CN114591431B - 抗人gas6抗体或其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗人GAS6抗体、抗原结合片段，及其应用。

Description

抗人GAS6抗体或其抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地，涉及抗人GAS6抗体或其抗原结合片段及其应用，更具体地，涉及抗人GAS6抗体或其抗原结合片段、编码该抗体的核酸，表达该抗体的载体和细胞，制备该抗体的方法，含有该抗体的药物组合物、以及该抗体在制备药物中的用途。
背景技术
生长停滞特异性蛋白6（Growth arrest-specific gene 6，GAS6）是一个75kDa的可溶性糖蛋白，该蛋白由3个结构域组成，包括一个γ-羧基化的N端Gla结构域（γ-carboxylated glutamic acid domain），一个类生长因子结构域（EGF-like domain）——含4个EGF重复基序和C端一个类性激素结合球蛋白结构域 (SHBG-like domain)，后者包括两个层粘连蛋白（Laminin G，LG domain）。其中GAS6 N端GLA结构域的γ-羧基化对于受体的完全激活是必需的。GAS6广泛表达于各种组织，主要表达在肺，小肠，骨髓和内皮。
GAS6下游受体被称为TAM受体 (TYRO3、AXL和MERTK)，属于受体酪氨酸激酶家族，GAS6通过其C端SHBG结构域的LG domain结合受体。GAS6与TAM受体作用参与多种生物过程，其与受体结合后，激活受体酪氨酸激酶活性，通过下游信号转导途径，包括PI3K、ERK及NF-kB等信号通路，在细胞增殖、存活、黏附、迁移、自噬、侵袭、血管生成、血小板聚集和NK细胞分化等方面发挥重要作用。在许多恶性肿瘤中，AXL与其配体GAS6都有高表达和活化，如急性髓系白血病、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及卵巢癌等。并且，GAS6-AXL信号通路在促进肿瘤生长及转移、肿瘤免疫逃逸与药物耐受中起关键作用，二者的表达水平及相互作用与患者的临床不良预后紧密相关。
癌症是目前造成人类死亡率最高的疾病之一。抗癌抗体的最新临床和商业成功引起了对基于抗体的疗法的极大兴趣。由此，治疗癌症的抗癌抗体有待进一步研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出抗人GAS6抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用。
研究发现，GAS6-AXL信号通路在促进肿瘤生长及转移、肿瘤免疫逃逸与药物耐受中起关键作用，二者的表达水平及相互作用与患者的临床不良预后紧密相关。同时在GAS6异位和原位同源小鼠肿瘤模型研究中，与野生型小鼠相比，GAS6缺陷小鼠的肿瘤生长及转移扩散均受到阻碍。因此阻断该通路已被认为是治疗癌症的有效策略。
目前有多家制药公司及科研机构在进行针对GAS6-AXL通路的研究，主要包括小分子抑制剂、拮抗性治疗抗体的开发和AXL可溶性胞外受体（AXL decoy receptor，诱饵受体）的开发，通过阻断GAS6-AXL信号抑制肿瘤的生长、增殖等。如Amgen公司开发了针对GAS6的中和抗体，GMAB1和GMAB2，抗体通过阻断GAS6-AXL信号通路来抑制胰腺导管癌（pancreaticductal adenocarcinoma，PDAC）肿瘤的生长。Kyowa Kirin公司同样也开发了抗GAS6的单克隆抗体。经Aravive Biologics工程改造的Batiraxcept (AVB-500)（AXL诱饵受体）通过高亲和力的结合GAS6, 螯合胞质中GAS6，特异性的阻断肿瘤细胞AXL的信号，从而有效的抑制肿瘤的转移和疾病的进展。该药目前主要用于铂类耐药的复发上皮卵巢癌、透明细胞肾癌等适应症，该诱饵受体可以改善化疗药物在卵巢癌和子宫浆液性癌中的敏感性，并且目前已启动铂类耐药的复发上皮卵巢癌的3期招募(NCT04729608)。以上均表明抑制GAS6对肿瘤治疗发挥积极的疗效。抗GAS6抗体在肿瘤治疗领域具有广泛的临床应用价值。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种抗人GAS6抗体或其抗原结合片段。据本发明的实施例，该抗人GAS6抗体或其抗原结合片段包括：
重链可变区，所述重链可变区（VH）包含抗原决定区（CDRs）1、2和3，且VH CDRs 1、2和3分别包括所选VH CDRs1、2和3所示的氨基酸序列；
轻链可变区，所述轻链可变区（VL）包含抗原VL CDRs1、2和3，且 VL CDRs 1、2和3分别包括所选VH CDRs1、2和3所示的氨基酸序列；
其中，所述所选VH CDRs1、2和3的氨基酸序列以及所述所选VL CDRs1、2和3的氨基酸序列选自下列之一：
（1）所述所选VH CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5、6和7所示，所述所选VL CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8、9和10所示；
（2）所述所选VH CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：11、12和13所示，所述所选VL CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：14、15和16所示；
（3）所述所选VH CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：49、50和51所示，所述所选VL CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：52、53和54所示；
（4）所述所选VH CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：57、58和59所示，所述所选VL CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如60、61和62所示；
（5）所述所选VH CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：63、64和65所示，所述所选VL CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如66、67和68所示。
根据本发明实施例的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段能特异性结合人GAS6和鼠GAS6蛋白，进而可以抑制GAS6-AXL信号传导途径，并能抑制细胞增殖，从而抑制肿瘤的进展、转移和耐药性。
根据本发明的实施例，所述VH包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VH包括SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是特异性结合人GAS6的抗体片段，且选自Fv、Fab、Fab'、scFv和F(ab')2。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，该载体包括前述的核酸。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的细胞。根据本发明的实施例，该细胞包括前述的载体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
（1）在合适的条件下，培养权利要求9所述的细胞；以及
（2）分离回收前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包括：前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段；以及药学上可接受的载体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物。根据本发明的实施例，该抗体-药物缀合物包含与治疗剂共价结合的、前述的抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的实施例，所述治疗剂为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)或一甲基澳瑞他汀F（MMAF）。
根据本发明的另一方面，本发明提供了前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、神经内分泌肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、头颈部癌及慢性和急性髓系白血病。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的免疫鼠血清与GAS6蛋白的结合结果示意图，其中，A为免疫鼠血清与人GAS6蛋白的ELISA结合结果；B为免疫鼠血清与鼠GAS6蛋白的ELISA结合结果；
图2显示了根据本发明一个实施例的鼠血清对GAS6-AXL结合的阻断结果示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体与人GAS6 his蛋白的结合的结果示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体与鼠GAS6 His蛋白的结合结果；
图5显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体与人Protein S His蛋白的结合结果；
图6显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体对Ba/F3-AXL细胞增殖抑制的评估结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
抗人GAS6抗体和其抗原结合片段
本发明提供了特异性结合GAS6的抗体及其抗原结合片段。根据本发明实施例的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段能特异性结合人GAS6和鼠GAS6蛋白，进而可以抑制GAS6-AXL信号传导途径，并能抑制细胞增殖，从而抑制肿瘤的进展、转移和耐药性。
本发明实施例提供了几种抗GAS6抗体，例如ch2D3C6和ch2O18G6，包括例如小鼠抗体、及其嵌合抗体。一些公开的抗体的CDR序列（Kabat定义）和重链可变区和轻链可变区的序列在下表中所示。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE002
本发明实施例还提供了嵌合抗体。这些嵌合抗体具有来自小鼠抗体的VH和VL。然而，这些嵌合抗体的恒定结构域来自人抗体（例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3、或人IgG4）。这些嵌合抗体被标记为chHvLv-IgG。本公开描述的一些嵌合抗体在下表中所示。
表2
类型 抗体名称 VH SEQ ID NO: VL SEQ ID NO: 恒定区
基于ch2D3C6的嵌合抗体 ch2D3C6-IgG 1 2 人IgG（例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4）
基于ch 2O18G的嵌合抗体 ch2O18G6-IgG 3 4 人IgG（例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4）
基于ch11B11D12的嵌合抗体 ch11B11D12-IgG 23 24 人IgG（例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4）
基于ch15G5E5的嵌合抗体 ch15G5E5-IgG 27 28 人IgG（例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4）
基于ch18I16C6的嵌合抗体 ch18I16C6-IgG 29 30 人IgG（例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4）
在一些实施方案中，抗体可以具有重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），所述重链可变区包含互补决定区（CDR）1、2、3，其中CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成；所述轻链可变区包含CDR 1、2、3，其中CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与选定的VLCDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以含有轻链可变区，所述轻链可变区含有选自以下的CDR中的一个、两个或三个：在选定的CDR的一个、两个、或三个上具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 5-7、SEQ ID NO: 8-10、SEQ ID NO: 11-13或SEQ ID NO:14-16、SEQ ID NO:49-51、SEQ ID NO:52-54、SEQ ID NO:57-59、SEQ ID NO:60-62、SEQ ID NO:63-65或SEQ ID NO:66-68。例如，本文所述的抗体或抗原结合片段可以含有轻链可变结构域，所述轻链可变区含有以下的CDR中的一个、两个或三个：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 5；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 6；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 7。
本发明实施例还提供了结合GAS6的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3。在一些实施方案中，基于本领域已知的各种CDR定义，例如Kabat定义、Chothia定义、或IMGT定义来确定VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3的序列。VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3的序列由表1和表2所示。
核酸、载体和细胞
本发明实施例还提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含如在表1和表2中所示的CDR，或具有如表1和表2中所示的序列。当多肽与相应的多肽（例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区）配对时，所述配对的多肽结合GAS6（例如，人GAS6）。
本发明实施例还提供了包括本文公开的分离的多核苷酸（例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸）的重组载体（例如表达载体）、引入了重组载体的宿主细胞（即，使得所述宿主细胞含有多核苷酸和/或含多核苷酸的载体）、以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。
如本文所用，“载体”是当载体被引入宿主细胞时能够将一个或多个目标多核苷酸递送至所述宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个目标多核苷酸作为编码的多肽。因此，在表达载体中，目标多核苷酸通过与调控元件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位于载体中表达，所述调控元件位于载体内或宿主细胞的基因组中的目标多核苷酸的整合位点处或所述整合位点附近或所述整合位点两侧，使得目标多核苷酸将在引入了所述表达载体的宿主细胞中得以翻译。
可以通过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染（例如DEAE-葡聚糖）、转化、转染以及感染和/或转导（例如用重组病毒）将载体引入到宿主细胞中。因此，载体的非限制性实施例包括病毒载体（可用于产生重组病毒）、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体。
本发明实施例提供了用上文描述的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的原核宿主细胞是大肠杆菌（Escherichia coli）。优选地，真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS细胞。优选的真菌细胞是酿酒酵母。
制备抗GAS6抗体的方法
可以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，将人GAS6的分离片段用作免疫原以产生抗体。可以通过多次注射（例如皮下或腹腔注射）抗原肽或蛋白质而在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，将抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，可以将抗原肽或蛋白质与待免疫物种中具有免疫原性的药剂缀合。可以多次向动物注射抗原肽或蛋白质。
免疫原通常用于通过免疫合适的受试者（例如表达至少一个人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物）来制备抗体。合适的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的多肽或化学合成的多肽（例如人GAS6的片段）。制剂可以进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。
药物组合物和用途及治疗方法
本发明实施例还提供了含有本发明实施例所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种（例如，一种、两种、三种或四种）的药物组合物。本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种（例如，两种、三种或四种）可以以任何组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。
药物组合物还可以含有药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或效力。
在一个方面，本发明提供了前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。根据本发明的实施例，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、神经内分泌肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、头颈部癌及慢性和急性髓系白血病。
本发明提供了一种或多种抗体或其抗原结合片段可以用于多种治疗目的。在一个方面，本公开提供了用于治疗受试者癌症的方法、降低受试者肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或降低受试者发生另外转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致受试者癌症的一个或多个症状的数量、严重程度和/或持续时间减少。
在一个方面，本公开的特征在于如下方法，所述方法包括向有需要的受试者（例如，患有、或鉴定为患有或诊断为患有癌症的受试者）施用治疗有效剂量的本文公开的抗体或其抗原结合片段，所述癌症是例如乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、神经内分泌肿瘤、胰腺癌、膀胱癌和头颈部癌。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗有癌症风险的患者。可以用本领域已知的多种方法来鉴定患有癌症的患者。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1 动物免疫
用重组人GAS6 hFc蛋白免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠，5只一组，具体的，每只老鼠用20ug重组GAS6蛋白（Human GAS6 C-Fc，Novoprotein，Cat#C12W）与弗氏完全佐剂（CFA）混合物通过皮下注射进行初次免疫，共进行5次免疫，其中接下来的四次免疫方法均是用20ug重组GAS6蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）混合物进行免疫，后面的4次免疫每次免疫间隔3周；而且最后两次免疫是用重组鼠GAS his蛋白(Sino Biological， Cat#58026-M08H) 20ug进行。从第二次免疫开始，免疫后1周进行眼眶取血，获得的血清进行抗原特异性滴度检测和GAS6-AXL结合阻断检测。
（1）血清滴度抗原结合检测
用重组人GAS6 his 蛋白（Novoprotein，Cat#C01W）和鼠GAS6 his蛋白(SinoBiological，Cat#58026-M08H)进行血清的ELISA结合试验。具体地，将1ug/ml 人GAS6 his蛋白和1ug/ml鼠GAS6 his蛋白分别包被在96孔板中，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用1%BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育1小时；孵育后用1xPBST洗三次，加入梯度稀释的血清并在37度孵育1小时；孵育后并洗涤后，加入1:5000稀释的山羊抗鼠IgG Fcγ片段特异性HRP抗体（Jackson ImmunoResearch，115-005-008），37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1NHCl终止反应，用Spectra M5e仪器检测OD450nm读值。
结果如图1所述，经过5次人GAS6蛋白和鼠GAS6蛋白免疫后，小鼠血清对两种抗原均有不同程度的特异性结合，其中编号为#4的小鼠血清对两种抗原的应答均较强。
（2）血清滴度配体受体结合阻断检测
用ELISA方法评估鼠血清对人GAS6蛋白和人AXL蛋白结合的阻断作用。具体地，将重组人AXL his 蛋白（AcroBiosystems，Cat#AXL-H5226）包被在96孔板中，1ug/ml，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用1%BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育1小时；孵育后用1xPBST洗三次，每孔加入50ul梯度稀释的血清和50ul终浓度为150ng/ml 重组人GAS6 hFc蛋白（Novoprotein，Cat#C12W）混合物并在37度孵育1小时；使用终浓度为20ug/ml的商业化GAS6中和抗体（R&D Systems，AB885）作为阳性对照(PC)和终浓度20ug/ml的Goat IgG（R&D Systems，AB-108-C）作为阴性对照(NC)。孵育并洗涤后，加入1:5000稀释的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性HRP抗体（Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-098），37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1N HCl终止反应，结果用Spectra M5e仪器检测OD450nm读值。在该系统中，只加GAS6 hFc蛋白并与HRP抗体孵育后的孔吸光值最大（Max），只加1%BSA的孔吸光值最小（Mini）。比Max低的孔对应血清稀释度含有抑制人GAS6和人AXL结合的抗体，抑制率(%)=(OD450Max-OD450Sample)/ (OD450Max-OD450Mini)*100。
ELISA结果如图2显示，在低稀释梯度下（第三个稀释度，1:360），小鼠血清对人GAS6 hFc和人AXL his蛋白的结合有60%以上的抑制率，其中编号为#4的小鼠血清的抑制效果较好。
实施例2 杂交瘤细胞的筛选和鉴定
(一)杂交瘤上清的初步筛选
1)杂交瘤上清的初步结合筛选
根据实施例1的血清滴度的检测结果，选择编号为#4和#5的两只小鼠进行加强免疫后取脾脏和淋巴结，研磨后将获得的细胞与鼠骨髓瘤细胞进行电融合，经HAT培养基和HT培养基培养10-14天后进行杂交瘤上清的筛选。首先用ELISA方法进行人GAS6 his蛋白和鼠GAS6 his蛋白的结合筛选，试验方法与血清滴度ELISA检测方法类似，将人GAS6 his蛋白和鼠GAS6 his蛋进行384孔板包被，1ug/ml，40ul/孔，进行过夜孵育，洗涤并封闭后加入杂交瘤上清30ul孵育后进行结合检测。最终筛选到372个克隆进行下一步阻断试验的筛选，其中有239个克隆与人鼠GAS6蛋白均有较强的结合；79个克隆与人GAS6结合较强，与鼠GAS6蛋白结合较弱；54个克隆与人GAS6有强结合，与鼠GAS6没有结合。
2)杂交瘤上清的初步阻断筛选
将ELISA结合试验选出来的372个克隆进行阻断试验的评估。具体方法与血清滴度阻断检测方法类似，将重组人AXL his 蛋白包被在96孔板中，1ug/ml，100ul/孔，孵育过夜。洗涤封闭后，每孔加入50ul杂交瘤上清和50ul 终浓度为150ng/ml 的重组人GAS6 hFc蛋白混合物并在37度孵育1小时。其中50ul杂交瘤培养基与50ul 终浓度为150ng/ml 的重组人GAS6 hFc蛋白混合物作为信号最大值（Max），只加杂交瘤培养基的孔吸光值为最小值（Mini）。洗涤后加入1:5000稀释的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性HRP抗体（Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-098），孵育后洗涤，每孔加入100ul TMB底物显色，并用等体积的1NHCl终止反应，读取OD450nm吸光值。在该系统中，吸光值比Max低的孔对应的杂交瘤上清含有抑制人GAS6和人AXL结合的抗体，抑制率(%)=(OD450Max-OD450Sample)/ (OD450Max-OD450Mini)*100。最终筛选到71个抑制率大于45%的克隆。
(二)杂交瘤上清的亚克隆筛选
根据杂交瘤上清的初步ELISA结合和阻断试验筛选，选择了53个克隆进行亚克隆，其中36个克隆与人GAS6和鼠GAS6结合均较强，配体受体结合抑制率大于50%；8个克隆与人GAS6结合较强，与鼠GAS6结合较弱，配体受体结合抑制率大于60%；9个克隆与人GAS6和鼠GAS6结合均较强，配体受体结合抑制率大于45%小于50%。亚克隆的上清经过人GAS6和鼠GAS6蛋白ELISA结合试验及配体受体结合阻断试验（方法同初步筛选使用方法），最终挑选到11个与人GAS6和鼠GAS6蛋白均有较强结合，配体受体结合抑制率大于40%的候选克隆。
实施例3 人鼠嵌合抗体的生产和鉴定
（一）候选克隆基因的提取
1)杂交瘤细胞中总RNA的提取和cDNA合成
将单克隆杂交瘤细胞培养至对数生长期后，收集细胞(约1E6个细胞/克隆)，利用NucleoSpin® RNA Plus (MN，Cat# 740984.250)提取杂交瘤细胞中的总RNA。使用1ug提取的RNA，通过HiScript® III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme，Cat# R323-01)进行cDNA的合成。
2)抗体VH和VL序列的基因扩增和T载体克隆
以合成的cDNA为模板，利用引物Primer A +S mix (含重轻链通用引物primer A和人hIgG1，2a，2b，3恒定区引物及人kappa特异性引物)和Ex Taq酶(TaKaRa， Cat#RR902A)对cDNA进行特异性扩增，PCR反应体系及循环如下。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up(MN， Cat# 740609.250)回收目的片段。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
然后利用Solution I (TaKaRa，Cat# 6022Q)将回收片段克隆到pMD19-T(TaKaRa，Cat# 3271)载体上，将克隆好的质粒通过热刺激的方法转化进感受态细胞DH5α(Yestern，Cat# FYE607-80VL)并将其均匀涂布在含氨苄的2YT固体平板上，将平板送至测序公司Genewiz进行测序，测序引物为通用引物PMAL-C2X-R（SEQ ID NO：70）。
（二）候选克隆人鼠嵌合表达载体的构建、表达和纯化
1）表达载体的构建
分析抗体VH和VL测序序列，选择抗体测序正确的TA克隆质粒，使用抗体VH/VL通用引物mix（含表达载体信号肽），在高保真酶PrimeSTAR (TaKaRa，Cat# R045)和引物作用下扩增目的片段（PCR程序如下），电泳后利用胶回收试剂盒（MN，Cat# 740609.250）回收目的片段。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
回收片段在重组酶（Vazyme，Cat# C112-02）作用下插入到相应线性化载体（pTT5_hIgG1.G1m3/ pTT5_hKappa.Km3），其中，pTT5_hIgG1.G1m3载体含有hIgG1 Fc序列（SEQ IDNO:69），pTT5_hKappa.Km3载体含有hKappa序列（SEQ ID NO:74）；将重组后的载体转化进感受态细胞DH5α中（Yestern，Cat# FYE607-80VL）并将其均匀涂布在含氨苄的2YT固体平板上，将平板送至测序公司Genewiz进行测序，测序引物为pTT5-F(SEQ ID NO:71) 和pTT5-R(SEQ ID NO:72)。
2）嵌合抗体的表达和纯化
分析测序序列，扩增以上测序正确的质粒并将重轻链质粒以2:3的比例用PEI试剂（Polysciences， Cat#24885） (1ug质粒：4ug PEI) 转染至密度为2E6/ml的HEK293细胞中，将转染的细胞放置37度，5%CO2轨道培养箱中培养5-7天。 将培养上清离心并用0.22um滤器过滤，用Protein G琼脂糖填料的纯化柱（GE Healthcare Bio-sciences，17-0618-05）进行纯化。首先用1xPBS（pH7.4）平衡纯化柱，将过滤的培养上清上样到纯化柱，再用1xPBS（pH7.4）洗涤纯化柱后，用洗脱溶液（50nM 柠檬酸钠，pH2.5）将样品洗脱下来，并用1MTris-HCl，pH 9.0溶液中和洗脱样品。将中和后的样品用1xPBS（pH7.4）置换，用0.22um滤器过滤除菌，并用Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc)测定纯化抗体的浓度，备用。
(三)人鼠嵌合抗体的特异性结合鉴定
1)抗人GAS6嵌合抗体与人GAS6特异性结合及与鼠GAS6交叉结合活性的评估
用重组人GAS6 his 蛋白（Novoprotein，Cat#C01W）和鼠GAS6 his蛋白(SinoBiological，Cat#58026-M08H)进行抗体的ELISA结合试验。具体地，将0.5ug/ml 人GAS6his蛋白和0.5ug/ml鼠GAS6 his蛋白分别包被在96孔板中，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用1%BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育1小时；孵育后用1xPBST洗三次，加入梯度稀释的纯化抗体并在37度孵育1小时，其中anti-huGas6 antibody(Santa cruz, sc-376087)和anti-mGas6 Ab(R&D systems, AF986)分别为结合人GAS6 his蛋白和鼠GAS6 his蛋白的阳性对照抗体；孵育后并洗涤后，加入1:5000稀释的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性HRP抗体（Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-098），37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1NHCl终止反应，结果用Spectra M5e仪器检测OD450nm。
表 3 嵌合抗体与人和鼠GAS6 his蛋白ELISA结合结果的总结
结合人 GAS6 结合小鼠 GAS6
嵌合抗体 EC50(nM) EC50(nM)
ch2D3C6 0.19 1.42
ch2O18G6 0.21 0.22
ch3F23G12 0.23 0.21
ch3K16C8 0.15 0.65
ch5I23B12 0.24 0.52
ch11B11D12 0.18 0.15
ch12H19D4 0.15 0.13
ch15G5E5 0.16 4.94
ch18I16C6 0.11 0.10
anti-Gas6 Antibody 0.43 0.32
ELISA结合结果如图3、图4和表1显示，有9个嵌合抗体可以特异性结合人GAS6 his和鼠GAS6 his蛋白。其中ch3K16C8、ch5I23B12、ch2O18G6、ch3F23G12、ch11B11D12、ch12H19D4和ch18I16C6与人鼠GAS6 his蛋白结合活性相当（表3）。
2)人鼠嵌合抗体与人Protein S交叉结合的评估
用重组人Protein his 蛋白（R&D，Cat# 9489-PS）进行抗体的ELISA结合试验。具体地，将1ug/ml 人Protein S his蛋白包被在96孔板中，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用1%BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育1小时；孵育后用1xPBST洗三次，加入梯度稀释的纯化抗体并在37度孵育1小时；孵育后并洗涤后，加入1:5000稀释的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性HRP抗体（Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-098），37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1N HCl终止反应，结果用Spectra M5e仪器检测OD450nm。
表4 嵌合抗体与人Protein S his蛋白ELISA结合结果
嵌合抗体 ch2O18G6 ch15G5E5 ch18I16C6
EC50(nM) 0.025 0.200 0.008
ELISA结合结果如图5和表4 所示，嵌合抗体ch2O18G6, ch15G5E5和ch18I16C6与人Protein S his蛋白均有交叉结合活性。
以上结果表明，抗体ch2O18G6, ch15G5E5和ch18I16C6与人GAS6 his 蛋白、鼠GAS6 his蛋白及人Protein S his蛋白均有特异性结合活性。
(四)人鼠嵌合抗体的阻断鉴定
用ELISA方法评估嵌合抗体对人GAS6蛋白和人AXL蛋白结合的阻断作用。具体地，将重组人AXL hFc蛋白（内部合成，序列如SEQ ID NO：73所示包被在96孔板中，1ug/ml，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用1%BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育1小时；孵育后用1xPBST洗三次，每孔加入50ul梯度稀释的抗体和50ul终浓度4 ng/ml 重组人GAS6 his 蛋白（Novoprotein，Cat#C01W）混合物并在37度孵育1小时；终浓度10ug/ml的Kyowa Kirin GAS6中和抗体hzKM5321 LV7bHV0作为阳性对照和终浓度10ug/ml的human IgG作为阴性对照。50ul 1%BSA与50ul 终浓度为4ng/ml 的重组人GAS6 his蛋白混合物作为信号最大值（Max），只加1%BSA的孔吸光值最小（Mini）。孵育并洗涤后，加入1:10000稀释兔抗6xhis HRP抗体（abcam, ab1187），37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1N HCl终止反应，结果用SpectraM5e仪器检测OD450nm吸光值。结果显示，纯化的人鼠嵌合抗体对该系统中GAS6-AXL的结合显示出一定的阻断活性。
(五)人鼠嵌合抗体的增殖抑制活性鉴定
为了评估抗GAS6抗体对GAS6依赖性的细胞生长的影响，用Ba/F3-AXL细胞（南京科佰，Cat# CBP73249）进行了细胞增殖抑制试验。取对数生长的Ba/F3-AXL细胞，离心并丢弃培养上清，将离心下来的细胞用1xDPBS洗三次，重悬于新鲜RPMI1640+10%FBS+100ng/ml 重组人GAS6 his(R&D，Cat#885-GSB)培养基中，细胞密度为5*10e4/ml；然后将重悬的细胞接种到96孔白色细胞培养板中，100ul/孔细胞悬液，设置3个重复孔，放置37度细胞培养箱4小时。孵育后，加入梯度稀释的10x抗体梯度溶液，11.1 ul/孔，继续在37度细胞培养箱培养72小时。孵育72小时后每孔加入100ul Cell Titer Glo检测试剂(Promega，Cat#G7572)放置30分钟，读取RLU数值。未加抗体只含100ng/ml GAS6孔的RLU读数为最大值，只加培养基孔的RLU读数为最小值，hIgG1作为阴性对照。抗体增殖抑制活性(%)=100-(样品孔RLU-最小值RLU)/(最大值RLU-最小值RLU)x100。
结果如图6显示，嵌合抗体ch2D3C6与ch2O18G6以浓度梯度依赖性的抑制Ba/F3-AXL的生长，在浓度200nM时对细胞的增殖分别有约30%和20%的抑制率。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 迈威（上海）生物科技股份有限公司
<120> 抗人GAS6抗体或其抗原结合片段及其应用
<160> 74
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Leu Trp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Glu Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Lys Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Arg Ile Pro Pro Tyr Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asn Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Ala Leu Trp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Glu Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Gln Ser Asp Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Tyr Ile Met His
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gly Ile Asn Pro Lys Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Val Arg Ile Pro Pro Tyr Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Arg Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Tyr Val Arg Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Phe Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Val Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Asp Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Tyr Arg Tyr Ser Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Gly Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ile Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Ser Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Tyr Tyr Arg Tyr Ala Lys Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Val Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Val Val Ser Lys Val Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
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100 105 110
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ile Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Ser Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Val Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Val Val Ser Lys Val Asp Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
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Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asp
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Gly Arg Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Glu Val Lys Ile Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ser
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Arg Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Cys Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Asn Tyr Arg Ile Gly
1 5
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Asp Gly Tyr Tyr Val Arg Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Asp Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 39
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Thr Asp Gly His
1
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Phe His
1 5 10 15
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Ser Gln Thr Thr His Val Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Arg Tyr Trp Ile Glu
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Tyr Tyr Arg Tyr Ser Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Arg Tyr Trp Ile His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Tyr Ile Ile Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Ser Gln Arg Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Tyr Tyr Arg Tyr Ala Lys Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Val Val Ser Lys Val Asp Ser
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Arg Tyr Trp Met His
1 5
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Tyr Tyr Arg Tyr Ala Lys Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Asp Asp Tyr Met Lys
1 5
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Arg Gly Arg Gly Ser
1 5
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Thr Pro Asp Tyr
1
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 69
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 70
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala Thr Thr Ala Ala Gly
1 5 10 15
Thr Thr Gly Gly
20
<210> 71
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Cys Cys Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Ala Cys Ala
1 5 10 15
Cys Thr Thr Gly
20
<210> 72
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Thr Ala Thr Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ala Gly Ala Gly
20
<210> 73
<211> 561
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys
1 5 10 15
Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala
20 25 30
Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg
35 40 45
Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro
50 55 60
Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp
65 70 75 80
Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp
85 90 95
Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr
100 105 110
Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser
115 120 125
Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu
130 135 140
Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys
145 150 155 160
Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp
165 170 175
Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu
180 185 190
His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His
195 200 205
Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu
225 230 235 240
Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr
245 250 255
His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln
260 265 270
Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser
275 280 285
Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro
290 295 300
Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp
305 310 315 320
Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro
325 330 335
Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His
340 345 350
Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg
355 360 365
Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly
370 375 380
Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser
385 390 395 400
Asn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro
405 410 415
Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln
420 425 430
Pro Val His Gln Leu Val Lys Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser Ile
435 440 445
Glu Gly Arg Met Asp Ala Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
450 455 460
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
465 470 475 480
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
485 490 495
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
500 505 510
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
515 520 525
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
530 535 540
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
545 550 555 560
Lys
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (14)

1.抗人GAS6抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
重链可变区，所述重链可变区（VH）包含抗原决定区（CDRs）1、2和3，且VH CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5、6和7所示；
轻链可变区，所述轻链可变区（VL）包含抗原VL CDRs1、2和3，且 VL CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8、9和10所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其结合片段，其特征在于，所述VH包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。
5.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是特异性结合人GAS6的抗体片段，且选自Fv、Fab、Fab'、scFv和F(ab')2。
6.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-5任一项所述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段。
7.一种载体，其特征在于，包括权利要求6所述的核酸。
8.一种分离的细胞，其特征在于，包括权利要求7所述的载体。
9.一种制备权利要求1-5任一项所述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，包括：
（1）在合适的条件下，培养权利要求8所述的细胞；以及
（2）分离回收权利要求1-5所述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1-5任一项所述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段；以及
药学上可接受的载体。
11.一种抗体-药物缀合物，其特征在于，包含与治疗剂共价结合的、权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求11所述的抗体-药物缀合物，其特征在于，所述治疗剂为一甲基澳瑞他汀E或一甲基澳瑞他汀 F。
13.权利要求1-5任一项所述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段或权利要求11-12所述抗体-药物缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、神经内分泌肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、头颈部癌及慢性和急性髓系白血病。
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Pledgor: Maiwei (Shanghai) Biotechnology Co.,Ltd.

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