ES2322756T3 - Tratamiento de infeccion por microorganismos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Description

Tratamiento de infección por microorganismos

La presente invención se refiere al tratamiento de infecciones del cuerpo humano o animal por microorganismos tales como S. aureus, particularmente cepas resistentes a antibióticos de organismos tales como MRSA. Se proporcionan medicamentos para el tratamiento de una infección por microorganismos tales como S. aureus, procedimientos de fabricación de medicamentos para el tratamiento de la infección, envases de productos farmacéuticos que contienen medicamentos para el tratamiento de la infección, y procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal para la infección por dichos microorganismos.

La resistencia a múltiples fármacos (MDR) es un problema creciente entre las bacterias gram-positivas (Banergee, S.N. y col. 1991, Am. J. Med. 91: 865-895; Shaberg, D.R. y col., 1991, Am. J. Med. supl., 88: 72-75; Gaynes, R.P. y col., 1994, Infect. Dis. Clin. Pract., 6: 452-455), particularmente en hospitales. En particular, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) y estafilococos coagulasa-negativos (CNS), particularmente CNS resistentes a meticilina, resultan problemáticos, siendo resistentes a todas las penicilinas y cefalosporinas. La resistencia a otros agentes tales como quinolonas está generalizada (Malabarta, A. y col., 1997, Eur. J. Med. Chem., 32: 459-478; Lewis, K., 1994, TIBS, 19: 119-123; Traub, W.H. y col., 1996, Chemotherapy, 42: 118-132). El tratamiento se realiza típicamente usando vancomicina o teicoplanina. Sin embargo, la resistencia a estos agentes se está propagando y por tanto se necesitan nuevas terapias. Por ejemplo, Hubert SK y col., (J Clin Microbiol. Nov 1999; 37 (11): 3590-3; PMID: 10523558) analiza aislados de S. aureus con susceptibilidad reducida a la vancomicina y teicoplanina. También se ha descubierto que ciertas cepas epidémicas de MRSA, incluyendo EMRSA-15 (www.phls.org.uk, Public Health Laboratories, Colindale, UK), pueden dar lugar a subclones con resistencia aumentada a la vancomicina (Burnie J y col., Clin Infect Dis. Sep 2000; 31 (3):684-9; PMID: 11017816). Se esperaba que el linezolid proporcionara una alternativa muy necesitada a las terapias actuales, pero Tsiodras S. y col. (Lancet. 21 Jul 2001; 358 (9277): 207-8; PMID: 11476839) han informado de un aislado clínico de NIRSA resistente a linezolid en un paciente que se estaba tratando con este antibiótico para peritonitis asociada con diálisis.

Además la administración de grandes cantidades de dichos antibióticos a pacientes para realizar el tratamiento de las infecciones, especialmente de infecciones que presentan resistencia al(a los) antibiótico(s) que se está(n) administrando, puede ser citotóxica y nefrotóxica y aunque esté ayudando a salvar la vida del paciente puede provocar graves efectos secundarios.

El tratamiento y diagnóstico de infecciones por estafilococos se analiza ampliamente en la técnica anterior y las publicaciones particularmente relevantes incluyen los documentos WO 98/01154, WO 99/50418, y EP 0786519. Las causas de la resistencia a antibióticos también se analiza en publicaciones tales como Allignet J. (Gene 20 Nov 1997; 202 (1-2):133-8; PMID: 9427556).

Por tanto existe una clara necesidad de terapias nuevas y potenciadas para infecciones por microorganismos, particularmente S. aureus.

Los presentes inventores ahora han descubierto que una combinación particular de agentes, concretamente un anticuerpo (detallado a continuación) que tiene una parte de unión a antígeno nueva y un antibiótico glicopeptídico (tal como vancomicina o teicoplanina), tiene un efecto terapéutico sinérgico muy sorprendente - la eficacia terapéutica del antibiótico glicopeptídico está sustancialmente potenciada en comparación con su eficacia terapéutico cuando se usa solo. Éste es particularmente el caso cuando el microorganismo que se está tratando es resistente al antibiótico glicopeptídico. De forma importante, la presente invención es capaz de realizar el tratamiento de cepas con resistencia completa a vancomicina y resistencia intermedia a vancomicina de S. aureus usando vancomicina junto con el anticuerpo de la SEC ID Nº 2. En ninguna parte de la técnica anterior se sugiere que esto pueda conseguirse. Los antibióticos glicopeptídicos funcionan afectando a la pared celular bacteriana. Otros antibióticos tales como las penicilinas también afectan a la pared celular bacteriana. Sin embargo, los presentes inventores han descubierto que su eficacia no se mejora usándolos con el anticuerpo de la SEC ID Nº 2, en particular, los experimentos han demostrado que la eficacia de la flucloxacilina no se mejora usándola con el anticuerpo de la SEC ID Nº 2. Las bacterias resistentes a la flucloxacilina no han reducido su resistencia por el uso del anticuerpo de la SEC ID Nº 2.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un anticuerpo que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo está codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 aunque, por supuesto, la secuencia de nucleótidos se puede modificar fácilmente para, por ejemplo, optimizar los codones para microorganismos específicos usados para sintetizarla o por otras razones que se
deseen.

El anticuerpo de la SEC ID Nº 2 (también mencionado como "Aurograb" RTM) es un anticuerpo recombinante genético humano. Se une al antígeno de superficie celular inmunodominante, GrfA, una proteína trasportadora ABC de estafilococos (documento WO 99/50418; Burnie JP y col., Infect Immun. Jun 2000; 68(6): 3200-9; PMID: 10816464). Se obtuvo originalmente de pacientes que se habían recuperado de septicemia por S. aureus y estaban produciendo anticuerpos contra GrfA. Tiene actividad anti-estafilococos intrínseca y muestra sinergia con vancomicina y otros antibióticos glicopeptídicos, tanto in vitro como in vivo, contra un amplio intervalo de cepas de S. aureus incluyendo MRSA y MRSA resistente a vancomicina. La actividad antibacteriana del anticuerpo de la SEC ID Nº 2, tanto solo como en combinación con antibióticos glicopeptídicos, es de beneficio significativo en el tratamiento de infecciones por S. aureus.

Tanto la inmunoglobulina derivada de plasma humano (Ramisse F y col., J Infect Dis. Oct 1993; 168(4): 1030-3; PMID: 8376815) como el antisuero hiperinmune de conejo creados contra GrfA son protectores en modelos de infecciones por estafilococos (véase la sección "Experimentos" a continuación). Los anticuerpos recombinantes humanos específicos para GrfA son protectores en modelos de ratón de infección por MRSA. Se descubrió que una secuencia de aminoácidos particular de GrfA, el epítope de la SEC ID Nº 3, estaba frecuentemente marcada por la respuesta inmune humoral en pacientes que se recuperan de septicemia por S. aureus (Burnie JP y col., 2000 supra).

Sin embargo, en ninguna parte de la técnica anterior se sugiere que el tratamiento mejorado de infecciones por microorganismos tales como S. aureus puede realizarse usando una combinación de un antibiótico glicopeptídico tal como vancomicina, o teicoplanina, y un anticuerpo anti-GrfA, particularmente no un anticuerpo específico para el epítope de la SEC ID Nº 3, y más particularmente no el anticuerpo que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 2.

Por tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un medicamento que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antibiótico glicopeptídico y un anticuerpo específico contra GrfA, particularmente un anticuerpo específico contra el epítope de la SEC ID Nº 3. También se proporcionan procedimientos de fabricación de medicamentos y envases de productos farmacéuticos que todos comprenden y usan lo mismo. El medicamento puede ser para el tratamiento de infección por S. aureus. El término "tratamiento" como se usa en este documento significa cualquier tratamiento que esté diseñado para curar, aliviar, eliminar o reducir los síntomas de, o prevenir o reducir la posibilidad de contraer dicha infección, e incluye la profilaxis.

La proteína GrfA, que es una proteína transportadora ABC, se ha aislado y purificado de S. aureus, pero existen homólogos que realizan la misma función en otros organismos y pueden usarse como la diana para la terapia. Por tanto, puede prepararse un anticuerpo contra un homólogo de GrfA producido por un microorganismo diferente de S. aureus y puede usarse junto con un antibiótico glicopeptídico para realizar el tratamiento de la infección por el microorganismo en un paciente. Ejemplos de otros microorganismos en que puede realizarse el tratamiento son otros estafilococos, particularmente estafilococos coagulasa-negativos, tales como S. haemolyticus, S. epidermidis y saprophyticus. La infección por enterococos, particularmente E. faecalis y E. faecium, también puede tratarse, como también se puede la infección por corinebacterias tales como C. jeikeium y C. xerosis.

El homólogo de GrfA puede tener una homología de secuencia de al menos el 60%, por ejemplo al menos el 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 99,5% con GrfA. Las homologías de secuencia se determinan usando los programas NCBI BLASTN (comparaciones de secuencias de nucleótidos) o BLASTP (comparaciones de polipéptidos), versión 2.1.2, con parámetros por defecto. El programa NCBI BLAST se encuentra en www.ncbi.nbnnihgov/bL-tst/. La expresión identidad de secuencia usada en este documento se refiere a restos aminoacídicos en secuencias alineadas de forma óptima que coinciden exactamente en posiciones relativas correspondientes.

En organismos diferentes de S. aureus, particularmente otros estafilococos, el epítope (SEC ID Nº 3) contra el que se producen los anticuerpos y que se usa como base para el tratamiento puede permanecer igual.

Por tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un medicamento para el tratamiento de una infección, particularmente una infección por S. aureus, comprendiendo dicho medicamento una cantidad terapéuticamente eficaz de un antibiótico glicopeptídico y el anticuerpo de la SEC ID Nº 2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

También se proporciona un antibiótico glicopeptídico y el anticuerpo de la SEC ID Nº 2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un procedimiento de fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones.

Para realizar una terapia contra una infección, particularmente una infección por S. aureus, el antibiótico glicopeptídico y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno pueden administrarse a un paciente por separado o secuencialmente. También se proporciona, de acuerdo con la presente invención, un envase de producto farmacéutico que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antibiótico glicopeptídico y el anticuerpo de la SEC ID Nº 2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

También se proporciona, de acuerdo con la presente invención, el uso de un antibiótico glicopeptídico y el anticuerpo de la SEC ID Nº 2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección, particularmente una infección por S. aureus.

Antibióticos glicopeptídicos de utilidad particular en la presente invención son vancomicina y teicoplanina, aunque, por supuesto, la presente invención se extiende a otros miembros de la familia de antibióticos glicopeptídicos.

El término "anticuerpo" en sus diversas formas gramaticales se usa en este documento para hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de combinación de anticuerpos o parátope. Dichas moléculas también se mencionan como "fragmentos de unión a antígeno" de las moléculas de inmunoglobulina.

Moléculas de anticuerpo ilustrativas son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y aquellas partes de una molécula de inmunoglobulina que contienen el parátope, incluyendo aquellas partes conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab')2, scFv y F(v).

La expresión "sitio de combinación de anticuerpos" se refiere a la parte estructural de una molécula de anticuerpo compuesta por regiones variables e hipervariables de cadena pesada y ligera que se unen específicamente (inmunorreaccionan con) el antígeno.

En cuanto al anticuerpo de la SEC ID Nº 2, puede modificarse fácilmente para alterar su secuencia de aminoácidos presentando al mismo tiempo el mismo parátope y reteniendo su especificidad de unión a antígeno. Hablando en líneas generales, su estructura se organiza (secuencia amino a carboxi terminal) como un dominio de cadena pesada variable (V_{H}) y un dominio de cadena ligera variable (V\kappa) de inmunoglobulina humana unidos covalentemente por un enlazador y que tiene una secuencia His carboxi-terminal.

Cada una de las regiones variables está compuesta por las regiones determinantes de complementariedad CDR_{1}, CDR_{2} y CDR_{3}, y son fundamentales para definir la especificidad de unión a antígeno del anticuerpo, es decir, el parátope. Los presentes inventores han descubierto que de estas regiones, la parte CDR_{3} de la región V_{H} es la más importante para definir la especificidad de antígeno. Están ampliamente disponibles en la técnica contenidos adicionales sobre anticuerpos, por ejemplo Harlow, E. y Lane, D., "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1998. Con el conocimiento general común acerca de las partes que definen un parátope de un sitio de combinación de anticuerpos y los contenidos anteriores, un especialista en la técnica es capaz de modificar fácilmente la secuencia de la SEC ID Nº 2 para producir anticuerpos alternativos con el mismo parátope y que posibiliten conseguir el mismo efecto terapéutico o similar.

Por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo de la SEC ID Nº 2 puede prepararse fácilmente eliminando simplemente uno o más de los restos His carboxi-terminales. Otros ejemplos de modificaciones incluyen el injerto de las regiones hipervariables (regiones determinantes de complementariedad) del anticuerpo de la SEC ID Nº 2 en regiones flanqueantes variables diferentes a las de la SEC ID Nº 2 de modo que el anticuerpo resultante aún tenga el mismo parátope (véase, por ejemplo, el documento EP 239400 y similares).

Por "tratamiento mejorado" se entiende que una cantidad dada de un antibiótico glicopeptídico tiene un afecto terapéutico mayor cuando se administra a un paciente junto con el anticuerpo de la presente invención que cuando se administra solo. Asimismo, puede conseguirse un efecto terapéutico deseado en un paciente con una dosificación más pequeña de un antibiótico glicopeptídico cuando se administra a un paciente junto con el anticuerpo de la presente invención que cuando el antibiótico glicopeptídico se administra solo. Éste es particularmente el caso cuando el microorganismo tal como S. aureus es resistente al antibiótico glicopeptídico. Esto puede ser extremadamente útil para reducir cualquier efecto secundario del tratamiento.

Proporcionando antibióticos glicopeptídicos existentes con un "nuevo aliento" y permitiéndoles que sean terapéuticamente eficaces contra, por ejemplo, una infección por S. aureus, incluso cuando S. aureus es resistente a ellos, la presente invención proporciona medicamentos y tratamientos cuya seguridad y eficacia puede evaluarse fácilmente y que no implican nuevas clases de sustancias - los parámetros de seguridad para antibióticos glicopeptídicos ya son bien conocidos y pueden aplicarse a la presente invención. Asimismo, el uso de anticuerpos como el otro ingrediente activo en la presente invención es una cuestión de seguridad relativamente simple. En particular, cuando el anticuerpo está en forma de un fragmento de anticuerpo recombinante derivado de secuencias de anticuerpos humanos, su inmunogenicidad será extremadamente baja. Además, el uso de regímenes de tratamiento en que el anticuerpo se administra durante un periodo de tiempo muy corto (por ejemplo unos pocos días) significa que hay pocas oportunidades para el sistema inmune del paciente de desarrollar una respuesta inmune contra el mismo. Por tanto, las reacciones adversas de tipo hipersensibilidad causadas por la producción de anticuerpos contra el anticuerpo de la presente invención y la formación/deposición de complejos inmunes es son muy pequeñas.

El anticuerpo de la SEC ID Nº 2 también tiene varias ventajas específicas - no tiene la parte F_{c} que puede desencadenar la deposición del complemento y la unión de macrófagos y por tanto es poco probable que cause la activación inapropiada de la cascada del complemento que puede causar inflamación y daño tisular.

Produciendo los anticuerpos de la presente invención sin el uso de productos derivados de animales, puede evitarse la posibilidad de introducir agentes de enfermedades infecciosas humanas o animales u oncogenes en pacientes.

Los regímenes de tratamiento y las dosificaciones de los medicamentos de la presente invención se describen a continuación, y la modificación de los mismos será muy evidente para un especialista en la técnica, que en particular será consciente de los regímenes de tratamiento usados con el antibiótico glicopeptídico y será capaz de modificarlos apropiadamente. Por ejemplo, los ensayos de respuesta a dosis simples pueden usarse fácilmente y los resultados del tratamiento en modelos de mamífero tales como modelos murinos simplemente pueden extrapolarse a seres
humanos.

La presente invención será adicionalmente evidente a partir de la siguiente descripción con referencia a la Figura adjunta, que muestra a modo de ejemplo solamente formas de tratamiento de una infección por S. aureus.

Figura 1 muestra la farmacocinética de elevadas dosis de Aurograb. El eje X es el tiempo en minutos. El eje Y es \mug/ml de Aurograb en muestras sanguíneas.

Experimentos

Los experimentos detallados a continuación muestran que Aurograb (es decir las SEC ID Nº 1 y 2), el fragmento de anticuerpo recombinante humano de la presente invención específico contra GrfA, tiene actividad anti-estafilococos intrínseca in vitro y en infecciones murinas por estafilococos y que muestra actividad sinérgica con antibióticos glicopeptídicos, particularmente el antibiótico glicopeptídico de amplio espectro vancomicina.

La actividad sinérgica con antibióticos glicopeptídicos se manifiesta por:

(1) una reducción en la concentración inhibidora mínima de vancomicina en presencia de Aurograb in vitro y

(2) recuentos reducidos de colonias en los órganos en modelos murinos de infección por S. aureus cuando, después de la estimulación con S. aureus, se da una única dosis de Aurograb (2 mg/kg) junto con una única dosis de vancomicina (6 mg/kg).

Salvo que se indique de otro modo, todos los procedimientos detallados en este documento se realizaron usando protocolos convencionales y siguiendo las instrucciones del fabricante cuando fueran aplicables. Los protocolos convencionales para diversas técnicas incluyendo PCR, clonación molecular, manipulación y secuenciación, la fabricación de anticuerpos, mapeado de epítopes y diseño de mimótopes, cultivo celular y presentación de fagos, se describen en textos tales como McPherson, M.J. y col. (1991, PCR: A practical approach, Oxford University Press, Oxford), Sambrook, J. y col. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Nueva York), Huynh y Davies (1985, "DNA Cloning Vol I - A Practical Approach", IRL Press, Oxford, Ed. D.M. Glover), Sanger, F. y col. (1977, PNAS USA 74(12): 5463-5467), Harlow, E. y Lane, D. ("Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1998), Jung, G. y Beck-Sickinger, A.G. (1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31: 367-486), Harris, M.A. y Rae, I.F. ("General Techniques of Cell Culture", 1997, Cambridge University Press, ISBN 0521 573645), "Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual" (Eds. Kay, B.K., Winter, J., y McCafferty, J., Academic Press Inc., 1996, ISBN 0-12-402380-0).

Los reactivos y el equipo útiles en, entre otros, los procedimientos detallados en este documento están disponibles en Amersham (www.amersham.co,uk), Boehringer Mannheim (www.boehringer-ingeltheim.com), Clontech (www.clontech.com), Genosys (www.genosys.com), Millipore (www.millipore.com), Novagen (www.novagen.com), Perkin Elmer (www.perkinelmer.com), Pharmacia (www.pharmacia.com), Promega (www.promega.com), Qiagen
(www.quiagen,com), Sigma (www.sigma-aldrich.com) y Stratagene (www.stratagene.com) y similares.

Cuando se dan números de referencia "PMID" para las publicaciones, estos son números de identificación de PubMed asignados a las mismas por la US National Library of Medicine, a partir de la cual está disponible la información bibliográfica completa y el resumen de cada publicación en www.ncbi.nlm.nih.gov. Éste también puede proporcionar acceso directo a copias electrónicas de las publicaciones completas, particularmente en el caso de, por ejemplo, publicaciones PNAS, JBC y MBC.

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1. Estudio en Seres Humanos

Para este estudio, se da Aurograb junto con vancomicina para reducir la mortalidad y/o morbilidad de pacientes con infección por MRSA profundamente arraigada confirmada por cultivo. Este estudio se realiza en tres partes:

i) Un estudio de tolerancia y de aumento de dosis en que a cohortes de 3 pacientes con infección por MRSA se les dan dosis escalonadas en fases de Aurograb, comenzando con una dosis sub-terapéutica (0,1 mg/kg) y elevándola hasta 1 mg/kg b.d., durante lo cual cada paciente se controla cuidadosamente para cualquier efecto secundario adverso.

ii) Un estudio provisional de etiqueta descubierta en que a 5 pacientes con infección por MRSA se les da el transcurso terapéutico previsto de Aurograb, concretamente 1 mg/kg b.d. durante 7 días, y se les controla cuidadosamente para la tolerancia y la farmacocinética. Puede hacerse una evaluación preliminar de la eficacia en base a los controles históricos.

iii) Un ensayo prospectivo, doble ciego, aleatorizado de fase II.

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2. Propiedades físicas, químicas y farmacéuticas TABLA 1

1

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3. Formulación, composición, manipulación y almacenamiento 3.1 Formulación y Composición

La composición completa de Aurograb se da en la Tabla 2, a continuación. Consta de polvo liofilizado (secado por congelación) proporcionado a 10 mg por vial. El fármaco se administra por resuspensión del polvo en 5 ml de agua inyectable estéril por antes de la inyección iv. No debe sustituirse el agua por otro disolvente ya que Aurograb es sensible a fluctuaciones de pH y se ha formulado especialmente para resuspensión en agua.

TABLA 2

3

La L-arginina y la urea están presentes para mantener el equilibrio de pH de la formulación y asegurar la solubilidad del Aurograb. Ambas están presentes en dosificaciones que se consideran seguras para administración intravenosa clínica. Por ejemplo, una dosis sencilla de Aurograb (37,5 ml para 75 Kg de peso corporal del paciente) contiene 7,5 mmoles de arginina. Esto es 26 veces menos que la dosis diaria permitida máxima de L-arginina cuando se administra durante la medición de los niveles de hormona del crecimiento en niños (ABPI compendium, 1998-99). Para la urea, una dosis sencilla de 35 ml de Aurograb contiene 1,125 g de urea. De nuevo, esto es mucho menos que la dosis diaria permitida máxima de 150 g de urea (esta es la dosis máxima indicada para el tratamiento de presión intracraneal aguda por suministro intravenoso - ABPI compendium, 1998-99).

3.2 Almacenamiento

El fármaco liofilizado se almacena en viales de vidrio a 4ºC en la oscuridad. Es aceptable el transporte durante una noche a temperaturas ambientales. Se evita la exposición prolongada a luz brillante o humedad excesiva. No se han observado cambios en la actividad de Aurograb después de almacenamiento a 4ºC (3 meses).

Después de su reconstitución con agua, Aurograb debe almacenarse a 4ºC y debe usarse en 14 horas. La actividad se deteriorará lentamente si se deja a temperatura ambiente.

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3.3 Preparación y administración

Aurograb, proporcionado a 10 mg por vial, se administra por resuspensión del polvo en 5 ml de agua inyectable estéril poco antes de la inyección intravenosa (iv). Un ejemplo de dosis para seres humanos es 1 mg/kg b.d. Se introduce agua estéril directamente en los viales por inyección a través del tapón de goma con una jeringa/aguja hipodérmica.

Para reconstituir:

se añade la mitad del volumen final de agua (2,5 ml por vial) y agitar para disolver, filtrar (si es necesario) para retirar cualquier material no disuelto

se añade el resto del agua.

NB. Si se retrasa la administración, se almacena a 4ºC (durante hasta 14 horas).

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No debe sustituirse el agua por otro disolvente ya que Aurograb es sensible a fluctuaciones de pH y se ha formulado especialmente para resuspensión en agua.

Aurograb debe administrarse por inyección en embolada iv lenta, por ejemplo a través de un equipo de administración iv que primero debe lavarse abundantemente con solución salina para retirar los restos de cualquier otro fluido iv y otra vez de nuevo después de la administración del fármaco.

No se requieren precauciones especiales para la limpieza de derrames o el desecho de residuos.

La solución salina para uso iv es compatible con Aurograb reconstituido (a una dilución 50:50). Es menos compatible con glucosa al 20% y tampón bicarbonato sódico, como se muestra por una reducción en la actividad ELISA, y por lo tanto si se está dando mediante el mismo equipo de administración iv que estos u oros fluidos, la vía de inyección debe lavarse abundantemente a su través con solución salina y después de administra el Aurograb.

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4. Estudios no clínicos

Aurograb muestra actividad antibacteriana, tanto in vitro como in vivo, contra un amplio intervalo de cepas de S. aureus. Además Aurograb ha demostrado ejercer un efecto antibacteriano sinérgico cuando se usa junto con vancomicina.

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4.1 Estudios de Eficacia No Clínicos: datos in vitro

Aurograb muestra actividad sinérgica en combinación con vancomicina contra un amplio intervalo de cepas de MRSA, incluyendo cepas de EMRSA con resistencia intermedia a la vancomicina ("VISA" - MRSA insensible a vancomicina).

Estos datos se prepararon usando la misma metodología MIC aplicada de rutina a los antibióticos.

Propósitos: Demostrar la sinergia cuando se usa en combinación con vancomicina, contra un amplio intervalo de cepas epidémicas de NMA.

Objetivo: La sinergia se demuestra por una reducción en la MIC de la vancomicina cuando se usa Aurograb en combinación.

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Introducción

Las cepas epidémicas de MRSA dan lugar fácilmente a sub-poblaciones de resistencia intermedia a la vancomicina (es decir, MIC de 4 o 8 \mug/ ml) por pases en serie en caldo nutriente con concentraciones crecientes de vancomicina (Burnie J y col., Clin Infect Dis. Sep 2000; 31 (3): 684-9; PMID: 11017816). Éstas son responsables probablemente de muchos de los fallos de tratamiento asociados con la terapia con vancomicina. En este estudio se examinó la actividad de Aurograb tanto contra estas VISA como contra la cepa EMRSA-15 precursora completamente sensible a la vancomicina.

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Procedimiento

Se cultivaron cepas de MRSA durante una noche en caldo nutriente y se diluyeron para dar un inóculo de 1x10^{3} células por ml. Se colocaron alícuotas de 100 \mul de cultivo en placas de microtitulación de fondo plano y se añadió vancomicina en el intervalo de 0,125 - 250 \mug/ml. Los cultivos se incubaron durante 2 días adicionales. La concentración inhibidora del crecimiento mínima (MIC) se define como la concentración más alta de antibiótico a la que no existe crecimiento bacteriano y se determina por evaluación espectrofotométrica de la ausencia de turbidez (crecimiento) en cultivo. Las MIC se determinaron en presencia de Aurograb exógeno o en presencia de tampón de formulación de Aurograb (control negativo).

Resultados:

TABLA 3

4

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Espectro de Actividad: La actividad antibacteriana potenciada es evidente en todas las cepas ensayadas, lo que demuestra un amplio espectro de actividad contra cepas de MRSA.

Sinergia: Aurograb tiene la capacidad de aumentar la sensibilidad de MRSA a la vancomicina, incluyendo MRSA con sensibilidad reducida a la vancomicina.

Se emprendieron experimentos adicionales para determinar la MIC de vancomicina para varias cepas de MRSA y el efecto del anticuerpo Aurograb sobre la MIC. Los experimentos también se realizaron usando flucloxacilina en lugar de vancomicina para investigar cómo se veía afectada la eficacia de antibióticos tipo penicilina por Aurograb. Los resultados se dan en la Tabla 3a:

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5

6

Los resultados obtenidos con flucloxacilina mostraron que la MIC obtenida era >256 \mug/ml para todas las cepas EMRSA. Flucloxacilina + Aurograb daba los mismos resultados y no mostró disminución en la MIC de flucloxacilina.

Conclusión: El uso de Aurograb en combinación con vancomicina debe aumentar aumentarla eficacia terapéutica e impedir la aparición de cepas resistentes a vancomicina. Debido a la estructura y función del anticuerpo con respecto a la molécula diana, pueden esperarse que se consigan resultados similares usando otros antibióticos glicopeptídicos tales como teicoplanina, siendo los mecanismos de resistencia empleados por S. aureus contra ellos los mismos que para la vancomicina y por lo tanto siendo también una diana para el anticuerpo y siendo susceptibles a terapia usándolo.

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4.2 Estudios de Eficacia No Clínicos: datos in vivo

El modelo murino de infección por estafilococos se usa ampliamente y se usa rutinariamente en la evaluación de fármacos antimicrobianos. Es un buen factor de predicción de la eficacia en seres humanos infectados ya que S. aureus se introduce por vía intravenosa para crear una bacteremia, a partir de la cual el patógeno se propaga a otros órganos, incluyendo el riñón, el hígado y el bazo. Por tanto, la naturaleza de la infección (septicemia) se análoga a la situación en paciente infectados. Además, la vía intravenosa de administración de Aurograb, usada en los modelos animales (datos dados a continuación) es la misma vía que la usada típicamente en pacientes, mejorando la probabilidad de farmacocinética comparable, biodisponibilidad y eficacia del fármaco.

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Serie de Datos 1: Aurograb - actividad antibacteriana intrínseca contra EMRSA-15

Propósitos: Demostrar que Aurograb es terapéutico cuando se da solo en ratones infectados con una cepa sensible a vancomicina de MRSA, la cepa EMRSA-15.

Objetivo: Se demuestra la actividad anti-estafilococos por una reducción en la mortalidad o una reducción en la carga bacteriana (unidades formadoras de colonias) en el riñón, el hígado o el bazo en presencia de Aurograb.

Procedimiento: A 20 ratones CD-1 hembra se les dio una estimulación sub-letal (1,3 x 10^{7} cfu) de una cepa sensible a vancomicina, resistente a meticilina, de S. aureus (EMRSA-15, Aislado Hospitalario Tipado, Central Manchester Healthcare Trust) en un bolo iv de 100 \mul (todas las inyecciones iv se hicieron por la vena de la cola lateral). Después de 1 hora, dos grupos de 10 ratones recibieron, en forma de un bolo iv de 100 \mul:

1. tampón de formulación (Arginina-Urea), como control negativo o

2. Aurograb (2,0 mg/kg) en tampón de formulación.

Todos los animales se sacrificaron después de 48 h adicionales y se determinaron las cfu viables por gramo de órgano.

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Resultados:

TABLA 4

7

Conclusión

Actividad anti-bacteriana - Se encontraron estafilococos viables en el riñón, el hígado y el bazo con localización preferente en el riñón. La administración de Aurograb provocó una reducción logarítmica (factor 10) en los organismos viables encontrados en los tres órganos. Esto sugiere que Aurograb reduce la viabilidad de S. aureus en infecciones experimentales de ratones en ausencia de cualquier otro agente antimicrobiano exógeno usando el modelo murino de infección profundamente arraigada.

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Serie de Datos 2: Estudio de escala de dosis de Aurograb

Propósitos: Estudio de escala de dosis para el uso de Aurograb frente a la cepa EMRSA-15 de S. aureus.

Objetivo: La actividad antibacteriana se demuestra por la mayor reducción en la carga bacteriana (cfu en el órgano) en el riñón, el hígado o el bazo cuando se da Aurograb, como único agente, en comparación con el control de placebo. El intervalo de dosis se determina comparando las cfu (expresadas como el log de las cfu por gramo de tejido) para diferentes órganos a diferentes dosis.

Procedimiento: se estimularon 40 ratones CD-1 hembra (24-26 g) con un bolo iv de S. aureus seguido 2 horas después por una única dosis iv de placebo o Aurograb (2 mg/kg, 1 mg/kg o 20 mg/kg). Todos los animales se sacrificaron a las 48 horas para el cultivo del riñón, el hígado y el bazo para determinar los recuentos de viabilidad en los órganos.

Resultados: expresados como log cfu por gramo de tejido

Experimento 1: S. aureus (1,5 x 10^{7} cfu): EMRSA-15.

TABLA 5

8

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Experimento 2: S. aureus (9 x 10^{6} cfu): aislado clínico EMRSA-15 - dosis baja de Aurograb.

TABLA 6

9

Experimento 1: Se consiguió una reducción de 10 a 100 veces en las bacterias viables bacteria para el hígado y el bazo en el intervalo de 1,0 a 2,0 mg/kg de Aurograb. A 0,2 mg/kg de Aurograb, la eliminación del bazo aún es buena, pero reducida en el hígado. La dosis más elevada provocaba una reducción de 0,8 log en los recuentos de bacterias en el riñón pero no existía reducción con las dosis inferiores.

Experimento 2: A dosis tan bajas como 0,2 mg no es evidente la reducción en los estafilococos viables en los riñones, pero existen evidencias de eliminación bacteriana en el hígado y el bazo.

Conclusión: La administración de Aurograb a 2 mg/kg provoca una reducción en los organismos viables encontraos en los tres órganos, pero particularmente el bazo y el hígado. Aurograb a una dosis de 1 mg/kg también mostró actividad antibacteriana significativa en el bazo y el hígado, pero perdía actividad en el riñón. Dosis tan bajas como 0,2 mg/kg, aún mostraban actividad antibacteriana en el bazo, y a un menor grado, en el hígado.

Extrapolación a seres humanos: Una única dosis de 2,0 mg/kg en ratones daba una disminución de aproximadamente 2,0 log en los recuentos del hígado y el bazo y una disminución de 0,8 log en los recuentos del riñón. Esto equivale, en una base de peso corporal, a 1 mg/kg dado dos veces al día a seres humanos.

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Serie de Datos 3: Actividad antibacteriana de Aurograb y sinergia con vancomicina: modelo sub-letal

Propósitos: Demostrar que Aurograb es antibacteriano cuando se da solo y sinérgico cuando se da junto con vancomicina en ratones infectados con una dosis sub-letal de S. aureus.

Objetivo: La actividad antibacteriana se demuestra por una reducción en la carga bacteriana (unidades formadoras de colonias) en el riñón, el hígado o el bazo en presencia de Aurograb solo. La sinergia se demuestra por una mayor reducción en los recuentos de colonias en los órganos cuando se dan juntos Aurograb y vancomicina que cuando cualquiera de los agentes antibacterianos se da solo.

Procedimientos: A 60 ratones CD-1 hembra (22-24 g) se les da 1 x 10^{7} cfu de EMRSA-15 en forma de un bolo iv de 100 \mul. Después de 2 horas, en grupos de 10 ratones, recibieron, en forma de un único bolo iv de 100 \mul:

Grupo 1 - 6,0 mg/kg de vancomicina + 2,0 mg/kg de Aurograb

Grupo 2 - 6,0 mg/kg de vancomicina + 0,2 mg/kg de Aurograb

Grupo 3 - 6,0 mg/kg de vancomicina + placebo (tampón de formulación)

Grupo 4 - placebo + 2,0 mg/kg de Aurograb

Grupo 5 - placebo + 0,2 mg/kg de Aurograb

Grupo 6 - placebo + 2,0 mg/kg de Aurograb

Todos los ratones se sacrificaron a las 48 horas para el cultivo del riñón, el hígado y el bazo.

Resultados: expresados como log cfu por gramo de tejido, salvo que la mayoría de los ratones (>5) lo eliminaran (es decir, los órganos fueran negativos al cultivo). N/A = no aplicable.

TABLA 7

10

Solo: Aurograb administrado solo a 2,0 mg/kg (grupo 4) dio resultados comparables a vancomicina sola (grupo 3), eliminándose cada uno de los hígados de 8 ratones y los bazos de 4 y 5 ratones, respectivamente, en comparación con un ratón con eliminación del hígado y el bazo en el grupo de control negativo (grupo 6). La eliminación renal fue mejor con vancomicina que con Aurograb, aunque ninguno de los ratones eliminó la infección renal.

Sinergia: Los ratones (grupo 1) que recibieron 2,0 mg/kg de Aurograb más vancomicina (6 mg/kg) mostraron eliminación completa de los estafilococos de los hígados de los 10 ratones, y eliminación potenciada de los bazos, siendo el cultivo negativos en 9 ratones, en comparación con 4-5 que tenían eliminación en el grupo de Aurograb o vancomicina solos y 1 que tenía eliminación en el grupo sin tratar. Los recuentos de colonias renales en los que recibieron terapia de combinación (grupo 1) se redujeron en 0,5 log adicionalmente en comparación con los ratones que recibieron vancomicina sola (grupo 3), y se redujeron en 1,6 log en comparación con los ratones de control negativo (grupo 6).

Esto demuestra la sinergia entre Aurograb y la vancomicina.

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Serie de Datos 4: Sinergia de Aurograb con vancomicina: modelo de letalidad

Propósitos: Demostrar que Aurograb es antibacteriano cuando se da solo y sinérgico cuando se da junto con vancomicina en ratones infectados con una dosis letal de S. aureus.

Objetivo: La actividad antibacteriana se demuestra por una reducción en la mortalidad con Aurograb solo. La sinergia se demuestra por una reducción mayor en la mortalidad cuando se da Aurograb en combinación con vancomicina, en lugar de vancomicina sola.

Procedimiento: A 60 ratones CD-1 hembra (22-24 g) se les da S. aureus (un aislado clínico fresco de EMRSA-15) a una dosis de 8 x 10^{7} cfu en un bolo iv de 100 \mul. Después de 2 horas, en grupos de 10 ratones, recibieron, en forma de un único bolo iv de 100 \mul:

Grupo 1 - 4,0 mg/kg de vancomicina + 2,0 mg/kg de Aurograb

Grupo 2 - 4,0 mg/kg de vancomicina

Grupo 3 - 2,0 mg/kg de vancomicina + 2,0 mg/kg de Aurograb

Grupo 4 - 2,0 mg/kg de vancomicina

Grupo 5 - 2,0 mg/kg de Aurograb

Grupo 6 - placebo

Todos los ratones se sacrificaron a las 48 horas para el cultivo del riñón, el hígado y el bazo. Los ratones muertos antes del sacrificio a las 48 horas no se sometieron a recuentos de colonias en los órganos.

Resultados: expresados como log cfu por gramo de tejido, salvo que la mayoría de los ratones (>5) estuvieran muertos.

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TABLA 8

11

Mortalidad: Esta cepa de S. aureus, probablemente debido a que era un aislado clínico fresco, era más virulenta en el modelo de ratón que la cepa de laboratorio usada previamente de EMRSA-15, y se observó un elevado grado de mortalidad. La administración de Aurograb solo (2,0 mg/kg) se asoció con una reducción en la mortalidad (4 muertes) en comparación con el grupo no tratado (7 muertes), comparable con la mortalidad del grupo de vancomicina sola (6 y 5 muertes). Esto sugiere que Aurograb tiene actividad anti-estafilococos intrínseca comparable con la vancomicina a 4,0 mg/kg.

Sinergia: Los ratones que recibieron terapia de combinación (Aurograb 2,0 mg/kg y vancomicina 4,0 mg/kg) tuvieron índices mayores de supervivencia que con vancomicina o Aurograb solo lo que sugiere un efecto sinérgico con los dos fármacos.

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5. Farmacocinética y metabolismo del producto en animales 5.1 Farmacocinética

Las características farmacocinéticas (PK) de Aurograb se han estudiado en ratones. Se usó un modelo murino a causa de la eficacia y se han realizado estudios de escala de dosis en esta especia tal como eran los estudios de toxicología de dosis repetidos. A los ratones se les dio una única dosis elevada en forma de un bolo iv y después se examinaron por duplicado para los niveles sanguíneos y la distribución orgánica. También se analizaron muestras de orina. Las muestras se analizaron para la actividad funcional, medida por ELISA (muestras sanguíneas solamente) y la concentración de fármaco (SDS PAGE/inmunotransferencias).

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Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 1. Los ratones a los que se les dio una única inyección en embolada intravenosa de Aurograb (10 mg/kg) mostraron niveles sanguíneos satisfactorios.

En todos los órganos (pulmones, cerebro, hígado, bazo, corazón, riñón y sangre) hubo eliminación en 24 horas.

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6.2 Estudio de Compatibilidad Sanguínea

Este estudio se realizó por el departamento de Farmacología Bioquímica en Inveresk Research, Escocia, para evaluar la idoneidad de Aurograb para administración intravenosa.

Se tomaron muestras sanguíneas de voluntarios humanos sanos, se transfirieron a tubos que contenían Aurograb, vehículo de Aurograb, saponina o solución salina y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Después de centrifugación, se evaluó la cantidad de hemoglobina en el sobrenadante para determinar la hemólisis. De acuerdo con la American Society for Testing and Materials classification system (ASTM F756-93, 1993) los datos indicaban que 0,1 mg/ml de Aurograb y el vehículo de Aurograb eran no hemolíticos. Era comparable con solución salina fisiológica que era no hemolítica, y estaba en contraste total con el compuesto de referencia positivo (saponina) que se descubrió que era muy hemolítico.

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7. Fabricación de anticuerpo Aurograb 7.1 Introducción

Aurograb se produce en E. coli en forma de cuerpos de inclusión. El aislamiento, solubilización, desnaturalización y replegamiento de los cuerpos de inclusión se ha documentado bien previamente (véase "Antibodies: A Laboratory Manual". Harlow, E. y Lane, D. 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press; "Inclusion bodies and purification of proteins in biologically active forms". Mukhopadhyay, A. 1997, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.; 56:61-109). Un ejemplo de dicho procedimiento se perfila en esta solicitud. En resumen, se extrajeron los cuerpos de inclusión de la masa celular, se solubilizaron/desnaturalizaron, replegaron y se purificaron usando cromatografía. La sobre-expresión de Aurograb es a partir del promotor T7 potente en el vector pET29b (Novagen). La masa celular se produce en formad de un cultivo puro, de calidad controlada, preparado en un fermentador estéril (1000 l) usando medios sin productos animales. La cepa de E. coli usada está genéticamente incapacitada (incapaz de colonizar/persistir en el entorno) y es avirulenta. Las impurezas eliminadas durante el procesamiento aguas abajo son por tanto (1) las proteína de la célula huésped E. coli (HCP), (2) los pirógenos de E. coli (principalmente endotoxinas), (3) los aditivos de fermentación (antibióticos), (4) los aditivos del procesamiento aguas abajo (tampones y NiSO_{4}).

Se eliminan grandes cantidades de contaminantes de E. coli y casi todos los contaminantes derivados del medio de fermentación durante la extracción de proteínas del procedimiento a partir de los cuerpos de inclusión. Para esto, se aísla la masa celular por centrifugación y se rompe usando un microfluidizador. Los cuerpos de inclusión de Aurograb se separan de la masa celular por tres etapas de centrifugación-resuspensión-microfluidización lavando de este modo extensivamente los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se solubilizan y se repliegan en un periodo de dos días en presencia de cloruro de cobre, que sirve como catalizador de oxidación, estableciendo de este modo la estructura correcta y biológicamente activa de la molécula de Aurograb. Se realiza diafiltración extensiva para eliminar las pequeñas moléculas de la reacción de replegamiento y los restos de kanamicina residual (de la reacción de fermentación). El resto de las proteínas de la célula huésped se eliminan por cromatografía de afinidad al metal níquel inmovilizado (IMAC) e intercambio aniónico. En particular, las endotoxinas, que es una cuestión de seguridad significativa para los fármacos fabricados en E. coli, se eliminan de forma eficaz durante la IMAC por la adición de ácido desoxicólico. Los últimos restos de HCP de E. coli se eliminan durante la etapa de intercambio aniónico. Los restos de níquel de la etapa de IMAC se eliminan usando una columna de afinidad al níquel. Finalmente, las pequeñas moléculas del sistema tampón de cromatografía se eliminan usando diafiltración frente al tampón de formulación. El producto a granel se liofiliza en viales para su uso en pacientes. Los siguientes párrafos numerados detallan específicamente la fabricación del anticuerpo Aurograb.

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7.2 Protocolo de fabricación de Aurograb

La fermentación y el procesamiento aguas abajo se realizaron usando un total de nueve etapas del siguiente modo:

1.

Fermentación

2.

Recolección y aislamiento de los cuerpos de inclusión

3.

Replegamiento

4.

Concentración y diafiltración

5.

Filtración y filtración estéril

6.

Purificación - Cromatografía de afinidad al metal níquel (Ni^{2+}) inmovilizado (IMAC)

7.

Purificación - Eliminación del níquel por cromatografía en sepharose quelante

8.

Purificación - Cromatografía de intercambio aniónico

9.

Diafiltración y carga a granel.

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7.3 Fermentación

Se inoculó una solución madre congelada de E. coli que expresa Aurograb (Clon JM109 (DE3) (pSaABC4)) en 4 matraces cónicos de vidrio de 500 ml, para preparar el inóculo antes de transferirlo a un fermentador agitado de 1000 l (MBR). Los precultivos (suplementados con kanamicina) se incubaron a 37ºC con agitación, durante 15-20h, hasta que el precultivo tuviera una DO_{578} = 4,0-8,0, que representa 7-8 divisiones celulares. A escala de producción, los precultivos se transfirieron en un fermentado de 1000 l (MBR) que contenía 1000 l de caldo nutriente. El cultivo de producción se incubó a 37ºC durante un total de 14-18 h, que representa 7 divisiones celulares. Aproximadamente 10-13 h después de la inoculación, cuando la DO_{578} = 5-8, se indujo el cultivo de producción a través de la adición de 23,8 g de IPTG (100 \muM).

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7.4 Recolección y aislamiento de los cuerpos de inclusión

Las células se recogieron por centrifugación (4 h después de la inducción) a 12.800 g en una centrífuga Alfa Laval BTPX 205 con un caudal de aprox. 400 l/h. La pasta celular de E. coli recogida se almacenó a -50ºC en bolsas de PE (Kendro). El procesamiento aguas abajo del 100% de la masa de pasta celular a partir de un único lote de fermentación que se había almacenado a -50ºC constituía un único lote de purificación. La pasta celular se descongeló y se resuspendió en 1000 l de tampón de lisis. Las células bacterianas resuspendidas se sometieron a homogeneización de elevada presión (APV Gaulin MC15) a aprox. 1000 bar (15.000 psi) con un caudal de aprox. 500 l/h. Los cuerpos de inclusión se sedimentaron por centrifugación a aprox. 12.800 g con un caudal de aprox. 400 l/h. Los cuerpos de inclusión después se lavaron con 400 l de tampón de lisis, y se sedimentaron por centrifugación a aprox. 12.800 g con un caudal de aprox. 400 l/h, para un total de tres veces. Los cuerpos de inclusión lavados se almacenaron en forma de una suspensión a -70ºC antes de la etapa de replegamiento. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron por agitación fuerte durante 5-10 minutos en 40 l de urea 6 M/Tris 100 mM pH 12,5 a temperatura ambiente.

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7.5 Replegamiento

Para el replegamiento, la solución de cuerpos de inclusión se compuso a 560 l con tampón de replegamiento, y se añadió CuCl_{2}\cdot2 H_{2}O a una concentración final de 100 \muM. La preparación se incubó durante 48 h a 2-8ºC con agitación fuerte. Los cuerpos de inclusión se filtraron (Sartorius GF 30'', 3,0/0,8 \mum) y después se esterilizaron por filtración (Seitz Supradisc SDPEK 1, filtro profundo).

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7.6 Concentración y diafiltración

Las etapas de concentración y diafiltración se realizaron usando casetes (15 m^{2}) del canal de selección omega con un punto de corte de 10 kDa (Pall) alojado en un portador de acero inoxidable "Centrasette" (Pall), bajo el control de una bomba con pistón de membrana 1000 (bomba quattro). La preparación de proteína replegada se concentró a 150 l, seguido de diafiltración con 3000 litros de tampón acetato amónico 10 mM, pH 9,5. La preparación se ajustó a urea 6 M, Tris 50 mM, DCA 10 mM, NaCl 1 M y se compuso a un volumen final de 300 l con agua RO. La proteína replegada diafiltrada se almacenó durante una noche a 2-8ºC. El pH después se ajustó a 8,0 a través de la adición de HCl.

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7.7 Etapas de filtración y filtración estéril

La proteína replegada diafiltrada se filtró (Seitz Supradisc SDPEK1, filtro profundo) y después se esterilizó por filtración (Millipore Opticap 10'', 0,2 \mum). El producto estéril se almacenó a 2-8ºC.

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7.8 Cromatografía de afinidad al metal Ni^{2+} inmovilizado (IMAC)

La etapa de IMAC se realizó en una columna BPG300/500 (Amersham Pharmacia). La esterilización de la columna de cromatografía tuvo lugar durante la limpieza de la resina en el sitio (CIP). La resina de cromatografía IMAC (18 l) se cargó inicialmente con 2 volúmenes de columna (CV) de NiSO_{4}\cdot6H_{2}O 100 mM. La cromatografía utilizó 5,5 CV de tampón de equilibrado (IMAC A); 5,5 CV de tampón de lavado I (IMAC B); 3,3 CV de tampón de lavado II (IMAC C); 5,5 CV de tampón de elución (IMAC D). Las fracciones recogidas del producto eluido se esterilizaron por filtración (Millipore Opticap 10'', 0,2 \mum) y se almacenaron durante una noche a 2-8ºC.

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7.9 Cromatografía para la eliminación del níquel

La cromatografía para la eliminación del níquel se realizó en una columna Bag 140/500 (Amersham Pharmacia) usando 2 l de resina Sepharose quelante. La columna se equilibró y se lavó con 5 CV de tampón (IMAC D) y se aplicó la solución que contenía el anticuerpo Aurograb, se lavó la columna con 2 CV de tampón aniónico/acondicionante (Tris 50 mM, urea 6 M pH 8,7) y el producto eluido se retuvo antes de la cromatografía de intercam-
bio aniónico.

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7.10 Cromatografía de intercambio aniónico

La etapa de cromatografía de intercambio aniónico se realizó en una columna Bug 300/500 (Amersham Pharmacia) usando 18 l de resina (Q-Sepharose FF). La columna se equilibró usando tampón de equilibrado y después tampón aniónico/acondicionante. Se aplicó la solución que contenía el anticuerpo Aurograb, se lavó con 2 CV de tampón aniónico/acondicionante, y el flujo continuo se esterilizó por filtración (Millipore Opticap 10'', 0,2 \mum) y se almacenó durante una noche a 2-8ºC.

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7.11 Diafiltración y carga a granel

El pH del flujo continuo estéril (que contenía el anticuerpo Aurograb) se ajustó a 9,5, y después se diafiltró frente a 10 volúmenes de renovación (TOV) de acetato amónico 10 mM; urea 0,5 M, pH 9,5. Lo siguió otra etapa de diafiltración, frente a 5 TOV de urea 0,5 M, arginina 0,2 M pH 9,5. La proteína se concentró a 2 mg/ml, se esterilizó por filtración (Millipore Opticap 10'', 0,2 \mum) en una bolsa Stedim, y se almacenó a 2-8ºC.

\newpage

7.12 Composición de los tampones, medios y soluciones Medios de crecimiento

Los medios se controlaron para la contaminación microbiana antes de la inoculación.

12

Las sustancias pre-pesadas de la tabla anterior se disuelven en 2,5 l de agua RO 1. Después de esterilización del caldo, se añadieron 10 ml de sulfato de kanamicina (62,5 mg en 50 ml de WFI).

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Composición para 1000 l de cultivo

13

El fermentador de 1000 l se esterilizó durante 30 minutos a 121ºC.

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IPTG

Se disolvieron 23,8 g de IPTG (Sigma) en 200 ml de WFI y se filtraron a esterilidad (0,2 \mum).

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Tampón de lisis celular

14

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Tampón de replegamiento

15

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Tampón de diafiltración

16

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Tampones IMAC

17

La composición de la reacción de replegamiento diafiltrada de 150 l se ajustó con los reactivos anteriores.

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Tampones de cromatografía IMAC

Solución de níquel: NiSO_{4}\cdot6 H_{2}O 100 mM (2 CV)

IMAC A/Tampón de equilibrado: Tris 100 mM; urea 6 M; NaCl 1 M; DCA 10 mM, pH 8,0

IMAC B/Tampón de lavado: Tris 100 mM; urea 6 M; NaCl 1 M; imidazol 50 mM; DCA 10 mM, pH 8,0

IMAC C/Tampón de elución I: Tris 100 mM; urea 6 M; NaCl 1 M; imidazol 150 mM; pH 8,0 (10-15 CV)

IMAC D/Elución II: Tris 100 mM; urea 6 M; NaCl 1 M; imidazol 300 mM pH 8,0 (7 CV) CIP: NaOH 1 M (3 volúmenes de columna, tiempo de incubación 1 hora)

Los tampones se prepararon con Tris (USP, E.Merck), Urea (USP, E.Merck o Riedel de Haen), NaCl (Ph.Eur, E.Merck), Imidazol (p.a., Fluka), DCA (Ácido desoxicólico, sal sódica monohidrato, Microselect, Fluka), NiSO_{4}\cdot6 H_{2}O (p.a., E.Merck).

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Tampones de Cromatografía de Eliminación de Ni^{2+}

Tampón de equilibrado: Tris 100 mM; urea 6 M; NaCl 50 mM; imidazol 300 mM; pH 8,0 (5 CV).

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Tampones de cromatografía de intercambio aniónico

Equilibrado: Tris 100 mM; urea 6 M; NaCl 50 mM; Imidazol 300 mM pH 8,7

CIP: NaOH 1 M (3 CV, tiempo de incubación 1 hora).

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Tampón de Diafiltración y Formulación

Para la esterilización y almacenamiento, los casetes de diafiltración se lavaron abundantemente con agua RO, se reciclaron durante al menos 45 minutos con NaOH 0,5 M y se almacenaron con NaOH 0,1 M.

Tampón de diafiltración: urea 0,5 M; acetato amónico 10 mM pH 9,5

Tampón de diafiltración (formulación): urea 0,5 M; arginina 0,2 M pH 9,5

Diafiltración y concentración (2 casetes, canal de selección Omega, 10 KD, Pall).

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8. Determinación del Efecto Sinérgico de Aurograb con Vancomicina 8.1 Procedimiento

Para determinar la Concentración Inhibidora Mínima (MIC), la Concentración Inhibidora Fraccional (FIC) y el FIX (índice inhibidor fraccional), se usó el siguiente procedimiento.

Se cultivaron representantes de cada una de las cepas EMRSA más comunes; varias subpoblaciones resistentes a vancomicina, y tres cepas resistentes a Linzolid durante una noche en caldo nutriente. Las células se diluyeron en Caldo Isosensitest (Oxoid, UK) para dar un inóculo final de 1 x 10^{3} células por ml. Se colocaron alícuotas de 100 \mul de cultivo en placas de microtitulación de fondo plano y se añadió vancomicina en el intervalo de 0,125 - 250 \mug/ml. A esto se añadió Aurograb exógeno en el intervalo de 0,3 - 25 \mug/ml en una formación de tablero de ajedrez. También se preparó una serie de control negativo que contenía tampón de formulación de Aurograb solo. Los cultivos se incubaron durante 48 horas a 37ºC.

La concentración inhibidora mínima (MIC) se define como la concentración más baja de agente a la que no sucede crecimiento bacteriano y se determinó por evaluación espectrofotométrica de la ausencia de turbidez (crecimiento) en cultivo.

Esta eliminación óptica era equivalente a >99% de muerte de estafilococos.

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8.2 Resultados

Los valores de MIC se obtuvieron para vancomicina y Aurograb (RTM) solos y en combinación. Se calcularon las concentraciones inhibidoras fraccionales (FIC) y los valores de FIX. La actividad sinérgica entre los dos agentes se definió como un valor de FIX <0,5. La actividad indiferente se definió como un valor de 0,5 - 4, y un valor >4 definía antagonismo.

Los resultados del experimento se dan a continuación en las Tablas 9 y 10. VAN indica vancomicina. La columna MIC (Solo) indica la concentración inhibidora mínima del agente cuando se administraba solo. La columna MIC (En combinación) indica la concentración inhibidora mínima de cada fármaco en cuando se usó en combinación.

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8.3 Conclusiones

Como puede observarse a partir de las Tablas 9 y 10, la administración de Aurograb con vancomicina provoca que se consiga un efecto terapéutico sinérgico, estando los niveles de MIC sustancialmente reducidos, que a su vez indica que la terapia de los pacientes puede realizarse con dosificaciones inferiores de antibióticos y con mayor efecto terapéutico, con una reducción esperada en los posibles efectos secundarios provocados por el antibiótico. Los resultados indican que incluso en casos en los que un paciente se infecta con S. aureus resistente a vancomicina puede tratarse satisfactoriamente con el anticuerpo de la presente invención y su uso en combinación con antibióticos tales como vancomicina puede posibilitar una terapia eficaz a niveles de dosificación no tóxicos previamente ineficaces de antibiótico.

TABLA 9

18

20

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TABLA 10

21

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<110> NBUTEC PHARMA PLC

\hskip1cm BURNIE, James P

\hskip1cm MATTHEWS, Ruth C

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<120> Tratamiento de Infección Por Microorganismos

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> N01/0697/PCT

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB 0127983.5

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<151> 22-11-2001

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 795

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> anticuerpo recombinantes de cadena sencilla humano (scFv)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(792)

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<223>

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<400> 1

22

23

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<210> 2

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<211> 264

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> anticuerpo recombinante de cadena sencilla humano (scFv)

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<400> 2

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24

25

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<210> 3

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Staphylococcus aureus

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<400> 3

\hskip1cm27

Claims (18)

1. Un anticuerpo que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

2. El uso de un anticuerpo específico para el epítope presentado por el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 3 en un procedimiento para fabricar un medicamento para el tratamiento de infecciones diferentes a una infección por estafilococos.

3. Un medicamento, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antibiótico glicopeptídico y un anticuerpo específico contra el epítope presentado por el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 3.

4. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento o diagnóstico del cuerpo humano o animal.

5. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 3, que es para el tratamiento de una infección por bacterias gram positivas.

6. Un procedimiento de fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección, caracterizado por el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antibiótico glicopeptídico y un anticuerpo específico contra el epítope presentado por el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 3.

7. Un envase de producto farmacéutico para el tratamiento de una infección, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antibiótico glicopeptídico y un anticuerpo específico contra el epítope presentado por el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 3.

8. Un medicamento, procedimiento de fabricación, o envase de producto farmacéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 6 y 7, teniendo dicho anticuerpo la secuencia de la SEC ID Nº 2.

9. Un medicamento, procedimiento de fabricación, o envase de producto farmacéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 6-8, seleccionándose dicho antibiótico glicopeptídico entre el grupo constituido por vancomicina y teicoplanina.

10. Un medicamento, procedimiento de fabricación, o envase de producto farmacéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 6-9, siendo dicha infección de una bacteria gram positiva.

11. Un medicamento, procedimiento de fabricación, o envase de producto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 10, siendo dicha bacteria un estafilococo.

12. Un medicamento, procedimiento de fabricación, o envase de producto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 11, siendo dicha bacteria un estafilococo coagulasa-negativo.

13. Un medicamento, procedimiento de fabricación, o envase de producto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 12, seleccionándose dicho estafilococo entre el grupo constituido por S. haemolyticus, S. epidermidis y S. saprophyticus.

14. Un medicamento, procedimiento de fabricación, o envase de producto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 11, siendo dicha bacteria un estafilococo coagulasa-positivo.

15. Un medicamento, procedimiento de fabricación, o envase de producto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 14, siendo dicho estafilococo S. aureus.

16. Un medicamento, procedimiento de fabricación, o envase de producto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 10, seleccionándose dicha bacteria entre el grupo constituido por Enterococcus sp., Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Corynebacterium sp., Corynebacterium jeikeium, y Corynebacterium xerosis.

17. Un medicamento, procedimiento de fabricación, o envase de producto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 10, siendo dicha bacteria resistente al tratamiento por dicho antibiótico glicopeptídico solo.

18. Un anticuerpo específico para el epítope presentado por el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 3 para su uso en el tratamiento de infecciones diferentes a una infección por estafilococos.