MXPA01002119A

MXPA01002119A - Vacunas multicomponentes.

Info

Publication number: MXPA01002119A
Application number: MXPA01002119A
Authority: MX
Inventors: Joseph M Patti
Original assignee: Inhibitex Inc
Priority date: 1998-08-31
Filing date: 1999-08-31
Publication date: 2003-03-27
Also published as: CA2340304A1; CN1317976A; EP1109577A4; EP1109577B1; KR20010085745A; JP2002523473A; CN1314450C; ATE422368T1; IL141639A; CA2777661C; AU5588999A; JP5460642B2; KR100644953B1; WO2000012131A1; CA2777661A1; EP1109577A1; BR9913340A; DE69940404D1; AU771426B2; JP2011168607A

Abstract

Vacunas multicomponentes son proporcionadas las cuales ayudan en la prevencion y tratamiento de infecciones estafilococales las cuales incluyen ciertas combinaciones seleccionadas de proteinas de enlace bacterial o fragmentos de ellas, o anticuerpos de aquellas proteinas o fragmentos. Por seleccion cuidadosa de las proteinas, fragmentos, o anticuerpos, una vacuna es proporcionada para que confiera proteccion contra un amplio espectro de especies bacteriales estafilococales y contra proteinas que estan expresadas en diferentes etapas de la curva de crecimiento logaritmico. En una modalidad de la invencion, una composicion es proporcionada para que incluya al menos una proteina de enlace colageno o peptido (o un sitio apropiado de secuencia mutante dirigida de ella) tal como CAN, o una proteina o fragmento con suficientemente alta homologia a ella, en combinacion son una proteina de enlace fibrogeno, preferiblemente e! factor Clumping A ("ClfA") o factor Clumping B ("ClfB"), o un fragmento util de ellos o un fragmento de proteina con suficientemente alta homologia de ella. Las vacunas y productos de la presente invencion son ventajosas ya que ellas responden a la urgente necesidad de la comunidad medica para un sustituto de pequenas moleculas antibioticos, las cuales estan perdiendo rapidamente efectividad y proporcionan combinaciones efectivas del largo numero de adhesinas superficiales conocidas las cuales pueden conferir proteccion efectiva contra un amplio espectro de infecciones bacteriales.

Description

VACUNAS MULTICOMPONENTES La presente invención fue hecha en parte del trabajo soportado por la subvención n0. 97-35204-5046 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en ésta invención. La invención pertenece al campo de los productos biológicos para el tratamiento y diagnosis de las infecciones bacteriales.

ANTECEDENTES PE LA INVENCIÓN Los estafilococos son células esféricas gramo-positivas, usualmente dispuestas en conjuntos irregulares tipo racimo de uvas. Algunas son miembros de la flora normal de la piel y membranas mucosas de humanos, otras causan supuración, formación de abcesos, una variedad de infecciones piogénicas, y aún septicema fatal. El estafilococo patogénico algunas veces hemoliza la sangre, plasma coagulado, y produce una variedad de enzimas extracelulares y toxinas. El tipo más común de envenenamiento de la comida es causado por una esterotoxina estafilococo estable al calor. El género estafilococo tiene al menos 30 especies. Las tres especies principales de importancia clínica son estafilococo aureus, estafilococo epidermidis, y estafilococo saprophyticus. El estafilococo aureus es coagulasa-positivo, el cual se diferencia de las otras especies. E. aureus es un patógeno mayor para humanos. Casi cada persona tiene algún tipo de infección de E. aureus durante su tiempo de vida, fluctuando en severidad desde envenenamiento de la comida a infecciones menores de la piel hasta severas infecciones que amenazan la vida. Los estafilococos coagulasa-negativa están en la flora humana normal a la cual algunas veces le causa infección, algunas veces asociado con dispositivos implantados, especialmente en pacientes muy jóvenes, viejos y pacientes ¡nmunocomprometidos. Aproximadamente el 75% de las infecciones causadas por el estafilococo coagulasa-negativa son debidas a E. epidermidis. Las infeciones causadas por el estafilococo warneri, estafilococo hominis, y otras especies son menos comunes. E. saprophyticus es una causa relativamente común de infecciones tracto urinarias en el hombre joven. El estafilococo produce catalasa, los cuales se diferencian del estreptococo. La colonización de E. aureus del cartílago articular, del cual el colágeno es su mayor componente, dentro del espacio de articulación parece ser un factor importante que contribuye al desarrollo de artritis séptica. Los restos de artritis bacterial hematogénicamente adquirida es un problema médico serio. Es rápidamente progresiva y altamente destructiva con la muerte de articulaciones y dificil de erradicar. Típicamente , menos del 50% de pacientes infectados suspenden la recuperación sin serios daños en las articulaciones. E. aureus es el patógeno predominante aislado de los pacientes adultos con hematógenos y osteomielitis secundaria. En pacientes hospitalizados, la bacteria estafilococo tal como E. aureus tiene una causa de infección mayor. Infecciones inicialmente localizadas en heridas o dispositivos médicos inadecuados pueden conducir a infeciones invasivas más serias tal como sepcticemia, osteomielitis, mastitis y endocarditis. En infecciones asociadas con dispositivos médicos, superficies plásticas y metálicas se cubren con un plasma huésped y una matriz de proteinas tal como un fibrinógeno y fibronectina poco después de la implantación. La capacidad de E. aureus y otra bacteria estafilococal para adherirse a esas proteinas es esencial para el inicio de la infección. Trasplantes vasculares, catéteres intravenosos, válvulas artificiales de corazón, y dispositivos de asistencia cardiaca son trombogénicos y propensos a colonización bacterial. La bacteria estafilococal, E. aureus es generalmente el patógeno más dañino de tales infecciones.

Un incremento significativo en E. aureus aislada que exhibe resistencia a la mayoría de los antibióticos corrientemente disponibles para tratar infecciones que han sido observadas en hospitales por todo el mundo. El desarrollo de la penicilina para combatir E. aureus fue el mayor avance en el control y tratamiento de la infección. Desafortunadamente, los organismos resistentes a la penicilina emergieron rápidamente y la necesidad de nuevos antibióticos fue capital. Con la introducción de cada nuevo antibiótico, E. aureus ha sido capaz de contar con ß-lactamasas, proteinas de enlace penicilina alteradas, y proteinas de membrana de célula mutada permitiendo a la bacteria su persistencia. Consecuentemente, El E. aureus resistente a la meticilina (MRSA) y organismos resistentes a multidrogas han emergido y establecido mayores bases en hospitales y clínicas para ancianos o convalescientes alrededor del mundo. (Chambers, H.F., Cün Microbiol Rev, 1 :173, 1988; and Mulligan, M.E., et al., Am J Med, 94:313, 1993). Hoy , al menos la mitad de las especies estafilococales causan infecciones nosocomiales son resistentes a todos los antibióticos excepto la vancomicina, y parece ser solo cuestión de tiempo antes de que la vancomicina sea inefectiva también. Hay una necesidad fuerte y de rápido crecimiento de la terapéutica para tratar las infecciones de estafilococo tal como E. aureus las cuales son efectivas contra las especies resistentes a los antibióticos de la bacteria. El U. S. Instituto Nacional para la Salud de los Estados Unidos ha indicado recientemente que este objetivo es ahora una prioridad nacional. MSCRAMMs La adherencia bacterial a los tejidos huésped ocurre cuando las adhesinas de superficie microbial específica denominadas MSCRAMMs ( Componentes de superficie Microbial de Moléculas de Reconocimiento de Matriz Adhesiva) específicamente reconocen y enlazan a las componentes de matriz extracelular (ECM), tal como fibronectina, fibrinógeno.colágeno, y elastina. Muchas bacterias patógenas han sido mostradas para reconocer específicamente y enlazar a varias componentes de la ECM en una interacción la cual parece representar un mecanismo de colonización de tejido huésped. La adherencia involucra a un grupo de proteinas bacteriales denominadas MSCRAMMs ( Patti, J.,et al., Ann Rev Microbiol, 48;585-617, 1994; Patti, J., and Hook, M., Cur Opin Cell Biol., 6:752-758, 1994). Las MSCRAMMs sobre la superficie celular bacterial y ligandos dentro del tejido huésped interactuan en una manera de llave y cerrojo que resulta en la adherencia de la bacteria al huésped. La adhesión es algunas veces requerida para la sobrevivencia bacterial y ayuda a la bacteria a evadir los mecanismos de defensa del huésped y los desafios antibióticos. Una vez que la bacteria se ha adherido exitosamente y colonizado los tejidos huésped, su fisiología es alterada dramáticamente y componentes dañinas tales como toxinas y enzimas son secretadas. Por otra parte, la bacteria adherente algunas veces produce una biopelícula y rápidamente se resiste al mortal efecto de la mayoría de los antibióticos. Un bacterium puede expresar MSCRAMMs que reconoce una variedad de proteínas de matriz. Sitios de enlace-ligando en MSCRAMMs parecen estar definidos por periodos relativamente cortos y contiguos de (motivos) de secuencias de amino ácidos. Porque un motivo similar se puede encontrar varias especies diferentes de bacterias, ello aparece como si estos motivos funcionales estuvieran sujetos a transferencia de interespecies ( Patti and Hook, Curr Opin Cell Biol, 6: 752-758, 1994). En consecuencia, una sola MSCRAMM puede algunas veces enlazar varios ligandos ECM.

ESTUDIOS DE VACUNACIÓN Históricamente, los estudios sobre adherencia bacterial se han enfocado primeramente sobre bacterias gramo-negativas, las cuales manifientan una amplia variedad de proteinas fimbriales adhesivas (designadas como adhesinas) o su superficie celular ( Falkow, S., Cell, 65:1099-1102, 1991). Estas adhesinas reconocen glicoconjugados específicos expuestos sobre la superficie de las células huésped (particularmente capas epiteliales). Empleando las estructuras tipo-lectina en la adherencia que permite al microorganismo eficientemente colonizar las superficies epiteliales. Esto proporciona a la bacteria un sitio excelente para la replicación y también la oportunidad para diseminarse a los tejidos huésped vecinos. Ha sido demostrado que la inmunización con adhesinas pilus puede provocar protección contra infección microbial, tal como otitis media inducida Hemophilus influenza en un modelo de chinchilla (Sirakova et al., Infecí Immun, 62 (5): 2002-2020, 1994), Moraxella bovis en keratoconjuntivitis bovina infecciosa experimentelmente inducida (Lepper et al., Vet Microbiol, 45(2-3):129-138, 1995), y diarrea inducida E. coli en conejos (McQueen et al., Vaccine, 11 : 201-206, 1993). En la mayoría de los casos, la inmunización con adhesinas lleva a ia producción de anticuerpos inmunes que previenen la infección por inhibición de la colonización y adherencia bacterial, también como mejorar la opsonofagocitosis bacterial y la muerte del complemento mediado del anticuerpo dependiente. El uso de moléculas que median la adhesión de microbios patagónicos para componentes de tejido huésped como vacunas componentes que emergen como un paso importante en el desarrollo de futuras vacunas. Porque la adherencia bacterial es el primer paso crítico en el desarrollo de la mayoría de infecciones, esto es un objetivo atracctivo para el desarrollo de nuevas vacunas. Un entendimiento incrementado de las interacciones entre MSCRAMMs y componentes de tejido huésped al nivel molecular acoplado con las nuevas técnicas en la tecnología de ADN recombinante que ha puesto las bases para una nueva generación de subunidades de vacunas. Dominios específicos o completos de MSCRAMMs, cualquiera de las dos formas nativas o de sitio específicamente alterado, se pueden ahora producir. Además, la capacidad para mezclar y juntar MSCRAMMs de diferentes microorganismos crea la posibilidad de diseñar una sola vacuna que protegerá contra múltiples bacterias. Recientes ensayos clínicos con una nueva subunidad de vacuna contra la tosferina, que consiste de la bordatella pertussis purificada filamentos de MSCRAMMs hemaglutinina y pertactina, que se agrega a una toxina pertussis inactivada, son el primer ejemplo del éxito de este tipo de acercamiento. Varias versiones de la nueva vacuna acelular fueron mostradas como seguras y más eficaces que las viejas vacunas que contenían las células bacteriales completas ( Greco et al., N Eng J Med, 334: 341-348, 1996; Gustaffson et al., N Eng J Med, 334: 349-355, 1996). La inmunidad natural a las infecciones de E. aureus son aún pobremente entendidas. Típicamente, la salud de humanos y animales exhibe un alto grado de resistencia innata a las infecciones de E. aureus. La protección es atribuida a las barreras mucosa e epitelial intacta y a las respuestas humoral y celular normal. Títulos de anticuerpos para las componentes de E. áureas son elevados después de severas infecciones ( Ryding et al., J Med Microbiol; 43(5):328-334, 1995), sin embargo no hubo evidencia serológica a la fecha de una correlación entre títulos de anticuerpo e inmunidad humana. Sobre varias décadas de vida pasada, la muerte por calor, y preparaciones de formalina fijadas de las células de E. aureus se han probado como vacunas para prevenir las infecciones estafilococales. Un ensayo clínico multicentral se diseñó para estudiar los efectos de una vacuna comercial, que consiste de una toxoide estafilococo y una pieza completa de estafilococo, sobre la incidencia de peritonitis, que sale del sitio de infección, y el vehículo nasal E. aureus además de los paciente con diálisis peritoneal continua (Poole- Warren et al., 35: 198-206, 1991). Además la inmunización con la vacuna provocó un incremento en el nivel de anticuerpos específicos para E. aureus, la incidencia de la peritonitis no fue afectada.

Similarmente, la inmunización de conejos con células completas de E. aureus no pudieron prevenir o modificar ninguna etapa en el desarrollo de la endocarditis experimental, reduce la incidencia de abcesos renales, o baja la carga bacterial en riñones infectados ( Greenberg, D.P., et al., Infecí Immun, 55.3030-3034, 1987). Comunmente no hay vacuna aprobada por la FDA para la prevención de infecciones de E. aureus. Sin embargo, una vacuna E. aureus (Staph VAX), basada sobre un polisacárido capsular, está siendo desarrollado comunmente por NABI( North American Bilogicals Inc.). Esta vacuna consiste polisacáridos capsulares conjugados del tipo 5 o tipo 8 para la exotoxina A Pseudomonas aeruginosa (rEPA). La vacuna está diseñada para inducir anticuerpos opsónicos tipo-específico y mejorar la opsonofagositosis (Karakawa et al., Infecí Immun, 56:1090-1095, 1988). Usando una infección refinada y letal en un modelo de ratón (Fatíom eí al., Infecí Immun, 61 :1023-1032, 1993) ello ha mosírado que la infusión intraperitoneal del polisacárido específico capsular del tipo 5 IgG reduce la mortalidad de ratones inoculados iníraperiíonealmeníe con E. aureus. La vacuna polisacárido-rEPA capsular íipo 5 íambién se ha usado para vacunar diez y siele pacieníes con elapa íerminal de deseso renal (Welch eí al., J Amer Soc Nephrol, 7(2):247-253, 1996). La media geoméírica (GM) de los niveles de aníicuerpo IgG del íipo 5 conjugado se incremenía eníre 13 y 17 veces después de la primera inmunización, sin embargo ningún incremento adicional pudo ser deíecíado después de las inyecciones adicionales. Iníeresaníemenfe, los niveles de GM IgM de los pacieníes vacunados fueron de manera significafiva más bajos que los coníroles individuales. Soportada por esíudios animales, la vacuna ha compleíado recieníemeníe una fase i I de ensayo en pacieníes con diálisis periíoneal ambulatoria coníínua. Los ensayos clínicos mosíraron que la vacuna es segura pero no efecíiva en prevenir las infecciones esíafilococales (NABI SEC FORM 10-K405, 12/31/95). Dos posibles explicaciones para la incapacidad de Síaph VAX para prevenir las infecciones relaíivas a la diálisis periíoneal en pacientes vacunados son que la inmunogenecidad de la vacuna fue fan baja se debe a la dosificación sub-ópíima de la vacuna o a que los aníicuerpos en el torrente sanguíneo no son capaces de afectar la infección en ciertas áreas anatómicas, tal como el peritoneo. La bacteria gramo-posiíiva relacinada con la sepsis esfa en incremento. De hecho eníre un tercio y un medio de todos los casos de sepsis son causados por bacteria gramo-posiíiva, particularmente E. aureus y E. epidermidis. En los Estados Unidos, se puede estimar que más de 200,000 pacientes desarrollarán la bacteria gramo-posiíiva relativa a la sepsis este año. Usando un modelo de ratón (Bremell et al., Infect Immun. 59(8):2615-2623,1991), ello ha sido claramente demoslrado que la inmunización acfiva con dominio M55 del enlace-Col MSCRAMM puede proteger ratones coníra la muerte inducida por sepsis. Los ratones fueron inmunizados subcuíaneameníe con ambas M55 o un anfígeno de conírol (suero bovino albúmina) y entonces ¡nfecíados inlravenosameníe con E. aureus. Ochenfa y íres por ciento (35/42) de los ratones inmunizados con M55 sobrevivieron comparados con solameníe 27% de los ratones inmunizados con BSA (12/45). Esto es una compilación de íres esíudios separados. Schennings ef al., demosíraron que la inmunización con proteínas de enlace de fibronectina de E. aureus protege contra la endocarditis experimental en ratas (Micro Phatog, 15:227-236, 1993). Las raías fueron inmunizadas con una fusión de proteina (gal-FnBP) que encierra la befa-galactosidasa y los dominios de la proteina de enlace de fibronectina de E. aureus responsible del enlace a la fibronectina. Anticuerpos contra proteínas de fusión gal-FnBP se mosíraron para bloquear el enlace de E. aureus a fibronecíina inmovilizada in viíro. La endocarditis en raíras de confrol inmunizadas y no-inmunizadas fue inducida por via de cateterización de la arteria carófida derecha, que resulía en daño aórtico de las válvulas del corazón las cuales se cubrieron por fibrinógeno y fibronecíina. Las ratas cateterizadas fueron infectadas iníravenosamenfe con 1 x 105 células de E. aureus. El número de bacterias asociadas con las válvulas aortas fue determinado 1 Vz días después del riesgo de infección y se observó una diferencia significantiva en números bacteriales entre los grupos inmunizado y no-inmunizado. Un modelo de ratón mastitis fue usado por Mamo, eí al., (Vaccine, 12:988-992, 1994) para esíudiar el efeclo de la vacunación con proteínas de enlace fibrinógeno (especialmente FnBP-A) y proteínas de enlace colágeno de E. aureus coníra el riesgo de infección con E. aureus. Los raíones vacunados con proteínas de enlace fibrinógeno mostraron reducidas proporciones de mastitis comparados con los controles. Un examen burdo de las glándulas mamarias infectadas de los ratones mostró que las glándulas de los ratones inmunizados con proteinas de enlace fibrinógeno desarrollaron una leve infección intramamaria o no íuvieron cambios patológicos comparados con las glándulas de los raíones de conírol. Un número significantemente reducido de bacterias pudo ser recuperado de las glándulas de los raíones inmunizados con proteínas de enlace fibrinógeno comparadas con los controles. Mamo estableció entonces que la vacunación con FnBP-A combinada con toxoide alfa esíafilococal no mejora la protección (Mamo, et al., Vaccine, 12:988-992, 1994). En seguida, Mamo, et al., con ratones inmunizados solamente con proteinas de enlace colágeno, las cuales no indujeron protección coníra el riesgo de infección con E. aureus. Esíafilococos complefameníe muertos fueron incluidos en un estudio de vacuna en humanos que involucra diálisis periíoneal (Poole-Warren ef al., Clin. Nephrol, 35: 198-206, 1991). En este ensayo clínico, una vacuna comercialmente disponible de toxoide alfa-hemolicina combinada con una suspensión de la bacteria complefamenle muerta) fue adminislrada iníramuscularmeníe diez veces por 12 meses, con pacientes de conírol que recibieron soluciones salinas. La vacunación evocó incrementos significantes en los niveles de anticuerpos para las células E. aureus en el fluido periíoneal y para alfa- 1 hemolicina en el suero. Sin embargo, la inmunización no redujo la incidencia de peritonitis, infecciones caleler-relacionadas o colonización nasal además de recipientes de vacunas. La falía de eficacia en la protección en esíe ensayo fue aíribuido a una subópfima formulación de vacuna. Proteínas secrefadas se han explorado como componentes de vacunas subcelulares. La alfa toxina es además la exoloxina estafilococal más potente; ella fiene actividad citolííica, induce necrosis en los tejidos y maía animales de laboratorio. La inmunización con toxina alfa formaldehido-desfoxificado no protege animales de infecciones siíémicas o localizadas, si bien ello puede reducir la severidad clínica de las infecciones (Eksíedí, R. D., in The Síaphylococci, 385-418,1972). Un esfudio ha evaluado la eficacia de protección de aníicuerpos para las microcápsulas de E. aureus en un modelo experimenlal de infección esíafilococal (Nemeth, J. and Lee, J. Ct, Infecí. Immun. 63:375-380,1995). Las raías fueron activamente inmunizadas con una mortal bacteria microencapsulada o pasivamente inmunizada con un antisuero específico de conejo de alto-fífulo para el polisacárido capsular. Los animales de conírol fueron inyecíados con salina o pasivamente inmunizados con suero normal de conejo. La protección coníra la endocarditis caíeter-inducida que resulta de la infección intravenosa con la misma especie fue entonces evaluada. No obsíanfe que se íienen elevados niveles de aníicuerpos aníicapsulres, los animales inmunizados fueron sucepíibles a la endocarditis esíafilococal e inmunizados y animales de control tuvieron números similares de bacterias en la sangre. Como se describe en la descripción detallada de la invención adjunte abajo, un número de patentes y solicitudes de patente describen las secuencias genéticas para fibronectina, fibrinógeno, colágeno, elastina, y MHC II proteínas de enlace tipo análogo. Estas patentes y solicitudes de patente las han incorporado por referencia en su loíalidad. Estos documentos enseñan que las proteínas, fragmentos, o aníicuerpos inmunoreacíivos con aquellas proteinas o fragmentos pueden ser usados en vacunaciones para el tratamiento de infecciones de E. aureus. PCT/US97/087210 describe la vacunación de ratones con una combinación de una proteina de enlace colágeno (fragmento M55), un péptido de enlace fibronectina (írafado con formulina FnBP-A (D1-D3)) y un pépíido de enlace fibrinógeno (ClfA). La faifa de adecuada protección contra infecciones esíafilococales que han sido vistes a la fecha de las vacunas descriías arriba es probablemente el resulfado de la falla para generar la apropiada respuesfa inmune , quizá junto con una programación inapropiada de inmunización o una rufa de inmunización no adecuada. Factores adicionales que íambién coníribuyen al alcance pobre de las vacunas aníeriores puede reflejarse en el hecho que la bacteria esíafilococal íal como E. aureus ha sido abservada para regular temporalmente la expresión de la mayoría de sus factores de virulencia via genes regulalorios loci (lugares geoméíricos) agr y sar. Por ejemplo, E. aureus contiene dos genes que codifican proteínas de enlace fibrinógeno de la superficie celular, ClfA y ClfB. Interesantemente, ClfA es expresada predominantemente en un crecimiento exponencial temprano, mieníras que ClfB esíá expresada después en la fase de crecimiento. De acuerdo, a los aníígenos que el organismo que invade presente al huésped in vivo puede no ser el mismo como aquellos usados en la vacuna. En adición, no cada aníígeno E. aureus eslá expresado sobre cada uno que aisla. Por ejemplo, solameníe aproximadamente 50% de E. aureus aislado clínicamente expresa el gen can, el cual codifica para el enlace colágeno MSCRAMM. Para generar una inmunoterapia efectiva contra el E. aureus la vacuna debe ser multicomponenle y conleine enlígenos que extienden el ciclo de crecimiento íambién como incluir aníígenos que son expresados por una mayoría de E. aureus aislados. No obíanle el avance en la técnica de las composiciones para el íratemienío de infecciones de bacteria esíafilococal íal como E. aureus, ahí se mantiene 2 una necesidad para proporcionar un producto más efecíivo, y preferiblemente uno que exhiba un amplio espectro de inmunización coníra bacteria esíafilococal de varias especies, y para proteínas particulares las cuales pueden ser expresadas en diferentes etapas de la fase de crecimiento bacterial. Por consiguiente, ello es un objeto de la invención proporcionar una nueva composición terapéutica para inmunización coníra infecciones de bacteria estafilococal lal como E. aureus y E. epidermidis. Es olro objeío de la presente invención proporcionar una vacuna que proporcione protección conlra mastitis, artritis, endocardilis, septicemia, y osteomieliíis, furunculosis, celulitis, piemia, neumonía, pioderma, supuración de heridas, envenenamiento de comida, infecciones de cortadas y oíros desesos infecciosos. Es otro objeto de la presente invención proporcionar una composición terapéutica que inmuniza coníra la infección esíafilococal, mejora la cantidad de mortandad intracelular de la bacteria esfafilococal, e incrementa la proporción de fagositosis déla bacteria esíafilococal. Es aún oíro objeío de la presente invención proporcionar una composición que además proteja al huésped por las exotoxinas que neuíralizan.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ha sido descubierto que el tratamienío de las infecciones estafilococales puede ser significantemente acreceníado por la inmunización con cierta combinación seleccionada de proteinas de enlace bacterial o fragmentos de ellas, o anticuerpos para aquellas proteínas o fragmentos. Las proteinas o fragmentos pueden ser usadas en vacunas activas, y los anticuerpos en vacunas pasivas. Alternativamente, la combinación puede ser usada para seleccionar mancomunidades de donadores de sangre para la fabricación de producios de sangre purificada para inmunización pasiva. Por una cuidadosa selección de las profeinas, fragmentos, o aníicuerpos, una vacuna es proporcionada para que imparta protección coníra un amplio espectro de especies bacteriales de esíafilococos y confra proteínas que son expresadas a diferentes efapas de la curva de crecimiento logaríímica. La vacuna y producios descritos adjunto responden a la urgente necesidad de la comunidad médica para un susíiíuío de pequeñas moléculas anlibioiicas, las cuales esíán perdiendo rápidamente efecíividad. Las vacunas tienen un mejoramiento significativo sobre la íécnica anterior, las cuales mienlras generalmeníe enseñan el uso de MSCRAMMs para impartir inmunización, no enseñaron cuales combinaciones del gran número de MSCRAMMs conocidas serian usadas para impartir proteccción superior. En una modalidad de la invención, es proporcionada una composición que incluye al menos una proíeina de enlace colágeno o pépíido (o un sitio apropiado de secuencia mutada dirigida de la misma) tal como CNA, o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología a ello, en combinación con una proteina de enlace fibrinógeno, preferiblemente un factor Clumping A ("ClfA") o factor dumping B ("CIfB"), o un fragmento útil del mismo o una proíeina o fragmento con suficientemente alta homología a ello. En otra modalidad de la invención, una composición es proporcionada que ¡ncluye al menos una proteina de enlace fibronecíina o péptido ( o un sitio apropiado de secuencia dirigida mutada de ella), o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología a ello), o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología a ello, en combinación con la proteina de enlace fibrinógeno, preferiblemente A o B (ClfA o ClfB, respectivamente), o un fragmento útil del mismo o una proíeina o fragmento con suficientemente alfa homología a ello.

En una tercera modalidad, una composición es proporcionada que incluye al menos la proíeina de enlace fibrinógeno A (CIfA) y la proleina de enlace fibrinógeno B (ClfB), o fragmentos úíiles de ellos o una proíeina o fragmento con suficientemente alia homología a eso. En una cuarta modalidad, una composición es proporcionada que incluye al menos una proíeina de enlace fibronectina o péptido ( o un siíio apropiado de secuencia mulada dirigida de ella), o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología de eso, en combinación con (i) la proteina de enlace fibrinógeno A y B (CIfA y ClfB), o un fragmento útil de la misma o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología a ello; y (ii) una proíeina de enlace colágeno o fragmento útil de ella. En una modalidad adicional, una composición es proporcionada que incluya las componentes de las anteriores modalidades en combinación con proteina de enlace elastina o péptido o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología a ellas. En otra modalidad, una composición es proporcionada que incluya las componentes de las anteriores modalidades en combinación con una proteina análoga MHC i! o péptido o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología a ellas. En oíra modalidad, una composición es proporcionada que ¡ncluye las componentes de cualquiera de las anteriores combinaciones en combinación con una componente bacterial para incremeníar la proporción de fagositosis de la bacteria estofilococal. En una íal modalidad, la componente bacterial comprende un polisacárido capsular, tal como el polisacárido capsular tipo 5 o lipo 8. En una modalidad adicional, una composición es proporcionada que incluya cualquiera de las anteriores combinaciones en combinación con las proteinas de enlace de matriz extracelular SdrC, SdrD, SdrE o un consenso o un motivo de amino ácido de secuencia variable, o fragmentos útiles de la misma o proteinas o fragmentos con suficientemente alta homología a ellas.

En una modalidad adicional, una composición es proporcionada que incluye y en combunación de las anteriores combinaciones con las proteinas de enlace de matriz extraceluiar SdrF, SdrG, SdrH, o un consenso o motivo de amino ácido de secuencia variable, o fragmentos útiles del mismo o proteinas o fragmentos con suficientemente alta homología a ellas. Esta modalidad es particularmente efectiva en el desarrollo de vacunas que pueden ser úíiles con referencia a ambas bacterias estafilococales de coagulasa-positiva y coagulasa-negativa. En olra modalidad, una composición es proporcionada que incluye al menos las proteinas de enlace de matriz extracelular SdrC, SdrD y SdrE o fragmentos útiles de ellas, tal como el consenso o motivo de amino ácido de secuencia varable, o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología de ellas. Alternativamente, composiciones son proporcionadas que incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales las cuales son inmunoreactivas a la combinación seleccionada de componentes descritos. Estas composiciones pueden ser usadas en vacunaciones para tratar pacientes infectados con infecciones de estafilococos. En otras modalidades de la invención, la combinación de proteinas, fragmentos o anlicuerpos como se describe son usados en equipo de diagnóstico. Como se describe abajo, proteinas y péptidos tienen que ser usados en la composición como es conocida la cual enlaza a la fibronectina, fibrinógeno, colágeno, y elastina. Alternativamente, uno puede identificar nueva fibronectina, fibrinógeno, colágeno, y proteinas de enlace elastina, o las epítopes de ellas para usarse en la composición. Métodos de identificar un péptido de un dominio de enlace de una proteina que enlaza a los ligandos de la selección que es conocida. Por ejemplo, uno puede contactar una proteina o péptido candidato con el ligando bajo condiciones efectivas que permiten enlazar al ligando al dominio de enlace de una proteina de enlace, e identificar un péptido candidato positivo que enlaza al ligando. Anticuerpos que enlazan a los dominios de enlace de la composición de proteinas o péptidos pueden ser generados por administrarle a un animal una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva inmunológicamenfe de la combinación de proteinas o péptidos, aunque aún el péptido no enlaza específicamente a la ECM. La combinación de la proteina MSCRAMM aislada, recombinante o sintética, o fragmentos activos de ella o proteinas de fusión de ella, son también útiles como herramienta de investigación científica para identificar sitios de enlace estafilococal sobre las moléculas huésped ECM, De ese modo promover un entendimiento del mecanismo de patología bacterial y el desarrollo de terapias antibacteriales. Ademas, las proteinas aisladas, recombinantes o sintéticas, o porciones anligénicas de ellas (incluyendo fragmentos de comportamiento epítope), o proteinas de fusión de ellas pueden ser administradas a animales como inmunógenos o antígenos, solas o en combinación con algún adyuvante, para la producción de antisuero reactivo con proteinas MSCRAMM. En adición, las proteinas pueden ser usadas para proteger el antisuero para pacientes hiperinmunes de quienes se pueden derivar anticuerpos que tienen una muy alia afinidad para las proteínas. Anticuerpos aislados del anlisuero son útiles para la defección específica de bacteria esfafilococal o proteínas de enlace, como herramienías de investigación, o como íraíamieníos terapéuticos contra infección estafilococal. Las proteinas, o fragmentos activos de ellas, y aníicuerpos para las proteínas son úíiles para el fraíamienío de infecciones de infecciones esíafilococales de bacteria tal como E. aureus como se describe arriba; para el desarrollo de vacunas aníi-estafilococales para inmunización activa y pasiva; y, cuando es adminisírada como composición farmacéutica a una herida o usada para cubrir dispositivos médicos o biomaleriales poliméricos in viíro e in vivo, las proteinas y las anticuerpos ambas son usadas como ageníes que bloquean para prevenir o inhibir el enlace de bacteria estafilococal al sitio de herida o biomateriales. Preferiblemente, anticuerpos derivados de animales están modificados tal que ello es menos inmunogénico en el paciente a quien le es administrado. Por ejemplo, si el paciente es un humano, el anticuerpo puede ser "humanizado" al trasplantarle la complementariedad que determinan las regiones del anticuerpo del hibridoma -derivado deníro de un anticuerpo monoclonal humano como es descrito por Jones et al., (Nature 321 :522-525 (1986)) o Tempest et al., (Biotechnology 9:266-273 (1991)). Son íambién proporcionados equipos que son útiles como un ageníe de diagnóstico para la defección de infecciones estefilococales. De acuerdo a todavía ofro modalidad, los anticuerpos aníi-MSCRAMM íambién como los polipépíidos MSCRAMM de este invención, son útiles como agentes de diagnóstico para detecíar infección por bacíeria esíafilococal, porque los polipéptidos son capaces de enlazar a moléculas anticuerpos producidas en animales, incluyendo humanos que están infecíados con bacíeria esíafilococal lal como E. aureus, y los aníicuerpos son capaces de enlazar a una bacteria estafilococal particular o antígenos de ella. Agentes de diagnóstico pueden ser incluidos en un equipo el cual puede también incluir instrucciones de uso y otros reactivos apropiados. El equipo puede también contener un medio para evaluar el producto del ensayo, por ejemplo, una carta de color, una carta de referencia numérica. El polipéptido o anticuerpo puede ser etiquetado con un medio de detección que permita la detección del polipépfido MSCRAMM cuando se une a un aníicuerpo, o para la defección del anticuerpo polipéptido anti-MSCRAMM cuando es unido a la bacteria estafilococo. Los medios de detección pueden ser un agente eíiqueíador flourescenle íal como fluorescina isocianaío (FIC), fluorescina isoliocianalo (FITC), y lo similar, una enzima, tal como rábano de caballo peroxidasa (HRP), oxidasa de glucosa y lo similar, un elemento radioactivo tal como 125l o s1Cr que producen emisiones de rayos gamma, o un elemento radioactivo que emite positrones el cual produce rayos gamma tras de encontrarse con los electrones presentes en la solución prueba, tales como 1C, 15O, o 13N. El enlace de los medios de detección es bien conocido en la técnica. Por consiguiente, el anticuerpo polipéptido monoclonal anti-MSCRAMM producido por un hibridoma puede ser etiquetado metabólicamente por la incorporación de amino ácidos que contienen radioisótopos en el medio de cultivo, o los polipépíidos pueden ser conjugados o acoplados a los medios de detección a íravés de grupos funcionales activados. Los equipos de diagnóstico de la presente invención se pueden usar para defeclar la presencia de una cantidad de bacteria esíafilococo o aníicuerpos aníi-eslafilococo en una muesíra e fluido corporal íal como suero, plasma u orina. Entonces, en una modalidad preferida, una composición de polipépfido MSCRAMM o aníicuerpo polipéptido anti-MSCRAMM de la presente invención se une a un. soporte sólido típicamente por la absorción de un medio acuoso. Matrices sólidas útiles son bien conocidas en la técnica, e incluyen un enlace cruzado de dexlrán; agarosa; poliestireno; polivinicloro; poliacrilamida de enlace cruzado; niírocelulosa o materiales basados en nylon; tubos, placas o los pozos de placas microtítulos. Los polipéptidos o anticuerpos de la presente invención pueden ser usados como ageníes de diagnósfico en forma de solución o como un polvo sustancialmeníe seco, es decir, en una forma liofilizada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una represeníación esquemática de los péptidos usados en una vacuna iluslraíiva, MSCRAMM IV.Este dibujo ilustra la característica esencial del enlace de proteínas colágeno MSCRAMM CNA, enlace fibrínógeno MSCRAMM CIfA, enlace fibrinógeno MSCRAMM ClfB y enlace fibronecíina MSCRAMM FnBPA. Las MSCRAMMs se muesíran con regiones que denoten que fueron expresadas como proteínas recombinantes y usadas para generar anticuerpos en conejos inmunizados con MSCRAMM IV. Todas las proteínas fueron designadas con una amino cola termina eslidina para facilitar la purificación por cromatografía que quela metal. La Figura 2 es una gráfica del curso del tiempo de la respuesta inmune en Monos Rhesus vacunados con MSCRAMM como se muestra por los combios en fííulos de aníicuerpo coníra las MSCRAMMs CAN, CIfA, ClfB y FnBPA, respectivamente. Los títulos fueron analizados por ELISA y medidos como cambios en absorbancia (cuantificada a 405 nm) durante cada semana en el curso de un periodo de seis meses de traíamienfo que sigue la inmunización original con el aníígeno. La Figura 3 muesíra la secuencia de ácido nucleico que codifica por el gen sdrF del E. epidermidis y la secuencia de amino ácido codificacada de ese modo. La Figura 4 muesíra la secuencia de ácido nucleico que codifica por el gen sdrG del E. epidermidis y la secuencia de amino ácido codificada de ese modc. La Figura 5 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica por el gen sdrH del E. epidermidis y la secuencia de amino ácido codificada de ese modo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Composiciones adecuadas para usarse como vacunas son proporcionadas que incluyen al menos: (i) Una proteina de enlace colágeno, pépfido o dominio tal como CAN ( o un sitio apropiado de secuencia mufada dirigida de ella), o una proleina, fragmento o dominio con suficientemente alfa homología a ella, en combinación con una proteina de enlace fibrinógeno preferiblemente factor Clumping A ("CIfA") o factor Clumping B ("ClfB"), o un fragmento útil de ella o una proíeina o fragmento con suficientemente alta homología a ella; (ii) Una proteina de enlace fibronectina o péptido (o un sitio apropiado de secuencia mutada dirigida de ella), o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología a ella, en combinación con proteinas de enlace fibrinógeno A y B (CIfA y ClfB), o fragmentos útiles de ella o proteinas o fragmentos con suficientemente alta homología a ella; o (iii) La proteina de enlace fibrinógeno A (CIfA) y la proteina de enlace fibrinógeno B (ClfB), o fragmentos útiles de ella o una proteína o fragmento con suficientemente alta homología a ella; o (iv) Proteina de enlace fibronectina o péptido (o un sitio apropiado de secuencia mutada dirigida de ella), o una proteina o fragmento con la suficientemente alta hología a ella, en combinación con la proteina de enlace fibrinógeno A y B (CIfA y ClfB), o un fragmento útil de de ella o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología a ella; y una proíeina de enlace colágeno o un fragmento útil de ella, o una proteina o fragmento con suficientemente alia homología a ella; (v) Componentes de cualquiera de las modalidades de arriba en combinación con una proteina de enlace elastina o péptido o una proteina o fragmento con suficientemente alta homología a ella; o . (vi) Componentes de cualquiera de las modalidades de arriba en combinación con una proteina o péptido de enlace tipo análogo MHC II, proteina o fragmento con suficientemente aita homología a ella; o (vii) Componentes de cualquiera de las modalidades de arriba en combinación con una componente bacterial para incremeníar la proporción de fagosifosis de una bacíeria esfafilococal fal como E. aureus, o (viii) Componentes de cualquiera de las modalidades de arriba en combinación con las proteínas de enlace de matriz extracelular SdrC, SdrD, SdrE, o fragmentos úíiles de ellas, íal como una mofivo de secuencia de amino ácido variable o consensada, o proteínas o fragmeníos con suficientemente alfa homología a ellas; o (ix) Componentes de cualquiera de las modalidades de arriba en combinación con las proteínas de enlace de malriz exíracelular SdrF, SdrG o SdrH, o fragmentos útiles de ellas, tal como un motivo de secuencia de amino ácido variable o consensada, o proteinas o fragmentos con suficientemente alta homología a ellas, tal que una vacuna creada de dichas componentes fambién será útil para inmunizar un paciente coníra infección de la bacteria coagulasa-negativa íal como E. aureus; o (x) Las proteínas de malriz de enlace exfracelular SdrC, SdrD y SdrE o fragmentos útiles de ellas, tal como un motivo de secuencia de amino ácido variable o consensada, o una proteina o fragmento con suficientemente alia homología a ella. Fragmentos de. proteina aislados del tipo silvestre o variantes que ocurren naturalmente o sintéticas o péptidos recombinántes que corresponden al tipo silvestre, variantes de ¡as que ocurren naíuralmente o muíaciones introducidas que no corresponden al dominio de enlace de las que ocurren naturalmente una proteina de enlace puede ser usada en esas modalidades. Los pépiidos aislados tendrían una longitud suficiente para permitir la generación de un anticuerpo que enlaza ambos el péptido aislado y el dominio de enlace, y bloques de enlace de las proteínas de enlace a su ligando. En cierto aspecto, los péptídos comprenden al menos aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 22, aproximadamente 24, aproximadamente25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45 o aproximadamente 50 los amino ácidos contiguos son preferidos. En otros aspectos preferidos de la invención, el péptido aislado comprende al menos aproximadamente 6 amino ácidos contiguos de la secuencia lipo silvesfre del dominio de enlace. En un aspecto de la invención, las composiciones de anticuerpo o péptido aislado son usadas para generar una respuesta ¡nmunológica en un animal En este aspecto, las composiciones preferiblemente además comprenden un adyuvante. Muchos adyuvantes se conocen para uso en vacunaciones y están fácilmente adaptados para esta composición. El péptido aislado o composición de profeina es dispersado preferiblemente en un ecipiente acepfable farmacéuticamente. El péptido aislado puede ser ligado a una secuencia de amino ácido seleccionada para hacer una proteina de fusión. Como un ejemplo no jimitaníe, una proteina de fusión puede ser hecha íal que comprenda al menos un primer péptido de un dominio de enlace o una proteina de enlace operativamente ligada a una secuencia de amino ácidos seleccionada. En una modalidad, si el péptido tiene un dominio de enlace fibronectina, ei primer péptido no enlaza específicamente a la fibronectina. En aspectos preferidos, el primer péptido está ligado a una molécula portadora seleccionada o secuencia de amino ácido, incluyendo, pero no límiíado a, un hoyo llave lapa hemocianina (KLH) y suero bovino albúmina (BSA). Composiciones ¡nmunológicas, incluyendo vacunas, y ofras composiciones farmacéuticas que contienen las proteinas seleccionadas MSCRAMM y el ADN codificado como proteínas MSCRAMM que esfán incluidas deníro del alcance de la presente invención. La combinación de proteínas de enlace, o fragmentos activos o antigénicos de ellas, o proteínas de fusión de ellas pueden ser formuladas y empacadas, solas o en combimnación con oíros anfígenos, usando métodos y materiales conocidos por aquellos expertos en la íécnica para vacunas. La respuesía inmunológica puede ser usada terapéuticamente o profilácticamente y puede proporcionar inmunidad al anticuerpo o inmunidad a la célula fal como aquella producida por linfociíos T o limfociíos CD4+T. Las vacunas pueden prepararse para uso en ambas inmunizaciones activa y pasiva. Preferiblemente el material antigénico esíá extensivamente dializado para remover moléculas indeseables de de peso molecular pequeño y/o liofilizadas para la formulación más fácil dentro de un vehículo deseado.

I. DEFINICIONES Los términos proíeina FnBP-A, proteina FnBP-B, proíeina CIfA, proteina ClfB, proteina SdrC, proteina SdrD, proíeina SdrE, proteina SdrF, proleina SdrG, proleina SdrH, proteina CNA, proteina EbpS y proteína MHC II están definidas adjunto para incluir subdominios FnBP-A, FnBP-B, CIfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS y MHC II, respectivamente, fragmentos activos o antigénicos de proteinas FnBP-A, FnBP-B, CIfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS y MHC II, y proteinas o fragmentos que tienen sificientemente alta homología con eso. Fragmentos activos de proteinas FnBP-A, FnBP-B, CIfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, .CNA, EbpS y MHC II están definidas adjunto como péptidos o polipéptidos capaces de bloquear el enlace de bacteria estafilococo para el huésped ECM. Fragmentos antigénicos de proíeinas FnBP-A, FnBP-B, CIfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS, y MHC II esíán definidos adjunto como pépfidos y poolipépíidos capaces de producir una respuesía inmunológica. El término "adhesina" como es usado adjunto incluye proíeinas de ocurrencia nalural y sintéticas o recombinaníes y pépíidos los cuales pueden enlazar a proteinas de matriz extracelular y/o adherencia mediada a células huésped.

El término " amino ácido" como es usado adjunto incluye amino ácidos de acurrencia nafural y sintéticos e incluye, pero no eslá limiíado a, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilanina, fripíofán, meíinina, glicina, serina, íreonina, cisteina, tirosina, asparagina, gluíamaío, ácido aspartico, ácido glutámico, lisina, arginina, y histidina. Y "anticuerpo" es cualquier inmunoglobulina, que incluye anticuerpos y fragmentos de ellos, que enlaza a un epítope específico. El término como es usado adjunto incluye anticuerpo monoclonal, policlonal, quimérico, de cadena simple, biespecífico, semianizado, y anticuerpos humanizados íambién fragmeníos Fab, incluyendo los producios de una colección de expresión de inmunoglobulina Fab. La frase "molécula anticuerpo" en sus varias formas gramaticales como es usada adjunto contempla ambas una molécula de inmunoglobulina infacfa y una porción activa inmunológicameníe de una molécula inmunoglobulina. Como es usada adjunto, una proíeina o péptido "equivalente funcional anligénicamenfe" es una que incorpora un epílope que es inmunológicamente reactivo cruzado con uno o más epítopes ambos derivados de cualquiera de las proteinas particulares MSCRAMM descriías ( es decir, FnB-B, FnB-A, FnBP-B y FnBP-A) o derivados de cualquiera de los componentes bacteriales particulares descriías (es decir, ácidos íeicoicos, alfa toxina y polisacárido capsular íipo 5). Equivalentes funcionales aníigénicameníe, o secuencias epiíópicas, pueden ser designadas primero o predecir y entonces probar, o pueden simplemente ser direcíamenle probadas por reactividad cruzada. Como se usa adjunto, "pg" significa picogramo, "ng" significa nanogramo, "ug" o "µg" significa microgramo, "mg" significa miligramo, "ul" o "µl" significa microlitro, "ml" significa mililitro, "I" significa litro.

Una "célula línea" es un clon o una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro por muchas generaciones. Un "clon" es una población de células derivadas de una célula simple o ancestro común por miíosis. Una ADN "secuencia que codifica" es una secuencia doble-írensada de ADN la cual es íranscriía y íraducida denlro de un pépíido in vivo cuando se coloca bajo el control de una secuencia regulatoria apropiada. Las fronteras de la secuencia están determinadas por una estrella codón al término 5' (amino) y una íraducción al codón tope termino 3' (carboxil). Una secuencia que codifica puede incluir, pero no esíá limiíadas a, secuencias procarióticas, cADN de MARN eucaríotica, secuencias genéticas ADN de la eucaríotica ADN ( es decir, mamalia), y aún secuencias sintéticas de ADN . Una señal de poliadenilación y transcripción de la terminación de la secuencia usualmente será ubicada 3' a la secuencia que codifica. "Molécula ADN " se refiere a la forma polimérica de desoxirubonucléotidos (adenina, guanina, liamina, o cilosina) en su forma írensada simple de ambas, o una hélice doble trensada. Estos términos se refieren solamente a la primera y segunda estrucíura de la molécula, y no la limite a cualquier forma particular terciaria. Entonces, esíe término incluye una doble írenzada ADN esíablecida, iníer alia, en una molécula lineal ADN (es decir, fragmeníos de resíricción), virus, plasmidas, y cromosomas. En discusión la esírucíura de una molécula particular doble írenzada de ADN, las secuencias pueden ser descriías adjunto de acuerdo a la convención normal de dar solameníe la secuencia en las direcciones 5' a 3'a lo largo de la írenza no íranscrifa de ADN (es decir, la írenza que tiene una secuencia homologa a el mARN. El confrol íranscrípcional y traslacional de las secuencias son " ADN secuencias regulatorias", tal como promotores, mejoradores.señales de poliadenilación, íerminadores, y lo similar, que se proporcionan para la expresión de una secuencia que codifica en una célula huésped.

Una "expresión de control de secuencia" es una secuencia de ADN que confrola y regula la franscripción y íraslación de oíra secuencia ADN. Una secuencia que codifica esíá "bajo el conírol" de secuencias de conírol íranscripcional y íraslacional en una célula cuando la polimerasa ARN íranscribe el código de secuencia deniro de mARN, el cual es entonces traducido deniro de la proíeina codificada por la secuencia que codifica. Como es usado adjunto, el término " proteinas de malriz extracelular", o ECM, se refieren a cuatro familias generales de macromoléculas, colágenos, glicoproteinas estructurales, proteoglicanos y elastinas, incluyendo fibronectina, y fibrinógeno, que proporciona soporte y modula el comportamiento celular. "Cantidades efectivas inmunológicamente" son aquellas cantidades capaces de estimular una célula B y/o célula de respuesta T. Como se usó adjunto, el termina "vacuna ¡p vivo" se refiere a inmunización de animales con proteinas tal como reacción a una respuesta humoral y celular que protege contra la última exposición al patógeno. El término " ligando" es usado para incluir moléculas, incluyendo aquellas dentro de los tejidos huésped, a los cuales atacan las bacterias patogénicas. El término "antígenos MHC II" como se usa adjunto se refiere a moléculas de célula de superficie que son responsables de los rápidos rechazos de injerto y son requeridos por la presentación de antígenos a las células T. La frase "anticuerpo monoclonal" en sus varias formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene solamente una especie de anticuerpo que combina sitios capaces de inmunoreaccionar con un antígeno particular. El término "oligonucléotido", como es usado adjunto está definido como una molécula que comprende de dos a más nucleótidos, preferiblemente más que tres. Su tamaño exacto dependerá sobre muchos factores los cuales, en turno, dependen de la última función y uso del oligonucléotido. Como es usada adjunto, la frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen típicamente una alergia inaceptable o reacción desfavorable similar cuando es administrada a un humano. El término "primer" como es usado adjunto se refiere a un oligonucléotido, si ocurre naturalmente como en una restricción purificada condensada o producida sintéticamente, la cual es capaz de acíuar como un punto de iniciación de síntesis cuando es colocada bajo condiciones en las cuales la síntesis de una primer extensión de producto, la cual es complementaria a una írenza de ácido nucleico, está inducida, es decir, en la presencia de nucléofidos y un ageníe que induce fal como un ADN polimerasa y a un pH y temperatura adecuada. El primer puede ser ambas doble írenzada y simple írénzada y debe ser lo suficientemente larga para iniciar la síntesis del producto de extensión deseada en la presencia dei agente que induce. La longitud exacta del primer dependerá de muchos factores, que ¡ncluyen temperaíura, fuente del primer y uso del método. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, que dependen de la complejidad de la secuencia objetivo, el oligonucléotido primer lípicamente confiene 15-25 o más nucléolidos, además puede contener menos nucléoíidos. Los primers adjuntos son seleccionados para esíar susfancialmeníe y complemenferiamenfe en diferentes írenzas de de un objeíivo particular de una secuencia de ADN. Esto significa que los primers deben ser suficientemente y complementeriamenle para hibridizar con sus respecfivas írenzas. De lo anterior, la secuencia primer no necesite reflejar la secuencia exacte del templete. Por ejemplo, un fragmento de nucléotido no complementario puede ser adherido al exíremo 5'del primer, con el resto de la secuencia primer siendo complemenlaria a la trenza.

Alternativamente, bases no complemeníarias o secuencias más largas pueden ser esparcidas deníro del primer, con fal que la secuencia primer tenga suficiente complementaridad con la secuencia de la írenza para hibridizar con eso y de ese modo formar el templete para la síntesis del producío de extensión. Una "secuencia promotora" es una región regulaíoria de ADN capaz de enlazar ARN polimerasa en una célula e iniciar la franscripción de una secuencia que codifica corriente abajo (dirección 3'). Para propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora esfá unida a sus términos 3'por el siíio de iniciación de íranscripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el mínimo número de bases o elementos necesarios para iniciar la íranscripción a niveles deíecfables arriba del umbral. Deníro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de transcripción' (convenientemente definido por mapeo con nuclasa Sl), también como dominios de enlace de proteina (secuencias de concenso) por el enlace dei ARN poiimerasa. Se obtendrán promoíores Eucaríolicos, pero no siempre, contienen cajas "TATA" y cajas "CAT". Secuencias Shine-Delgarno que contienen promoíores procaríoficos en adición arla -10 y -35 secuencias de consenso. Un "replicón" es un elemenío genético (es decir, plasmida , cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo; es decir, es capaz de replicación bajo su propio conírol. Como es usado adjunto el término "restricción de endonucleasas" y "restricción de enzimas" se refiere a enzimas bacteriales, cada una de las cuales corta el ADN doble írenzado a o secuencia cercana y específica polindrómica de nucléoíido. Una "secuencia señal" puede ser incluida antes de la secuencia que codifica. Esla secuencia codifica una señal péptido, N-terminal al polipéptido, aquella lo comunica a la célula huésped para dirigir al polipéptido a la célula superficial o secrete el polipépíido deniro del medio, y esla señal polipéptido es desengrapada por la célula huésped antes de que la propteina salga de la célula. La secuencia señal puede ser encontrada en asosiación con una variedad de proteinas nativas a procarióticas y eucarióticas. Como es usado adjunto, el término " sitio dirigido mutágeno" se refiere a un compuesto que puede incrementar la proporción a la cual las mutaciones ocurren en un cierto sitio dentro de la molécula de ADN. Una célula ha sido "transformada" por ADN exógenos o heterólogos cuando tal ADN ha sido introducido dentro de la célula. El ADN que transforma puede o no puede ser integrado (covalentemente ligado) dentro del ADN cromosomal haciendo el genoma de la célula. En procaríoticas, levadura, y células mamarias por ejemplo, el ADN que transforma puede ser mantenido sobre un elemento episomal tal como una plasmida. Con respecto a las células eucarióticas, una célula transformada estable es una en la cual el ADN que transforma viene a integrarse dentro de un cromosoma tal que ello es heredado por la célula hija a íravés de la repiicación del cromosoma. Esta estabilidad es demosírada por ia capacidad de la célula, eucariótica para establecer líneas de célula o . clones que comprenden de una población de células hijas que contienen el ADN que transforma. Un "vector" es un replicón, tal como una plasmida, devorador o cosmida, al cual otro segmento de ADN puede ser adherido como para traer aproximadameníe la replicación del segmento adherido. El término "herida" es usado adjunto para indicar la capa celular epitelial, y oirás esíructuras superficiales sobre el tejido, dañado por influencia mecánica, química u oíros. Por "cantidad efecíiva inmunológicameníe" significa una caníidad de una composición de pépíido que es capaz de generar una respuesía inmune en el recipiente animal. Esto ¡ncluye en ambas la generación de una respuesla al aníicuerpo (respuesía de célula B), y/o la estimulación de una respuesta inmune a la citoxina (respuesta de célula T). La generación de tal respuesta inmune tendrá utilidad en ambas la producción de bioreaccionantes útiles , es decir, CTLs y, más particularmente, anticuerpos reactivos, para uso en modalidades de diagnóstico, y también tendrá utilidad en varias modalidades profilácticas o terapéuticas. Las combinaciones seleccionadas de proteinas de enlace bacterial o fragmentos de ellas en la composición usada incluye aquellos enlaces a fibronectina, fibrinógeno, colágeno, y elastina. Cualquier proteina, péptido, fragmento de ella, o secuencia sustancialmeníe homologa a ella puede ser usada en esta invención. Ejemplos ¡luslraíivos son suminisírados abajo, En adición, las profeinas de enlace bacterial o fragmentos análogos a MHC II.

II. ENLACE-FIBRONECTINA MSCRAMMs La fibronectina (Fn) es una glicoproíeina 440-kDa enconfrada en ¡a ECM y fluidos del cuerpo de los animales. La función bilógica primaria de la fibronectina parece estar relacionada a su capacidad para servir como un sustrato para la adhesión de las células que expresan las integrinas apropiadas. Varias especies bacteriales se han mostrado para enlazar fibronecíina específicamente y para adherirse a un suírafo que contiene fibronecíina. La mayoria aisladas E. aureus Fn, pero lo hacen en varias extensiones, las cuales reflejan variaciones en el número de moléculas MSCRAMM expresadas sobre la superficie celular bacterial. La interacción eníre Fn y E. aureus es allamenfe específica (Kussela, P., Nature,276:718-20, 1978). El Fn que enlaza es mediado por dos superficies expuestas a las proteinas con pesos moleculares de 110 kDa, llamadas FnBP-A y FnBP-B. El sitio de enlace primario Fn consiste de un motivo de 35-40 amino ácidos, repelido de íres a cinco veces. Los genes para eso han sido clonados y secuenciados (Jhonson, K. , eí al., Eur. J. Biochem., 202:1041-1048,1991 ).

La solicitud WO-A-85/05553 describe proteinas de superficie de célula bacterial que tienen fibronectina, fibrinógeno, colágeno, y/o capacidad de enlace laminina. La patente U.S. No. 5,320,951 y 5,571 ,514 de Hook et al., describen la secuencia genética proteina de enlace fibronectina A (fnbA), y productos y métodos basados en ésta secuencia. La patente U.S. No. 5,175,096 de Hook et al., describe la secuencia genética de fnbB, una molécula híbrida de ADN (fnbB) y productos biológicos y métodos basados sobre esta secuencia. La patente U.S. 5,652,217 una proteina aislada y purificada que fiene actividad de enlace y es codificada por una molécula híbrida de ADN de E. aureus o secuencia definida. La paíeníe U.S. 5,440,014 describe un pépfido de enlace ñbronecíina denfro de la unidad de homología D3 de una proteina de enlace fibronectina de E. aureus ¡a cual se puede usar para la vacunación de rumiantes contra mastitis causada por infecciones esíafilococales, para el íratamiento de heridas, para bloqueo de receptores de proíeina, para inmunización de otros animales, o para uso en un ensayo diagnóstico. La patente U.S. 5,189,015 describe un método para el frafamienfo profiláctico de la colonización de especies bacteriales de E. aureus que tienen la capacidad de enlazar a la fibronecíina en un mamífero que incluye la administración al mamífero en necesidad de tratamienío de una caníidad activa terapéuticamente y profilácticamente además de una proteina que íiene proiedades de enlace fibronectina, para prevenir la generación de infecciones causadas por una especie bacterial de E. aureus que tiene la capacidad de enlazar fibronectina, donde la profeina íiene un peso molecular de 87 kDa a 165 kDa. La patente U.S. 5,416,021 describe una profeina de enlace fibronectina que codifica ADN de Eslrepíococo dysgalacíiae, junio con una plasmida que incluye ADN que codifica para proíeinas de enlace fibronectina de E. disgalactiae contenida en E. coli, ADN que codifica una proteina de enlace fibronectina de E. dysgalactiae y un microorganismo E. coli transformado por el ADN que codifica una proteina de enlace fibronectina de E. dysgalactiae. Se ha observado que los anticuerpos para un íipo silvesíre de proteina de enlace fibronecíina no inhiben susfancialmehte la capacidad de E. aureus para enlazar la fíbroneclina, y entonces no exhiben un efecto terapéutico significante, in vivo. La soliciíud PCT/US98/01222 describe anticuerpos que bloquean el enlace de fobronectina a proíeinas de enlace fibronecíina. Los anticuerpos fueron suscitados coníra un sitio dirigido de una secuencia muíada de proteina de enlace fibronectina que no enlazan a la fibronectina. Ello fue identificado que hay una rápida composición de fibronectina con proteinas de enlace fibronectina y fragmentos in vivo. Pépíido epítopes que no enlazan a la fibronectina, aunque están basados en un dominio de enlace fibronectina de una proteina de enlace fibronectina , no forman un compuesto con fibronecfina in vivo. Esto permite que los aníicuerpos sean asegurados contra del péptido epítope no compuesto, el cual inhibe o bloquea el enlace de fibronecíina a proíeinas de enlace fibronectina. lll.- ENLACE COLÁGENO MSCRAMMs. EL colágeno es mayor constiluyenfe del cartílago. Colágeno (Cn) enlaza profeinas que son comunmente expresadas por especies esíafilococales. El enlace Cn MSCRAMM de E.aureus se adhiere a los cartílagos en un proceso que constifuye una parte importante del mecanismo patogénico en infecciones estafilococales. (Swifalski, eí al. Mol. Micro. 7(1), 99-107,1993) el enlace Cn por E. aureus se encuenfra jugando un papel en al menos, pero no solameníe, artritis y septicemia. CNAs con pesos moleculares de 133, 110 y 87 kDa (Paííi, J.,el al., J. Biol. Chem.,267:4766-4772,1992) han sido identificadas. Especies que expresan CNAs con diferentes pesos moleculares no difieren en su capacidad de enlace Cn (Switalski, L.M., Mol. Microbiol., 7:99-107,1993). Especies esfafilococales recuperadas de las articulaciones de pacieníes diagnosticados con artritis séptica u ostiomielitis al menos expresan invariablemente una CBP, puesto que significantemente son menos ias obtenidas y aisladas de infecciones de heridas que expresan esta adhesina (Switaski et al., Mol. Microbiol., 7:99-107,1993). Similarmente, Las especies E. aureus aisladas de los huesos de un paciente con osteomielitis algunas veces tienen un reconocimiento MSCRAMM de la proteina específica del hueso, la sialoproteina del hueso (BSP) (Ryden ET AL., Lancet, 11:5115-518, 1987). La colonización de E. aureus del cartílago articular deníro del espacio de la articulación parece ser un factor importante que confribuye al desarrollo de la artritis séptica. La solicilud PCT WO 92/07002 describe una molécula de ADN híbrida la cual ¡ncluye una secuencia de nucléoíidos de E. aureus que codifica para una proteipa o polipépíido que tiene acíividad de enlace colágeno y una plasmida o devorador que comprende la secuencia de nucléolidos. También son descriías una especie E. coli que expresa la proíeina de enlace colágeno, un microorganismo fransformado por el ADN recombinaníe, el método para producir una proteina de enlace colágeno o polipéptido, y la secuencia de proíeina de la proleina de enlace colágeno o polipéptido. La clonación, secuenciación, y la expresión de un gene cna, que codifica una E. aureus CBP ha sido reportado (Patti, J. et al., J. Biol. Chem., 267:4766-4772,1992). El gene cna codifica una adhesina 133-kDa que contiene características estructurales, características de superficie de proteina aislada de la bacteria gramo-positiva. Recientemente, el sitio de ligando-enlace ha sido localizado deniro de la N-terminal media de la CBP (Patíi, J. eí al., Bichesfry, 32:11428-11435, 1993). Analizando la actividad de enlace Col de proteinas recombinántes que corresponden a diferentes segmentos de la MSCRAMM, un fragmento de proteina larga amino ácido 168 (que corresponden a residuos de amino ácido 151-318) que fuvo una acíividad de enlace aprecible Col fue identificada. Truncaciones cortas de esta proteina en el término N o C resultó en una pérdida de actividad de enlace en los ligandos pero íambién resultó en combios conformacionales en la proteina como se indica por la especíroscopía de dicroismo circular. Paííi et al. (J of Biol Chem.,270,12005-1201 [1 ,1995) describe un epítope de enlace colágeno en la adhesión codificada por el gen cna de E. aureus. En su esíudio, los autores sintetizaron pépíidos derivados de la secuencia de dicha profeina y los usaron para producir aníicuerpos. Alguno de esos anticuerpos inhiben el enlace de la proíeina al colágeno. La solicitud PCT/US97/08210 describe que ciertos epííopes identificados de la profeina de enlace colágeno (M55, M33, y M17) se pueden usar para generar anticuerpos de protección. La solicitud también describe la estructura cristalina de la CBP la cual proporciona información crítica necesaria para identificar composiciones las cuales interfieren con, o bloquean completamente, el enlace de Col a CBPS. El sitio de ligando-enlace en la E. aureus CBP y un pépíido amino ácido 25 fue caracíerizado con que inhibe directamente el enlace de E. aureus a 125 I- etiquetado tipo II Col. r .- ENLACE FIBRINOGENO MSCRAMMs La fibrina es el mayor componente de los coágulos sanguíneos, y fibrinógeno/fibrina es uno de los mayores plasmas de proteínas depositados o implantados en biomaíeriales. Existe evidencia considerable para sugerir que la adherencia bacterial al fibrinógeno/fibrina es importante en la iniciación de la infección relacionada a dispositivos. Por ejemplo, como fue mostrado por Vaudaux et al., E. aureus se adhiere a plásticos in viíro que han sido cubiertos con fibrinógeno en una manera dosifico-dependiente (J. Infecí. Dis. 160:865-875 (1989)). En adición, en un modelo que imita a un coágulo sanguíneo o daña a una válvula del corazón, Herrmann et al. Demostró que la E. aureus se enlaza ávidamente vía un puente fibrinógeno a las plaquetas que se adhieren a la superficie ( J. Infecí. Dis. 167:312-322 (1993)). E. aureus se puede adherir directamente a fibrinógenos en coágulos de sangre formados in vitro, y puede adherirse a células endofeliales culfivadas via fibrinógeno depositado del plasma que acfúa como un puente (Moreillon ef al., Infecí Immun. 63:4738-4743 (1995); Cheun et al., J. Clin. Invesf. 87:2236-2245 (1991)). Como muesíra Vaudaux eí al. Y Moreillon eí al., los defectos mulantes en las proíeinas de enlace fibrinógeno de factor Clumping (CIfA) exiben reducida adherencia al fibrinógeno in votro, a catéteres que tomaron en cuenta, coágulos sanguíneos, y para válvulas del corazón dañadas en el modelo de rata para edocardifis (Vaudaux et al., Infect. Imrnun. 63: 585-590 (1995); Moreillon et al., Infecí, ¡mmun. 63:4738-4743 (1995)). Una adhesina para fibrinógeno, algunas veces referida como "factor clumping", está ubicada sobre la superficie de las células E. aureus. La interacción entre bacteria y fibrinógeno en solución resulta en la instaníánea pesadez de las células bacteriales. El sitio de enlace sobre el fibrinógewno está localizado en los términos C de la cadena gamma de la glicoproteina fibrinógeno dimérica. La afinidad es muy alta y la pesadez ocurre en bajas concentraciones de fibrinógeno. Los científicos han mostrado recientemente que el factor Clumping también promueve la adherencia a sólidos en la fase fibrinógeno, para coágulos sanguíneos, y para válvulas dañadas del corazón (McDevití eí al., Mol. Microbiol. 11 :237-248 (1994); Vaudaux eí al., Infecí Immun. 63:585-590 (1995); Moreillon ef al., Infecí. Immun. 63:4738-4743 (1995)). Dos genes en E. aureus han sido enconírados que codifican para dos Fg proteinas de enlace, CIfA y ClfB. E I gen, CIfA, fue clonado y secuenciado y enconlrado para codificar por un polipéptido de 92kDa. Enlaces CIfA de la cadena gamma de fibrinógeno, y enlaces ClfB de las cadenas alfa y beta (Eidhin, et al., Mol Micro, publicación en espera, 1998). ClfB es una pared de células de proteina asociada con un peso molecular predicho de 88kDa y un peso molecular aparente de 124 kDa que enlaza ambos fibrinógenos soluble e inmovilizado y acíúa como un factor de pesadez. El gen para una proteina de factor Clumping, designado CIfA, fue clonado, secuenciado y analizado en detalle a nivel molecular (McDevitf el al., Mol. Microbiol. 11:237-248 (1994); McDevití el al., Mol. Microbiol. 16:895-907 (1995)). La proteina predicha está compuesta de 933 amino ácidos. Una secuencia de señal de 39 residuos ocurre en el N-termino seguida por una región residual 520 (región A), la cual contiene el dominio de enlace fibrinógeno. Una región residual 308 (región R), compuesta de 154 repeticiones de la dipéptido asparatato-serina, seguidas. La secuencia de la región R es codificada por el par base 18 repetido GAY TCN GAY TCN GAY AGY en el cual Y es igual a pirimidinas y N es igual a cualquier base. El termino C de CifA tiene las presentes características en muchas superficies de proíeinas de bacíeria gramo-positiva tal como un motivo LPDTG, el cual es responsable para el anclaje de la proteina a la pared de la célula, una membrana que asegura, y residuos positivamente cargados en el exíremo del término-C. La plaqueta iníegrina Ilbß3 reconoce el íérmino-C de la cadena gamma de fibrinógeno. Esíe es un evento crucial en la iniciación del coagulado de la sangre duraníe la coagulación. CIfA y alfa Ilbß3 parecen reconocer precisamente los mismos sitios sobre la cadena gamma fibrinógeno porque CIfA puede bloquear la agregación de plaquetas, y un péptido correspondiente al término-C de la cadena gamma (198-411) pueden bloquear ambas la iníegrina y CIfA que interacíúa con el fibrinógeno (McDiviít eí al., Eur. J. Biochem.247:416-424(1997)). El siíio de enlace fibrinógeno de alfa Ilbß3 es cercano a, o traslapa, a un enlace Ca2+ determinantemente referido como una "mano EF". La región A CIfA lleva varios motivos EF parecidos a la mano. Una concentración de Ca2+ en el intervalo de 3-5 mM bloquea esas interacciones fibrinógeno-CIfA y cambia la estruclura secundaria de la proteina ClfA. Efecíuando mufaciones de CIfA EF mano reduce o previene las interacciones con fibrinógeno. Ca2+ y la cadena gamma fibrinógeno aparenta enlazarse a la misma, o que se traslapa, sitios CIfA en la región A. La cadena alfa de la infegrina leucocito, alfa MB2, tiene una inserción de 200 amino ácidos (dominio A o I) la cual es responsible para las actividades de enlace de los ligandos. Un metal nuevo sitio de adhesión ion-dependiente motivo (MIDAS) en el dominio I es requerido para enlazar ligandos. También el ligando reconocido es fibrinógeno. Los sitios de enlace sobre el fibrinógeno están en la cadena gamma (residuos 190-202). Fue reportado recientemente que Candida albicans fiene una superficie de protéina, alfa Inílp, que íiene propiedades reminiscenfes de integrinas eucarióticas. La superficie de profeina tiene homología de secuencia de amino ácido con el dominio I de Mß2, incluyendo el moíivo MIDAS. Por consiguiente, Inílp enlaza al fibrinógeno. La región A CIfA también exibe algún grado de homología de secuencia con alfa Intlp. Mutaciones en residuos que coordinan el catión putativo en la porción DxSxS del moíivo MIDAS en CIfA que resulla en una reducción significativa en enlace fibrinógeno. Un péptido que corresponde al sitio de enlace de la cadena gamma para alfa Mß2 (190-202) ha sido mostrado por O'Connel et al. Para inhibir interacciones fibrinógeno-CIfA (O'Connel, J. Biol. Chem., en prensa, 1998). Entonces parece que CIfA puede enlazar a la cadena gamma de fibrinógeno en dos sitios separados. Los ligandos que enlazan sitios sobre CIfA son similares a aquellos empleados por integrinas eucarióticas e involucra un enlace catión divalente EF-mano y motivos MIDAS. También es conocida la proteina de enlace fibrinógeno , ClfB. Son usada adjunto las proteinas también como anticuerpos para las proteinas y equipos de diagnóstico que incluyen las proteinas o sus anticuerpos. ClfB tiene un peso molecular predicho de aproximadamente 88 kDa y un peso molecular aparente de aproximadamenle 124 kDa. ClfB es una célula de pared asociada con proíeinas y enlaza ambas soluble y fibrinógeno inmovilizado. En adición, ClfB enlaza ambas las cadenas alfa y beta de fibrinógeno y actúa como un factor Clumping. Proteinas relacionadas al enlace fibrinógeno CIfA y ClfB han sido determinadas, las cuales enlazan a la matriz extracelular . Las proteinas SdrC, SdrD y SdrE en una secuencia primaria y organización estructural a las proteinas CIfA y CifB , y están también ubicadas sobre la superficie de la célula. Con la región A de esas proteinas ubicada sobre la superficie de la célula, las proteinas pueden interaccionar con las proteinas en plasma, la matriz extracelular o con moléculas sobre la superficie de las células huésped. SdrC puede enlazar a las proteinas de malriz extracelular , por ejemplo, SdrE a las sialoproteinas del hueso (BSP). Se ha descubierto que en la región A de SdrC, SdrD, SdrE, CIfA, y ClfB, hay secuencias de amino ácido altamente conservadas que pueden ser usadas para derivar un motivo de consenso TYTFTDYVD. El motivo puede ser usado en vacunas muíticomponentes para impartir un amplio espectro de inmunidad a las infecciones bacteriales, y también puede ser usado para producir anticuerpos monoclonales y policlonales que impartan un amplio especíro de inmunidad pasiva. En una modalidad alternativa, cualquier combinación del motivo de secuencia variable derivado de las familias de proteinas Sdr y Clf, (T/I)(Y/F)(T/V)(F)(T)(D/N)(Y)(V)(D/N), pueden ser usados para impartir inmunidad o para inducir anticuerpos de protección.

V.- ENLACE-ELASTINA MSCRAMMs El papel primario de la eiastina es conferir la propiedad de reversibilidad y elasticidad a los tejidos y órganos (Rosenbloom, J.,et al., FASEB J.J. 1208-1218, 1993). La expresión de la elastina es más alta en el pulmón, piel y vasos sanguíneos, pero la proteina está ampliamente expresada en huéspedes mamíferos por E. aureus. E. aureus que enlaza elastina se determinó que es rápida, reversible, de alta afinidad y ligando específico,. Además, una célula superficial 25 kDa de proteina de enlace elastina (EbpS) fue aislada y propuesta para mediar los enlaces de E. aureus al huésped rico en elastina ECM. Los enlaces EbpS para una región en la terminal-N 30 kDa de fragmento de elastina. La solicitud PCT/US97/03106 describe la secuencia de gen para una proteina de enlace elastina. Los datos de secuencia ADN descriía indican que el marco lector ebps abierto consiste de 606 bp, y codifica a un nuevo polipéptido de 202 amino ácidos.. La proteina EbpS tiene una masa molecular predicha de 23,345 daltones y pl de 4.9. La EbpS fue expresada en E. coh como una función de la profeina con residuos de poiihístidina ai término-N. Un anticuerpo policlonal sucítada contra la interactuada EbpS recombinante específicamente con la célula superficial 25 kDa EbpS e inhibido el enlace elastina estefilococal. Además, el enlace recombinaníe unido específicamente para inmovilizar elastina e inhibir el enlace elastina del Estafilococo aureus con elastina. Un producto de degradación de recombinaníes EbpS que falía de los primeros 59 amino ácidos de la molécula y fragmentos de la lerminal-C de CNBr-adheridos a la recombinanle EbpS, sin embargo, no iníeractuo con elastina. Esos resultados sugieren fuertemente que la EbpS es la molécula de célula de superficie que media el enlace del Estafilococo aureus con elastina. El que determina que algunas consírucciones del recombinanfe EbpS no inferactuán con elastina sugiere que el sitio de enlace elastina en EbpS esíá contenido en los primeros 59 amino ácidos de la molécula.

Varios criterios independientes indican que EbpS es la proteina que media el enlace celular elastina. Primero, enlaces rEbpS específicamente para inmovilizar elastina e inhibir enlace de células E. aureus a elastina en una dosis que depende de la manera. Estos resultados establecen que EbpS es una proteina de enlace elastina que es funcionalmente activa en una forma soluble. Segundo, un anticuerpo sucitado conlra rEbpS reconoce una proíeina 25 kDa expresada sobre la superficie celular de las células E. aureus. En adición para la similaridad del íamaño y reacíividad del aníicuerpo, mas evidencia que esía proíeina 25 kDa es la célula de superficie EbpS que es proporcionada por el experimento que muestra que el enlace de la proteina 25 kDa para el inmovilizado anti-rEbpS IgG es inhibida en la presencia del exceso no etiquetado rEbpS. Finalmente, Fragmentos Fab preparados del anticuerpo anfi-rEbpS, pero no de su conírol pre-inmune, inhibe el enlace de E. aureus a elasíina. Este resultado sugiere que la topología de superficie EbpS es tal que el sitio de enlace elastina es accesible para interactuar con ligandos ( es decir, elastina y el fragmento anfi-ri=bpS) y no inmerso en la pared celular o dominios membrana. E I compuesto de datos demuestra que EbpS es la proteina de célula de superficie responsible por el enlace E. aureus a elastina. Las determinaciones previas y presentes sugieren la existencia de un precursor intracelular funcionalmente activo 40 kDa de la EbpS que requiere que procese a la término-C anterior a la expresión de superficie. Esía noción eslá basada sobre las siguientes observaciones: I) existe una proíeina de enlace elasíina inlracelular de 40 kDa que nunca es detectada durante el experimento de etiquetado de la superficie celular, ii) las proíeinas de enlace elasíina 25 kDa y la 40 kDa tienen una secuencia ideníica terminal-N, y iii) existe un gene simple para EbpS. Porque el íamaño del marco de lecíura abierto ebps no es suficiente para codificar una proteina kDa, al principio los inventores desconsideraron esta hipótesis. No obstante, susestudios con rEbpS demosfraron que aunque el tamaño actual de la profeina recombinante es 26 kDa, ella migra aberrantemente como una proíeina 45kDa en SDS-30 PAGE. Esto que se determina sugiere que la longilud completa de la nativa EbpS, con un tamaño predicho de 23 kDa, puede ser que migre en SDS-PAGE como el precursor intracelular 40 kDa, y que la forma superficial 25 kDa de EbpS tenga actualmente una forma pequeña de la molécula procesada en el término-C. Aunque a EbpS le falta una señal péptido terminal-N y otras variedades conocidas y señales de anclaje, estos propusieron que un evento de proceso intracelular debe explicar alguna pregunta considerando como es apuntada la EbpS a la célula de superficie. En efecto, Un péptido de señal terminal-C ha sido identificado en varias proteinas bacteriales (Faíh.M.J. y Kolíer, R., Microbiol Rev. .,57.995-1017,1993) y medios alternativos de anclaje de proteinas a las células de superficie que han sido reportadas en bacteria gramo positiva (Yofher, J. y White, J.M., J. Bacteriol., 176:2976-2985,1994). r Usando traslapamiento de los fragmentos EbpS se mapéo al dominio terminal amino de la molécula (PCT/US97/03106). Traslapando péptidos sintéticos que dispersan amino ácidos 14-34 fueron usados entonces para definir mejor el dominio enlace. Mas de eso, péptidos que corresponden a residuos 14-23 y 18-34 específicamente inhibieron enlace elasíina por más de 95%. Común a iodos los péptidos activos sintéticos y proteoiíticos y fragmentos recombinantes de EbpS esta la secuencia examérica ^Thr-Asn-Ser-His-Gln-Asp23. Mas evidencia que esta secuencia es importante para el enlace elastina fue la pérdida de activida cuando Asp23 fue sustituido con Asn en el péptido sintético que corresponde aresiduos 18-34. Sin embargo, el hexamer sintético TNSHQD por el mismo no inhibe enlace esíafilococal a elastina. Estas determinaciones indican que aunque la presencia de la secuencia TNSHQD es esencial para la actividad de EbpS, que flanquea amino ácidos en la dirección de las terminales N- o C- y la cadena del lado carboxil de Asp23 son requeridas para el reconocimiento elastina.

VI. PROTEÍNAS ANÁLOGAS MHC II, (MAP) En adición al fibrinogeno, fibronecíina, colágeno y elastina, especies E.aureus asociadas con oirás proteinas eucarióticas adhesivas, muchas de las cuales pertenecen a la familia de proteinas de matriz adhesiva, tal como vitronectina (Chatwal et al., Infecí Immun., 55:1878-1883,1987). La patente U. S. 5,648,240 describe un segmento ADN que comprende un gen que codifica a un amplio espectro de adhesina de E. aureus tal que tiene un peso molecular de aproximadamente 70 kDa. La adhesina es capaz de enlazar fibronectina o vitronectina e incluye una MHC II simulando la unidad de aproximadamente 30 amino ácidos. Más análisis de las especificidades de enlace de esta proteina revelan que es funcionalmenle semejante a una MHC II antígeno en que ella enlaza pépíidos sintéticos. Entonces, en adición a la adhesión bacterial que media a las proteinas ECM, esto puede jugar un papel en las infecciones estafilococales por la supresión del sisíema inmune dei huésped. La patente además reclama un vector récombinaníe que ' incluye la secuencia especificada ADN, una célula huésped recombinánfe transformada con ai vector, y ADN el cual hibridíza con el ADN de la secuencia especificada. También, describió que es una composición que incluye una proteina o polipéptido codificado por la secuencia especificada ADN y un método de inducir una respuesía inmune en un animal que incluye la adminisíración de una composición inmunogénica que incluye la proíeina o poüpépíido codificado. Un método de hacer una proleina análoga aníígeno MHC ll que comprende los pasos de incertar la, secuencia especificada ADN en un vector de expresión adecuado y cultivar una célula huésped íransformada con el vector bajo condiciones para producir la proteina antígeno análoga MHC II. Está adicionalmente reclamado en la patente.

Vil. PROTEÍNAS SDR DE ESTAFILOCOCO EPIDERMIDIS Estafilococo epidermidis , una bacteria coagulasa-negativa, es un habitante común de la piel humana y frecuentemente causa infecciones de cuerpos extraños. La patogénesis es facilitada por la capacidad del organismo para adherirse primero a, y subsecuentemente para formar biopelículas sobre, dispositivos médicos inadecuados tal como válvulas artificiales , dispositivos ortopédicos, y catéteres de diálisis iníravenosos y peritoneales. Dispositivos relacionados a infecciones pueden arriesgar el éxito del tratamiento médico y significativamente incrementar la mortalidad de los • pacientes. Correspondientemente , la capacidad para desarrollar vacunas que puedan controlar o prevenir rompimientos de infecciones de E. epidermidis es de gran importancia, como es el desarrollo de vacunas multicomponenles que puedan prevenir o frater infecciones de un amplio especíro de bacterias, incluyendo ambas bacterias coagulasa-positiva y coagulasa-negativa al mismo tiempo. Tres proteinas (región de repetición serine-aspartate (SD)) que están expresadas por E. epidermidis han sido designadas como SdrF, SdrG, y SdrH, y las secuencias de amino ácido de esas proteinas y sus secuencias de ácido nucleico se muestran en las figuras 3-5, respectivamente. En adición, una descripción más completa de esas proteinas es suministrada en una soliciíud de paíeníe U. S. copendieníe de Fosfer eí al. La cual está basada sobre la solicitud provisional U. S. Nos. 60/098,443 y 60/117,119. Estas soliciíudes se incoforan adjunto por referencia. De acuerdo con la presenie invención, una composición útil como vacuna se proporciona que incluye las componentes de cualquiera de las modalidades de arriba en combinación con una proteina SdrF, SdrG, o una SdrH. En adición, los anticuerpos de esas proteinas pueden ser conseguidos usando medios convencionales, y anticuerpos de las proteinas SdrF, SdrG, o una SdrH se pueden emplear en cualquiera de las combinaciones de arriba las cuales emplean anticuerpos para las oirás adhesinas discutidas adjunto. Las composiciones y vacunas las cuales incluyen una proteina SDR fal como SdrF, SdrG, o SdrH puede entonces ser usada para tratar un amplio espectro de infecciones bacteriales, incluidos aquelos que surgen de ambas bacterias de coaguiasa positiva y coagulasa negativa.

VIII. COMPONENTES BACTERIALES En una modalidad de la invención, una composición es suminisírada y que incluye las componentes de cualquiera de las modalidades de arriba en combinación con una componente bacterial, preferiblemente polisacáridos capsulares lipo 5 o lipo 8, para incrementar la proporción de opzonización y fagositosis de E. aureus. El estafilococo contiene polisacáridos antigénicos, tal como polisacarida capsular tipo 5 o tipo 8, y proteinas también otras sustancias importantes en la estructura de pared celular. Peptidoglicán, un polisacárido polimérico que contiene subunidades enlazadas, proporciona el esqueleto rígido de la pered celular. El peptidoglicán es destruido por ácidos fuertes o expuesto a lizozima. Ello es importante en la' patogénesis de la infección. Ello provoca la producción de interleukin-1 (pirógeno endógeno) y anticuerpos opsónicos por monocitos. Puede ser chemoatractanle por leucocitos polimorfonucleares, tiene actividad parecida a la endotoxina, produce un fenómeno Shwartzman localizado, y activa el complemento. Ácidos teichoicos, ácido lipoíeichoico por ejemplo, los cuales son polímeros de glicerol o fosfato ribotol, están ligados al peptidolglican y puede ser antigénico. Anticuerpos antiteichoicos detectables por la difusión de gel puede ser encontrado en pacientes con endocarditis activa debido al E. aureus. La proíeina A es una componente de pared celular de muchas especies de E. aureus que enlazan a las porciones de moléculas Fc de IgG excepto lgG3. La porción Fab de IgG enlaza a la profeina A está libre para combinarse con un antígeno específico.

La proteina A es un reactivo importante en inmunología y tecnología de laboratorio de diagnóstico; por ejemplo, la proteina A con moléculas IgG adheridas y dirgidas contra un aníígeno bacterial específico aglutinará bacterias que tienen aquel anlígeno ("coaglutinación"). Algunas especies E. aureus fienen cápsulas, las cuales inhiben fagocitosis por leucocitos polimorfonucleares excepto que los anticuerpos específicos estén presentes. La mayoría de especies de E. aureus tienen coagulasa, o factor de pesadez, « sobre la superficie de pared celular; la coagulasa enlaza nonenzimáticamenle al fibrinógeno, produciendo agregación de la bacíeria. Estafilococo puede producir la muerte a través de su capacidad para multiplicarse y expanderse ampliamente en tejidos y a íravés de su producción de . muchas sustancias extracelulares. Algunas de esas sustancias son enzimas. Muchas de ' las toxinas esíán bajo el control genético de plasmidas; algunas pueden estar bajo ambos controles cromosomal y exíracromosomal; y para oirás el mecanismo de control genético no está bien definido. . A Catalasa: El estafilococo produce catalasa, la cual convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. La prueba de catalasa diferencia el estafilococo, el cual es positivo, del estreptococo, el cual es negativo. B. Coagulasa: E. aureus produce ccagulasa, una enzima parecida a la proteina que coagula plasma oxalatado o citratado en la presencia de un factor contenido en muchos sueros. El factor suero reacciona con coagulasa para generar ambas enterasa y actividades de coagulación, en una manera similar a la activación de proírombina a trombina. La acción de coagulasa evade la cascada de coágulos en el plasma normal. La coagulasa puede depositar fibrina sobre la superficie del estafilococo, quizá para alterar su ingestión por células fagocííicas o su desírucción con íales células. La producción de coagulasa es considerada sinónimo con potencial patogénico invasivo. Sin embargo, la bacíeria coagulasa negativa tal como E. epidermidis también posee una amenaza para serias infecciones . O Oirás Enzimas: Oirás enzimas producidas por estafilococo ¡ncluyen una hialuronidasa, o factor que esparce, una estafiloquinasa que resulía en fibrinólisis pero que acíúa mucho más lentamente que la estrepíoquinasa; proíeinasas, lipasas; ß-lacíamasa. D. Exoloxinas: Estas incluyen varias toxinas que son lefrales para los animales sobre su inyección, causa necrosis en la piel, y con íiene hemolisinas solubles las cuales pueden ser separadas por elecírofóresis. La toxina alfa (hemolisina) es una proteina heterogénea que puede fastidiar ertiírocííos y dañar plaquetas y es probablemente idéntica con los factores deexotoxína leíales y dermonecrólicos La alfa toxina también tiene un facíor potente de sobre músculos vasculares tersos. La beta toxir¡a degrada la esfingomielina y es tóxica para muchas clases de células. Esíae toxinas soii oirás dos, las toxinas gamma y delta; son antigenicamente disfintas y no poseen relación a las usinas estrepiococales. Las exotoxinas tratadas con formaüna dan un tóxoide ?o venenoso pero antigénico, pero este no es clínicamente útil. E. Leucocidin: Esla íoxin a de E. aureus puede matar células blancas expuestas de la sangre de muchos animales. Su papel en estafilococo patagónico puede no matar células blancas y puede serfagositosado tan efeclivamente como variedades no patogénicas. Sin embargo, ellas son capaces de variar la muy activa multiplicación ihtracelular, además ¡os organismos no patogénicos tienden a morir deníro de la célula. Anticuerpos para leucocidin pueden planear un papel en resistencia para infecciones estafilococales recurrentes. E Toxina Exfoliativa: Esta toxina de E. aureus incluye al menos dos proteinas que detienen la exfoliación generalizada del síndrome de piel escamada estafilococal. Anticuerpos específicos protegen contra la acción exfoliativa de la toxina.

G. Toxina del síndrome de conmoción tóxico. La mayoría de las especies de E. aureus aisladas de los pacientes con síndrome de conmoción tóxico producen una toxina llamada síndrome de conmoción tóxico toxina-1 (TSST-1), la cual es la misma como la enterotoxina F y exotoxina C pirogénica. TSST-1 es el superantígeno prototípico el cual promueve las manifestaciones de proteina del síndrome de conmoción tóxico. En humanos, la toxina está asociada con fiebre, conmoción, y multisisfemas envolventes, que incluyen un salpullido de la piel exfoliativo. En conejos, TSST-1 produce fiebre, susceptibilidad mejorada para los efectos de lipopolisacaridos bacteriales, y otros efectos biológicos similares al síndrome de conmoción tóxica, pero el salpullido de la piel y la exfoliación no ocurren. H. Enterotoxinas: Hay al menos seis toxinas solubles (A-F) producidas por cerca del 50% de las especies de E. aureus. Similares a TSST-1 , las enterotoxinas son superantígenos que enlazan a moléculas MHC clase II, produciendo estimulación de las células. T. Las enterotoxinas son estables ai palor, (resisten la ebullición por 30 minutos) y son . resistentes a la acción de las enzimas del intestino. Una causa importante del envenenamiento de la comida, las. enterotoxi?as son producidas cuando E. aureus crece en .carbohidratos y proteinas de las comidas. El gen para la producción de enteroloxina puede esíar sobre el cromosoma, pero una plasmida puede portar una proteina que regule la actividad de la producción de la toxina. La ingestión de 25 µg de enterotoxina B para humanos o monos resulta en vómito y diarrea. El efecto hemético de la enterotoxina es probablemente el resultado de la estimulación del sistema nerviosos central (centro de vómito) después que la toxina actúa sobre los receptores neurales en el intestino. Las eníeroíoxinas pueden ser ensalladas por pruebas de precipitación (difusión de ge!). Hay también otras muchas proteinas antigénicas producidas por organismos estafilococales. Estas incluyen las mencionadas arriba MSCRAMMs, tan bien como: la proíeina de enlace sialoproíeina del hueso, la proleina de enlace de racimo, proíeina de enlace sulfato heparina, proteina de enlace frombospodina, proteina de enlace frans terrina y proteina de enlace vitronecíina. E. aureus además expresa factores de virulencia íales como fofafidilfosfolipasa, y reguladores de expresión de íoxina tal como la proteina Rap.

IX. PROTEÍNAS Y PEPTIDOS CON HOMOLOGÍA SUSTANCIAL O FUNCIÓN EQUIVALENTE A AQUELLAS DESCRITAS ADJUNTO. Las composiciones descritas pueden incluir, como se desea, proteinas de secuencia completa, péptidos, fragmentos de proteinas o péptidos, epítopes aislados, proíeinas de fusión, o alguna alfeARNíiva la cual se enlaza al objeíivo ECM, si en la forma de una íipo silvesíre, un sitio mutanle dirigido, o una secuencia la cual es susfancialmente homologa a ella. Dos secuencias de ADN son "susíancialmeníe homologas" cuando al menos aproximadamente 70%, (prefriblemenfe al menos 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90 o 95%) de los nucléotidos se juntan sobre la longiíud definida de la secuencia de ADN. Secuencias que son sustancialmente homologas pueden ser identificadas por secuencias que usan software estandard adecuado en bancos de datos de secuencias, o en una hibrización hacia el sur bajo experimento, por ejemplo, condiciones esíringenles como las definidas por aquel sisíema particular. Que define las condiciones de apropiada hibridación que están dentro de los conocimientos de la técnica. Ver, es decir, Vols. I & II, supra; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982; ADN Cloníng.Vols I & II, supra; Nucleic Acid Hibridizalion, [B.D. Hames & S.J. Higginns eds. (1985)]. Cuando se usa en conjunción con las secuencias de amino ácido, el término "sustancialmenfe similar" significa una secuencia de amino ácido la cual no es idéntica a las secuencias publicadas, pero las cuales producen una proíeina que íiene la misma funcionalidad y actividades, cualquiera de las dos porque un amino ácido es reemplazado con otro amino ácido similar , o porque el cambio (si hay sustilución, supresión o inserción) no afecía susíancialmenfe el siíio activo de la proíeina. Dos secuencias de amino ácidos son "susfamcialmenle homologas" cuando al menos aproximadameníe 70%, (prefriblemenle al menos aproximadamente 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90 o 95%) de los amono ácidos que se juntan sobre la longitud definida de las secuencias. También se entenderá que cada una de las secuencias polipépíidos MSCRAMM de esía invención pueden ser parte de una proteina más larga. Por ejemplo, un polipéptido CIfA de esta invención pude ser fundido a su término-N o férmino-C para un pólipépíido ClfB, o a un polipéptido de enlace no-fibrinógeno o combinaciones de ellos. Polipéptidos los cuales pueden ser úíiles para éste propósito incluyen . potipépíidos derivados de cualquiera de las proíeinas MSCRAMM, y variantes seroíípicos de cualquiera de las de arriba. Polipépíidos no-MSCRAMM los cuales pueden ser úíiles para éste propósito incluyen alguna de las componentes bacteriales descriías arriba. Modificaciones y cambios se pueden hacer en la eslructura de los péplidos de la presente invención y segmentos de ADN los cuales los codifican y aún obtienen una molécula funcional que codifica a una proteina o péptido con características deseadas. Lo siguiente es una discusión basada en cambiar los amino ácidos de una proteina para crear una equivalente, o aún una mejorada, una molécula de segunda generación. Los cambios de amino ácidos se pueden lograr por cambiar los codones de la secuencia de ADN, de acuerdo a la tabla 1. Se entenderá por un experto en la técnica que los codones especificados en la labia 1 son para secuencias ARN. Los codones correspondientes para ADN tienen una T sustituida por U. Para mantenerla con la nomenclatura estándar (J. Biol. Chem., 243:3552-3559,1969), Se muestran además abreviaciones para residuos de amino ácido en la tabla 1.

Por ejemplo, ciertos amino ácidos pueden ser sustituidos por otros amino ácidos en una estructura de proteífia sin pérdida apreciable de capacidad de enlace con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de enlace antígeno de anticuerpos o sitios de enlace sobre sustratos de moléculas. Entonces ello es ia capacidad interactiva y naturaleza de una proteina que define que la actividad funcional biológica de las proteinas, ciertas sustituciones de secuencias de amino ácidos se pueden hacer en una secuencia de proteina, y, desde luego, es subyacente a la secuencia ADN que codifica, y siempre y cuando se obtenga una proteina con propiedades parecidas. Es entonces contemplado por los inventore que varios cambios se pueden hacer en las secuencias de péptidos de las composiciones descritas, o secuencias que corresponden al ADN el cual codifica dichos péptidos sin pérdida apreciable de su actividad o utilidad biológica. Tabla 1 Amino ácidos Codónes Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C. UGC UGU . Acido aspártico Asp D GAC GAU GAC GAU Acido glulámico Glu E GAA GAG Fenilanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GCG GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina lie I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG GUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptofan Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU En hacér teles cambios, el índice hidropáíico de los amino ácidos puede ser considerado. La importancia del índice hidropáíico de amino ácido en lo que confiere a ta función biológica interactiva sobre una proteina es entendida generalmente en la técnica (Kyíe and Dooiillle, J Mol Biol, 157(1): 105-132, 1982, se incorpora adjunto por referencia). Es aceptado que el carácter hidropáíicp relafivo.del amino ácido coníribuye a la estructura secundaria de la protéína resultante, la cual define en turno la interacción de la proteina con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sutratos, receptore, ADN, anticuerpos, aníígenos, y lo similar. A cada amino ácido le ha sido asignado un índice hídropáfico sobre ia base de su hidrofobicidad y características de carga (Kyíe and Dooliífle, supra 1982), esías son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilanina (+2.8); cisteina/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glisina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-.08); fripiofan (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glufamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspártele (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). Es conocido en la íécnica que ciertos amino ácidos pueden ser sulituidos por otros amino ácidos que tienen un índice hidropático similar o puntuación y aún resulta en una proteina con actividad biológica similar, es decir, aún se obtiene una proteina con funcionalidad biológica equivalente. En hacer tales cambios, la sustitución de amino ácidos cuyos índices hidropáficos preferidos esíán deniro de ±2, aquellos los cuales están "-' "* .~*r. dentro de ±1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de ±0.5 son aún más particularmente preferidos. Esto íambién es entendido en la íécnica que la susíilución de amino ácidos parecidos puede ser hecha efectivamente sobre la base de la hidrofilicidad.

La patente U.S. 4,554,101 , incorporada adjunto por referencia, establece que el promedio local más grande de hidrofilicidad de una proteina, es gobeARNdo por la hidrofilicidad de sus amíno ácidos adyacentes, que se correlaciona con una propiedad biológica de la proteina. Como se detalla en la Patente U.S. 4,554,101 , los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a residuos de amino ácido: arginina (+3.0); lisina (+1.0); aspart to (+3.0 ± 1); glutamaío (+3.0 ± 1); serina (+0.3); asparagina(+0.2); glutamina (+0.2);,gsicina (0); íreonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisleina (-1.0);' metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fénilanina (-2.5); íripíofan (-3.4). Es eníendido que un amino ácido puede ser sustituido por oíro qué tiene un valor similar de hidrofilicidad y aún se obíiene un equivalente biológicamente, y en particular, una proteina equivalente inmunológicamenfe. En íales cambios, la sustitución de amino ácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2 son preferidos, aquellos los cuales están dentro de ± 1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de ± 0.5 son aún más particularmente preferidos. Como es esbozado arriba, las sustituciones de amino ácidos están generalmente basados por lo íanío sobre la relativa similaridad de los amino ácidos sustífuyentes de cadena lateral, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga.famaño, y lo similar. Sustituciones ejemplificadoras las cuales toman varias de las características precedentes en consideración son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamafo y aspártelo; serina y freonina; glutamina - - a y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser químicamente sintetizados. Los polipépíidos sintéticos son preparados usando la bien conocida íécnica de la fase sólida, fase líquida, o técnicas de condensación de péptido, o cualquier combinación de ellos, puede incluir amino ácidos nalurales o no naturales. Los amino ácidos usados para la síntesis del péptido puede ser la resina amino ácido estándar Boc (Na-amino protegida Na-t-buti!oxycarbonil) con la desprotección estándar, neutralización, que acopla y lava protocolos del procedimiento de base sólida original de Merrifield [J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963)], o la base labil-Na-amino protegida 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) amino ácidos descritos primero por Carpino y Han [J. Org. Chem., 37:3403-3409 (1972)]. Ambos amino ácidos Fmoc y Boc Na-amino protegidos pueden, ser obtenidos de Fluka, , Bachem, Advanced Chemtec, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem, o Península Labs u otras compañías químicas familiares a aquellos que practican esta técnica. En adición, el método de la invención puede ser usado con otros Na-grupos que protegen que son familiares a aquellos expertos en la íécnica. La síntesis de péptidq en fase sólida puede ser lograda por técnicas familiares a aquellos expertos en la técnica y proporcionadas, por ejemplo, en Steward and Young, 1984, Solid Phase Syntesis, second edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Fields et al., Int. J. Pept. Protein ES. 35: 161-214 (1990), o usando sintetizadores automatizados, íales como los vendidos por ABS. Entonces, ios polipépíidos de la invención pueden comprender amino ácidos-D, una combinación de amino ácidos-D y -L, y varios amina ácidos "diseñados" (es decir, amino ácidos ß-melil, amino ácidos Ca-meíil, y amino ácidos Na-metil, etc.) para comunicar propiedades especiales. Los amino ácidos sintéticos incluyen ornitina para lisina, fluoro-fenilanina para fenilanina, y norleucina para leucina o isoleucina.

Adicionalmeníe, para asignar amino ácidos específicos a los pasos de acoplamiento específicos , helices-a, ß-vuelías, ß-planos, ß- vueltas, y pépíidos cíclicos que pueden ser generados. En una modalidad posterior, subunidades de péplidos que confieren utilidad química y propiedades esírucíurales serán elegidas. Por ejemplo, pépíidos que comprenden amino ácidos-D serán resistentes a los amino ácidos específicos-L proteasas in vivo. En adición, la presente invención avisora la preparación de pépíidos que fienen propiedades eslruclurales más bien definidas, y el uso de pepíidomiméticos, y enlaces peptidomíméticos, lales como enlaces esíer, para preparar péptidos con propiedades nuevas. En otra modalidad, un péptido puede generarse para que incorpore un enlace péptido reducido, es decir, R1-CH2-NH-R2, donde R-¡ y R2 son residuos de amino ácidos o secuencias. Un enlace péptido reducido pude ser introducido como una subunidad dipéptido. Tal molécula sería resistente a la hidrólisis de enlace péptido, es decir, actividad proteasa. Tales péptidos podrían proveer ligandos con una única función y actividad, tal como las medias vidas extendidas in vivo debido a la resistencia al rompimíeenfo metabólico, o actividad proteasa. Además, es bien conocido que en ciertos sistemas de pépíidos constriñidos muestran actividad funcional mejorada (Hruby, Life Science, 31:189-199 (1982)); (Hruby et al., Biochem J, 268:249-262 (1990)]. Los siguientes amino ácidos no-clásicos pueden ser incorporados en el péptido para introducir motivos conformacionales particulares: 1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolenina-3-carboxilato (Kazmiesrski et al., J. Am. Chem. Soo, 113:2275-2283,1991); (2S,3S)-metil-fenilanina,(2S,3R)-metil-fenilanina,(2R,3S) metil-fenilanina y (2R.3S) metil-fenilanina (Kazmierski and Hruby, Ttrahedron Lett., 1991); ácido 2-amínofetrahidro-naftaleno-2-carboxílico (Landis, Ph.D. Thesis, Universify of Arizona, 1989); hidroxy-1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato (Miyake et al, J. Takeda Res. Labs., 43:53-76,1989); ß-carbolina (D y L) (Kazmierskí, Ph,D. Thesis, University of Arizona., 1988); HIC (ácido hisíidina isoquinolina carboxílico) (Zechel eí al, Iní. J. Pep. a ir Proíein Res., 43, 1991); y HIC (urea hisíidina cíclica) (Dharanipragada). Los siguientes amino ácidos análogos y peplidomimélicos pueden ser incorporados en un pépíido para inducir o favorecer esírucluras secundrias específicas: LL-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidona-6-carboxílico), un dipéptido análogo que induce ß-vuellas [Kemp ef al., J. Org. Chem., 50:5834-5838(1985)]; análogos que inducen ß-planos [Kemp eí al., Tefrahedron Leít., 29:5081-5082(1988)]; análogos que inducen ß-vuelfas [Kemp ef al., Tefrahedron Leíf., 29:5057-5060(1988)]; análogos que inducen alpha-helix [Kemp eí al., Teírahedron Leíí., 29:4935-4938(1988)]; análogos que inducen ß-vuelías [Kemp eí al., J. Org. Chem., 54:109-115(1989)]; y análogos proporcionados por las siguientes referencias: Nagai and Salo, Teírahedron Lelí., 26:647-650(1985); DiMaio et al ., J. Chem. Soc. Perkin Trans., p. 1687 (1989); también un análogo vuelta Gly-Ala (Kahn eí al., Teírahedron Lett., 30:2317, 1989); amida de unión (Jones et al., Tetrahedron Lett, 29:3853-3856, 1989); tetrazol (Zabrocki et al., J. Am. Chem. Soc.m 110:5875-5880, 1988); DTC (Samanen et al., Int. J. Protein Pep. Res., 35:501-509, 1990); y análogos enseñados en Olson et al., (J. Am. Chem. Sci., 112:323-333, 1990) y Garvey .el al., (J. Org. Chem., 56:436, 1990). Mimélicos conformacionalmele resfringidos de beía-vuellas y beta-combas, y péptidos que los contienen están descritos en ia patente U.S. No. 5, 440, 013, otorgada el 8 de agosto de 1995 a Kahn.

X. USOS PARA MSCRAMM Y COMPOSICIONES DE ANTICUERPO Las composiciones de proteina descritas adjunto pueden ser usadas para el íralamienlo de heridas, para bloquear las proíeinas receptores o para inmunización (vacunación). En el último caso, el cuerpo crea anticuerpos específicos, los cuales puedenproteger coníra invación por especies que comprenden una proleina de célula superficial, y por lo cual los anticuerpos bloquean la adherencia de tas especies bacteriales a un tejido dañado. Las composiciones de proteinas pueden ser dispersados en una solución salina isotónica, estéril opcionalmente con la adición de un agente dispersante aceptable farmacéuticamente. Diferentes tipos de adyuvantes pueden además ser usados para apoyar la liberación en el tejido, y entonces exponer el péptido por un largo tiempo al sistema de defensa inmune de el cuerpo. Las proteinas, moléculas de ácido nucleico o anticuerpos son útiles por interferir con la interacción física inicial entre un patógeno y un huésped mamífero responsible por la infección, tal como la adhesión de bacteria, particularmente bacíeria gramo positiva, para proteinas de matriz extracelular en mamíferos sobre dispositivos inadecuados o para proteinas de matriz extracelular en heridas; para bloquear invasión de células en mamíferos de proteína mediada; para bloquear adhesión bacterial entre proteinas de matriz exlracelular en mamíferos y proteinas bacteriales que median el daño en el tejido; y, para bloquear la progresión normal de la patogénesis en oirás infecciones iniciadas que por la implantación de dispositivos inadecuados o técnicas de sirugía. Dispositivos médicos o biomateriales poliméricos para ser cubillos con los anticuerpos, proteinas y fragmentos activos descritos adjunto incluyen, pero no limitados a, grapas suturas, reemplazo de válvulas del corazón, dispoeitivos de asistencia cardiaca, lentes de contacto duros y blandos, implantes de lentes infraoculares (cámara anterior, cámara posterior o fásico), oíros implantes lales como incrustaciones corneales, keralo-proíesis, horquillas vasculares, dispositivos de epikeratofalia, desviaciones de glaucoma, grapas retínales, presillas esclerales, prótesis dénteles, dispositivos tiroplásíicos, dispositivos laringopláslicos, injertos wasculares, incluyendo próíesisde íejido suave y duro, pero no limilado a, bombas, dispositivos eléclricos incluyendo estimuladores y grabadores, prótesisde auditoría, marcapasos, laringe artificial, implantes dentales, implantes mamarios, implantes peniles, íendones cranio/faciales, articulaciones artificiales, tendones, ligamentos, meniscos, y discos, huesos artificiales, órganos artificiales incluyendo páncreas artificial, corazones artificiales, miembros artificiales, y válvulas del corazón; síenís (aparaíos moldeados), alambres, guias de alambres, catéteres intravenosos y venosos centrales, dispositivos laserm y globo de angioplastía, deisposiíivos vasculares y de corazón (íubos, catéteres, globos), asistencias veníricuíares, componentes de diálisis para sangre, oxigenadores de sangre, dispositivos uretrales/urelerales/urinarios ( catéteres Foley, stenís, íubos y globos), catéteres (lubos endoíraqueal y traqueoíomía y puños), íubos de alimeníación eníerales (incluyendo nasogástricos, intragásíricos y íubos yeuyenales), íubos de drenaje de heridas, tubos usados para drenar las cavidades del cuerpo tales como la pleural.cranial, y cavidades pericardiales, bolsas de sangre, tubos de prueba, tubos de colección de sangre, contenedores de vacunas, jeringas, agujas, pipetas, pipetas de punte, y eníubado de sangre. El término "cubierta" o "cubriendo" , como es usado adjunto, significa aplicar la protrina, el anticuerpo, o fragmentos activos a una superficie del dispositivo, preferiblemente una superficie exterior que podría ser expuesta a infección de E. aureus. La superficie del dispositivo no necesita estar enteramente cubierta por la profeina, anticuerpo o fragmento activo.

XI. PREPARACIÓN DE PROTEÍNAS, ADN,Y ANTICUERPOS El lector experto puede emplear biología molecular convencional, microbiología, y técnicas de ADN recombináníe para preparar las proíeinas, péptidos, y composiciones de anticuerpos descritos adjunto. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Ver, es decir, Sambrook et al, Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual (1989); Currení Protocols in Molecular Bioloqy Volumes l-ll (Ausubel, R. @-l ed., 1994); Cell Bioloav: A Laboraíory Handbook Volumes l-lll (J. E. Celis,ed,1994); Currení Proíocols in Immunology Volumes l-lll (Coligan, J. E. ed,1994); Oligonucleoíide Syntesis (M.J. Gail ed. 1984): Transcripíion and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture [R.l. Freshney, ed. 1 , (1986); Immobilized Cells and Enzimes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Clonina (1984).

' Referencias para aníicuerpos a fravés de ¡a descripción ¡ncluye anticuerpos completos policlonal y monoclonal, y partes de ellos, de uno en uno solos o conjugados con oirás porciones. Las partes de aníicuerpo incluyen Fab y F(ab)2 fragmentos y una cadena simple de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser hechos in vivo en animales de laboratorio adecuados o in viíro usando técnicas recombinántes de ADN. Un aníicuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un monoclonal. En una modalidad preferida, un anticuefo es un anticuefo policlonal, Medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en la técnica (ver,e.g. Harlow and Lañe, Antibodies: Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, NY, 1988). Brevemente, un anticuerpo policlonal es preparado por inrnuniozar un animal con un inmunógeno que comprende un polipépíido de la presente invención y juníar aníisuero de aquel animal inmunizado. Un amplio intervalo de especies animales se pueden usar para la producción de antisuero. Típicamente un animal usado para la producción de aníisuero es un conejo, un ratón, una rala, un hámster o un puerco de guinea. Por el relativamente grande volumen de sangre de los conejos, un conejo es preferido y seleccionado para la producción de anticuefos policlonales. Anticuerpos, ambos policlonal y monoclonal, específicos para epílopes MSCRAMM pueden ser preparados usando técnicas de inmunización convencional, también sera generalmente conocido para aquellos expertos en la técnica. Una composición que contiene epítopes antigenicos de enlace particular MSCRAMMs (cualquiera de los dos pépíidos sintéticos, sitio-específicamente mutado, o péptidos truncados) pueden ser usados para inmunizar uno o más animales experimentales, íal como un conejo o ratón, el cual entonces procederá a producir aníicuerpos específicos coníra pépíidos epííope- conteniendo MSCRAMM. El aníisuero policlonal puede ser obtenido, después del tiempo permitido para la generación del anticuerpo, simplemente por sangrar el animal y preparar las muestras de suero de la sangre entera. La caníidad de composición inmunógena usada en la producción de aníicuerpos policlonales varía acerca de la nafuraleza del inmunógeno, también como del animal usado para la inmunización. Una variedad de rutas se pueden usar para adminisírar el inmunógeno (subcuíanea, iníramuscular, ¡nlradermal, inlravenosa e inlraperiíoneal). La producción de aníicuerpos policlonales pueden ser monitoreados por muesíreo de la sangre de! animal inmunizado en varios punios siguiendo la inmunización. Una segunda, inyección de refuerzo , lambién se puede dar. El proceso de reforzamiento y titulación se repite hasta que un título adecuado es logrado. Cuando un nivel deseado de inmunogenicidad es obtenido, ei animal inmunizado puede ser sangrado y el suero aislado y almacenado. Una de las características importantes proporcionada por la presente invención es un suero poligonal que es relativamente homogéneo con respecto a la especifidad de los anticuerpos adjuntos. Típicamente, antisuero poligonal es derivado de una variedad de diferentes "clones", es decir, células-B de diferente linaje. Anticuerpos monoclonales, en contraste, están definidos como que vienen de células de producción de anticuerpo con un ancestro común célula-B, entonces su "mono" clonalidad. Cuando los péptidos son usados como aníígenos para producir suero policlonal , se esperan considerablemente menos variaciones en la naturaleza clonal del suer que si un antígeno entero fuera empleado. Infortunadamente, sí fragmentos incompletos de un epítope son presentados, el epífope puede muy bien considerar múliples conformaciones (y probablemente no-nativas). Como resulfado, aún péptidos cortos pueden producir antisuero policlonal con especificidades relativamente plurales y, infortunadamente, un antisuero que no reacciona o reacciona pobremente con la molécula nativa. El antisuero policlonal de acuerdo a la presente invención es producido contra péptidos que son predichos para comprender la totalidad, epífopes intactos. Se cree que esos epítopes son, por consiguiente, más esíables en un seníido inmunológico y entonces expresan un más consistente objetivo inmunológico para el sisíema inmune. Bajo este modelo, el número de clones potenciales células-B que responderán a éste, péplido es considerablemente más pequeño y, entonces, la homogeneidad del suero resulfaníeserá más alto. En varias modalidades, la presente invención proporciona para aníisuero policlonal donde la clonalidad, es decir, el porceníaje de clones que reaccionan cort el mismo determinante molecular, es al menos 80%. Aún clonalidad más alta-90%, 95% o más grande- esíá contemplada. " - Pra obtener anticuerpos monoclonales, uno también iniciaimente inmuniza un animal experimental, Algunas veces preferiblemente un ratón, con una composición que contiene un epítope MSCRAMM-derivado. Uno entonces, después de un periodo de tiempo suficiente para permitir la generación dei aníicuerpo, obtiene una población del bazo del animal o células Lymph. El bazo o células Lymph esíán entonces fusionadas con líneas de células, tales como humanas o especies myeloma de ratón, para producir anticuerpos que secretan hibridomas. Estos hibridomas pueden ser aislados para obtener clones individuales los cuales pueden entonces ser checados por la producción de anticuerpos para un péptido deseado. Siguiendo la inmunización, las células del bazo son removidas y fusionadas, usando un protocolo estándar de fusión con células de plasmacitoma para producir hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales contra epífopes derivados MSCRAMM. Hibridomas las cuales producen anficuerpos monoclonales para los antigenos seleccionados son ideníificados usando técnicas estándar, íales como ELISA y métodos de ocultar hacia el oeste. Los clones de hibridoma pueden ser entonces cultivados en medios líquidos y el cultivo unificado de supeARNtantes para proporcionar anticuerpos monoclonales de epítope específico derivado de MSCRAMM. El anticuerpo inmortal producido por las lineas de células puede ser creado por ofras técnicas que las de fusión, tal como transformación directa de los linfocitos B con ADN oncogénico, o íransfección con el virus Epstein-Barr. Ver, es decir, M. Schreier el al., Hibrydoma Techniques (1980); Hammerling eí al., Monoclonal Aníibodies And T-Cell Hybridomas (1981); Kennet et al., Monoclonal Antibodies (1980); ver también las patentes U.S. Nos. 4,341 ,761; 4,399,721 ; 4,427,783; 4,444,887; 4,451 ,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491 ,632; 4,493,890. Es propuesto que los anticuerpos monoclonales de la presente invención determinarán aplicaciones útiles en procedimientos inmunoquímicos estándar, tales como ELISA y métodos de ocultar hacia el oeste, también como otros procedimientos los cuales pueden utilizar anticuerpo específico de epítopes MSCRAMM. Aüicionalmente, es propuesto que los anticuerpos específicos monoclonales para el particular MSCRAMM derivado los péplidos pueden ser utilizados en otras aplicaciones útiles. Por ejemplo, su uso en protocolos inmunoabsorventes puede ser útil en purificar especies de pépíido recombinanfe o nativo o variantes siníeficas o naíurales de ellos. En general, ambos anticuefos poli y monoclonal contra estos pépíidos puede ser usado en una variedad de modalidades. Por ejemplo, ellos pueden ser empleados en protocolos que clonan aníicuerpos para obtener cADNs o genes que codifican los péplidos discutidos adjunto o proteinas relacionadas. Ellos lambién pueden ser usados en estudios de inhibición para analizar los efectos de los péptidos MSCRAMM derivados en células o animales. Los anticuerpos epítope anti-MSCRAMMs también serán útiles en estudios de inmunolocalización para analizar la distribición de MSCRAMMs durante varios eventos celulares, por ejemplo, para determinar la distribución celular o tejido específico de los péptidos MSCRAMM bajo diferentes condiciones fisiológicas. Una aplicación particularmente útil de tales anticuerpos esta en la purificación de MSCRAMMs nativas o recombinantes, por ejemplo, usando una columna de afinidad de anticuerpo. La operación de todas las técnicas inmunológicas será conocida por aquellos expertos en ia técnica a la luz de la presente descripción. Técnicas para la producción de una cadena simple de anticuerpos es conocida por aquellos expertos en la técnica y descrila en la patente U.S. No.4,946J78 y puede ser usada para produycir cadenas simples de aníicuefos para las proleinas descriías adjunto. La tecnología de exibición de devorador puede ser usada para seleccionar genes de aníicuerpo que tienen enlace, actividades para MSCRAMMs. o porciones antigénicas de ellas, de ¡os linfocitos de genes v PCR-amplificado de humanos protegidos por tener anticuerpos para MSCRAMMs o colecciones inluifivas. Aníicuerpos biespecíficos que tienen dos dominios de enlace antígeno de donde cada uno de los dominios eslá dirigido conlra un epííope diferente. El anticuerpo puede ser etiqueíado directamente con una etiquete detectable por identificación y cuantificación de una bacteria esfafilococa! tal como E. Aureus. Etiquetas para usar en inmunoensayos son generalmeníe conicidas por aquellos expertos en la técnica e incliyen enzimas, radioisótopos, y suslancias fluoreceníes, luminiceníes y cromogénicas que incluyen partículas coloreadas tales como oro coloidal y glóbulos de látex. Inmunoensayos adecuados incluyen ensayos inmunoabsorvenles de enzima ligada (ELISA). Alternativamente, el aníicuerpo puede ser etiquetado indirectamente por reacción con las sustancias etiquetadas que tienen una afinidad para inmunoglobulína, tai como proteina A o G ó segundos anticuerpos. El anticuerpo puede ser conjugado como una segunda sustancia y detectado con una tercera sustencia eliqueíada que tiene una afinidad para la segunda sustancia conjugada al aníicuerpo. Por ejemplo, el anticuefo puede ser conjugado con bioíina y el anticuerpo biotina conjugado detectado usando etiquetado avidina o eslreptavidina. Similarmente, el aníicuerpo puede ser conjugado con un hapíeno y el anticuerpo hapfeno conjugado delectado usando etiquetado anticuerpo anti-hapteno. Estos y otros métodos de etiquetar anticuerpos y ensayos conjugados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Anticuerpos para las proteinas de enlace pueden ser usados en la producción de comodidades o laboratorios para aislar cantidades adicionales de la proteina, tal como por afinidad cromatográfica. En general, la preparación de anticuerpos biespecíficos es también bien conocida en la técnica, como es ejemplificado por Glennie et al. (J. Immunol, 139:2367-2375,1987). Los anticuerpos biespecíficos han sido empleados clínicamente, pot ejemplo, para tratar pacientes con cáncer (Bauer et al, Vox Sang, 61 :156-157,1991). Un método para la preparación de anticuerpos biespecíficos involucra la preparación separada de anticuerpos que tienen especificidad para diferentes epítopes de uno o mas dominios de enlace fibroneíina de una o mas proteinas de enlace fibronetina. Mientras que numerosos métodos son conocidos en la técnica para la preparación de anticuerpos biespecíficos, el método de Glennie et el., (1987 supra) involucra la preparación de fragmentos pépticos F(ab'Y)2 de dos anticuerpos seleccionados, seguido por la redfucción d© cada uno de los fragmentos proporcionados y separados F ab'YSH. Los grupos SH sobre uno de los dos compañeros tiene que ser acoplado y entonces aquilatado con un reaccionante de enlace cruzado tal como o-fenilenedimaleimida para proporcionar grupos libres maleiminda sobre un compañero. Este comañero puede entonces ser conjugado con el otro por medio de un enlace tioter, para obtener el heteroconjugado deseado F(ab'Y)2.

Debido a la facilidad de preparación, la alta docilidad y reproductibilidad, el método de Glennie et al., (1987 supra) es algunas veces preferido para la preparación de anticuerpos biespecíficos, sin embargo, hay otras numerosas aproximaciones que pueden ser empleadas y que son avistadas por los inventores. Por ejemplo, otras técnicas son conocidas en donde el enlace cruzado con SPDP o proteina A se lleva a cabo, o una construcción específica es preparada (Titus et al, J. Immunol., 138:4018-4022,1987; Tutt et al, Eur J. Immunol, 21 :1351-1358,1991). Otro método de producir anticuerpos biespecíficos es por la fusión de dos hibridomas para formar un cuadroma (Flavell et al, Br. J. Cancer,64(2):274- 280,1991 ;Pimm et al, J. Cáncer Res Clin Qncol, 118:367-370, 1992;french et al, Cáncer Res, 51:2358-2361,1991 ;Embleton et al., Br. J. Cáncer, 63(5):670-674,1991). Como se usa adjunto, el término "cuadroma" se usa para describir la fusión prodictiva de dos células B hibridomas. Usando ahora técnicas estándar, dos anticuerpos que producen hibridomas son fundidos para dar células hijas, y aquellas células que han mantenido la • expresión de ambos conjuntos de genes inmunoglobulina clonotipo son entonces seleccionadas. Un método preferido de generación de un cuadroma involucra la selección de una enzima mutante deficiente de al menos uno de los hibridomas padres. Esta primera linea de célula hibridoma mutante es entonces fundida a células de un segundo hibridoma que ha sido expuesto letalmente, es decir, a la yodoacetamida, imposibililando su sobrevivencia continuada. La fusión de células permite el rescate del primer hibridoma • por ¡a adquisición del gen para su deficiencia de enzima de el hibridoma letalmente tralado, y el rescate del segundo hibridoma a través de la fusión del primer hibridoma. Preferida, pero no requerida, es la fusión de inmunoglobulinas del primer isotipo, pero de una subclase diferente. Una subclase de anticuerpo mezclada permite el uso de un ensayo alteARNíivo para el aislamiento de un cuadroma preferido.

En mas detalle, un método de desarrollo y separación de cuadroma involucra obtener una linea de ibridoma que secreta la primer mAb seleccionada y hace esto deficiente para la enzima metabólica esencial, hipoxantina-guanina.fosforibosiilransferasa(HGPRT). Para obtener muíanles deficientes de la hibridoma, las células son cultivadas en la presencia de concentraciones que se incrementan de 8-azaguanina(1x107 M a 1x10"5 M). Las mutantes son subclonadas por dilución limitante y probadas por su sencibilidad a hipoxantina/aminopterina/timidina(HAT). El medio de cultivo puede consistir de, por ejemplo, DMEM suplementado con 10% de FCS, 2 mM L-Glutamina y 1 mM penicilina-estreptomicina. Una línea de célula hibridoma complementeria que produce la segunda Mab deseada es usada para generar los cuadromas por las técnicas de fusión de células estándar (Gaifre et al, Methods EnzymolJ3:1-46,1981 ),o por usar el protocolo descrito por Clark et al (Int J. Cáncer, 2:15-17,1988). Brevemente, 4.5x107 HAT-sensitivas (as ppmeras células son mezcladas con 2.8x sal neutralizadora fosfato por 30 minutos sobre hielo antes de la fusión. La fusión de células es inducida usando un polietileno gücoi(PEG) y ias células son colocadas en el pozo 96 de las placas de microcultivo. Los cuadromas son seleccionados usando un medio que contiene Hat. Los cultivos que contienen anticuerpo biespecífico son identificados usando, por ejemplo, una fase solida isoiipo específica ELISA y un isotipo específico de inmunofluorescencia que decolora. En una modalidad de identificación para identificar el anticuerpo biespecífico, los pozos o placas microlitro ? (Falcon, Becton Dickinson Labware) son cubiertas con un reaccionante que interactua específicamente con uno de los anticuerpos hibridoma padre y que quita la reactividad cruzada con ambos anticuerpos. Las placas son lavadas, bloqueadas, y las superflotantes(SNs)tienen que ser probadas y adicionadas a cada uno de los pozos. Las placas son incubadas a la temperatura ambiente por dos horas, los superflotantes descartados, las placas lavadas, y un anti-anticuerpo fosfalasa alcalino diluido conjugado es agregado por 2 horas a la íemperaíura ambieníe. Las placas son lavadas y un substrato de fosfatasa, es decir, fosfatasa p-Nitrofenil (Sigma, St Louis) es agregada a cada pozo. Las placas son incubadas, 3N NaOH es agregada a cada pozo para detener la reacción y los valores OD410 determinados usando un lector ELISA. En oíra modalidad de ideníificación, las placas microliíro preíraíadas con poli-L-lisina son usadas para enlazar una de las células objeíivo a cada uno de los pozos, las células son entonces fijadas, es decir, usando 1 % de gluíaraldheido, y los anticuerpos biespecíficos son probados por su capacidad para enlazar a las células intactas. En adición, FACS, inmunofluorescencia que decolora, aníicuerpos específicos idiotipo, ensayos de competencia de enlace aníigeno, y oíros métodos comunes en la caracterización de aníicuerpos se pueden usar en conjunción con la presente invensión para identificar cuadromas preferidos. Siguiendo el aislamiento del cuadroma, ios anticuerpos biespecíficos son purificados lejos de otras células producto. Esto puede ser conseguido por una variedad de? procedimientos de aislamiento de proíeinas, conocidos por aquellos expertos en la técnica de purificación de ¡nmunoglobulina. Medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bein conocidos en la íécnica (Ver, es decir, aníicuerpos: A Laboraíory Manual, 1988). Por ejemplo, los superfloíaníes de cuadroma seleccionados son pasados sobre columnas de proleina A ó proleina G sefarosa para enlazar IgG (dependiendo del isptipo). Los enlaces de anticuerpos son entonces extraídos con, es decir, un pH 5.0 citrato neutralizado. Las fracciones extraídas que contienen el BsAbs, son dializadas contra un neutralizador ¡sotonico. AlteARNtivamente, la extracción es también pasada sobre una columna anti-inmunoglobulina-sefarosa. La BsAbs es entonces exíraida con 3.5M de magnesio clorado. La BsAbs purificada de esta manera es entonces probada por la acíividad de enlace por, es decir, un ensayo de isoíipo específico ELISA e inmunofluorescencia que destiñe de las células objetivo, como se describe arriba. La BsAbs purificada y anticuerpos padres pueden ser caracterizados e aislados por electroforesis SDS PAGE, seguida por teñido con plata o Coomassie. Esto es posible cuando uno de los anticuefos padres tiene un mas alto peso molecular que el oíro, de donde la banda de la BsAbs migra a la mitad eníre los dos anticuerpos padres. La reducción de las muesíras verifica la presencia de cadenas fuertes con dos pesos moleculares aparentes diferentes. Ademas, la tecnología recombinante esta ahora disponible para la preparación de aníicuerpos en general permitiendo la preparación de genes de anticuerpos recombinantes que codifican un aníicuerpo que íiene la especificidad dual deseada (Van Duk et al. Int. J Cáncer, 43:344-349,1989). Entonces, después de seleccionar los anficuefos monoclonales que tienen las mas preferidas caracterisíicas de enlace, los genes respecíivos de esos aníicuerpos pueden ser aislados, es decir, por. oculíamienío inmunological de una colección de expresión de devorador (Oi and Morrison, 1986; Winter and Milsíein, 1991). Entonces, por medio del rearreglo del Fab- que codifica dominios, la consírucción quimérica apropiada puede ser fácilmente obtenida. Los aníicuefos monoclonales humanizados son anticuerpos de origen animal que han sido modificados. Usando técnicas de ingeniería genética para reemplazar regiones constantes y/o regiones variables de marcos de secuencias con secuencias humanas, mieníras que se retiene la especificidad de antígeno original. Tales anticuerpos son cumunmente derivados de aníicuerpos de roedores con especificidad en conlra de los aníígenos humanos. Tales aníicuerpos son generalmente úíiles para aplicaciones terapéuticas in vivo. Esía estrategia reduce la respuesta del huésped al aníicuerpo eslraño y permite la selección de funciones eficaces humanas.

Las técnicas para producir inmunoglobulinas humanizadas son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo la patente U. S. No.5, 693,762 describe métodos para producir, y composiciones de, inmunoglobulinas humanizadas que tienen una o mas regiones que determinan complementaridad (CDR's). Cuando son combinadas deniro de un anticuerpo intacto las inmunoglobulinas humanizadas son sustancialmente no inmunogénicas en humanos y retienen sustancialmeníe la misma afinidad como los donadores inmunoglobulina para el aníígeno, lal como una proteina u otro compuesto que contiene un epítope. Otras patentes U.S. , cada una incorporada junto por referencia, que enseña la producción de anticuerpos útiles en la presente invención patente U.S. No.5,565,332, la cual describe la producción de anticuerpos quiméricos usando una aproximación combinaforial; 4,81.6,567.1a cual describe preparaciones inmunoglobulina recombinante y 4,867,567 la cual describe agentes aníicuerpo terapéuticos conjugados. La paíeníe U.S. 5,565,332 describe métodos para la producción de anticuerpos, o fragmentos de anticuefo, los cuales tienen ia misma especificidad de enlace como un anticuerpo padre pero los cuales tienen las caracteristicas humanas incrementadas. Los anticuerpos humanizados pueden ser obtenidas por cadenas que se arraslran quiza usando tecnología de exposición de devorador, en tantos métodos como será útil en la presente invención el texto entero de la patente U.S. 5,565,332 es incorporada adjunto por referencia. Usando los aníígenos péptido descritos adjunto, la presente invención íambién proporciona métodos de generar una respuesta inmune, cuyos métodos generalmente comprenden la adminisíración a un animal, de una composición farmacéuticamente acepíable que comprende una caníidad efectiva inmunologicamenle de una composición de pépíido MSCRAMM-derivado. Los animales preferidos incluyen mamíferos, y particularmente humanos. Oíros animales preferidos incluye a los marinos, 5 bovinos, equinos, porcinos, caninos, y felinos. La composición puede incluir parcialmente o significantemente epítopes péplido MSCRAMM-derivada purificada, obtenida de fuentes naturales o recombinaníes, cuyas proíeinas o pépfidos pueden ser naluralmente obtenibles o químicamente sintetizados o cualquiera de los dos, o alteARNlivamenle producido in viíro de células huésped recombinaníes que expresan segmentos de ADN que codifican íales epítopes. Los péptidos mas pequeños que incluyen epííopes reactivos, tales como aquellos entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100 amino ácidos de longitud algunas veces serán preferidos. Las proteinas antigénicas o péptidos pueden ser combinados con oíros agentes tales como otro pépfido estrepfococal ó estafilococal ó composiciones de ácido nucleico, si se desea. La composición puede también incluir estafilicoco producido por componentes bacteriales fales como aquellas discutidas arriba, obtenidas de fuentes . recombinantes o naturales, cuyas proteinas pueden ser naíuralmenfe obtenibles químicamente ' sintetizadas o cualquiera de lae dos. o 1 alternativamente producidas ¡n vitro de células huésped recombinantes que expresan segmentos de ADN que' codifican tales péptidos. Inmunoformulaciones de esta invención, si es pretendida para vacunación, íraíamienío, de la generación de anticuerpos uíiles en la detección de estafilococo y esírepíococo, o prevención de adhesión bacterial a las componentes ECM tales como fibronectina, colágeno, elastina, fibrinógeno ó viíronectina pueden comprender sitios específicamente mutados, truncados, o fragmentos de pépíido aníigénico Stníélicameníe derivado de esas profeinas. Tal como, equivalentes funcionales aníigenicos de las proíeinas y pépfidos descritos adjunto íambién caen deníro de! alcance de la presente invención. Más medios contemplados por los inventores para generar una respuesfa inmune en un animal incluye la administración al animal, o sujeto humano, de una composición aceplable farmacéuíicameníe que comprende una caníidad efectiva inmunologicamenfe de una composición de ácido nucleico que codifica a un epííope péplido, o una cantidad efectiva inmunológicamente de un organismo vivo atenuado que incliye y expresa lales composiciones de ácido nucleico. La caníidad de ADN expresable o transcrito ARN para ser introducido dentro del recipiente de la vacuna tendrá un amplio intervalo de dosis y puiede depender sobre la solidez de ios promotores usados transcripcional y traslacionai. En adición, la magnitud de la respuesta inmune puede depender sobre el nivel de expresión de la proteina y sobre la inmunogenisidad del producto genético expresado En general, el intervalo de dosis efectivo de aproximadamente 1 ng a 5 mg, 100 ng a 2.5 mg, 1µg a 750 µg, y preferiblemente aproximadamente 10 µg a 300 µg de ADN es administrado directamente dentro de! tejido muscular. La inyección subcutánea, introducción intradermal, impresión a íravés de la piel, y oíros modos de adminisíración tal como intraperitonial, intravenosa, o entrega por inhalación son también adecuados. Ello es también contemplado que las vacunaciones de refuerzo pueden ser proporcionadas. Siguiendo la vacunación con un inmunógeno polinucieótido MSCRAMM, reforzando con proteina MSCRAMM inmunógenas tales como el producto genético M55 es también comtemplado. El polinucléotido puede ser "desnudado", que esta, no asociado con ninguna proteina, adyuvantes u otros agentes los cuales afectan a los sistemas inmunorecipienfes. En este caso, es deseables para el polinucléotido esfar un una solución aceptable fisiológicamente, tel como, pero no limiíada a, salina eslerií o salina de salvaguarda esleril. Alternativamente, el ADN puede estar asociado con liposomas, tales como liposomas lesitina y otros liposomas conocidos en la íécnica como una mezcla liposoma-ADN, o el ADN pueder estar asociado con un adyuvante conocido en la técnica para estimular las repuestas inmunes, fal como una proleina u olro portador. Agentes los cuales asisten en el entendimiento celular del ADN, tal como, pero no limitados a, iones de calcio, pueden también ser usados. Estos agentes están generalmente referidos adjunto como reaccionantes que facilitan la transfección y portadores aceptebles farmacéuticamente. Técnicas para la capa que cubre los microproyecfiles con polinucléotidos conocidos en la técnica son lambién útiles en conexión con esta invención. Para el ADN pretendido para uso humano puede ser útil tener el producto final ADN en un portador aceptable farmacéuticamente o solución neutra. Portadores aceptables farmacéuticamente o soluciones neutras son conocidos en la técnica e incluyen aquellos descritos en una variedad de textos tal como Remington's Pharmaceutical Sciences. En otra modalidad, la invención es un polinucléotido el cual comprende secuencias contiguas de ácido nucleico capaz de ser expresado para producir u producto genético tras ia introducción de dicho polinucléotido dentro de tejidos eucarióíicos in vivo. El producto genético codificado preferiblemente actúa como un ir.munoestimular.le o como un antígeno capaz de generar una respuesta inmune o cualquiera de las dos. Entonces, ias secuencias de ácido nucleico en esta modalidad codifican un epítope ínmunogenético MSCRAMM, y opcionalmente una citoquina o un elemento coestimulatorio célula-T, tal como un miembro de la familia de proteinas B7. Hay varias ventajas de inmunización con un gen preferido a su producto genético. El primero es de relativa simplicidad con el cua! en aníígeno nativo o cercanamente nativo puede ser presentado al sistema inmune. Las proteinas de los mamíferos expresadas recombinantemente en bacteria, levadura, o aún células de mamíferos que a veces requieren un extensivo tratamiento para asegurar una apropiada antigenicídad. Una segunda ventaja de Is inmunización de ADN es el potencia! para el inmunógeno para enírar a la írayectoria de la clase I de MHC y evocar una respuesía ciíoíóxica de célula T. La inmunización de ratones con ADN que codifica la influenza A 7 nucleoproteina (NP) provoca una respuesta a un CD8+ para el NP que protege a los ratones contra la competencia con especies de flu heterólogas, (Montgomery, D.L. ef al., Cell Mol Biol, 43(3):2 85-292,1997;Ulmer, J. Ef al., Vaccine, 15(8):792-794,1997). La inmunidad de célula mediada es importante para confrolar la infección. Desde que la inmunización de ADN puede evocar ambas respuesfas humoral y célula mediada, su ventaja mas grande puede ser aquella que proporciona un método relaíivameeníe simple para que sobrevivan un numero grande de genes de E. Aureus para su vacuna potencial. La inmunización por inyección de ADN lambién permite la reunión fácil de subunidades de vacunas multicomponentes. La inmunización simultanea con genes de influenza múltiple han sido reportados recientemente. (Donnelly, J. et al., Vaccines., 55-59,1994). La inclusión en una vacuna de E. Aureus de genes cuyos productos acíivan una variedad y respuestas múltiples del sistema inmune puede fambién proporcionar una protección completa de competencia subsecuente. Además proporciona una composición que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que. codifica a un pépfido de un dominio de enlace, de donde el pépíido hace o no hace específicamente el enlace con sus ligandos. Ello es también contemplado que los organismos atenuados pueden ser consíruidos para expresar productos genéticos recombinantes MSCRAMM y ellos mismos ser vehículos de enlrega para la invención. Particularmente preferidas son las especies bacteriales atenuadas fal como Mycobacterium, y en particular M bovis, M smegmaíis, ó BCG. Alternativamente, pox-, polio-, adeno-, u otros virus, y bacterias íales como especies Salmonella, Shigella, Listeria, Estreptococo pueden también ser usadas en conjunción con los métodos y composiciones descritas adjuntó. La tecnología del ADN desnudo, algunas veces referida como inmunización genética, se ha mosírado que es adecuado para la protección contra organismos infecciosos. Tales como segmentos de ADN que podrían ser usados en una variedad de formas que incluyen ADN desnudo y plasmidas ADN, y pueden ser administradas al sujeto en una variedad de formas que incluyen parental, mucosal, e inoculaciones también llamadas "cañón de genes" basadas en microproyecliles. El uso de composiciones de ácido nucleico de la presenie invención en lales técnicas de inmunización se propone entonces para ser útil como una estrategia de vacunación contra aí menos las infecciones esfrepíococal y esíafilococal. Es reconocido por aquellos expertos en la técnica que un programa de dosificación óptima de un régimen de vacunación de ADN puede incluir muchas o de cinco a seis, pero preferiblemente tres a cinco, o aún mas preferiblemente de una a tres administraciones de la entidad dada que inmuniza a los intervalos de cómo dos a cuatro semanas, hasía ten largo como de cinco a diez años, u ocacionalmeníe a intervalos aún mas largos. Aspectos particulares - de la invención conciernen el uso de vectores plasmida para la clonación y expresión de pépfidos recombinantes y en particular pépíidos epítopes que comprenden ambos nativos, o sitio específicamente mutado de enlace de sitios epítopes. La generación de vectores recombinanles, la transformación de. células huésped, y la expresión de proteinas recombinantes es bien conocida por aquellos expertos en la técnica. Los huéspedes procarióticos son preferidos para la expresión de las composiciones de péplido de la presenie invención. Un ejemplo de un huésped procariótico preferido es E. Coli , y en particular, especies de E. coli ATCC 69791, BL21 (DE3), JMIOI, XL1-Blue™, RRI, LE392, B, ?776(ATCC31537), y W3110(F, ?, profoíropico, ATCC273325). Alternativamente, otras especies Enterobacteriaceae tal como Salmonella typhymurium y Serratia marcescens, o aún otros huéspedes gramo negativos que incluyen varias especies Pseudomonas que pueden ser usadas en la expresión recombinante de las construcciones genéticas discutidas adjunto. Huéspedes adicionales pueden incluir los bien conocidos huéspedes eucarióíica y procarióíica, fal como especies de Bacillus, Sfrepíomyces, hongos íales como levaduras, y células animales, íal como células CHO, R1.1 , B-W y L-M, células de riñon de mono verde africano (es decir, COS 1 , COS 7, BSC1 , BSC40, y BMT10), células de insecto (es decir, Sf9), y células humanas y células de plantas en cultivo de íejido. Una amplia variedad de combinaciones de vectores de expresión huésped pueden ser empleados en la expresión del ADN. Vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir de segmentos de secuencias de ADN cromosomal, no-cromosomal y sintéticas. Vectores adecuados que incluyen derivados de SV40 y plasmidas bacteriales conocidas. Es decir, plasmidas E. coli col E1 , pCR1 , pBR322, pMB9 y sus derivados, plasmidas tales como RP4; ADNs devoradoras, es decir los numerosos derivados de ? devorador, es decir, NM989, y otro ADN devorador, es decir, M13 y filamentos individuales de ADN devorador trenzado; plasmidas de levadura tal como ia plasmida 2µ o derivados de ella; vectores útiles en células eucarióticas, tal como vectores útiles en células de insectos o mamíferos; vectores derivados de combinaciones de plasmidas y ADNs devoradoras, tal como plasmidas que han sido modificadas para emplear ADN devorador u oirás secuencias de confrol dp expresión; y lo similar. Como es bien conocido en la técnica, las secuencias de ADN pueden ser expresadas por secuencias de expresión de control que operativamente las une en un vector de expresión apropiado y que emplea aquel vector de expresión para transformar un huésped unicelular apropiado. Tal operativo de unión de ecuencias de ADN de esta invención a una secuencia de control de expresión, desde luego, incluye, si la secuencia ya no es parte del ADN, la provisión de un codón de iniciación, ATG, en el marco correcto de lectura aguas arriba de la secuencia de ADN. Cualquiera de la amplia variedad de secuencias de control de expresión- -secuencias que conírolan la expresión de una secuencia de ADN operativamente unida a él- puede ser usado en esos vectores para expresar la secuencia de ADN de esta invención. Tal secuencia de control de expresión incluye, por ejemplo, los promotores temprano y íardio de SV40, CMV, vaccinia, polioma ó adenovirus, el sisíema lac, el sisíema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, el mayor operador y promotor de regiones del devorador ?, el confrol de regiones de la proteina cubierta fd, el promotor para 3-fosfo-gliceraío quinasa u oirás enzimas glicolílicas, los promotores de ácido fosfatasa (es decir, Pho5), los promotores de levadura factores de apareamiento-a, y oirás secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y varias combinaciones de ellas. Se entenderá que no todos los vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes funcionarán igualmente bien para expresar las. secuencias de ÁDN de esta invención. Tampoco todos los huéspedes funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en ia técnica sera capaz, se seleccionar los vectores propios, secuencias de control de expresión, y huéspedes sin éxperimeníación excesiva para conseguir la expresión deseada sin salir del alcance de esía invención. Por ejemplo, en un vector que selecciona, el huésped debe ser considerado porque el vector debe ser función de é¡. El número copia del vector, la capacidad para controlar aquel número copia, y la expresión de cualquiera otras proteinas codificadas por ei vector, tal como un marcador antibiótico, íambién será considerado. Én seleccionar una secuencia de conírol de expresión, una variedad de factores normalmente serán considerados. Esto incluye, por ejemplo, la relativa solidez del sislema, su confrolabilidad, y su compatibilidad con la secuencia particular de ADN o gen para ser expresado, particularmente con respecto a las esírucfuras secundarias de potencial. Huéspedes unicelulares adecuados son seleccionados por consideración de, es decir, su compatibilidad con el vector seleccionado, sus características de secreción, su capacidad para desdoblar proteinas correctemenfe, y sus requerimientos de fermentación, también como la toxicidad del huésped del producto codificado por la secuencia de ADN que es expresada, y la faciliodad de purificación de los productos de expresión. Considerando esos y otros factores una persona experta en la íécnica será capaz de consíruir una variedad de control de vector/expresión y combinaciones de secuencia/huésped que expresaran las secuencias de ADN que codifican las componentes de esla invención sobre la fermeníación o en el culíivo animal a larga escala. En ciertas modalidades, esía fambién contemplado que los segmentos de ácido nucleico discuíidos adjunto serán usados para llevar a cabo las apropiadas células huésped. La tecnología para la introducción del ADN dentro de las células es bien ' conocida para aquellos expertos en la técnica. Cuatro métodos generales para entregar un segmento nucleico, dentro de las células que han sido descrilas:(1) métodos químicos (Graham and VanDerEb, Virology, 54 (2):536-539,1973); métodos físicos tal cómo jTiicroinyección (Capecchi, Cell, 22 (2):479-488,1980), elecíroporación (Wong and. Neuman, Biochim Biophys Res Commun, 107 (2):584-587,1982; Fromm el al., Prcc Nali Acad Sci USA, 82 (17):5824-5828,1985) y el cañón de genes (Yang et al., Proc Nati Acad Scí USA, 87:4144-4148,1990); (3) vectores virales (Eglitis and Anderson, Bio/íechníques, 6(7):608.-614,1988); y (4) mecanismos que median receptores (Wagner, ef al., Proc Nall Acad Sci USA, 89(13):6099-6103, 1992). Las secuencias de ADN que codifican MSCRAMM pueden ser preparadas sintéticamente o clonadas. Las secuencias de ADN pueden ser designadas por los codones apropiados para la secuencia de amino ácidos MSCRAMM. En general, uno seleccionara los codones preferidos para el huésped pretendido si la secuencia se usará para expresión. La secuencia completa es montada del traslapamienlo de oligonucleóíidos preparados por los métodos estándar y montados deníro de una secuencia completa que codifica. Ver, es decir, Edge, Nature, 292:756 (1981);Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984). Las secuencias siníeíicas de ADN permiten una construcción conveniente de genes los cuales expresaran análogos MSCRAMM. Alternativamente, ADN análogos que codifican pueden ser hechos por mutagénesis de sitio dirigido o genes nativos MSCRAMM o cADNs, y análogos pueden ser hechos directamente usando síntesis polipéptido convensional. Un método general para la incorporación de sitio específico de amino ácidos no nuaturales deníro de las proteínas esía descrito en Noren eí ai., Science. 244:182-188 (April 1989). Esíe método puede ser usado para crear análogos con amino ácidos no naturales.

XII. OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO Y RIBOZOMAS La presente invención se extiende a la preparación de oligonucleótidos de antiseníido y ribozomas que pueden ser usadas para interferir ccn la expresión de la MSCRAMM a el nivelk íraslacional. La aproximación utiliza ácido nucleico antisentido y ribozomas para bloquear la íraslación de un mARN específico, cualquiera de los dos que enmascara el mARN con un ácido nucleico antisentido o lo corta con un ribozoma. Los ácidos nucleicos antiseníido son moléculas ADN o ARN que son complementarias a al menos una porción de una molécula específica de mARN. En la célula, ellos hibridizan íal que el mARN específico, forma una molécula doble írenzada. La célula no íraslada un mARN en esta forma doble trenzada. Por consiguiente, los ácidos nucleicos antisentido interfieren con la expresión de mARN dentro de la proteina. Oligómeros de aproximadamente quince nucleófidos y moléculas que hibridizan al codón de iniciación AUG será particularmente eficiente. Entonces ellos son fáciles para sintetizar y probabnlemente para poseer menos problemas que las moléculas mas largas cuando son iníroducidos deníro de las células que producen MSCRAMM. Los métodos aníisenfido han sido usados para inhibir la expresión de muchos genes in vilro (Marcus-Sekura, 1988; Hambor et al., 1988). Los ribozomas son moléculas ARN que poseen la capacidad para cortar específicamente otras moléculas ARN simples trenzadas en una manera algo análoga a la restricción ADN endonucleasas. Los ribozomas fueron descubiertas de la observación que ciertas mARNs tienen la capacidad para consumir sus propios inírones. Por modificar la secuencia de nucleóíido de esas ARNs, los ¡nvesíigadores han sido capaces de construir moléculas que reconocen secuencias de nucleótido especifico en una molécula ARN y la cortan (Cech, 1988.). porque ellas son secuencias específicas solamente mARNs con una secuencia particular son inacfivadas. Los investigadores han identificado dos tipos de ribozomas, tipo-Tetrahymena y tipo'-hammerhead.(Hasselhoff and Gerlach, Nalure, 334(6183):585-591 ,1988) el tipo de ribozoma Tetrahymena reconoce cuatro secuencias base, mientras que eí tipo "hammerhead", reconoce de .once a dieciocho secuencias base. El reconocimiento de secuencia mas largo, la que ocurre mas probablemente exclusivamente en las especies objetivo MRNA de lo anterior, el tipo de ribozomas hammerhead son preferibles a las ribosomas tipo Tetrahymena porque inactiban una especie específica de mARN, y reconoce dieciocho secuencias base son preferibles para secuencias de reconocimiento mas cortas. Las secuencias ADN descriías adjunto pueden entonces ser usadas para preparar moléculas anlisenlido confra, y ribozomas que cortan mARNs por MSCRAMM y sus ligandos.

XIII. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS. Es proporcionada una composición farmacéuíica que comprende proíeinas de enlace, los pépíidos, los aníicuerpos, o los ácidos nucleicos como se describen arriba opcionalmenle en combinación con componentes bacteriales, en un ecipiente aceptable farmacéuticamente, en una cantidad efectiva para íratar infección E. aureus. Las composiciones son tipicamenfe usadas en la preparación de una formulación para inmunización que opcionalmente incluye un adyuvante y oíros adilivos habituales. Las composiciones pueden también comprender equipos de diagnóstico como se describió adjunto. Métodos para preparar composiciones farmacéuticas las cuales contienen poíipéptidos, fragmentos análogos y activos como ingredientes activos son bien entendidos en la técnica. Típicamente, tales composiciones son preparadas como inyectables, cualquiera de las dos como soluciones liquidas o suspensiones, sin embargo, las formas sólidas adecuadas en solución, o en suspensión, liquido primario para inyección puede también ser preparado. La preparación puede también ser emulsificada. Eí ingrediente terapéutico activo es algunas veces mezclado con ecipieníes los cules son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Ecipientes adecuados son. por ejemplo, agua, salina, dextroza, glicol, efanol o lo simüar y combinaciones de ellas. En adición, si se desea, la composición puede contener menores cantidades de sustancias auxiliares lales como ageníes humecíantes o ßmulcificantes, los agentes pH que neutralizan los cuales mejoran la efectividad del ingrediente activo. Un polipéptido, fragmento análogo o activo puede ser formulado dentro de las composiciones terapéuticas como formas de sales aceptables farmacéuticamente neutralizadas. Sales aceptables farmacéuticamente incluyen las sales acidas de adición (formadas con los grupos libre amino de polipéptido o molécula anticuerpo) y las cuales son formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácidos hidroclórico o fosfórico, o teles ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mendélico, y lo similar. Sales formadas de los grupos libres carboxílico pueden también ser derivados de base inorgánicas íales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos, y tales bases orgánicas como isopropilamina, írimeíilamina, dos-etilamino etanol, histidina, procaina, y lo similar. El polipépíido terapéutico, fragmento análogo o activo que contiene composiciones son convensionalmente adminisírados inírevenosamenle, como por inyección de una dosis unidad por ejemplo. El término "dosis unidad" cuando es usado en referencia a una composición terapéuíica de la presente invención se refiere a unidades discreías físicamente adecuadas como dosificación uniíaria para humanos, cada una de las unidades coníiene una caníidad predeterminada de amíerial acíivo calculado para producir el efecto terapéutico de seado en asociación con el diliyente requerido; es decir, portador, o vehículo. Las composiciones son adminisíradas en una manera compaíible con la formuilación de dosificsción, y en una caníidad efectiva terapéuticamente. La cantidad a ser administrada depende dei sujeto que va a ser tratado, capacidad del sistema inmune del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y grado de inhibición o neutralización de ña capacidad de enlace MSCRAMM deseado. Cantidades precisas de ingrediente acíivo requerido para ser adminisírado depende sobre el juicio dei practicante y es peculiar a cada uno de manera individual. Sin embargo, el intervalo de dosificación adecuado tiene de aproximadamente 0.1 a 20, preferiblemente aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10, y más preferiblemente de uno a varios, miligramos de ingrediente acíivo por kilogramo del peso del cuerpo del individuo por día y depende de la ruía de admimslración. Regímenes adecuados para la adminisíración inicial y las inyecciones de refuerzo son también variables, pero son tipificadas por una administración inicial seguda por repetidas dosis a intervalos de una o más horas para una inyección subsecuente u otra administración. Alternafivamenfe, infisiones continuas intravenosas suficientes para mantener las conceníraciones de diez nanomolares a diez micromolares en la sangre esían contempladas. Las composiciones terapéuticas pueden ademas incluir una caníidad efectiva de la antagónica MSCRAMM/MSCRAMM o análogos de ella, si uno o más de los siguientes ingredientes activos:un aníibiótico, o un esteroide. La preparación de vacunas que contienen secuencias de péptido como ingredientes activos es generalmente bien entendida en la técnica, como es ejemplificado por las patentes U.S. 4,608,251 ; 4,601 ,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; y 4,578,770 todas incoforadas adjunto por referencia. Típicamente, íales vacunas esían preparadas como inyectables, cualquiera de las dos como soluciones líquidas o suspenciones, las-formas sólidas adecuadas en solución, o en suspensión, líquido primario para inyección íambién puede ser preparado. La preparación puede también ser emulsificada. El ingrediente inmunogénico acíivo es algunas veces mezclado con ecipienfes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente acíivo. Ec.ipieníes aceptables son, por ejemplo, agua, salina, . dexíroza, glicol, efanoi, o lo similar y combinaciones de eilas. En adición, si se desea la vacuna puede contener menores cantidades de sustancias auxiliares tales cqmo ageníes humectantes o emulsifiacantes, agentes que neuíralízan pH, o adyuvantes que mejoran la efectividad de las vacunas La preparación de tales composiciones que están esencialmente libres de endotoxina pueden ser logradas por la siguiente metodología publicada, por ejemplo, la patente U.S. 4,271,147 (incorporada adjunío por referencia) describe métodos para la preparación de proteinas de membrana Neisseria meningiíides para uso en vacunas. Las composiciones inmunológicas fales como vacunas, y oirás composiciones farmacéuticas pueden ser usadas solas o en combinación con oíros ageníes que bloquean para proteger confra infecciones humanas y animales causadas por bacteria estafilococal tal como E. aureus. En particular, las composiciones pueden ser usadas para proíreger humanos coníra endocarditis o para proteger humanos o rumiantes coníra mastitis causada por infecciones esíafilococales. La vacuna puede íambién ser , . usada para proíeger animales caninos y equinos confra infecciones similares esíafiiococales. Para mejorar la inmunogenisidad, las proteinas pueden ser conjugadas a una molécula portadora. Portadores inmunogénicos adecuados ¡ncluyen proleinas, polipéptidos o péplidos teles como albúmina, hemocianina, tiroglobulina y derivados de ellas, particularmente suero bovino albúmina (BSA) y ojo de cerradura lapa hemocianina (KLH), polisacáridos, carbohidratos, polímeros, y fases sólidas. Otras sustancias proteina derivadas o no-proteina derivadas son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Un portador típico inmunogénico tiene un peso molecular de al menos 1 ,000 daltones preferiblemente mayor que 10,000 daltones. Las moléculas portadoras algunas veces contienen un grupo reactivo para facilitar la conjugación covalenfe para el hapfeno. El grupo ácido carboxílico o grupo amina de amino ácidos de los grupos azúcar de glícoproíeinas son algunas veces usados en este manera. La falta de tales grupos portadores puede algunas veces ser reactivado con un químico apropiado para producirlos. Preferiblemente, una respuesta inmune se produce cuando el inmunógeno es inyectado dentro de ios animales fales como ratones, conejos, raías, cabras, borregos, puercos .de guinea, pollos, y oíros animales, más preferiblemente ratones y conejos. Alternativamente, un péptido antigenico múltiple comprende múltiples copias de la proteina o polipéptido, o un polipéptido antigénicamente o inmunológicamente equivalente puede ser suficientemente antigénico para mejorar la ¡nmunogenícidad sin el uso de un portador. La proteina o proíeinas MSCRAMM pueden ser adminisíradas con un adyuvante en una cantidad efectiva para mejorar la respuesta ¡nmunogénica coníra el conjugado. Por esía vez, solameníe ei adyuvante ampliamente usado en humanos ha sido alúmina (el fosfaío de aluminio o hidróxido de aluminio). Saponin y su componeníe purificado Quil A, el adyuvante completo de Freund y oíros adyuvantes usados en la investigación y aplicaciones veterinarias íienen toxicidades las cuales limiten su potencial de uso en vacunas humanas. Sin embargo, preparaciones definidas químicamente íales como dipéplido muramil, lípido A monofosforil, fosfolípidos conjugados fales como aquellos descritos por Goodman-Snifkoff et al.(J. Immunol. 147:410-415,1991) e incorporados por referencia adjunto, la encapsulación de los conjugados dentro de un proleoliposoma como se describe por Miller el al., (J. Exp. Med. 176:1739-1744, 1992) e incorporados por referencia adjunío, y encapsulación de la proteina en vehículas lípido tal como vehículo lipido Novasome™ (Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH) puede ser útil. En ciertas modalidades, los inventores contemplan el uso de liposomas y/o nanocápsuias para la introducción de péptidos particulares o segmentos de ácido nucleico dentro de las células huésped. En particular, los péptidos maloniltirosil y fosfotirosil de la presente- invención pueden ser formulados para entregarse en solución con DMSO o encapsulados en liposbmas tales formulaciones pueden ser preferidas por la introducción de formulaciones aceptables farmacéuticamente de los ácidos nucleicos, péptidos, y/o anticuerpos descritos adjunto. La formación y uso de liposomas es generalmente conocida por aquellos expertos en la íecnica (ver por ejemplo, Couvreur eí al., FEBS Leíl, 84:323-326,1977; y Crií Rev Ther Drug Carríer Sysí, 5:1-20,1988 las cuales describen el uso de liposomas y nanocapsulas en la terapia de antibióticos objetivados de las infecciones bacteriales intracelulares y desesos). Recientemente, las liposomas fueron desarrolladas con esfyabilidad mejorada de suero y circulación de medios tiempos (Gabizon and Papahadjopoulos, Proc Nati Acad Sci USA, 85:6949-6953,1988; Alien and Chuon, FEBS Leít, 223:42-46, 1987). Los liposomas han sido usados con un número de células lipo que son normalment eresislentes a la transfección por otros procedimientos que incluyen suspenciones de células T, cultivos primarios hepaíocilo y células PC 12 ( Muller ef al., DNA Cell Biol, 9 839:221-229, 1990). En adición, las liposomas están libres de las constricciones de longitud adn que son íípicas de sisíemas de entrega en base viral. Las liposomas han sido usadas efectivamente para introduccir genes, drogas, agentes radioíerapéuíicos, enxzimas, virus, factores de transcrición y efecíores alosíéricos denfro de una variedad de lineas de células cultivadas y animales. En adición, varios rasíros clínicos exitosos que examinan la efectividad de la enírega de droga de la liposoma mediada han sido completadas (Lopez-Beresíein eí al., Cáncer Drug Review, 2(3): 183-189,1985; Sculier eí al, Eur J. Cáncer Clin Oncol, 24(3):527-538, 1988). Ademas, varios esíudios sugieren que el uso de liposomas no esta sodado con repuestas autoinmunes tixisidad o localización gonadal después de la enírega sistemica (Mori and Fukaísu, Epilepsia, 33(6):994-1000, 1992). Las liposomas esían formadas de fosfolipidos que esfan dispersas en un medio acuoso y espontaneameníe forman vehículos bicapa concéníricos multilaminares (también llamados vehículos millilaminares (MLVs). Los MLVs generalmente tienen diámeíros desde 25 nm a 4 micrones. La sonificación de MLVs resulta en ia formación de pequeños vehículos unilaminares (SUVS) con diámelros en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen una solución acuosa en el núcleo. Los liposomas albergan muchas resemblanzae a las membranas celulares y esten contempladas para uso en conexión con la presente invención como portadores para las composiciones péptido. Ellas son ampliamente adecuadas, como ambas susíancias agua y lípido-soluble que pueden ser aírapadas, es decir, en los espacios acuosos y deníro de la misma bicapa, respectivamente. Es posible que las liposomas drogaportadoras pueden aún ser empleadas para entrega de sitios específicos de ageníes activos por modificar la selectividad de la formulación líposomal. En adición a las enseñanzas de Couvreur eí al. (FEBS Leíf, 84:323-326,1977;y Crif Rev Ther Drug Carrier Sysl, 5:1-20,1988), la siguiente información puede ser utilizada en la generación de formulaciones liposomales. Los fosfolípidos pueden formar una variedad de oirás estrucíuras que las liposomas cuando son dispersadas en agua, dependiendo de la proporción molar de lípido a agua. A bajas proporciones la liposoma es la estruclura preferida. Las caracíeristicas físicas de las liposomas dependen del pH, el poder iónico y la presencia de cationes dibalentes. Los liposomas pueden mosírar baja permeabilidad a las sustancias iónicas y polares, pero a elevadas temperaíuras se someten a una transición de fase la cual marcadamente altera su permeabilidad. La íransición de fase involucra un cambio de una cercanamente compacta, estrucíura ordenada, conocida como esíado de gel, a una liberalmenfe compacía, esírucíura menos ordenada, conocida como estado fluido. Esto ocurre a una característica de temperafura de íransición de fase y resulta en un incremento en la permeabilidad a los iones, azúcares y drogas. En adición a la temperafura, la exposición a las proíeinas puede alterar la permeabiüdfad de las lipcsomas. Ciertas proíeinas solubles íales como cilocromo de-enlace C, deforma y penetra la bicapa, de ese modo causa cambios en ia permeabilidad. Inhibe el colesteroí esta penetración de profeinas. aparentemente por la ciompactación de fosfolípidos mas apretadamente. Esto es contemplado que la mayoria de formaciones liposoma útiles para antibiótico e inhibidor de entrega contendrá colesterol. La capacidad para atrapar solutos varía entre diferentes tipos de liposomas. Por ejemplo, los MLVs son moderadamente eficientes al atrapar solutos, pero los SUVs son extremadamente ineficientes. Los SUVs ofrecen la veníaja de hogeneidad y reproducfibilidad en tamaño de distribución, sin embargo, un compromiso entre el tamaño y la eficiencia de afrapamienlo es dispuesto por el largo vehículo unilaminar (LUVs). Estos son preparados por evaporación de efer y son íres o cuaíro veces mas eficientes para el afrapamiento de soluto que los MLVS.

En adición a las características del liposoma, un determinante importante en compuestos de aírapamienfo es la propiedad fisicoquímica del compuesío mismo. Los compuesíos polares son liberados a íravez de la permeación o cuando la bicapa es rota, pero los compuestos no polares se mantienen afiliados con la bicapa a menos que esto sea interrumpido por la temperatura o la exposición a lipoproteinas. Ambos tipos muestran máximas proporciones de flujo en la fase de temperaíura de íransición. Las liposomas iníeracíuan con las células vía cuaíro mecanismos difereníes: Endosiíosis por células fagocíticas del sistema reticuloendolelial íal como macrodevoradores y neuírofilos; la absorción de la superficie de la céluia, por fuerzas elecíroslaíicas o hidrofobicas no específicas o cualquiera de las dos, o por interacciones específicas con componentes superficiales de célula; la fusión con el plasma de la membrana celular por la incersión de el lípido bicapa o la liposoma deníro del plasma de • la membrana, con liberación simultanea de contenido liposomai deníro del ciíiplasma; y por la transferencia de lípidos iipssomales a las membranas celular o subcélular, o viceversa, sin ninguna asociación de contenidos de liposoma. Algunas veces es difícil determinar cual mecanismo es operativo y más que uno puede operar al mismo tiempo. El desfino y disposición de las liposomas inyectadas inlravenosamenfe depende de sus propiedades físicas, tal como tamaño, fluidez y carga superficial. Ellas pueden persistir en tejidos por horas o días, dependiendo de su composición, y media vida en la sangre de intervalos de minutos a varias horas. Las liposomas mas largas, tal como MLVs y LUVS, son reanudadas rápidamente por las células fagocíticas del sistema reticuloendoíelial, pero la fisiología del sistema circulatorio retiene la salida de íales especies largas a la mayoria de sitios. Ellas pueden salir solamente en lugares de grandes aberturas o poros que existen en el endoíelio capilar, íales como sinusoides del hígado o bazo. Entonces, esos órganos están en el sitio predominante de entorpecer. Por otro lado, las SUVs muesíran una disíribución mas amplia de íejido pero aún son altamente secuestradas en el hígado y bazo. En general, este comportamiento in vivo limite el potencial objeíivo de las liposomas a solamente aquellos órganos y tejidos accesibles a su largo íamaño. Esto incluye la sangre, hígado, bazo, médula del hueso y órganos linfoides. El objetivo no es generalmente una limiíacióbn en lérminos de la presente invención. Sin embargo, se especificaría el objeíivo que se desea, ¡os métodos que eslan disponiles para esío tienen que ser logrados. Los anticuerpos pueden ser usados para enlazar la superficie de las liposomas y directamente al anticuerpo y su contenido de : droga para receptores antigénicos específicos dispuestos sobre una superficie célula íipo particular. Los carbohidratos determinantes (las componentes glicoproteina ó glicolípido de superficie celular juegan un papel en el reconocimiento célula- célula, interacción y adheción) pueden íambién ser usados como sitios de reconocimiento como aquellos que .tienen potencial en la dirección de las liposomas para tipos de célula particular. Principalmente, es contemplado que la inyección intravenosa de preparaciones' liposomales podrían ser usadas, pero oirás rutas de administración son también "concevibles. Alternativamente, prevee formulaciones nanocapsulares aceptables farmacéuticamente de los péplidos de la presenie invención. Las nanocápsulas pueden generalmente atrapar compuestos en una manera estable y reproducible ( Henry- Micheland et al, Int J. Pharm, 35:121-127, 1987). Para evitar efectos laterales debido a la sobrecarga polimérica intracelular, tales partículas ultrafipas (tamaños aproximadamente de 0.1 micrones) serán designadas para usar polímeros capaces de ser degradados ¡n vivo. Nanopartículas biodeggradables polialkil-cianoacrilato que reúnen esos requerimientos son contempladas para usarse en la presente invención, y tales partículas pueden ser fácilmente hechas, como es descrito por Couvreur et al, (Supra, 1977 y 1988).

Métodos adecuados de administración incluyen, pero no están limitados a, los actuales, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, administración intranasal e intradermal. Para la administración actual, la composición está formulada en la forma de un ungüento o pomada, crema, gel, loción, gotas (tal como gotas para los ojos y gotas para los oídos), o solución (tal como enjuague bucal), Heridas o gasa, suturas y aerosoles pueden impregnarse con la composición. La composición puede contener aditivos convencionales, tal como presenvativos, solventes para promover penetración, y emolientes. Las formulaciopnes actuales también pueden contener portadores 10 convencionales tales como crema o bases de pomada, etanol, o alcohol oleo. En una modalidad preferida, una vacuna está empacada en una dosis simple para inmunización por administración paternal ( es decir, intramuscular, intradermal , o subcutánea) o administración nasofaringeal (es decir, intranasaf).La vacuna es. más preferiblemente inyectada ¡ntramuseuiarmente dentro del músculo deltoide. La vacuna es :1ß preferiblemente combinada con un portador aceptable farmacéuticamente para facilitar la administración. El portador es usualmente agua o salina neutralizada, con o sin" preservativo. La vacuna puede ser liofilizada por resuspensión en el tiempo de administración o en solución. • - El potador con el cual la proteina puede ser conjugada puede también ser 20 un sistema polimérico de liberación retrazada. Polímeros sintéticos son particularmente . útiles en la formulación de una vacuna para efectuar la liberación controlada de antígenos. Por ejemplo, la polimerización de metil metacrilato dentro de esferas que tienen diámetros menores que un m?crón han sido reportadas por Kreuter, J., Microcapsules And Nanoparticles In Medicine And Pharmacology, M. Donbrow (Ed). CRC Press, p. 125-148. 25 La microencapsulación de la proteina también dará una liberación controlada. Un número de factores contribuyen a la selección de un polímero particular para microencapsulación. La reproducibilidad de síntesis de polímeros y el proceso de microencapsulación, el costo y proceso de materiales de microencapsulación, ei perfil toxicológico, los requerimientos para la liberación cinética variable y la compatibilidad fisicoquímica de los polímeros y los antígenos son todos factores que deben ser considerados. Ejemplos de polímeros útiles son policarbonatos, poliesteres, poiiurefanos, poliortoesteres poliamidas, poli (d,1-lacíido-co-glicolido) (PLGA) y otros polímeros biodegradables. El uso de PLGA para la liberación conrtrolada de antígenos es revisada por Eldridge, J. H., et al. Current Topics In Microbiology And Immunology, 146:59-66 (1989). La dosis preferida para administración humana es de 0.01 mg/kg a 10 mg/kg, prefriblemente aproximadamente 1 mg/kg. Basado en este intervalo, ia dosificación equivalente de pesos más pesados se puede determinar. La dosis será ajustada para favorecer al iondividua a quien es adminiatrada la composición y variará 'con la edad, peso y meíabolismo de! individuo. La vacuna puede contener adicianalmenfe estabilizadores Tl como timerosal (etil (2-mercapíobenzoaía-S) sal de sodio de mercurio') (Sigma Chemical Company, St Louis, MO) o preservativos aceptables fisiológicamente. Elo será fácilmente aparente para un experto en la materia que se pueden hacer varias sustiíuciones y modificaciones a la invención descriía adjunto sin salir del alcance y espíriíu de la invención.

XIV. EQUIPOS Esla invención lambién ¡ncluye un equipo que comprende anticuerpo anti- MSCRAMMM o un anlígeno MSCRAMM para la detección y diagnosis de infecciones causadas o axacervadas por la bacteria estafilococo ta! como E. Aureus o E. Epidermidis. El equipo preferido contiene suficiente anticuerpo para enlazar sustancialmente todos los antígenos en la muestra en aproximadamente diez minutos o menos, o suficiente antígeno para enlazar anticuerpos para MSCRAMMs. El anticuerpo o antígeno puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido, y puede ser etiquetado con un agente detectable, como se describe arriba. El equipo opcionalmente contiene un medios para detectar el agente detectable. Si el anticuerpo o antígeno es etiquetado con un fluorocromo o etiqueta radioactiva, ningún medio para detectar el agente íípicamente será proporcionado, como esperaría el usuario para tener el espectrofotómetro apropiado, contadores de centelleo, o microscopio. Si el agente detectable es una enzima, un medio para deteclar el agente detecíable puede ser suministrado con el equipo, y podría típicamente incluir un sustrato para la enzima en suficiente cantidad para detectar todos los antígerno-anticuerpo complejos. Un medio preferido para detectar un agente detectable es un sustrato que es convertido por una enzima en un producto coloreado. Un ejemplo común es el uso de la enzima peroxidasa rábano de caballo con 2,2' ~azino-di-[3-eíil-benzoíiazolina sulfonaía] (ABTS). El equipo puede contener opcionalmente un ageníe liberado"- que libera células presentes en la muestra de fluido deJ cuerpo. Adecuados agentes liberadores ¡ncluyen usrfactaníes tales como Tween-80, Nonidet P40, y Trifon X-100. Preferiblemente, el ageníe liberador está inmovilizado sobre y a lo largo del soporte sólido con el aníicuerpo. El equipo puede íambién contener una solución neutral para lavar el sustrato entre los pasos. La solución neutral es típicamente una solución fisiológica tal como fosfsío neuíralizador, salina fisiológica, ciírafo neuíralizador, o iris neuíralizador. El equipo puede opcionalmete contener diferentes concentraciones de un antígeno preformado para calibrar ei ensayo. El equipo puede contener adicionalmente una representación visual numérica de cantidades de antígeno en un ensayo estándar calibrado como propósito de referencia. Por ejemplo, si un ensayo se usa para producir un producto coloreado, una hoja puede ser incluida que proporciona una representación de incremento de intensidades asociadas con diferentes cantidades de antígeno. El equipo puede opcionalmente incluir dos anficuefos en el sistema de detección. El primer anticuefo el cual esta presente en pequeñas caníidades es específico para el antígeno que es ensayado. El segundo anticuerpo proporcionado en altes caníidades es usado para detectar el primer anticuerpo. Por ejemplo, un anficuefo de conejo puede ser usado para detectar el anlígeno LOOH/amina, y entonces un anticuerpo IgG anti-conejo puede ser usado para detecíar un anticuerpo de enlace conejo. Los aníicuerpos de cabras y aníi-anlicuerpos son también comunmente usados. Como un ejemplo no limítente, un equipo para la delección del eslado de peroxídación del lípido de un paciente es proporcionado para que incluya un anticuerpo conejo específico para un anticuerpo deseado, un anticuerpo IgG anti-conejo en suficientes cantidades para detectar el primer enlace anticuerpo, una enzima conjugada para e! segundo anticuerpo y un susírato para la enzima la cual cambia de color sobre la exposición a la enzima. En adición, un equipo puede ser preparado para usar uno o mas antígenos MSCRAMM tal como el dominio M55 de la proleina de enlace colágeno y la proteina de enlace fribrinógeno CIfA, y este equipo permitirá la detección de muestras con anticuerpos para el enlace colágeno y enlace fibrinógeno MSCRAMMs.

EJEMPLOS. Los siguientes ejemplos están incluidos para demostrar modalidades preferidas de la presente invención. Ello será apreciado por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes los cuales representan las técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la practica de la invención, y entonces pueden ser considerados para consíiíuir modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción, podrían apreciar que muchos cambios se pueden hacer an las modalidades específicas las cuales esían descriías y aún se obtiene un resultado parecido o similar sin salir del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1. Preparación del prototipo de vacuna de cuaíro componentes MSCRAMM Una serie de proteinas recombinaníes, que representen dominios de colágeno, Fn, y enlace-Fbg MSCRAMMs (Fig 1), fueron sobreexpuesías en E. Coli y afinidad purificada por cromatografia de metal chelaníe como se describió previamente (Ver, es decir, Joh el al., Biochemisíry. 33(20):6086-6092,1994; Paíti et al., J. Biol: Chem. 270,12005-12011 ,1995; McDevitt et al., Mol. Micro. 11(2):237-248,1994; Ni Eidh'n et al., infecí. Immun. Sibmiífed, 1998). Usado donde ¡os siguieníes:amino ácidos contenidos en el enlace colágeno recombinante MSCRAMM expresado de cna (M55. tal como se describe en las solicitudes de patente co-pendieníes U.S. 08/856,253, incorporada adjunto por referencia); amino ácidos contenidos en el enlace fibrinógeno recombmante MSCRAMM expresado de clfA (pCF 40, ta! como se describe en la solicitud de patente U.S. Ser. No. 08/293,728, incorporada adjunto por referencia); amino ácidos contenidos en ei enlace fibrinógeno recombinante MSCRAMM expresado de clfB (región A, tal como la descrita en la soliciíud U.S. Ser. No. 09/200,650, incorporada adjunto por referencia); un amino ácido contenido en el enlace fibronectína recombinanle MSCRAMM (DUD 4, fal como aquella descriía en ia soliciíud co-pendieníe U.S. Ser. No 09/010.317, incorporada adjunío por referencia). El enlace FN recombinaníe de la proleina MSCRAMM DUD 4 fue tratada con formalina (5% de formalina toda la noche, 4°C) antes de combinarla con la M55, Región A de CIfA y Región A de ClfB.

EJEMPLO 2. Eiemplo de cultivo de especias E. Coli para la producción de proteinas recombinantes. Toda la noche el cultivo de las células E coli JM101 o TOP3 (estratagene) abrigando las plasmidas recombinantes que fueron diluidas 1 :50 en 1 L de Luria Broth (Gibco BRL) que contiene 50 mg/mL de ampicilina. Las células E. coli fueron cultivadas hasía que el cultivo alacanzó un OD60o de 0.5 a 0.8. La expresión de las proteínas recombinaníes fue inducida por agregar IPTG a una concentración final de 0.2 mM. Después de tres horas de periodo de inducción, las células fueron recogidas por ceñlrifugación, resuspendidas en 15 mL de Neuíralizador A (5 mM imidazol, 0.5 M NaCI, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) y liberado al pasar dos veces a íravés de una prensa francesa a 20,000 lb/in2. Los restos de célula fueron removidos por cenírifugación a 50,000 X g por 10 minutos y la superflolante fue pasada a través de un filtro de 0.45 µM.

EJEMPLO 3. La purificación de'proteinas recombinantes que contienen HISfi expresadas de pQE-30 (Qiaqen®; Qiaqen Inc., Chaísworth, CA) o plasmidas recombinaníes basadas en PV-4. Las proíeinas recombinantes fueron purificadas por cromatografía chelada de melal inmovilizado, usando una columna de ácido/sefarosa® 6B iminodiacelico de flujo rápido (Sigma, St. Louis, MO) cargada con Ni 2+; (Poralh et al., 1975; Hochuli eí al. 1988). Las proteínas etiquetadas HIS6 fueron purificadas por cromatografía de afinidad chelada de metal inmovilizado. Mas específicamente, una columna que contiene de ácido/sefarosa® 6B FF iminodiacetico, conectado a un sistema FPLC® (Pharmacia), fue cargada con 150 mM Ni++ y equilibrada con un neutralizador A (5 mM imidazol, 0.5 M NaCI, 20 mM Tris, pH 7.9). después de ser equilibrada el superflolaníe bacterial fue aplicado a la columna y la columna fue lavada con un cama de 10 volúmenes de neutralizador A. Subsecuentemente, la columna fue lavada con neutralizador B (200 mM imídazol, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7.9). el lavado fue monitoreado por la absorvancia a 280 nm y fraccionesa del pico fueron analizados por SDS-PAGE. La endotoxina fue removida de las proteinas recombinaníes purificadas por la extracción de detergente con 1% de Tritón X-114 seguido por la cromatografía de afinidad chelada de metal y pasada a íravés de una columna de una polimixina B-sefarosa. El nivel de endotoxina fue cuantificado usando un ensayo cromogénico Limulus Amobocyte Lysate (Bio Whiííaker, Walkersville, MD).

EJEMPLO 4. Inmunización de animales con vacunas de cuatro componentes MSCRAMM-MSCRAMM IV. Monos Rhesus. 100 µg de M55 (1 EU/mg), CIfA (2.5 EU/mg), ClfB (<1.0 EU/mg), y DUD4 (<10 EU/mg) fueron mezcladas ambas para formar la vacuna MSCRAMM IV. El coctel fue mezclado con TiterMax™Gold (CylRX, Norcross, GA) en una proporción 1 :1. Dos hembras mono rhesus, ID#495Z & 664U (89.4 kg), fueron vacunadas inframuscularmeníe (!M) en el cuadril posterior con 200 µl de la vacuna. Veintiocho días después las dos monas fueron reforzadas con inyección IM con 200 µl de la misma formulación de vacuna. Dos monos hembra adicionales, ID#215W 6 203U («8.0 kg). Fueron inmunizadas con la MSCRAMM IV que fue compuesta en una proporción 1 :1 con hidróxido de aluminio (2% Ahdrogel; Superfos, Denmark). Veintiocho días después las dos monas fueron reforzadas con inyección de IM con 200 µl de la misma formulación de vacuna.

El régimen clínico seguido esíá descrito abajo. '-* -Día 0 15 ml de muesfra de plasma de pre-inmunización, completa la química de la sangre. Día 1 Vacuna IM cuadril írasero con 0,2 ml de MSCRAMM IV (100 µg), inyección en el siíio de examen, íemperaíura grabada. Día 7 Panel de hígado, temperatura grabada, inyección en el sitio de examen.

Día 14 15 ml muesíra de plasma. Día 21 15 ml muesíra de plasma. Día 28 Completa la química de la sangre, temperatura grabada 15 ml muestra de plasma, inyección reforzada con IM de 0.2 ml de MSCRAMM IV (100 µg). Día 30 Panel de hígado, temperatura grabada, inyección en eí sitio de examen.

Día 35 Pane! de hígado, temperartura grabada, inyección en el sitio, 15 ml de muesíra de plasma. Día 42 15 m! de muesíra de plasma. Día 49 15 ml de muesíra de plasma. Día 106 15 ml de mueslra de plasma. Todos los cuatro animales ceroconvertidos siguieron la inmunización inicial. Niveles de aníicuerpo mayores que fres veces arriba del umbral que pudo ser detectado por ELISA 106 dias después de la primera vacunación. Los cuatro animales recibieron' _.otra inyección de refuezo de inmunización en la semana 21 del estudio. A cada animal se le dio una inyección de refuerzo de cuatro inyecciones subcutáneas de 125 µl de la vacuna para un total de inyección de refuerzo de 600 µl de la vacuna. Niveles de anticuerpo de a! menos tres veces arriba del umbral, y mucho mas que 15 veces arriba del umbral, pudieron ser deíecíados por ELISA 189 días después de la primera vacunación. Ver fig 2. Ningunas reacciones adversas al siíio de inyección fueron detectadas por observación directa por los veterinarios. En adición, los perfiles de enzima de hígado, CBC, y perfiles de hematología estuvieron deníro del intervalo normal para las monas rhesus.

EJEMPLO 5. Análisis de muestras de plasma de las monas vacunadas fueron analizadas por ELISA. Placas lnmulón-2 microtítulo (Dynex Technologies, Chantilly, VA) fueron cubiertas toda ia noche a 4°C con 10 µg/ml (50 µl) del enlace colágeno MSCRAMM (M55), enlace fibrinógeno MSCRAMM (CIfA; pCF44), enlace fibrinógeno MSCRAMM (ClfB; Región A), y en enlace fibronectina MSCRA.MM (DUD4). Cincuenta microlitros de las muestras de plasma diluido fueron agregados a los pozos cubiertos de MSCRAMM e incubados por una hora ala íemperaiura ambiente. Eí lavado neuíralizador que consiste de PBS que contiene 0.05% vol/vol Tween-20, una solución que bloquea de 1% peso/vol BSA, 0.05% Tween-20 en PBS, y un anticuerpo neuíralizador en dilusión que consiste de PBS que contiene 0.1% de BSA, 0.05% Tween-20. la incubación con anticuerpos primarios y secundarios fue por 60 minutos a 25°C. El anticuerpo secundario fue alcalino conjugado fosfafasa inmunoglobulina G cabra anlimono, (Rockland, Gilbertsville, PA), el anticuerpo diluido 3500 veces en dilusión neutra. Las placas ELISA fueron elaboradas por 30 minutos a 37°C con 1 mg/ml fosfalasa p-nitrofeníl (Sigma) en 1 M dietanolamina, 0.5 mM MgCI2, pH 9.8, y cuantificado a 405 nm sobre un lector de bioensayo Perkin Elmer HTS 7000. cada una de las muesíras de plasma fue diluida 100 veces en salina neuíralizada fosfato, conteniendo 0.05 % Tween-20, 0.1% BSA, pH 7.4. Los dalos ELISA son mosírados en la figura 2.

EJEMPLO 6. Esavos de Inhibición. Especies 601 Methicillin resistentes al E. aureus (Smeltzer, M. S., Gene. 196:249-159, 1997) fue cultivado bajo rotaciín constante por 15 horas a 37°C en un caldo BHI. Una dilusión 1 :100 del cultivo de toda la noche fue hecha deniro del BHI y las bacterias fueron cultivadas a 37°C hasta la fase media exponencial. Las bacterias fueron cosechadas por centrifugación, lavadas tres veces en PBS estéril, pH 7.4, y entonces resuspendidas en un carbonato neulral (50 mM NaHCO3, pH 8.5 e incubadas extremo sobre extremo en la obscuridad por una hora a 25°C. La reacción que etiqueta FITC fue detenida por centrifugación de las células bacteriales y que remueven las que contienen superflotaníes de las no reaccionadas FITC. Las bacterias etiqueíadas fueron lavadas fres veces en PBS para remover la FITC ni incorporadas, resuspendidas en PBS, ajusfadas a «1x108 cfu/ml y almacenadas a -20°C en PBS, pH 7.4.

EJEMPLO 7. Purificación de IqG de los monos inmunizados. lgG fue purificada del plasma de monos por afinidad cromaíográfica sobre una resina de alta capacidad PROSEP®-A (Bioprocessing Inc., Princeíon, NJ). Brevemente, el plasma fue descongelado y pasado a íravés de un filíro de 0.45 µm. El plasma fue aplicado a una columna combada superiormente que contiene una resina de alta capacidad PROSEP®-A. El material no aderido fue removido por lavar la columna extensivamente con PBS. El IgG fue extraído de la columna con 0.1 M de citraío de sodio, pH 3.0. el pH del IgG exfraido fue inmediatamente neufralizado a pH 6.8-7.4 la adición de 1 M Tris, pH 9.0. El IgG fue entonces dializado dentro del PBS, pH 7.4, concenfrado filírado y esíerilizado. La concentración del IgG purificado fue determinada por absorbancia a 280 nm.

EJEMPLO 8. Inhibición competitiva ELISA. Las placas de pozo negro Costar 96 fueron cubiertas toda la noche a 4°C o a la íemperaíura ambiente por dos horas con una solución 10 µg/ml de componentes de maíriz que consisten de colágeno bovino, fibrinógeno humano, y fibronecfína bovina en PBS, pH 7.4. Las placas cubiertas de maíriz de proíeina fueron ¡avadas tres veces con PBS, 1% BSA. Las placas bloqueadas fueron lavadas tres veces con PBS, 0.05% Tween-20. Un licuado de 500 µl de FITC-eíiquetada células E. aureus fueron mezcladas con una cantidad que se incrementa de IgG purificada de los monos en PBS, 0.05% Tween-20, 0.1% BSA. Las células etiqueíadas e IgG fueron mezcladas sobre un sacudidor de extremo a extremo po una hora a 25°C. Cincuenta µl de una mezcla células etiqueíadas IgG fue agregada a cada uno de los pozos sobre la placa microíítulc e incubada a 25°C sobre una plataforma mecedora. Los pozos fueron lavados tres veces con PBS, 0.05% Tween-20. La cantidad de bacteria unida a las proteínas de maíriz inmobilizadas fueron determinadas en un lector de Bio-ensayo Perkin Elmer HTS 7000 con el conjunto de filtro de exitación a 485 nm y el conjunto de filtro de emisión a 535 nm.

EJEMPLO 9. Modelo animal de Sepsis. Usando un modelo de ratón de sepsis (Bremell, T. A., et al., Infecí. Immun. 62(7):2976-2985,1992) hemos demosírado que la inmunización pasiva con IgG purificada de monos rhesus inmunizados con la MSCRAMM IV puede proíeger raíones confra sepsis de muerte inducida. Los raíones machos fiemos NMRI de edad de 5 -8 semanas fueron inmunizados pasivamente i. p. sobre un día-1 con 20 mg de cualquiera de los purificados IgG de monos rhesus inmunizados con MSCRAMM IV (n=12), o IgG de monos rhesus no inmunizados (n=13). Sobre un día 0, los raíones fueron infectados i. v. con 2.4x107 CFU/ralon especies LS-1 E. aureus. El cambio en peso y mortalidad fue moniloreado sobre los próximos íres días. Tres días después la inoculación raíones 3/13 (13%) murieron en el grupo de control, comparados a 0/12 ratones (0%) en el grupo de confrol. La mortalidad en el grupo de confrol al dia 13 fue de 52.8 % (7/13) comparado a solameníe 16.2% (2/12) para el grupo pasivamente inmunizado MSCRAMM IV. El conírol de raíones exhibió una reducción significante en su peso corporal comparado con MSCRAMM IV e IgG ratones pasivamente inmunizados (28.0 ± 2.5 % vs 21.3 ± 3.1%; p < 0.01).

EJEMPLO 10. Vacunas .multicomponeníes que contienen M55 (enlace - coiáqeno MSCRAMM) v CIfA (enlace - fibrinóqeno MSCRAMM) Sesenta ratones Webster suizos hembras recibieron un total de 50 µg de ambas ovalbuminas, proteinas M55 (enlace - colágeno MSCRAMM) o una combinación de M55 y CIfA (enlace - fibrinógeno MSCRAMM) vía una inyección subcuíanea. La primera inyección fue preparada por emulsificación de anlígenos en un adyuvante completo Freund. Los raíones recibieron una segunda inyección de 25 µg de proíeina loíal en un adyuvante incompleto Freund 14 días después de la primera inyección una inyección final de 25 µg de proteina toíal en PBS se les dio 28 días espués de la primera inyección. Muestras de post-sangrado de todos los ratones fueron obtenidas dos semanas después de la inyección final para determinar tííulos de aníicuerpo confra las diferentes proteínas MSCRAMM. Los ratones fueron entonces infectados (42 días después de la primera inyección) vía una inyección simple^ intravenosa con 1.2x108 CFU de E. aureus 601. Al día 5 de la post-infección, los ratones fueron sacrificados y sus riñones cosechados. Los riñones fueron entonces homogenizados y plateados sobre placas de sangre agar. Las placas fueron incubadas a 37°C toda la noche y la carga bacterial en los riñones fue determinada por contadores de colonias. Los resultados del experimento mosíraron 2 diferencias log (logarítmicas) en carga bacterial eníre el grupo ovalbumina (7.03 ± 0.93 log CFU/g) y ei grupo M55/CIÍA (4.83 ± 3.04 log CFU/g, p=0.006). una diferencia en carga bacíerial se observó lambién en el grupo M55 (5.86 ± 3.42 log CFU/g, p=0.003) cuando se comparó con el grupo ovalbumina. Como se mosíro en la descripción de arriba y ejemplos, ías composiciones inmunológicas, que incluyen vacunas, y oirás composiciones farmacéuticas que contienen ias proteinas MSCRAMM son incluidas dentro dei acance de ía presente invención. Una o más de las proteinas de enlace, o fragmentos activos o antígenos de ellas, ó proteínas, de fusión de ellas pueden ser formuladas y empaquetadas, solas o en combinación con otros antígenos, usando métodos y materiales conocidos por aquellos expertos en la técnica para vacunas. La respuesta inmunológica puede ser usada terapéuticamente o profilácticamente y puede proveer inmunidad de anticuerpo o inmunidad celular tal como aquella producida por ios linfocitos T tal como los linfocitos citotóxicos T ó linfocilos CD4+T.

Claims

REIVINDICACIONES 1.- Una composición que comprende un anticuerpo que enlaza a un dominio de enlace colágeno de una proteina de enlace colágeno e inhibe el enlace de dicha proteina de enlace colágeno al colágeno.y un anticuerpo que enlaza a un dominio de enlace fibrinógeno de una proteina de enlace fibrinógeno e inhibe el enlace de dicha proteina de enlace fibrinogeno al fibrinógeno. 2.- Una composición que comprende un anticuerpo que enlaza a un dominio de enlace fibronectina de una proteina de enlace fibronectina e inhibe el enlace de dicha proteina de enlace fibronectina a la fibronectina, y un anticuerpo que enlaza a un dominio de enlace colágeno de una proteina de enlace colágeno e inhibe el enlace de dicha proteipa de enlace colágeno al colágeno, y un anticuerpo que enlaza a un domin.o de, enlace fibrinógeno de una proteina de enlace fibrinógeno e inhibe el enlace de dicha proteina de enlace fibrinógeno a! fibrinógeno. . 3.~ Una composición de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizada porque los anticuerpos enlazan a las proíeinas de enlace microbial. 4.- Una composición de acuerdo a la reivindicación 3, caracterizada porque las proteinas de enlace microbial son proteinas de enlace estafilococal. 5.- Una composición de acuerdo a la reivindicación 3, caracterizada porque las proteinas de enlace microbial son proteinas de enlace estreptococal. 6.- Una composición de acuerdo a ía reivindicación 4, caracterizada porque las proteinas de enlace estafilococal son proteinas de enlace Estafilococo aureus. J.- Una composición de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizada porque las proteinas de enlace Estafilococo aureus son proteínas de enlace E. aureus FnBP-A y CNA y CIfA y ClfB. 8.- Una composición de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizada porque además comprende un anticuerpo para una proteina seleccionada del grupo que consiste de SdrF, SdrG, SdrH. 9.- Una vacuna que comprende cantidaes efectivas inmunológicamente de el dominio de enlace colágeno de una proteina de enlace colágeno, y el dominio de enlace fibrinógeno de una proteina de enlace fibrinógeno, y un portador aceptable farmacéuticamente o ecipiente. 10.- Una vacuna que comprende el dominio de enlace fibronectina de una proteina de enlace fibronectina, el dominio de enlace colágeno de una proteina de enlace colágeno, y el dominio de enlace fibrinógeno de una proteina de enlace fibrinógeno, y un portador aceptable farmacéuticamente o ecipiente. 11.- Una vacuna que comprende el ligando péptido fibronectina que podría ser unido por una proteina de enlace fibronectina, el ligando péptido colágeno que podría ser unido por una proteina de enlace colágeno, y el ligando péptido fibrinógeno que podría ser- unido por una proteina de enlace fibrinógeno, y un portador aceptable fannacéuticamente o ecipiente. 12.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizada porque acjemás las proteinas de enlace son de microorganismos. 13.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizada porque además los microorganismos son organismos estafilococales 14.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizada porque además los microorganismos son organismos estreptococales. 15.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 13, caracterizada porque además los organismos esíafilococales son Estafilococos aureus 16.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 15, caracterizada porque además las proteinas de enlace Estafilococo aureus comprenden FnBP-A, CNA, CIfA, ClfB. 17.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 15, caracterizada porque además comprende una proteina seleccionada del grupo que consiste de SdrF, SdrG, SdrH. 18.- Una vacuna de acuerdo a ia reivindicación 10, caracterizada porque además las proteinas de enlace son de microorganismos. 19.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 18, caracterizada porque además los microorganismos son organismos eslafilococales. 20.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 18, caracterizada porque además los microorganismos son organismos estreplococales. 21.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 195 caracterizada porque además los organismos estefilococales son Estafilococo aureus. 22.- Un método de generación de una respuesía inmune, que comprende la adminisíración a un animal de una composición fápnacéutica que comprende una caníidad efecíiva inmunológicamente de una composición de péptido que comprende el dominio de enlace colágeno de una proíeina de enlace colágeno y el dominio de enlace fibrinógeno de una proteina de enlace fibrinógeno. 23.- Un método de generación de una respuesta inmune, que comprende la administración a un animal de una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva inmunológicamente de una composición de péptido que comprende el dominio de enlace fibronectina de una proteina de enlace fibronectina, el dominio de enlace colágeno de una proteina de enlace colágeno, y el dominio de enlace fibrinógeno de una proteina de enlace fibrinógeno. 24.- Un método de inhibición de la colonización microbial en un animal, el método comprende la administración a el animal de una composición de acuerdo a la reivindicación 1. 25.- Un método de inhibición de la colonización microbial en un animal, el método comprende la administración a el animal de una composición de acuerdo a la reivindicación 2. 26.- Un método de inhibición de la colonización microbial en un animal, el método comprende la administración a el animal de una vacuna de acuerdo a la reivindicación 9. 27.- Un método de inhibición de la colonización microbial en un animal, el método comprende la administración a el animal de una vacuna de acuerdo a la reivindicación 10. 28.- Una vacuna que comprende una formulación aceptable farmacéuticamente que comprende ácido nucleico ?ue codifica una proteina e' enlace . colágeno, y ácido nucleico que codifica una protiena de enlace fibrinógeno, y un portador aceptable farmacéuticamente o ecipiente. 29.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación S, caracterizada porque además la proteina de enlace colágeno comprende M55. 30.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizada porque además la proteina de enlace fibrinógeno comprende ClfA. 31.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 28, caracterizada porque además la proteina de enlace colágeno comprende M55. 32.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 28, caracterizada porque además la proteina de enlace fibrinógeno comprende ClfA. 33.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 28, caracterizada porque además las proteinas de enlace son de microorganismos. 34.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizada porque además los microorganismos son organismos estafilococales. 35.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizada porque además los microorganismos son organismos estreptococales. 36.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 34, caracterizada porque además los organismos estafilococales son Estafilococos aureus. 37.- Una vacuna que comprende ácido nucleico que codifica una proteina de enlace fibronectina, ácido nucleico que codifica una proteina de enlace colágeno, y ácido nucleico que codifica una proteina de enlace fibrinógeno, y un portador aceptable farmacéuticamente o ecipiente. 38.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 37, caracterizada porque además los ácidos nucleicos codificados enlazan proteinas de bacteria estafilococai. 39.- Una vacuna que comprende las proteinas de enlace fibronectina y un portador aceptable farmacéuticamente o ecipiente. 40.- Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 29, caracterizada porque además las proíeinas de enlace fibronectina comprenden FnBP-A y FnBP-B.