 박테리아에 관하여 유용할 수 있는 백신의 개발에 특히 효과적이다.
다른 예에서는, 적어도 세포외 매트릭스-결합 단백질인 SdrC, SdrD 및 SdrE 또는 공통 또는 가변 서열의 아미노산 모티브와 같은 이들의 유용한 단편, 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편을 포함하는 조성물이 제공된다.
대안적으로, 상기 성분의 선택된 혼합물에 대하여 면역반응성인 단일 클론성 또는 다중 클론성 항체를 포함하는 조성물들이 제공된다. 이들 조성물은Staphylococcus감염균이 감염된 환자를 치료하기 위한 백신제품에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 단백질, 단편 또는 항체의 혼합물이 진단 키트에 사용된다.
이하에 개시된 바와 같이, 피브로넥틴, 피브리노겐, 콜라겐, 및 엘라스틴에 결합하는 조성물에 사용되는 단백질 및 펩타이드가 공지되어 있다. 대안적으로, 상기 조성물 용도의 새로운 피브로넥틴, 피브리노겐, 콜라겐, 및 엘라스틴 결합 단백질, 또는 이들의 에피토프가 동정될 수 있다. 선택 리간드에 결합하는 결합 단백질의 결합 부위의 펩타이드를 동정하는 방법이 공지되어 있다. 예를 들면, 리간드를 결합 단백질의결합 부위에 결합시키기에 효과적인 조건하에서 후보 단백질 또는 펩타이드와 리간드를 접촉시킨 뒤, 리간드에 결합한 양성의 후보 펩타이드를 동정할 수 있다.
펩타이드는 ECM에 특이적으로 결합하지는 않지만, 면역학적 유효량의 단백질 또는 펩타이드의 혼합물을 포함하는 약리학적 조성물을 동물에 투여함으로써 조성물의 단백질 또는 펩타이드의 결합 부위에 결합하는 항체를 제조할 수 있다.
분리된 재조합 또는 합성의 MSCRAMM 단백질, 또는 이들의 활성 단편 또는 융합 단백질의 혼합물 또한 숙주의 ECM 분자 상의 포도상구균의 결합자리를 동정하는 과학적인 연구 수단으로서 유용하며, 이는 박테리아의 병리 메커니즘에 대한 이해 및 항박테리아 치료법의 개발을 촉진한다. 게다가, 분리된 재조합 또는 합성 단백질, 또는 (에피토프-보유 단편을 포함하는) 이들의 항원성 부분, 또는 이들의 융합 단백질이 MSCRAMM 단백질에 대하여 반응성을 가지는 항혈청의 생산의 위한 면역원 또는 항원으로서 단독으로 또는 면역 보강제(adjuvant)와 함께 동물에 투여될 수 있다. 또한, 이들 단백질은 상기 단백질에 대하여 매우 높은 친화성을 가지는 항체를 유도할 수 있는 과면역 환자에 대한 항혈청을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 항혈청으로부터 분리된 항체는 연구 수단으로서 포도상구균 박테리아 또는 결합 단백질을 특이적으로 검출하는 데 유용하며, 포도상구균의 감염에 대한 치료제로서도 유용하다.
상기 단백질 또는 이들의 활성 단편, 및 상기 단백질에 대한 항체는 상기에 기재된 바와 같이S. aureus와 같은 박테리아 유래의 포도상구균 감염체로부터 감염을 치료하는 데; 능동 또는 수동 면연접종용 항-Staphylococcus백신의 개발; 및 약리학적 조성물로서 상처에 투여하는 경우 또는 의료 기구 또는 시험관내 및 생체내 폴리머성 생체 적합성 물질을 코팅하는 경우에 유용하며, 상기 단백질 및 항체는 상처자리 또는 생체 적합성 물질에 대한 포도상구균 박테리아의 결합을 방지 또는 억제하는 차단제로서 유용하다.
동물 유래의 항체는 그것이 투여되는 환자 내에서 면역원성이 보다 적어지도록 변형되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 환자가 사람인 경우에는, Jones 등의Nature321:522-525(1986) 또는 Tempest 등의Biotechnology9:266-273(1991)에 개시된 바와 같이, 하이브리도마-유래 항체의 상보적인 결정 부위를 사람의 단일 클론성 항체에 이식하여 항체를 "인간화" 할 수 있다.
또한, 포도상구균 감염의 검출용 진단시약으로서 유용한 키트가 제공된다. 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 MSCRAMM 폴리펩타이드는S. aureus와 같은 포도상구균성 박테리아로 감염된 사람을 포함하는 동물 내에서 생산되는 항체 분자에 결합할 있으며, 항-MSCRAMM 항체는 특정한 포도상구균성 박테리아 또는 이들의 항원에 결합할 수 있기 때문에, 본 발명의 MSCRAMM 폴리펩타이드뿐 아니라 항-MSCRAMM 항체도 포도상구균 박테리아에 의한 감염을 검출하기 위한 진단시약으로서 유용하다.
진단시약은 사용 지침 및 기타 적절한 반응시약을 포함할 수 있는 키트 내에 포함될 수 있다. 상기 키트는 또한 예를 들면, 색도표 또는 수치 참조표와 같은 분석결과를 평가하는 수단을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드 또는 항체는 항체에 결합되는 경우에는 MSCRAMM 폴리펩타이드가 검출되도록 하거나,Staphylococcus박테리아에 결합되는 경우에는 항-MSCRAMM 폴리펩타이드 항체가 검출되도록 하는 검출수단으로 표지 될 수 있다.
상기 검출수단은 플루오레세인 아이소시아네이트(FIC) 및 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 등과 같은 형광성 표지시약, 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 및 글루코오스 옥시다아제 등과 같은 효소, 및 감마선을 방출하는125I 또는51Cr과 같은 방사성 원소, 또는 테스트 용액 내에 존재하는 전자와 충돌하는 경우 감마선 방출하는 양성자를 방출하는11C,15O 또는13N과 같은 방사성 원소일 수 있다. 검출수단의 연결 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 하이브리도마에 의하여 생산되는 단일 클론성 항-MSCRAMM 폴리펩타이드 항체 분자는 방사성 동위원소-함유 아미노산을 배양액에 첨가함으로써 대사적으로 표지할 수 있고, 폴리펩타이드는 활성화 작용기를 통해 검출수단과 접합 또는 연결할 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 혈청, 혈장 또는 소변과 같은 체액 샘플 내 다량의Staphylococcus박테리아 또는 항-Staphylococcus항체의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 바람직한 예에서, 본 발명의 MSCRAMM 폴리펩타이드 또는 항-MSCRAMM 폴리펩타이드 항체 조성물은 통상적으로 수계 배지로부터의 흡착시켜 고체 지지체에 결합된다. 유용한 고체 매트릭스는 당 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 가교결합 덱스트란; 아가로스; 폴리스티렌; 폴리비닐클로라이드; 가교결합 폴리아크릴아미드; 니트로셀룰로오스 또는 나일론계 물질; 튜브, 플레이트 또는 소량 역가 플레이트의 웰이 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 항체는 용액 형태 또는 실질적인 건조 분말, 예를 들면 동결 건조된 형태의 진단시약으로 사용될 수 있다.
적어도 다음과 같은 성분들을 포함하는 백신 용도로 적합한 조성물이 제공된다:
(ⅰ) 피브리노겐 결합 단백질, 바람직하게는 응집 인자 A("ClfA") 또는 응집 인자 B("ClfB"), 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 큰 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, CNS와 같은 콜라겐 결합 단백질, 펩타이드 또는 부위(또는 이들의 적절한 자리 특이적 돌연변이 서열), 또는 이들에 대하여 충분히 큰 상동성을 가지는 단백질, 단편 또는 부위;
(ⅱ) 피브리노겐 결합 단백질 A 및 B(ClfA 또는 ClfB), 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 큰 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, 피브로넥틴 결합 단백질 또는 펩타이드(또는 이들의 적절한 자리 특이적 돌연변이 서열), 또는 이들에 대하여 충분히 큰 상동성을 가지는 단백질 또는 단편;
(ⅲ) 피브리노겐 결합 단백질 A(ClfA) 및 피브리노겐 결합 단백질 B(ClfB), 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편;
(ⅳ) 피브리노겐 결합 단백질 A 및 B(ClfA 및 ClfB), 또는 이들의 유용한 단편 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, 피브로넥틴 결합 단백질 또는 펩타이드(또는 이들의 적절한 자리 특이적 돌연변이 서열), 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편; 및 콜라겐 결합 단백질 또는 이들의 유용한 단편, 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편;
(ⅴ) 엘라스틴 결합 단백질 또는 펩타이드 또는 이들에 대하여 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, 상기 임의의 구현예의 성분:
(ⅵ) MHC Ⅱ와 유사한 유형의 결합 단백질 또는 펩타이드, 이들에 대하여 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께, 상기 임의의 구현예의 성분;
(ⅶ)S. aureus와 같은 포도상구균성 박테리아의 식균작용의 속도를 증가시키는 박테리아 성분과 함께 상기 임의의 구현예의 성분;
(ⅷ) 세포외 매트릭스-결합 단백질인 SdrF, SdrG 또는 SdrH, 또는 공통 또는 가변 서열의 아미노산 모티브와 같은 이들의 유용한 단편, 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편과 함께 상기 임의의 구현예의 성분(이때, 상기 성분들로부터 제조되는 백신은S. epidermidis와 같은 응고효소-음성 박테리아뿐 아니라S. aureus와 같은 응고효소 양성 박테리아로부터의 감염에 대해 환자를 면역화하는 데 유용할 것이다); 또는
(ⅸ) 세포외 매트릭스-결합 단백질인 SdrC, SdrD 및 SdrE 또는 공통 또는 가변 서열의 아미노산 모티브와 같은 이들의 유용한 단편, 또는 이들에 대하여 충분히 높은 상동성을 가지는 단백질 또는 단편.
야생형 또는 자연발생 변이체 유래의 유리의 분리 단백질 단편 또는 부위 또는 결합 단백질의 자연발생 결합 부위에 상응하지 않는 야생형, 자연발생 변이체 또는 도입 돌연변이에 해당하는 합성 또는 재조합 펩타이드가 상기 구현예에 사용될 수 있다.
상기 분리 펩타이드는 상기 분리된 펩타이드 및 결합 부위에 결합하여, 이들결합 단백질이 그들의 리간드에 결합하는 것을 방해하는 항체를 제조하기에 충분한 길이를 가져야 한다. 몇몇 양태에서, 펩타이드는 적어도 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 22, 약 24, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45 또는 약 50개의 인접 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 다른 양태에서, 상기 분리 펩타이드는 결합 부위의 야생형 서열로부터 유래되는 적어도 약 6개의 인접 아미노산을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 분리 펩타이드 또는 항체는 동물 내에서 면역학적 반응을 일으키는 데 사용된다. 이 양태에서, 조성물은 면역 보강제를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 백신접종 용도의 많은 면역 보강제가 공지되어 있으며, 이들은 상기 조성물에 용이하게 적용된다. 상기 분리 펩타이드 또는 단백질 조성물은 약리학적으로 허용 가능한 부형제 내에 분산되는 것이 바람직하다.
상기 분리 펩타이드를 선택된 아미노산 서열에 연결하여 융합 단백질을 만들 수 있다. 비제한적인 예로서, 융합 단백질은 선택된 아미노산 서열에 유효하게 연결된 결합 단백질의 결합 부위의 적어도 제1 펩타이드를 포함하도록 만들어질 수 있다. 한 구현예에서, 상기 펩타이드가 피브로넥틴 결합 부위인 경우, 제1 펩타이드는 피브로넥틴에 특이적으로 결합하지 않는다. 바람직한 양태에서, 제1 펩타이드는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH) 및 소의 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 선택된 담체 분자 또는 아미노산 서열에 연결되지만 이는 제한적인 것은 아니다.
백신을 포함하는 면역학적 조성물 및 선택된 MSCRAMM 단백질 또는 이러한 MSCRAMM 단백질을 코딩하는 DNA를 함유하는 기타 면역학적 조성물이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 결합 단백질, 또는 이들의 활성 또는 항원성 단편, 또는 이들의 융합 단백질의 혼합물은 백신 분야의 당업자에게 공지된 방법 및 물질을 사용하여 단독으로 또는 기타의 항원과 함께 제형화 또는 패킹 될 수 있다. 상기 면역학 반응은 치료목적 또는 예방목적으로 사용될 수 있으며, 세포독소성 T 림프구 또는 CD4+T 림프구와 같은 T 림프구에 의하여 유도되는 항체 면역성 또는 세포 면역성을 제공할 수 있다.
백신은 능동 및 수동 면역접종 모두의 용도로 제조될 수 있다. 항원성 물질은 광범위하게 투석하여 원하지 않는 작은 분자량의 분자를 제거하고/제거하거나, 원하는 부형제로의 보다 용이하게 제형화하기 위하여 동결 건조하는 것이 바람직하다.
Ⅰ. 정의
본 명세서에서, FnBP-A 단백질, FnBP-B 단백질, ClfA 단백질, ClfB 단백질, SdrC 단백질, SdrD, SdrE 단백질, SdrF 단백질, SdrG 단백질, SdrH 단백질, CNA 단백질, EbpS 단백질, 및 MHCⅡ 단백질은 각각 FnBP-A, FnBP-B, ClfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS, 및 MHC Ⅱ의 서브부위, FnBP-A, FnBP-B, ClfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS 및 MHCⅡ 단백질의 활성 또는 항원성 단편, 및 이들에 대하여 충분히 큰 상동성을 가지는 단백질 또는 단편을 포함하는 것으로 정의된다. 본 명세서에서, FnBP-A, FnBP-B, ClfA,ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS 및 MHCⅡ 단백질의 활성 단편은Staphylococcus박테리아가 숙주의 ECM에 결합하는 것을 차단할 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드로 정의된다. FnBP-A, FnBP-B, ClfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS 및 MHCⅡ의 항원성 단편은 면역학적 반응을 유도할 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드로 정의된다.
본 명세서에서, "부착인자"란 세포외 매트릭스 단백질에 결합하고/결합하거나 숙주 세포로의 부착을 매개할 수 있는 천연 및 합성 또는 재조합 단백질 및 펩타이드를 의미한다.
본 명세서에서, "아미노산"이란 천연 및 합성 아미노산을 의미하며, 제한적인 것은 아니지만, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타메이트, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘을 포함한다.
"항체"는 특정 에피토프에 결합하는 항체 및 이들의 단편을 포함하는 임의의 면역글로불린이다. 본 명세서에서 "항체"라는 용어의 의미에는 단일 클론성 항체, 다중 클론성 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 이중 특이성 항체, 유인원화 항체, 및 인간화 항체뿐 아니라 FaB 면역글로불린 발현 라이브러리의 산물을 포함하는 Fab 단편도 포함된다.
본 명세서에서 다양한 문법적 형태로 사용되는 "항체 분자"란 온전한 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부위를 의미한다.
본 명세서에서, "항원 기능상 동등한" 단백질 또는 펩타이드는 상기에 개시된 임의의 특정 MSCRAMM 단백질(예를 들면, FnB-B, FnB-A, FnBP-B, 및 FnBP-A)로부터 유래되거나, 상기에 개시된 임의의 특정 박테리아 성분(예를 들면, 테이초이산 (Teichoic acid), 알파 독소 및 5형 캡슐 다당류)으로부터 유래되는 하나 이상의 에피토프와 면역학적 교차-반응성을 가지는 에피토프를 포함하는 것이다. 항원 기능상 동등한, 또는 에티포트성 서열은 먼저 또는 구상된 뒤, 테스트될 수 있거나, 교차-반응성에 대하여 직접 테스트될 수 있다.
본 명세서에서, "pg"는 피코그램을 의미하고, "ng"는 나노그램을 의미하고, "ug" 또는 "μg"은 마이크로그램을 의미하고, "mg"는 밀리그램을 의미하고, "uℓ" 또는 "㎕"는 마이크로리터를 의미하고, "㎖"는 밀리리터를 의미하며, "ℓ"는 리터를 의미한다.
"세포주"는 여러 세대 동안 시험관내에서 안정적으로 성장할 수 있는 1차 세포의 클론을 말한다.
"클론"은 유사분열에 의하여 단일 세포 또는 공통 조상으로부터 유래되는 세포의 군집을 말한다.
DNA "코딩 서열"은 적절한 조절 서열의 통제하에 놓이는 경우, 생체내에서 폴리펩타이드로 전사 및 번역되는 이중가닥의 DNA 서열을 말한다. 상기 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시코돈 및 3' (카르복시) 말단의 번역 종결코돈에 의하여 결정된다. 코딩 서열은, 제한적인 것은 아니지만, 원핵생물의 서열, 진핵생물의 mRNA 유래의 cDNA, 진핵생물(예를 들면, 포유류)의 DNA 유래의 유전자 DNA 서열, 및 심지어는 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3'에 위치한다. "DNA 분자"란 단일가닥 형태 또는 이중나선 구조의 폴리머 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드(아데닌, 구아닌, 티민, 또는 시토신)를 말한다. 이 용어는 1차 및 2차 구조의 분자에만 적용되고, 임의의 특정한 3차 형태에는 적용되지 않는다. 따라서, DNA 분자에는 발견되는 이중가닥 DNA, 특히 직쇄형 DNA 분자(예를 들면, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드, 및 염색체가 포함된다. 특정한 이중가닥 DNA 분자의 구조에 있어서 결론짓자면, 본 명세서에서는 서열을 DNA의 비전사 가닥(즉, mRNA와 상동한 서열을 가지는 가닥)을 따라 5' 방향에서 3' 방향으로만 나타낸다는 규정에 따라 서열들이 기재될 수 있다. 전사 및 번역 조절 서열은 숙주 세포 내에서 코딩 서열의 발현을 위하여 제공되는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 터미네이터 등과 간은 "DNA의 조절 서열"을 말한다.
"발현 통제 서열"이란 다른 DNA 서열의 전사 및 번역을 통제 및 조절하는 DNA 서열을 말한다. RNA 폴리머라아제가 코딩 서열을 mRNA로 전사하는 경우, 코딩 서열은 세포 내에서 전사 및 번역 통제 서열의 "통제하에" 놓이게 된다. 전사된 mRNA는 코딩 서열에 의하여 코딩된 단백질로 번역된다.
본 명세서에서, "세포외 매트릭스 단백질" 또는 ECM이란 피브로넥틴 및 피브리노겐을 포함하는 엘라스틴, 콜라겐, 구조성 당단백질, 및 프로테오글리칸을 포함하는 4개의 일반적인 고분자 군을 의미한다.
"면역학적 유효량"이란 B 세포 및/또는 T 세포의 반응을 자극할 수 있는 함량을 말한다.
본 명세서에서, "생체내 백신"이란 단백질을 동물에 면역접종하여 추후의 병원체 노출로부터 보호하는 체액 및 세포성 반응을 유도하는 것을 일컫는다.
"리간드"란 병원성 박테리아가 부착하는 숙주 세포 내의 분자들을 포함하는 분자를 일컫는 데 사용된다.
본 명세서에서, "MHCⅡ 항원"이란 용어는 이입물에 대한 신속한 거부반응을 담당하며, T-세포에 대한 항원 제시에 요구되는 세포 표면의 분자를 말한다.
문법적으로 다양한 형태로 사용되는 "단일 클론성 항체"란 특정 항원과 면역반응할 수 있는 한 종류의 항체 결합 자리를 가지는 항체를 의미한다.
본 명세서에서 "올리고뉴클레오타이드"란 2개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 3개 이상의 뉴클레오타이드로 이루어지는 분자로 정의되며, 이것의 실제 크기는 올리고뉴클레오타이드의 궁극적인 기능 및 용도에 따라 결정되는 많은 인자에 따라 좌우된다.
본 명세서에서, "약리학적으로 허용 가능한"이란 생리학적으로 허용 가능하고, 통상적으로 사람에게 투여되는 경우에 허용 불가능한 알레르기 반응 또는 이와 유사한 부정적인 반응을 일으키지 않는 분자 본체 및 조성물을 일컫는데 사용된다.
본 명세서에서 "프라이머"란 핵산 가닥과 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드 및 DNA 폴리머라아제와 같은 유도 제제의 존재하의 적절한 온도 및 pH하에 놓이는 경우, 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미하며, 이는 정제된 제한적 분해에서 자연 발생하거나 또는 합성 제조된다. 프라이머는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 유도제의존재하에서 원하는 연장 산물의 합성을 시발하기에 충분한 길이를 가져야 한다. 프라이머의 실제 길이는 온도, 프라이머의 원료, 및 용도를 포함하는 많은 인자에 따라 결정될 것이다. 예를 들면, 진단 제품의 경우에는, 표적 서열의 복잡성에 따라 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 보다 소수의 뉴클레오타이드를 함유할 수도 있지만, 통상적으로 15 내지 25개 이상의 뉴클레오타이드를 함유한다.
본 발명에서, 프라이머는 특정한 표적 DNA 서열의 상이한 가닥과 실질적으로 상보적인 것으로 선택된다. 이는 프라이머가 그들 각각의 가닥과 혼성화되기에 충분한 상보성을 가져야 한다는 것을 의미한다. 따라서, 프라이머 서열은 주형의 실제 서열과 완전히 상보적일 필요는 없다. 예를 들면, 비상보적인 뉴클레오타이드 단편도 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있으며, 이때 상기 프라이머의 나머지 부분은 가닥과 상보적이다. 대안적으로, 비상보적인 염기 또는 보다 긴 서열을 프라이머로 삽입하여, 프라이머 서열이 이들과 혼성화되는 가닥의 서열과 충분한 상보성을 가지도록 함으로써 연장 산물의 합성을 위한 주형을 만들 수도 있다.
"프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 결합 폴리머라아제와 결합하여 하류(3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA의 조절 부위이다. 본 발명을 한정하기 위하여, 프로모터 서열은 전사 개시자리에 의하여 이들의 3' 말단에서 한정되고, 검출 가능한 정도의 전사개시에 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하는 상류(5' 방향)으로 연장된다. 프로모터 서열 내에서는 전사 개시자리(뉴클레아제 S1을 사용한 유전자 지도 작성에 의하여 용이하게 확인됨)뿐 아니라, RNA 폴리머라아제가 결합할 수 있는 단백질 결합 부위(공통 서열)이 발견될 것이다. 진핵생물의 프로모터는 종종 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 함유하지만, 항상 그러한 것은 아니다. 원핵생물의 프로모터는 -10 및 -35 공통 서열 외에도 샤인-달가노 서열을 함유한다.
"복제 단위"는 생체내 DNA 복제의 자율단위로 작용하는 유전자 요소(예를 들면, 플라스미드, 염색체, 바이러스), 즉 복제를 자체적으로 조절할 수 있는 유전자 요소이다.
본 명세서에서, "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"란 이중가닥 DNA의 특정한 회귀성 뉴클레오타이드 서열 또는 인근을 절단하는 박테리아성 효소를 말한다.
"신호 서열"은 코딩 서열 전의 서열을 의미할 수 있다. 이 서열은 숙주 세포로 전달되어 폴리펩타이드를 세포 표면으로 안내하거나 배지로 분비시키는 폴리펩타이드에 대한 N-말단인 신호 펩타이드를 코딩하고, 이러한 신호 펩타이드는 단백질이 세포를 떠나기 전에 숙주 세포에 의해 절단된다. 신호 서열은 원핵생물 및 진핵생물 자생의 다양한 단백질과 결합된 상태로 발견될 수 있다.
본 명세서에서, "자리 특이적 돌연변이 유발원"이란 DNA 분자 내의 특정 자리에서 발생하는 돌연변이의 속도를 증가시킬 수 있는 화합물을 일컫는다.
외인성 또는 이종 DNA가 세포 내부로 유입되는 경우, 세포는 이들 DNA에 의하여 "형질전환"된다. 형질전환 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA로 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 원핵생물(?), 예를 들면 효모 및 포유류 세포에서, 형질전환 DNA는 플라스미드와 같은 에피솜 요소 상에 보유될 수 있다. 진핵생물의 경우, 안정적으로 형질 전환된 세포는 형질전환 DNA가 염색체로 통합되고, 이것이 염색체 복제를 통해 딸세포에 의하여 유전되는 세포이다. 이러한 안정성은 진핵 생물의 세포가 형질전환 DNA를 함유하는 딸세포 군집으로 이루어지는 세포주 또는 클론을 정착시키는 능력에 의하여 평가된다.
"벡터"는 다른 DNA 분절에 부착되어 부착된 분절의 복제를 유도할 수 있는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 복제 단위이다.
본 명세서에서 "상처"란 상피 세포층 및 조직위의 기타 표면 구조가 기계적, 화학적 또는 그 밖의 영향에 의하여 손상된 것을 의미하는 데 사용된다.
"면역학적 유효량"이란 수용체 동물 내에서 면역반응을 일으킬 수 있는 펩타이드 조성물의 함량을 의미한다. 이때, 면역반응은 항체 반응(B 세포 반응)의 유도 및/또는 세포독성 면역 반응(T 세포 반응)의 자극 모두를 포함한다. 이러한 면역 반응의 유도는 진단용 구현예 용도로 유용한 생체 반응물, 예를 들면 CTL, 보다 구체적으로 반응성 항체의 제조에 유용하고, 다양한 예방 및 치료용 구현예에도 유용할 것이다.
사용된 조성물 내의 선택된 박테리아 결합 단백질 또는 이들 단편의 혼합물에는 피브로넥틴, 피브리노겐, 콜라겐, 및 엘라스틴에 결합하는 것들이 포함된다. 이러한 임의의 단백질, 펩타이드, 이들의 단편, 또는 이들과 실질적으로 상동한 서열이 본 발명에 사용될 수 있으며, 그 실례를 하기에 개시하였다. 또한 MHC Ⅱ 유사체에 대한 박테리아성 결합 단백질 또는 단편도 하기에 개시하였다.
Ⅱ. 피브로넥틴-결합 MSCRAMM
피브로넥틴(Fn)은 ECM 및 동물의 체액 내에서 발견되는 440 kDa의 당단백질이다. 피브로넥틴의 생물학적 주요 기능은 적절한 인테그린을 발현하는 세포의 부착을 위한 기질로서 제공되는 능력과 관련된 듯 하다. 몇몇 박테리아 종은 특이적으로 피브로넥틴에 결합하여 피브로넥틴-함유 기층에 부착하는 것으로 밝혀졌다. 대부분의S. aureus분리균은 피브로넥틴에 결합하지만, 그 정도가 다양하고, 이는 박테리아 세포의 표면상에서 발현되는 MSCRAMM 분자 수에 있어서의 다양성을 반영한다. 피브로넥틴과S. aureus간의 상호작용은 매우 특이적이다(Kuusela, P.,Nature, 276:718-20, 1978). 피브로넥틴의 결합은 FnBP-A 및 FnBP-B라 불리는 110 kDa의 분자량을 가지는 단백질에 노출된 두 표면에 의하여 매개된다. 피브로넥틴의 1차 결합자리는 3회 내지 5회 반복되는 35 내지 40개의 아미노산 모티브로 이루어진다. 이들에 대한 유전자가 클로닝 및 서열 결정되었다(Jonsson, K.,et al.,Eur. J. Biochem., 202:1041-1048, 1991).
WO-A-85/05553호에는 피브로넥틴, 피브리노겐, 콜라겐, 및 라미닌 결합 능력을 가지는 박테리아 세포의 표면 단백질이 개시되어 있다.
Hook 등에게 허여된 미국특허 제5,320,951호 및 제5,571,514호에는 피브로넥틴 결합 단백질 A(fnbA)의 유전자 서열, 이 서열을 근거로 한 제품 및 방법이 개시되어 있다.
Hook 등에게 허여된 미국특허 제5,175,096호에는 fnbB의 유전자 서열, 혼성 DNA 분자(fnbB) 및 이들 서열을 근거로 한 생물학적 제품 및 방법이 개시되어 있다.
미국특허 제5,652,217호에는 한정된 서열의S. aureus유래의 혼성 DNA 분자에 의하여 코딩되는 결합 활성을 가지는 분리 및 정제 단백질이 개시되어 있다.
미국특허 제5,440,014호에는 포도상구균 감염에 의하여 유발되는 유선염에 대비한 반추동물의 백신접종, 상처 치료, 단백질 수용체 차단, 기타 동물의 면역접종, 또는 진단 분석용으로 사용될 수 있는S. aureus의 피브로넥틴 결합 단백질의 D3 상동 단위 내의 피브로넥틴 결합 펩타이드가 개시되어 있다.
미국특허 제5,189,015호에는 포유류 내에서 피브로넥틴에 결합하는 능력을 가지는S. aureus박테리아 균주의 군집 형성을 예방 치료하는 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 포유류에게 피브로넥틴 결합 특성을 가지는 단백질을 예방 치료 유효량으로 투여하여 피브로넥틴에 결합하는 능력을 가지는S. aureus박테리아 균주에 의하여 유발되는 감염의 발생을 예방하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 단백질은 87 kDa 내지 165 kDa의 분자량을 갖는다.
미국특허 제5,416,021호에는E. coli에 함유된S. dysgalactiae유래의 피브로넥틴 결합 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드,Streptococcus dysgalactiae유래의 피브로넥틴 결합 단백질을 코딩하는 DNA,S. dysgalactiae유래의 피브로넥틴 결합 단백질을 코딩하는 DNA, 및S. dysgalactiae유래의 피브로넥틴 결합 단백질을 코딩하는 DNA에 의하여 형질 전환된E. Coli미생물과 함께,Streptococcus dysgalactiae유래의 피브로넥틴 결합 단백질 코딩 DNA가 개시되어 있다.
야생형 피브로넥틴 결합 단백질에 대한 항체는 피브로넥틴에 결합하는S.aureus의 능력을 실질적으로는 억제하지 못하므로, 생체내에서 현격한 치료 효과를 나타내지 못하는 것으로 밝혀졌다. PCT/US98/01222호에는 피브로넥틴이 피브로넥틴 결합 단백질에 결합하는 것을 차단하는 항체가 개시되어 있다. 상기 항체는 피브로넥틴에 결합하지 못하는 자리-특이적으로 돌연변이된 피브로넥틴 결합 단백질의 서열에 대항하여 증가되었다. 생체내에서 피브로넥틴과 피브로넥틴 결합 단백질 및 단편의 신속한 복합체 형성이 동정되었다. 피브로넥틴에 결합하지 못하는 펩타이드 에피토프는 피브로넥틴 결합 단백질의 피브로넥틴 결합 부위로 이루어 졌음에도 불구하고, 생체내에서 피브로넥틴과 복합체를 형성하지 않는다. 이는 복합체를 형성하지 않는 펩타이드 에피토프에 대한 항체의 형성을 유도하고, 이러한 항체는 피브로넥틴이 피브로넥틴 결합 단백질에 결합하는 것을 억제 또는 차단한다.
Ⅲ. 콜라겐-결합 MSCRAMM
콜라겐은 연골의 주요 성분이다. 콜라겐(Cn) 결합 단백질은 보통 포도상구균 균주에 의하여 발현된다.S. aureus의 Cn 결합 MSCRAMM는 포도상구균성 감염에서 발병 메커니즘의 중요한 부분을 구성하는 과정에서 연골에 부착한다(Switalski,et al.,Mol. Micro.7(1), 99-107, 1993).S. aureus에 의한 콜라겐의 결합은 적어도 관절염 및 패혈증에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 밝혀졌다. 133, 110, 및 87 kDA의 분자량을 가지는 CNA가 동정되었다(Patti, J.,et al.,J. Biol. Chem., 267:4766-4772, 1992). 상이한 분자량을 가지는 CNA를 발현시키는 균주들은 그들의 콜라겐 결합 능력에 있어서 차이가 없었다(Switalski, L.M.,et al.,Mol. Microbiol., 7:99-107, 1993).
패혈성 관절염 및 골수염 진단을 받은 환자의 관절로부터 회수된 포도상구균 균주는 거의 일정하게 CBP를 발현시키는 반면, 상처 감염 부위로부터 얻어진 상당히 작은 수의 분리균은 이러한 부착인자를 발현시킨다(Switalski,et al.,Mol. Microbiol., 7:99-107, 1993). 마찬가지로, 골수염을 가지는 환자의 뼈에서 분리된S. aureus균주는 종종 뼈-특이성 단백질인 뼈의 시알로 단백질(bone sialoprotein; BSP)을 인식하는 MSCRAMM를 함유한다(Rydenet al.,Lancet, 11:515-518, 1997). 관절영역 내의 관절성 연골에 대한S. aureus의 군집 형성은 패혈성 관절염을 일으키는 중요 요인인 것 같다.
PCT WO 92/07002호에는 콜라겐 결합 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는S. aureus유래의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 혼성 DNA 분자, 및 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 또는 파지가 개시되어 있으며, 콜라겐 결합 단백질을 발현하는E. coli균주, 재조합 DNA에 의하여 형질 전환되는 미생물, 콜라겐 결합 단백질 또는 폴리펩타이드의 제조 방법, 및 콜라겐 결합 단백질 또는 폴리펩타이드의 단백질 서열도 함께 개시되어 있다.
S. aureus의 CBP를 코딩하는cna유전자가 클로닝, 서열결정, 및 발현 되었다(Patti, J.,et al.,J. Biol. Chem., 267:4766-4772, 1992).cna유전자는 그람-양성 박테리아로부터 분리되는 표면 단백질에 특징적인 구조적 부분을 함유하는 133 kDA의 부착인자를 코딩한다.
최근, 리간드-결합 자리가 CBP의 N-말단의 절반이내로 국한되었다(Patti, J.,et al.,Biochemistry, 32:11428-11435, 1993). MSCRAMM의 상이한 분절에 해당하는 재조합 단백질의 콜라겐 결합 활성을 분석함으로써, 상당한 콜라겐 결합 활성을 가지는 186개 아미노산 길이(151 내지 318개의 아미노산 잔기에 해당함)의 단백질 단편이 동정되었다. 이러한 단백질의 N 또는 C 말단에서의 짧은 절단은 리간드의 결합 활성을 손상시켰을 뿐 아니라, 원평광 이색성 분석법에 의하여 확인되는 단백질 내의 형태변화를 초래하였다.
Patti 등의J of Biol. Chem., 270, 12005-12011(1995)에는cna유전자에 의하여 코딩되는S. aureus부착인자 내의 콜라겐 결합 에피토프가 개시되어 있다. 이 연구에서, 저자는 상기 단백질의 서열로부터 유래되는 펩타이드를 합성하여 항체 제조에 사용하였다. 이러한 항체의 몇몇은 상이 단백질이 콜라겐에 결합하는 것을 억제한다.
PCT/US97/08210호에는 콜라겐 결합 단백질의 몇몇 동정된 에피토프(M55, M33, 및 M17)가 보호성 항체의 생산에 사용될 수 있음이 개시되어 있다. 상기 문헌에는 또한 콜라겐이 CBP에 결합하는 것을 방해 또는 완전히 차단하는 조성물을 동정하는 데 필요한 결정적인 정보를 제공하는 CBP의 결정 구조가 개시되어 있다.S. aureus의 CBP 및 25개 아미노산 펩타이드 내의 리간드-결합 자리는S. aureus가125Ⅰ 표지된 Ⅱ형 콜라겐에 결합하는 것을 직접적으로 억제하는 것으로 특성을 갖는다.
Ⅳ. 피브리노겐-결합 MSCRAMM
피브린은 혈괴의 주요 성분이며, 피브리노겐/피브린은 이식된 생체 적합 물질 상에 침착되는 주요 혈장 단백질 중 하나이다. 박테리아의 피브리노겐/피브린 결합이 기구-관련 감염을 개시함에 있어 중요하다는 제안을 뒷받침하는 증거는 상당히 많다. 예를 들면, Vaudaux 등은S. aureus가 시험관내에서 투여량-의존적 방식으로 피브리노겐으로 코팅된 플라스틱에 부착된다는 것을 밝혀졌다(J. Infect. Dis., 160:865-875 (1989)). 또한, Herrmann 등은 혈병을 모방한 모델 또는 심장 판막이 손상된 모델 내에서,S. aureus가 피브리노겐 다리를 통하여 표면에 부착된 혈소판에 격렬하게 결합한다는 사실을 입증하였다(J. Infect. Dis., 167:312-322 (1993)).S. aureus는 시험관내에서 형성된 혈괴 내의 피브리노겐에 직접 부착할 수 있으며, 다리의 기능을 하는 혈장 유래의 침착된 피브리노겐을 통하여 배양된 내피 세포에 부착할 수 있다(Moreillonet al,J. Infect. Immun.,63:4738-4743 (1995); Chenget al.,J. Clinm. Invest., 87:2236-2245 (1991)). Vaudaux 및 Moreillon 등에 의하여 밝혀진 바와 같이, 피브리노겐 결합 단백질인 응집 인자(ClfA)에 결함이 있는 돌연변이는 시험관내 피브리노겐, 외식 카테터, 혈괴, 및 심장 결막염에 대한 래트 모델 내에서 손상된 심장 판막과의 부착이 저하된 것으로 나타났다(Vaudauxet al.,J. Infect. Immun.63:585-590 (1995); Moreillonet al,J. Infect. Immun.,63:4738-4743 (1995)).
종종, "응집 인자"라 불리는 피브리노겐에 대한 부착인자는S. aureus세포의 표면상에 위치한다. 용액 내에서 박테리아와 피브리노겐 사이의 상호작용은 박테리아 세포의 즉각적인 응집을 초래한다. 피브리노겐 상의 결합 자리는 피브리노겐 당단백질 다이머의 감마 사슬의 C-말단에 위치한다. 친화성은 매우 높고, 응집은 저농도의 피브리노겐 내에서 발생한다. 최근, 과학자들은 응집 인자 또한 고체상태의 피브리노겐, 혈괴, 및 손상된 심장 판막과의 부착을 촉진한다는 것을 밝혀내었다(McDevittet al.,Mol. Microbiol., 11:237-248 (1994); Vaudauxet al.,J. Infect. Immun.,63:585-590 (1995); Moreillonet al,J. Infect. Immun.,63:4738-4743 (1995)).
S. aureus내의 두 유전자가 피브리노겐 결합 단백질인 ClfA 및 ClfB를 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 그 유전자인 clfA를 클로닝 및 서열 결정하여, 92 kDa의 폴리펩타이드를 코딩한다는 것을 발견하였다. ClfA는 피브리노겐의 감마 사슬에 결합하고, ClfB는 알파 및 베타 사슬에 결합한다(Eidhinet al.,Mol Micro., 발행 대기 중, 1998). ClfB는 88 kDA의 예상 분자량 및 124 kDa의 겉보기 분자량을 가지는 세포벽 관련 단백질로서, 용해성 및 고정 피브리노겐 모두에 결합하고 응집 인자로서 작용한다.
ClfA로 지정된 응집 인자 단백질에 대한 유전자가 분자 수준에서 정밀하게 클로닝, 서열결정, 및 분석되었다(McDevittet al.,Mol. Microbiol., 11:237-248 (1994); McDevittet al.,Mol. Microbiol., 16:895-907 (1995)). 예상 단백질은 993개의 아미노산으로 구성된다. 39개의 잔기로 이루어진 신호 서열이 N-말단에서 나타나고, 그 뒤에 피브리노겐 결합 부위를 함유하는 520개의 잔기로 이루어진 부위(A 부위)가 온다. 다음, 308개의 잔기로 이루어진 부위(R 부위)는 디펩타이드 세린-아스파르테이트의 154 반복서열로 구성된다. R 부위의 서열은 GAY TCN GAY TCN GAY AGY로 구성되는 18개 염기 쌍의 반복서열에 의하여 코딩된다. 여기서, Y는 피리미딘이고 N은 임의의 염기를 의미한다. ClfA의 C-말단은 세포벽, 막 고정자(anchor), 및 맨 끝 C-말단의 양 전하 잔기에 단백질을 고정시키는 기능을 담당하는 LPDTG 모티브와 같은, 그람-양성 박테리아의 표면 단백질에 존재하는 특징적인 구조를 갖는다.
혈소판의 인테그린 알파 Ⅱbβ3은 피브리노겐의 감마 사슬의 C-말단을 인식한다. 이는 응고 시 혈괴 형성을 함에 있어 중대한 사항이다. ClfA는 혈소판 응고를 방해할 수 있고, 감마 사슬의 C-말단에 대응하는 펩타이드(198-411)는 피브리노겐과 반응하는 인테그린 및 ClfA 모두를 방해할 수 있기 때문에, ClfA 및 알파 Ⅱbβ3은 피브리노겐 감마 사슬 상의 동일한 자리를 정확하게 인식하는 것으로 여겨진다(McDevittet al.,Eur. J. Biochem., 247:416-424 (1991)). 알파 Ⅱbβ3의 피브리노겐 결합 자리는 "EF 핸드"라 불리는 Ca2+결합 결정자 인접하거나 중첩된다. ClfA의 A 부위는 EF 핸드와 유사한 몇몇 모티브를 함유한다. 3 내지 5 mM 범위의 Ca2+의 농도는 이들 ClfA-피브리노겐의 상호작용을 차단하고 ClfA 단백질의 2차 구조를 변화시킨다. ClfA EF 핸드에 영향을 주는 돌연변이는 피브리노겐과의 상호작용을 저하시키거나 방해한다. Ca2+및 피브리노겐 감마 사슬은 ClfA의 A 부위 내의 동일자리에 결합하거나 ClfA의 A 부위 내의 자리에 중첩되는 것 같다.
백혈구 인테그린의 알파 사슬인 알파 MB2는 리간드 결합 활성을 담당하는 200개의 아미노산 삽입부위(A 또는 I 부위)를 갖는다. I 부위 내의 신규한 양이온-의존성 부착인자 자리(MIDAS) 모티브는 리간드 결합에 필요하다. 인식되는리간드 중 하나가 피브리노겐이다. 피브리노겐 상의 결합 자리는 감마 사슬(190 내지 202개의 잔기)상에 있다. 최근,Candida albicans가 진핵생물의 인테그린을 암시하는 특성을 가지는 표면 단백질인 알파 Intlp를 함유하고 있음이 보고되었다. 상기 표면 단백질은 MIDAS 모티브를 포함하는 Mβ2의 I 부위과 상동한 아미노산 서열을 갖는다. 더욱이, Intlp는 피브리노겐에 결합한다.
ClfA의 A 부위는 또한 알파 Intlp와 상동한 다소의 서열을 나타내었다. ClfA의 A 부위의 서열에 대한 연구를 통하여 잠재성 MIDAS 모티브가 밝혀졌다. ClfA 내 MIDAS 모티브의 DxSxS 부위 내의 잔기에 해당하는 추정 양이온의 돌연변이는 피브리노겐 결합에 있어 현격한 감소를 초래한다. O'Connel 등에 의하여 알파 Mβ2의 감마-사슬 결합 자리에 해당하는 펩타이드(190-202)가 ClfA-피브리노겐의 상호작용을 억제한다는 사실이 밝혀졌다(O'Connel,J. Biol. Chem., 발행 중, 1998). 따라서, ClfA는 피브리노겐의 감마 사슬의 개별적인 두 자리에 결합할 수 있다. ClfA 상의 리간드 결합 자리는 진핵생물의 인테그린에 의하여 사용되는 것들과 유사하며, 이가 양이온 결합 EF-핸드 및 MIDAS 모티브를 포함한다.
ClfB도 피브리노겐 결합 단백질로 공지되었다. 본 발명에는 상기 단백질뿐 아니라 상기 단백질에 대한 항체 및 상기 단백질 또는 이들의 항체를 포함하는 진단 키트가 사용된다. ClfB는 대략 88 kDa의 예상 분자량 및 대략 124 kDa의 겉보기 분자량을 갖는다. ClfB는 세포벽 관련 단백질로서, 용해성 및 고정 피브리노겐 모두에 결합한다. 또한, ClfB는 피브리노겐의 알파 및 베타 사슬 모두에 결합하고 응집 인자로서 작용한다.
피브리노겐 결합 ClfA 및 ClfB와 관련된 단백질도 세포외 매트릭스에 결합하는 것으로 밝혀졌다. SdrC, SdrD, 및 SdrE 단백질은 ClfA 및 ClfB 단백질에 대한 1차 서열 및 구조적 기구와 관련되며, 세포 표면상에 위치한다. 세포 표면상에 위치하는 이러한 단백질의 A 부분과 함께, 상기 단백질은 혈장내 단백질, 세포외 매트릭스 또는 숙주 세포의 표면상의 분자와 상호 작용할 수 있다. SdrC는 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들면 비트로넥틴에 결합할 수 있다. SdrE 또한 세포외 매트릭스, 예를 들면 뼈의 시알 단백질(BSP)에 결합한다.
SdrC, SdrD, SdrE ClfA, 및 ClfB의 A 부위에는 공통의 TYTFTDYVD 모티브를 유도하는 데 사용될 수 있는 고도로 보존된 아미노산 서열이 존재한다. 상기 모티브는 박테리아의 감염에 대하여 광범위한 면역성을 제공하는 다성분 백신에 사용될 수 있으며, 광범위한 수동 면역성을 제공하는 단일 클론성 또는 다중 클론성 항체의 제조에도 사용될 수 있다. 대안적인 구현예에서는, Sdr 및 Clf 단백질 군으로부터 유래되는 가변 서열 모티브의 임의의 혼합물인 (T/I)(Y/F)(T/V)(F)(T)(D/N)(Y)(V)(D/N)이 면역성을 제공하거나 보호성 항체를 유도하는데 사용될 수 있다.
Ⅴ. 엘라스틴-결합 MSCRAMM
엘라스틴의 주된 역할은 조직 및 기관에 가역적인 탄성을 제공하는 것이다(Rosenbloom, J.,et al.,FASEB J., 7:1208-1218, 1993). 엘라스틴은 폐, 피부, 및 혈관 내에서 가장 많이 발현되지만,S. aureus에 대한 포유류 숙주 내에서도 광범위하게 발현된다.S. aureus의 엘라스틴과의 결합은 신속하고 가역적이며 친화성이 높고 리간드 특이성인 것으로 밝혀졌다. 또한, 25 kDa의 세포 표면의 엘라스틴 결합 단백질(EbpS)이 분리되었으며, 이들이S. aureus가 엘라스틴이 풍부한 숙주의 ECM에 결합하는 것을 매개하는 것이라고 제안되었다.
PCT/US97/03106호에는 엘라스틴 결합 단백질에 대한 유전자 서열이 개시되어 있다. 개시된 DNA 서열 데이터에는 ebps 오픈 리딩 프레임이 606 bp로 이루어지며, 202개 아미노산의 신규한 폴리펩타이드를 코딩하는 것으로 나타나 있다. EbpS 단백질은 23,345 달톤의 예상 분자량 및 4.9의 pI를 갖는다. EbpS는 N-말단에 부착된 폴리히스티딘 잔기를 가지는 융합 단백질로서E. coli내에서 발현되었다. 제조한 EbpS에 대항하여 증가되는 다중 클론성 항체는 25 kDa의 세포 표면의 EbpS와 특이적으로 반응하였으며, 포도상구균의 엘라스틴 결합을 억제하였다. 더욱이, 재조한 EbpS는 고정 엘라스틴에 특이적으로 결합하여 엘라스틴에 대한S. aureus의 결합을 억제하였다. 그러나, 상기 분자의 처음 59개의 아미노산이 결여된 재조합 EbpS의 분해 산물 및 CNBr-절단 재조합 EbpS의 C-말단 단편은 엘라스틴과 상호작용하지 못하였다. 이러한 결과는 EbpS가S. aureus의 엘라스틴과의 결합을 매개하는 표면 분자임의 강하게 시사한다. 몇몇 재조합 EbpS의 구조체는 엘라스틴과 상호작용하지 않는다는 발견은 EbpS 내의 엘라스틴 결합 자리가 상기 분자의 처음 59개의 아미노산 내에 존재함을 시사한다.
독립적인 여러 연구자료에는 EbpS가 세포의 엘라스틴의 결합을 매개하는 표면 단백질인 것으로 나타나 있다. 첫째, EbpS는 투여량-의존적 방식으로 고정 엘라스틴에 특이적으로 결합하여S. aureus세포가 엘라스틴에 결합하는 것을 억제한다. 이러한 결과는 EbpS가 용해성 형태에서 기능적으로 활성인 엘라스틴 결합 단백질임을 뒷받침한다. 둘째, EbpS에 대항하여 증가되는 항체는S. aureus세포의 세포 표면상에서 발현되는 25 kDa의 단백질을 인식한다. 크기 유사성 및 항체 반응성 외에도, 이러한 25 kDa의 단백질이 세포 표면의 EbpS일 것이라는 점에 대한 다른 증거로는, 과량의 비표지 rEbpS의 존재하에서 25 kDa의 단백질이 고정된 항-rEbpS IgG에 결합하는 것이 억제된다는 사실을 밝힌 실험을 들 수 있다. 끝으로, 항-rEbpS 항체로부터 제조된 Fab 단편은 이들의 사전면역 대조군을 제외하고는S. aureus가 엘라스틴에 결합하는 것을 억제한다. 이러한 결과는 표면 EbpS의 형태가 엘라스틴 결합 자리가 리간드(즉, 엘라스틴 및 항-rEbpS Fab 단편)와의 상호작용에 용이한 형태임을 암시한다. 상기의 데이터를 종합하면, EbpS가S. aureus와 엘라스틴의 결합을 담당하는 세포 표면의 단백질임이 입증된다.
본 발명 및 종래의 연구결과는 표면 발현 전, C 말단에서의 프로세싱이 요구되는 기능적으로 활성인 EbpS의 40 kDa의 세포내 전구체 형태의 존재를 시사한다. 이러한 견해는 다음과 같은 관찰결과를 근거로 한다:
ⅰ) 세포 표면의 표지 실험 중에 전혀 검출되지 않는 40 kDa의 세포내 엘라스틴 결합 단백질이 존재한다;
ⅱ) 상기 25 kDa의 EbpS 및 40 kDa의 엘라스틴 결합 단백질은 동일한 N-말단 서열을 갖는다; 그리고
ⅲ) EbpS에 대한 단일 유전자가 존재한다.
ebps오픈 리딩 프레임의 크기는 40 kDa의 단백질을 코팅할 정도로 충분하지못하기 때문에, 처음에는 본 발명자들은 이와 같은 무시하였다. 그러나, rEbpS를 사용한 연구에서, 재조합 단백질은 실제 크기가 26 kDa임에도 불구하고, SDS-30 PAGE 내에서 45 kDa의 단백질로서 비정상적으로 이동한다는 사실이 입증되었다. 이러한 연구결과는 23 kDa의 예상 크기를 가지는 전체길이의 자생 EbpS가 SDS-PAGE 내에서 40 kDa의 세포내 전구체로서 이동할 수 있으며, 25 kDa 표면 형태의 EbpS가 실제로는 C-말단이 프로세싱된 것보다 작은 형태의 분자임을 시사한다. EbpS에는 N-말단의 단일 펩타이드 및 기타 공지된 선별 및 정착 신호가 없지만, 이와 같이 제안된 세포내 프로세싱 과정은 EbpS가 세포 표면으로 표적화되는 방법에 대한 몇 가지 의문점들을 설명해 줄 수 있다. 실제로, C-말단의 신호 펩타이드가 여러 박테리아 단백질 내에서 동정되었으며(Fath, M.J. and Kolter, R.,Microbiol. Rev., 57:995-1017, 1993), 그람-양성 박테리아 내에서도 세포 표면에 단백질을 정착시키는 다른 수단이 보고되었다(Yother, J. and White, J.M.,J. Bacteriol., 176:2976-2985, 1994).
EbpS 단편 및 재조합 구조체를 중첩시키는 방법을 사용하여, 분자의 아미노 말단 부위에 대한 EbpS 내의 엘라스틴 결합 자리의 유전자 지도가 작성되었다(PCT/US97/03106). 이어서, 합성 펩타이드 스패닝 아미노산 14-34의 중첩방법이 결합 부위의 보다 명확하게 규정하는 데 사용되었다. 이들 중에서, 14-23 잔기 및 18-34 잔기에 해당하는 펩타이드는 엘라스틴 결합을 95% 이상 특이적으로 억제하였다. 모든 활성의 합성 펩타이드 및 EbpS의 단백질-가수분해 및 재조합단편의 공통서열은18Thr-Asn-Ser-His-Gln-Asp23헥사머 서열이다. 이러한 서열이 엘라스틴 결합에 중요하다는 것에 대한 또 다른 증거로는, 18-34 잔기에 해당하는 합성 펩타이드 내의 Asp23이 Asn으로 치환된 경우, 활성이 상실되었음을 들 수 있다. 그러나, 합성의 헥사머 TNSHQD 단독으로는 포도상구균이 엘라스틴에 결합하는 것을 억제하지 못하였다. 이러한 연구결과는 TNSHQD 서열의 존재가 EbpS의 활성에 필수적이기는 하지만, 엘라스틴 인식에는 N-말단 또는 C-말단 방향의 측면 아미노산 및 Asp23의 카르복시 측쇄가 요구됨을 가리킨다.
Ⅵ. MHC Ⅱ-유사 단백질(MAP)
피브리노겐, 피브로넥틴, 콜라겐, 및 엘라스틴 외에도,S. aureus균주는 기타 진핵생물의 부착성 단백질과 관련있으며, 그 대부분은 비트로넥틴과 같은 부착성 매트릭스 단백질 군에 속한다(Chatwalet al.,Infect. Immun., 55:1878-1883, 1987). 미국특허 제5,648,240호에는 약 70 kDa의 분자량을 가지는S. aureus의 다양한 부착인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 분절이 개시되어 있다. 상기 부착인자는 피브로넥틴 또는 비트로넥틴과 결합할 수 있으며, 약 30개 아미노산의 MHC Ⅱ 유사 단위를 포함한다. 더 나아가, 이 단백질의 결합 특이성을 분석한 결과, 이들이 합성 펩타이드와 결합한다는 점에서 MHC Ⅱ 항원과 기능적으로 유사하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이들은 ECM 단백질로의 박테리아의 부착을 매개하는 것 외에도, 포도상구균의 감염에서도 숙주의 면역계를 억제하는 역할을 담당할 수 있다. 또한, 특정화 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기벡터에 의하여 형질전환되는 재조합 숙주 세포, 특정화 서열의 DNA와 혼성화하는 DNA도 본 발명의 범위에 포함된다. 특정화 DNA 서열에 의하여 코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물, 및 동물 내에서 면역반응을 유도하는 방법으로서, 상기 코딩 단백질 및 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법도 본 발명에 개시되어 있다. 특정화 DNA 서열을 적절한 발현 벡터에 삽입하는 단계 및 MHC Ⅱ 항원 단백질 유사체를 생산하는 조건하에서 상기 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 MHC Ⅱ 항원 단백질 유사체를 제조하는 방법 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
Ⅶ. Staphylococcus epidermidis 유래의 SDR 단백질
응고효소-음성 박테리아인Staphylococcus epidermidis는 사람 피부에 존재하는 보편적인 서식체이며, 자주 이입체 감염의 원인이다. 먼저 인공 판막, 정형외과적 기구, 및 정맥내 및 복막의 투석 카테터와 같은 내재된 의료 기구에 부착한 뒤, 그 위에서 생체막을 형성하는 유기체의 능력에 발병이 촉진된다. 기구-관련 감염은 의학적 치료 결과에 부정적인 영향을 주고, 환자의 사망률을 현격하게 증가시킬 수 있다. 따라서,S. epidermidis감염의 발생을 통제 또는 예방할 수 있는 백신을 개발하는 능력이 상당히 중요하며, 이것은 응고효소-양성 및 응고효소-음성 박테리아를 동시에 포함하는 다양한 박테리아로부터의 감염을 예방 및 치료할 수 있는 다성분 백신을 개발하는 것이다.
S. epidermidis에 의하여 발현되는 3종류의 Sdr(세린-아스파르테이트(SD) 반복 부위) 단백질을 SdrF, SdrG, 및 SdrH로 지정되었다. 이들 단백질의 아미노산서열 및 이들의 핵산 서열을 도 3 내지 도 5에 개별적으로 도시하였다. 또한, 이들 단백질에 대한 보다 상세한 설명은 본 발명과 함께 계류 중인 Foster 등의 미국 특허 출원에 개시되어 있다. 상기 미국출원은 미국 가출원 제60/098,443 및 제60/117,119호에 근거하며, 이들 출원은 본 발명에 참고로 인용되었다.
본 발명에 따르면, SdrF, SdrG, 및 SdrH 단백질과 함께 상기 임의의 구현예의 성분을 포함하는 백신으로서 유용한 조성물이 제공된다. 또한, 이들 단백질에 대한 항체는 종래의 방법들을 사용하여 증가될 수 있으며, SdrF, SdrG, 및 SdrH 단백질에 대한 항체는 본 명세서에 기재된 기타 부착인자에 대한 항체를 사용하는 상기 임의의 혼합물에 사용될 수 있다. 따라서, SdrF, SdrG, 및 SdrH와 같은 SDR 단백질을 포함하는 혼합물 및 백신은 응고효소-양성 및 응고효소-음성 박테리아에 의하여 유발되는 광범위한 박테리아의 감염을 치료하는 데 사용될 수 있다.
Ⅷ. 박테리아 성분
본 발명의 구현예에서는, S. aureus의 옵소닌화(opsonization) 및 발병 작용의 속도를 증가시키는 박테리아 성분, 바람직하게는 5형 또는 8형의 캡슐 다당류와 함께 상기 임의의 구현예의 성분을 포함하는 조성물이 제공된다.
포도상구균은 5형 및 8형의 캡슐 다당류와 같은 항원성 다당류 및 단백질뿐 아니라 세포벽의 구조에 중요한 그 외의 성분을 함유한다. 연결 서브유닛을 함유하는 다당류 폴리머인 펩티도글리칸은 세포벽의 견고한 외골격을 제공한다. 펩티도글리칸은 강산 또는 라이소자임으로의 노출에 의하여 파괴된다. 이는 감염의 발병작용에 중요하며, 단핵 세포에 의한 인터루킨-1(내생 발열원) 및 옵신성 항체의생산을 유도한다. 다핵 백혈구에 대한 화학 유인물질일 수 있으며, 내독소와 같은 활성을 가질 수 있고, 국부적인 슈와츠만 현상(Shwartzman phenomenon)을 나타낼 수 있으며, 보체를 활성화할 수 있다.
예를 들면, 글리세롤 또는 리보톨 포스페이트의 폴리머인 테이초이산, 리포테이초이산이 펩티도글리칸에 연결되어 있으며, 이것이 항원성일 수 있다. 겔 확산에 의하여 검출될 수 있는 항-테이초이산 항체가S. aureus로 인한 활성 심장 내막염을 가지는 환자에게서 발견될 수 있다.
단백질 A는 IgG3을 제외한 IgG 분자의 Fc 부위에 결합하는S. aureus균주의 세포벽의 한 성분이다. 단백질 A에 결합된 IgG의 Fab 부위는 특정 항원과의 결합이 자유롭다. 단백질 A는 면역학 및 진단을 위한 실험방법에서 중요한 반응시약이 되었다. 예를 들면, 특정 박테리아의 항원에 대항하여 유도되는 부착된 IgG 분자를 가지는 단백질 A는 그러한 항원을 가지는 박테리아를 응집시킬 것이다("공응집작용(coagglutination)").
몇몇S. aureus균주는 특정 항체가 존재할 때까지 다핵 백혈구에 의한 발병작용을 억제하는 캡슐을 갖는다. 대 부분의S. aureus균주는 응고효소 또는 세표벽 표면상의 응집 인자를 가지며, 비효소적으로 피브리노겐에 결합하여, 박테리아의 응집을 일으킨다.
포도상구균은 그들의 증식 능력 및 조직내 광범위한 확산 능력과 많은 세포외 물질의 생산을 통하여 질병을 일으킬 수 있다. 이러한 물질의 일부는 효소이고, 나머지는 효소로 작용할 수는 있지만 독소로 간주되는 것들이 된다. 많은 독소가 플라스미드의 유전자의 통제하에 있고, 이들 중 일부는 염색체 및 가외염색체 모두의 통제하에 있으며, 나머지에 대한 유전자 조절 메커니즘을 잘 밝혀져 있지 않다.
A. 카탈라아제:포도상구균은 과산화수소를 물과 산소로 전환시키는 카탈라아제를 생산한다. 카탈라아제 테스트는 양성 포도상구균과 음성 연쇄상구균을 구분짓는다.
B. 응고효소: S. aureus는 많은 혈청 내에 함유된 인자의 존재 하에서 옥살레이트화 또는 시트레이트화 혈장을 응집시키는 효소형 단백질인 응고효소를 생산한다. 상기 혈청 인자는 응고효소와 반응하여, 프로토트롬빈을 트롬빈으로 활성화하는 방식과 유사한 방식으로 에스테라아제 및 응집 활성을 발생시킨다. 응고효소의 작용은 정상의 혈장 응집 케스케이드를 방해한다. 응고효소는 피브린을 포도상구균의 표면상에 침적시킬 수 있으며, 아마도 이는 식세포에 의한 이들의 섭취 또는 이러한 세포 내에서의 그들의 파괴현상을 변화시킬 것이다. 응고효소 생산은 침략적인 병원 가능성과 유사한 것으로 여겨진다. 그러나,S. epidermidis와 같은 응고효소-음성 박테리아 또한 심각한 감염에 대한 치료효과를 나타낸다.
C. 기타 효소:포도상구균에 의하여 생산되는 기타의 효소로는 하이알루로니다아제 또는 분산 인자; 피브린 가수분해(fibrinolysis)에 관여하지만, 스트렙토키나아제보다는 상당히 느리게 작용하는 스타필로키나아제; 프로테이나아제; 리파아제; 및 β-락타마아제가 있다.
D. 외독소:외독소에는 주입 시 동물에 치명적이고, 피부 내에서 괴사를 유발하며, 전기영동에 의하여 분리될 수 있는 용해성 헤모리신을 함유하는 몇 가지 독소가 있다. 알파 독소(헤모리신)는 적혈구를 용해시키고 혈소판을 손상시킬 수 있으며, 외독소의 치명적인 피부괴사 인자와 거의 동일한 이질 단백질이다. 알파 독소는 또한 혈관 이완 근육에 대하여 강력하게 작용한다. 상기 독소와 감마 및 델타 독소는 항원적으로 구별되며 포도상구균의 리신과 전혀 관계가 없다. 포르말린으로 처리된 외독소는 비독성이지만, 항원성 변성독소이고, 임상적으로 유용하지 않다.
E. 류코시딘: S. aureus의 류코시딘 독소는 노출된 많은 동물의 백혈구 세포를 죽인다. 병원성 포도상구균 내에서 이들은 백혈구 세포를 죽일 수 없고, 비병원성 변종으로서 효과적으로 식균될 수 있다. 그러나, 이들은 세포내에서 매우 활발하게 증식할 수 있는 반면, 비병원성 유기체는 세포 내에서 죽는 경향이 있다. 류코시딘에 대한 항체는 재발성 포도상구균의 감염에 대한 내성을 담당 할 수 있다.
F. 박락성 독소(exofoliative toxin): S. aureus의 박락성 독소는 포도상구균성 비늘 피부증의 일반적인 표피 탈락을 일으키는 적어도 2개의 단백질을 포함한다. 특정항체는 상기 독소의 박락성 작용에 방어한다.
G. 독성 뇌졸중 독소:독성 뇌졸중을 가지는 환자로부터 분리되는 대부분의S. aureus균주는 내독소 F 및 병원성 외독소 C와 동일한 독성 뇌졸중 독소-1(TSST-1)이라 불리는 독소를 생산한다. TSST-1은 독성 뇌졸중의 다양한 징후를 촉진하는 원형성 초 항원이다. 사람에서, 상기 독소는 열병, 쇼크, 및 탈락성 피부 발진을 포함하는 다중시스템 침습과 관련있다. 토끼에서, TSST-1은 열병을 일으키며, 박테리아의 지질 다당류의 작용 및 독성 뇌졸중과 유사한 기타 생물학적 작용에 대한 감수성을 높이지만, 피부 발진 및 탈락은 일으키지 않는다.
H. 내독소:거의 50%의S. aureus균주에 의하여 생산되는 적어도 6종류의 용해성 독소가 있다. TSST-1과 같이, 내독소는 MHC Ⅱ군 분자에 결합하여 T 세포를 자극하는 초항원이다. 내독소는 열-안정성(이들은 비등을 30분간 견딘다)이며, 장내 효소에 대하여 내성이다. 식중독의 중요한 원인인 내독소는 탄수화물 및 단백질 식품 내에서S. aureus가성장하는 경우에 생산된다. 내독소 생산에 대한 유전자는 염색체 상에 있을 수 있지만, 플라스미드가 활성 독소 생산을 조절하는 단백질을 간직할 수 있다. 사람 또는 원숭이가 25 ㎍의 내독소 B를 섭취하는 경우에는 구토 및 설사가 일어난다. 아마도, 내독소의 구토유발 효과는 상기 독소가 장내의 신경 수용체에 작용한 후, 중추신경계를(구토 중심) 자극하는 결과인 것으로 여겨진다. 내독소는 침강소 테스트(겔 확산)에 의하여 분석될 수 있다.
포도상구균 유기체에 의하여 생산되는 기타의 많은 항원성 단백질이 존재한다. 여기에는 상기에 기재된 MSCRAMM뿐 아니라; 뼈의 시알로 단백질 결합 단백질, 클러스테린(clusterin) 결합 단백질, 헤파린 설페이트 결합 단백질, 트롬보스폰딘 결합 단백질, 트랜스페린 결합 단백질, 및 비트로넥틴 결합 단백질이 있다.S. aureus는 또한 포스파티딜 포스포리파아제와 같은 병독성 인자 및 Rap 단백질과 같은 독소 발현 조절 인자를 발현시킨다.
Ⅸ. 본 명세서에 개시된 것들과 실질적으로 상동하거나 동일한 기능을 가지는 단백질 및 펩타이드
원하는 경우, 상기 조성물은 전체 서열 단백질, 펩타이드, 단백질 또는 펩타이드의 단편, 분리된 에피토프, 융합 단백질, 또는 표적 ECM에 결합하는 임의의 대체물을 포함할 수 있으며, 이들은 야생형, 자리-특이적 돌연변이 형태, 또는 이들과 실질적으로 상동한 서열의 형태일 수 있다.
두 DNA 서열이 적어도 약 70%(바람직하게는 적어도 약 80%, 가장 바람직하게는 적어도 약 90 내지 95%)의 뉴클레오타이드가 제한된 길이의 DNA 서열과 일치하는 경우, 이들 두 DNA 서열은 "실질적으로 상동하다". 실질적으로 상동한 서열은 예를 들면, 특정 시스템에 대하여 제한된 엄격한 조건하에서 서열 데이터 은행 또는 서던 혼성화 실험의 표준 소프트웨어 제품을 사용하여 서열을 비교함으로써 동정될 수 있다. 적절한 혼성화 조건은 당업자에 의하여 결정되며, 예를 들면 다음과 같은 문헌을 참조한다: Maniatiset al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982;DNA Cloning, Vols. I & Ⅱ,supra;Nucleic Acid Hybridization, [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)].
아미노산 서열과 관련되는 경우, "실질적으로 유사한"이란 아미노산 서열이 공개된 서열과 동일하지는 않지만, 동일한 기능 및 활성을 가지는 단백질을 생산하는 것을 의미하며, 이는 하나의 아미노산이 다른 유사한 아미노산으로 대체되었거나, 변화(치환, 결실, 또는 삽입 중 어느 것이든 관계없이)가 단백질의 활성 자리에 실질적으로 영향을 주지 못하였기 때문이다. 두 아미노산 서열이 적어도 약 70%(바람직하게는 적어도 약 80%, 가장 바람직하게는 적어도 약 90 내지 95%)의 뉴클레오타이드가 제한된 길이의 DNA 서열과 일치하는 경우, 이들 두 아미노산 서열은 "실질적으로 상동한 것이다".
본 발명의 각각의 MSCRAMM 폴리펩타이드는 거대 단백질의 일부일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 ClfA 폴리펩타이드는 그들의 N-말단 또는 C-말단에서 ClfB 또는 비-피브리노겐 결합 폴리펩타이드 또는 이들의 혼합물과 융합할 수 있다. 본 발명에 유용할 수 있는 폴리펩타이드는 임의의 MSCRAMM 폴리펩타이드로부터 유래되는 폴리펩타이드 및 상기에 기재된 임의의 폴리펩타이드의 항원 변이체를 포함한다. 본 발명에 유용할 수 있는 비-MSCRAMM 폴리펩타이드는 상기에 개시된 임의의 박테리아 성분을 포함한다.
본 발명의 펩타이드 및 이들을 코딩하는 DNA 분절의 구조는 변형 및 변경될 수 있으며, 바람직한 특성을 가지는 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 기능성 분자를 얻을 수도 있다. 다음은 단백질의 아미노산을 변경하여 동등 또는 개선된 제2 세대 분자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 아미노산의 변경은 표 1에 따라 DNA 서열의 코돈을 변경함으로써 이루어질 수 있다. 당업자는 표 1에 개시된 코돈이 RNA 서열임을 이해할 수 있을 것이다. DNA에 대한 해당 코돈에서는 U가 T로 대체된다. 표준 명명법(J. Biol. Chem., 243:3552-3559, 1969)에 따라, 아미노산 잔기에 대한 약어를 표 1에 함께 표기하였다.
예를 들면, 몇몇 아미노산은 항체의 항원-결합 부위 또는 기질 분자 상의 결합 자리와의 상호 작용성 결합 능력을 현저하게 손실시키지 않고도, 단백질 구조 내에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 이는 단백질의 생물학적 기능의 활성을 한정하는 단백질의 상호작용 능력 및 특성이기 때문에, 몇몇 아미노산 서열의 치환이 단백질 서열 및 DNA 코딩 서열 내에서 이루어 질 수 있으며, 이렇게 하여도 유사한 특성을 가지는 단백질이 얻어 질 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 개시된 조성물의 펩타이드 서열, 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 해당 DNA 서열 내에서 이들의 생물학적 유용성 또는 활성을 현저하게 손상시키지 않고도 다양한 변화가 이루어질 수 있을 것으로 생각한다.
< 표 1 >
아미노산 코 돈
알라닌 Ala A GCA GCC GCG GCU
시스테인 Cys C UGC UGU
아스파르트산 Asp D GAC GAU GAC GAU
글루타민산 Glu E GAA GAG
페닐알라닌 Phe F UUC UUU
글리신 Gly G GGA GCG GGG GGU
히스티딘 His H CAC CAU
아이소류신 Ile I AUA AUC AUU
리신 Lys K AAA AAG
류신 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG GUU
메티오닌 Met M AUG
아스파라긴 Asn N AAC AAU
프롤린 Pro P CCA CCC CCG CCU
글루타민 Gln Q CAA CAG
아르기닌 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
세린 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
트레오닌 Thr T ACA ACC ACG ACU
발린 Val V GUA GUC GUG GUU
트립토판 Trp W UGG
티로신 Tyr Y UAC UAU
이와 같은 변화를 가하는데 있어서, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 대한 상호 작용성 생물학적 기능을 제공함에 있어, 수치의 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당 기술분야에 공지되어 있다(Kytie and Doolittle,J. Mol. Biol., 157(1): 105-132, 1982, 본 발명에 참고로 인용됨). 아미노산의 상대적인 수치 특성은 얻어진 단백질의 2차 구조에 영향을 주며, 상기 2차 구조는 다시, 예를 들면 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 같은 다른 분자와 단백질의 상호작용을 제한하는 것으로 여겨진다. 각 아미노산은 그들의 소수성 및 전하 특성을 기준으로 수치 지수가 지정되었으며(Kyte 및 Doolittle,supra1982), 이는 다음과 같다: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 트리소닌(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
몇몇 아미노산은 유사한 수치 지수 또는 스코어를 가지는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 이러하게 하여도 유사한 생물학적 활성을 가지는 단백질, 즉 생물학적 기능상 등가의 단백질이 얻어진다는 사실 공지되어 있다. 이와 같은 변화를 가하는 데 있어서는, 수치 지수가 ±2 이내인 아미노산, 바람직하게는 수치 지수가 1±인 아미노산, 보다 바람직하게는 수치 지수가 0.5±인 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 당업자는 친수성을 기준으로 하여 유사한 아미노산으로 효과적으로 치환할 수 있을 것이다. 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 제4,554,101호에는 인접 아미노산의 친수성에 의하여 결정되는 단백질의 국부적인 평균 최대 친수성 값이 그 단백질의 생물학적 특성과 상호 관련이 있다고 개시되어 있다.
미국특허 제4,554,101호에 상세히 개시된 바와 같이, 다음과 같은 친수성 값이 아미노산 잔기에 지정되었다: 알라닌(+3.0); 리신(+1.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(+0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 당업자는 아미노산이 유사한 친수성 값을 가지는 다른 아미노산으로 치환되더라도, 여전히 생물학적으로 동등한, 특히 면역학적으로 동등한 단백질이 얻어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 변화에서는, 친수성 값이 ±2, 바람직하게는 ±1, 더욱 바람직하게는 ±0.5 이내인 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다.
따라서, 상기에 약술된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 상대적인 아미노산 측쇄 치환기의 유사성, 예를 들면 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기준으로 이루어진다. 당업자는 이러한 다양한 특성을 가지는 치환기의 예들을 잘 알고 있을 것이며, 이러한 것에는 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파르테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 발린, 류신과 아이소류신이 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 화학적으로 합성될 수 있다. 합성 폴리펩타이드는 공지된 고체 상 또는 액체 상 방법, 또는 펩타이드 축합 반응이나 이들을 통합한 방법을 사용하여 제조되며, 천연 및 인공 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 합성에 사용되는 아미노산은 Merrifield[J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154(1963)]의 원형 고체 상법의 표준 보호기 제거(deprotecting), 중화, 연결, 및 세척 프로토콜을 사용하여 규격화된 Boc(Na-아미노 보호 Na-부티록실카보닐) 아미노산 잔기, 또는 Capino 및 Han[J. Org. Chem., 37:3403-3409(1972)]에 의하여 처음 제시된 염기-불안정 Na-아미노 보호 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 아미노산일 수 있다. Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem, 또는 Peninsula Lab사 또는 그 밖의 당 기술분야에 속하는 화학 회사들이 Fmoc 및 Boc Na-아미노 보호 아미노산을 시판하고 있다. 또한, 본 발명의 방법은 당 기술분야에 공지된 다른 Na-보호기와 함께 사용될 수 있다. 고체 상 펩타이드 합성은, 예를 들면 Stewart and Young, 1984,Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockfold, IL; Fieldset al.,Int. J. Pept. Protein es. 35:161-214(1990)에 개시된 바와 같이, 당 기술분야에 공지된 방법에 의하여 이루어질 수 있으며, ABS사 제공의 자동 합성기를 사용하여 합성할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 특별한 특성을 전달하는 D-아미노산, D-아미노산과 L-아미노산의 혼합물, 및 다양한 "디자이너" 아미노산(예를 들면, β-메틸 아미노산, Ca-메틸 아미노산, 및 Na-메틸 아미노산 등)을 포함할 수 있다. 합성 아미노산으로는 리신 대신 오르니틴, 페닐알라닌 대신 플루오로-페닐알라닌, 그리고 류신 또는 아이소류신 대신 노르류신이 있을 수 있다. 또한, 특정한 연결 단계에서 특정 아미노산을 지정함으로써, α-헥릭스, β-턴, β-시트, 및 환형 펩타이드를 만들 수도 있다.
다른 구현예에서, 유용한 화학적 및 구조적 특성을 제공하는 서브유닛이 선택된다. 예를 들면, D-아미노산을 포함하는 펩타이드는 생체내 L-아미노산-특이성프로테아제에 대하여 내성일 것이다. 또한, 본 발명은 보다 명확하게 한정된 구조적 특성을 가지는 펩타이드의 제조방법 및 의펩타이드(peptidomimetics) 및 에스테르 결합과 같은 의펩타이드 결합의 용도, 및 새로운 특성을 가지는 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 환원된 펩타이드 결합을 가지는 펩타이드, 즉 R1-CH2-NH-R2인 펩타이드―여기서 R1및 R2는 아미노산 잔기 또는 서열임―가 제조될 수 있다. 환원 펩타이드 결합은 이중 펩타이드 서브유닛으로서 도입될 수 있다. 이러한 분자는 펩타이드 결합의 가수분해, 예를 들면 프로테아제 활성에 대하여 내성이다. 이러한 펩타이드는 대사성 분해 또는 프로테아제 활성에 대한 내성으로 인한 연장된 생체내 반감기와 같은 독특한 기능 및 활성을 가지는 리간드를 제공한다. 더욱이, 몇몇 시스템 내에서, 억압 펩타이드는 강화된 기능적 활성을 나타내는 것으로 공지되어 있다[Hruby,Life Sciences, 31:189-199(1982); Hrubyet al.,Biochem. J., 268:249-262 (1990)].
다음의 비분류 아미노산은 특정 형태의 모티브를 유도하기 위하여 펩타이드에 삽입될 수 있다: 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-3-카르복실레이트(Kazmierskiet al.,J. Am. Chem. Soc.,113:2275-2283, 1991); (2S,3S)-메틸-페닐알라닌, (2S,3R)-메틸-페닐알라닌, (2R,3S)-메틸-페닐알라닌, 및 (2R,3R)-메틸-페닐알라닌(Kazmierski and Hruby,Tetrahedron Lett., 1991); 2-아미노테트라하이드로-2-카르복시산(Landis, Ph.D.Thesis, University of Arizona, 1989); 하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-3-카로복실레이트(Miyakeet al,J. Takeda Res. Labs., 43:53-76, 1989); β-카볼린(D 및 L)(Kazmierski,Ph.D. Thesis, University of Arizona, 1988); HIC(히스티딘 아이소퀴놀린 카르복시산)(Zechelet al, Int. J. Pep. Protein Res., 43, 1991); 및 HIC(히스티딘 환형 우레아)(Dharanipragada).
다음의 아미노산 유사체 및 의펩타이드는 특정 2차 구조를 유도 또는 선호하는 펩티드 내에 삽입될 수 있다: LL-Acp(LL-3-아미노-2-프로페니돈-6-카르복시산), β-턴 유도 디펩타이드 유사체[Kempet al.,J. Org. Chem., 50:5834-5838(1985)]; β-시트 유도 유사체[Kempet al., Tetrahedron Lett., 29:5081-5082(1988)]; β-턴 유도 유사체[Kempat al., Tetrahedron Lett., 29:5057-5060(1988)]; 알파-헬릭스 유도 유사체[Kempet al., Tetrahedron Lett., 29:4935-4938(1988)]; β-턴 유도 유사체[Kempet al., J. Org. Chem., 54:109:115(1989)]; 및 다음의 참고문헌에 제안되는 유사체: Nagai and Sato,Tetrahedron Lett., 26:647-650(1985); DiMaioet al.,J. Chem. Soc.Perkin Trans., p. 1687(1989); 또한 Gly-Ala 턴 유사체(Kahnet al., Tetrahedron Lett., 30:2317, 1989); 아미드 결합 아이소스테레(isostere)(Joneset al., Tetrahedron Lett., 29:3853-3856, 1989); 테트라졸(Zabrockiet al., J. Am. Chem. Soc., 110:5875-5880, 1988); DTC(Samanenet al., Int. J. Protein Pep. Res., 35:501:509, 1990); 및 Oslon 등의J. Am. Chem. Sci., 112:323-333 (1990) 및 Garvey 등의J. Org. Chem., 56:436(1990)에 개시된 유사체들. 1995년 8월 8일에 Kahn에게 허여된 미국특허 제 5,440,013호에는 형태상으로 제한된 β턴 및 β벌지(bulge), 및 이들을 함유하는펩타이드가 개시되어 있다.
Ⅹ. MSCRAMM 및 항체 조성물의 용도
본 명세서에 개시된 단백질 조성물은 상처 치료용, 단백질 수용체 차단용 또는 면역접종(백신접종)용으로 사용될 수 있다. 면역접종의 경우, 신체는 이러한 세포 표면 단백질을 포함하는 박테리아 균주의 침입으로부터 방어할 수 있는 특정한 항체를 만들고, 이 항체는 손상된 조직에 박테리아 균주가 결합하는 것을 차단한다.
상기 단백질 조성물은 선택적으로, 약리학적으로 허용 가능한 분산제가 첨가된 살균 등장 염수용액 내에 분산될 수 있다. 상이한 유형의 면역 보강제를 추가로 사용하여, 조직 내에서의 방출을 억제함으로써, 신체의 면역방어 시스템에 펩타이드를 장시간 노출시킬 수 있다.
상기 단백질, 핵산 또는 항체는 내재기구 상의 포유류의 세포외 매트릭스 단백질 또는 상처 내의 세포외 매트릭스 단백질에 대한 박테리아의 부착인자, 특히 그람-양성 박테리아와 같은 감염을 담당하는 병원체와 포유류 숙주간의 초기의 물리적 반응을 방해하는 데; 단백질-매개 포유류 세포의 침입을 차단하는 데; 조직 손상을 매개하는 박테리아성 단백질과 포유류의 세포외 매트릭스 단백질과 박테리아의 부착을 차단하는 데; 그리고, 내재기구의 이식 또는 외과적 수술 이외의 원인에 의하여 개시되는 감염 시, 정상적인 발병작용을 차단하는 데 유용하다. 상기에 개시된 항체, 단백질, 및 활성 단편으로 코팅되는 의료기구 또는 폴리머성 생체접합 물질로는 원료, 봉합실, 교체용 심장 판막, 심장 보조장치, 하드 콘택트렌즈 및소프트 콘택트렌즈, (전방 챔버, 후방 챔버 또는 위상성) 안내(眼內) 렌즈 삽입물, 각막 장식, 각막 보철, 혈관 스텐트, 상각막 수정체 성형 기구, 녹내장 문합, 망막 원료, 공막 버클, 의치, 갑상선 성형 기구, 후두 성형 기구, 혈관 이식물, 펌프를 포함하는(제한적인 것은 아님) 연조직 및 경조직 인공 삽입물, 자극기 및 기록기를 포함하는 전기 장치, 청각 삽입물, 페이스 메이커, 인공 후두, 의치, 유방 이식물, 음경 이식물, 두개건/앞면건, 인공 관절, 건(tendon), 인대, 연골, 및 디스크, 인공 뼈, 인공 췌장, 인공 심장, 인공 림프 및 심장 판막을 포함하는 인공 기관: 스텐트, 와이어, 가이드 와이어, 정맥내 및 중앙 정맥 카테터, 레이저 및 기구(balloon) 혈관성형기, 혈관 및 심장 기구(튜브, 카테터, 기구), 심실 보조기, 혈액 투석 성분, 혈액 산소공급기, 요도/요관/비뇨기 장치(폴레이 카테터, 스텐트, 튜브, 기구), 기도 카테터(기관내 및 기관개구 튜브 및 커프), 소장내 공급 튜브(비위, 내위 및 공장(空腸) 튜브 포함), 창상 배액 튜브, 늑막, 복막, 두개와 같은 체강 및 심막강을 배액하기 위해 사용되는 튜브, 혈낭, 테스트 튜브, 혈액 회수 튜브, vacutainers, 주사기, 바늘, 피펫, 피펫 팁, 혈액 관조직이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "코팅된" 또는 코팅"이란 기구의 표면, 바람직하게는S. aureus감염에 노출되는 기구의 외부 표면에 단백질, 항체 또는 활성 단편을 도포하는 것을 의미한다. 상기 기구의 표면 전체를 이들 단백질, 항체 또는 활성 단편으로 피복할 필요는 없다.
ⅩⅠ. 단백질, DNA, 및 항체의 제조
당업자는 종래의 분자 생물학, 미생물학, 및 DNA 재조합 방법을 사용하여 상기 단백질, 펩타이드, 및 항체 조성물을 제조할 수 있을 것이다. 이러한 방법은 다음과 같은 문헌에 상세히 개시되어 있다. Sambrooket al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1989);Current Protocols in Molecular BiologyVolumes Ⅰ-Ⅲ(Ausubel, R @-I ed., 1994);Cell Biology: A Laboratory HandbookVolumes Ⅰ-Ⅲ(J. E. Celis, ed., 1994);Current Protocols in Immunology VolumesⅠ-Ⅲ(Coligan, J. E., ed., 1994);Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait ed. 1984);Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds., 1985);Transcription And Translation(B. D. Hames & S. J. Higgins eds., 1984);Animal Cell Culture[R. I. Freshney, ed. 1,(1986)];Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)]; B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984).
본 명세서 개시된 항체의 예는 단독 또는 다른 모이어티와 접합된 다중 클론성 및 단일 클론성 항체, 및 이들 항체의 일부를 포함한다. 항체의 부분은 Fab 및 F(ab)2 단편 및 단쇄 항체를 포함한다. 이러한 항체는 적절한 실험 동물의 생체내 또는 DNA 재조합 방법을 사용하여 시험관내에서 제조 될 수 있다. 항체는 다중 클론성 또는 단일 클론성 항체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 단일 클론성 항체이다. 항체의 제조 및 분석 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다(Harlow and Lane,Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1988).
간단하게 말하면, 다중 클론성 항체는 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 동물에 면역접종하고, 이렇게 면역접종된 동물로부터 항혈청을 수집하여제조된다. 항혈청의 제조에는 다양한 종의 동물이 사용될 수 있다. 통상적으로, 항-항혈청의 제조에 사용되는 동물은 토끼, 마우스, 래트, 햄스터 또는 기니아 돼지이다. 토끼는 혈량이 상대적으로 많기 때문에, 다중성 항체의 제조용으로는 토끼를 선택하는 것이 바람직하다.
MSCRAMM 에피토프에 대하여 특이적인 다중 클론성 및 단일 클론성 항체는 당 기술분야에 공지된 종래의 면역접종 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특정 결합 MSCRAMM(합성 펩타이드, 자리-특이적 돌연변이 또는 절단 펩타이드)의 항원성 에피토프를 함유하는 조성물은 토끼 또는 마우스와 같은 하나 이상의 실험 동물을 면역접종하는 데 사용될 수 있으며, 이렇게 면역접종된 동물은 에피토프 함유 MSCRAMM 펩타이드에 대항하는 특정 항체를 생산하게 된다.
항체 생성에 소요되는 시간이 경과된 후, 동물로부터 혈액을 채취하고 전체 혈액으로부터 혈청 샘플을 제조함으로써 간단하게 다중 클론성 항혈청을 얻을 수 있다.
다중 클론성 항체의 제조에 사용되는 면역원 조성물의 함량은 면역원의 특성뿐 아니라 면역접종에 사용되는 동물에 따라 달라진다. 면역원 투여에는 다양한 경로(피하, 근육내, 피부내, 정맥내, 및 복막내)가 사용될 수 있다. 다중 클론성 항체의 생성은 면역접종 후 다양한 시점에서 면역접종된 동물의 혈액을 샘플링하여 관찰할 수 있다. 다음, 추가의 자극 접종이 수행될 수 있다. 적절한 역치에 도달할 때까지, 추가자극 접종 및 역가 과정이 반복된다. 원하는 수준의 면역성이 얻어지면, 면역화 동물로부터 혈액을 채취하고, 혈청을 분리하여 저장한다.
본 발명에 의하여 제공되는 중요한 산물 중 하나는 본 발명의 항체에 대하여 비교적 상동성을 가지는 다중 클론성 혈청이다. 통상적으로, 다중 클론성 항혈청은 다양하고 상이한 "클론", 즉 상이한 계통의 B-세포로부터 유래된다. 반면, 단일 클론성 항체는 공통조상의 B-세포를 가지는 항체-생산 세포로부터 유래된 것으로 정의되며, 이러한 의미에서, 이들을 "단일" 클론성이라 한다.
다중 클론성 혈청을 증가시키는 항원으로서 펩타이드가 사용되는 경우에는, 혈청의 클론 다양성 면에서 전체 항원이 사용된 경우에 비하여 상당히 떨어질 것이다. 불행하게도, 에피토프의 불완전한 단편이 존재하는 경우, 펩타이드는 매우 (특징적이지 못할 수 있는) 여러 가지 형태를 취할 수 있다. 따라서, 심지어는 짧은 펩타이드 조차도 비교적 다수의 특이성을 가지는 다중 클론성 항혈청, 및 자생 분자와 반응하지 않거나 불완전하게 반응하는 항혈청을 생산할 수 있다.
본 발명에 따르는 다중 클론성 항혈청은 온전한 전체 에피토프를 포함하리라고 추정되는 펩타이드에 대항하여 생산된다. 따라서, 이러한 에피토프는 면역학적인 면에서 보다 안정하기 때문에, 면역계에 대하여 보다 일관된 면역학적 표적을 발현시킨다. 이러한 모델 하에서는, 상기 펩타이드와 반응하게 될 잠재성 B-세포 클론의 수가 현저하게 작기 때문에, 얻어지는 혈청의 동질성이 높아지게 될 것이다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 클론율, 즉 동일한 분자 결정체와 반응하는 클론의 분율이 적어도 80%인 다중 클론성 항체를 제공한다. 90%, 95% 이상의 높은 클론율을 가지는 것도 고려된다.
단일 클론성 항체를 얻기 위해서는, 먼저 실험 동물, 바람직하게는 마우스에MSCRAMM-유래의 에피토프 함유 조성물을 면역접종한다. 그런 다음, 항체가 생성되기에 충분한 시간이 경과된 후, 상기 동물로부터 비장 또는 림프 세포군을 채취한다. 이어서, 상기 비장 또는 림프 세포를 사람 또는 마우스의 골수종 균주와 같은 세포주와 융합하여 항체-분비 하이브리도마를 제조한다. 이러한 하이브리도마를 분리하여 각각의 클론을 얻은 뒤, 원하는 펩타이드에 대한 항체를 생산하는 것을 스크리닝할 수 있다. 면역접종 후, 비장 세포를 떼어낸 다음, 표준 융합 방법을 사용하여 형질세포종 세포와 융합하여, MSCRAMM-유래의 에피토프에 대항하여 단일 클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조한다. ELISA 및 웨스턴 블롯 방법과 같은 표준 방법을 사용하여 선택된 항원에 대해 단일 클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정하였다. 이어서, 하이브리도마 클론을 통합된 액상 배지 및 배양 현탁액 내에서 배양하여 MSCRAMM-유래의 에피토프-특이성 단일 클론성 항체를 제공할 수 있다.
영구적인 항체-생산 세포주는 융합 이외에, 종양형성 유전자 DNA를 사용하여 B 림프구를 직접 형질 전환시키는 방법 또는 Epstein-Barr 바이러스를 사용한 형질전환 방법과 같은 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들면 다음과 같은 문헌을 참조할 수 있다: M. Shreieret al., Hybridoma Techniques(1980); Hammerlinget al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridiomas(1981); Kennettet al., Mnoclonal Antibodies(1980); 미국특허 제4,341,761호; 제4,399,121호; 제4,427,783호; 제4,444,887호; 제4,451,570호; 4,466,917호; 제4,472,500호; 제4,491,632호; 제4,493,890호.
본 발명의 다일 클론성 항체는 ELISA 및 웨스턴 블롯 방법과 같은 표준 면역화학적 방법뿐 아니라 MSCRAMM 에피토트에 대해 특이적인 항체를 사용할 수 있는 그 밖의 방법도 유용하게 적용될 것이다. 또한, 특정한 MSCRAMM-유래의 펩타이드에 대해 특이적인 단일 클론성 항체는 기타의 유용한 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 면역흡수제 프로토콜에서 자생 또는 재조합 펩타이드 종류 또는 이들의 합성 또는 자연발생 변이체를 정제하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
일반적으로, 이들 펩타이드에 대항하는 다중 또는 단일 클론성 항체는 다양한 구현예에 사용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 항체는 cDNA 또는 본 명세서에 개시된 펩타이드를 코딩하는 유전자 또는 관련 단백질 제조를 위한 유전자 항체 클로닝 프로토콜에 사용될 수 있으며, 세포 또는 동물 내에서 MSCRAMM-유래의 펩타이드의 효과를 분석하기 위한 억제 연구에 사용될 수도 있다. 항-MSCRAMM 에피토프 항체는 다양한 세포 활동기 동안의 MSCRAMM의 분포를 분석하기 위한 면역위치 측정 연구, 예를 들면, 상이한 생리 조건하에서 MSCRAMM 펩타이드의 세포 또는 조직-특이 분포를 결정하는 데도 유용할 것이다. 특히, 이들 항체는 예를 들면, 항체 친화성 칼럼을 사용한 자생 또는 재조합 MSCRAMM의 정제에 유용하다. 당업자는 본 발명의 범위 이내에서 이러한 모든 면역학적 방법을 조작할 수 있을 것이다.
단쇄 항체의 제조방법은 당 기술분야에 공지된 것으로서, 미국특허 제4,946,778에 개시되어 있으며, 본 발명에 개시된 단백질에 대한 단쇄 항체의 제조에 사용될 수 있다. MSCRAMM 또는 자생 라이브러리에 대한 항체의 함유 여부에 대하여 스크리닝된 사람의 PCR-증폭 림프구의 ν유전자로부터 유래된 MSCRAMM에 대한 결합 활성을 가지는 항체 유전자 또는 이들의 항원 부위를 선별하는 데는 파지 디스플레이법이 사용될 수 있다. 이중 특이성 항체는 각 부위가 상이한 에피토프에 마주하는 2개의 항원 결합 부위를 갖는다.
상기 항체는S. aureus와 같은 포도상구균 박테리아의 동정 및 정량을 위하여 검출 가능한 표지로 직접 표지될 수 있다. 면역분석을 위한 용도의 표지는 일반적으로 당 기술분야에 공지되어 있으며, 효소, 방사성 동위원소, 및 형광물질, 콜로이드성 금 및 유색 비드와 같은 착색 입자를 포함하는 발광물질 및 색소생산 물질을 포함한다. 적절한 면역학적 분석방법은 효소-결합 면역흡착법(ELISA)이다.
대안적으로, 상기 항체는 단백질 A 또는 G와 같은 면역글로불린 또는 항체에 대해 친화성을 가지는 표지된 물질과의 반응에 의해 표지될 수 있다. 상기 항체를 제2의 물질과 접합시키고, 그 항체에 접합된 제2의 물질에 대하여 친화성을 가지는 표지된 제3의 물질을 사용하여 이를 검출할 수 있다. 예를 들면, 항체를 바이오틴과 접합시키고, 얻어진 항체-바이오틴 접합체는 표지된 아비딘 또는 스트렙토아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 마찬가지로, 항체를 헵탄과 접합시키고, 얻어진 항체-헵탄 접합체는 표지된 항-헵탄 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 항체를 표지하고 그 접합체를 분석하는 상기와 같은 방법 및 기타의 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 결합 단백질에 대한 항체 또한 친화성 크로마토그래피와 같은, 부가량의 단백질을 분리하는 생산설비 또는 제조소에 사용될 수 있다.
일반적으로, 이중 특이성 항체의 제법 또한 당 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, Glennie 등의J. Immunol., 139:2367-2375(1987)에 개시되어 있다. 이중 특이성 항체는 임상용, 예를 들면 암 환자의 치료에 사용되어 왔다(Baueret al.,Vox Sang, 61:156-157, 1991). 이중 특이성 항체를 제조하기 위한 한가지 방법은 하나 이상의 피브로넥틴 결합 단백질 유래의 하나 이상의 피브리노겐 결합 부위의 상이한 에피토프에 대하여 특이성을 가지는 항체를 개별적으로 제조하는 단계를 수반한다.
이중 특이성 항체의 제법으로는 많은 방법들이 당 기술 분야에 공지되어 있으며, Glennie 등(1987supra)의 방법은 선택된 두 항체로부터 유래된 펩신의 F(ab'Y)2 단편을 제조하는 단계를 수반한다. 연결되는 두 파트너 중 하나에 존재하는 SH기를 o-페닐렌디말레이미드와 같은 가교결합제를 사용해 알킬화하여, 유리된 말레이미드기를 한 파트너 상에 제공한다. 이어서, 티오에테르 결합을 통하여 이 파트너를 다른 파트너에 접합시키면, 원하는 F(ab'Y)2 이형 접합체가 얻어진다.
Glennie 등(1987supra)의 방법은 제조의 용이, 고수율, 및 재생산성으로 인하여, 종종 이중 특이성 항체의 제조에 바람직하지만, 본 발명에 사용될 수 있는 방법에는 이외에도 많은 방법들이 있다. 예를 들면, SPDP 또는 단백질 A를 사용하여 가교결합을 수행하거나 특정 구조체를 제조하는 방법이 공지되어 있다(Tituset al.,J. Immunol., 138:4018-4022, 1987; Tuttet al.,Eur. J. Immunol., 21:1351-1358, 1991).
이중 특이성 항체를 제조하는 또 다른 방법은 두 하이브리도마를 융합시켜 쿼토마를 제조하는 것이다(Flavellet al.,Br. J. Cancer, 64(2):274-280, 1991; Pimmet al.,J. Cancer Res. Clin. Oncol., 118:367-370, 1992; Frenchet al.,Cancer Res., 51:2358-2361, 1991; Embletonet al.,Br. J. Cancer, 63(5):670-674, 1991). 본 명세서에서, "쿼토마"란 두 개의 B세포 하이브리도마를 생산적으로 융합한 것을 의미한다. 현재의 표준 방법을 사용하여, 하이브리도마를 생산하는 두 항체를 융합하여 딸세포를 제조하고, 이들 세포 중에서 두 클론형 세트의 면역글로불린 유전자의 발현물을 함유하는 세포를 선별한다.
바람직한 쿼토마의 제조방법에는 적어도 하나의 어버이 하이브리도마의 효소 결합 돌연변이를 선별하는 단계가 수반된다. 이러한 제1 돌연변이 하이브리도마 세포주를 예를 들면, 요오도아세트아미드에 치명적으로 노출된 제2 하이브리도마 세포와 융합한다. 세포 융합은 치명적으로 처리된 하이브리도마로부터 유래된 이들의 효소 결함에 대한 유전자의 획득함으로써 제1 하이브리도마를 구제하고, 이러한 제1 하이브리도마와의 융합을 통하여 제2 하이브리도마가 구제된다. 반드시 요구되는 것은 아니지만, 상이한 아강(subclass)을 제외한 동일한 동기준 표본의 면역글로불린을 융합하는 것이 바람직하다. 바람직한 쿼토마를 분리하기 대안적인 분석에는 혼합된 아강의 항체가 사용될 수도 있다.
보다 자세히 말하면, 쿼토마 개발 및 스크리닝 방법은 선택된 제1 mAb를 분비하는 하이브리도마주를 제조하는 단계 및 필수 대사 효소인 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(HGPRT)에 대한 이들의 결함체를 만드는 단계를 수반한다. 하이브리도마의 결함 돌연변이체를 얻기 위하여, 고농도(1×107M 내지 1×10-5M)의 8-아자구아닌의 존재하에서 세포를 배양한다. 희석을 제한함으로써 상기 돌연변이체를 계대 클로닝하고, 이들의 하이포크산틴/아미노프테린/티미딘(HAT) 감수성을 테스트한다. 예를 들면, 배양 배지는 10%의 FCS, 2 mM의 L-글루타민, 및 1 mM의 페니실린-스트렙토마이신이 보충 첨가된 DMEM으로 이루어질 수 있다.
원하는 제2의 MAb를 생산하는 상보적인 하이브리도마 세포주를 사용하고, 표준 세포융합 방법(Galfreet al.,Methods Enzymol., 73:1-46, 1981)을 사용하거나 Clark 등에 의하여 제안된 방법(Int. J. Cancer, 2:15-17, 1988)을 사용하여 쿼토마를 제조한다. 간단히 말하면, 융합 전 얼음 상에서 4.5×107HAT-감수성의 제1 세포를 차가운 2.8×인산염 완충 염수와 30분 동안 혼합한다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 세포 융합을 유도하고, 그 세포를 96개 웰의 미세배양 플레이트에 플레이팅한다. Hat-함유 배지를 사용하여 쿼토마를 선별한다. 예를 들면, 고체 상 동기준 표본-특이성 ELISA 및 동기준 표본-특이성 면역형광 염색법을 사용하여 이중 특이성 항체-함유 배양물을 동정한다.
이중 특이성 항체를 동정하는 동정 구현예에서, 마이크로리터 플레이트의 웰(Falcon, Becton Dickinson Labware)은 어버이 하이브리도마 항체와 특이적으로 상호 작용하는 반응시약 및 두 항체의 교차-반응성을 결여시키는 반응시약으로 코팅된다. 상기 플레이트를 세척하고 차단하여, 테스트될 상청액(SN)을 각각의 웰에 넣는다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하고, 상청액을 제거한 뒤, 플레이트를 세척하고, 실온에서 2시간 동안 묽은 알칼리성 포스페이타아제-항-항체 접합체를 첨가한다. 상기 플레이트를 세척하고 포스페이타아제 기질, 예를 들면 p-니트로페닐 포스페이트(Sigma, St. Louis)를 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트를 배양하고 3N의 NaOH를 각각의 웰에 첨가하여 반응을 중단시키고, ELISA 판독기를 사용하여 OD410값을 측정한다.
다른 동정 구현예에서, 폴리-L-리신으로 사전 처리된 마이크로리터 플레이트를 사용하여 표적 세포를 각각의 웰에 결합시킨 뒤, 상기 세포를, 예를 들면 1%의 글루타르알데하이드를 사용하여 고정하고, 이중 특이성 항체에 대하여 온전한 세포에 결합하는 능력을 테스트하였다. 또한, 쿼토마의 동정에는 FACS, 면역형광 염색법, 이지모식 표본(idiotype) 특이성 항체, 항원 결합 경쟁 분석법, 및 기타 당 기술분야에 공지된 항체 분석방법이 본 발명에 사용될 수 있다.
쿼토마를 분리한 후, 이중 특이성 항체를 기타 세포산물로부터 분리 정제한다. 이는 면역글로불린의 정제 분야에 공지된 다양한 단백질 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 항체의 제조 및 분석 수단은 당 기술분야에 널리 공지되어 있다(Antibodies: A Laboratory Manual(1988) 참조).
예를 들면, 선택된 쿼토마 유래의 상청액을 (동기준 표본에 따라) 단백질 A 또는 단백질 G 세파로스 칼럼위로 통과시켜 IgG에 결합시킨다. 이어서, 결합된 항체를, 예를 들면 pH 5.0의 시트르산염 완충용액으로 용리시킨다. 대안적으로, 용리물을 항-면역글로불린-세파로스 칼럼 위로 통과시킨다. 그런 다음, 3.5 M의 염화마그네슘을 사용하여 BsAb를 용리시킨다. 예를 들면, 동기준 표본-특이성 ELISA 및 상기 표적 세포의 면역형광 염색 분석법을 사용하여 이러한 방식으로 정제된 BsAb에 대한 결합 활성에 대하여 테스트한다.
정제된 BsAb 및 어버이 항체 또한 SDS PAGE 전기영동 후, 은 또는 쿠마시 염색하여 분석 및 분리할 수 있다. 이는 어버이 항체 중 하나가 다른 것보다 분자량이 큰 경우에 가능하다. 이때, BsAb 밴드는 두 어버이 항체 사이의 중간지점으로 이동한다. 샘플의 감소는 2개의 다른 겉보기 분자량을 가지는 중쇄의 존재를 입증한다.
또한, 현재는, 재조합 방법이 일반적인 항체의 제조에 사용될 수 있으며, 이는 원하는 이중 특이성을 가지는 항체를 코딩하는 재조합 항체의 유전자의 제조를 가능하게 한다(Van Duket al.,Int. J. Cancer, 43:344-349, 1989). 따라서, 가장 바람직한 결합 특성을 가지는 단일 클론성 항체를 선별한 후, 예를 들면 파지 발현 라이브러리의 면역학적 스크리닝을 통해 이들 항체에 대한 각각의 유전자를 분리할 수 있다(Oi and Morrison, 1986; Winter anmd Milstein, 1991). 이어서, Fab 코딩 부위를 재배열하면, 적절한 키메라 구조체를 용이하게 얻을 수 있다.
인간화 단일 클론성 항체는 유전자 공학적 방법을 사용하여, 고유의 항원 특이성을 유지하게 하고, 일정 부위 및/또는 가변 부위의 골격 서열을 사람의 서열로 교체하여 변형시킨 동물 기원의 항체이다.
보통, 이러한 항체는 사람의 항원에 대해 특이성을 가지는 설치동물의 항체로부터 유래된다. 이러한 항체는 일반적으로, 생체내 치료 목적에 유용하다. 이러한 방법은 외래 항체에 대한 숙주의 반응을 감소시키고, 사람의 작동체 기능을 선택 가능하게 한다.
인간화 면역글로불린을 제조하는 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,693,762호에는 하나 이상의 상보적인 결정 부위(CDR's)를 가지는 인간화 면역글로불린의 제조방법 및 조성물이 개시되어 있다. 상기 인간화 면역글로불린은 온전한 항체와 혼합되는 경우, 사람 내에서 실질적으로 비면역원성이고, 실질적으로 에피토프를 함유하는 단백질 또는 기타 화합물과 같이 항원에 대해 면역글로불린 공여자와 동일한 친화성을 갖는다.
본 발명에 유용한 항체의 제조방법이 개시되어 있는, 미국특허 제5,565,332호에는 조합적인 방법을 사용하여 키메라 항체를 제조하는 방법이 개시되어 있으며; 미국특허 제4,816,567호에는 재조합 면역글로불린의 제법이 개시되어 있으며; 미국특허 제4,867,973호에는 항체-치료제 접합체가 개시되어 있다. 이들 특허는 모두 본 발명에 참고로 인용되었다.
미국특허 제5,565,332호에는 항체 또는 어버이 항체와 동일한 결합 특이성을 갖지만, 인간화 특성이 높은 항체 단편을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 인간화 항체는 아마도, 파지 디스플레이법을 사용한 체인 셔플링에 의하여 얻어질 수 있으며, 본 발명에 유용한 방법들은 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 제5,565,332호에 자세히 개시되어 있다.
본 발명은 또한, 본 명세서에 개시된 펩타이드 항원을 사용하여 면역반응을 일으키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 면역학적 유효량의 MSCRAMM-유래의 펩타이드 조성물을 포함하는 약리학적으로 허용 가능한 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 기타 바람직한 동물로는 마우스, 소, 말, 돼지, 및 고양이가 있다. 상기 조성물은 천연 또는 재조합 원료로부터 얻어지는 일부 또는 상당량의 정제된MSCRAMM-유래의 펩타이드 에피토프를 포함할 수 있으며, 단백질 또는 펩타이드는 천연 또는 화학적으로 합성되거나, 대안적으로 에피토프와 같은 재조합 숙주 세포의 발현 DNA 분절의 코딩에 의하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 원하는 경우, 항원 단백질 또는 펩타이드도 기타 포도상구균성 또는 연쇄상구균성 펩타이드 또는 핵산 조성물과 같은 기타의 제제와 혼합될 수 있다. 상기 조성물은 또한 천연 또는 재조합 원료로부터 얻어지는, 포도상구균에 의하여 생산되는 박테리아성 성분을 포함할 수 있으며, 단백질은 천연 또는 화학적으로 합성되거나, 대안적으로 에피토프와 같은 재조합 숙주 세포의 발현 DNA 분절의 코딩에 의하여 시험관내에서 제조될 수 있다.
백신용, 치료용, 포도상구균 및 연쇄상구균의 검출에 유용한 항체의 제조용, 피브로넥틴, 콜라겐, 엘라스틴, 피브리노겐 또는 빈트로넥틴과 같은 ECM 성분에 대한 박테리아의 부착을 방지하기 위한 용도이든, 본 발명의 면역제제는 자리-특이적 돌연변이, 절단, 또는 이들 단백질로부터 합성-유도된 항원 펩타이드 단편을 포함할 수 있다. 이와 같이, 본 명세서에 기재된 항원 기능의 단백질 및 펩타이드 등가물 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
동물 내에서의 면역반응을 유발하기 위하여 본 발명에 사용될 수 있는 또 다른 방법은 대한 추가의 의미는 펩타이드 에피토프를 코딩하는 면역학적 유효량의 핵산 조성물, 또는 이러한 핵산 조성물을 포함하고 발현하는 면역학적 유효량의 살아있는 감화 유기체를 포함하는 약리학적으로 허용 가능한 조성물을 동물 또는 인간 대상에 투여하는 것을 포함한다.
백신 수여자에게 투여되는 발현성 DNA 또는 전사 RNA의 함량은 매우 넓은 용량 범위를 가지며, 사용되는 전사 및 번역 프로모터의 길이에 따라 결정된다. 또한, 면역반응의 크기는 단백질의 발현 정도 및 발현된 유전자 산물의 면역원성에 따라 결정된다. 일반적으로, 약 1 ng 내지 5 mg, 100 ng 내지 2.5 mg, 1 ㎍ 내지 750 ㎍, 바람직하게는 약 10 ㎍ 내지 300 ㎍의 유효 투여량 범위의 DNA가 근육조직에 직접 투여된다. 피하 주사, 피부내 주입, 피부를 통한 압흔(壓痕), 및 복막내, 정맥내 또는 흡입 전달과 같은 투여 방법도 적합하다. 추가 백신접종이 이루어질 수도 있다. MSCRAMM 폴리뉴클레오타이드 면역원을 백신접종한 후, M55 유전자 산물과 같은 MSCRAMM 단백질 면역원이 추가 접종될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 "나출된" 것, 즉 임의의 단백질, 면역 보강제 또는 수여자의 면역계에 영향을 주는 기타 제제와 회합되지 않은 것일 수 있다. 이 경우, 상기 폴리펩타이드는, 제한적인 것은 아니지만, 살균 염수 또는 살균 완충 염수와 같은 생리학적으로 허용 가능한 용액 내에 함유되는 것이 바람직하다. 대안적으로, DNA는 레시틴 리포좀 또는 당 기술분야에 공지된 기타 리포좀과 같은 리포좀 또는 DNA-리포좀 혼합물과 회합되거나, 단백질 또는 기타 담체와 같은 면역반응을 추가 자극하는 당 기술분야에 공지된 면역 보강제와 회합될 수 있다. 제한적인 것은 아니지만, DNA의 세포 유입을 지원하는 칼슘이온과 같은 제제가 사용될 수도 있다. 본 명세서에서, 이들 제제는 일반적으로 트랜스펙션 촉진 반응시약 및 약리학적으로 허용 가능한 담체를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드로 코팅된 미세 투사체(microprojectile)를 코팅하는 방법이 당 기술분야에 공지되어 있으며, 본발명에도 유용하다. 사람을 위한 용도의 DNA는 그 최종 DNA 산물이 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 완충용액 내에 함유되는 것이 유용할 수 있다. 약리학적으로 혀용 가능한 담체 또는 완충용액은 당 기술분야에 공지되어 있으며, Remington's Pharmaceutical Science와 같은 다양한 문헌에 개시되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드가 진핵생물의 조직 내로 주입되는 경우, 생체내에서 발현되어 유전자 산물을 생산할 수 있는 인접 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 코딩된 유전자 산물은 면역반응을 일으킬 수 있는 면역자극체 또는 항원으로 작용하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 구현예에서 핵산은 MSCRAMM 면역원성 에피토프, 선택적으로는 B7군 단백질의 일원과 같은 사이토킨 또는 T-세포 공동자극 요소를 코딩한다.
유전자 산물이 아닌, 유전자를 면역접종하는 경우에는 여러 가지 이점이 얻어진다. 첫째, 비교적 간단한 방식으로 자생 또는 거의 자생의 항원이 면역계에 제공될 수 있다는 것이다. 박테리아, 효모, 또는 심지어는 포유류 세포 내에서 재조합적으로 발현된 포유류의 단백질에는 종종 적합한 항원성을 보장하기 위한 고가의 처리가 요구된다. DNA 면역접종의 두 번째 장점은 면역원이 MHC I군의 경로로 들어가 세포독성 T 세포를 유도할 수 있는 잠재능을 갖는다는 것이다. 인플루엔자 A 핵단백질(NP)을 코딩하는 DNA를 마우스에 면역접종한 경우, NP에 대한 CD8+반응이 유발되어, 인플루엔자의 이종 균주의 추가 접종 감염으로부터 마우스를 보호하였다(Montgomery, D.L.et al.,Cell Mol. Biol., 43(3):285-292, 19997; Ulmer,J.et al.,Vaccine, 15(8):792-794, 1997).
세포-매개의 면역성은 감염의 통제에 있어 중요하다. DNA 면역접종은 인간화 및 세포-매개의 면역반응 모두를 유발할 수 있기 때문에, 이것의 가장 큰 이점은 백신 가능성에 대해 다수의 S. aureus 유전자를 조사하기 위한 비교적 간단한 방법이 제공된다는 것일 수 있다.
또한, DNA 주입에 의한 면역접종은 다성분 서브유닛 백신의 신속한 수집을 가능하게 한다. 최근, 다수의 인플루엔자 유전자의 동시 면역접종이 보고되었다(Donnelly, J.et al.,Vaccines, 55-59, 1994). 유전자 산물이 면역계로부터 다양화된 다수의 반응을 활성화하는 유전자를S. aureus백신 내에 포함시키면, 후속의 추가 접종 감염으로부터 방어할 수 있는 능력을 제공할 수 있다.
또한, 결합 단백질의 결합 부위의 펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산 단편을 포함하는 조성물이 제공된다. 이때, 상기 펩타이드는 그들의 리간드에 특이적으로 결합하거나, 특이적으로 결합하지 않는다. 감화 유기체는 재조합 MSCRAMM의 유전자 산물을 발현하도록 유전자 조작될 수 있으며, 이들 자체가 본 발명의 전달 부형제일 수 있다.Mycobacterium, 특히M bovis,M smegmatis또는 BCG와 같은 약독화 박테리아 종이 바람직하다. 대안적으로, 폭스-, 폴리오-, 아데노-, 또는 기타 바이러스 및Salmonella,Shigella,Listeria,Streptococcus종이 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
종종, 유전자 면역접종법이라 불리기도 하는 나출 DNA 방법이 감염성 유기체로부터의 방어에 적합한 것으로 밝혀졌다. 이러한 DNA 분절은 나출 DNA 및 플라스미드 DNA를 포함하는 다양한 형태로 사용될 수 있으며, 비경구, 비강, 및 소위 미세 투사체로 이루어지는 "유전자 총" 접종을 포함하는 다양한 방식으로 대상에게 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 면역접종 방법에서 본 발명의 핵산 조성물의 사용은 적어도 연쇄상구균 및 포도상구균의 감염에 대한 백신접종 방법으로서 유용할 것이다.
당업자는 DNA 백신접종 체제의 최적의 투여량 스케줄이, 짧게는 2주 내지 4주의 간격에서, 길게는 5년 내지 10년의 간격으로, 경우에 따라서는 이보다 더 긴 간격으로 5회 내지 6회, 바람직하게는 3회 내지 5회, 더욱 바람직하게는 1회 내지 3회의 면역화 실체의 투여를 포함할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 특정한 양태는 재조합 펩타이드 및 자생 또는 자리-특이적으로 돌연변이된 결합 자리의 에피토프를 포함하는 특정 펩타이드 에피토프의 클로닝 및 발현을 위한 플라스미드 벡터의 용도에 관한 것이다. 재조합 벡터의 제작, 숙주 세포의 형질전환, 및 재조합 단백질의 발현방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 본 발명의 펩타이드 조성물의 발현에는 원핵생물 숙주가 바람직하다. 바람직한 원핵생물 숙주의 예로는E. coli, 특히E. coli균주 ATCC 69791, BL21(DE3), JMIOI, KL 1-Blue™, RRI, LE392, Bx776(ATCC31537), 및 W310(F, λ, 원영양균, ATCC 273325)가 있다. 대안적으로, 기타Salmonella typhimurium및Serratia marcescens와 같은Enterobacteriaceae종, 심지어는 다양한Pseudomonas종을 포함하는 기타 그람-음성 숙주가 본 발명의 유전자 구조체의 재조합 발현에 사용될 수있다. 부가의 숙주로는 공지된 진핵생물, 및Bacillus, Streptomyces와 같은 원핵생물 숙주, 효모와 같은 균류, 및 CHO, R1.1, B-W 및 L-M 세포와 같은 동물 세포, 아프리카 그린 마운틴 원숭이의 신장 세포(예를 들면, COS1, COS7, BSC1, BSC40, 및 BMT10), 곤충 세포(예를 들면, Sf9), 및 조직 배양된 사람 세포와 식물 세포가 포함될 수 있다.
다양한 숙주/발현 벡터 혼합물이 DNA의 발현에 사용될 수 있다. 예를 들면, 유용한 발현 벡터는 염색체 분절, 비-염색체 및 합성 DNA 서열로 이루어질 수 있다. 적절한 벡터에는 SV40 및 공지된 박테리아 벡터, 예를 들면E. coli플라스미드 col E1, pCR1, pBR322, pMB9, 및 이들의 유도체; RP4와 같은 플라스미드; 파지 DNA, 예를 들면, NM989와 같은 다양한 λ파지 유사체, 및 M13과 같은 기타 파지 DNA 및 편모성 단일 가닥 파지 DNA; 2μ 플라스미드 또는 이들의 유사체와 같은 효모 플라스미드; 곤충 또는 포유류 세포에 유용한 벡터와 같은 진핵생물 세포에 유용한 벡터; 플라스미드 및 파지 DNA의 혼합체로부터 유래되는 벡터, 예를 들면 파지 DNA 또는 기타 발현 조절 서열을 사용하는 변형된 플라스미드 등이 있다.
당 기술분야에 공지된 바와 같이, DNA 서열은 적절한 발현 벡터 내의 발현 조절 서열에 유효하게 연결하고, 적절한 단핵 숙주를 형질 전환시키는 발현 벡터를 사용하여 발현시킬 수 있다. 물론, 본 발명의 DNA 서열은 발현 조절 서열에 이렇게 유효한 연결하는 것은, 이미 DNA 서열의 일부가 아닌 경우, DNA 서열의 올바른 리딩 프레임의 상류에 있는 AGT 개시코돈을 포함한다.
다양한 발현 조절 서열―여기서 서열은 거기에 유효하게 연결된 DNA 서열의발현을 조절하는 서열임―은 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는 이러한 벡터에 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 조절 서열은, 예를 들면 SV40, CMV, 백시니아, 폴리오마 또는 아데노바이러스의 초기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, LTR 시스템, λ파지의 주요 오페레이터 및 프로모터 부위, fd 코트 단백질의 조절 부위, 3-포스포-글리세레이트 키나아제 또는 기타 당 가수분해 효소의 프로모터, 산 포스페이타아제의 프로모터(예를 들면, Pho5), 효모의 a-결합 인자의 프로모터, 및 기타 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 서열, 및 이들의 다양한 혼합체를 포함한다.
당업자는 벡터, 발현 조절 서열, 및 숙주 모두가 본 발명의 DNA 서열의 발현에 있어 동등하게 작용하지 않는 다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러나, 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 적절한 벡터, 발현 조절 서열, 및 숙주를 선택하여 원하는 발현을 달성할 수 있을 것이다. 예를 들면, 벡터의 선택 시에는, 벡터가 작용하는 숙주 세포를 고려해야 한다. 벡터 복사물의 수, 복사수를 조절하는 능력, 및 그 벡터에 의하여 코딩되는 기타 임의의 단백질의 발현을 고려해야 한다.
발현 조절 서열의 선택 시에는, 보통 다양한 인자가 고려될 것이다. 예를 들면, 이러한 인자에는 시스템의 상대적인 길이, 조절능력, 특히 가능한 2차 구조와 관련하여 발현되는 특정 DNA 서열 또는 유전자와의 적합성이 포함된다. 예를 들면, 선택된 벡터와의 적합성, 그들의 분비 특성, 정확하게 단백질을 폴딩하는 능력, 및 발효 요구성뿐 아니라 발현되는 DNA 서열에 의하여 코딩되는 산물의 숙주에 대한 독성 및 발현 산물의 정제 용이성을 고려하여, 적절한 단세포 숙주가 선택될 것이다. 당업자는 이러한 인자 및 기타 인자를 고려하여, 발효 시 또는 대규모 동물 배양 시, 본 발명의 성분을 코딩하는 DNA 서열을 발현시키는 다양한 벡터/발현 조절 서열/숙주 혼합체를 구성할 수 있을 것이다.
몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 핵산은 적절한 숙주 세포를 편절(transect)하는 데 사용된다. DNA를 세포에 주입하는 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 핵산 분절을 세포로 전달하는 일반적인 4가지 방법은 다음과 같은 문헌에 개시되어 있다:
(1) 화학적 방법(Graham and VanDerEB,Virology, 54(2):536-539, 1973);
(2) 물리적 방법: 마이크로인젝션(Capecchi,Cell, 22(2):479-488, 1980), 일렉트로포레이션(Wong and Neuman,Biochem. Biophys. Res. Common, 107(2):584-587, 1982; Frommet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(17):5824-5828, 1985) 및 유전자 총(Yanget al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4144-4148, 1990);
(3) 바이러스 벡터(Eglitis and Anderson,Bio/techniques, 6(7):608-614, 1988); 및
(4) 수용체-매개 메커니즘(Wagneret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(13):6099-6103, 1992).
MSCRAMM을 코딩하는 DNA 서열은 합성 제조되거나 클로닝될 수 있다. DNA 서열은 MSCRAMM 아미노산 서열에 대한 적절한 코돈을 가지도록 제작될 수 있다. 일반적으로, 당업자는 이들 서열이 발현에 사용되는 경우, 의도된 숙주에 바람직한 코돈을 선택할 수 있을 것이다. 완전한 서열은 표준 방법에 의하여 제조되는 중첩 올리고뉴클레오타이드로부터 조립되어, 완벽한 코딩 서열로 조립된다. 예를 들면, Edge, Nature, 292:756(1981); Nambairet al., Science, 223:1299(1984); Jayet al., J. Biol. Chem., 259:6311(1984)을 참조한다.
합성 DNA 서열은 MSCRAMM 유사체를 발현시키는 유전자의 용이한 제작을 가능하게 한다. 대안적으로, 유사체를 코딩하는 DNA는 자생 MSCRAMM 유전자 또는 cDNA 자리-특이적 돌연변이 유발에 의하여 만들어질 수 있으며, 유사체는 종래의 폴리펩타이드 합성법을 사용하여 직접 만들 수 있다. 천연 아미노산을 자리-특이적으로 단백질에 삽입하는 일반적인 방법은 Noren 등의Science244:182-188(1989년 4월)에 개시되어 있다. 이 방법은 천연 아미노산을 사용하는 유사체의 제조에 사용될 수 있다.
ⅩⅡ. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 리보자임
본 발명은 MSCRAMM의 발현에 있어서, 번역 레벨을 손상시키는 데 사용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 리보자임의 제법으로 확장된다. 이 방법은 안티센스 핵산을 사용하여 mRNA를 차폐하거나, 리보자임을 사용하여 mRNA를 절단함으로써 특정 mRNA의 번역을 방해하는 안티센스 핵산 및 리보자임을 사용한다.
안티센스 핵산은 적어도 일부 특정 mRNA 분자와 상보적인 DNA 또는 RNA 분자이다. 이들은 세포 내에서 특정 mRNA와 혼성화하여, 이중가닥 분자를 형성한다. 세포는 이중가닥 형태의 mRNA를 번역하지 못한다. 따라서, 안티센스 핵산은 mRNA가 단백질로 발현되는 것을 방해한다. AUG 개시코돈과 혼성화되는 약 15개의 뉴클레오타이드 및 분자로 이루어지는 올리고머는 MSCRAMM-생산 세포로 주입되는 경우, 그들보다 큰 분자보다 합성이 용이하고 문제를 일으킬 확률이 적기 때문에, 이러한 올리고머가 특히 효과적이다. 안티센스 방법은 많은 유전자의 시험관내 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다(Marcus-Sekura, 1988; Hamboret al., 1988).
리보자임은 DNA 제한 엔도뉴클레아제와 다소 유사한 방식으로 다른 단일가닥의 RNA 분자를 특이적으로 절단하는 능력을 가지는 RNA 분자이다. 리보자임은 몇몇 mRNA가 그들 고유의 인트론을 절제하는 능력을 갖는다는 관찰로부터 밝혀졌다. 연구자들은 이러한 RNA의 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써, RNA 분자 내의 특정 뉴클레오타이드 서열을 인식하고 이를 절단하는 분자를 조작할 수 있었다(Cech, 1988). 이들은 서열-특이성이기 때문에, 특정 서열을 가지는 mRNA만이 불활성화된다.
연구자들은 두 가지 유형, 즉Tetrahymena-유형 및 "해머헤드"-유형의 리보자임을 동정하였다(Hasselhoff and Gerlach, Nature, 334(6183):585-591, 1988).Tetrahymena-유형의 리보자임은 4개의 염기 서열을 인식하는 반면, "해머헤드"-유형의 리보자임은 11개 내지 18개의 염기 서열을 인식한다. 인식 서열이 길어질수록, 표적 mRNA 종류에 있어서 보다 배타적으로 발생하는 것 같다. 따라서, 특정 mRNA 종류를 불활성화하는 데는 해머헤드-유형의 리보자임이Tetrahymena-유형의 리보자임보다 바람직하고, 18개의 염기 인식 서열이 이보다 짧은 인식 서열보다 바람직하다.
따라서, 본 명세서에 개시된 DNA 서열은 안티센스 분자와, MSCRAMM 및 이들의 리간드에 대한 mRNA를 절단하는 리보자임의 제조에 사용될 수 있다.
ⅩⅢ. 약리학적 조성물
선택적으로 박테리아 성분과 함께, 약리학적으로 허용 가능한 부형제 내에 상기에 개시된 결합 단백질, 펩타이드, 항체, 또는 핵산을S. aureus의 감염을 치료하기 위한 유효량으로 포함하는 약리학적 조성물이 제공된다. 통상적으로, 상기 조성물은 면역 보강제 및 기타 통상적인 첨가제를 선택적으로 포함하는 면역접종 제형의 제조에 사용된다. 상기 조성물은 또한 본 명세서에 개시된 진단 키트를 포함할 수 있다.
활성성분으로서 폴리펩타이드, 유사체 또는 활성 단편을 함유하는 약리학적 조성물을 제조하는 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 통상적으로, 이러한 조성물은 주사 가능한 액상 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있으나, 주사 전에 액상 형태로 만들어지는 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있으며, 에멀젼화될 수도 있다. 활성 치료성분은 종종 약리학적으로 허용 가능하고 상기 활성성분에 적합한 부형제와 혼합된다. 적절한 부형제의 예로는 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이들의 혼합물이 있다. 또한, 원하는 경우, 상기 조성물은 활성성분의 효능을 강화하는 pH 완충제, 습윤제 또는 에멀젼화제와 같은 소량의 보조물질을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드, 유사체 또는 활성 단편은 약리학적으로 허용 가능한 중화 염의 형태의 치료용 조성물로 조제될 수 있다. 약리학적으로 허용 가능한 염으로는 (폴리펩타이드 또는 항원 분자의 유리된 아미노기를가지는) 산 첨가 염과, 예를 들면 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로부터 제조된 것이 있다. 유리된 카르복시기로부터 제조된 염은, 예를 들면 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철과 같은 무기염기와, 아이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기염기로부터 유도될 수 있다.
통상적으로, 치료용 폴리펩타이드, 유사체 또는 활성 단편 함유 조성물은, 예를 들면 단위 투여량 주사를 통해 정맥내 투여된다. 본 발명의 치료용 조성물과 관련하여 사용되는 경우의 "단위 투여량"이란 사람에 대한 단일 용량의 물리적인 분리 단위를 의미하며, 이때 각 단위는 요구되는 희석제와 함께 원하는 치료효과를 일으키는 소정의 분량의 활성물질을 함유한다.
상기 조성물은 용량 제형에 적합한 방식으로 치료 유효량으로 투여된다. 투여되는 양은 치료대상, 활성성분을 이용하는 치료대상의 면역계의 능력, 및 요구되는 MSCRAMM 결합 능력의 억제 또는 중화정도에 따라 결정된다. 투여에 요구되는 활성성분의 정확한 함량은 각 개인에 따라 고유한 것으로서 의사의 판단에 따라 결정된다. 그러나, 활성성분의 적절한 용량은 개체의 체중당 하루에 약 0.1 내지 20, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10, 보다 바람직하게는 1 내지 수 밀리그램의 범위일 수 있으며, 이는 투여 경로에 따라 결정된다. 초기투여 및 재투여에 적합한 체계 또한 가변적이지만, 초기투여 후, 1시간 이상의 간격으로 후속의 주사 또는 기타 투여방식에 의하여 투여를 반복하는 것이 통상적이다. 대안적으로, 혈액 내에서 10 나노몰 내지 10 마이크로몰의 농도를 유지하기에 충분하도록 연속적으로 정맥내 주입하는 것도 고려된다.
치료용 조성물은 유효량의 MSCRAMM/MSCRAMM 길항제 또는 이들의 유사체, 및 항생제 또는 스테로이드와 같은 하나 이상의 활성성분을 추가로 포함할 수 있다.
활성성분으로서 펩타이드 서열을 함유하는 백신의 제법은 일반적으로 당 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 제4,608,251호, 제4,601,903호, 제4,599,230호, 제4,599,231호, 제4,596,792호, 및 제4,578,770호에 개시되어 있다. 통상적으로, 이러한 백신은 주사 가능한 액체 또는 현탁액이며, 주사 전에 액상 형태로 만들어지는 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있으며, 에멀젼화될 수도 있다. 활성 치료성분은 종종 약리학적으로 허용 가능하고 상기 활성성분에 적합한 부형제와 혼합된다. 적절한 부형제의 예로는 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이들의 혼합물이 있다. 또한, 원하는 경우, 상기 조성물은 활성성분의 효능을 강화하는 pH 완충제, 습윤제 또는 에멀젼화제와 같은 소량의 보조물질을 함유할 수 있다.
본질적으로 내독소를 함유하지 않는 이러한 조성물은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 예를 들면, 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 제4,271,147호에는 백신용도의Neisseria meningitides의 막 단백질의 제조방법이 개시되어 있다.
이러한 백신과 같은 면역학적 조성물 및 기타 약리학적 조성물은 단독으로 또는 S. aureus와 같은 포도상구균성 박테리아에 의하여 유발되는 사람 및 동물의감염으로부터 방벙하는 기타 차단제와 함께 사용될 수 있다. 특히, 상기 조성물은 심장 내막염으로부터 사람을 보호하거나, 포도상구균의 감염에 의하여 유발되는 유선염으로부터 사람 또는 반추동물을 보호하는 데 사용될 수 있다. 또한, 상기 백신은 이와 유사한 포도상구균성 감염으로부터 개 및 말을 보호하는 데 사용될 수 있다.
면역원성을 강화하기 위하여, 단백질을 담체 분자에 접합시킬 수도 있다. 적절한 면역원성 담체로는 알부민, 헤모시아닌, 티로글로불린, 및 이들의 유도체와 같은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 특히 소의 혈청 알부민(BSA) 및 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)이 있다. 기타 유도 단백질 또는 비단백질성의 유도 물질이 당 기술분야에 공지되어 있다. 면역원성 담체는 통상적으로 적어도 1,000 달톤, 바람직하게는 10,000 달톤 이상의 분자량을 갖는다. 담체 분자는 종종 헵텐과의 공유결합을 촉진하는 반응성 기를 함유한다. 아미노산의 카르복시산기 또는 아민기 또는 당단백질의 당기는 종종 이러한 방식으로 사용된다. 이러한 기가 결여된 담체는 종종 적절한 화학물질과 반응시켜 이러한 기를 만들 수 있다. 면역원이 마우스, 래트, 염소, 양, 기니아 돼지, 닭 등 같은 동물, 바람직하게는 마우스 및 토끼에 주사되면, 면역반응이 유발된다. 대안적으로, 다수의 단백질 또는 펩타이드의 복사체를 포함하는 다수의 항원 펩타이드 또는 항원적으로 또는 면역학적으로 동등한 폴리펩타이드가 담체를 사용하지 않아도 면역원성을 개선시키기에 충분한 항원일 수 있다.
MSCRAMM 단백질은 접합체에 대한 면역원성 반응을 촉진하는 유효량의 면역보강제와 함께 투여될 수 있다. 동시에, 사람에게 광범위하게 사용되는 유일한 면역 보강제는 명반 (인산알루미늄 또는 수산화알루미늄)이다. 사포인 및 이것의 정제 성분인 Quil A, 연구 및 수의 분야에 사용되는 프로인트의 완전 면역 보강제 및 기타 변역 보강제는 사람의 백신 내에서 이들의 잠재적인 용도를 제한하는 독성을 갖는다. 그러나, 본 발명에 참고로 인용된 Goodman-Snikoff 등의J. Immunol., 147:410-415(1991)에 개시된 무라밀 디펩타이드, 모노포스포릴 리피드 A, 인지질 접합체와 같은 화학적으로 제한된 제법, 본 발명에 참고로 인용된 Miller 등의J. Exp. Med., 176:1739-1744(1992)에 개시된 프로테오리포좀 내의 접합체 캡슐화, 및 Novasome™ 지질 부형제(Micro Vascular Systems, Inc., Nashua, NH)와 같은 지질 부형제 내의 단백질 캡슐화도 유용할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명자는 특정 펩타이드 또는 핵산 분절을 숙주 세포에 주입하기 위하여 리포좀 및/또는 나노캡슐의 사용을 고려하였다. 특히, 본 발명의 말로닐티로실 및 포스포티로실 펩타이드는 DMSO를 함유하는 용액 내 전달을 위하여 제형화되거나 리포좀 내에 캡슐화될 수 있다.
이러한 제형은 본 발명의 핵산, 펩타이드, 및/또는 항체를 약리학적으로 허용 가능한 제형에 주입하는 데 바람직할 수 있다. 리포좀의 제조방법 및 용도는 당 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, Couvreur 등의FEBS Lett, 84:323-326(1997) 및Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 5:1-20(1988)에는 세포내 박테리아의 감염 및 질환을 표적 항생제 치료하는 데 있어 리포좀 및 나모캡슐의 용도가 개시되어 있다. 최근, 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 가지는 리포좀이 개발되었다(Gabizon and Papahadjopoulos,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6949-6953, 1988; Allen and Choun,FEBS Lett, 223:42-46, 1987).
리포좀은 T 세포 현탁액, 1차 간세포 배양물, 및 PC 12 세포를 포함하는 다른 과정에 의해 트랜스펙션에 내성인 다양한 세포 유형과 함께 성공적으로 사용되었다(Mulleret al.,DNA Cell Boil., 9(3): 221-229, 1990). 또한, 리포좀은 바이러스 계통의 전달 시스템에는 통상적인 DNA의 길이 제한에 무관하다. 리포좀은 유전자, 약제, 방사선 치료제, 효소, 바이러스, 전사인자, 및 알로스테릭 작용체를 다양한 배양 세포주 및 동물에 도입하는데 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀-매개의 약제 운반의 효능을 조사하는 여러 성공적인 의학적 실험은 완성되었다(Lopez-Beresteinet al, cancer Drug Review, 2(3):183-189, 1985; Sculieret al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 24(3):527-538, 1988). 더욱이, 리포좀의 사용이 전신 전달 후의 자가 면역반응, 독성 또는 생식선으로의 이동과는 관련이 없다는 것이 여러 연구를 통해 제안되었다(Mori and Fukatsu,Epilepsia, 33(6):994-1000, 1992).
리포좀은 수계 배지 내에서 분사되어, 자발적으로 이중막의 동심 소포(멀티라멜라 이중막 소포(MLV)라고도 칭함)를 형성하는 인지질로부터 형성된다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 미크론의 직경을 갖는다. MLV를 파쇄하면, 중심에 수용액을 함유하는 200 내지 500 A 범위의 직경을 가지는 작은 유니라멜라 소포(SUVS)가 형성된다.
리포좀은 세포막과 유사성이 많고, 펩타이드 조성물의 담체로서 본 발명에사용된다. 리포좀은 수용성 및 지용성 물질은, 즉 수계 환경 및 그들의 이중막 각각에 포획될 수 있기 때문에, 다양한 용도로 적합하다. 약제-함유 리포좀은 리포좀 제형을 선택적으로 변형시킴으로써 활성제의 자리-특이성 운반에 사용될 수 있다.
Couvreur 등의 연구(FEBS Lett, 84:323-326, 1977; andCrit Rev Ther Drug Carrier Syst, 5:1-20, 1988) 외에도, 다음과 같은 정보가 리포좀 제형의 제조에 사용될 수 있다. 인지질은 물에 분산되는 경우, 지질 대 물의 몰 비율에 따라 리포좀보다 다양한 구조를 형성할 수 있다. 리포좀의 비율은 낮은 것이 구조에 바람직하다. 리포좀의 물리적인 특성은 PH, 이온력, 2가 양이온의 존재에 따라 좌우된다. 리포좀은 이온 및 극성 물질에 대하여 낮은 투과성을 나타내지만, 고온에서는 그들의 투과성을 현격하게 변경시키는 상 전이가 일어난다. 상 전이는 겔 상태로서 공지된 조밀하게 팩킹된 정렬된 구조에서, 유체 상태로서 공지된 느슨하게 팩킹된 덜-정렬된 구조로의 변화를 수반한다. 이는 특정한 상-전이 온도하에서 발생하며, 이온, 당, 및 약제에 대한 투과성을 증가시킨다.
온도에 외에도, 단백질에의 노출 또한 리포좀의 투과성을 변화시킬 수 있다. 시토크롬 C와 같은 몇몇 용해성 단백질은 이중막을 변형시키고 투과함으로써 투과성을 변화시킨다. 콜레스테롤은 인지질을 보다 조밀하게 팩킹하여 단백질의 이런 투과를 억제한다. 항생제 및 억제제의 전달용으로 가장 유용한 리포좀 형태는 콜레스테롤을 함유하는 것이라고 여겨진다.
용질을 포획하는 능력은 리포좀의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, MLV는용질의 포획에 있어 적절한 효과를 나타내지만, SUV는 상당히 비효과적이다. SUV는 크기 분포에 있어 균질화 및 재생산성의 장점을 제공하지만, 보다 큰 유니라멜라 소포(LUV)는 크기와 포획 효율간의 절충효과를 제공한다. 이는 에테르 증발에 의해서 제조되며 MLV보다 용질 포획에 있어 3배 내지 4배 이상 효율적이다.
리포좀 특성 외에도, 포획 화합물에 있어서 중요한 결정인자는 화합물 자체의 물리화학적 특성이다. 극성 화합물은 수계 영역에 포획되고, 비극성 화합물은 소포의 지질 이중막에 결합한다. 이중막이 파괴되는 경우, 극성 화합물은 투과를 통해 방출되지만, 비극성 화학물질은 이중막이 온도 또는 지질단백질(lipoprotein)로의 노출에 의해 파괴되지 않는 한, 이중막과 제휴한 상태를 유지한다. 두 유형 모두 상 전이 온도에서 최고의 발산속도를 나타낸다.
리포좀은 다음과 같은 4개의 상이한 메커니즘을 통해 세포들과 상호 작용한다: 대식세포 및 호중구와 같은 세망내피계의 식세포에 의한 세포이물 흡수; 비특이적 약한 소수성 또는 정전기적인 힘, 또는 세포-표면 성분과의 특이적인 상호작용에 의한 흡착; 세포질로의 리포좀 함유물의 자발적인 방출과 함께, 원형질막으로의 리포좀의 지질 이중막의 삽입에 의한 원형질 세포막과의 융합; 및 리포좀 함유물과 관계없이, 세포 또는 세포하의 막으로의 리포좀성 지질 전달. 종종, 어떠한 메커니즘이 유효하고, 하나 이상의 메커니즘이 동시에 작동하는 지를 결정하는 것을 어려운 일이다.
정맥내 주입된 리포좀의 운명 및 배치는 크기, 유동성 및 표면전하와 같은 물리적 특성에 의해 좌우된다. 이들은 수시간 또는 수일 동안 조직내에 존재할 수있으며, 혈액 내에서의 반감기는 수분 내지 수시간의 범위이다. MLV 및 LUV와 같은 보다 큰 리포좀은 세망내피계의 식세포에 의해 신속하게 흡수되지만, 순환계의 생리기능은 대부분의 자리에서 이러한 큰 종류의 물질의 방출을 억제한다. 이들은 거대 천공 또는 구멍이 간 또는 비장의 시누소이드(sinusoid)와 같은 모세 내피 내에 존재하는 장소에서만 방출될 수 있다. 따라서, 이들 기관은 흡수가 우세한 자리이다. 반면, SUV는 광범위한 조직분포를 나타내지만, 여전히 간 또는 비장 내에 우세하게 격리되어 있다. 일반적으로, 이러한 생체내 행동은 그들의 큰 크기에 허용 가능한 기관 및 조직에만 리포좀의 가능한 표적화를 제한한다. 여기에는 혈액, 간, 비장, 골수, 및 림프 기관 등이 포함된다.
일반적으로, 표적화는 본 발명의 관점에서 제한적이지 않다. 그러나 특정한 표적화를 원하는 경우에는, 이를 수행하기에 적합한 방법이 사용될 수 있다. 항체는 리포좀 표면에 결합하여 항체 및 특정한 세포형의 표면상에 위치하는 특이 항원 수용체에 대한 이들의 약제 함유물을 인도하는 데 사용될 수 있다. 탄수화물 결정체(세포-세포 인식, 상호작용 및 부착을 담당하는 당단백질 또는 당지질 세포-표면 성분)는 리포좀을 특정한 세포형으로 인도할 수 있기 때문에, 인식자리로도 사용될 수 있다. 대부분, 리포좀 제제는 정맥내 주입되어 왔지만, 다른 투여경로가 사용될 수도 있다.
대안적으로, 본 발명은 본 발명의 펩타이드의 약리학적으로 허용 가능한 나노캡슐 제형을 제공한다. 일반적으로, 나노캡슐은 안전하고 재생산 가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다(Henry-Michellandet al,Int. J. Pharm., 35:121-127, 1987). 세포내의 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용한 (약 0.1 미크론 크기의) 초미립자가 고안되어야 한다. 이러한 요구사항을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 본 발명에 사용되었으며, 이러한 입자는 Couvreur 등의supra(1977, 1988)에서 개시된 바와 같이 용이하게 제조될 수 있다.
적절한 투여방법에는 국부, 경구, 항문, 질, 정맥내, 복막내, 근육내, 피하, 비강내, 및 피내 투여가 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
국부 투여용 조성물은 연고, 크림, 겔, 로션, 드롭(점이제, 또는 점안제와 같은)의 형태로 제형화된다. 상기 조성물은 창상 또는 외과적 연고, 봉합 및 에어로졸에 첨가될 수 있다. 상기 조성물은 보존제, 투과 촉진 용매, 연화제와 같은 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다. 국부용 제형은 또한 크림 또는 연고 기재, 에탄올, 또는 오레일 알콜과 같은 통상적인 담체를 함유할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 백신은 비경구(즉, 근육내, 피내 또는 피하) 투여 또는 비인두(즉, 비강내) 투여용 단일용량으로 팩킹될 수 있다. 상기 백신은 삼각근으로 근육내 주입되는 것이 가장 바람직하다. 상기 백신은 투여를 용이하게 하는 약리학적으로 허용 가능한 담체와 혼합되는 것이 바람직하다. 상기 담체는 보존제를 함유하거나 함유하지 않는 물 또는 완충 염수가 보편적이다. 상기 백신은 투여 시 또는 용액 내에서 재현탁하기 위하여 동결 건조될 수 있다.
단백질이 접합될 수 있는 담체 또한 중합성 방출지연 시스템일 수 있다. 합성 폴리머가 항체의 조절방출을 달성하는 백신 제형에 특기 유용하다. 예를 들면,1 미크론 이하의 직경을 가지는 구로의 메틸 메타크릴레이트의 중합은 Kreuter, J.에 의하여 보고되었다(Microcapsules And Nanoparticles In Medicine And Pharmacology, M. Donbrow(Ed). CRC press, p. 125-148).
단백질의 마이크로캡슐화 또한 조절 방출을 제공할 것이다. 마이크로캡슐화를 위한 특정한 중합체의 선별에는 다양한 인자가 고려된다. 중합체 합성의 재생산성 및 마이크로캡슐화 방법, 마이크로캡슐화 물질 및 과정의 비용, 독소학적 측면, 다양한 방출 동력학의 요구조건, 및 중합체 및 항원의 물리화학적 적합성이 모두 고려되어야 하는 인자들이다. 유용한 중합체의 예로는 폴리카보네이트, 폴리에스터, 폴리우레탄, 폴리오르토에스테르 폴리아민, 폴리(d,l-락티드-코-글리콜라이드)(PLGA) 및 기타 생분해성 중합체가 있다. 항원의 조절 방출을 위한 PLGA의 용도는 Eldridge, J.H. 등의Current Topics In Microbiology And Immunology, 146:59-66(1989)에 개시되어 있다.
사람에 투여하기 위한 적당한 투여량은 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 바람직하게는 대략 1 mg/kg이다. 이러한 범위를 기초하여, 체중이 큰 사람에 대한 동등한 용량이 결정될 수 있다. 투여량은 조성물이 투여되는 개개인에게 적합하도록 조절되어야 하며, 개개인의 연령, 체중, 및 대사능력에 따라 달라질 것이다. 백신은 티메로살(thimerosal; 에틸(2-머캡토벤조에이트-S) 수은 나트륨 염)(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) 또는 생리학적으로 허용 가능한 보존제과 같은 안정화제를 부가적으로 함유할 수 있다.
당업자는 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명이다양하게 변환 및 변형될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
XIV. 키트
본 발명은 또한 S. aureus 또는S. epidermidis와 같은Staphylococcus박테리아에 의해 유발 또는 악화되는 감염을 검출 및 진단하기 위한 항-MSCRAMM 항체 또는 MSCRAMM 항원을 함유하는 키트를 포함한다. 바람직한 키트는 약 10분 이내에 샘플 내의 모든 항원에 실질적으로 결합하기에 충분하거나, MSCAMM을 위한 항체에 결합하기에 충분한 항원을 함유한다. 상기 항체 또는 항원은 고체 지지대 상에 고정될 수 있으며, 상기에 개시된 바와 같은 검출 가능한 제제로 표지될 수 있다. 상기 키트는 검출 가능한 제제를 검출하는 검출수단을 선택적으로 함유한다. 항체 또는 항원이 플루오로크롬 또는 방사성 표지로 표지되는 경우, 사용자는 적절한 분광 광도계, 섬광 측정기, 또는 현미경을 가지고 있을 것이기 때문에, 이들 제제를 검출하기 위한 수단은 통상적으로 키트 내에 제공되지 않는다. 검출 가능한 제제가 효소인 경우에는, 검출 가능한 제제를 검출하기 위한 수단이 키트 내에 제공되며, 이는 통상적으로 모든 항원-항체 복합체를 검출하기에 충분한 양의 효소에 대한 기질을 포함한다. 검출 가능한 제제를 검출하기 위한 바람직한 수단 중 하나가 효소에 착색 산물로 전환되는 기질이다. 보편적인 예는 2,2'-아지노-디-[3-에틸-벤조티아졸린 설포네이트](ABTS)와 함께 양고추냉이 포옥시다아제 효소를 사용하는 것이다.
상기 키트는 체액 샘플 내에 존재하는 세포를 용해시키는 용해제를 선택적으로 함유한다. 적절한 용해제로는 Tween-80, Nonidet P40, 및 Triton X-100과 같은계면활성제가 있다. 상기 용해제는 항체와 함께 고체 지지대에 고정되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 키트는 각 단계 사이에서 기질을 세척하기 위한 완충용액을 함유할 수 있다. 통상적으로, 완충용액에는 인산염 완충용액, 생리 염수, 시트르산염 완충용액, 또는 트리스 완충용액이 있다.
상기 키트는 분석결과를 측정하기 위해 상이한 소정의 농도의 항원을 선택적으로 함유할 수 있다. 상기 키트는 대조목적을 위해 측정된 표준 분석물 내의 항원의 함량에 대한 가시적 또는 수적 설명이 부가적으로 함유할 수 있다. 예를 들면, 착색 산물을 생산하는 분석물이 사용되는 경우, 시트에는 항원의 함량 차이와 관련된 증가강도에 대한 사항이 포함될 수 있다.
상기 키트 검출 시스템 내에 두 개의 항체를 선택적으로 포함할 수 있다. 소량으로 존재하는 제1 항체는 분석용 항원에 대하여 특이성을 갖는다. 이보다 다량으로 제공되는 제2 항체는 제1 항체의 검출에 사용된다. 예를 들면, 토끼의 항체는 LOOH/아민 항원의 검출에 사용될 수 있고, 항-토끼 IgG 항체는 결합된 토끼의 항체를 검출하는데 사용될 수 있다. 염소의 항체 및 항-항체 또한 보편적으로 사용된다.
비제한적인 실시예에서, 환자의 지질 과산화 상태를 검출하기 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는 원하는 항체에 대하여 특이적인 토끼의 항체, 결합된 제1 항체를 검출하기에 충분한 함량의 항-토끼 IgG 항체, 제2항체와 접합된 효소, 및 효소에 노출되는 경우 색상을 변화시키는 효소에 대한 기질을 포함한다. 또한, 콜라겐 결합 단백질 및 ClfA 피브리노겐 결합 단백질의 M55 부위과 같은 하나 이상의 MSCRAMM 항원을 사용하여 키트를 제조할 수도 있으며, 이 키트는 콜라겐 결합 및 피브리노겐 결합 MSCRAMM에 대한 항체를 함유하는 샘플의 검출할 수 있을 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위한 것이다. 당업자는 하기 실시예에 개시된 방법이 본 발명의 방법을 재연하는 것이며, 실시를 위한 바람직한 방식임을 이해해야 한다. 그러나 당업자는 본 발명의 권리 내에서, 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않는 범위 이내에서 이들 특정 구현예가 변형될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
실시예 1
원형 4성분 MSCRAMM 백신의 제법
일련의 재조합 단백질. 콜라겐으로부터 대표적인 부위, Fn 및 Fbg-결합 MSCRAMM(도 1)을E. coli에서 과대 발현시키고, 상기에서 기술한 것처럼 금속 킬레이팅 크로마토그래피를 사용하여 친화성 정제하였다(예를 들면, Johet al., Biochemistry. 33(20):6086-6092; Pattiet al.,J. Biol. Chem. 270, 12005-12011, 1995; McDevittet al.,Mol. Micro. 11(2):237-248, 1994; Ni Eidhinet al., Infect. Immun. Submitted, 1998). 사용된 것은 다음과 같다: cna로부터 발현된 재조합 콜라겐-결합 MSCRAMM 내에 함유된 아미노산(M55, 본 발명과 함께 계류중인 미국특허 출원 제08/856,253호에 개시됨, 본 발명에 참고로 인용됨); clfA으로부터 발현된 재조합 피브리노겐-결합 MSCRAMM 내에 함유된 아미노산(pCF40, 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 출원 제08/293,728호에 개시됨); clfB으로부터 발현된 재조합 피브리노겐-결합 MSCRAMM 내에 함유된 아미노산(A 부위, 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 출원 제09/200,650호에 개시됨); 및 재조합 피브로넥틴-결합 MSCRAMM 내에 함유된 아미노산(DUD4, 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 출원 제09/101,317호에 개시됨). 재조합 FN-결합 MSCRAMM 단백질 DUD4를 M55, ClfA의 A 부위 및 ClfB의 A 부위에 결합하기 전에 포르말린(5% 포르말린, 4℃에서 하룻밤 동안)으로 처리하였다.
실시예 2
재조합 단백질의 생산을 위한 E. coli 균주의 증식 실시예
하루밤 동안 배양한 재조합 플라스미드를 함유하는E. coliJM101 또는 TOP3 세포(Stratagene) 배양균을 50 mg/㎖의 암피실린을 함유하는 1 ℓ의 Luria Broth(Gibco BRL)를 사용하여 1:50으로 희석하였다. 배양균이 OD600이 0.5 내지 0.8이 될 때까지,E. coli세포를 배양하였다. 최종농도가 0.2 mM이 되도록 IPTG를 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 3시간동안 발현을 유도한 후, 원심분리하여 세포를 수집하고, 15 ㎖의 완충용액 A(5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)로 재 현탁한 다음, 20,000 lb./in2로 2회 프렌치프레스(French press)를 통과시켜 용해시켰다. 10분 동안 50,000×g로 원심분리하여 세포 파쇄물을 제거하고 상청액을 0.45 μM 필터를 통과 시켰다.
실시예 3
pQE-30(Qiagen™; Qiagen Inc., Chatsworth, CA) 또는 PV-4 기반의
재조합 플라스미드로부터 발현된 HIS 6 함유 재조합 단백질의 정제
Ni2+로 하전된 이미노디아세트산/Sepharose™ 6B Fast Flow(Sigma, St. Louis, MO) 칼럼을 사용하는 고정화 금속 킬레이트 크로마토그래피에 의해 재조합 단백질을 정제하였다. 고정된 메탈 킬레이트 친화성 크로마토그래피하여 HIS6표지된 단백질을 정제하였다. 보다 구체적으로는, FPLC™ 시스템에 연결된, 이미노디아세트산/Sepharose™ 6B FF를 함유하는 칼럼을 150 mM Ni2+로 전하를 띠게 하고 완충용액 A(5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7.9)로 평형화하였다. 평형화 후, 박테리아의 상청액을 칼럼에 주입하고, 칼럼을 10 베드 볼륨(bed volumes)의 완충용액 A로 세척하였다. 이어서, 완충용액 B(200 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7.9)로 칼럼을 용리시켰다. 280 nm의 흡광도에서 용리액의 단백질을 측정하였고, SDS-PAGE를 통하여 피크 분율(peak fraction)을 분석하였다. 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 후, 1% Triton X-114로 세제 추출하여 정제된 재조합 단백질로부터 내독소를 제거하고, 이를 폴리마이신(polymyxcin) B-세파로스 칼럼을 통과시켰다. 내독소의 함량는 색원체 Limulus Amebocyte Lysate(BioWhittaker, Walkersville, MD) 분석을 통해 정량하였다.
실시예 4
4가지 성분의 MSCRAMM 백신-MSCRAMM IV를 사용한 실험동물의 면역화
붉은 털 원숭이:
100 ㎍의 M55(1 EU/mg), ClfA(2.5 EU/mg), ClfB(<1.0 EU/mg), 및 DUD4(<10 EU/mg)를 함께 혼합하여 MSCRAMM IV 백신을 제조하였다. 혼합액을 TiterMax™Gold(CytRX, Norcross, GA)와 1:1 비율로 혼합하였다. 두 마리의 암컷 붉은 털 원숭이(ID#495Z&664U(~9.4 kg))의 후부 사두근에 200 ㎕의 백신을 근육내 접종하였다. 28일 후, 두 원숭이에 200 ㎕의 동일한 백신 제형을 IM 추가 접종 감염시켰다. 부가의 두 마리 암컷 원숭이 (ID#215W&203U(~8.0 kg))를 수산화알루미늄(2% Alhydrogel; Superfos, Denmark)과 1:1의 비율로 혼합한 MSCRAMM IV로 면역화하였다. 28일 후, 두 원숭이에 200 ㎕의 동일한 백신 제형을 IM 추가 접종 감염시켰다.
임상조건은 다음과 같다.
당일 15 ml의 사전-면역화 혈장 샘플, 완전 혈액 화학1일 0.2 ml의 MSCRAMM(100㎍)으로 후부 사두근에 IM 백신접종,주사위치 조사, 온도 기록7일 간 패널(panel), 온도 기록, 주사위치 조사14일 15 ml 혈장 샘플21일 15 ml 혈장 샘플28일 완전 혈액 화학, 온도 기록, 15 ml 혈장 표본,0.2 ml MSCRAMM IV(100 ㎍)의 IM 추가 접종 감염.30일 간 패널, 온도 기록, 주사위치 조사35일 간 틀, 온도 기록, 주사위치, 15 ml 혈장 샘플42일 15 ml 혈장 샘플49일 15 ml 혈장 샘플106일 15 ml 혈장 샘플
4마리 실험동물 모두 초기 면역화 후에 혈청변환(seroconvert)되었다. 일차 백신접종 뒤 106일 후, ELISA를 통해 바탕값보다 3배 이상 증가된 항체수치를 검출되었다. 실험 21주 째에, 4마리의 실험동물에 추가 면역접종하였다. 각각 실험동물에 125 ㎕의 백신을 4차례 피하 주사하여 총 600 ㎕의 백신을 추가 접종 감염시켰다. 1차 백신접종 뒤 189일 후, ELISA를 통해 바탕값보다 적어도 3배, 많게는15배 정도의 항체 수치 증가가 검출되었다. 표 2를 참조한다. 수의사들의 직접적인 관찰결과, 주사자리의 어떠한 역반응도 검출되지 않았다. 또한 간 효소 프로파일, CBC, 혈액학적 프로파일은 붉은 털 원숭이의 정상범위 내에 있었다.
실시예 5
백신접종된 원숭이로부터 채취된 혈장 샘플의 ELISA 분석
Immunon-2 마이크로리터 플레이트(Dynex Technologies, Chantilly, VA)는 10 ㎍/㎖(50 ㎕)의 콜라겐 결합 MSCRAMM(M55), 피브리노겐 결합 MSCRAMM(ClfA; pCF44), 피브리노겐 결합 MSCRAMM(ClfB; A 부위), 및 피브로넥틴 결합 MSCRAMM(DUD4)으로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 15㎕의 희석된 혈청 샘플을 MSCRAMM 코팅된 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 0.05% vol/vol의 Tween-20을 함유하는 PBS로 이루어진 완충용액으로 세척하고, PBS내의 1% wt/vol의 BSA, 0.05% Tween-20을 함유하는 용액으로 차단하고, 및 0.01% BSA, 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 이루어진 완충용액으로 항체를 희석하였다. 1차 및 2차 항체를 25℃에서 60분 동안 배양하였다. 2차 항체는 항체 완충용액으로 3500배 희석된 알칼리성 포스페이타아제-접합 염소 항 원숭이 면역글로불린 G(Rockland, Gilbertsville, PA)이다. ELISA 플레이트를 pH 9.8의 1M 디에탄올아민, 0.5 mM MgCl2내에 1 ㎎/㎖의 p-니트로페닐 포스페이트(Sigma)로 37℃에서 30분 동안 전개시키고, Perkin Elmer HTS 7000 Bio-assay reader를 사용하여 405 nm에서 정량하였다. 각각의 혈장 샘플을 pH 7.4의 0.05% Tween 20, 0.1% BSA를 함유하는포스페이트 완충 염수로 100배 희석하였다. 도 2는 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
실시예 6
억제 분석
메티실린 내성의S. aureus균주 601(Smeltzer, M. S.,Gene, 196:249-157, 1997)을 37℃하의 BH1 배지 내에서 일정한 속도로 교반하면서 15 시간동안 배양하였다. 하룻밤 동안의 배양물을 BH1을 사용하여 1:100으로 희석하고, 지수 생장곡선의 중간 단계가 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 박테리아를 원심분리하여 수집하고, 멸균된 PBS(pH 7.4)로 3회 세척하고, 카보네이트 완충용액(50 mM NaHCO3, pH 8.5)으로 재현탁하였다. 박테리아를 pH 8.5의 50 mM NaHCO3내의 1 mg/㎖의 FITC(Sigma)와 혼합하고, 25℃하의 암실에서 1시간 동안 교반 배양하였다. 박테리아 세포를 원심분리하여 FITC 표지 반응을 중단하고, 비반응 FITC를 함유하는 상청액을 제거하였다. 표지된 박테리아를 PBS로 3회 세척하여 비첨가 FITC를 제거하고, PBS로 재현탁한 뒤, 1×108cfu/㎖로 조절하여, pH 7.4의 PBS 내에서 -20 ℃에 보관하였다.
실시예 7
면역화 원숭이 유래의 IgG 정제
PROSEP™-A 고용량 수지(Bioprocessing Inc., Princeton, NJ) 상에서 친화성 크로마토그래피하여 원숭이 혈장으로부터 정제하였다. 간단히 발하면, 혈장을 녹여서 0.45 μ필터를 통과시켰다. 혈장을 PROSEP™-A 고용량 수지를 함유하는 벤치탑 칼럼에 걸었다. PBS를 사용하여 칼럼을 광범위하게 세척하여 비결합 물질을 제거하였다. 0.1M 나트륨 시트르산(pH 3.0)을 사용하여 칼럼으로부터 IgG를 용리시켰다. 그런 직후, 1M Tris(pH 9.0)를 첨가하여 용리된 IgG의 pH를 pH 6.8 내지 7.4로 중화시켰다. 이어서, IgG를 PBS(pH 7.4)와 함께 투석하여, 농축하고 필터멸균 하였다. 280nm의 흡광도에서 정제된 IgG의 농도를 측정하였다.
실시예 8
경쟁억제 ELISA
Costar 96 웰 검정 플레이트를 PBS(pH 7.4) 내의 소의 콜라겐, 사람의 피브리노겐, 및 소의 피브로넥틴으로 이루어지는 10 ㎍/㎖의 매트릭스 성분 용액을 사용하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 2시간 동안 코팅하였다. 매트릭스 단백질 코팅된 플레이트를 PBS, 0.05% Tween 20을 사용하여 3회 세척한 뒤, PBS, 1%BSA로 차단하였다. 차단된 플레이트를 PBS, 0.05% Tween 20을 사용하여 3회 세척하였다. FITC-표지된S. aureus세포 분취액 500㎕를 PBS, 0.05% Tween 20, 0.1% BSA 내의 많은 양의 정제된 원숭이 IgG와 혼합하였다. 표지 세포 및 IgG를 25℃에서 1시간 동안 교반 혼합하였다. 50㎕의 표지 세포/IgG 혼합물을 마이크로리터 플레이트 상의 각각의 웰에 첨가하고, 25℃하의 로커 플랫트폼(rocker platform) 상에서 배양하였다. PBS, 0.05% Tween 20을 사용하여 웰을 3회 세척하였다. 485 nm로 설정된 여기필터 및 535 nm로 설정된 방출필터가 장착된 Perkin Elmer HTS7000 Bio-Assay reader를 사용하여 고정된 매트릭스 단백질에 결합된 박테리아의 양을 측정하였다.
실시예 9
폐혈증 동물모델
본 발명자들은 폐혈증의 마우스 모델(Bremell, T. A.,et al., Infect. Immun. 62(7):2976-2985, 1992)을 사용하여, MSCRAMM IV로 면역화된 붉은 털 원숭이로부터 정제된 IgG를 사용한 수동 면역접종은 사망을 초래하는 폐혈증으로부터 마우스를 보호할 수 있음을 증명하였다. MSCRAMM IV(n=12)로 면역화된 붉은 털 원숭이 유래의 정제된 IgG 또는 비-면역화 붉은 털 원숭이 유래의 IgG(n=13) 20 mg을 5주 내지 8주된 어린 NMRI 수컷 마우스에게 I.P. 수동 면역접종하였다. 당일, 2.4×107CFU/마우스의S. aureus균주 LS-1을 이들 마우스에게 i.v. 추가 접종 감염시켰다. 다음 3일에 걸쳐, 사망률 및 체중 변화를 측정하였다. 접종 후 3일 뒤에, MSCRAMM 수동 면역화 군에서는 12마리 중 한 마리의 마우스도 사망하지 않은 것에 비해, 대조군에서는 13마리 중 3마리의 마우스(13%)가 사망하였다. 13일 후, 대조군의 사망률은 53.8%(7/13)인 데 비하여, MSCRAMM IV 수동 면역화군의 사망률은 단지 16.2%(2/12)이었다. 대조군의 마우스는 MSCRAMM IV IgG 수동 면역화군의 마우스에 비해 체중이 현저하게 감소된 것으로 나타났다(28.0±2.5% 대 21.3±3.1%; p<0.01).
실시예 10
M55(콜라겐-결합 MSCRAMM) 및 ClfA(피브리노겐-결합 MSCRAMM)를
함유한 다성분 백신
60마리의 암컷 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스에 총 50 ㎍의 오브알부민, M55(콜라겐-결합 MSCRAMM) 또는 M55 및 ClfA(피브리노겐-결합 MSCRAMM) 단백질의 혼합물을 피하주사를 통해 수여하였다. 프로인트의 완전 면역 보강제에 항원을 에멀젼화하여 1차 주사액을 제조하였다. 1차 접종 후 14일 뒤, 프로인트의 완전 면역 보강제 내의 25 ㎍의 총 단백질 2차 주사액을 수여하였다. 1차 접종 후 28일 뒤, PBS 내의 25 ㎍의 총 단백질의 최종 주사액을 수여하였다. 마지막 접종 후 2주 뒤, 모든 마우스의 후기 혈액 샘플을 채취하여 상이한 MSCRAMM 단백질에 대한 항체의 역치를 측정하였다. 이어서, 단일 정맥내 주사를 통해 1.2×108CFU의S. aureus601을 마우스에 추가 접종 감염시켰다(1차 접종 후 42일 뒤). 추가 접종 감염 후 5일 뒤, 마우스를 죽이고, 그들의 신장을 취하였다. 이어서, 상기 신장을 균질화하고, 혈액 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하고, 콜로니의 개수를 계측하여 신장 내의 박테리아의 부하를 측정하였다. 실험결과, 오브알부민 군(7.03±0.93 log CFU/g)과 M55/ClfA 군(4.83±3.04 log CFU/g, p=0.003)간의 박테리아 부하는 로그2의 차를 나타내었다. 오브알부민 군과 비교한 경우, M55 군(5.86±3.42 log CFU/g, p=0.003)에서도 박테리아의 부하에 차이가 나타났다.
상기 발명의 상세한 설면 및 실시예에 개시된 바와 같이, 백신을 포함하는 면역학적 조성물, 및 MSCRAMM 단백질을 함유하는 기타 약리학적 조성물은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 하나 이상의 결합 단백질, 또는 이들의 활성 또는 항원성단편, 또는 이들의 융합 단백질은 당 기술분야에 공지된 방법 및 물질을 사용하여, 단독으로 또는 기타 항원과 함께 제형화 및 팩킹될 수 있다. 면역학적 반응은 치료 또는 예방의 목적으로 사용될 수 있으며, 세포독성의 T-림프구 또는 CD4+ T 림프구와 같은 T-림프구에 의해 생산되는 것들과 같은 항체 면역성 또는 세포 면역성을 제공할 수 있다.

Claims (40)

  1. 콜라겐 결합 단백질의 콜라겐 결합 부위에 결합하여 상기 콜라겐 결합 단백질의 콜라겐에의 결합을 억제하는 항체, 및 피브리노겐 결합 단백질의 피브리노겐 결합 부위에 결합하여 상기 피브리노겐 결합 단백질의 피브리노겐에의 결합을 억제하는 항체를 포함하는 조성물.
  2. 피브로넥틴 결합 단백질의 피브로넥틴 결합 부위에 결합하여 상기 피브로넥틴 결합 단백질의 피브로넥틴에의 결합을 억제하는 항체, 콜라겐 결합 단백질의 콜라겐 결합 부위에 결합하여 상기 콜라겐 결합 단백질의 콜라겐에의 결합을 억제하는 항체, 및 피브리노겐 결합 단백질의 피브리노겐 결합 부위에 결합하여 상기 피브리노겐 결합 단백질의 피브리노겐에의 결합을 억제하는 항체를 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 미생물의 결합 단백질에 결합하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 미생물의 결합 단백질이 포도상구균의 결합 단백질인 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 미생물의 결합 단백질이 연쇄상구균의 결합 단백질인 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 포도상구균의 결합 단백질이Staphylococcus aureus의 결합 단백질인 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기Staphylococcus aureus의 결합 단백질이Staphylococcus aureus의 FnBP-A 및 CNA 및 ClfA 및 ClfB의 결합 단백질인 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    SdrF, SdrG, 및 SdrH로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질에 대한 항체를 추가로 포함하는 조성물.
  9. 콜라겐 결합 단백질의 콜라겐 결합 부위 및 피브리노겐 결합 단백질의 피브리노겐 결합 부위, 및 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 각각 면역학적 유효량으로 포함하는 백신.
  10. 피브로넥틴 결합 단백질의 피브로넥틴 결합 부위, 콜라겐 결합 단백질의 콜라겐 결합 부위, 및 피브리노겐 결합 단백질의 피브리노겐 결합 부위, 및 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 백신.
  11. 피브로넥틴 결합 단백질이 결합되는 피브로넥틴 리간드 펩타이드, 콜라겐 결합 단백질이 결합되는 콜라겐 리간드 펩타이드, 및 피브리노겐 결합 단백질이 결합되는 피브리노겐 리간드 펩타이드, 및 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 백신.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 결합 단백질이 미생물로부터 유래되는 백신.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 미생물이 포도상구균 유기체인 백신.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 미생물이 연쇄상구균 유기체인 백신.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 포도상구균 유기체가Staphylococcus aureus인 백신.
  16. 제15항에 있어서,
    상기Staphylococcus aureus결합 단백질이 FnBP-A, CNA, ClfA, 및 ClfB를 포함하는 백신.
  17. 제15항에 있어서,
    SdrF, SdrG, 및 SdrH로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질을 추가로 포함하는 백신.
  18. 제10항에 있어서,
    상기 결합 단백질이 미생물로터 유래되는 백신.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 미생물이 포도상구균 유기체인 백신.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 미생물이 연쇄상구균 유기체인 백신.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 포도상구균 유기체가Staphylococcus aureus인 백신.
  22. 콜라겐 결합 단백질의 콜라겐 결합 부위 및 피브리노겐 결합 단백질의 피브리노겐 결합 부위를 포함하는 펩타이드 조성물을 면역학적 유효량으로 포함하는 약리학적 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 면역반응 유도방법.
  23. 피브로넥틴 결합 단백질의 피브로넥틴 결합 부위, 콜라겐 결합 단백질의 콜라겐 결합 부위, 피브리노겐 결합 단백질의 피브리노겐 결합 부위를 포함하는 펩타이드 조성물을 면역학적 휴효량으로 포함하는 약리학적 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 면역반응 유도방법.
  24. 동물 내에서 미생물의 군집 형성을 억제하는 방법에 있어서,
    제1항에 따르는 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 동물 내에서 미생물의 군집 형성을 억제하는 방법에 있어서,
    제2항에 따르는 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 동물 내에서 미생물의 군집 형성을 억제하는 방법에 있어서,
    제9항에 따르는 백신을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 동물 내에서 미생물의 군집 형성을 억제하는 방법에 있어서,
    제10항에 따르는 백신을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 콜라겐 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 및 피브리노겐 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 및 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약리학적으로 허용 가능한 제형을 포함하는 백신.
  29. 제9항에 있어서,
    상기 콜라겐 결합 단백질이 M55를 포함하는 백신.
  30. 제9항에 있어서,
    상기 피브리노겐 결합 단백질이 ClfA를 포함하는 백신.
  31. 제28항에 있어서,
    상기 콜라겐 결합 단백질이 M55를 포함하는 백신.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 피브리노겐 결합 단백질이 ClfA를 포함하는 백신.
  33. 제28항에 있어서,
    상기 결합 단백질이 미생물로터 유래되는 백신.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 미생물이 포도상구균 유기체인 백신.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 미생물이 연쇄상구균 유기체인 백신.
  36. 제34항에 있어서,
    상기 포도상구균 유기체가Staphylococcus aureus인 백신.
  37. 피브로넥틴 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 콜라겐 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 및 피브리노겐 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 및 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 백신.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 핵산이 포도상구균 유래의 결합 단백질을 코딩하는 백신.
  39. 피브로넥틴 결합 단백질 및 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 백신.
  40. 제29항에 있어서,
    상기 피브로넥틴 결합 단백질이 FnBP-A 및 FnBP-B를 포함하는 백신.
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