CN1589280A - 微生物感染的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的抗体、药物、药物包装、制备药物的方法和治疗微生物感染的方法，特别是治疗葡萄球菌感染如金黄色葡萄球菌感染的方法，包括MRSA感染。

Description

微生物感染的治疗
本发明涉及人或动物体微生物感染的治疗，如金黄色葡萄球菌，特别是抗生素耐药生物菌株如MRSA。本发明提供了治疗微生物如金黄色葡萄球菌感染的药物，制备治疗感染药物的方法，治疗感染的含有药物的药物包装，和治疗由所述微生物所致的感染的人或动物体方法。
多药耐药(MDR)在革兰氏阳性细菌中是越来越多的问题(Banergee，S.N.等人.1991，Am.J.Med.91：865-895；Shaberg，D.R.等人，1991，Am.J.Med.suppl.， 88：72-75；Gaynes，R.P.等人，1994，Infect.Dis.Clin.Pract.， 6：452-455)，特别是在医院内。特别地，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)，特别是耐甲氧西林CNS，由于对所有青霉素类和头孢菌素类耐受，证实是成问题的。对其它药物如喹诺酮类是普遍耐受的(Malabarta，A.等人，1997，Eur.J.Med.Chem.，32：459-478；Lewis，K.，1994，TIBS， 19：119-123；Traub，W.H.等人，1996，Chemotherapy， 42：118-132)。用万古霉素或替考拉宁治疗通常是有效的。但是，对这些药物的耐受正在不断增加，因此需要新的治疗。例如，Hubert SK等人，(J Clin Microbiol.1999 Nov；37(11)：3590-3；PMID：10523558)论述了对万古霉素和替考拉宁敏感性下降的金黄色葡萄球菌分离种群。已经发现，某些流行的MRSA菌株包括EMRSA-15(www.phls.org.uk，Public Health Laboratories，Colindale，UK)可以产生对万古霉素耐受性增加的亚克隆(Burnie J等人，Clin Infect Dis.2000 Sep；31(3)：684-9；PMID：11017816)。曾经希望linezolid能对目前的治疗中提供更需要的选择，但Tsiodras S.等人(Lancet.2001 Jul 21；358(9277)：207-8；PMID：11476839)报道了在用此抗生素治疗透析相关腹膜炎的患者中临床分离出的一种耐受linezolid的MRSA。
此外，为有效治疗感染，特别是对所用的抗生素(类)显示耐受的感染，而给予患者的大剂量这种抗生素，是细胞毒的和肾毒性的，尽管有助于挽救患者的生命，但可以引起严重的副作用。
对葡萄球菌感染的治疗和诊断先前在本领域中被广泛地讨论，特别是相关的公开物包括WO98/01154、WO99/50418和EP 0786519。抗生素耐受的原因也在公开物中被讨论，如Allignet J.(Gene 1997 Nov 20；202(1-2)：133-8；PMID：9427556)。
因此，明显的需要对微生物，特别是金黄色葡萄球菌感染的新的和更强的治疗。
本发明者现在已发现，特殊的联合药剂，即具有新的抗原结合部分的抗体(详述如下)与糖肽抗生素(如万古霉素或替考拉宁)，有非常惊人的协同治疗效果——与单独使用相比，糖肽抗生素的治疗有效性明显地提高了。特别是在被治疗的微生物对糖肽抗生素耐受的情况下。重要地，通过万古霉素与SEQ ID NO：2的抗体一起使用，本发明能够有效治疗万古霉素完全耐药和万古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌菌株。此前，现有技术中没有提示可能获得此结果。糖肽抗生素通过影响细菌细胞壁发挥作用。其它的抗生素如青霉素类也影响细菌细胞壁。但是，本发明者发现，它们的有效性没有通过与SEQ ID NO：2的抗体一起使用而改善。特别地，实验显示，与SEQID NO：2的抗体一起使用，氟氯青霉素的有效性没有改善。使用SEQ ID NO：2的抗体，耐受氟氯青霉素的细菌的耐受性没有下降。
按照本发明，提供了具有SEQ ID NO：2序列的抗体或其抗原结合片段。抗体由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码，尽管核苷酸序列当然可以容易地被修饰以，例如，优化用于合成该核苷酸的特定微生物的密码子，或为其它原因所需的密码子。
SEQ ID NO：2抗体(也称作″Aurograb″RTM)是人的遗传重组体抗体。它与免疫显性细胞表面抗原GrfA结合，后者是葡萄球菌ABC转运子蛋白(WO 99/50418；Burnie JP等人，Infect Immun.2000 Jun；68(6)：3200-9；PMID：10816464)。最初，它来自金黄色葡萄球菌败血症康复并产生GrfA抗体的患者。它具有内在的抗葡萄球菌活性，并在体外和体内显示与万古霉素和其它糖肽抗生素协同对抗广谱金黄色葡萄球菌菌株，包括MRSA和万古霉素耐药MRSA。SEQ ID NO：2抗体的抗菌活性，无论单独还是与糖肽抗生素联合，都显著地有助于金黄色葡萄球菌感染的治疗。
人血浆来源的免疫球蛋白(Ramisse F等人，J Infect Dis.1993Oct；168(4)：1030-3；PMID：8376815)和兔抗GrfA产生的超免疫抗血清，都在葡萄球菌感染模型中有保护作用(见下面的″实验″章节)。对GrfA特异的人重组体抗体在MRSA感染小鼠模型中有保护作用。GrfA的特殊氨基酸序列，即SEQ ID NO：3的抗原决定簇，被发现经常地为金黄色葡萄球菌败血症康复患者的体液免疫反应所靶向(Burnie JP等人，2000见上)。
但是，现有技术中没有提示采用糖肽抗生素如万古霉素、替考拉宁和达托霉素，与抗GrfA抗体联合应用可有效改善对微生物感染如金黄色葡萄球菌感染的治疗，特别地，没涉及对SEQ ID NO：3抗原决定簇特异的抗体，更特别地，没涉及具有SEQ ID NO：2序列的抗体。
因此，按照本发明，提供了含有治疗有效量的糖肽抗生素和特异性抗GrfA的抗体的药物，特别是特异性抗SEQ ID NO：3抗原决定簇的抗体。还提供了制备该药物的方法、药物包装和全部包含或使用相同药物的治疗方法。该药物可用于治疗金黄色葡萄球菌感染。如这里所用，术语″治疗″是指设计用来治愈、缓解、去除或减轻这种感染症状的任何治疗，或用来防止或减少其感染的可能性，包括预防。
GrfA蛋白，即ABC转运子蛋白，已经从金黄色葡萄球菌中分离和纯化，但在其它生物体中存在具有相同功能的同源物，它们可被用作治疗靶标。因此，可以制备抗非金黄色葡萄球菌微生物产生的GrfA同系物的抗体，并可与糖肽抗生素一起使用以有效治疗患者的微生物感染。治疗可以产生效果的其它微生物实例是其它的葡萄球菌，特别是凝固酶阴性的葡萄球菌，如溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。也可以治疗肠球菌感染，特别是粪肠球菌和屎肠球菌，如可以治疗棒状杆菌如杰式棒状杆菌和干燥棒状杆菌所致的感染。
GrfA同系物与GrfA可具有至少60％的序列同源性，例如至少70、80、85、90、95、96、97、98、99或99.5％的序列同源性。采用NCBIBLASTN(核苷酸序列比较)或BLASTP(多肽比较)程序，2.1.2版，以默认参数可确定GrfA序列同系物。NCBI BLAST程序可见www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/。这里所用的术语序列同一性是指最佳排列序列的氨基酸残基，其在相应的相对位置上正确地匹配。
在非金黄色葡萄球菌的生物体中，特别是其它的葡萄球菌中，产生抗体并作为治疗基础的抗原决定簇(SEQ ID NO：3)仍然可能是相同的。
因此，按照本发明，提供了治疗感染的药物，特别是金黄色葡萄球菌感染，该药物含有治疗有效量的糖肽抗生素和SEQ ID NO：2抗体或其抗原结合片段。
还提供了用于制备治疗感染药物的方法的糖肽抗生素和SEQ ID NO：2抗体或其抗原结合片段。
在实施抗感染治疗中，特别是金黄色葡萄球菌感染，糖肽抗生素和抗体或抗原结合片段可以分别地或连续地给予患者。按照本发明还提供了含治疗有效量的糖肽抗生素和SEQ ID NO：2抗体或其抗原结合片段的药物包装。
按照本发明还提供了使用糖肽抗生素和SEQ ID NO：2抗体或其抗原结合片段制备治疗感染的药物，特别是金黄色葡萄球菌感染。
按照本发明还提供了在患者中治疗感染的方法，特别是金黄色葡萄球菌感染，包括给予该患者治疗有效量的糖肽抗生素和SEQ ID NO：2抗体或其抗原结合片段的步骤。
在本发明中特别使用的糖肽抗生素是万古霉素、替考拉宁和达托霉素，尽管本发明当然延伸至糖肽抗生素家族的其它成员。
这里所用的各种语法形式的术语″抗体″是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即包含抗体结合位点或抗体结合部位的分子。这种分子也称作免疫球蛋白分子的″抗原结合片段″。
举例说明的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、实质上完整的免疫球蛋白分子和包含抗体结合部位的免疫球蛋白分子部分，包括本领域已知的Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv和F(v)部分。
术语″抗体结合位点″是指由重和轻链可变和超变区组成的抗体分子的结构部分，特异地与抗原结合(与之发生免疫反应)。
关于SEQ ID NO：2抗体，它可被容易地修饰以改变其氨基酸序列，同时呈现相同的抗体结合部位并保持其抗原结合特异性。总的来说，其结构被排列(氨基至羧基末端序列)成通过连接子共价连接在一起的人免疫球蛋白可变重结构区(VH)和可变轻链(VK)，并具有His羧基末端序列。
每一个可变区由互补决定区CDR1、CDR2和CDR3组成，它们是界定抗体的抗原结合特异性的基础，即抗体结合部位。本发明者发现，在这些区中，VH区的CDR3部分在界定抗原特异性中是最重要的。关于抗体的进一步讲授可在本领域广泛获取，如Harlow，E.和Lane，D.，″抗体应用：实验室手册″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1998。通过关于抗体结合位点的抗体结合部位界定部分的公共常识和上述讲授，本领域技术人员能够容易地修饰SEQ ID NO：2序列以产生具有相同抗体结合部位的可选择抗体，使之获得相同或相似的治疗效果。
例如，SEQ ID NO：2抗体的抗原结合片段可容易地通过简单地去除一个或多个羧基末端His残基而制备。其它的修饰实例包括接枝SEQID NO：2抗体的超变区(互补决定区)到不同于SEQ ID NO：2的可变结构区上，使得到的抗体仍然具有相同的抗体结合部位(见如，EP 239400和类似文献)。
″治疗的改善″的意思是，指定剂量的糖肽抗生素与本发明抗体一起给予患者时比单独用药具有更大的治疗效果。相似地，同单独给予糖肽抗生素相比，与本发明抗体一起用药可以用较小剂量的糖肽抗生素在患者中获得所需的治疗效果。特别是在微生物如金黄色葡萄球菌对糖肽抗生素耐受的情况下。这对于减少任何治疗副作用可以是非常有用的。
即使金黄色葡萄球菌是耐药的，通过给现有的糖肽抗生素“恢复力量(second wind)”并使其对如金黄色葡萄球菌感染的治疗有效，本发明提供了药物和治疗方法，其安全性和有效性可以容易地被评价且不涉及新的物质种类—糖肽抗生素的安全性参数已熟知并可应用于本发明。相似地，应用抗体作为本发明中的其它活性成分是相对简单的安全性问题。特别地，当抗体是以人抗体序列的重组抗体片段形式时，其免疫原性将会非常地低。此外，应用在非常短的时间内(例如数天)给予抗体的治疗方案意味着患者的免疫系统不容易形成对其的免疫反应。因此，由产生抗本发明抗体的抗体而引起的有害超敏型反应及免疫复合物的形成/沉积是非常小的。
SEQ ID NO：2的抗体也有若干特殊的优势——它没有能够激发补体沉积和巨噬细胞结合的Fc部分，因此不太可能引起能够导致炎症和组织损害的不适当的补体级联活化。
由于不使用动物来源的产物生产本发明抗体，给患者引入人或动物感染性疾病病因或致癌基因的可能性能够被避免。
本发明药物的治疗方案和剂量描述如下，本领域技术人员将容易地明白将其改进，特别知道与糖肽抗生素一起使用的治疗方案并将能够适当地修改它们。例如，可以容易地使用简单的剂量-反应试验，在哺乳动物模型如小鼠类模型中的治疗结果可以简单地外推到人。
参考附图，本发明将变得更为清楚，它们作为例子仅显示了金黄色葡萄球菌感染的治疗形式。
图1显示高剂量Aurograb的药代动力学。X轴是以分钟为单位的时间。Y轴是Aurograb在血样中的μg/ml。
                        实验
下面详述的实验显示，Aurograb(即SEQ ID NOs：1和2)，本发明的特异抗GrfA的人重组抗体片段具有内在的体外和葡萄球菌感染鼠中抗葡萄球菌的活性，它显示与糖肽抗生素的协同活性，特别是广谱糖肽抗生素万古霉素。
与糖肽抗生素的协同活性表现为：
(1)在体外存在Aurograb情况下，万古霉素的最低抑制浓度减小和
(2)用金黄色葡萄球菌激发后，单剂量Aurograb(2mg/kg)与单剂量万古霉素(6mg/kg)联合给药，金黄色葡萄球菌感染鼠类模型中的器官集落计数减少。
除非另有说明，这里详述的所有步骤采用标准方案按照可应用的厂商使用说明书进行。各种技术的标准方案包括PCR、分子克隆、操作和测序、抗体制备、抗原决定簇绘图和模拟型设计、细胞培养和噬菌体显示，描述于下列讲义，如McPherson，M.J.等人(1991，PCR：实用方法，Oxford University Press，Oxford)，Sambrook，J.等人(1989，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbour Laboratory，New York)，Huynh和Davies(1985，″DNA克隆第I卷——实用方法″，IRL Press，Oxford，D.M.Glover主编)，Sanger，F.等人(1977，PNAS USA 74(12)：5463-5467)，Harlow，E.和Lane，D.(″应用抗体：实验室手册″，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，1998)，Jung，G.和Beck-Sickinger，A.G.(1992，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.，31：367-486)，Harris，M.A.和Rae，I.F.(″细胞培养一般技术″，1997，Cambridge University Press，ISBN 0521 573645)，″肽类和蛋白类的噬菌体显示：实验室手册″(Kay，B.K.，Winter，J.和McCafferty，J.主编，Academic Press Inc.，1996，ISBN0-12-402380-0)。
其中，这里细述方法使用的试剂和设备可从这些公司获得：Amersham(www.amersham.co.uk)，Boehringer Mannheim(www.boehringer-ingeltheim.com)，Clontech(www.clontech.com)，Genosys(www.genosys.com)，Millipore(www.millipore.com)，Novagen(www.novagen.com)，Perkin Elmer(www.perkinelmer.com)，Pharmacia(www.pharmacia.com)，Promega(www.promega.com)，Qiagen(www.qiagen.com)，Sigma(www.sigma-aldrich.com)和Stratagene(www.stratagene.com)。
在公开物指定的″PMID″参考号码处，美国国家医学图书馆给它们分配了PubMed标识号，从中在www.ncbi.nlm.nih.gov.上可以获得每一个出版物的完整文献目录信息和摘要。这也提供了获得完整公开物电子拷贝的直接方式，特别是在如PNAS、JBC和MBC公开物的情况下。
这里讨论的每一个文献的内容，包括这里引用的文献，均在此整体合并为参考文献。
1.人体研究
为此研究，Aurograb与万古霉素联合给药以降低培养证实的深层MRSA感染患者的死亡率和/或发病率。此研究分三部分进行：
i)耐受性和剂量范围研究，3个MRSA感染患者组给予分段逐步升高剂量的Aurograb，开始于亚治疗剂量(0.1mg/kg)，升至1mg/kg b.d.，在此过程中，仔细监测每一个患者的任何有害副作用。
ii)中期的、开放、标记研究，其中5个MRSA感染患者被给予预先的Aurograb治疗过程，即1mg/kg b.d.7天，仔细监测耐受性和药代动力学。根据历史对照可以进行初步的有效性评价。
iii)前瞻性的、双盲、随机化II期试验。
2.物理、化学和药学特性
表1：
物理形态： Aurograb是白色无定形冻干粉末，以2mg/mL在水中溶解，产生清亮、无色的溶液。具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的重组蛋白——人scFv，和6个组氨酸氨基酸残基的羧基末端组氨酸标记。单体——28.1kDa——大约18％的分子以同源二聚体形式存在。白色粉末或易碎的固体。吸湿的Aurograb调整在pH9.5±0.2。
结构分子式：
分子量：
特征：
酸度/碱度：
3.制剂、组合物、处理和储存
3.1制剂和组合物
Aurograb的完整组合物在下面的表2中给出。它由每小瓶10mg的冻干(冷冻干燥的)粉末组成。静脉注射前不久，在5mL消毒的可注射水中重悬浮粉末而给药。不应使用其它的溶剂取代水，因为Aurograb对pH波动敏感并被特别地重悬浮在水中进行配制。
表2：
成分名称 每Aurograb小瓶的量 用5mL水重制后每ml的量 功能
Aurograb 10mg 2mg 活性成分
尿素PhEur，BP，USP，JP精氨酸Ph Eur 150mg174mg 30mg34.8mg 赋形剂赋形剂
存在L-精氨酸和尿素以维持制剂的pH平衡并保证Aurograb的溶解度。两者存在的剂量被认为对临床静脉内给药是安全的。例如，单剂量Aurograb(75Kg体重的患者37.5mL)含7.5mmoles精氨酸。这比儿童测量生长激素水平过程中给予的L-精氨酸最大允许每日剂量(ABPI纲要，1998-99)低26倍。对于尿素，35mL单剂量的Aurograb含1.125g尿素。这又更低于尿素的150g最大允许每日剂量(这是经静脉内输送治疗急性颅内压需要的最大剂量——ABPI纲要，1998-99)。
3.2储存
冻干药物在玻璃小瓶中4℃暗处储存。在环境温度下过夜运输是可接受的。避免长期暴露于明亮光线或过度潮湿。已经观察到4℃(3个月)储存后不改变Aurograb活性。
用水重制后，Aurograb必须储存在4℃并应在14小时内使用。如果置于室温，活性将缓慢损失。
3.3制备和给药
每小瓶10mg提供的Aurograb，于静脉注射前不久，在5mL消毒的可注射水中重悬浮粉末给药。人剂量的实例是1mg/kg b.d.。消毒水用皮下注射器/针经橡皮帽直接注射进入小瓶。
为重制：
添加终容积一半的水(2.5ml每小瓶)并混旋以溶解
过滤(如必要)以去除任何未溶解的物质
添加剩余的水
NB.如果延迟给药，储存在4℃(最长至14小时)。
不应用其它溶剂取代水，因为Aurograb对pH波动敏感并已被特别地配方以在水中重悬浮。
Aurograb应当通过缓慢静脉内弹丸注射给药，例如通过静脉内给药装置，它应当首先用盐水冲洗以去除任何其它静脉内液体的痕迹，然后在用药后再次冲洗。
不需要特殊的预防措施来清除溢液或废物处置。
静脉用盐水与重制的Aurograb是可配伍的(以50∶50稀释)。它与20％葡萄糖和重碳酸钠缓冲液很少配伍使用，如ELISA活性下降所显示，因此如果要经过与这些或其它液体同一个静脉给药装置给药，注射端口必须在给予Aurograb前后用盐水冲洗。
4.非临床研究
Aurograb在体外和体内都显示对广谱金黄色葡萄球菌菌株的抗菌活性。此外，Aurograb已显示与万古霉素联合使用时发挥协同的抗菌作用。
4.1非临床有效性研究：体外资料
Aurograb与万古霉素联合显示抗宽范围MRSA菌株的协同活性，包括对万古霉素中度耐受的EMRSA菌株(″VISA″-万古霉素不敏感MRSA)。
用相同的MIC方法学常规地应用到抗生素来准备这些资料。
目的：证明与万古霉素联合对宽范围MRSA流行菌株的协同作用。
观察指标：通过Aurograb联合应用时，万古霉素MIC的下降证明协同作用。
引言
通过在万古霉素浓度逐步升高的营养肉汤中连续传代，引入的MRSA流行菌株容易地产生对万古霉素中度耐受(即MIC 4或8μg/ml)的亚群(Burnie J等人，Clin Infect Dis.2000 Sep；31(3)：684-9；PMID：11017816)。这可能是许多与万古霉素有关的治疗失败的原因。在此研究中，检验了Aurograb抗这些VISA和完全万古霉素敏感亲代EMRSA-15菌株的活性。
方法
MRSA菌株在营养肉汤中过夜生长，并稀释至1×103细胞/mL的接种体。100μl等份的培养物置于平底的微量滴定板，并加入0.125-250μg/ml的万古霉素。培养物进一步孵育2天。最低生长抑制浓度(MIC)定义为没有细菌生长发生的最高抗生素浓度，并通过分光光度法评价培养物中浊度(生长)缺失来测定。MICs在存在外源Aurograb或Aurograb制剂缓冲液(阴性对照)的情况下被测定。
结果：(表3)
MRSA菌株 在存在以下浓度Aurograb情况下，万古霉素的MIC
 VISA：- 0μg/ml 60μg/ml 80μg/ml 125μg/ml
 EMRSA-1 8μg/ml 4μg/ml 2μg/ml ＜0.125μg/ml
 EMRSA-2 4μg/ml 0.5μg/ml 1μg/ml 0.125μg/ml
 EMRSA-8 8μg/ml 2μg/ml 1μg/ml ＜0.125μg/ml
 EMRSA-11 4μg/ml 4μg/ml 1μg/ml 0.125μg/ml
 EMRSA-12 8μg/ml 4μg/ml 2μg/ml 0.125μg/ml
 EMRSA-15 8μg/ml 4μg/ml 2μg/ml ＜0.125μg/ml
 亲代EMRSA-15 1μg/ml - 0.25μg/ml ＜0.125μg/ml
活性谱：在所有检测的菌株中抗菌活性增加是明显的，表明抗MRSA菌株的广谱活性。
协同作用：Aurograb具有提高MRSA对万古霉素敏感性的能力，包括对万古霉素敏感性下降的MRSA。
为测定万古霉素对若干MRSA菌株的MIC及Aurograb抗体对MIC的影响，进行了另外的实验。还用氟氯青霉素代替万古霉素进行了实验，以研究Aurograb如何影响青霉素型抗体的有效性。结果在表3a中给出：
EMRSA菌株 万古霉素的MIC 万古霉素+100μg/ml Aurograb的MIC
1 0.5μg/ml 0.03μg/ml
2 0.5μg/ml 0.03μg/ml
3 0.5μg/ml 0.03μg/ml
4 0.5μg/ml 0.03μg/ml
5 0.5μg/ml 0.03μg/ml
6 0.5μg/rnl 0.0125μg/ml
7 0.5μg/ml 0.03μg/ml
8 0.5μg/ml 0.0125μg/ml
9 0.5μg/ml 0.0125μg/ml
10 0.5μg/ml 0.03μg/ml
11 0.5μg/ml 0.03μg/ml
12 0.5μg/ml 0.03μg/ml
13 0.5μg/ml 0.03μg/ml
14 0.25μg/mi 0.3μg/ml
15 0.5μg/ml 0.03μg/ml
16 0.5μg/ml 0.03μg/ml
用氟氯青霉素获得的结果显示，所有EMRSA菌株获得的MIC＞256μg/ml。氟氯青霉素+Aurograb得到相同的结果并显示氟氯青霉素MIC没有减小。
结论：Aurograb与万古霉素联合使用应当提高治疗有效性并阻止出现万古霉素耐药菌株。就靶分子而言，由于抗体的结构和功能，可以预期使用其它的糖肽抗生素如替考拉宁可以获得相似的结果，金黄色葡萄球菌对其采用的耐受机制与对万古霉素相同，因此也是抗体的靶标并对其治疗敏感。
4.2非临床有效性研究：体内资料
葡萄球菌感染的鼠类模型被广泛使用，并常规地用于抗菌药物的评价。这是被感染的人体内有效性的很好预测器，因为金黄色葡萄球菌经静脉内引入产生菌血症，由此病原体播散至其它器官，包括肾、肝和脾。因此，感染(败血症)的状态类似于在感染患者中的情况。而且，动物模型中所用的Aurograb静脉内给药途径(下面给出的资料)与通常在患者中使用的途径相同，提高了药代动力学、药物生物利用度和有效性可比较的可能性。
资料系1：Aurograb内在的抗EMRSA-15抗菌活性
目标：证明单独给予Aurograb对感染万古霉素敏感的MRSA菌株EMRSA-15的小鼠是有疗效的。
目的：有Aurograb情况下，通过死亡率的下降或肾、肝或脾中细菌含量(集落形成单位)的减少来显示抗葡萄球菌活性。
方法：20只雌性CD-1小鼠给予亚致死激发量(1.3×107cfu)的耐甲氧西林、万古霉素敏感株金黄色葡萄球菌(EMRSA-15，TypedHospital Isolate，Central Manchester Healthcare Trust)100μl，弹丸静注(所有静脉注射都通过尾静脉进行)。1小时以后，两组10只的小鼠接受以下的100μl静脉弹丸注射：-
1.缓冲液制剂(精氨酸-尿素)，作为阴性对照，或
2.Aurograb(2.0mg/kg)的缓冲液制剂。
继续48小时，处死所有动物，确定每克器官的活性cfu后。
结果：(表4)
  组(n＝10) Aurograb     肾     肝     脾
                    Log cfu/g组织
1.制剂缓冲液  - 8.58±2.59  4.79±0.53 5.04±0.24
2.Aurograb  2mg/kg 7.20±1.15  3.63±0.68 3.79±0.82
结论：
抗细菌活性—采用在肾中选择性定位，在肾，肝和脾中发现了有活力的葡萄球菌。使用Aurograb可导致所有三种器官中发现的活生物体对数(10倍)性减少。这表明使用鼠的深层感染模型，在不使用任何其他的外源性抗微生物物质的情况下，Aurograb可减少鼠实验性感染中金黄色葡萄球菌的活力。
资料系2：Aurograb剂量范围研究
目标：使用Aurograb对抗金黄色葡萄球菌EMRSA-15株的剂量范围研究。
目的：当Aurograb以单一药剂给药，与安慰剂对照组相比，可更大幅度的减少肾，肝或脾中的细菌含量(器官cfu)，证明了其抗菌活性。通过在不同剂量下不同器官中比较cfu(表示为每克组织中的cfu对数)来确定剂量范围。
方法：40只雌性CD-1小鼠(24-26g)静脉弹丸注射金黄色葡萄球菌进行激发，2小时后，静脉给予单独给予安慰剂或Aurograb(2mg/kg，1mg/kg或20mg/kg)。在48小时处死所有小鼠，培养肾，肝和脾以确定器官活力计数。
结果：表示为每克组织的对数cfu
实验1：金黄色葡萄球菌(1.5×107cfu)：EMRSA-15(表5)
  Aurograb剂量     肾     肝     脾
    0   8.40±2.256   7.22±2.52   6.98±2.39
    2mg/kg   7.62±1.16   5.22±1.39   5.10±1.29
    1mg/kg   8.7±2.6   5.40±1.38   5.33±1.21
    0.2mg/kg   8.5±2.55   6.61±3.03   5.69±1.16
实验2：金黄色葡萄球菌(9×106cfu)：临床分离EMRSA-15-低剂量Aurograb(表6)
Aurograb剂量     肾     肝     脾
0.2mg/kg Aurograb   7.14±1.28   3.13±0.44   3.40±0.64
安慰剂1   7.36±1.05   4.14±1.27   4.01±1.26
1对GrfA的非保护性抗原决定簇特异的阴性对照抗体(WC7)。
实验1：在1.0至2.0mg/kg Aurograb的范围内，对肝和脾可达到活细菌减少10至100倍。在0.2mg/kg Aurograb时，从脾中的清除率仍然是良好的，但在肝是减小的。最高的剂量可引起肾细菌计数0.8的对数性减少，但较低剂量时不减少。
实验2：在0.2mg较低的剂量下很明显在肾中活葡萄球菌没有减少，但在肝和脾中有杀死细菌的证据。
结论：使用2mg/kg的Aurograb可使在所有三种器官中发现的活生物体减少，但特别是脾和肝。1mg/kg剂量的Aurograb也显示在脾和肝中明显的抗菌活性，但在肾中活性丧失。在0.2mg/kg的较低剂量下，仍在脾中显示抗菌活性，在肝中低一些。
对人使用的推算：小鼠2.0mg/kg的单一剂量在肝和脾的计数中产生大约2.0对数下降，在肾计数中产生0.8的对数下降。以体重为基础，对于人这相当于1mg/kg，每天2次。
资料系3：Aurograb的抗菌活性和与万古霉素的协同作用：亚致死模型。
目标：为了证明对于用亚致死剂量的金黄色葡萄球菌感染的小鼠，在单独给药时Aurograb具有抗菌性，当与万古霉素联合给药时具有协同作用。
目的：通过单独使用Aurograb，在肾，肝或脾中的细菌含量(集落形成单位)减少而证明其抗菌活性。当Aurograb和万古霉素一起给药时器官集落计数较两种抗菌剂单独给药时的计数大幅度降低，从而证明其协同作用。
方法：60只雌性CD-1小鼠(22-24g)以100μl弹丸静脉注射给予1×107cfu EMRSA-15。2小时后，每组10只小鼠，接受单一100μl弹丸静脉注射：
1组-6.0mg/kg万古霉素+2.0mg/kg Aurograb
2组-6.0mg/kg万古霉素+0.2mg/kg Aurograb
3组-6.0mg/kg万古霉素+安慰剂(制剂缓冲液)
4组-安慰剂+2.0mg/kg Aurograb
5组-安慰剂+0.2mg/kg Aurograb
6组-安慰剂+2.0mg/kg Aurograb
所有小鼠在48小时处死，培养肾，肝和脾。
结果：表示为每克组织的对数cfu，除非在大多数小鼠(＞5)中被清除(即器官培养阴性)。N/A＝不适用的。(表7)
组别    万古霉素   Aurograb     肾     肝     脾
               Log cfu/g组织(已清除的小鼠数目)
1     6mg/kg   2.0mg/kg     6.02±1.21  0(所有10只均清除) N/A(9只清除)
2     6mg/kg   0.2mg/kg     6.28±1.36  N/A(7只清除) 3.51±0.63(5只清除)
3     6mg/kg     6.53±1.53  N/A(8只清除) 3.63±0.91(5只清除)
4     -   2.0mg/kg     7.30±1.26  N/A(8只清除) 3.54±0.61(4只清除)
5     -   0,2mg/kg     7.50±1.53  4.28±1.28(2只清除) 3.91±0.87(3只清除)
6     -   -     7.65±1.62  4.34±1.37(1只清除) 4.57±1.53(1只清除)
单独使用：Aurograb以2.0mg/kg(4组)单独应用与单独使用万古霉素(3组)产生可相比较的结果，每个分别可清除8只小鼠的肝，4只和5只小鼠的脾，相比阴性对照组(6组)只有1只小鼠可清除肝和脾。肾清除率万古霉素优于Aurograb，尽管没有1只小鼠可清除肾脏感染。
协同应用的小鼠(1组)接受2.0mg/kg Aurograb和万古霉素(6mg/kg)，显示所有10只小鼠从肝中完全清除葡萄球菌，从脾中的清除率增加，9只小鼠培养阴性，相比单独使用Aurograb或万古霉素清除4-5只，未处理组1只清除。接受联合治疗(1组)的肾集落计数与单独接受万古霉素的小鼠(3组)相比另外减少了0.5对数，与阴性对照小鼠(6组)相比减少了1.6对数。这证明了在Aurograb和万古霉素之间存在协同作用。
资料系4：Aurograb与万古霉素的协同：致死性模型。
目标：证明对用致死剂量的金黄色葡萄球菌感染的小鼠，当单独给药时Aurograb是有抗菌性的，当与万古霉素联合应用时是有协同性的。
目的：通过单独使用Aurograb，死亡率降低而证明其抗菌活性。当Aurograb和万古霉素一起给药，而不是单独给予万古霉素时，死亡率大幅度降低，从而证明其协同作用。
方法：60只雌性CD-1小鼠(22-24g)以100μl弹丸静脉注射给予8×107cfu剂量的金黄色葡萄球菌(EMRSA-15的新鲜临床分离物)。2小时后，每组10只小鼠，接受单一100μl弹丸静脉注射：
1组-4.0mg/kg万古霉素+2.0mg/kg Aurograb
2组-4.0mg/kg万古霉素
3组-2.0mg/kg万古霉素+2.0mg/kg Aurograb
4组-2.0mg/kg万古霉素
5组-2.0mg/kg Aurograb
6组-安慰剂
所有小鼠在48小时处死，培养肾、肝和脾。
在48小时采集前死亡的小鼠不进行器官集落计数。
结果：表示为每克组织的对数cfu，除非大多数小鼠(＞5)死亡(表8)。
组别 万古霉素  Aurograb  24h时的生存     肾     肝     脾
           Log cfu/g组织
    1  4.0mg/kg  2.0mg/kg     8  7.25±1. 4.55±1. 4.24±0.
    2  4.0mg/kg  -     4           统计上存活数太少
    3  2.0mg/kg  2.0mg/kg     6  7.66±1. 5.55±1. 5.16±1.
    4  2.0mg/kg  -     5           统计上存活数太少
    5  -  2.0mg/kg     6  7.87±1  5.18±0. 5.53±2.
    6  -  -     3           统计上存活数太少
死亡率：这株金黄色葡萄球菌，可能因为是新鲜的临床分离物，在鼠模型中较以前使用的实验室EMRSA-15菌株的毒力更强，观察到很高的死亡率。与未处理组(7只死亡)相比，单独给予Aurograb(2.0mg/kg)可使死亡率下降(4只死亡)，与单独使用万古霉素(6和5只死亡)是可比较的。这表明在4.0mg/kg时Aurograb具有与万古霉素相当的固有的抗葡萄球菌活性。
协同作用：接受联合治疗(Aurograb 2.0mg/kg和万古霉素4.0mg/kg)的小鼠较单独使用万古霉素或Aurograb有更高的生存率，表明两种药物有协同效应。
5.在动物中的药物动力学和产物代谢
5.1药物动力学
Aurograb的药物动力学(PK)参数已经在小鼠中进行了研究。使用鼠模型是因为已经在这种种属中进行了效应和剂量范围的研究，以及反复的剂量毒理学研究。小鼠以静脉弹丸的形式给予单一的最高剂量，然后重复检测血液水平和器官分布。对尿标本也进行了分析。分析标本的功能活性，用ELISA测定(仅对血标本)，测定药物浓度(SDS PAGE/免疫印迹)。
结果：结果在图1中显示。给予单一静脉弹丸注射Aurograb(10mg/kg)的小鼠显示了满意的血液水平。
所有器官(肺，脑，肝，脾，心，肾和血液)通过24小时可被清除。
6.2血液相容性研究
本研究由苏格兰Inveresk Research的生化药物学系完成，其目的是评价Aurograb静脉应用的适应性。
从健康人志愿者中采集血标本，转移至含有Aurograb，Aurograb载体，皂甙或盐水的试管中，并在37℃孵育1小时。离心后，确定上清液中血红蛋白的量以测定溶血作用。根据美国试验和材料协会分类系统(ASTM F756-93，1993)数据表明0.1mg/ml Aurograb和Aurograb载体是非溶血性的。这可与无血溶性的生理盐水相比较，总体上与阳性参考化合物(皂甙)是对比的，后者发现是具有严重的溶血性的。
7生产Aurograb抗体
7.1介绍
Aurograb以包含体的形式在大肠杆菌中产生。包含体的分离，溶解，变性和重折叠以前已经被详细叙述(见“抗体：实验室手册”。Harlow，E.和Lane，D.1988。Cold Spring Harbor Laboratory Press；“包含体和蛋白以生物学活性形式的纯化”。Mukhopadhyay，A.1997.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.；56：61-109)。这样一种步骤的实例概述在本应用中。简言之，从细胞团中提取包含体，溶解/变性，重折叠和使用层析纯化。用强的T7启动子从载体pET29b(Novagen)中过度表达Aurograb。作为质量控制的，在无菌发酵罐(1000L)中制备的纯培养物，使用不含动物产物的培养基产生细胞团。使用的大肠杆菌株是遗传缺陷的(不能在环境中定植/)和无毒力的。在下游处理过程中去掉的杂质是(1)大肠杆菌细胞蛋白(HCPs)(2)大肠杆菌致热原(主要是内毒素)(3)发酵添加剂(抗生素)(4)下游处理添加剂(缓冲液和NiSO4)。
来自大肠杆菌的大量污染物和实质上所有发酵培养基来源的污染物可在从包含体中提取蛋白的过程中被去掉。为此，通过离心分离细胞团，采用微型fluidiser进行破碎。Aurograb包含体从细胞团中通过三个离心-重悬浮-微流体化作用步骤分离出来，因此要大量的冲洗包含体。包含体被溶解和重折叠，经过2天的时间，在氧化催化剂氯化铜的存在下，形成了正确的和生物学活性结构的Aurograb分子。进行广谱透滤作用以从重折叠反应中去除小分子和痕量的残余卡那霉素(从发酵反应中)。剩余的宿主细胞蛋白通过固定的镍-金属亲合层析(IMAC)和阴离子交换被去除。特别是，对于从大肠杆菌中制备的药物有显著的安全性问题的内毒素，可有效地在IMAC的过程中通过添加脱氧胆酸而被去除。最后的痕量大肠杆菌HCP在阴离子步骤中被去掉。IMAC步骤中的痕量镍可采用镍亲合柱去掉。最终层析缓冲系统中的小分子可再次使用透滤作用从制剂缓冲液中去除。大量产物冻干在小瓶中以用于患者。下面编号的段落将特别地详细描述Aurograb抗体的生产过程。
7.2 Aurograb生产过程
发酵和下游的处理采用下面总共九个步骤：
1.发酵
2.收获和分离包含体
3.重折叠
4.浓缩和透滤
5.过滤和无菌过滤
6.纯化-固定镍(Ni2+)金属亲合层析(IMAC)
7.纯化-通过螯合的琼脂糖层析去掉镍
8.纯化-阴离子交换层析
9.透滤和大量充填
7.3发酵
冻存的表达Aurograb的大肠杆菌(CloneJM109(DE3)(pSaABC4))储存液接种至4×500ml玻璃锥形瓶中，在转移至1000L搅拌发酵罐(MBR)之前制备接种物。预培养物(添加卡那霉素)在37℃孵育，振摇15-20小时，直至预培养物OD578＝4.0-8.0，代表7-8次细胞分裂。在生产的规模时，预培养物转移至含有1000L营养肉汤的1000L发酵罐(MBH)中。产生的培养物在37℃孵育总共14-18小时，代表7次细胞分裂。接种后大约10-13小时，当OD578＝5-8，产生的培养物通过添加23.8g IPTG(100μM)而被诱导。
7.4收获和分离包含体
细胞通过离心收获(诱导后4h)，Alfa Laval BTPX 205离心机，12,800g，流率大约为400L/h。收获的大肠杆菌细胞团在-50℃储存在PE袋中(Kendro)。来自单批发酵的已经储存在-50℃的100％细胞团的下游处理形成了一次纯化过程。细胞团复温，重新悬浮在1000L溶解缓冲液中。重悬浮的细菌细胞进行高压均化作用(APV Gaulin MC15)，ca.1000巴(15,000psi)，流率ca.500L/h。通过离心沉淀包含体，ca.12.800g，流率ca.400L/h。然后用400L溶解缓冲液冲洗包含体，离心沉淀，ca.12.800g，流率ca.400L/h，总共三次。冲洗的包含体在重折叠步骤前以混悬液储存在-70℃。包含体通过强烈的搅拌5-10分钟在40L 6M尿素/100mM Tris pH12.5中室温下溶解。
7.5重折叠
为了重折叠包含体溶液用重折叠缓冲液制成560L，加入CuCl2.2H2O至终浓度100μM。配制液在强烈的搅拌下在2-8℃孵育48小时。包含体被过滤(Sartorius GF 30″，3.0/0.8μrn)，然后滤器灭菌(SeitzSupradisc SDPEK 1，depth filter)。
7.6浓缩和透滤
采用截取10kDa(Pall)的Ω筛选通道盒(15m2)进行浓缩和透滤步骤，该通道固定在”Centrasette”不锈钢架(Pall)上，受一个1000膜片活塞泵(quattro泵)的控制。重折叠的蛋白制剂浓缩至150L，然后用3000升10mM醋酸铵缓冲液，pH9.5进行透滤。制剂调整至6M尿素，50mM Tris，10mM DCA，1M NaCl，用RO水制成最终体积为300L。透滤的重折叠液在2-8℃储存过夜。然后通过添加HCl将pH调整至8.0。
7.7过滤步骤和无菌过滤
透滤的重折叠液被过滤(Seitz SupradiscSDPEK1，depth filter)，然后滤器灭菌(微孔过滤器Opticap 10″，0.2μm)。无菌产物储存在2-8℃。
7.8固定Ni2+金属亲合层析(IMAC)
IMAC步骤在BPG300/500柱(Amersham Pharmacia)中进行。层析柱的灭菌发生在树脂定置洗净(CIP)的过程中。IMAC层析树脂(18L)最初用2柱体积的(CV)100mM NiSO4.6H2O填充。层析使用5.5(CV)平衡缓冲液(IMAC A)；5.5CV冲洗缓冲液I(IMAC B)；3.3CV冲洗缓冲液II(IMAC C)；5.5CV洗脱缓冲液(IMAC D)。从洗脱液收集的馏分用滤器灭菌(微孔过滤器Opticap10″，0.2μm)，并在2-8℃储存过夜。
7.9镍清除层析
镍清除层析是在BPG140/500柱(Amersham Pharmacia)中进行，使用2L螯合琼脂糖树脂。用5CV缓冲液(IMAC D)平衡和冲洗柱，应用含有Aurograb抗体的溶液，用2CV阴离子/调节缓冲液(50mM Tris，6M尿素pH8.7)冲洗柱，在阴离子交换层析之前保留洗脱液。
7.10阴离子交换层析
阴离子交换层析是在BPG300/500柱(Amersham Pharmacia)中进行，使用18L树脂(Q-Sepharose FF)。柱用平衡缓冲液平衡，然后用阴离子/调节缓冲液平衡。使用含有Aurograb抗体的溶液，用2CV阴离子/调节缓冲液冲洗，流过的液体滤器灭菌(微孔过滤器Opticap10″，0.2μm)，2-8℃储存过夜。
7.11透滤和大量充填
无菌流出液(含有Aurograb抗体)的pH调整至9.5，然后在10次循环体积(TOV)的10mM醋酸铵；0.5M尿素，pH9.5中进行透滤。然后进行另一次透滤步骤，在5次TOV 0.5M尿素，0.2M精氨酸pH9.5中透滤。蛋白浓缩至2mg/ml，过滤灭菌(微孔过滤器Opticap10″，0.2μm)进入Stedim袋，在2-8℃储存。
7.12缓冲液成分，培养基和溶液
生长培养基：
在接种前监测培养基的微生物污染。
对于2.5L预培养物：
大豆蛋白胨A3(Organotechnie)                 67.5g
酵母自溶产物(KAV；Deutsche Hefewerke)       35.0g
氯化钠(Ph.Eur，E.Merck)                     12.5g
甘油(Ph.Eur，E.Merck)                       75.0g
磷酸氢二钾(Ph.Eur，E.Merck)                 11.5g
磷酸二氢钾(Ph.Eur，E.Merck)                 7.5g
7水硫酸镁(Ph.Eur，E.Merck)                  1.25g
卡那霉素硫酸盐(Sigma)                       62.5mg
RO I水                                      2.5升
pH                                          7.1±0.1
上表中的物质预先称重，溶解在2.5L RO 1水中。肉汤灭菌后，加入卡那霉素硫酸盐10ml(62.5mg在50ml WFI中)。
1000L培养物的成分：
大豆蛋白胨(Organotechnie)                   27.0kg
酵母自溶产物(KAV；Deutsche Hefewerke)       14.0kg
氯化钠(Ph.Eur，E.Merck)                     5.0kg
甘油(Ph.Eur，E.Merck)                       30.0kg
磷酸氢二钠(Ph.Eur，E.Merck)                 4.6kg
磷酸二氢钠(Ph.Eur，E.Merck)                 3.0kg
7水硫酸镁(Ph.Eur，E.Merck)                  0.5kg
Struktol(消泡剂，Sichler)                   600ml
卡那霉素硫酸盐(USP，Sigma)                25.0g
RO I水                                    1000升
pH                                        7.0±0.2
1000 L发酵罐在121℃灭菌30分钟。
IPTG：
23.8g IPTG(Sigma)溶解在200ml WFI中，无菌过滤(0.2nom)。
细胞溶解缓冲液
Tris(Ph.Eur，E.Merck)                   6.06gL-1
EDTA(Ph.Eur，E.Merck)                   0.37gL-1
氯化钾(DAB，E.Merck)                    7.46gL-1
RO I水                                  1000升
pH                                      8.0±0.1
重折叠缓冲液
Tris(DAB，E.Merck)                      5.96gL-1
氯化铜(p.a.，E.Merck)                   0.018gL-1
RO I水(1000 L不锈钢容器)                600升
pH                                      9.0±0.1
透滤缓冲液：
醋酸铵(E.Merck)                         0.77gL-1
RO I水                                  1000升
pH                                      9.0±0.1
IMAC缓冲液：
标本的制备
Tris                                    1.82kg
尿素                                    108kg
氯化钠                        17.5kg
脱氧胆酸，钠盐                1.30kg
150L透滤的重折叠反应的成分用上述试剂进行调整。
IMAC层析缓冲液：
镍溶液：100mM NiSO4.6H2O(2CV)
IMACA/平衡缓冲液：100mM Tris；6M尿素；1MNaCl；10mM DCA，pH8.0
IMAC B/冲洗缓冲液：100mM Tris；6 M尿素；1M NaCl；50mM咪唑；10mM DCA，pH8.0
IMAC C/洗脱缓冲液I：100mM Tris；6M尿素；1M NaCI；150mM咪唑；pH8.0(10-15CV)IMAC D/洗脱缓冲液II：100mM Tris；6M尿素；1M NaCl；300mM咪唑pH8.0(7CV)
CIP：1M NaOH(3柱体积，孵育时间1小时)
缓冲液用Tris(USP，E.Merck)，尿素(USP，E.Merck或Riedelde Haen)，NaCl(Ph.Eur，E.Merck)，咪唑(p.a.，Fluka)，DCA(脱氧胆酸，钠盐一水化物，Microselect，Fluka)，NiSO4.6H2O(p.a.，E.Merck)制备。
Ni2+清除层析缓冲液：
平衡缓冲液：100mM Tris；6M尿素；50mM NaCl；300mM咪唑；pH8.0(5CV)
阴离子交换层析缓冲液：
平衡液：100mM Tris；6M尿素；50mM NaCl；300mM咪唑pH8.7
CIP：1M NaOH(3CV，孵育时间1小时)
透滤和制剂缓冲液
为了灭菌和储存，透滤盒用RO水冲洗，用0.5M NaOH至少再循环45分钟，用0.1M NaOH储存。
透滤缓冲液：0.5M尿素；10mM醋酸铵pH9.5
透滤(制剂)缓冲液：0.5M尿素；0.2M精氨酸pH9.5
透滤和浓缩(2盒，Ω筛选通道，10 KD，Pall)
8.确定Aurograb和万古霉素的协同效应
8.1方法
为了确定最低抑制浓度(MIC)，部分抑制浓度(FIC)和FIX(部分抑制指数)，使用方法如下。
每种最普通的EMRSA株的代表，许多万古霉素抗性亚群，和三种Linzolid抗性菌株在营养肉汤中生长过夜。细胞在IsosensitestBroth(Oxoid，UK)稀释至最终每mL接种1×103细胞。100μl等分培养物置于平底的微量滴定板中，加入的万古霉素的范围是0.125-250μg/ml。以棋盘格方式在其中加入0.3-25μg/ml范围的外源Aurograb。也制备仅含有Aurograb制剂缓冲液的阴性对照系列。培养物在37℃孵育48小时。
最低抑制浓度(MIC)定义为没有细菌生长发生时试剂的最低浓度，通过分光光度计对培养系统中无浊度(生长)时的评定而测定。这种视觉上的透明相当于99％以上的葡萄球菌死亡。
8.2结果
获得万古霉素和Aurograb(RTM)单独和联合使用的MIC值。计算部分抑制浓度(FIC)和FIX。
两种药剂之间的协同活性确定为FIX值≤0.5。0.5-4的值确定为不同的活性，值为≥4确定为拮抗作用。
在下面的表9和10中给出了实验的结果。VAN代表万古霉素。
MIC(单独)柱表示当单独给药时的最低抑制浓度。MIC(联合)柱表示当联合使用时的最低抑制浓度。
8.3结论
如在表9和10中所见，万古霉素与Aurograb一起给药可协同的引起要达到的治疗效应，其MIC水平大体上是降低的，反过来表明患者的治疗可使用更低剂量的抗生素，达到更高的治疗效应，预期能减少抗生素可能导致的副作用。结果表明即使在由万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌感染的患者，可成功的用本发明的抗体进行治疗，其与如万古霉素的抗生素联合使用，在以前无效的、无毒性的抗生素剂量水平下，可达到有效的治疗。
表9：
EMRSA株 药剂 每种药剂的MIC(μg/ml) FIC(μg/ml) FIX 结果
单独 联合
1 VAN 0.5 0.03 0.06 0.066 协同
Aurograb 125 0.75 0.006
1A VAN 8 1 0.125 0.17 协同
Aurograb 250 12.5 0.05
2 VAN 0.5 0.03 0.06 0.07 协同
Aurograb 125 0.75 0.006
2A VAN 8 1 0.125 0.17 协同
Aurograb 250 12.5 0.05
3 VAN 0.5 0.03 0.06 0.07 协同
Aurograb 250 3 0.012
4 VAN 0.5 0.03 0.06 0.06 协同
Aurograb 125 0.325 0.0026
5 VAN 0.5 0.03 0.06 0.06 协同
Aurograb 250 0.325 0.001
6 VAN 0.5 0.125 0.025 0.03 协同
Aurograb 125 0.325 0.0026
7 VAN 0.5 0.03 0.06 0.06 协同
Aurograb 125 0-325 0.0026
8 VAN 0.5 0.03 0.025 0.03 协同
Aurograb 250 0.325 0.0013
8A VAN 0.5 0.03 0.06 0.11 协同
Aurograb 250 12.5 0.05
9 VAN 0.5 0.0125 0.025 0.03 协同
Aurograb 125 0.75 0.006
10 VAN 0.5 0.03 0.06 0.07 协同
Aurogra 125 1.5 0.012
11 VAN 0.5 0.03 0.06 0.07 协同
Aurograb 125 0.75 0.006
11A VAN 4 1 0.25 0.30 协同
Aurograb 250 12.5 0.05
12 VAN 0.5 0.03 0.06 0.07 协同
Aurograb 250 0.325 0.0013
12A VAN 0.5 0.03 0.06 0.06 协同
Aurograb 250 0.75 0.003
13 VAN 0.5 0.03 0.06 0.07 协同
Aurograb 250 1.5 0.006
14 VAN 0.5 0.03 0.06 0.08 协同
Aurograb 125 1.5 0.012
15 VAN 0.5 0.03 0.06 0.07 协同
Aurograb 125 1.5 0.012
15A VAN 0.5 0.03 0.06 0.07 协同
Aurograb 250 0.75 0.006
16 VAN 0.5 0.03 0.06 0.07 协同
Aurograb 250 1.5 0.012
17 VAN 4 1 0.25 0.25 协同
Aurograb 250 0.75 0.006
表10：
EMRSA株 药剂 每种药剂的MIC(μg/ml) FIC(μg/ml) FIX 结果
单独 联合
NARSA1(Hiramatsu) VAN 8 2 0.25 0.25 协同
Aurograb 250 0325 0.001
NARSA2(Hiramatsu) VAN 3 0.5 0.17 0.17 协同
Aurograb 250 0.325 0.001
NARSA12(France) VAN 8 1 0.12 0.12 协同
Aurograb 250 0.75 0.003
NARSA17(New York) VAN 8 2 0.25 0.25 协同
Aurograb 250 0.325 0.001
SA119(Lino2X)lid R) VAN 4 1 0.25 0.27 协同
Aurograb 125 3 0.02
NARSA120(Linezolid R) VAN 4 1 0.25 0.27 协同
Aurograb 125 3 0.02
NARSA121(Linezolid R) VAN 4 1 0.25 0.27 协同
Aurograb 125 3 0.02
                                 序  列  表
<110>神经技术药物公司
<120>微生物感染的治疗
<130>N01/0697/PCT
<150>GB 0127983.5
<151>2001-11-22
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人单链(scFv)重组抗体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(792)
<223>
<400>1
atg gcc aag gtg cag ctg ttg cag tct gca act gag gtg aag aag cct     48
Met Ala Lys Val Gln Leu Leu Gln Ser Ala Thr Glu Val Lys Lys Pro
1               5                   10                  15
ggg gcc tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tat ggt tac act ttc acc     96
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Tyr Gly Tyr Thr Phe Thr
            20                  25                  30
gat tat ggt ata acc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag    144
Asp Tyr Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
tgg atg gga tgg atc age gct tat aat ggt tac aca aac tat gcg cag    192
Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln
    50                  55                  60
aag ttc cag gac aga atc acc atg acc aca gac gca tcc acg agc aca    240
Lys Phe Gln Asp Arg Ile Thr Met Thr Thr Asp Ala Ser Thr Ser Thr
65                  70                  75                  80
gcc tat atg gag ttg agg agc ctg aga cct gac gac acg gcc gta ctt    288
Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Leu
                85                  90                   95
tac tgt gcg agg gat cgg gaa gat gca tct ctg tta cgg gac ggt cac    336
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Glu Asp Ala Ser Leu Leu Arg Asp Gly His
            100                 105                 110
tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtg agc tct ggt gga ggc ggt tca    384
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
ggc gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc agc ggc ggt ggc gga tcg gaa    432
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
    130                 135                 140
acg aca ctc acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg gaa    480
Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu
145                 150                 155                 160
agg gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag att gtt agc agc agc tac    528
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Ser Tyr
                165                 170                 175
tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc    576
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
            180                 185                 190
tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt ggc    624
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
        195                 200                 205
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aaa ctg gag cct    672
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Lys Leu Glu Pro
    210                 215                 220
gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cat tat ggt agc tca tct ccg    720
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Ser Ser Pro
225                 230                 235                 240
tgg acg tct cgg cca agg gac caa agt gat atc aaa cgt gcg gcc gca    768
Trp Thr Ser Arg Pro Arg Asp Gln Ser Asp Ile Lys Arg Ala Ala Ala
                245                 250                 255
ctc gag cac cac cac cac cac cac tga                                795
Leu Glu His His His His His His
        260
<210>2
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人单链(scFv)重组抗体
<400>2
Met Ala Lys Val Gln Leu Leu Gln Ser Ala Thr Glu Val Lys Lys Pro
1               5                   10                  15
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Tyr Gly Tyr Thr Phe Thr
            20                  25                  30
Asp Tyr Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Thr Ash Tyr Ala Gln
    50                  55                  60
Lys Phe Gln Asp Arg Ile Thr Met Thr Thr Asp Ala Ser Thr Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Leu
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Glu Asp Ala Ser Leu Leu Arg Asp Gly His
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
    130                 135                 140
Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Set Ser Tyr
                165                 170                 175
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
            180                 185                 190
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
        195                 200                 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Lys Leu Glu Pro
    210                 215                 220
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Ser Ser Pro
225                 230                 235                 240
Trp Thr Ser Arg Pro Arg Asp Gln Ser Asp Ile Lys Arg Ala Ala Ala
                245                 250                 255
Leu Glu His His His His His His
            260
<210>3
<211>7
<212>PRT
<213>金黄色葡萄球菌
<400>3
Gly Val Thr Thr Ser Leu Ser
1               5

Claims (20)

1.一种具有SEQ ID NO：2序列的抗体或其抗原结合片段。
2.一种具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽所显示的对抗原决定簇特异的抗体，用于治疗或诊断人体或动物体的方法。
3.具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽所显示的对抗原决定簇特异的抗体在制备治疗感染的药物的方法中的用途。
4.一种含有治疗有效量的糖肽抗生素和GrfA特异抗体的药物。
5.根据权利要求4用于治疗或诊断人体或动物体的药物。
6.根据权利要求4的药物治疗革兰氏阳性细菌感染。
7.制备治疗感染的药物的方法，其特征在于使用治疗有效量的糖肽抗生素和GrfA特异抗体。
8.一种治疗感染的药物包装，包括治疗有效量的糖肽抗生素和GrfA特异抗体。
9.一种治疗感染的方法，其步骤包括给予需要的患者以治疗有效量的糖肽抗生素和GfrA特异抗体。
10.根据权利要求4和7-9中任何一项中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的抗体具有SEQ ID NO：2的序列。
11.根据权利要求4和7-10中任何一项中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的抗体对SEQ ID NO：3的抗原决定簇是特异的。
12.根据权利要求4和7-11中任何一项中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的糖肽抗生素选自万古霉素、替考拉宁和达托霉素。
13.根据权利要求4和7-12中任何一项中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的感染是革兰氏阳性细菌感染。
14.根据权利要求13中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的细菌是葡萄球菌。
15.根据权利要求14中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的细菌是凝固酶阴性的葡萄球菌。
16.根据权利要求15中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的葡萄球菌选自溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。
17.根据权利要求14中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的细菌是凝固酶阳性的葡萄球菌。
18.根据权利要求17中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的葡萄球菌是金黄色葡萄球菌。
19.根据权利要求13中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的细菌选自肠球菌属、粪肠球菌、屎肠球菌、棒状杆菌属、杰氏棒状杆菌和干燥棒状杆菌。
20.根据权利要求13中的药物、制备方法、药物包装或治疗方法，其中所述的细菌对单独使用所述的糖肽抗生素是耐药的。
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