JP2004512040A - Ｍａｐタンパク質に対するモノクローナル抗体、および感染を処置または予防することにおける使用方法 - Google Patents

Abstract

ＭＡＰタンパク質（Ｍａｐ１０タンパク質を含む）のサブドメインまたはＭＡＰタンパク質の他の免疫原性亜領域を結合するモノクローナルおよびポリクローナル抗体（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのようなブドウ球菌細菌からの処置およびこれらからの予防において有用であり得る）が提供される。さらに、医療機器は、それらが汚染されるまたはさらに汚染を拡大させる可能性を低減させるか、または排除するために、本発明の抗体を用いて処理され得る。特に、本発明の抗体は、これらが細菌の宿主細胞への接着を予防し且つ感染した宿主における細菌の殺傷を促進させるという二重の目的を果たす故に、有益である。

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、概してＭＡＰタンパク質、すなわちＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの実質的に全ての株によって発現される表面局在タンパク質に対して生成された抗体に関し、そして特にＭａｐ１０タンパク質に対するモノクローナル抗体およびＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の処置および保護におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓは、広範囲な宿主組織にコロニー形成し（ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ）、さらに皮膚損傷（創傷感染、インペチゴ、およびフランケルのような）から生命を脅かす状態（肺炎、敗血性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、敗血症、心内膜炎、および生体材料に関連する感染を含む）までの範囲に渡る範囲の感染を引き起こし得る細菌性病原体である。宿主の首尾よいコロニー形成は、ほとんどの微生物（Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む）が動物またはヒトにおいて感染を引き起こすのに必要とされるプロセスである。微生物の接着は、最終的に疾患を引き起こし得る一連の出来事における最初の重要な段階である。病原性微生物は、細菌の表面上に存在する特定の付着因子（ａｄｈｅｓｉｎｓ）を介して、カテーテル、人工関節、および脈管移植片のような宿主組織または血清の準備され埋入された生体材料に結合することによって、その宿主にコロニー形成する。ＭＳＣＲＡＭＭ^ＴＭｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ　Ａｄｈｅｓｉｖｅ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は、宿主の細胞外マトリックスにおける異なる成分を認識し且つ特異的に結合する細胞表面付着因子のファミリーである。一旦細菌が接着に成功し、そして宿主組織にコロニー形成すると、それらの生理機能が劇的に改変され、そして有害な成分（トキシンおよび加水分解酵素のような）が分泌される。さらに接着性細菌は、しばしば、バイオフィルムを産生し、そして素早くほとんどの抗生物質の殺傷効果に対してより耐性になる。
【０００３】
このようにＳ．ａｕｒｅｕｓは、特定の宿主組織成分への細菌接着を促進するように、個別に、または協力的に働き得る異なるＭＳＣＲＡＭＭ^ＴＭｓのレパートリーを発現することが知られている。ＭＡＰタンパク質（実質的に全てのＳ．ａｕｒｅｕｓ株によって発現される表面局在タンパク質）として知られる１つのこのようなタンパク質は、例えば、ＭｃＧａｖｉｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．ｐ２４７９−２４８５（１９９３）において記載される。しかしながら、異なるＭＳＣＲＡＭＭ^ＴＭｓの結合特性および細菌感染の感染力および蔓延におけるそれらの役割における多様性ゆえに、ＭＡＰタンパク質のようなＳ．ａｕｒｅｕｓからのＭＳＣＲＡＭＭ^ＴＭｓに関する情報を明らかにし且つ利用するという問題が依然として残っている。従って、広く多様なブドウ球菌（ｓｔａｐｈ）感染を予防することだけでなく、ブドウ球菌生物の感染宿主からの迅速または強力な除去を促進することにおいて成果のある組成物を開発するという感染疾患の分野において大いに所望される目的が残されている。
【０００４】
発明の要旨
従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ　ＭＡＰタンパク質に対する抗体を提供し、ブドウ球菌感染を防ぐことが本発明の目的である。
【０００５】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ　ＭＡＰタンパク質（Ｍａｐ１０タンパク質を含む）の結合サブドメインに対する抗体を提供し、ブドウ球菌感染に対し保護することもまた、本発明の目的である。
【０００６】
ブドウ球菌細菌の接着を防ぐことにおいて、およびオプソニン食作用性殺傷（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｋｉｌｌｉｎｇ）を介して、感染宿主からのこのような微生物の迅速な除去を促進することにおいて有用なＭａｐ１０タンパク質に対するモノクローナル抗体を提供することもまた、本発明の目的である。
【０００７】
ＭＡＰタンパク質を認識し得、それゆえブドウ球菌感染を同定および診断する方法において有用であり得る抗体および抗血清を提供することも、本発明のさらなる目的である。
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体の可変軽鎖配列および可変重鎖配列をコードするアミノ酸配列および核酸配列を提供することも、本発明のさらなる目的である。
【０００９】
ブドウ球菌感染の予防および処置を目的とするＭＡＰタンパク質および／またはその結合ドメイン（タンパク質Ｍａｐ１０を含む）に対するモノクローナル抗体の単離および使用を含む本発明によって、これらおよびその他の目的が提供される。本発明に従う抗−ＭＡＰ抗体の発見および単離は、従って、これらの抗体が、最初に微生物接着を予防し、そして次にオプソニン食作用殺傷を介する宿主からの感染生物の迅速な除去を促進するので、細菌に対する両刃（ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ）の攻撃に使用され得る。単離ＭＡＰタンパク質およびそれらに惹起される抗体に基づく適切な組成物およびワクチン、ならびにそれらの使用のための方法がまた、本発明によって企図される。
【００１０】
この開示される発明の精神および範囲を越えないこれらの実施形態ならびにその他の改変および改良は、本明細書および／または本明細書中に記載される参考文献（その全てが参考として援用される）を読むことによって、当業者に容易に明らかになるであろう。
【００１１】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明に従って、本発明者らによって単離および精製され、且つＳ．ａｕｒｅｕｓ感染に対して保護することが示されたＳ．ａｕｒｅｕｓのＭＡＰタンパク質に結合し得るモノクローナル抗体が提供される。ＭＡＰタンパク質は、実質的に全てのＳ．ａｕｒｅｕｓ株によって発現される表面局在タンパク質である。ＭｃＧａｖｉｎら［（ＭｃＧａｖｉｎら、１９９３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．ｐ２４７９−２４８５）は、様々な宿主タンパク質（ＢＳＰ、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびトロンボスポンジンを含む）に結合する７２ｋＤａ表面タンパク質（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株　ＦＤＡ　５７４由来）を同定した。Ｍａｐと称されるその遺伝子はクローン化され、そして配列決定された（米国特許第５，６４８，２４０（本明細書中で参考として援用される））。ｍａｐ遺伝子は６つの繰り返しユニットを含み、各サブドメイン（おおよそ約１００−１４０アミノ酸を含む）は、哺乳類動物種からのＭＨＣクラスＩＩ　ＤＲβ分子のペプチド結合溝に類似性を示す。従って、ＭＡＰタンパク質は、それぞれ約１００−１４０アミノ酸の範囲にある６つの分離したサブドメインを有すると考えられ、そしてその各々は約３５残基の保存アミノ酸を含んでいると考えられる。当初は、Ｍａｐ結合がレクチン様活性を伴うことが提唱されたが（ＭｃＧａｖｉｎら、１９９３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．ｐ２４７９−２４８５）、その後の研究によって、Ｍａｐとその標的タンパク質との間の相互作用がタンパク質−タンパク質相互作用を伴うことが実証された（Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，ｐ．２１４５７−２１４６０）。サザンブロットおよびＰＣＲ技術を用いて、２つ目のｍａｐ遺伝子クラスもまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ分離株において発見された。ｍａｐ遺伝子の２つ目のクラスによってコードされるタンパク質は、多数の繰り返し単位の有無を反映するようなサイズに関して異種性を示した。本発明に従って、本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｐ１０タンパク質（配列番号２として以下に記載される配列を参照のこと）が、全ＭＡＰタンパク質の最小結合領域であるようであり、そしてそれゆえに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのようなブドウ球菌属細菌の真核細胞への結合を予防することにおいて有用であり得、それゆえヒトおよび動物におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ型感染を処置または予防し得るモノクローナルおよび他の型の抗体を単離および獲得するために使用され得ることを決定づけた。
【００１２】
従って、本発明はＭＡＰタンパク質またはその結合サブドメイン（Ｍａｐ１０タンパク質を含む）に結合し得、またそれゆえブドウ球菌感染を予防または処置するのに有効な量で使用される場合、このような感染を予防および処置する方法において有用であり得るモノクローナル抗体を単離および／または精製することに関する。これらのモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５）の方法または当該分野で公知の他の適切な方法を使用して産生され得、さらに当該分野において周知である方法でキメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体として調製され得る。さらになお、モノクローナル抗体は、単鎖（軽または重鎖のような）から調製され得、さらに全抗体の結合特性を保持する抗体の活性フラグメントから調製され得る。活性フラグメントによって、ＭＡＰタンパク質に結合する完全な抗体と同じ結合特異性を有する抗体フラグメントが意味され、また本明細書中において使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、上記フラグメントを含むことを意味される。さらに、本発明に従うモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて調製される抗血清もまた企図され、そして当業者によって認識されるような数多くの適切な方法によって調製され得る。
【００１３】
上記に示したように、ＭＡＰタンパク質に対する抗体は、当該分野において周知である数多くの適切な方法（ＭＡＰタンパク質に対するモノクローナル抗体を生成するために利用され得る上記の十分に確立されたＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ法のような）において調製され得る。１つのこのような方法において、マウスは、１週間に１回、長期間、精製組換えＭＡＰタンパク質を用いて腹腔内注射され、その後この免疫されたマウスから得られた血液の試験を行い、精製ＭＡＰタンパク質に対する反応性を測定する。ＭＡＰに対して反応性であるマウスの同定に続いて、マウス脾臓から単離されるリンパ球がマウス骨髄腫細胞へ融合され、ＭＡＰに対する抗体に対して陽性なハイブリドーマ（これは、その後単離および培養され、その後精製およびアイソタイピングを行われる）が生産される。
【００１４】
本発明に従うモノクローナル抗体を生成するためには、これらが、当該分野において周知の慣用的な方法を用いて組換的に調製されたＭＡＰまたはＭａｐ１０タンパク質を用いて生成されることが好ましい。例えば、１つのこのような方法は、組換えタンパク質およびペプチドをクローニングおよび発現させるための発現ベクターとして、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＱＥ−３０の使用を採用する。ＤＮＡの調製、精製、制限消化、アガロースゲル電気泳動およびライゲーションは、標準的な方法を用いて行われ得、そして生じる組換えＭＡＰセグメントが単離および精製され、次いで上記の方法でモノクローナル抗体を生成するために使用され得る。
【００１５】
ＰＣＲを用いる好ましい方法において、ｍａｐの最初のサブドメインがＳ．ａｕｒｅｕｓ　ＦＤＡ　５７４ゲノムＤＮＡなどから増幅され、そしてＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターＰＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）（これは、６つのヒスチジン残基を含む組換え融合タンパク質の発現を可能にする）へサブクローニングされ得る。このベクターは、続いて、適切なＥ．ｃｏｌｉ株へ形質転換され、適切な光学密度（例えば、ＯＤ_６００）になるまで発酵槽の中で増殖され、さらに適切な化合物（０．２ｍＭ　イソプロピル−１−ベータ−Ｄ　ガラクトシド（ＩＰＴＧ）のような）で誘導され得る。次いでこの細胞は、中空糸アセンブリー（ｈｏｌｌｏｗ−ｆｉｂｅｒ　ａｓｓｅｍｂｌｙ）（例えば、孔サイズ０．４５μｍ）を使用して回収され得、そしてその細胞ペーストは凍結され、その後、適切な圧力（例えば、Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓ　＠　１１００ｐｓｉを通して２通過）で破砕される。次いで、破砕された細胞はスピンダウンされ、細胞破片が取り除かれ、キレート化カラムおよび適切な洗浄および溶出のような適した方法を用いて、適切なＭＡＰタンパク質（またはＭａｐ１０のような適切なサブドメイン）が単離される。ＭＡＰタンパク質はまた、エンドトキシン除去プロトコールを受ける。この産物をさらに精製することが必要とされる場合、さらなる工程が行われ得、そしてこの精製ＭＡＰ抗体に対して生成される抗体は、さらに以下に記載される通りである。この方法を介して単離される１つのこのようなＭａｐ１０タンパク質は、配列番号２に記載される様な配列を有し、そして配列番号１に記載される様な配列を有する核酸（またはその縮重体）によってコードされる。
【００１６】
本発明に従って、ＭＡＰタンパク質に対するモノクローナル抗体が、数多くの適切な方法によって産生され得る。１つの好ましい方法において、この精製Ｍａｐ１０サブドメインが使用され、マウスモノクローナル抗体のパネルが作製された。この好ましい方法において、Ｂａｌｂ／Ｃマウスのグループに、溶液状態か、または皮下フロイント完全または不完全アジュバントのようなアジュバントと混合された１３５μｇのＭａｐ１０の一連の皮下免疫を行った。アジュバントの最後のブーストの３日後に、脾臓を取り出し、単一な細胞懸濁液へ細かく切り（ｔｅａｓｅｄ）、そしてリンパ球を回収した。次いでこのリンパ球はＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞系（ＡＴＣＣ＃１５８１）へ融合された。細胞融合、続くプレーティングおよびフィーディングは、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｈａｐｔｅｒ２，Ｕｎｉｔ２）からのｔｈｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って行われた。
【００１７】
次いでこの融合体から生成された任意のクローンが、特異的抗−Ｍａｐ．１０抗体産生について、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングされた。陽性クローンが増殖され（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、さらに試験され、そして抗−Ｍａｐ．１０抗体を生成した単一細胞クローンを生産するクローンが同定された。
【００１８】
次いで、ハイブリドーマ細胞は、ＲＰＭＩ／ＤＭＥＭ（２ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ　Ｌ−グルタミンおよび２×ペニシリン−ストレプトマイシンを含み２−３リットル培養体積になる１×Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ培地）中で増殖された。次いでハイブリドーマの上清は、遠心分離によって回収された。上清は０．４５μＭフィルターを通して濾過され、そしてこのＩｇＧは、Ｇタンパク質クロマトグラフィーを用いてアフィニティー精製された。このモノクローナル抗体は、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）を用いて溶出され、そして直ぐに１０分の１体積の２Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ　８．０）で中和された。次いで精製ＩｇＧは、１×Ｄ−リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ　７．４）に対して透析された。必要ならば、この精製抗体を濃縮し、そしてアリコートを凍結させた。本発明に従って作製されるモノクローナル抗体としては、配列番号４（配列番号３の配列を有する核酸、またはそれらの縮重体によってコードされる）に示されるような可変軽鎖配列、および配列番号６（配列番号５の配列を有する核酸、またはそれらの縮重体によってコードされる）に示されるような可変重鎖配列を有する抗体が挙げられる。
【００１９】
モノクローナル抗体に加えて、本発明はまた、ＭＡＰまたはそのサブドメイン（Ｍａｐ１０のような）からのポリクローナル抗体を生成することを企図する。このようなポリクローナル抗体は、当該分野において公知の多数の適切な方法（精製ＭＡＰまたはＭａｐ１０タンパク質ペプチドの適切な動物宿主への導入、続く宿主動物において産生された生成抗体の単離および精製のような）のいずれかにおいて生成され得る。
【００２０】
ＭＡＰまたはＭａｐタンパク質の組換え型を用いる抗体の産生が好ましいけれども、抗体は、天然の単離および精製ＭＡＰタンパク質またはペプチドからも生成され得、また上記と同様の方法において天然ＭＡＰタンパク質を用いて、モノクローナルまたはポリクローナル抗体が生成され、このような抗体が得られ得る。なお他の慣用的な方法も、当業者によって認識されるように、組換えまたは天然精製ＭＡＰタンパク質を用いて本発明のＭＡＰ抗体を生成するのに使用可能である。
【００２１】
当業者によって認識されるように、本発明の抗体はまた、ブドウ球菌属細菌によって引き起こされる感染を処置または予防するためのヒトまたは動物患者への投与のための適切な薬学的組成物中へ形成され得る。本発明の抗体（またはその有効フラグメント）を含む薬学的組成物は、当該分野において一般的に使用され得る適切な薬学的ビヒクル、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）または担体（生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、他の治療化合物、およびそれらの組み合わせなどを含む）と共に処方され得る。当業者が認識するように、使用される特定のビヒクル、賦形剤または担体は、患者および患者の状態に依存して異なり、また当業者によって認識されるように、種々の投与形態が本発明の組成物に適する。本出願に開示される任意の薬学的組成物の投与の適切な方法としては、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内および皮内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
局所投与のために、該組成物は、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、滴剤（点眼剤および点耳剤のような）、または液剤（マウスウォッシュのような）の形態で処方される。創傷または外科用包帯、縫合糸およびエアロゾルは、この組成物で含浸され得る。この組成物は、慣用的な添加剤（保存剤、浸透を促進させるための溶媒、皮膚緩和薬（ｅｍｏｌｌｉｅｎｔｓ）のような）を含み得る。局所製剤はまた、慣用的な担体（クリームまたは軟膏基剤、エタノール、あるいはオレイルアルコールのような）を含み得る。
【００２３】
抗体組成物のさらなる形態、および組成物に関する他の情報、他のＭＳＣＲＡＭＭ^ＴＭｓに関する情報についての方法および適用はまた、ＭＡＰ　ＭＳＣＲＡＭＭ^ＴＭに対する抗体を含む本発明にも応用され、また例えば米国特許第６，２８８，２１４（Ｈｏｏｋら）（本明細書中で参考として援用される）に開示される。
【００２４】
ＭＡＰタンパク質またはそのサブドメイン（Ｍａｐ１０のような）に対して生成される本発明の抗体組成物はまた、この複合体に対する免疫原性応答を促進するのに有効な量の適切なアジュバントを用いて投与され得る。例えば、適切なアジュバントとしては、ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）（これは、ヒトにおいて広く使用される）、および他のアジュバント（サポニンおよびその精製成分Ｑｕｉｌ　Ａ、フロイント完全アジュバント、および研究および獣医学の適用において使用される他のアジュバントのような）が挙げられ得る。さらに他の化学的に定義される調製物（ムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質Ａ、リン脂質複合体（Ｇｏｏｄｍａｎ−Ｓｎｉｔｋｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０−４１５（１９９１）によって記載され且つ本明細書中で参考として援用されるもののような）、プロテオリポソーム内での複合体のカプセル化（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１７６：１７３９−１７４４　（１９９２）によって記載され且つ本明細書中で参考として援用されるような）、および脂質小胞（Ｎｏｖａｓｏｍｅ^ＴＭ脂質小胞（Ｍｉｃｒｏ　Ｖｅｓｃｕｌａｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｓｈｕａ，ＮＨ）のような）におけるタンパク質のカプセル化もまた、有用であり得る。
【００２５】
とにかく、本発明の抗体組成物は、このように、ブドウ球菌細菌と宿主細胞上のＭＡＰタンパク質との間の結合相互作用を妨げ、調節し、阻害するために、あるいは宿主細胞上のＭＡＰへ結合されるようになるブドウ球菌細菌を追放することにおいて、有用であろう。従って、本発明は、ブドウ球菌感染を予防または処置する組成物および方法を開発することにおいて、ならびにブドウ球菌細菌の真核細胞への結合を阻害することにおいて、特別な適用を有するであろう。
【００２６】
本発明に従って、ブドウ球菌感染を予防または処置するための方法（これは、この感染を処置または予防するために有効な量で、上記のようなＭＡＰタンパク質またはＭａｐ１０タンパク質に対する有効量の抗体を投与することを包含する）が提供される。上にも示したように、本発明に従うＭａｐ１０抗体は、細菌の接着を防ぐことだけでなく、生物の殺傷の増大および宿主からの感染の迅速な除去を導くオプソニン食作用活性を増大させることも観察されてきたという点において、二重に効果的である。従って、本発明に従って、上記の慣用的な方法（例えば、局所、非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、筋肉内など）のいずれかにおける本発明の抗体の投与は、ヒトまたは動物患者におけるブドウ球菌感染を処置または予防する特に有用な方法を提供するであろう。有効量によって、細菌の接着を防ぐのに（宿主細胞へのブドウ球菌細菌の結合を阻害するのに）十分な抗体力価（ｔｉｔｅｒ）のレベルが、あるいは事前の感染（ｐｒｉｏｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の場合、感染を処置するためにオプソニン食作用殺傷を促進し且つ細菌の宿主細胞からの除去を促進するのに十分であろう量が意味される。当業者によって認識されるように、ブドウ球菌感染を処置または予防するのに効果的であるために必要とされる抗体力価のレベルは、患者の性質（ｎａｔｕｒｅ）および状態、および／または予め存在する（ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ）ブドウ球菌感染の重大度（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）に依存して異なるであろう。
上記のようなＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を処置または予防するための方法におけるＭＡＰタンパク質への抗体の使用に加え、本発明は、患者においてか、または感染されるかも知れない医療器具において、ブドウ球菌感染を診断するためのＳ．ａｕｒｅｕｓの存在の検出を含む様々な方法におけるこれらの抗体の使用を企図する。本発明に従って、ブドウ球菌感染の存在を検出する好ましい方法は、１つ以上のブドウ球菌細菌種または株によって感染された疑いのあるサンプル（個体から（例えば、個体の血液、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨または皮膚から）採取されたサンプルのような）を得る工程を包含する。次いで、この細胞は溶解され、そしてそのＤＮＡが抽出され、沈殿され、さらに増幅され得る。このサンプルの単離後、本発明のＭａｐ１０抗体を利用する診断アッセイが行われ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在を検出し得、そしてサンプル中のこのような存在を決定するためのこのようなアッセイ技術は、当業者に公知であり、且つラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイのような方法を含む。概して、本発明に従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染を診断する方法が企図され、ここでＳ．ａｕｒｅｕｓ感染に感染していると疑われているサンプルが本発明に従うＭＡＰタンパク質抗体へ添加され、またＳ．ａｕｒｅｕｓがそのサンプル中のＭＡＰタンパク質に結合する抗体によって表示される。
【００２７】
従って、本発明に従う抗体は、ブドウ球菌ｍａｐタンパク質の特異的検出のために、ブドウ球菌細菌からの感染の予防のために、進行中の感染症の処置のために、または研究道具としての使用のために、使用され得る。本明細書中において使用されるような用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」としては、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、二重特異性、サル化（ｓｉｍｉａｎｉｚｅｄ）、およびヒト化または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、ならびにＦａｂフラグメント（ＭＡＰまたはＭａｐ１０タンパク質に対するその抗体の結合特異性を維持するそれらのフラグメント（Ｆａｂイムノグロブリン発現ライブラリーの産物を含む）のような）が挙げられる。これらの型の抗体または抗体フラグメントのいずれの生成も当業者に周知である。本発明の場合、ＭＡＰタンパク質に対するモノクローナル抗体は、生成および単離され、そしてブドウ球菌感染に対して保護することが示された。
【００２８】
上記抗体のいずれも、ブドウ球菌細菌の同定および定量化のための検出可能な標識を用いて直接的に標識され得る。イムノアッセイにおける使用のための標識は、一般的に当業者に公知であり、そして酵素、放射性同位体、ならびに蛍光、発光、および発色物質（コロイダルゴールドおよびラテックスビーズのような着色粒子を含む）を含む。適切なイムノアッセイとしては、酵素−結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００２９】
あるいは、この抗体は、イムノグロブリンに対する親和性を有する標識物質との反応によって間接的に標識され得る。この抗体は、二次物質と複合体化され、そして抗体に複合体化される二次物質に対する親和性を有する標識三次物質を用いて検出され得る。例えば、この抗体はビオチンへ複合体化され、そしてその抗体−ビオチン複合体は、標識アビジンまたはストレプトアビジンを用いて検出され得る。同様に、この抗体は、ハプテンへ複合体化され、そしてこの抗体−ハプテン複合体は、標識抗−ハプテン抗体を用いて検出され得る。抗体およびアッセイ複合体を標識化するこれらおよび他の方法が当業者に周知である。
【００３０】
ＭＡＰタンパク質に対する抗体はまた、製造施設または研究室において使用され、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによりさらなる量のタンパク質を単離し得る。例えば、本発明の抗体はまた、さらなる量のＭＡＰタンパク質を単離するために利用され得る。
【００３１】
本発明の単離抗体、またはその活性フラグメントはまた、ブドウ球菌感染に対する受動免疫のためのワクチンの開発において利用され得る。さらに、薬学的組成物として創傷に投与されるか、あるいは医療用デバイスまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏにおける重合性生体材料をコーティングするために使用される場合、本発明の抗体は、細菌のオプソニン食作用性殺傷を増強するこの抗体の能力ゆえに、ブドウ球菌感染が既に存在するこれらの場合において有用である。さらに、この抗体は必要に応じて改変され得、そのため、ある場合において、それが投与される患者においてより低い免疫原性である。例えば、もし患者がヒトであるならば、抗体は、ハイブリドーマ−由来抗体の相補的決定領域をヒトモノクローナル抗体へ移植する（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）ことによって「ヒト化」され得る（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）またはＴｅｍｐｅｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：２６６−２７３（１９９１）によって記載される）。
【００３２】
本明細書中に記載される抗体、タンパク質または活性フラグメントでコーティングされるであろう医療デバイスまたは重合性生体材料としては、ステープル（ｓｔａｐｌｅ）、縫合糸、代替心臓弁（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｈｅａｒｔ　ｖａｌｖｅｓ）、心臓補助装置（ｃａｒｄｉａｃ　ａｓｓｉｓｔ　ｄｅｖｉｃｅ）、ハードおよびソフトコンタクトレンズ、眼内レンズインプラント（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ　ｌｅｎｓ　ｉｍｐｌａｎｔ）（前眼房または後眼房）、角膜インレー（ｃｏｒｎｅａｌ　ｉｎｌａｙｓ）、角膜−プロテーゼ（ｋｅｒａｔｏ−ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ）、血管ステント（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｓｔｅｎｔｓ）、エピケラトファリア（ｅｐｉｋｅｒａｔｏｐｈａｌｉａ）デバイス、緑内障シャント（ｇｌｕｃｏｍａ　ｓｈｕｎｔｓ）、網膜ステープル（ｒｅｔｉｎａｌ　ｓｔａｐｌｅｓ）、強膜バックル（ｓｃｌｅｒａｌ　ｂｕｃｋｌｅｓ）、歯科プロテーゼ、甲状軟骨形成術用デバイス、喉頭形成術用（ｔｈｙｒｏｐｌａｓｔｉｃ）デバイス、血管移植片、軟部および硬部組織プロテアーゼ（ポンプを含むがこれに限定されない）、電気デバイス（刺激器および記録器を含む）、聴覚プロテーゼ、ペースメーカー、人工喉頭、歯科インプラント、乳房インプラント、陰茎インプラント、頭蓋／顔面の腱（ｃｒａｎｉｏ／ｆａｃｉａｌ　ｔｅｎｄｏｎｓ）、人工関節、腱、靱帯、半月および盤（ｄｉｓｃｓ）、人工骨、人工臓器（人工膵臓、人工心臓、人工四肢、および心臓弁；ステント、ワイヤー、ガイドワイヤー、静脈内および中心静脈カテーテル、レーザーおよびバルーン血管形成術用デバイス、血管および心臓デバイス（チューブ、カテーテル、バルーン）、心室補助材、血液透析コンポーネント、血液酸素供給器、尿道／尿管／泌尿器デバイス（フォーリーカテーテル、ステント、チューブおよびバルーン）、気道カテーテル（気管内および気管開口チューブおよびカフ）、経腸栄養チューブ（経鼻胃、胃内および空腸チューブを含む）、創傷ドレーナッジチューブ（体腔（胸膜、腹膜、頭蓋、および心膜の腔のような）を除液する（ｄｒａｉｎ）ために使用されるチューブ）、血液バッグ、試験管、血液採取管、ヴァキュテーナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒｓ）、シリンジ、ニードル、ピペット、ピペットチップ、および血液チュービングが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「コーティングされた」または「コーティング」が、抗体または活性フラグメント、またはそれに由来する薬学的組成物をデバイスの表面（好ましくはブドウ球菌細菌感染に曝される外表面）へ塗布することを意味することは、当業者によって理解されるであろう。デバイスの表面は、このタンパク質、抗体または活性フラグメントによって完全に覆われなくてもよい。
【００３４】
好ましい実施形態において、抗体はまた、ブドウ球菌感染を処置または予防するのに適切な抗体を提供する際に有用であろう受動ワクチンとして使用され得る。当業者によって認識されるように、数多くの適切な方法（例えば、非経口（すなわち筋肉内、皮内または皮下）投与または鼻咽頭（すなわち鼻腔内）投与による）における投与のためにパッケージ化され得る。１つのこのような形態では、ワクチンが筋肉内的に（例えば、三角筋へ）注射されるが、しかしながら投与の特定の形態は、取り扱われる細菌感染の性質および患者の状態に依存する。ワクチンは、好ましくは、投与を促進するための薬学的に許容される担体と組み合わせられ、そしてこの担体は通常、保存剤を含むまたは含まない水または緩衝生理食塩水である。このワクチンは、投与時の再懸濁に適するよう凍結乾燥され得、または溶液であり得る。
【００３５】
本発明に従う抗体組成物の投与のための好ましい用量は、ブドウ球菌感染を予防するまたは処置するのに有効であろう量であり、そしてこの量が感染の性質および患者の状態に依存して非常に大きく変化するであろうことは容易に認識される。上記に示すように、本発明に従って使用される抗体または薬剤の「有効量」は、所望の予防または治療効果をもたらすような、薬剤の無害であるが十分な量を意味することを意図される。以下に指摘するであろうように、必要とされる抗体または特定の剤の正確な量は、被験体の種、年齢および全体的な状態、処置される状態の重篤度、使用される特定の担体またはアジュバントおよびその投与形態などに依存して、被験体ごとに異なる。従って、任意の特定の抗体組成物の「有効量」は、特定の環境に基づいて異なり、そして適切な有効量は、適用の各々の場合において、日常的に行われる実験のみを用いて当業者により決定され得る。その用量は、組成物が投与される個体に合わせて調整されるべきであり、また年齢、体重、および個体の代謝に伴って変化する。この組成物はさらに、（チメロサール（エチル（２−メルカプトベンゾエート−Ｓ）水銀ナトリウム塩）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）のような薬学的に許容される保存剤または安定化剤を含み得る。
【００３６】
適切な標識または他のふさわしい検出可能な生体分子または化学物質と共に使用される場合、本明細書中において記載されるモノクローナル抗体は、ブドウ球菌感染のｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断あるいはブドウ球菌属細菌の検出のような目的のために有用である。研究所の研究もまた、このような抗体の使用を通じて促進され得る。以下に示されるもののように、様々な型の標識およびこの標識を本発明の抗体へ複合体化させる方法は、当業者に周知である。
【００３７】
例えば、抗体は、^３２Ｐ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ，または^１３１Ｉ（これらに制限されない）のような放射性標識へ複合体化され得る。標識の検出は、シンチレーション計数、ガンマ線分光測定、またはオートラジオグラフィーのような方法によるものであり得る。生物発光標識（ホタルルシフェリンの誘導体ような）もまた、有用である。この生物発光物質は、従来法によってタンパク質へ共有結合され、そしてこの標識タンパク質は、酵素（ルシフェラーゼのような）が、生体発光分子に光の光子を放出させるＡＴＰを用いる反応を触媒する際に、検出される。発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｓ）の例としては、フルオレセインおよび誘導体、フィコエリトリン、アロ−フィコシアニン、フィコシアニン、ローダミン、およびＴｅｘａｓ　Ｒｅｄが挙げられる。発蛍光団は一般的に、蛍光検出器によって検出される。
【００３８】
細胞におけるリガンドの位置は、上記のように抗体を標識すること、および当業者に周知の方法（Ｗａｒｒｅｎ　ａｎｄ　Ｎｅｌｓｏｎ（Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ，　７：　１３２６−１３３７，　１９８７）によって記載されるような方法を用いる免疫蛍光顕微鏡法のような）に従って標識を検出することによって、決定され得る。
【００３９】
上に示されるように、本発明のモノクローナル抗体、あるいはその活性部分またはフラグメントは、哺乳類動物細胞外マトリックスタンパク質（ＭＡＰタンパク質のような）への細菌の接着のような感染の原因となるブドウ球菌病原体と哺乳類動物宿主との間の最初の物理的相互作用を妨害するために特に有用であり、そしてこの物理的相互作用の妨害は、患者を処置すること、および内在する医療デバイスへの細菌感染を予防および減少させ、それらを使用により安全にすることの両方において有用であり得る。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、単一容器内に凍結乾燥され、後にブドウ球菌細菌を含むと疑われる水性サンプルの添加によって活性になるような適切な形態で本発明の抗体を含む、ブドウ球菌属細菌および感染を単離および同定することにおいて有用であり得るキットが提供される。このようなキットは代表的に、本発明のＭＡＰ抗体へ結合する複合体の同定を可能にするであろう適切な免疫検出試薬と共に適切な形態において抗体を収容するための適切な容器を含み得る。例えば、免疫検出試薬は、ビオチンまたは検出可能な色を生成する酵素などのような、通常抗体へ結合され得るか、またはその抗体が抗原へ結合する際に検出可能な結果をもたらすような別の方法において利用され得る適切な検出可能なシグナルまたは標識を含み得る。
【００４１】
簡単には、ＭＡＰタンパク質またはその活性フラグメントに結合する本発明の抗体は、このように、ヒトおよび動物患者におけるブドウ球菌感染を処置または予防することにおいて、ならびに医療用または他の内在デバイスにおいて格別に有用である。従って、本発明は、ＭＡＰタンパク質へ結合し得且つ細菌のオプソニン食作用性殺傷を伴うブドウ球菌感染の処置の方法において使用され得る抗体を同定するおよび単離する方法に関する。Ｍａｐタンパク質を結合し得、そしてブドウ球菌感染を予防または処置し得るＭＡＰ抗体のような、本発明の方法を用いて同定および／または単離される抗体はそれゆえ、本発明の一部である。
【００４２】
【実施例】
本発明の好ましい実施態様の局面を例示する以下の実施例が提供される。当業者らは以下の実施例に開示される当該技術が、本発明の実施において有効に機能するように本発明者らによって発見された技術であり、またそれゆえに、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられることを理解すべきである。しかしながら、本開示に鑑み、当業者は開示される特定の態様において多くの改変がなされ得ることを理解すべきであり、そしてまた本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様もしくは類似の結果を得る。
【００４３】
実施例１． ＭＡＰタンパク質およびＤＮＡの単離ならびにシーケンシング
ＰＣＲを使用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＦＤＡ５７４のゲノムＤＮＡからｍａｐの第一サブドメインを増幅し、そして６個のヒスチジン残基を含む組換え融合タンパク質の発現を可能にするＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターＰＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）のサブクローニングを行った。その後、このベクターをＥ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ　５５１５１中に形質転換し、１５−リットル発酵槽中で光学密度（ＯＤ_６００）０．７まで増殖させ、そして０．２ｍＭのイソプロピル−１−ベータ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）と共に４時間誘導した。ＡＧテクノロジーズ中空糸アッセンブリー（ＡＧ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｈｏｌｌｏｗ−ｆｉｂｅｒ　ａｓｓｅｍｂｌｙ）（孔サイズ０．４５μｍ）を使用して細胞を回収し、そしてこの細胞ペーストを−８０℃で凍結した。Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓ＠１１００ｐｓｉによる２回の通過を使用して、細胞を１×ＰＢＳ（１０ｍＬの緩衝液／１ｇの細胞ペースト）中で溶解した。溶解させた細胞を１７，０００ｒｐｍで３０分間スピンダウンし、細胞片を除いた。０．１Ｍ　ＮｉＣｌ_２で荷電した５−ｍＬ　ＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に、上清を通した。負荷後、５カラム容量の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ　ＮａＣｌ（Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ）を用いて、このカラムを洗浄した。３０カラム容量以上の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２００ｍＭ　イミダゾール（Ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ）の０−１００％グラディエントを使用して、タンパク質を溶出した。Ｍａｐ１０は〜１３％Ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ（〜２６ｍＭイミダゾール）にて溶出した。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。Ｍａｐ１０を含む画分を１×ＰＢＳ中で透析した。
【００４４】
その後、このタンパク質をエンドトキシン除去プロトコールにかけた。このプロトコールの間使用された緩衝液は、５−ｍＬ　Ｍｏｎｏ−Ｑ　セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上を通過させることによって、エンドトキシンフリーにされた。タンパク質を４×１５ｍＬ管の間で均等に分けた。ＢｕｆｆｅｒＡを用いて、それぞれの管の容量を９ｍＬにした。１ｍＬの１０％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４をそれぞれの管に加え、４℃で１時間、回転させながらインキュベーションした。相を分離するため、管を３７℃の水浴中に置いた。管を２，０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンし、そしてそれぞれの管の上部水相を回収し、さらに界面活性剤抽出を繰り返した。二度目の溶出からの水相を混合し、そして残留する界面活性剤を除くために、０．１Ｍ　ＮｉＣｌ_２で荷電した５−ｍＬ　ＩＤＡ　ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ）カラム上を通過させた。３カラム容量のＢｕｆｆｅｒ　Ｂでこのタンパク質を溶出する前に、このカラムを９カラム容量のＢｕｆｆｅｒ　Ａで洗浄した。この溶出物は、５−ｍＬ　Ｄｅｔｏｘｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）カラム上を通され、そしてその通過液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収し、そしてカラムに再アプライ（ｒｅａｐｐｌｙ）した。二度目の通過からの通過液を回収し、１×ＰＢＳ中で透析した。マウスに投与する前に、この精製産物を濃度、純度、およびエンドトキシンレベルについて分析した。
Ｍａｐ１０　ＤＮＡ配列（６×Ｈｉｓ融合を含む）（配列番号：１）：
【００４５】
【化１】

【００４６】
アミノ酸配列（配列番号：２）：
【００４７】
【化２】

【００４８】
実施例２．ＭＡＰモノクローナル抗体の生産および単離
この精製されたＭａｐ１０タンパク質を使用し、マウスモノクローナル抗体のパネル（ｐａｎｅｌ）を生成した。簡潔には、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの群に、溶液中または以下に示すアジュバンドと混合される１３５μｇのＭａｐ．１０タンパク質の一連の皮下免疫を行った：
【００４９】
【化３】

【００５０】
最終ブーストの三日後、その脾臓を除き、細かく切って（ｔｅａｓｅｄ）単一細胞懸濁液にし、そしてそのリンパ球を回収した。その後、そのリンパ球をＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ＃１５８１）へ融合した。細胞融合、続くプレーティングおよび栄養補給（ｆｅｅｄｉｎｇ）は、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（Ｃｈａｐｔｅｒ２，Ｕｎｉｔ２．）からのｔｈｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って行った。
【００５１】
その後、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、この融合から生成された全てのクローンを特異的抗―Ｍａｐ．１０抗体産生についてスクリーンした。陽性のクローンを拡大し（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、さらに試験した。当初は１０個の陽性クローンを同定したが、結局４個が死滅し、限界希釈によって最終的に単一細胞クローン化された６個のみを残した。単一細胞クローンを活性について試験し、そしてもとの６クローンのうち４クローンのみが抗―Ｍａｐ．１０抗体を生産する単一細胞クローンを産生した。
【００５２】
抗体のスケールアップおよび精製
ハイブリドーマ細胞を、ＲＰＭＩ／ＤＭＥＭ（２−３リットル培養容量に対し２ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ　Ｌ−グルタミンおよび２×ペニシリン−ストレプトマイシンを含む１×Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ培地）中で増殖した。その後、ハイブリドーマ上清を遠心分離によって回収した。この上清を０．４５μＭフィルターを介して濾過し、そしてプロテインＧクロマトグラフィーを用いて、このＩｇＧをアフィニティ精製した。０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７を使用してこのモノクローナル抗体を溶出し、直ちに１０分の１容量の２Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和した。次いでこの精製ＩｇＧを、１×Ｄ−リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４に対して透析した。必要であれば、この精製抗体を濃縮し、アリコートを凍結した。
【００５３】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．ａｕｒｅｕｓ株
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞は凍結グリセロールストックから取られ、そして一枚の血液寒天プレート上に植え付けられ、そして２４時間、３７℃で増殖させた。その後、単独コロニーを選択し、そして新たな血液寒天プレート上に植え付けた。これを最終凍結ストックの２０ｍｌ毎に約３０プレートについて繰り返した。その後、このプレートを２４時間、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション後、この細菌をスクレイパー（ｓｃｒａｐｅｒ）から取り除くために穏やかにボルテックスしながら、このコロニーを各プレートの表面から５０ｍｌ管（１０ｍｌの１×ＰＢＳを含む）へ掻き取った（１０ｍｌのＰＢＳあたり２０−３０プレート）。次いで、細菌からの全ての寒天片の分離を容易にするため勢いよくボルテックスしながら、さらなる１０ｍｌの１×ＰＢＳを１０ｍｌの細菌懸濁液に加えた。この懸濁液を１０分間、３５００×ｇ、４℃で遠心分離することによって、ペレット化した。この細菌をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、そして所望容量の培地に再び懸濁した。この細菌ストックは、エタノール／ドライバス（ｅｔｈａｎｏｌ／ｄｒｙ　ｂａｔｈ）中で急速凍結することによって１ｍｌのアリコート中に入れられ、そして−８０℃の冷凍庫中に置いた。凍結ストックのＣＦＵ／ｍｌ濃度は、ストックの１ｍｌを解凍し、１０分間、３５００×ｇ、４℃で遠心分離し、管から上清をデカントし（ｄｅｃａｎｔｉｎｇ）、そしてペレットを１ｍｌの１×ＰＢＳに再び懸濁することによって決定された。先の１００μｌの希釈液および９００μｌの１×ＰＢＳを使用して１０^−１から１０^−８までの一連の希釈液を作成し、５０μｌの１０^−４から１０^−８の希釈液を、血液寒天プレート上に二重に（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）プレーティングし、そして３７℃で１６−１８時間インキュベーションした。１０^−１から１０^−２についての６００ｎｍにおける吸光度を測定および記録した。平均ＣＦＵ／ｍｌを決定するため、各希釈液についてＣＦＵ／ｍｌを決定し（ＣＦＵ／ｍｌ＝（平均＃コロニー×希釈ファクター）／０．００５ｍｌｓ）、そして平均した。注射の日に、２つの１ｍｌアリコートを解凍し、一つの管に混合し、そしてボルテックスした。注射後、１０^−５、１０^−６および１０^−７希釈のサンプル調製物を血液寒天プレート上にプレーティングし、注射したＣＦＵ／ｍｌを決定した。注射した細菌の量は２．２×１０^８ＣＦＵ／ｍｌ　Ｓ．ａｕｒｅｕｓ　Ｂａｒｎｅｔｔであった。
【００５４】
動物、性別、種、数、年齢および供給源
Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓ　ａｎｄ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）より雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（５−６週齢）を購入した。動物は、処理開始前に少なくとも１４日間の間、順応させた。到着してすぐに、マウスは検診され、吸湿性のある敷きわらを敷いたポリカーボネート靴箱型ケージ中でグループ飼育した（５／ケージ）。全てのマウスは、ｔｈｅ　ＮＩＨ　Ｇｕｉｄｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓに示される必要な管理基準の下、１２時間の明暗周期に置かれた。
【００５５】
同定および無作為化
全ての動物は、投与前に尾の入れ墨を使用することによって、独自に同定された。処理の開始前に、動物は個別に体重測定され、そしてそれらの健康状態が評価された。マウスを無作為化し、そして等級別に分けた体重を用いて処理群に割り当てた。
【００５６】
ＭＡＰ特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）、アイソタイプ：
Ｈ０１　ＭＡＰ．１０　Ｍａｂ，ＩｇＧ_１
Ｈ０４　ＭＡＰ．１０　Ｍａｂ，ＩｇＧ_１
Ｈ０７　ＭＡＰ．１０　Ｍａｂ，ＩｇＧ_１
Ｈ１０　ＭＡＰ．１０　Ｍａｂ，ＩｇＧ_１
【００５７】
コントロール
コントロールは、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．（Ｃａｔ．Ｎｏ．１００１０−０２３；Ｌｏｔ　Ｎｏ．１０７８７４９）より購入したリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）であった。
本実験のための実験計画は以下に示すとおりである：
実験計画
【００５８】
【表１】

【００５９】
データ
０．５ｍｇのモノクローナルＨ０１、Ｈ０４、Ｈ０７、Ｈ１０またはＰＢＳを用いる腹腔内（ＩＰ；０．５ｍｌ）注射により、マウスを処理した。ＩｇＧ投与後１８時間、そのマウスにＳ．ａｕｒｅｕｓ株Ｂａｒｎｅｔｔを単一静脈注射でチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）した。その後、このマウスを７日間飼育し（Ｆｉｇ．１）、そして各群におけるマウスの生存データを、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘとして知られるログランク（ｌｏｇｒａｎｋ）テストによって解析した。この結果は表２に要約される。
【００６０】
【表２】

【００６１】
モノクローナルＨ０７はマウス菌血症モデルにおいて最も高い防御効果を示した。モノクローナルＨ０１は全く効果を示さなかったが、モノクローナルＨ０４およびＨ１０はコントロールに比べて有意な防御を引き起こした（しかし、Ｈ０７と比較すると幾分効果が低かった）。ここに示される結果は、ＭＡＰに対するモノクローナル抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓ感染に対して防御することを明白に表した。
【００６２】
実施例３．いくつかのＳ．ａｕｒｅｕｓ株に対するＭａｂ　Ｈ０７およびＭａｂ１０の比較
抗体のスケールアップおよび精製
ハイブリドーマ細胞をＲＰＭＩ／ＤＭＥＭ（２−３リットルの培養容量に対し、２ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ　Ｌ−グルタミンおよび２×ペニシリン−ストレプトマイシンを含む１×Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ培地）中で増殖した。その後、ハイブリドーマ上清を遠心分離によって回収した。この上清を０．４５μＭフィルターを介して濾過し、そしてプロテインＧクロマトグラフィーを用いて、アフィニティ精製した。０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７を使用してこのモノクローナル抗体を溶出し、そして直ちに１０分の１容量の２ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０によって中和した。次いでこの精製ＩｇＧを、１×Ｄ−リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４に対して透析した。必要であれば、この精製抗体を濃縮し、アリコートを凍結した。
【００６３】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．ａｕｒｅｕｓ
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞は凍結グリセロールストックから取られ、一枚の血液寒天プレート上に植え付けられ、そして２４時間、３７℃で増殖させた。その後、単独コロニーを選択し、そして新たな血液寒天プレート上に植え付けた。これを最終凍結ストックの２０ｍｌ毎に、約３０プレートについて繰り返した。その後、このプレートを２４時間、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション後、この細菌をスクレイパー（ｓｃｒａｐｅｒ）から取り除くために穏やかにボルテックスしながら、このコロニーを各プレートの表面から５０ｍｌ管（１０ｍｌの１×ＰＢＳを含む）へ掻き取った（１０ｍｌのＰＢＳ当たり２０−３０プレート）。次いで、細菌からの全ての寒天片の分離を容易にするため勢いよくボルテックスしながら、さらなる１０ｍｌの１×ＰＢＳを１０ｍｌの細菌懸濁液に加えた。この懸濁液を１０分間、３５００×ｇ、４℃で遠心分離することによって、ペレット化した。この細菌をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、所望容量の培地に再び懸濁した。細菌ストックは、エタノール／ドライバス（ｅｔｈａｎｏｌ／ｄｒｙ　ｂａｔｈ）中で急速凍結することによって１ｍｌアリコート中に入れられ、−８０℃の冷凍庫中に置いた。凍結したストックのＣＦＵ／ｍｌ濃度は、ストックの１ｍｌを解凍し、１０分間、３５００×ｇ、４℃で遠心分離し、管から上清をデカントし、そしてペレットを１ｍｌの１×ＰＢＳに再び懸濁することによって決定された。先の１００μｌの希釈液および９００μｌの１×ＰＢＳを使用して１０^−１から１０^−８までの一連の希釈液を作成し、５０μｌの１０^−４から１０^−８の希釈液を二重で血液寒天プレート上にプレーティングし、そして３７℃で１６−１８時間インキュベーションした。１０^−１から１０^−２についての６００ｎｍにおける吸光度を測定および記録した。平均ＣＦＵ／ｍｌを決定するため、各希釈液についてのＣＦＵ／ｍｌを決定し（ＣＦＵ／ｍｌ＝（平均＃コロニー×希釈ファクター）／０．００５ｍｌｓ）、そして平均した。注射の日に、２つの１ｍｌアリコートを解凍し、一つの管に混合し、ボルテックスした。注射後、１０^−５、１０^−６および１０^−７希釈のサンプル調製物を血液寒天プレート上にプレーティングし、注射したＣＦＵ／ｍｌを決定した。注射した細菌の量は１．４×１０^９ＣＦＵ／ｍｌ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ　Ｂａｒｎｅｔｔ、２．３×１０^８ＣＦＵ／ｍｌ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ　ＡＴＣＣ２５９２３、４．９×１０^７ＣＦＵ／ｍｌ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ　ＡＴＣＣ４９２３０であった。
【００６４】
動物、性別、種、数、年齢および供給源
Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓ　ａｎｄ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）より雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（５−６週齢）を購入した。動物は、処理の開始前に少なくとも１４日間の間、順応させた。到着してすぐに、マウスは検診され、吸湿性のある敷きわらを敷いたポリカーボネート靴箱型ケージ中でグループ飼育した（５／ケージ）。全てのマウスは、Ｔｈｅ　ＮＩＨ　Ｇｕｉｄｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓに示される、必要な管理基準の下、１２時間の明暗周期に置かれた。
【００６５】
同定および無作為化
全ての動物は、投与前に尾の入れ墨を使用することによって、独自に同定された。処理開始前に、動物は個別に体重測定され、そしてそれらの健康状態が評価された。マウスを無作為化し、そして等級別に分けた体重を用いて処理群に割り当てた。
【００６６】
ＭＡＰ特異的Ｍａｂ
Ｈ０７ＭＡＰ．１０Ｍａｂ
Ｈ１０ＭＡＰ．１０Ｍａｂ
【００６７】
コントロール
コントロールには、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．（Ｃａｔ．Ｎｏ．１００１０−０２３；Ｌｏｔ　Ｎｏ．１０７８７４９）より購入したリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）であった。
本実験のための実験計画は以下に示すとおりである：
実験計画
【００６８】
【表３】

【００６９】
データ
０．５ｍｇのモノクローナルＨ０７、Ｈ１０またはＰＢＳを用いる腹腔内（ＩＰ；０．５ｍｌ）注射により、マウスを処理した。ＩｇＧ投与後１８時間、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株Ｂａｒｎｅｔｔを単一静脈（ＩＶ）注射でチャレンジした。その後、このマウスを７日間飼育し、そして各群のマウスの生存データをＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘとして知られるログランク（ｌｏｇｒａｎｋ）テストによって解析した。この結果は表４に要約される。
【００７０】
【表４】

【００７１】
これらのデータは、Ｍａｐ．１０のモノクローナル抗体，Ｈ０７およびＨ１０の単一注入が、当該ｉｎ　ｖｉｖｏモデルにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓの多様な菌株に対して、菌血症媒介死を有意に防ぐことを明確に表している。この結果は、図２、３および４に示される。
【００７２】
実施例４．可変領域配列の単離および配列決定
Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　２．０　キット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５００）を使用して、Ｍａｐ　Ｈ０７ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーＲＮＡを単離した。簡潔には、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１０培地中で培養した１．４×１０^８ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離によってペレット化した（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）後、Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮａｓｅ　Ｄｅｇｒａｄｅｒを含む界面活性剤中に溶解させた。オリゴ−ｄＴセルロース上でのアフィニティ精製によって、ＰｏｌｙＡ^＋　ｍＲＮＡを単離した。第一鎖（ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成は、ｍＲＮＡ（５μｇ）、各可変重鎖および可変軽鎖に対する２０ｐｍｏｌの３’オリゴヌクレオチド・マウス−特異的プライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｃａｔ．Ｎｏｓ．６９７９６および６９８１２）を含む、ｃＤＮＡ合成キット（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｃａｔ．Ｎｏ．６９００１−３）中の逆転写酵素を使用することによって達成された。ＰＣＲ　Ｒｅｇｅｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１０１９８−０１８）ならびにマウス可変重鎖および軽鎖特異的プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｃａｔ．Ｎｏ．７００８１−３、各５ｐｍｏｌ）を使用する３０サイクル（９４Ｃ　ホットスタートの後、９４Ｃ１分間、５０Ｃ１分間、７２Ｃ１分間サイクル）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡの一部（５から５０ｎｇ）を増幅した。ＰＣＲ産物を酢酸ナトリウム緩衝液中の１％超純粋アガロースゲル中で電気泳動的に分別し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。予想されたサイズに適合するＰＣＲ断片をそのゲルから切り出し、そしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドへのライゲーションのためにＢＩＯ　１０１　Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンカラム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０１−４００）を使用して精製し、続いてコンピテントＴＯＰ１０　Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５００）への形質転換を行った。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２７１０６）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した後、インサートを含む陽性クローンを制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、続いてＭ１３　フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用してＡＢＩ自動シークエンサー上で配列決定した。
【００７３】
配列決定の結果は以下のとおりである：
Ｈ０７ＶＬＧ−２（可変軽鎖配列）（配列番号：３および４）
【００７４】
【化４】

【００７５】
ＣＤＲを示すアミノ酸には下線が引かれる。
Ｈ０７ＶＨＤ−１（可変重鎖配列）（配列番号：５および６）
【００７６】
【化５】

【００７７】
ＣＤＲを示すアミノ酸には下線が引かれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明に従うモノクローナル抗体で注射されたマウスの生存データのグラフ図である。
【図２】
図２は、本発明に従うモノクローナル抗体で注射されたマウスの生存データのグラフ図である。
【図３】
図３は、本発明に従うモノクローナル抗体で注射されたマウスの生存データのグラフ図である。
【図４】
図４は、本発明に従うモノクローナル抗体で注射されたマウスの生存データのグラフ図である。

Claims (29)

1. Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＭａｐ１０タンパク質へ結合する単離抗体。
2. 前記抗体がヒトまたは動物におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を予防する、請求項１に記載の抗体。
3. 前記抗体がブドウ球菌属細菌の真核細胞への結合を阻害する、請求項１に記載の抗体。
4. 前記抗体がヒトまたは動物における非経口、経口、鼻腔内、皮下、エアゾール化または静脈内投与に適する、請求項１に記載の抗体。
5. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
6. 前記モノクローナル抗体がキメラ、ヒト化、およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される型に属する、請求項５に記載の抗体。
7. 前記抗体が単鎖モノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体。
8. Ｓ．ａｕｒｅｕｓ　ＭＡＰタンパク質へ結合する抗体と同一の結合特異性を有する抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の抗体。
9. 配列番号４に記載の可変軽鎖配列を有する、請求項１に記載の抗体。
10. 配列番号３に記載の核酸配列またはその縮重体によってコードされる可変軽鎖配列を有する、請求項１に記載の抗体。
11. 配列番号６に記載の可変重鎖配列を有する、請求項１に記載の抗体。
12. 配列番号５に記載の核酸配列またはその縮重体によってコードされる可変軽鎖配列を有する、請求項１に記載の抗体。
13. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
14. 請求項１に記載の抗体を含む単離抗血清。
15. 請求項１に記載の抗体およびその抗体による結合を検出するための手段を含む診断キット。
16. 前記結合を検出するための手段が前記抗体へ結合された検出可能な標識を含む、請求項１５に記載の診断キット。
17. 請求項１に記載の抗体をＳ．ａｕｒｅｕｓに感染していると疑われるサンプルへ添加すること、および抗体が該サンプルへ結合したか否かを決定することを包含する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を診断する方法。
18. 有効量の請求項１に記載の抗体および薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を処置または予防するための薬学的組成物。
19. ヒトまたは動物患者へ有効量の請求項１に記載の抗体を投与することを包含する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を処置または予防する方法。
20. ヒトまたは動物へ単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓ　Ｍａｐ１０タンパク質を投与することを包含する、免疫学的応答を誘導する方法。
21. 抗−ＭＡＰ抗体を含むと疑われるサンプルへ単離Ｍａｏ１０タンパク質を添加すること、および該抗体が添加されたＭａｐ１０タンパク質へ結合したか否かを決定することを包含する、Ｍａｐ１０タンパク質に対する抗体を同定する方法。
22. Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＭａｐ１０タンパク質へ結合する単離抗体。
23. 配列番号２のアミノ酸配列へ結合する能力を有する、請求項１に記載の単離抗体。
24. 配列番号１の核酸配列またはその縮重体によってコードされるアミノ酸配列へ結合する能力を有する請求項１に記載の単離抗体。
25. 配列番号４に記載の可変軽鎖配列を有する単離抗体。
26. 配列番号６に記載の可変重鎖配列を有する単離抗体。
27. 単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓ　Ｍａｐ１０タンパク質。
28. 配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の単離タンパク質。
29. 配列番号１に記載の核酸配列またはその縮重体によってコードされるアミノ酸配列を有する請求項２７に記載の単離タンパク質。

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