TW202126684A - 抗α-溶血素的抗體及其應用 - Google Patents

抗α-溶血素的抗體及其應用 Download PDF

Info

Publication number
TW202126684A
TW202126684A TW109132357A TW109132357A TW202126684A TW 202126684 A TW202126684 A TW 202126684A TW 109132357 A TW109132357 A TW 109132357A TW 109132357 A TW109132357 A TW 109132357A TW 202126684 A TW202126684 A TW 202126684A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
antibody
hemolysin
Prior art date
Application number
TW109132357A
Other languages
English (en)
Inventor
安毛毛
王驪淳
高攀
林鑒
姜遠英
慎慧
陳思敏
郭詩雨
方瑋
Original Assignee
大陸商邁威（上海）生物科技股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商邁威（上海）生物科技股份有限公司 filed Critical 大陸商邁威（上海）生物科技股份有限公司
Publication of TW202126684A publication Critical patent/TW202126684A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本發明提供了一種結合金黃色葡萄球菌α-溶血素的抗體或其片段，以及該抗體或其片段用於預防或治療金黃色葡萄球菌感染的用途。本發明的抗體係通過α-溶血素的弱毒性免疫、強毒性篩選的策略篩選得到，對α-溶血素具有高親和力，能夠有效阻斷α-溶血素的溶血作用，且在α-溶血素膿毒症模型、MRSA菌血症模型和MRSA肺部感染模型中均證明了顯著的保護或治療作用，且與抗生素具有協同作用，是對金黃色葡萄球菌現有抗生素療法的有利補充。

Description

抗α-溶血素的抗體及其應用
本發明涉及抗體藥物領域，具體而言，本發明涉及一種抗α-溶血素的抗體及其製藥用途。
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）屬於葡萄球菌屬，是一種重要的革蘭氏陽性致病菌，是人類最主要的G+ 致病菌，可引起化膿性感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等局部感染，以及敗血症、膿毒血症等全身感染。中國耐藥監測網資料顯示，金黃色葡萄球菌位居醫院內檢出病原菌的第4位、醫院內檢出G+菌的第1位。
金黃色葡萄球菌在感染人體過程中釋放大量的毒素破壞組織細胞，並抑制機體免疫細胞清除病原體。目前臨床上主要採用β-內醯胺類抗生素來治療金黃色葡萄球菌感染。但是，抗生素只能抑制或者殺死細菌，對細菌釋放的毒素卻無能為力。相反，在抗生素的壓力下細菌會釋放更多的毒素，同時被抗生素殺死的細菌裂解也會釋放出毒素，大量毒素進入血液之後會過度激活宿主免疫系統，釋放過量的發炎因子，形成膿毒症。
並且，在與人類鬥爭的過程中，金黃色葡萄球菌已經對β-內醯胺類抗生素越來越不敏感，例如目前耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的分離率越來越高，中國耐藥監測網資料顯示2016年MRSA的分離率甚至已經高達38.9%。對於MRSA，治療藥物臨床上主要包括萬古黴素、利奈唑胺等有限的幾種藥物，而這些藥物又是引起人類感染的「超級耐藥」菌的典型代表。因此，臨床上MRSA感染日益嚴重，可供選擇的抗菌藥物非常受限，臨床患者治療失敗和死亡率居高不下。近年來甚至又不斷出現對萬古黴素耐藥的VRSA（萬古黴素耐藥金黃色葡萄球菌）感染，人類即將面臨無藥可用的境況。
研究發現，金黃色葡萄球菌釋放的致病因子包括溶血素、殺白血球素、腸毒素、凝固酶等。其中溶血素是金黃色葡萄球菌分泌的重要毒性因子之一，可分為α-溶血素、β-溶血素、γ-溶血素及δ-溶血素四種類型。α-溶血素（alpha hemolysis，Hla）是由金黃色葡萄球菌HLA基因編碼的分泌型毒素蛋白，在幾乎所有菌株中均有表達，相對其他類型的溶血素，是影響金黃色葡萄球菌致病性的更為關鍵的毒性因子，研究表明，表達α-溶血素之HLA基因缺失的金黃色葡萄球菌感染動物的毒性顯著降低。α-溶血素的蛋白全長為319個胺基酸，相對分子質量為33KD，以單體的形式分泌。作為穿孔毒素（pore forming toxin）家族成員之一，α-溶血素最為明確的生物學特性是能夠快速裂解宿主紅血球及其他組織細胞，其與宿主細胞上的膽固醇和鞘磷脂結合之後聚集形成一個相對分子質量約為232KD的七聚體，然後再通過折疊形成一個直徑約1.5奈米之β桶狀的跨膜結構，使得細胞內水、離子和其他小分子物質外泄，從而發生溶血或者靶細胞的死亡。此外，α-溶血素還可以引發微血管的平滑肌收縮與抽搐痙攣，從而導致微血管堵塞並且造成局部缺血和組織壞死，在金黃色葡萄球菌引發膿毒症、肺炎、乳腺感染、角膜感染以及嚴重的皮膚感染等疾病的過程中發揮重要作用。同時，α-溶血素還可以破壞感染組織內的白血球，阻礙宿主清除感染的金黃色葡萄球菌。在宿主免疫系統以及抗生素的壓力下，感染部位的金黃色葡萄球菌大量釋放α-溶血素，進入血液後可激活宿主免疫系統釋放過量的發炎因子，形成膿毒症。
面對超級細菌的不斷出現，抗體藥物已成為後抗生素時代的利器。抗體是適應性免疫系統產生的天然蛋白，人體經被動免疫給予抗體藥物，不僅能夠中和毒性因子，同時加強宿主對病原體的免疫應答能力，可以加快清除感染的病原菌。而基於以下原因，α-溶血素顯示了其作為抗感染抗體藥物標靶治療金黃色葡萄球菌感染的潛力：
α-溶血素在金黃色葡萄球菌中高度保守，在幾乎所有的金黃色葡萄球菌中均有表達；α-溶血素生物學功能明確，在金黃色葡萄球菌形成宿主感染及膿毒症發生過程中發揮重要作用；哺乳動物細胞內不存在α-溶血素的同源蛋白，靶向α-溶血素設計抗體藥物，潛在的脫靶可能性小、毒副反應低。
因此，α-溶血素是抗金黃色葡萄球菌感染抗體藥物理想的標靶，有效中和α-溶血素有利於阻斷金黃色葡萄球菌感染人體、避免嚴重感染後膿毒症的發生並改善臨床感染患者的預後。目前Aridis製藥公司以α-溶血素的標靶研發的全人源抗體R-301（Salvecin®）已經進入第III期臨床研究，主要適應症為金黃色葡萄球菌（包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）引起的重症肺炎；阿斯利康製藥有限公司以α-溶血素的標靶研發的人源化抗體MEDI4893正在開展第II期臨床研究，主要適應症為金黃色葡萄球菌（包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）肺炎的預防和治療。
目前，抗生素例如萬古黴素等仍然是治療金黃色葡萄球菌感染的一線藥物，但考慮到抗藥性的持續增加及新型抗生素的研發減緩，本領域仍需要開發新穎、高效的通過直接中和毒素來抗金黃色葡萄球菌的抗體藥物。由於金黃色葡萄球菌α溶血素具有溶血活性，因此其單株抗體的製備策略主要包括：以α溶血素的類毒素作為免疫原通過融合瘤技術製備；以α溶血素為靶蛋白通過篩選體外抗體庫製備等。這些方法難以獲得對強毒性α溶血素具有高親和力、高生物活性的抗α溶血素抗體。再生元公司採用了弱毒性α溶血素作為免疫原，對於陽性選殖株通過表面等離子共振檢測親和力，篩選效率低、且不能高效獲得生物活性高的抗體。
本發明要解決的技術問題是，改進傳統的抗α-溶血素的抗體分子製備方法，通過弱毒性免疫解決了α-溶血素對動物的毒性、通過強毒性篩選確保了抗體對野生型強毒性α溶血素的高親和力、通過紅血球裂解抑制篩選從源頭上確保了單抗的生物學活性，提高了抗α-溶血素治療性單抗的篩選效率。本發明還進一步提供一種抗α-溶血素的抗體分子，特別是人源化α-溶血素單株抗體，所述抗體具有與金黃色葡萄球菌α-溶血素結合並抑制其溶血和損傷組織細胞的能力，可以單獨或者與現有抗菌藥物合用於治療由α-溶血素或產生α-溶血素的微生物所導致的感染或感染相關疾病。
針對上述技術問題，本發明的目的是提供一種抗體或其功能片段，並基於該抗體或其功能片段，提供其用途。
本發明的技術方案如下。
一方面，本發明提供一種製備抗α溶血素單株抗體的方法，包括以下步驟： （1）採用弱毒性α溶血素或不具有毒性的α溶血素免疫動物； （2）取脾細胞，製備融合瘤； （3）以強毒性α溶血素或野生型α溶血素篩選對其具有高親和力的抗體； （4）通過紅血球裂解抑制實驗，選擇具有抑制強毒性α溶血素或野生型α溶血素裂解紅血球活性的抗體。
其中該紅血球裂解抑制實驗包括將抗體（融合瘤上清液）稀釋後與α溶血素等體積混合，加入紅血球孵育，離心取上清液，通過OD450檢測抗體抑制α溶血素裂解紅血球的活性。
較佳地，在本發明之製備抗α溶血素單株抗體的方法中， 該強毒性α溶血素或野生型α溶血素為金黃色α溶血素，較佳具有SEQ ID NO: 78所示之胺基酸序列； 該弱毒性α溶血素或不具有毒性的α溶血素為H35L α溶血素，較佳具有SEQ ID NO: 80所示之胺基酸序列。
較佳地，在本發明所述製備抗α溶血素單株抗體的方法中，該強毒性α溶血素或野生型α溶血素、弱毒性α溶血素或不具有毒性的α溶血素，係獨立地與純化標記、載體蛋白及／或佐劑分子連接； 該連接包括偶聯、交聯、共軛及／或融合。
另一方面，本發明還提供通過前述任一方法製備所獲得的抗α溶血素單株抗體，該抗體具有選自由以下所組成之群組的至少一種活性：能夠阻斷α溶血素的溶血效應、阻斷α溶血素對肺上皮細胞的損傷、降低MRSA肺部感染組織載菌量、延長MRSA菌血症的生存時間、預防或減輕α溶血素膿毒症。
本發明之通過前述任一方法製備所獲得的抗α溶血素單株抗體，該抗體具有以下結構： VH-CDR1：選自SEQ ID NO:1、2、3、12、13、14、22、23、24、34、35、36； VH-CDR2：選自SEQ ID NO:4、5、6、15、16、17、25、26、27、28、37、38、39； VH-CDR3：選自SEQ ID NO:7、18、29、40； VL-CDR1：選自SEQ ID NO:8、19、30、31、41； VL-CDR2：選自SEQ ID NO:9、11、20、32、42； VL-CDR3：選自SEQ ID NO:10、21、33、43。
另一方面，本發明提供一種抗體或其片段，該抗體或其片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）分別包含選自以下的CDR組合（VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3；VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3）： (1) 如SEQ ID NO: 1所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 4所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 7所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 8所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 9所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR3； (2) 如SEQ ID NO: 2所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 5所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 7所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 8所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 9所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR3； (3) 如SEQ ID NO: 3所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 6所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 7所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 8所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 9所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR3； (4) 如SEQ ID NO: 2所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 6所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 7所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 8所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 9所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR3； (5) 如SEQ ID NO: 2所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 6所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 7所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 8所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 11所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR3； (6) 如SEQ ID NO: 12所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 15所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 18所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 19所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 20所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 21所示的VL-CDR3； (7) 如SEQ ID NO: 13所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 16所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 18所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 19所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 20所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 21所示的VL-CDR3； (8) 如SEQ ID NO: 14所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 17所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 18所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 19所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 20所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 21所示的VL-CDR3； (9) 如SEQ ID NO: 13所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 17所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 18所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 19所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 20所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 21所示的VL-CDR3； (10) 如SEQ ID NO: 22所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 25所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 29所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 30所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL-CDR3； (11) 如SEQ ID NO: 23所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 26所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 29所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 30所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL-CDR3； (12) 如SEQ ID NO: 24所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 27所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 29所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 30所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL-CDR3； (13) 如SEQ ID NO: 23所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 27所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 29所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 30所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL-CDR3； (14) 如SEQ ID NO: 23所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 28所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 29所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 31所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL-CDR3； (15) 如SEQ ID NO: 34所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 37所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 40所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 43所示的VL-CDR3； (16) 如SEQ ID NO: 35所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 40所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 43所示的VL-CDR3； (17) 如SEQ ID NO: 36所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 40所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 43所示的VL-CDR3； (18) 如SEQ ID NO: 35所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 40所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 43所示的VL-CDR3。
較佳地，在本發明提供的抗體或其片段中，重鏈可變區包含： 如SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 68和SEQ ID NO: 72中任一個所示的胺基酸序列、或者與所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；及／或 輕鏈可變區包含： 如SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 74和SEQ ID NO: 76中任一個所示的胺基酸序列、或者與所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列。
根據本發明的具體實施方式，該抗體或其片段包含的重鏈可變區及輕鏈可變區係選自由以下所組成之群組： (1) 如SEQ ID NO: 44所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 44所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 46所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 46所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (2) 如SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 50所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 50所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (3) 如SEQ ID NO: 52所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 52所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 54所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 54所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (4) 如SEQ ID NO: 56所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 56所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 58所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 58所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (5) 如SEQ ID NO: 60所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 60所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 62所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 62所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (6) 如SEQ ID NO: 64所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 64所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 66所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 66所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (7) 如SEQ ID NO: 68所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 68所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 70所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 70所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (8) 如SEQ ID NO: 72所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 72所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 74所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 74所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (9) 如SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 76所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 76所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列。
其中，上述至少75%同一性為至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、進一步較佳至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或甚至99%同一性等≥75%的任何百分比的同一性。
本發明所提供的抗體或其片段可以為單株抗體、單鏈抗體、單域抗體、雙功能抗體、奈米抗體、完全或部分人源化的抗體或者嵌合抗體等任意形式；或者，該抗體或其片段為半抗體或半抗體的抗原結合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2 、Fab、Fab'、F(ab')2 或Fv；關於本發明所提供的抗體的片段，較佳地，該片段為抗體的能夠特異性結合抗原金黃色葡萄球菌α-溶血素的任何片段。
或者，本發明的抗體為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，更佳為IgG1。抗體的片段選自該抗體的scFv、Fab、F(ab')2 或Fv片段。
較佳地，該抗體或其片段更包含人或鼠的恆定區，較佳包含人或鼠的輕鏈恆定區（CL）及／或重鏈恆定區（CH）；更佳地，該抗體或其片段包含選自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重鏈恆定區及／或κ或λ型輕鏈恆定區。根據本發明的具體實施方式，該抗體為單株抗體，較佳為鼠源、嵌合或人源化的單株抗體；更佳地，該單株抗體的重鏈恆定區為IgG1或IgG4亞型，輕鏈恆定區為κ型。
較佳地，本發明所提供的抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 86所示的重鏈恆定區及／或如SEQ ID NO: 87所示的輕鏈恆定區，或者與所示的重鏈恆定區或輕鏈恆定區具有至少75%同一性的胺基酸序列。
另一方面，本發明還提供一種核酸分子，其編碼本發明任意抗體或其片段、或者編碼該抗體或其片段中所包含的重鏈CDR、輕鏈CDR、重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈或輕鏈。
根據本發明的具體實施方式，該核酸分子編碼本發明之抗體或其片段中的重鏈可變區或輕鏈可變區，例如，該核酸分子包含如SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75及SEQ ID NO: 77中任一個所示的核苷酸序列。
還一方面，本發明提供一種載體，其包含本發明的核酸分子。該載體可以為真核表達載體、原核表達載體、人工染色體及噬菌體載體等。
本發明的載體或核酸分子可以用於轉化或轉染宿主細胞或以任何方式進入宿主細胞內，用於保存或表達抗體等目的。因此，另一方面，本發明提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含本發明的核酸分子及／或載體，或者該宿主細胞被本發明的核酸分子及／或載體轉化或轉染。宿主細胞可以是任何原核或真核細胞，例如細菌或昆蟲、真菌、植物或動物細胞。
基於本發明的公開內容，本發明提供的抗體或其片段、核酸分子、載體及／或宿主細胞可以通過使用本領域已知的任何常規技術方法獲得。例如，關於抗體，可以先由本發明所提供的核酸分子獲得該抗體的重鏈可變區及／或輕鏈可變區，或者獲得該抗體的重鏈及／或輕鏈，然後與該抗體的任選其他結構域組裝成抗體；或者，在允許本發明所提供的宿主細胞表達該抗體的重鏈可變區及／或輕鏈可變區或者該抗體的重鏈及／或輕鏈以組裝成該抗體的情況下，培養所述宿主細胞。任選地，該方法更包括回收所產生之抗體的步驟。
本發明所提供的抗體或其片段還可與其他部分結合，例如細胞表面受體、小分子化合物如胺基酸及糖類、小分子聚合物或對本發明之抗體進行修飾的任何其它部分，或者甚至是活性蛋白或多肽，例如抗菌肽或抗生素。因此，另一方面，本發明提供一種共軛物或融合蛋白，其包含本發明所提供的抗體或其片段。例如，該共軛物或融合蛋白可以是包含本發明之抗體或其片段的雙特異性抗體。
本發明所提供的抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、共軛物或融合蛋白等可以被包含在藥物組成物中，更特別地被包含在藥物製劑中，從而根據實際需要用於各種目的。因此，在又一方面，本發明更提供一種藥物組成物，該藥物組成物包含本發明之抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、共軛物及／或融合蛋白，以及視需要的藥學上可接受的輔料。
出於任何使用目的，本發明更提供一種試劑盒，該試劑盒包括本發明的抗體分子或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、共軛物、融合蛋白及／或藥物組成物。
基於與α-溶血素結合並抑制其溶血及損傷組織細胞的能力，本發明的抗體或其片段可以單獨或者與其他抗菌藥物合用於治療或改善由α-溶血素或產生α-溶血素的微生物感染或者由其感染所導致的其他疾病或症狀。因此，本發明更提供上述主題的相關應用。
具體而言，再一方面，本發明提供使用本發明之抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、共軛物、融合蛋白及／或藥物組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防或治療由α-溶血素或產生α-溶血素的微生物所導致的感染及併發症。
並且，本發明提供使用該抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、共軛物、融合蛋白及／或藥物組成物與其他抗菌藥物或抗α-溶血素抗體的組合在製備藥物中的用途，該藥物用於預防或治療由α-溶血素或產生α-溶血素的微生物所導致的感染及併發症。
另外，本發明提供一種預防或治療由α-溶血素或產生α-溶血素的微生物所導致的感染及併發症的方法，該方法包括給有此需要的受試者施用該抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、共軛物、融合蛋白及／或藥物組成物，以及任選的抗菌藥物。該任選的抗菌藥物可以是與本發明抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、共軛物、融合蛋白及／或藥物組成物聯合施用的藥物。二者的聯合施用可以採取任意形式進行，包括同時、連續或間隔一定時間進行。
在本發明中，產生α-溶血素的微生物較佳為金黃色葡萄球菌，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。
在本發明中，由α-溶血素或產生α-溶血素的微生物所導致的感染可為選自上呼吸道感染、肺炎、重症肺炎、腹腔感染、皮下及軟組織感染、菌血症及各種臟器的感染中的一種或多種；該併發症可為選自急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、膿毒症以及有機體發炎因子升高中的一種或多種。
在本發明中，其他抗菌藥物為可用於治療和預防金黃色葡萄球菌、例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的藥物（包括化學藥物、生物製劑和中藥），較佳為抗生素，例如β-內醯胺類抗生素。抗生素可以為美國感染病學會（IDSA，Infectious Diseases Society of America）或者中國中華醫學會頒佈的指南／治療策略中所列的可用於治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的藥物，較佳為萬古黴素、去甲萬古黴素、替考拉寧、利奈唑胺、達托黴素、頭孢吡普、夫西地酸、頭孢洛林。
本發明更提供一種診斷由α-溶血素或產生α-溶血素的微生物所導致的感染的方法，該方法包括使該抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、共軛物、融合蛋白及／或藥物組成物與來自受試者的樣品相接觸。
在本發明中，「受試者」可以是哺乳動物，例如靈長類動物或齧齒類動物，更佳為人。
在本發明中，術語「溶血素α」和「溶血素α毒素」可互換地指由金黃色葡萄球菌分泌的33kDa單聚蛋白質，其在宿主細胞膜中寡聚化成七聚結構以形成孔隙，從而導致細胞溶解、炎症及組織損傷。野生型溶血素α的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：78中。經修飾的溶血素α（H35L突變體）的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：80中。除非另外指出，否則提及溶血素α是指野生型形式。Hla-H35L是位置35的組胺酸已變成亮胺酸的溶血素α。這允許毒素在宿主細胞膜上組裝，直到前孔形成步驟，但未形成完全功能孔隙。這使得溶血素α是非產毒的。
在本發明中，術語「抗體」意在指包含四個多肽鏈（通過二硫鍵相互連接的兩個重（H）鏈和兩個輕（L）鏈）的免疫球蛋白分子（即，「完全抗體分子」），以及其多聚體（例如IgM）或其抗原結合片段。各重鏈包含重鏈可變區（「HCVR」或「VH」）和重鏈恆定區（包含結構域CH1、CH2和CH3）。各輕鏈包含輕鏈可變區（「LCVR」或「VL」）和輕鏈恆定區（CL）。VH和VL區可以進一步再分成稱為互補決定區（CDR）的高變異性區域，其間散佈有稱為構架區（FR）的較保守的區域。各VH和VL由三個CDR和四個FR組成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明的某些實施例中，抗體（或其抗原結合片段）的FR可以與人類生殖系序列相同，或可以經天然或人造修飾。胺基酸共同序列可以基於兩個或更多個CDR的並行分析來定義。
一個或多個CDR殘基的取代或一個或多個CDR的省略也是可能的。科學文獻中已描述關於結合可以省掉一或兩個CDR的抗體。Padlan等人（《美國實驗生物學會聯合會會志（FASEB J.）》1995，9：133-139）基於所公開的晶體結構分析了抗體與其抗原之間的接觸區域，且得出以下結論：僅約五分之一到三分之一的CDR殘基實際上接觸抗原。Padlan還發現一或兩個CDR中沒有胺基酸與抗原接觸的許多抗體（還參見Vajdos等人2002《分子生物學雜誌（J.Mol.Biol.）》320：415-428）。 不接觸抗原的CDR殘基可基於先前研究（例如CDRH2中的殘基H60-H65常常是不需要的）通過分子模型化及／或根據經驗由位於喬西亞（Chothia）CDR外部的卡巴特（Kabat）CDR的區域來識別。如果省去CDR或其殘基，那麼其通常用另一人類抗體序列或這類序列的共同序列中佔據對應位置的胺基酸取代。CDR內用於取代的位置和用於取代的胺基酸也可以根據經驗來選擇。經驗取代可以是保守或非保守取代。
術語「特異性結合」或「特異性結合於」等類似術語意指抗體或其抗原結合片段與抗原形成在生理條件下相對穩定的複合物。特異性結合的特徵可以是平衡解離常數是至少約1×10-6 M或更小（例如較小的KD表示較緊密的結合）。確定兩個分子是否特異性結合的方法是所屬領域中眾所周知的，且包括例如平衡滲析、表面等離子共振和類似方法。如本文所描述，已通過表面等離子共振（例如BIACORETM）識別特異性結合於溶血素α的抗體。此外，如本文所用，結合於溶血素α中的一個結構域和一種或多種額外抗原的多特異性抗體或結合於溶血素α的兩個不同區的雙特異性抗體仍然被視為「特異性結合」的抗體。
術語「高親和力」抗體是指如通過表面等離子共振（例如BIACORETM）或溶液-親和力ELISA所測量之對溶血素α具有以KD表示至少10-7 M；較佳10-8 M；更佳10-9 M，甚至更佳10-10 M，甚至更佳10-11 M之結合親和力的mAb。
術語「緩慢解離速率」、「K解離」或「kd」意在描述如通過表面等離子共振（例如BIACORETM）所測定以1×10-3 s-1 或更小、較佳1×10-4 s-1 或更小的速率常數自溶血素α解離的抗體。
如本文所用，術語抗體的「抗原結合部分」、抗體的「抗原結合片段」和類似術語，包括特異性結合抗原以形成複合物的任何天然存在、酶促可獲得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。如本文所用，術語抗體的「抗原結合片段」或「抗體片段」是指抗體中保留結合於溶血素α之能力的一個或多個片段。
在具體實施例中，本發明的抗體或抗體片段可以結合於治療劑部分（「免疫結合物」），如抗生素、第二抗溶血素A抗體或針對如IL-1、IL-6或TGF-β之細胞因子的抗體或適合用於治療疾病或病狀的任何其它治療劑部分，該疾病或病狀包括金黃色葡萄球菌感染、皮膚和軟組織感染（包括膿腫）、手術部位感染、人造關節感染、菌血症、敗血症、膿毒性關節炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、肺炎、中毒性休克綜合症、乳房炎、及癤病和癰病（癤）。
如本文所用，「經分離的抗體」意在指基本上不含具有不同抗原特異性之其它抗體（Ab）的抗體（例如特異性結合溶血素A的經分離的抗體或其片段基本上不含特異性結合不是溶血素A之抗原的Ab）。
如本文所用，術語「KD」意在指具體抗體-抗原相互作用的平衡解離常數。
相對於現有技術，本發明通過大腸桿菌原核表達獲得金黃色葡萄球菌α-溶血素（α-Toxin）以及不具有毒性的金黃色葡萄球菌α-溶血素突變蛋白（α-Toxin H35L）。利用α-溶血素 H35L成功免疫小鼠後取脾細胞，利用融合瘤技術建立抗體庫，篩選獲得與α-溶血素（α-Toxin）具有高親和力並且具有生物學活性的α-溶血素單株抗體，進一步將其人源化後獲得先導抗體分子（IgG1亞型）。
具體而言，本發明利用α-溶血素 H35L成功免疫小鼠後取脾細胞，利用融合瘤技術建立抗體庫，篩選獲得與α-溶血素（α-Toxin）具有高親和力並且具有生物學活性的α-溶血素單株抗體。共獲得16個先導抗體分子，不僅和α-溶血素具有高親和力，而且具有阻斷α-溶血素溶血的活性。特別是在抗原選擇與抗體篩選上，本發明採取了弱毒性免疫、強毒性篩選的策略。
基於鼠源先導抗體分子進行重組表達人鼠親和抗體及人源化抗體，最終獲得具有與鼠源抗體相似生物學活性的人源化抗體分子。
體外藥效學研究表明，本發明的人源化抗體能夠成劑量依賴性阻斷α-溶血素對兔紅血球的溶血效應、阻斷α-溶血素對肺上皮細胞的損傷作用。此外，本發明還利用小鼠α-溶血素膿毒症模型、MRSA菌血症模型和MRSA肺部感染模型對先導抗體分子進行了動物體內藥效學評價。研究結果表明，本發明的人源化抗體對小鼠α-溶血素膿毒症模型具有顯著的保護作用；能夠顯著延長小鼠MRSA菌血症模型的生存時間；能夠顯著降低小鼠MRSA肺部感染模型組織載菌量。而且，本發明的人源化抗體與常用抗菌藥萬古黴素、利奈唑胺等的聯合應用，在小鼠α-溶血素膿毒症模型、MRSA菌血症模型和MRSA肺部感染模型中表現出顯著的協同作用。
並且，對本發明的抗體按照20毫克／公斤劑量在食蟹猴體內開展了單次給藥的藥代動力學研究（N=3），結果表明基本的藥代動力學參數符合成藥性標準（表1），體內消除半衰期（T1/2 ）為137±36.9小時，血漿清除率（CL）為0.501±0.222毫升／小時／公斤。此外，在小鼠體內開展了本發明的抗體急性毒性試驗研究（N=10），結果表明最高24小時內給予125毫克／公斤劑量時，未出現小鼠死亡，連續觀察14天未見動物出現任何不適現象，處死動物取主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、腦）大體觀察未見異常；食蟹猴單次給藥本發明的抗體10毫克／公斤劑量，未出現動物死亡，連續觀察28天未見動物出現任何不適現象。急性毒性試驗研究表明本發明的抗體安全性好。
本發明的抗體可以有效中和毒素，阻斷其對患者組織細胞的破壞，同時提高患者免疫力，由此減輕臨床金黃色葡萄球菌感染組織損傷、促進患者體內感染菌更快清除、預防或減輕膿毒症。在該抗體的作用下，患者可以更快地由靜脈輸液治療轉為口服治療、治療療程縮短；同時，本發明的抗體具有更好的臨床療效和耐受性，是對現有抗生素療法的有利補充。
以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
本文中採用已知抗體作為對照，其中： Aridis製藥公司的全人源抗體R-301（Salvecin®），簡稱為AR（參見US9249215B2），重鏈可變區示於SEQ ID NO: 82，輕鏈可變區示於SEQ ID NO: 83。 Astrazeneca製藥公司的人源化抗體MEDI4893，簡稱為AZ（參見US20140072577A1），重鏈可變區示於SEQ ID NO: 84，輕鏈可變區示於SEQ ID NO: 85。
本發明提供的抗體具有如 SEQ ID NO: 86所示的重鏈恆定區和 SEQ ID NO: 87所示的輕鏈恆定區。
實施例 1 ：融合His標記的金黃色葡萄球菌α-溶血素（α-Toxin）的重組表達
以金黃色葡萄球菌α-溶血素胺基酸序列為目的序列，人工合成相應的鹼基序列，並利用酶切位點NdeI和XhoI將其選殖至含His標記的Pet-21a質體中。其中該金黃色葡萄球菌α-溶血素胺基酸序列如 SEQ ID NO: 78所示，相應的鹼基序列如 SEQ ID NO: 79所示，重組質體的構建見圖1。
將獲得的重組質體轉化至感受態細胞BL21(DE3) pLysS中，於次日挑取單菌落接種至含100微克／毫升之胺苄西林的LB液體培養基中，37℃振盪培養過夜。過夜培養的菌液按1:100體積比接種至含100微克／毫升之胺苄西林的LB液體培養基中，以200rpm於37℃振盪培養至OD600 約為0.6~0.8，向菌液中加入IPTG至終濃度為0.1mM，於16℃誘導16-18小時。取誘導後菌液，以8,000rpm離心3分鐘收集菌體，於-80℃保存。
實施例 2 ： 融合His標記的金黃色葡萄球菌α-溶血素突變體（H35L α-Toxin）的重組表達
基於金黃色葡萄球菌α-溶血素胺基酸序列，將35位組胺酸（His）突變為亮胺酸（Leu），得到突變後的胺基酸序列，人工合成相應的鹼基序列，並利用酶切位點NdeI和XhoI將其選殖至含His標記的Pet-21a質體中。其中該金黃色葡萄球菌突變α-溶血素（H35L α-Toxin）胺基酸序列如SEQ ID NO: 80所示（H35L在該序列中為第36位），相應的鹼基序列如 SEQ ID NO: 81所示，重組質體的構建見圖2。
將獲得的重組質體轉化至感受態細胞BL21(DE3) pLysS中，於次日挑取單菌落接種至含100微克／毫升之胺苄西林的LB液體培養基中，37℃振盪培養過夜。過夜培養的菌液按1:100體積比接種至含100微克／毫升之胺苄西林的LB液體培養基中，以200rpm於37℃振盪培養至OD600 約為0.6~0.8，向該菌液加入IPTG至終濃度為0.25mM，於25℃誘導4.5小時。取誘導後菌液，以8,000rpm離心3分鐘收集菌體，於-80℃保存。
實施例 3 ： 金黃色葡萄球菌α-溶血素（α-Toxin）及其突變體（H35L α-toxin）的純化
將誘導表達金黃色葡萄球菌α-溶血素及其突變體的大腸桿菌分別用超聲破碎儀破碎，180瓦（W）工作3秒間歇3秒，時間7-9分鐘；以13,000 rpm離心30分鐘，收集上清液，用0.22μmL濾器過濾除菌。
室溫下將鎳（Ni）柱與經過濾的上清液於旋轉混合儀上混合1小時，將Ni柱裝載到填料柱中。用5倍柱床體積的BD液（含咪唑濃度30mM）洗脫與Ni柱非特異性結合的蛋白，洗至蛋白顯色液不變色，然後用5倍柱床體積的BB液（含咪唑濃度300mM）洗脫目的蛋白。然後使用10KD的濃縮管將含目的蛋白的洗脫液濃縮置換，溶劑為PBS。所得到之蛋白的電泳結果見圖3。
實施例 4 ： 金黃色葡萄球菌α-溶血素（α-Toxin）及其突變體（H35L α-toxin）生物學活性檢測（體外溶血實驗及小鼠體內毒性作用）
分別滴加10微升不同濃度（5微克／毫升，0.5微克／毫升，0.05微克／毫升）的金黃色葡萄球菌α-溶血素及其突變體至綿羊血平板（上海科瑪嘉微生物技術有限公司）表面，並將血平板置於37℃培養箱中孵育24h，滴加α-溶血素周圍可見明顯的溶血環，並且溶血環直徑大小與其濃度呈相關性；而α-溶血素突變體周圍未見溶血環。實驗結果見圖4。
向96孔板中每孔加入5%兔紅血球75微升（Bio-channel Biotechnology）和不同品質的金黃色葡萄球菌α-溶血素或其突變體，並加入PBS緩衝液至終體積150微升。37℃培養箱中孵育1小時，將96孔板以3000 rpm離心3分鐘。取100微升上清液通過用酶標儀檢405奈米處吸光度值（OD405 ）評價其溶血活性。結果表明α-溶血素對兔紅血球的溶血活性呈劑量依賴性，而α-溶血素突變體沒有溶血活性。實驗結果見圖5。
通過尾靜脈注射給予C57小鼠不同劑量的金黃色葡萄球菌α-溶血素或其突變體，發現按照實施例1、實施例2和實施例3描述的方法重組表達的金黃色葡萄球菌α-溶血素對C57小鼠的最低致死劑量為3微克／隻；最高注射α-溶血素突變體200微克／隻，小鼠未發生任何不適反應。
實施例 5 ： 金黃色葡萄球菌α-溶血素突變體（H35L α-Toxin）對C57小鼠的毒性作用
將α-溶血素或α-溶血素突變體用PBS稀釋至不同濃度，尾靜脈注射C57小鼠。比較二者對C57小鼠的毒性作用，以選擇出適合後續免疫動物之免疫原及其用量。結果見表1。
表1. 不同劑量的α-溶血素和α-溶血素突變體對小鼠的毒性作用
蛋白 劑量 小鼠狀態
野生型α- 溶血素 50微克／隻小鼠（2.5毫克／公斤） 瞬間死亡
10微克／隻小鼠（0.5毫克／公斤） 瞬間死亡
3微克／隻小鼠（0.15毫克／公斤） 30分鐘內死亡
1微克／隻小鼠（0.05毫克／公斤） 出現顫抖、煩躁等不適反應，存活，16小時（過夜）後恢復正常
0.1微克／隻小鼠（0.005 毫克／公斤） 未出現明顯不適反應
H35L α- 溶血素 200微克／隻小鼠（10毫克／公斤） 未出現明顯不適反應
無關蛋白BSA 200微克／隻小鼠（10毫克／公斤） 未出現明顯不適反應
實施例 6 ：金黃色葡萄球菌α-溶血素突變體（H35L α-Toxin）對Balb/c小鼠的免疫
參考Antibodies a Laboratory Manual, Second Edition （Edward A. Greenfield 2012），以14天為間隔共計42天的過程免疫8週齡Balb/c小鼠。
將金黃色葡萄球菌α-溶血素突變體在完全或不完全弗氏佐劑中乳化，將其以單側的方式注射於小鼠頸背部、尾根部、腹股溝3處皮下組織和腹膜腔內。在免疫第35天尾靜脈採血，用ELISA方法檢測抗體力價後，取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合。
實施例 7 ：融合瘤細胞株的篩選、鑒定及抗體序列測定
取金黃色葡萄球菌α-溶血素突變體（H35L α-Toxin）免疫的Balb/c小鼠的脾臟細胞，與骨髓瘤細胞P3X63Ag8.653使用PEG或者電融合方法進行融合。將融合後的融合瘤細胞接種於30塊384孔板中，24小時後加入含HAT培養基和含HT培養基，篩選融合瘤細胞。於384孔板中培養10-14天後，取細胞上清液與α-溶血素進行ELISA實驗，篩選能夠分泌和α-溶血素特異性結合之抗體的融合瘤母克隆（見圖6A）。隨後，按ELISA OD值從高到低排序，每塊板挑選了94個孔轉至96孔板培養，（其中第30號板ELISA檢測陽性較差一些，未選孔轉板），共轉板29塊96孔板。
生理條件下，α-溶血素的存在會導致紅血球的裂解，裂解物的釋放會導致溶液上清液顏色發生變化。而細胞分泌上清液中的抗α-溶血素抗體可以抑制α-溶血素對紅血球的裂解。通過檢測上清液吸光值，可以檢測α-溶血素對細胞的裂解程度，以及抗體對α-溶血素的抑制。
對轉板後的96孔板培養上清液進行溶血實驗檢測，步驟如下：將野生型-α-溶血素稀釋為5微克／毫升濃度母液，取25微升與等體積細胞培養上清液混合後，加入至含5%兔紅血球（PBS稀釋至75微升）之96孔板中，放置於37℃培養箱中孵育1小時。將96孔板以離心機離心3000rpm，3分鐘。取75微升上清液加入到新的96孔板中，用酶標儀測OD405和OD450吸光度值。部分結果見圖6B。
將篩選到的分泌抗α-溶血素抗體的融合瘤母克隆採用有限稀釋法加入鋪有飼養細胞的96孔板中，第2-3天後，於顯微鏡下觀察並標記單株細胞，第7天後通過ELISA實驗篩選能夠分泌抗α-溶血素單株抗體的單株融合瘤細胞。
將分泌抗α-溶血素單株抗體的單株融合瘤細胞擴大培養後，按照RNAfast200試劑盒（上海飛捷生物技術有限公司）之說明書步驟提取細胞總RNA；利用5×PrimeScript RT Master Mix（Takara）將融合瘤細胞總RNA反轉錄成cDNA；使用退化性引子（Anke Krebber.1997）和Extaq PCR試劑（Takara）擴增抗體輕鏈可變區IgVL(κ)和重鏈可變區VH 的序列。利用PCR clean-up Gel extraction試劑盒（Macherey-Nagel公司）純化PCR擴增產物；按照pClone007 Simple Vector Kit試劑盒（擎科生物科技有限公司）之說明書將擴增PCR產物連接至T載體並轉化大腸桿菌感受態細胞，菌株擴增、抽提質體後進行DNA測序獲得單株抗體可變區序列。
獲取鼠源抗體可變區序列並分析如下：＞ 98G9 鼠源抗體 重鏈可變區： DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSTFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCASGYPYGLDYWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 44） 輕鏈可變區： DIDMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINWYLSWFQQKPGKSPKTLIYRGNRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPFTFGSGTKLEIK（SEQ ID NO: 46） 按照不同方法，對98G9鼠源抗體的重鏈和輕鏈CDR進行定義，見表2。 表2. 98G9鼠源抗體的CDR序列
方法 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
喬西亞（Chothia） SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 7
抗原結合分子（AbM） SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7
卡巴特（Kabat） SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7
組合 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7
方法 輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3
喬西亞 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
抗原結合分子 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
卡巴特 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
組合 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
＞ 78F4 鼠源抗體 重鏈可變區： QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLSQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTRFDWDRAMDYWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 52） 輕鏈可變區： DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIFSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNTRSLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYGTPWTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 54） 按照不同方法，對78F4鼠源抗體的重鏈和輕鏈CDR進行定義，見表3。 表3. 78F4鼠源抗體的CDR序列
方法 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
喬西亞 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 18
抗原結合分子 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 18
卡巴特 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
組合 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
方法 輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3
喬西亞 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21
抗原結合分子 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21
卡巴特 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21
組合 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21
＞ 78D4 鼠源抗體 重鏈可變區： EVHLQQSGPELMKPGASVKISCKTSGYTFSEYTMHWVKQSHGKSLEWIGSINPNNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYNCARTRDYDNDGGLFAYWGQGTLVTVSA（SEQ ID NO: 60） 輕鏈可變區： DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKNISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGNRSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHYEYPFTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 62） 按照不同方法，對78D4鼠源抗體的重鏈和輕鏈CDR進行定義，見表4。 表4. 78D4鼠源抗體的CDR序列
方法 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
喬西亞 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 29
抗原結合分子 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 29
卡巴特 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 29
組合 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 29
方法 輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3
喬西亞 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33
抗原結合分子 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33
卡巴特 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33
組合 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33
＞ 16H4 鼠源抗體 重鏈可變區： EVQLQQSGAELVKPGASVTLSCTVSGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGKIDPASGNTKYDPQFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSEDSAVYFCASPYGNDYAMNYWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 68） 輕鏈可變區： DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASEKIYSFLAWYQQKQEKSPQLLVYNAETLAEGVPSRFSGTGSGIQFSLKIISLQPEDFGIYYCQHHYGTPYTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 70） 按照不同方法，對16H4鼠源抗體的重鏈和輕鏈CDR進行定義，見表5。 表5. 16H4鼠源抗體的CDR序列
方法 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
喬西亞 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 40
抗原結合分子 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 40
卡巴特 SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40
組合 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40
方法 輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3
喬西亞 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43
抗原結合分子 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43
卡巴特 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43
組合 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43
實施例 8 ：本發明抗體與α-溶血素（α-Toxin）的結合
將α-溶血素用PBS緩衝液稀釋至1微克／毫升，每孔100微升包被於96孔板（Microwell 96F 167008，Thermo）4℃孵育過夜；次日取出96孔板，用PBST（含0.5% PBS）洗板，每次浸潤1分鐘後徹底甩乾殘餘水分。樣品孔中分別加入200微升的含5% BSA PBST，置於37℃封閉1小時；然後用PBST洗板，並甩乾孔中水分。
分別向96孔板中加入倍比稀釋之不同濃度的重組表達的抗α-溶血素單株抗體100微升（抗體濃度參見圖7橫坐標），4℃孵育過夜。取出96孔板後用PBST洗板，然後每孔加入抗小鼠IgG二抗（IH-0031，北京鼎國昌盛生物技術）100微升，並置於37℃孵育1小時。再用PBST洗5次，每孔加入100微升受質溶液（Substrate Solution，Invitrogen），於37℃孵育10分鐘；每孔加入2N硫酸50微升終止反應後於酶標儀（Multiskcin FC，Thermo）450奈米波長處檢測吸光度。
結果見圖7。
實施例 9 ： 本發明嵌合抗體和人源化抗體的獲得
首先將鼠源抗體的完整輕、重鏈可變區和人輕、重鏈恆定區組合，得到嵌合抗體形式作為對照。得到的嵌合抗體命名為「鼠源抗體簡稱-xi」。
在對鼠源抗體重鏈序列進行綜合分析，確定抗體與抗原結合的抗原互補決定簇（CDR）區域及支撐抗體保守三維構象的框架區（framework）後，通過分析搜索已知人源抗體序列，選擇與鼠源抗體最為相似接近的人源抗體重鏈序列，如IGHV1-3*01，選擇其抗體框架區序列作為範本。將鼠源抗體重鏈CDR嵌入到人源抗體框架區，生成人源化抗體重鏈序列（重鏈版本0）。隨後，對可能參與抗原抗體結合的鼠源框架區個別胺基酸位點進行回復，生成人源化抗體重鏈序列（版本1，2，3……）。同樣過程，生成人源化抗體輕鏈序列（版本0，1，2……）。將設計合成的人源化抗體輕重鏈共轉染293細胞，重組表達人源化抗體（版本命名方式例如：重鏈版本0+輕鏈版本0共表達，即為H0L0，可進一步縮寫為00版本）。實驗證明，純化後的人源化抗體與鼠源母本抗體表現出一致的特異性結合α-溶血素蛋白活性。
採用Octect儀器對最終獲得的人源化抗體版本和嵌合抗體xi版本做抗原結合力的對比，圖8為部分抗體的測定結果。由抗體與抗原結合的結合和解離階段的曲線看，特定人源化抗體版本在抗原抗體的結合、解離階段表現出和對照抗體（包括本發明的嵌合抗體或AZ、AR抗體）類似或更佳的性質。
篩選得到具有以下人源化抗體。＞ 人源化抗體 98G9-02 （98G9-H0L2） 重鏈可變區（H0）： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTFGMHWVRQAPGKGLEWVSYISGGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGYPYGLDYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 48） 輕鏈可變區（L2）： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINWYLSWFQQKPGKAPKTLIYRGNRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTFTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPFTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 76）＞ 人源化抗體 98G9-03 （98G9-H0L3） 重鏈可變區（H0）： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTFGMHWVRQAPGKGLEWVSYISGGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGYPYGLDYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 48） 輕鏈可變區（L3）： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINWYLSWFQQKPGKAPKTLIYRGNRLVEGVPSRFSGSGSGQDYTFTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPFTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 50）＞ 人源化抗體 78F4-00 （78F4-H0L0） 重鏈可變區（H0）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSETRLSQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARFDWDRAMDYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 56） 輕鏈可變區（L0）： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNTRSLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 58）＞ 人源化抗體 78D4-33 （78D4-H3L3） 重鏈可變區（H3）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFSEYTMHWVRQAPGQRLEWMGSINPNQGGTTYNQKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTRDYDNDGGLFAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 64） 輕鏈可變區（L3）： DVQITQSPSFLSASVGDRVTITCRASKNILKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSRSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYEYPFTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 66）＞ 人源化抗體 16H4-11 （16H4-H1L1） 重鏈可變區（H1）： EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWMGKIDPASGNTKYDPQFQGRVTITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPYGNDYAMNYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 72） 輕鏈可變區（L1）： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEKIYSFLAWYQQKPGKAPKLLLYNAETLAEGVPSRFSGSGSGIDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPYTFGGGTKVEIK（SEQ ID NO: 74） 人源化抗體的重鏈和輕鏈CDR見表6。 表6. 人源化抗體的CDR序列
98G9 H0L2 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7
輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3
SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
98G9 H0L3 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7
輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3
SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 10
78F4 H0L0 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3
SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21
78D4 H3L3 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29
輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3
SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33
16H4 H1L1 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3
SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40
輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3
SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43
實施例 10 ： 本發明抗體抗α-溶血素（α-Toxin）的溶血活性的檢測
向96孔板中每孔加入5%兔紅血球75微升（Bio-channel Biotechnology）、12.5奈克之金黃色葡萄球菌α-溶血素和不同品質的抗α-溶血素抗體（12.5奈克、25奈克、50奈克），並加入PBS緩衝液至終體積150微升。37℃培養箱中孵育1小時，將96孔板以3000 rpm離心3分鐘。取100微升上清液，並通過用酶標儀檢測405奈米處吸光度值（OD405 ）評價其溶血活性。
實驗結果表明，本發明的嵌合抗體和人源化抗體具有明顯的抗α-溶血素溶血活性，並且具有劑量依賴性，部分抗體活性與對照抗體AR和AZ相當。結果見圖9。
實施例 11 ： 本發明抗體與α-溶血素（α-Toxin）的結合動力學（Kon ，Koff ）和親和力常數KD 的檢測
採用GE公司BIAcore儀器S200測定抗體抗原相互作用力。
參考GE公司人類抗體捕捉套組（Human antibody capture kit）商品試劑盒（貨號BR-1008-39，Lot10261753）操作說明，首先在傳感晶片CM5分析通道和對照樣品通道都飽和偶聯最大量之抗人Fc（anti-human Fc）抗體，然後在分析通道流過7.5微克／毫升待測抗體，使抗體均勻分佈，最後在分析通道和樣品通道一起流過梯度稀釋的抗原樣品（起始濃度20nM，1:3稀釋8個濃度點，並且設定0.741奈米濃度點重複），測定抗體抗原結合後發生的光反應值。隨後，經儀器軟體擬合（1:1）分析，最終得到抗體的結合常數Kon 和解離常數Koff ，以及親和力常數KD 。
結果見表7。 表7. 本發明抗體與抗原的結合動力學和親和力常數
抗體 結合常數（ka）(1/Ms) 解離常數（kd）(1/s) 親和力常數（KD）(M) 信號值（Rmax）(RU) 可信度（Chi²）(RU²)
78D4 xiIgG 1.40E+06 3.36E-04 2.39E-10 67.1 0.198
78D4-H3L3 1.25E+06 3.02E-04 2.40E-10 37.2 0.0303
98G9 xiIgG 8.84E+05 3.77E-04 4.26E-10 47.3 0.46
98G9-H0L2 7.76E+05 5.24E-04 6.74E-10 18.9 0.0677
98G9-H0L3 7.19E+05 5.12E-04 7.13E-10 22.5 0.0481
AZ IgG 1.60E+06 2.11E-04 1.32E-10 48.8 0.0552
AR IgG 2.76E+05 6.77E-05 2.45E-10 48.7 0.48
實施例 12 ： α-溶血素（α-Toxin）導致的膿毒症動物模型複製以及本發明抗體的治療作用檢測
將C57BL/6J小鼠根據體重隨機分為模型對照組和單株抗體藥物治療組。實驗前30分鐘，治療組尾靜脈注射抗α-溶血素單株抗體（6微克／隻），對照組小鼠注射相同劑量的PBS，然後所有小鼠均尾靜脈注射α-溶血素（3微克／隻）建立膿毒症感染小鼠模型，觀察記錄實驗動物生存時間，結果見圖10。
實施例 13 ： 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌導致的菌血症動物模型複製以及本發明抗體的治療作用檢測
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300在TSB固體培養基平板上活化2代，接種至TSB液體培養基中過夜培養，以12,000rpm離心收集菌體，並重新懸浮於生理鹽水中備用。
C57BL/6J小鼠尾靜脈感染USA300（6×107 CFU／隻），並根據體重隨機分為模型對照組（Control）、不同抗α-溶血素單株抗體藥物治療組。感染2小時後經尾靜脈注射，各組單株抗體治療組給予15毫克／公斤劑量的相應抗體，對照組注射相同劑量的PBS，觀察記錄各組小鼠生存時間，結果見圖11。
實施例 14 ： 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的肺炎動物模型複製以及本發明抗體的治療作用檢測
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300在TSB固體培養基平板上活化2代，接種至TSB液體培養基中過夜培養，以12,000rpm離心收集菌體，並重新懸浮於生理鹽水中備用。
C57BL/6J小鼠經氣管感染USA300（1.8×108 CFU／隻），並根據體重隨機分為模型對照組、單株抗體藥物治療組、萬古黴素治療組、萬古黴素+單株抗體治療組。感染2小時後經尾靜脈注射，各組動物給予相應藥物治療，單株抗體給藥劑量為15毫克／公斤，萬古黴素給藥劑量為1.25毫克／公斤，對照組注射相同劑量的PBS。感染24小時後處死動物，取肺組織勻漿，稱重、勻漿、塗布於TSB固體培養基上檢測組織載菌量，實驗結果表明本發明中抗α-溶血素抗體能夠增強萬古黴素治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的肺炎感染的藥效學作用。
結果見圖12。
實施例 15 ： 本發明抗體的急性毒性研究
在小鼠和食蟹猴體內展開本發明78D4 H3L3抗體分子的急性毒性試驗研究（小鼠實驗N=10，食蟹猴實驗N=3）。
C57BL/6小鼠（18-20克），雌雄各半，每隻小鼠經尾靜脈24小時內注射125毫克／公斤的78D4 H3L3抗體分子。結果表明，最高24小時內給予125毫克／公斤劑量時，未出現小鼠死亡，連續觀察14天未見動物出現任何不適現象，處死動物取主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、腦）大體觀察未見異常。
每只雄性食蟹猴動物，經四肢靜脈滴注給予78D4 H3L3抗體分子10毫克／公斤，單次給藥。結果表明，78D4 H3L3抗體分子10毫克／公斤劑量時，未出現動物死亡，連續觀察28天未見動物出現任何不適現象。
急性毒性試驗研究表明78D4 H3L3抗體分子安全性好。
實施例 16 ： 本發明抗體的藥代動力學研究
78D4 H3L3抗體分子按照10毫克／公斤劑量在食蟹猴體內展開單次給藥的藥代動力學研究（N=3）。
食蟹猴，雄性，每隻動物經四肢靜脈滴注給予78D4 H3L3抗體分子10毫克／公斤，單次給藥。於給藥前0小時（pre-dose，0h），給藥開始後0.25小時（15分鐘）、0.5小時（拔針點）、4小時、24小時（D2）、48小時（D3）、96小時（D5）、168小時（D8）、336小時（D15）、504小時（D22）、672小時（D29）進行採血。採血部位為動物四肢外周靜脈（非給藥肢）或腹股溝靜脈取血。採血量為約1毫升全血／隻／時間點。採用ELISA法測定食蟹猴血清中抗體濃度；採用非房室模型分析的方法，通過WinNonlin Phoenix（v6.4, Pharsight公司）軟體計算AUClast 、Cl、T1/2 等藥代動力學參數。
採用ELISA法測定食蟹猴血清中78D4 H3L3抗體濃度，血清藥物濃度個體圖見圖13，藥代動力學參數匯總見表8，各動物給藥後均可見藥物暴露。 表8. 抗體78D4 H3L3的藥代動力學結果
動物ID
111 112 113 N 平均值 標準差（SD ） 變異係數（CV ）%
參數 單位 估值
從給藥開始到外推無窮遠時間的曲線下面積（AUCINF_obs ） 小時*奈克／毫升（h*ng/mL） 26900000 44700000 64300000 3 45300000 18700000 41.3
從給藥時間開始到最後一個時間點的時間段內曲線下面積（AUClast ） 小時*奈克／毫升 26800000 43200000 60700000 3 43600000 17000000 38.9
最大血清藥物濃度（C0 ） 奈克／毫升（ng/mL） 431000 387000 592000 3 470000 108000 22.9
清除率（Cl_obs ） 毫升／小時／公斤 0.744 0.447 0.311 3 0.501 0.222 44.2
平均滯留時間（MRTlas t ） 小時 83.8 160 170 3 138 47.1 34.2
半衰期（T1/2 z ） 小時 99.2 140 173 3 137 36.9 26.9
表觀分佈容積（Vz_obs ） 毫升／公斤 107 90.4 77.6 3 91.5 14.5 15.8
本專利申請要求於2019年9月20日提交的申請號為CN201910889697.5的中國發明專利申請的優先權權益，在此將其全部內容引入作為參考。
以上對本發明具體實施方式的描述並不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明所附申請專利範圍的範圍。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中： 圖1顯示出融合His標記的金黃色葡萄球菌α-溶血素（α-Toxin）蛋白的重組表達質體的構建。 圖2顯示出融合His標記的金黃色葡萄球菌突變α-溶血素（H35L α-Toxin）蛋白的重組表達質體的構建。 圖3顯示出重組表達的金黃色葡萄球菌突變α-溶血素及其突變體H35L α-溶血素的10% SDS-PAGE電泳結果，其中圖3A為α-溶血素，圖3B為H35L α-溶血素，上樣量為10微克。 圖4顯示出金黃色葡萄球菌α-溶血素及其突變體（H35L α-Toxin）對綿羊血平板的溶血作用。 圖5顯示出金黃色葡萄球菌α-溶血素及其突變體（H35L α-Toxin）對兔血的溶血作用，其中圖5A為α-溶血素，圖5B為H35L α-溶血素。 圖6顯示出融合瘤細胞株篩選過程中的檢測結果，其中圖6A為不同細胞株上清液中抗體與α-溶血素結合的ELISA檢測結果，圖6B分別為不同細胞株上清液中抗體對α-溶血素的抑制結果。 圖7顯示出本發明的抗體與α-溶血素結合的ELISA檢測結果，其中圖7A至圖7D分別顯示出篩選到的抗體78D4、16H4、78F4和98G9對α-溶血素的結合。 圖8顯示出本發明的抗體α-溶血素的Octect結合和解離曲線，其中圖8A至圖8D分別顯示出篩選到的78D4、16H4、78F4和98G9人源化版本抗體對α-溶血素的結合。 圖9顯示出本發明的抗體抗α-溶血素溶血活性的作用，其中圖9A至9C分別顯示出不同抗體量時的結果。 圖10顯示出本發明的抗體在α-溶血素導致的膿毒症動物模型中的治療作用。 圖11顯示出本發明的抗體在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌所導致的菌血症動物模型中的治療作用。 圖12顯示出本發明的抗體在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的肺炎動物模型中的治療作用。 圖13顯示出本發明的抗體在食蟹猴體內單次給藥後的藥代動力學研究結果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059

Claims (20)

  1. 一種製備抗α溶血素單株抗體的方法，包括以下步驟： （1）採用弱毒性α溶血素或不具有毒性的α溶血素免疫動物； （2）取脾細胞，製備融合瘤； （3）以強毒性α溶血素或野生型α溶血素篩選對其具有高親和力的抗體； （4）通過紅血球裂解抑制實驗，選擇具有抑制強毒性α溶血素或野生型α溶血素裂解紅血球活性的抗體。
  2. 如請求項1之製備抗α溶血素單株抗體的方法，其中， 該強毒性α溶血素或野生型α溶血素為金黃色α溶血素，較佳具有SEQ ID NO: 78所示之胺基酸序列； 該弱毒性α溶血素或不具有毒性的α溶血素為H35L α溶血素，較佳具有SEQ ID NO: 80所示之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之製備抗α溶血素單株抗體的方法，其中，該強毒性α溶血素或野生型α溶血素、弱毒性α溶血素或不具有毒性的α溶血素，係獨立地與純化標記、載體蛋白及／或佐劑分子連接； 該連接包括偶聯、交聯、共軛及／或融合。
  4. 一種以請求項1至3中任一項之方法製備的抗α溶血素單株抗體，其特徵在於，該抗體具有選自由以下所組成之群組的至少一種活性：能夠阻斷α溶血素的溶血效應、阻斷α溶血素對肺上皮細胞的損傷、降低MRSA肺部感染組織載菌量、延長MRSA菌血症的生存時間、預防或減輕α溶血素膿毒症。
  5. 一種以請求項1至3中任一項之方法製備的抗α溶血素單株抗體，其特徵在於，該抗體具有 VH-CDR1：選自SEQ ID NO:1、2、3、12、13、14、22、23、24、34、35、36； VH-CDR2：選自SEQ ID NO:4、5、6、15、16、17、25、26、27、28、37、38、39； VH-CDR3：選自SEQ ID NO:7、18、29、40； VL-CDR1：選自SEQ ID NO:8、19、30、31、41； VL-CDR2：選自SEQ ID NO:9、11、20、32、42；以及 VL-CDR3：選自SEQ ID NO:10、21、33、43。
  6. 一種抗體或其片段，該抗體或其片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）分別包含選自以下的CDR組合（VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3；VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3）： (1) 如SEQ ID NO: 1所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 4所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 7所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 8所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 9所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR3； (2) 如SEQ ID NO: 2所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 5所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 7所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 8所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 9所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR3； (3) 如SEQ ID NO: 3所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 6所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 7所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 8所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 9所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR3； (4) 如SEQ ID NO: 2所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 6所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 7所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 8所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 9所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR3； (5) 如SEQ ID NO: 2所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 6所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 7所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 8所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 11所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 10所示的VL-CDR3； (6) 如SEQ ID NO: 12所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 15所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 18所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 19所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 20所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 21所示的VL-CDR3； (7) 如SEQ ID NO: 13所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 16所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 18所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 19所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 20所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 21所示的VL-CDR3； (8) 如SEQ ID NO: 14所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 17所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 18所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 19所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 20所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 21所示的VL-CDR3； (9) 如SEQ ID NO: 13所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 17所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 18所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 19所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 20所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 21所示的VL-CDR3； (10) 如SEQ ID NO: 22所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 25所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 29所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 30所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL-CDR3； (11) 如SEQ ID NO: 23所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 26所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 29所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 30所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL-CDR3； (12) 如SEQ ID NO: 24所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 27所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 29所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 30所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL-CDR3； (13) 如SEQ ID NO: 23所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 27所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 29所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 30所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL-CDR3； (14) 如SEQ ID NO: 23所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 28所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 29所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 31所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL-CDR3； (15) 如SEQ ID NO: 34所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 37所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 40所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 43所示的VL-CDR3； (16) 如SEQ ID NO: 35所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 40所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 43所示的VL-CDR3； (17) 如SEQ ID NO: 36所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 40所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 43所示的VL-CDR3； (18) 如SEQ ID NO: 35所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 40所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 43所示的VL-CDR3。
  7. 如請求項4至6中任一項之的抗體或其片段，其中，該重鏈可變區包含： 如SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 68及SEQ ID NO: 72中任一個所示的胺基酸序列、或者與所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；及／或 該輕鏈可變區包含： 如SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 74及SEQ ID NO: 76中任一個所示的胺基酸序列、或者與所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列。
  8. 如請求項4至7中任一項所述的抗體或其片段，其中，該抗體或其片段所包含的重鏈可變區及輕鏈可變區係選自由以下所組成之群組： (1) 如SEQ ID NO: 44所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 44所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 46所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 46所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (2) 如SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 50所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 50所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (3) 如SEQ ID NO: 52所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 52所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 54所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 54所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (4) 如SEQ ID NO: 56所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 56所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 58所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 58所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (5) 如SEQ ID NO: 60所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 60所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 62所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 62所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (6) 如SEQ ID NO: 64所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 64所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 66所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 66所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (7) 如SEQ ID NO: 68所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 68所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 70所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 70所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (8) 如SEQ ID NO: 72所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 72所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 74所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 74所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (9) 如SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 76所示的胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 76所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列。
  9. 如請求項4至8中任一項之抗體或其片段，其中，該至少75%同一性為至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、進一步較佳至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性等≥75%的任何百分比的同一性； 較佳地，該抗體或其片段為單株抗體、單鏈抗體、單域抗體、雙功能抗體、奈米抗體、完全或部分人源化的抗體或者嵌合抗體等任意形式；或者，該抗體或其片段為半抗體或半抗體的抗原結合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2 、Fab、Fab'、F(ab')2 或Fv； 或者，該抗體為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，更佳為IgG1；該抗體的片段選自該抗體的scFv、Fab、F(ab')2 或Fv片段。
  10. 如請求項4至9中任一項之抗體或其片段，其中，該抗體或其片段更包含人或鼠的輕鏈恆定區（CL）及／或重鏈恆定區（CH）；較佳地，該抗體或其片段包含選自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重鏈恆定區及／或κ或λ型輕鏈恆定區；更佳地，重鏈恆定區為IgG1或IgG4亞型，輕鏈恆定區為κ型。
  11. 一種核酸分子，其編碼請求項4至10中任一項之抗體或其片段，或者編碼該抗體或其片段中所包含的重鏈CDR、輕鏈CDR、重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈或輕鏈。
  12. 一種載體，其包含請求項11之核酸分子。
  13. 一種宿主細胞，其包含請求項11之核酸分子及／或請求項12之載體，或者該宿主細胞被請求項11之核酸分子及／或請求項12之載體轉化或轉染。
  14. 一種共軛物或融合蛋白，其包含請求項4至10中任一項之抗體或其片段。
  15. 如請求項14之共軛物或融合蛋白，其中，該共軛物或融合蛋白包含與該抗體或其片段直接或間接連接的其他部分，例如細胞表面受體、小分子化合物、小分子聚合物、活性蛋白或多肽。
  16. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含請求項4至10中任一項之抗體或其片段、請求項11之核酸分子、請求項12之載體、請求項13之宿主細胞及／或請求項14或15之共軛物或融合蛋白，以及視需要的藥學上可接受的輔料。
  17. 一種試劑盒，該試劑盒包括請求項4至10中任一項之抗體或其片段、請求項11之核酸分子、請求項12之載體、請求項13之宿主細胞、請求項14或15之共軛物或融合蛋白及／或請求項16之藥物組成物。
  18. 一種使用請求項4至10中任一項之抗體或其片段、請求項11之核酸分子、請求項12之載體、請求項13之宿主細胞、請求項14或15之共軛物或融合蛋白及／或請求項16之藥物組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防或治療由α-溶血素或產生α-溶血素的微生物所導致的感染及併發症。
  19. 一種使用請求項4至10中任一項之抗體或其片段、請求項11之核酸分子、請求項12之載體、請求項13之宿主細胞、請求項14或15之共軛物或融合蛋白及／或請求項16之藥物組成物與其他抗菌藥物或抗α-溶血素抗體之組合在製備藥物中的用途，該藥物用於預防或治療由α-溶血素或產生α-溶血素的微生物所導致的感染及併發症。
  20. 如請求項18或19的用途，其中，該微生物為金黃色葡萄球菌；較佳地，該金黃色葡萄球菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌； 該感染包括上呼吸道感染、肺炎、重症肺炎、腹腔感染、皮下及軟組織感染、菌血症及各種臟器的感染； 該併發症包括急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、膿毒症以及有機體發炎因子升高； 較佳地，該其他抗菌藥物為可用於治療和預防金黃色葡萄球菌、例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的藥物（包括化學藥物、生物製劑和中藥），較佳為抗生素，例如β-內醯胺類抗生素，更佳為萬古黴素、去甲萬古黴素、替考拉寧、利奈唑胺、達托黴素、頭孢吡普、夫西地酸、頭孢洛林。
TW109132357A 2019-09-20 2020-09-18 抗α-溶血素的抗體及其應用 TW202126684A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910889697.5 2019-09-20
CN201910889697.5A CN112538112B (zh) 2019-09-20 2019-09-20 抗α-溶血素的抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202126684A true TW202126684A (zh) 2021-07-16

Family

ID=74883889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109132357A TW202126684A (zh) 2019-09-20 2020-09-18 抗α-溶血素的抗體及其應用

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220324949A1 (zh)
EP (1) EP4032904A4 (zh)
JP (1) JP2022548937A (zh)
CN (2) CN112538112B (zh)
AU (1) AU2020348817A1 (zh)
CA (1) CA3151773A1 (zh)
TW (1) TW202126684A (zh)
WO (1) WO2021052461A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021233408A1 (zh) * 2020-05-21 2021-11-25 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗α-溶血素的抗体及其稳定制剂
WO2023208123A1 (zh) * 2022-04-28 2023-11-02 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 特异性结合金黄色葡萄球菌Hla毒素的全人源单克隆抗体
CN116789814B (zh) * 2023-06-27 2024-03-29 重庆原伦生物科技有限公司 一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用
CN117771379A (zh) * 2023-10-25 2024-03-29 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 特异性结合金黄色葡萄球菌Hla毒素的全人源抗体与抗生素的组合
CN117126282B (zh) * 2023-10-26 2024-01-12 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗体及其在制备阻断αvβ8与Latent TGF-β的结合的药物中的应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200744632A (en) * 2006-06-12 2007-12-16 Nabi Biopharmaceuticals Use of alpha-toxin for treating and preventing staphylococcus infections
US8840906B2 (en) * 2007-08-31 2014-09-23 The University Of Chicago Methods and compositions related to immunizing against Staphylococcal lung disease and conditions
EP2284193A1 (en) 2009-08-10 2011-02-16 Kenta Biotech AG Human monoclonal antibody against S. aureus derived apha-toxin and its use in treating or preventing abscess formation
SG192212A1 (en) * 2011-02-08 2013-09-30 Medimmune Llc Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
US20140286960A1 (en) * 2011-07-28 2014-09-25 Cangene Corporation Staphlococcus aureus alpha-hemolysin antibodies
KR20150092738A (ko) * 2012-11-06 2015-08-13 메디뮨 엘엘씨 에스.아우레우스 연관 질병의 치료 방법
MX2015005477A (es) * 2012-11-06 2015-11-30 Medimmune Llc Anticuerpos contra determinantes de la superficie de s. aureus.
CN105367632B (zh) * 2015-11-13 2019-02-01 长春百克生物科技股份公司 两种金黄色葡萄球菌蛋白抗原及其制备和应用
TW202311284A (zh) * 2017-01-03 2023-03-16 美商再生元醫藥公司 抗金黃色葡萄球菌溶血素ａ毒素之人類抗體
CN109400704B (zh) * 2018-11-14 2020-07-21 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用
CN109705213B (zh) * 2018-12-04 2023-04-18 上海长征医院 抗金黄色葡萄球菌毒素抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN114729033B (zh) 2023-11-28
CN112538112B (zh) 2023-10-27
EP4032904A4 (en) 2024-01-24
CN114729033A (zh) 2022-07-08
EP4032904A1 (en) 2022-07-27
JP2022548937A (ja) 2022-11-22
WO2021052461A1 (zh) 2021-03-25
US20220324949A1 (en) 2022-10-13
CA3151773A1 (en) 2021-03-25
CN112538112A (zh) 2021-03-23
AU2020348817A1 (en) 2022-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11447543B2 (en) Antibodies to S. aureus surface determinants
CA2769394C (en) Human monoclonal antibody against s. aureus derived alpha-toxin and its use in treating or preventing abscess formation
WO2021052461A1 (zh) 抗α-溶血素的抗体及其应用
KR20100021577A (ko) 에스.아우레우스 ＯＲＦ0657ｎ을 표적화하는 항원 결합 단백질
JP2022512647A (ja) 抗黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）抗体の組み合わせ
US20150210775A1 (en) Antibody specific to staphylococcus aureus, therapeutic method and detection method using same
WO2021233408A1 (zh) 抗α-溶血素的抗体及其稳定制剂
BR112012002892A2 (pt) anticorpo monoclonal específico para a alfa-toxina de s. aureus, hibridoma, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo monoclonal, composição farmacêutica, uso de um anticorpo monoclonal e kit de teste para o diagnóstico de uma infecção de s. aureus