CN117126282B - 抗体及其在制备阻断αvβ8与Latent TGF-β的结合的药物中的应用 - Google Patents

抗体及其在制备阻断αvβ8与Latent TGF-β的结合的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉抗体及其在制备阻断αvβ8与Latent TGF‑β的结合的药物中的应用。本发明通过杂交瘤技术筛选获得了与阻断αvβ8与TGF‑β的结合的αvβ8抗体，该抗体的具有良好的亲和力和特异性，能够通过抑制TGFβ信号的转导，发挥抗肿瘤的作用。试验表明，该抗体与肿瘤细胞具有良好的结合性。

Description

抗体及其在制备阻断αvβ8与Latent TGF-β的结合的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及抗体及其在制备阻断αvβ8与LatentTGF-β的结合的药物中的应用。
背景技术
长期以来，转化生长因子β（TGF-β）一直被认为与早期胚胎发育和器官发生、免疫监督、组织修复和成人体内平衡密切相关。TGF-β在纤维化和癌症中的作用是复杂的，有时甚至是相互矛盾的，根据疾病的阶段表现出抑制或促进作用。在病理条件下，过度表达的TGF-β会导致上皮-间充质转化（EMT）、细胞外基质（ECM）沉积、癌相关成纤维细胞（CAF）形成，从而导致纤维化疾病和癌症。
TGF-β分泌后以无活性的复合体形式存在，整合素家族成员参与TGF-β的识别和激活，复合体中LAP 蛋白被切割然后将有活性的TGF-β释放。此外，整合素介导的TGF-β激活在免疫系统(整合素αvβ6和αvβ8)、肿瘤发生和成纤维细胞中至关重要。整合素αvβ6和αvβ8通过结合LAP 蛋白中的RGD肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，可识别整合素）调节TGF-β信号，依赖于肌动蛋白细胞骨架产生的张力。除了整合素αvβ6和αvβ8外，整合素α8β1、α5β1和αIIβ3也能识别TGF-β LAP区域的RGD位点。这种RGD识别机制调节TGF-β家族的活性，维持形态发生和稳态。
αvβ8全称 Integrin alpha-V beta-8 (ITGAV:ITGB8)，分子量为194KD，由ITGAV和ITGB8两个亚单位组成的异源二聚体，在胞内通过二硫键组装，表达在细胞膜上，是细胞表面重要的黏附分子和信号传导功能受体，现有文献证明αvβ8在多种肿瘤细胞中有表达，例如：αvβ8在人肺腺癌细胞COLO699，人卵巢癌细胞OVCAR3中高表达。
此前，Stephen L. Nishimura团队发文证明αvβ8肿瘤细胞中高表达，在TME中，肿瘤上的αvβ8与免疫细胞上的L-TGFB互作，促使CD4+T细胞向iTreg细胞分化，通过Treg的调控从而实现免疫逃逸。通过阻断αvβ8与latent TGF-β的结合，便能够起到治疗肿瘤的作用。目前针对αvβ8在研的抗体药物主要为阻断活性抗体，但目前αvβ8抗体特异性不足，无法实现很好的阻断效果。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抗体及其在制备阻断αvβ8与TGF-β的结合的药物中的应用。
本发明提供的αvβ8抗体，
其重链包含三个CDR区，其中至少一个CDR区的氨基酸序列具有如SEQ ID NO:1~3所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80%序列同源性的序列；
其轻链包含三个CDR区，其中至少一个CDR区的氨基酸序列具有如SEQ ID NO:4~6所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80%序列同源性的序列。
本发明中，所述与具有至少80%序列同源性的序列为在原序列的基础上，经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个。
一些实施例中，
所述αvβ8抗体的重链的CDR1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； CDR2具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列； CDR3具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
所述αvβ8抗体的轻链的CDR1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列； CDR2具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列； CDR3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
本发明所述的αvβ8抗体中，
其重链的4个FR区的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:7~10任一项所示的氨基酸序列；
其轻链的4个FR区的氨基酸序列分别具有如SEQ ID NO:11~14任一项所示的氨基酸序列。
一些实施例中，
所述αvβ8抗体的重链的FR1具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列； FR2具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列； FR3具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列; FR4具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
所述αvβ8抗体的轻链的FR1具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列； FR2具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列； FR3具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列; FR4具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
一些具体实施例中，其重链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示； CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示； CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。即，其重链的三个CDR区分别为：NYGIN、YIYIRTGYTEYNEKFQG、NYYGSRFFDY。
一些具体实施例中，其重链的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示； FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示； FR4的氨基酸序列如SEQID NO:10所示。即，其重链的四个FR区分别为：EVQLQQSGAELVRPGSSVKMSCKTSGYTFT、WVKQRPGQGLEWIG、KATLASDTSSS TGYMQLSSLTSEDSAIYFCAL、WGQGTTLTVSS。
更具体的，在一个具体实施例中，本发明所述的抗体的重链可变区具有如SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列。
一些实施例中，其轻链的CDR1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列； CDR2具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列； CDR3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
一些具体实施例中，其轻链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示； CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示； CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。即，其轻链的三个CDR区分别为：RASQNIINNLH、YASQSIS、QQSDSWPLT。
一些具体实施例中，其轻链的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示； FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示； FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。即，其轻链的四个FR区分别为：EIVLTQSPASLSVTPGDSVSLSC、WYQQKSHESPRLLFK、GIPSRFSGSASGTDFTLSINSV EPEDFGMYFC、FGAGTKLELK。
更具体的，在一个具体实施例中，本发明所述的抗体的轻链可变区具有如SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列。
作为优选，本发明所述的抗体为嵌合抗体，其重链恒定区为人IgG、人IgA、人IgD、人IgM或人IgE，其轻链的恒定区为κ型或λ型。一些实施例中，本发明所述抗体的重链的恒定区为人IgG1，轻链的恒定区为κ型。
本发明所述的抗体为阻断αvβ8与TGF-β的结合的抗体，其能够特异性的结合人整合素蛋白ITGAV/ITGB8，具有良好的亲和力和特异性的，能够抑制TGFβ信号的转导，从产生抗肿瘤的作用。
进一步的，本发明还提供了编码所述的αvβ8抗体的核苷酸。
具体的，
本发明提供了编码所述αvβ8抗体重链可变区的核酸。
本发明提供了编码所述αvβ8抗体轻链可变区的核酸。
本发明提供了编码所述αvβ8抗体重链的核酸，其包括编码重链可变区的核酸和编码人IgG1的核酸。
本发明提供了编码所述αvβ8抗体轻链的核酸，其包括编码轻链可变区的核酸和编码人κ链的恒定区的核酸。
更进一步的，本发明还提供了一种表达载体，其包括如前所述的核酸。
本发明中所述的表达载体适用于如前所述核酸的保存或扩增。一些实施例中所述表达载体包括骨架载体和如前所述的核酸。其中，所述骨架载体为pcDNA3.1、AbVec2.0-hIgG1、pComb3XTT、pComb3、pFUSE-hIgG4-Fc2、pComb3Xlambda、pEE12.4、pEE6.4、pCHO1.0、pComb3XSS、pFUSE-hIgG1e1-Fc2、pcDNA3.1-hIgG1-Fc2、pFUSE-hIgG1-Fc2、pFUSE-mIgG1-Fc2、pTT5_hIgG1.G1m3或pTT5_hKappa.Km3中的任一种或多种。
更进一步的，本发明还提供了基因组整合有如前所述的核酸的宿主细胞，或者转化或转染如前所述的表达载体的宿主细胞。
本发明所述的宿主细胞用于抗体的制备或如前所述核酸的保存或扩增。一些实施例中，所述宿主为真核生物或原核生物的细胞，例如，所述宿主为动物细胞（昆虫细胞或哺乳动物细胞）、真菌细胞（酵母菌细胞）或细菌细胞（大肠杆菌）。本发明实施例中，以HEK-293细胞为例进行抗体的制备。
更进一步的，本发明还提供了如前所述抗体的制备方法，包括：培养如前所述的细胞、诱导αvβ8抗体的表达。本发明所述的制备方法，还包括对诱导产物进行分离和纯化的步骤。
更进一步的，本发明还提供了如前所述的抗体、所述的核酸、所述的表达载体和/或所述的宿主细胞，在制备治疗癌症的药物中的应用。
本发明中，所述治疗包括阻断αvβ8与L-TGF-β结合。
本发明中，所述癌症为TGFβ信号通路相关的癌症，例如，所述癌症为肺腺癌、卵巢癌、膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌。
更进一步的，本发明还提供了治疗癌症的药物，由所述的抗体、所述的核酸、所述的表达载体和/或所述的宿主细胞制得。
更进一步的，本发明还提供了一种治疗癌症的药物组合物，其包括癌症的治疗剂和由所述的抗体、所述的核酸、所述的表达载体和/或所述的宿主细胞制得的药物。
所述癌症的治疗剂以注射剂为主，不仅限于注射剂，可以与免疫检查点类抗肿瘤药物联用如PD1,PDL1,CTLA4等；顺铂类，紫杉醇，皮质醇类等化药联用；亦可用放疗后治疗等。
本发明所述的药物中，还包括药学上可接受的辅料。
本发明所述的药物为口服制剂或注射剂。所述注射剂为注射用粉针剂或注射液剂。
更进一步的，本发明还提供了治疗TGFβ信号通路相关疾病的方法，其包括给予本发明所述的药物。本发明所述方法中，给予的方式包括注射或口服。
本发明通过杂交瘤技术筛选获得了与阻断αvβ8与TGF-β的结合的αvβ8抗体，该抗体的具有良好的亲和力和特异性，能够通过抑制TGFβ信号的转导，发挥抗肿瘤的作用。试验表明，该抗体与肿瘤细胞具有良好的结合性。
附图说明
图1示10只小鼠免疫血清分别与人αvβ8和鼠αvβ8过表达及CHO-K1 blank细胞的FACS结合；
图2示嵌合抗体与293-human-αvβ8过表达细胞的结合结果；
图3示嵌合抗体与293-mouse-αvβ8过表达细胞的结合结果；
图4示嵌合抗体与293-cyno-αvβ8过表达细胞的结合结果；
图5示嵌合抗体与293-human-αvβ6过表达细胞的结合结果；
图6示嵌合抗体ELISA水平的阻断结果；
图7示嵌合抗体FACS水平的阻断结果；
图8示嵌合抗体与Colo699细胞株的FACS 结合。
具体实施方式
本发明提供了抗体及其在制备阻断αvβ8与latent TGF-β的结合的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology（Ausubel）。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
“抗体”包括一种典型的“四链抗体”，其属于由两条重链（HC）和两条轻链（LC）组成的免疫球蛋白；重链是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域；轻链是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链；重链与重链之间、重链与轻链之间通过二硫键连接，形成“Y”字型结构。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文“免疫球蛋白”分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。 “载体”是指能够扩增与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及整合入已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman andCo.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。其中，重链可变区CDR可缩写为HCDR，轻链可变区CDR可缩写为LCDR。本术语“构架区”或“FR区”可互换，是指抗体重链可变区或轻链可变区中除CDR以外的那些氨基酸残基。通常典型的抗体可变区由4个FR区和3个CDR区按以下顺序组成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”可选自：CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自Fc或CH3结构域。
“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“药物组合物”是指以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
“治疗”是指外科手术或药物处理（surgical or therapeutic treatment），其目的是预防、减缓（减少）治疗对象中不希望的生理变化或病变，如癌症和肿瘤。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定（即，未恶化）、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解（无论是部分缓解或完全缓解），无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。本文术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
“治疗剂”表示能够起到治疗作用（例如治疗、预防、缓解或抑制任何疾病和/或病症）的任何物质或实体（entity），其包括但不限于：化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、热治疗剂（thermally therapeutic agent）等。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
实施例中涉及生物材料：
293 -αvβ8过表达细胞株，由HEK293细胞（购自ATCC）通过慢病对包装的方式构建的过表达细胞株；
CHO -αvβ8过表达细胞株，由CHO-K1细胞（购自ATCC）通过慢病毒包装技术构建过表达细胞株。
人αvβ8是二聚体，有两个序列登记号1）UniProtKB - P06756 (ITAV_HUMAN)；2）UniProtKB - P26012 (ITB8_HUMAN)；
猴αvβ8是二聚体，有两个序列登记号1）UniProtKB - A0A2K5WCD3 (A0A2K5WCD3_MACFA)；2）UniProtKB - G7P0S0 (G7P0S0_MACFA)；
鼠αvβ8是二聚体，有两个序列登记号1）UniProtKB - P43406 (ITAV_MOUSE)；2）UniProtKB - Q0VBD0 (ITB8_MOUSE)；
实施例还涉及αvβ6过表达细胞株，其构建方法与αvβ8过表达细胞株的构建一致。人αvβ6是二聚体，有两个序列登记号1）UniProtKB - P06756 (ITAV_HUMAN)；2）UniProtKB- P18564 (ITB6_HUMAN)。
ADWA11抗体可变区序列如下：
ADWA11-VH:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDQGNTIYEPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSS
ADWA11-VL:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLSHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLEYPFTFGGGTKVEIK
C6D4抗体可变区序列如下：
C6D4-VH:QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLEWVARINTETGEPTFADDFRGRFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAIFYYGRDTWGQGTTLTVSS
C6D4-VL:EIVMTQSPATLSVSPGERVTMSCKSSQSLLNSRSRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCKQSYNLLSFGQGTVLEIK
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一、动物免疫
用胞外段的重组人异源二聚体αvβ8蛋白（ITGAV:Phe31-Val992&ITGB8:Glu43-Arg684）免疫，共免疫3次，KO鼠（αvβ8 KO鼠(C57BL/6JGpt-Itgb8em2Cd1815/Gpt Cat:T011241)，购买自集萃药康）选择6-8周龄雌性小鼠5支（12056~12060），体重18-20g ，免疫前两天腹腔注射100ug CD25抗体，两天后每只老鼠用50ug 重组αvβ8蛋白（Human ITGAV/ITGB8，Acro，Cat# IT8-H52W4）与弗氏完全佐剂（CFA）混合物通过腹腔注射进行初次免疫；14天后进行第2针免疫，第2次免疫前7天腹腔注射100ug CD40抗体， 2次免疫方法用25ug重组αvβ8蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）混合物进行免疫；第3次免疫间隔21天，用25ug 重组αvβ8蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）混合物进行免疫；从第二次免疫开始，免疫后1周进行眼眶取血，获得的血清进行抗原特异性滴度检测。
用293-human-αvβ8过表达细胞株免疫，共免疫3次，KO鼠选择6-8周龄雌性5支（12061~12065），体重18-20g ，免疫前两天腹腔注射100ug CD25抗体，两天后每只老鼠用5E6细胞通过腹腔注射进行初次免疫； 14天后进行第2针免疫，第2次免疫前7天腹腔注射100ug CD40抗体， 2次免疫方法同第一次免疫方法一样；第3次免疫间隔21天，同第一次免疫方式一样；从第二次免疫开始，免疫后1周进行眼眶取血，获得的血清进行抗原特异性滴度检测。
（一）血清滴度抗原结合检测
用CHO-human-αvβ8，CHO-mouse-αvβ8过表达细胞进行血清FACS结合试验，CHO-K1作为Blank 细胞。具体地，取对数生长的细胞株，离心并丢弃培养上清，将离心下来的细胞用1xDPBS洗三次，以2E5/孔铺96孔板，小鼠血清用DPBS稀释，稀释倍数1:100，其中TB3为三免后的血清，PB为免疫前的血清，稀释后的与细胞4℃孵育2h后，1500rpm/min 离心5min，弃上清，PBS洗1遍，加入1:1000稀释的二抗APC-anti-mouse Fc，4℃孵育30 min后离心弃上清，PBS清洗2次后，每孔加入30ul PBS充分混匀后，IQue Screener PLUS上机检测样品。
图1所示：10只小鼠免疫血清分别与人αvβ8和鼠αvβ8过表达及CHO-K1 blank细胞的FACS结合；结果显示，经过3次人αvβ8蛋白、过表达细胞免疫后，小鼠血清对两种过表达细胞均有特异性结合。
二、杂交瘤抗体的产生
（一）杂交瘤上清的初步筛选
1）杂交瘤上清的初步结合筛选
根据以上血清滴度的检测结果，选择编号为#12057、#12058、#12059、#12062、#12063的五只Balb/c小鼠进行加强免疫后取脾脏和淋巴结，研磨后将获得的PBMC细胞与鼠骨髓瘤细胞(SP20)进行电融合，经HAT培养基培养10天后进行杂交瘤上清的筛选。首先用ELISA方法进行人αvβ8蛋白，鼠αvβ8蛋白(正筛)和人αvβ6蛋白（负筛）的结合筛选，试验方法：人αvβ8与αvβ6蛋白进行96孔板包被，1ug/ml，100ul/孔，4℃过夜孵育，洗涤并封闭后加入杂交瘤上清50ul孵育2h后进行结合检测。然后FACS检测复测结合水平，最终筛选到13个特异性结合人αvβ8，不结合人αvβ6的多克隆，13个克隆均与人猴鼠αvβ8有交叉结合反应。
2）杂交瘤上清的初步阻断筛选
将选出来的13个克隆进行阻断试验的评估。具体方法，将重组人αvβ8蛋白包被在96孔板中，1ug/ml，100ul/孔，4℃孵育过夜。洗涤封闭后，每孔加入50ul杂交瘤上清和50ul终浓度为0.25ug/ml 的重组人生物素化的Latent TGFβ1蛋白混合物并在37度孵育2小时。洗涤后加入1:5000稀释的山羊抗鼠IgG Fcγ片段特异性HRP抗体，孵育后洗涤，每孔加入100ul TMB底物显色，并用等体积的1N HCl终止反应，读取OD450nm吸光值。抑制率(%)=(OD450Max-OD450Sample)/ (OD450Max-OD450Mini)*100。最终筛选到13个抑制率大于40%的克隆。
表1：杂交瘤上清初筛汇总表
（二）杂交瘤上清的亚克隆筛选
根据杂交瘤上清的初步ELISA结合和阻断试验筛选，选择13个多克隆进行亚克隆，再通过单克隆FACS结合及ELISA阻断活性验证，确定13个候选分子并进行序列调取，其中1个抗体的可变区序列如表2。
表2 抗体的可变区序列
三、人鼠嵌合抗体的生产和鉴定
（一）候选克隆基因的提取
1）杂交瘤细胞中总RNA的提取和cDNA合成
将单克隆杂交瘤细胞培养至对数生长期后，收集细胞(约5E6个细胞/克隆)，利用NucleoSpin® RNA Plus (MN，Cat# 740984.250)提取杂交瘤细胞中的总RNA。使用1ug提取的RNA，通过HiScript® III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme，Cat#R323-01)进行cDNA的合成。
2)抗体VH和VL序列的基因扩增和T载体克隆
以合成的cDNA为模板，利用兼并引物Primer A +S mix (含重轻链通用引物primer A和鼠hIgG1，2a，2b，3恒定区引物及鼠kappa特异性引物)和Ex Taq酶(TaKaRa，Cat# RR902A)对cDNA进行特异性扩增，PCR反应体系及循环如下。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up(MN， Cat# 740609.250)回收目的片段。
然后利用Solution I (TaKaRa，Cat# 6022Q)将回收片段克隆到pMD19-T(TaKaRa，Cat# 3271)载体上，将克隆好的质粒通过热刺激的方法转化进感受态细胞DH5α(Yestern，Cat# FYE607-80VL)并将其均匀涂布在含氨苄的2YT固体平板上，将平板送至测序公司Genewiz进行测序，测序引物为通用引物PMAL-C2X-R。
(二）候选克隆人鼠嵌合表达载体的构建、表达和纯化
1）表达载体的构建
分析抗体VH和VL测序序列，选择抗体测序正确的TA克隆质粒，使用抗体VH/VL通用引物mix（含表达载体信号肽），在高保真酶PrimeSTAR (TaKaRa，Cat# R045)和引物作用下扩增目的片段（PCR程序如下），电泳后利用胶回收试剂盒（MN，Cat# 740609.250）回收目的片段。反应体系如下：
回收片段在重组酶（Vazyme，Cat# C112-02）作用下插入到相应线性化载体（pTT5_hIgG1.G1m3/ pTT5_hKappa.Km3）；将重组后的载体转化进感受态细胞DH5α中（Yestern，Cat# FYE607-80VL）并将其均匀涂布在含氨苄的2YT固体平板上，将平板送至测序公司Genewiz进行测序，测序引物为pTT5-F。
2）嵌合抗体的表达和纯化
分析测序序列，扩增以上测序正确的质粒并将重轻链质粒以2:3的比例用PEI试剂（Polysciences， Cat#24885） (1ug质粒：4ug PEI) 转染至密度为2E6/ml的HEK293细胞中，将转染的细胞放置37度，5%CO2轨道培养箱中培养5-7天。 将培养液5000rpm离心20min，取上清并用0.22um滤器过滤，用rProtein A琼脂糖填料的纯化柱（GE Healthcare Bio-sciences，17127903）进行纯化。首先用1xPBS（pH7.4）平衡纯化柱，将过滤的培养上清上样到纯化柱，再用1xPBS（pH7.4）洗涤纯化柱后，用洗脱溶液（100mM Gly-HCl pH2.2）将样品洗脱下来，并用1M Tris-HCl，pH 9.0溶液中和洗脱样品。将中和后的样品用1xPBS（pH7.4）置换，用0.22um滤器过滤除菌，并用Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc)测定纯化抗体的浓度，备用。
（三）人鼠嵌合抗体的特异性结合鉴定
抗人αvβ8嵌合抗体与人αvβ8特异性结合以及与鼠，猴αvβ8交叉结合活性的评估
用过表达293-Human-αvβ8，293-Cyno-αvβ8，293-Mouse-αvβ8，293-Human-αvβ6进行抗体的FACS结合实验，其中293-Humanαvβ6作为Blank细胞。具体地，取对数生长的293过表达细胞株，离心并丢弃培养上清，将离心下来的细胞用1xDPBS洗三次，以2E5/孔铺96孔板，嵌合抗体用DPBS稀释，工作浓度30ug/mL,3倍稀释，共12个梯度，嵌合抗体与细胞4℃孵育2h后，1500rpm/min 离心5min，弃上清，PBS洗1遍，加入1:1000稀释的二抗（AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific，#jackson Cat No:109-006-098），4℃孵育30 min后离心弃上清，PBS清洗2次后，每孔加入30ul PBS充分混匀后，IQue Screener PLUS上机检测样品。
结果分析，图2结果：所有嵌合抗体均与293-human-αvβ8 过表达细胞有结合；图3-4结果：三个嵌合抗体均有猴鼠交叉结合活性；图5结果： 140D4C2与human-αvβ6有微弱的结合（图中136A11F8和140A2C5示另外两株抗体的活性，作为对照）。
（四）人鼠嵌合抗体的阻断鉴定
1）嵌合抗体ELISA阻断活性分析
用ELISA方法评估嵌合抗体对human-αvβ8蛋白与Biotinylated-human-L-TGFβ1（AcroBiosystems,Cat# LAP-H82Q6）蛋白结合的阻断作用，具体地，将重组人αvβ8蛋白包被在96孔板中，浓度为1ug/ml，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用2%BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育2小时；孵育后用1xPBST洗三次，嵌合抗体以200nM浓度起始，2倍稀释8个梯度，然后每孔加入50ul梯度稀释的抗体和50ul终浓度0.25 ug/ml 重组Biotinylated-human-L-TGFβ1蛋白混合物，并在37度孵育1小时。孵育并洗涤后，加入1:5000稀释的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性HRP抗体（JacksonImmunoResearch，Cat#109-035-098），37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1N HCl终止反应，结果用Spectra M5e仪器检测OD450nm吸光值。结果显示 140D4C2的阻断活性与阳性对照抗体ADWA11相当（图6）。
2）嵌合抗体FACS阻断活性分析
用FACS方法评估嵌合抗体对293-human-αvβ8过表达细胞株和人Biotinylated-human-L-TGFβ1（AcroBiosystems,Cat# LAP-H82Q6）蛋白结合的阻断作用。具体地，将293-human-αvβ8细胞以每孔2E5/孔铺96孔板，嵌合抗体用DPBS稀释，工作浓度30ug/mL,3倍稀释，共12个梯度，ADWA11作为阳性对照抗体，嵌合抗体与细胞4℃孵育30min后，每孔加入等体积的0.5ug/mL Biotinylated-L-TGFβ蛋白即工作浓度为0.25ug/mL，设置一个PBS孔作为背景扣减，混匀后4℃孵育90min。11500rpm/min 离心5min，弃上清，PBS洗1遍，加入1:1000稀释的二抗Allophycocyanin (APC) Streptavidin（Jackson，Cat#016-130-084），4℃孵育30 min后离心弃上清，PBS清洗2次后，每孔加入30ul PBS充分混匀后，IQue Screener PLUS上机检测样品 。
结果分析：当配体Biotinylated-Latent-TGFβ工作浓度为0.25 ug/mL时， 140D4-C2具有较强的阻断活性（图7）。
（五）嵌合抗体与抗原亲和力检测
OCTET检测嵌合抗体与αvβ8蛋白之间的亲和力。具体的，配制running buffer:0.1%BSA，0.05%Tween20的PBS溶液，嵌合抗体用running buffer稀释至浓度为10ug/mL, 人αvβ8蛋白以100nM起始2倍稀释8个梯度。选择AHC传感器Load 嵌合抗体，人αvβ8蛋白作为分析物，样品结合时间为150s,解离时间300s。实验结果如下。
表3：亲和力检测汇总
Loading Sample ID Sample ID KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
140D4C2 Human-αvβ8 1.38E-08 1.85E+05 2.55E-03
（六）嵌合抗体与人肺腺癌细胞株Colo699流式结合能力评估
用过Colo699肿瘤细胞株进行抗体的FACS结合实验。具体地，取对数生长的Colo699细胞株，离心并丢弃培养上清，将离心下来的细胞用1xDPBS洗三次，以2E5/孔铺96孔板，嵌合抗体用DPBS稀释，工作浓度30ug/mL,3倍稀释，共12个梯度，ADWA11作为阳性对照抗体，嵌合抗体与细胞4℃孵育2h后，1500rpm/min 离心5min，弃上清，PBS洗1遍，加入1:1000稀释的二抗（AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ FragmentSpecific，#jackson Cat No:109-006-098），4℃孵育30 min后离心弃上清，PBS清洗2次后，每孔加入30ul PBS充分混匀后，IQue Screener PLUS上机检测样品。结果显示，嵌合抗体140D4-C2与Colo699细胞株能够良好的结合（图8）。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.αvβ8抗体，其特征在于，
其重链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
其轻链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的αvβ8抗体，其特征在于，
其重链的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示； FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示； FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
其轻链的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示； FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示； FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
3.根据权利要求1或2所述的αvβ8抗体，其特征在于，
其重链可变区具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
其轻链可变区具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的αvβ8抗体，其特征在于，其为嵌合抗体，其重链的恒定区为人IgG1，轻链的恒定区为κ型。
5.编码权利要求1~4任一项所述的αvβ8抗体的核酸。
6.一种表达载体，包括编码权利要求1~4任一项所述的αvβ8抗体的核酸。
7.基因组整合有权利要求5所述的核酸的宿主细胞，或者转化或转染权利要求6所述的表达载体的宿主细胞。
8.权利要求1~4任一项所述的αvβ8抗体的制备方法，包括：培养权利要求7所述的宿主细胞、诱导αvβ8抗体的表达。
9.权利要求1~4任一项所述的抗体、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的宿主细胞，在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。
10.治疗癌症的药物，其由权利要求1~4任一项所述的抗体、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的宿主细胞制得。
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