CN107001452B - 用于治疗癌症的抗ck8抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种特异性结合具有SEQ ID No.29(CK‑8的片段)的氨基酸序列的肽的人CK8抗原肽、抗体或抗体片段或人源化抗体。所述分子可以用于检测和/或治疗其细胞在该细胞表面表达CK8蛋白，特别是根据SEQ ID No.29的序列的肽的肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及可用于治疗目的的抗体的领域。特别地，本发明涉及抗细胞角蛋白-8抗体。这些抗体在治疗表达细胞角蛋白-8(CK8)的癌症(例如结肠直肠癌)中有用。
背景技术
细胞角蛋白-8(CK8)是上皮细胞的细胞骨架的中间丝的蛋白组分。
各种研究已表明CK8蛋白的出现与各种癌细胞的质膜有关。例如，Godfroid等人(Journal of Cell Science，99：595-607，1991)记载了CK8蛋白存在于培养的乳腺癌细胞的表面。Hembrough等人(Journal of Cell Science，108：1071-1082，1995)记载了CK8或CK8样蛋白存在于肝细胞、HepG2细胞和乳腺癌细胞的表面。
在其它癌症的癌(carcinoma)(如上消化道癌)的表面也已检测到了CK8蛋白(Gires等人，Biochemical and Biophysical Research Communications，328：1154-1162，2005)。也已经表明CK8蛋白暴露在结肠直肠癌的侵袭性和非侵袭性肿瘤细胞的表面(WO2010/136536)。更具体地，已经表明在结肠直肠癌中侵袭性和/或转移性细胞的出现伴随着暴露于这些细胞表面的人CK8蛋白的裂解。CK8蛋白的N-末端部保持暴露于结肠腺癌细胞的表面，而该蛋白的C-末端部部分地或完全从这些细胞的表面消失。
结肠直肠癌是一种特别有侵袭性的癌症。虽然已经在转移性结肠直肠癌(CRC)患者的治疗中取得了显著改进，但是这种类型的癌症仍是重大的全球公共健康问题(Weitz等人.Lancet 2005；365：153-65)。CRC在两种性别中是诊断的第三大癌症，估计每年有940,000例，并且是癌症死亡的第二大常见原因，每年约500,000例(Weitz等人.Lancet 2005；365：153-65)。在法国，每年有37,000名新患者被诊断为患有CRC，其中约一半的患者会死于转移性疾病。然而，36,000名新患者中约50％的患者在诊断时已经有转移瘤或者会形成转移瘤(Weitz等人，Lancet 2005；365：153-65；Cunningham等人，Lancet 2010；Chevreul EurJ Health Econ 2010)。
更有效药物(伊立替康、奥沙利铂)的开发使得显著改善CRC患者的治疗成为可能。过去十年也已经看到了分子基疗法-针对肿瘤细胞中相对于健康细胞过表达的特异性靶(EGF或VEGF受体)的单克隆抗体(Mab)的出现。这些分子显著地改善了治疗。
细胞角蛋白8表现出多种功能，例如基于其独特的结构特点调节细胞侵袭和/或细胞凋亡。关于细胞侵袭，CK8结合纤维蛋白溶酶原和组织型纤溶酶原激活物(t-PA)，并加速癌细胞表面纤维蛋白溶酶原的激活(J Protein Chem.1998Nov；17(8)：845-54)。纤维蛋白溶酶原结合位点位于CK8的C-末端。
另外，通过干扰纤维蛋白溶酶原系统，CK8可以参与到响应于微环境变化的癌细胞的由外而内信号转导的调节中(Deryugina和Quigley，J.Biomed Biotechnol，2012；2012：564259)。
关于细胞凋亡，细胞角蛋白8/18(CK8/18)细胞骨架网络是凋亡期间胱天蛋白酶裂解的早期靶。最近的报道表明含有DNA结合蛋白(DEDD)的高度保守且普遍存在的死亡效应物结构域在该C8/18支架处募集胱天蛋白酶原-9和胱天蛋白酶原-3中发挥作用。DEDD既与CK8/18中间丝网络相互作用又与胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶原-9相互作用(Apoptosis(2006)11：1561-1572)。表明CK8/18纤丝可以为与胱天蛋白酶-3密切相关的胱天蛋白酶原-9的邻近诱导自切割和激活提供支架。
已经描述了结合至人CK8蛋白的各种单克隆抗体。特别地，Erlandsson等人(J.ofMolecular Recognition，16：157-163，2003；Johansson等人，Cancer Res1999，59，48-51)描述了针对人CK8蛋白的单克隆抗体TS1、其抗独特型αTS1以及其在用于治疗癌症的免疫疗法中的用途。Doljak等人(Cancer Letters，267：75-84，2008)描述了结合至各种细胞角蛋白中保守的VKIALEVEIATY基序的单克隆抗体。该单克隆抗体特别地结合至MCF-7乳腺癌细胞中的CK2、CK8、CK10和CK18蛋白。该抗体抑制纤维蛋白溶酶原在体外激活MCF-7。VanMuijen，G.等人(Lab.Invest.，57：359，1987；Waseem et al.Biochemistry 2004，43，1283-1295)描述了以
销售的抗体M20。已经表明该特异性结合至CK8蛋白的抗体在体外和体内进行的测试中抑制结肠直肠癌肿瘤细胞的生长和侵袭能力(WO2010/136536)。特别地，在国际专利申请WO2010/136536中，表明该抗体特异性结合至出现在结肠腺癌肿瘤细胞表面的人CK8蛋白的未切割部分。通过小鼠腹水制备了纯化的抗体M20。没有描述该特定抗体的人源化Mab形式。
虽然在鉴定肿瘤细胞表面的抗原以及在理解与癌症的发生有关的机制方面取得了进步，并且该进步使得能够开发可以显著改善治疗的单克隆抗体，但是该单克隆抗体的有效性和特异性可进一步提高。事实上用于开发靶向疗法的蛋白中的许多蛋白在癌细胞中过表达，但在健康组织中也表达，虽然表达的程度不同。因此，靶向在癌组织的细胞表面更特异性表达的蛋白关键表位的药物代表了非常有希望提高抗癌治疗的癌特异性的方法。因此，仍需要开发用于治疗其细胞在该细胞的表面表达外在化CK8(eCK8)蛋白的肿瘤的治疗手段，例如特别是用于治疗结肠直肠癌的治疗手段。更特别地，仍需要开发不仅靶向CK8而且更特异性靶向癌症相关表位的单克隆抗体，所述癌症相关表位通过调节充分描述的肿瘤进展的过程如参与细胞侵袭和细胞凋亡的那些过程来干扰细胞的肿瘤发生能力。
发明内容
本发明涉及一种抗体或其抗体片段，特异性结合具有SEQ ID No.29的氨基酸序列的肽，所述抗体包括：
-重链，其包括分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的三个CDR，其中：
CDR-H1包含序列SEQ ID No.37，或与序列SEQ ID No.37最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-H2包含序列SEQ ID No.38，或与序列SEQ ID No.38最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-H3包含序列SEQ ID No.39，或与序列SEQ ID No.39最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
-轻链，其包括分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的三个CDR，其中：
CDR-L1包含序列SEQ ID No.34，或与序列SEQ ID No.34最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-L2包含序列SEQ ID No.35，或与序列SEQ ID No.35最佳比对后具有至少70％，优选80％、85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-L3包含序列SEQ ID No.36，或与序列SEQ ID No.36最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列。
本发明还涉及一种人源化抗体或其抗体片段，所述人源化抗体或其抗体片段特异性结合具有SEQ ID No.29的氨基酸序列的肽，所述人源化抗体包括：
-重链，其包括分别为CDR-H1’、CDR-H2’和CDR-H3’的三个CDR，其中：
CDR-H1’包含序列SEQ ID No.40，或与序列SEQ ID No.37最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-H2’包含序列SEQ ID No.41，或与序列SEQ ID No.38最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-H3’包含序列SEQ ID No.39，或与序列SEQ ID No.39最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
-轻链，其包括分别为CDR-L1’、CDR-L2’和CDR-L3’的三个CDR，其中：
CDR-L1’包含序列SEQ ID No.42，或与序列SEQ ID No.34最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-L2’包含序列SEQ ID No.35，或与序列SEQ ID No.35最佳比对后具有至少70％，优选80％、85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-L3’包含序列SEQ ID No.36，或与序列SEQ ID No.36最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列。
本发明的抗体或抗体片段可用于治疗肿瘤，所述肿瘤的细胞在该细胞的表面表达CK8蛋白，特别是根据SEQ ID No.29的序列的肽。
本发明还涉及一种人CK8抗原肽，其由具有8至16个氨基酸的多肽组成并且包含SEQ ID No.29的序列，特别是涉及由SEQ ID No.29的序列组成的人CK8抗原肽。
本发明还涉及所述人CK8抗原肽，用作药物。
本发明还涉及一种药物组合物，包括根据本发明的抗体或抗体片段和合适的药物载体，特别地用于治疗或预防癌症、自身免疫病、炎性病症、病毒感染或病毒病和/或用作诱导肿瘤细胞凋亡的药物，特别地用于治疗其细胞在该细胞的表面表达CK8蛋白，特别是根据SEQ ID No.29的序列的肽的肿瘤。
最后，本发明涉及一种试剂盒，包括含有可特异性结合至表位的分子的容器，其中所述表位具有与序列SEQ ID No.29最佳比对后具有至少60％，优选65％、70％、75％、80％、85％和90％和100％的同一性的序列。所述试剂盒可用于检测癌症。
附图说明
图1A和1B图示了使用不同抗CK8抗体(包括mD-A10Mab)通过蛋白质印迹对CK8同种型的检测。
图2A和2B图示了在非缀合肽1(SEQ ID NO：1)或非缀合肽2(SEQ ID NO：2)的存在下对通过流式细胞术分析的抗CK8抗体的细胞标记的竞争水平。
图3A、图3B和图3C图示了在非缀合肽1(SEQ ID NO：1)或非缀合肽2(SEQ ID NO：2)的存在下对使用M20抗体、mD-D6Mab或Md-A10Mab通过蛋白质印迹检测CK8蛋白同种型的竞争水平。
图4图示了抗CK8抗体(50μg/ml)(包括mD-A10Mab)对由10％的胎牛血清(FBS)诱导的Isreco-1细胞的侵袭的作用。
图5图示了抗CK8抗体对Isreco-1细胞增殖的作用。
图6A和图6B图示了在体内抗CK8抗体对来自Iserco-1肿瘤细胞的胱天蛋白酶3激活的作用。
图7图示了抗CK8抗体(包括mD-A10Mab)对小鼠的肿瘤(Isreco-1)生长的作用。
图8图示了mD-A10Mab的浓度对小鼠的肿瘤(Isreco-1)生长的剂量依赖性作用。
图9图示了抗CK8抗体(包括mD-A10Mab)对小鼠的肿瘤(HCT116)生长的作用。
图10图示了mD-A10Mab的浓度对小鼠的肿瘤(HCT116)生长的剂量依赖性作用。
图11图示了肽1(SEQ ID NO：1)、肽2(SEQ ID NO：2)、肽3(SEQ ID NO：3)和肽4(SEQID NO：4)在人细胞角蛋白8序列中的定位(参比：Uni-ProtKB P05787)。
图12图示了通过ELISA进行的M20抗体或mD-A10Mab对BSA缀合肽1(SEQ ID NO：1)、BSA缀合肽2(SEQ ID NO：2)、BSA缀合肽3(SEQ ID NO：3)、BSA缀合肽4(SEQ ID NO：4)或BSA缀合肽17(SEQ ID NO：17)的反应性。
图13A图示了通过ELISA进行的mD-A10Mab对未缀合包被肽1、5至28(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：28)的反应性。
图13B图示了通过ELISA进行的M20对未缀合包被肽1、5至28(SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：5至SEQ ID NO：28)的反应性。
图14图示了通过ELISA进行的未缀合肽1、5至28(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5至SEQID NO：28)对mD-A10Mab识别BSA缀合肽1(SEQ ID NO：1)的作用。
图15图示了通过ELISA进行的未缀合肽1、5至28(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5至SEQID NO：28)对mD-A10Mab识别BSA缀合肽17(SEQ ID NO：17)的作用。
图16图示了根据
的带有对FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的说明的mD-A10Mab的轻链可变(VL)区的氨基酸序列和核苷酸序列。
图17图示了根据
的带有对FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的说明的mD-A10Mab的重链可变(VH)区的氨基酸序列和核苷酸序列。
图18图示了mD-A10Mab的人源化单克隆抗体衍生物的重链可变(VH)区的氨基酸序列和核苷酸序列。
图19图示了mD-A10Mab的人源化单克隆抗体衍生物的轻链可变(VL)区的氨基酸序列和核苷酸序列。
图20图示了mD-A10Mab的人源化单克隆抗体衍生物的重链恒定(CH)区的氨基酸序列和核苷酸序列。
图21图示了mD-A10Mab的人源化单克隆抗体衍生物的轻链恒定(CL)区的氨基酸序列和核苷酸序列。
定义
在本发明的描述中所使用的术语“抗体”是指单克隆抗体(Mab)或多克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或缀合抗体。典型的抗体由通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链组成。每条重链和轻链包括恒定区和可变区。每个可变区包括三个部分，称为“互补决定区”(“CDR”)或“高变区”，主要负责结合抗原的表位。从N末端按顺序编号，它们通常被称为CDR1、CDR2和CDR3。可变区的更高度保守部分被称为“骨架区”。
在本发明的描述中所使用的表述“单克隆抗体”是指源于基本上同源的抗体群体的抗体。更具体地，群体中的各个抗体是相同的，除了可少量发现的几个可能天然发生的突变。换句话而言，单克隆抗体由单个细胞克隆(例如，杂交瘤、用编码同源抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、用编码同源抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞等)的增殖产生的同源抗体组成，通常被表征为单个类和亚类的重链和单个型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的，并且针对单一抗原。而且，与通常包括针对各种决定簇或表位的各种抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原的单一表位。
在本发明的描述中所使用的表述“嵌合抗体”是指包括给定的物种的抗体(例如人抗体)的重链和轻链的恒定部分的抗体，其中所述抗体上植入有异源物种的抗体(例如鼠源抗体)的重链和轻链的可变部分。
在本发明的描述中所使用的表述“人源化抗体”是指高变区(CDR)被异源(例如鼠源)抗体的高变区(CDR)取代的人抗体，该异源抗体的高变区组成抗原结合位点。由于位于与CDR(FR)相邻的区域的某些氨基酸在抗原结合位点的结构中发挥作用，因此，可另外修饰人抗体(CDR)以便包括异源抗体的FR的氨基酸。
在本发明的描述中所使用的表述“缀合抗体”是指人工混合的分子，该分子中的组分与能够选择性识别抗原的抗体有关。这些组分可以是细胞毒性药物、抗癌剂、毒素、片段和/或放射性元素。
抗体可以是多价抗体，即它们可以包括不止两个抗原结合位点或者只要它们表现出所需的生物活性就可以是多特异性抗体。
在本发明的描述中所使用的表述“抗体片段”是指抗体的功能部分(与整个抗体相对)，即抗体的能够结合至抗原的部分(抗原结合片段)。要理解的是，抗体片段保留有结合至参比抗体的靶(通常也称为抗原)的能力。抗体片段的实例包括如下片段：Fv(由抗体的重链和轻链的可变区组成)、ScFv(二价单链可变片段)、Fab(由整条轻链和重链的一部分组成)、F(ab′)2(由通过铰链区连接的两个Fab片段组成)或通过化学修饰(例如，加入聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化”)(聚乙二醇化的片段称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG)(“PEG”为聚乙二醇))或通过在脂质体中引入具有根据本发明的抗体的特征性CDR中的至少一个的片段可提高半衰期的任何片段。通常，只要抗体片段与特异性结合至参比抗体的表位的抗体类似或相对于该特异性结合至参比抗体的表位的抗体具有免疫性质，该抗体片段可以具有任何上限尺寸。例如，如果抗体片段与轻链抗体亚单位有关，则结合实体和轻链抗体片段可以具有至少60个氨基酸，少于约200个氨基酸、少于约175个氨基酸、少于约150个氨基酸或少于约120个氨基酸。而且，如果抗体片段与重链抗体亚单位有关，则结合实体和重链抗体片段可以具有少于约425个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约375个氨基酸、少于约350个氨基酸、少于约325个氨基酸或少于约300个氨基酸。
在本发明的描述中所使用的术语“凋亡”是指哺乳动物中通常伴随一种或多种特征性细胞变化(如细胞质浓缩、质膜微绒毛减少、核分裂、染色体DNA降解或线粒体功能的丧失)的有序或受控形式的细胞死亡。称为胱天蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶的激活在细胞凋亡的执行中起着重要作用。
在本发明的描述中所使用的术语“侵袭”是指细胞迁移，限定细胞变得能动并且导航通过组织内的细胞外基质或者浸润相邻组织的能力。变得侵袭的癌细胞可以散布到次生位点并形成转移瘤(metastase)。
在本发明的描述中所使用的术语“激动剂”或“激动的”是指能够直接或间接诱导、促进或提高CK8生物活性或激活的分子。
在本发明的描述中所使用的术语“拮抗剂”或“拮抗的”是指能够直接或间接对抗、减少或抑制CK8生物活性或激活的分子。
在本发明的描述中所使用的术语“癌症”是指不管有什么组织性质的所有恶性赘生形成物。存在两种类型的恶性肿瘤：上皮来源的癌(carcinomas)和结合来源的肉瘤。恶性肿瘤由侵袭性或扩散性非典型细胞组成，通常特征在于自发生长的能力、不精确的轮廓、侵袭相邻组织和血管的能力以及通过产生转移瘤进行扩散的倾向。
在本发明的描述中所使用的术语“多核苷酸”是指单链DNA或RNA核苷酸链或其互补物，或者是指双链互补DNA(cDNA)或基因组DNA核苷酸链。
在本发明的描述中所使用的术语“表位”是指可通过互补位(抗体的可变部分)识别的分子。
在本说明书中所使用的术语“同源性”是指肽序列之间的相似性。该肽序列可以与参比多肽相比具有至少一个氨基酸的缺失、插入或取代。
在本发明的描述中所使用两个核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”通过比较两个最佳比对的序列确定，在所述两个最佳比对的序列，待比较的核酸或氨基酸序列与用于两个序列之间最佳比对的参比序列相比可以有插入或缺失。同一性百分比通过如下来计算：确定两个序列(优选两个完整序列)之间氨基酸、核苷酸或残基相同位置的数量、将相同位置的数量除以比对窗口中的总位置的数量，并将结果乘以100，得到两个序列之间的同一性百分比。例如，在网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b 12.html上可得到的BLAST程序“BLAST 2序列”(Tatusova等人，“Blast 2序列-一种比较蛋白和核苷酸序列的新工具(Blast 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences)”，FEMS Microbiol.，1999，Lett.174：247-250)可与默认参数一起使用(尤其是参数“开放空位罚分(open gap penalty)”：5，以及“拓展空位罚分(extension gappenalty)”：2；所选择的矩阵例如为通过程序提出的“BLOSUM62”)；待比较的两个序列之间的同一性百分比通过该程序直接计算。
鼠源单克隆抗体D-A10在本文中被称为“mD-A10Mab”。
嵌合单克隆抗体D-A10在本文中被称为“chD-A10Mab”。
人源化单克隆抗体D-A10在本文中被称为“HzD-A10Mab”。
序列表
SEQ IDNO：1是指下列肽：
AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C
SEQ ID NO：2是指下列肽：AEQRGELAIKDANAKLSELE-C
SEQ IDNO：3是指下列肽：AALQRAKQD-C
SEQ ID NO：4是指下列肽：SELEAALQRAKQD-C
SEQ ID NO：5是指下列肽：AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD
SEQ ID NO：6是指下列肽：AALQRAKQD
SEQ ID NO：7是指下列肽：EAALQRAKQD
SEQ ID NO：8是指下列肽：LEAALQRAKQD
SEQ ID NO：9是指下列肽：ELEAALQRAKQD
SEQ ID NO：10是指下列肽：SELEAALQRAKQD
SEQ ID NO：11是指下列肽：LSELEAALQRAKQD
SEQ ID NO：12是指下列肽：KLSELEAALQRAKQD
SEQ ID NO：13是指下列肽：AKLSELEAALQRAKQD
SEQ ID NO：14是指下列肽：NAKLSELEAALQRAKQD
SEQ ID NO：15是指下列肽：ANAKLSELEAALQRAKQD
SEQ ID NO：16是指下列肽：DANAKLSELEAALQRAKQD
SEQ ID NO：17是指下列肽：C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD
SEQ ID NO：18是指下列肽：AIKDANAKLSELEAALQRAKQ
SEQ ID NO：19是指下列肽：AIKDANAKLSELEAALQRAK
SEQ ID NO：20是指下列肽：AIKDANAKLSELEAALQRA
SEQ ID NO：21是指下列肽：AIKDANAKLSELEAALQR
SEQ ID NO：22是指下列肽：AIKDANAKLSELEAALQ
SEQ ID NO：23是指下列肽：AIKDANAKLSELEAAL
SEQ ID NO：24是指下列肽：AIKDANAKLSELEAA
SEQ ID NO：25是指下列肽：AIKDANAKLSELEA
SEQ ID NO：26是指下列肽：AIKDANAKLSELE
SEQ ID NO：27是指下列肽：AIKDANAKLSEL
SEQ ID NO：28是指下列肽：AIKDANAKLSE
SEQ ID NO：29是指下列肽：LSELEAAL
SEQ ID NO：30是指下列核苷酸序列：
AACATTGTTATGACCCAGGCCGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTTCTGTATAGTAATGGCAACACTTATTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCGCCTGATATATTATATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGAGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAAAGTCTAGAATATCCTTTCACG
SEQ ID NO：31是指下列肽：
NIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLYSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：32是指下列核苷酸序列：
GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCGGGGGGGTCACGGGGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTTACTTTTAGTGGCTTCTGGATGAGCTGGGTTCGACAGACACCTGGGAAGACCCTGGAGTGGATTGGAGACATTAATTCTGATGGCAGTGCAATAAAATACGCACCATCCATAAAGGATCGATTCACTATCTTCAGAGACAATGACAAGAGCACCCTGTACCTGCAGATGAGCAATGTGCGATCTGAGGACACAGCCACGTATTTCTGTATCGCCCATTACTCCGGTGGGGGGTTTGCTTACTGGGGTCAAGGAACCTCGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：33是指下列肽：
EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFTFSGFWMSWVRQTPGKTLEWIGDINSDGSAIKYAPSIKDRFTIFRDNDKSTLYLQMSNVRSEDTATYFCIAHYSGGGFAYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO：34是指下列肽：KSLLYSNGNTY
SEQ ID NO：35是指下列肽：YMS
SEQ ID NO：36是指下列肽：MQSLEYPFT
SEQ ID NO：37是指下列肽：GFTFSGFW
SEQ ID NO：38是指下列肽：INSDGSAI
SEQ ID NO：39是指下列肽：IAHYSGGGFAY
SEQ ID NO：40是指下列肽：GFTFSSYW
SEQ ID NO：41是指下列肽：INSDGSST
SEQ ID NO：42是指下列肽：KSLLYSNGYNY
SEQ ID NO：43是指下列肽：
DIVMTQAPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYSNGYNYLYWFLQKPGQSPQLLIYYMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：44是指下列肽：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLVWVSDINSDGSSTKYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCIAHYSGGGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：45是指下列核苷酸序列：
GAAGTACAATTGGTAGAATCAGGTGGTGGTTTGGTTCAGCCAGGAGGATCACTGAGACTGTCCTGCGCTGCAAGCGGCTTTACCTTCTCTAGCTACTGGATGTCTTGGGTCCGGCAAGCCCCAGGGAAGGGACTGGTGTGGGTGAGCGATATTAATAGTGACGGCTCTTCTACTAAGTATGCTGATAGTGTCAAGGGCCGATTCACCATCTCACGAGACAACGCCAAGAACACCTTGTACCTCCAGATGAACTCTTTGAGAGCTGAGGATACAGCAGTGTATTACTGTATCGCCCACTACTCAGGGGGAGGCTTTGCTTACTGGGGTCAAGGCACACTCGTGACAGTCTCCTCT
SEQ ID NO：46是指下列核苷酸序列：
GATATTGTAATGACTCAAGCTCCACTCTCCTTGCCTGTAACTCCTGGAGAGCCCGCTTCTATTAGCTGTAGGAGTAGTAAAAGCCTGCTTTACAGTAATGGTTACAATTACCTGTACTGGTTTTTGCAGAAGCCTGGACAGTCACCCCAGCTCCTCATCTATTATATGTCTAACTTGGCCAGTGGTGTCCCAGACCGTTTTAGTGGCAGCGGCTCAGGCACCGACTTTACCCTTAAGATCAGCCGAGTCGAGGCTGAAGACGTAGGAGTGTACTACTGTATGCAGAGTCTTGAGTATCCATTCACCTTCGGGCAGGGCACCAAGCTCGAAATAAAG
SEQ ID NO：47是指下列肽：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：48是指下列核苷酸序列：
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGG
TGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO：49是指下列肽：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：50是指下列核苷酸序列：
CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
具体实施方式
抗体和抗体片段
发明人已经开发出了特异性结合至具有人CK8蛋白的从第353位至第360位的氨基酸序列(参比：Uni-ProtKB P05787)的肽的抗体和抗体片段。以SEQ ID NO：29给出了人CK8蛋白的从第353位至第360位的氨基酸序列。所谓“特异性”是指抗体或抗体片段只结合至具有该序列的人CK8肽。应理解的是，抗体或抗体片段可以结合至包括该序列的任何蛋白/肽片段。
因此，本发明涉及特异性结合至根据序列SEQ ID NO：29的肽的抗体或其抗体片段。在本发明的描述中通过表述“本发明的抗体或抗体片段”指明了这些抗体或抗体片段。
本发明的抗体包括：
-重链，其包括分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的三个CDR，其中：
CDR-H1包含序列SEQ ID No.37，或与序列SEQ ID No.37最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-H2包含序列SEQ ID No.38，或与序列SEQ ID No.38最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-H3包含序列SEQ ID No.39，或与序列SEQ ID No.39最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
-轻链，其包括分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的三个CDR，其中：
CDR-L1包含序列SEQ ID No.34，或与序列SEQ ID No.34最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-L2包含序列SEQ ID No.35，或与序列SEQ ID No.35最佳比对后具有至少70％，优选80％、85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-L3包含序列SEQ ID No.36，或与序列SEQ ID No.36最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列。
按照
或保留与
和
共有的序列的共同编号系统(common numbering system)限定CDR序列(参见实施例部分)。表1中给出了本发明的抗体的CDR，特别是mD-A10Mab的CDR。
表1：mD-A10Mab的VH或VL的CDR序列
按照定义，这些CDR包括因一个或多个氨基酸的缺失、取代或插入引起的变体CDR，所述变体保留有原CDR的特异性。共同编号系统提供具有短的氨基酸序列的CDR定义或最小CDR的定义。
本发明的抗体或抗体片段(抗CK8抗体或抗CK8抗体片段)有效地抑制在体外肿瘤细胞的侵袭能力和有效地抑制在体内的肿瘤生长。
本发明的抗体或抗体片段(抗CK8抗体或抗CK8抗体片段)通过胱天蛋白酶3介导的细胞凋亡有效地诱导在体内表达CK8的癌细胞的死亡。事实上，本发明的抗体或抗体片段能够在体内诱导胱天蛋白酶3的裂解，这证明了细胞凋亡的激活。
本发明的抗体优选为单克隆抗体。所述单克隆抗体可以是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。它们可以通过本领域技术人员公知的标准方法得到。
单克隆抗体，特别是鼠源来源的单克隆抗体可根据手册《抗体》(Harlow和Lane，抗体：实验手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY，pp.726，1988)中描述的技术来制备或由杂交瘤来制备。这样的技术对于本领域的技术人员而言是公知的。
可选地，本发明的单克隆抗体可例如通过如下从动物细胞得到：用包括具有SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的肽的人CK8蛋白片段免疫接种动物，然后通过表位作图筛选结合至具有SEQ ID NO：29的肽的单克隆抗体。
根据本发明的单克隆抗体例如可以用亲和柱纯化，在所述亲和柱上提前固定有包括SEQ ID NO：29的肽的人CK8片段。可以同时或相继使用本领域技术人员公知的其它纯化技术。
嵌合抗体可以利用基因重组技术制备。例如，可以通过克隆具有启动子和编码非人，特别是鼠源单克隆抗体的可变区的序列和编码人抗体的恒定区的序列的重组DNA来制备。本发明的由这样的重组基因编码的嵌合抗体例如为小鼠-人嵌合体，该抗体的特异性由源自鼠源DNA的可变区决定，而其同种型由源自人DNA的恒定区决定。用于制备嵌合抗体的方法广泛记载在文献中。
人源化抗体可以通过本领域技术人员已知的技术制备(例如，Singer等人，J.Immun.，150：2844-2857，1992；Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10：1-142，1992；和Bebbington等人，Bio/Technology，10：169-175，1992中记载的那些技术)。也为本领域技术人员所已知的其它人源化技术，例如记载在专利EP 0 451 261、EP 0 682 040、EP0 939 127、EP 0 566 647或美国专利5,530,101、美国专利6,180,370、美国专利5,585,089和美国专利5,693,761中的“CDR移植”技术。也可引用美国专利5,639,641或6,054,297、5,886,152和5,877,293。
为了使抗V区应答最小化，可以通过只将特异性决定残基(SDR)(即对Mab与其抗原的表面互补性必需的残基)移植到人模板上来制备单克隆人源化抗体。为了该目的，可以通过在保留视为对抗原结合位点的完整性必需的那些鼠源骨架残基的同时，将鼠源抗体的互补性决定区(CDR)移植到人免疫球蛋白分子的可变轻链骨架和可变重链骨架上来使鼠源抗体人源化。然而，由于人源化抗体的异种CDR可以在患者体内引起抗独特型(抗Id)应答，因此可以通过使抗Id应答最小化的技术来制备本发明的人源化抗体或其片段。这些技术的实例包括只将特异性决定残基(SDR)(即在抗体-配体相互作用中最关键的CDR残基)移植到人骨架上。SDR通过已知结构的抗原-抗体复合物的三维结构的数据库的帮助来鉴定或者通过对抗原-抗体位点的突变分析来鉴定。涉及保留更多CDR残基的人源化的可选方法是基于“简写”的CDR(即包括所有SDR的CDR残基的延伸序列(stretches))的移植。
本发明的抗体片段可以由本文描述的抗体通过酶消化(例如借助于胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原裂解二硫键得到。可选地，本发明的抗体片段可以通过基因重组技术或通过肽合成得到。这些方法是本领域技术人员所公知的。
本发明的抗体或抗体片段优选为选自鼠源抗体、嵌合抗体和人源化抗体的抗体或抗体片段，优选具有优化序列的抗体或抗体片段。
表述“优化序列”特指编码感兴趣蛋白的组成组成型氨基酸的密码子(例如，抗体可变域)可以优化，以便在专门的细胞类型中通过翻译装置更好地识别。在这方面，由优化的序列编码的蛋白的氨基酸序列与非优化序列的相同，但是核苷酸序列不同。
本发明的抗体或其抗体片段可以包括：SEQ ID No.31，或与序列SEQ ID No.31最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和/或SEQ IDNo.33，或与序列SEQ ID No.33最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列。
本发明的抗体或其抗体片段可以包括由多核苷酸编码的可变区，所述多核苷酸具有：鼠源轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)，或与序列SEQ ID No.30最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和/或鼠源重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：32)，或与序列SEQ ID No.32最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列。
SEQ ID NO：30对应于根据本发明的抗体的鼠源轻链可变区的核苷酸序列(图16中给出的根据
的带有对FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的说明的mD-A10Mab)。
SEQ ID NO：31对应于根据本发明的抗体的鼠源轻链可变区的氨基酸序列(图16中给出的根据
的带有对FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的说明的mD-A10Mab)。
SEQ ID NO：32对应于根据本发明的抗体的鼠源重链可变区的核苷酸序列(图17中给出的根据
的带有对FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的说明的mD-A10Mab)。
SEQ ID NO：33对应于根据本发明的抗体的鼠源重链可变区的氨基酸序列(图17中给出的根据
的带有对FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的说明的mD-A10Mab)。
在一些实施方式中，本发明的抗体为mD-A10Mab。
表2给出了mD-A10Mab的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。
| mVL核酸序列 | mVH核酸序列 | |
| D-A10 | SEQ ID NO：30 | SEQ ID NO：32 |
| mVL氨基酸序列 | mVH氨基酸序列 | |
| D-A10 | SEQ ID NO：31 | SEQ ID NO：33 |
表2：CDR VH和CDR VL的序列汇编(sequence codification)
本发明的抗体或抗体片段优选为人源化抗体或人源化抗体片段。
本发明的人源化抗体可以包括：
-重链，其包括分别为CDR-H1’、CDR-H2’和CDR-H3’的三个CDR，其中：
CDR-H1’包含序列SEQ ID No.40，或与序列SEQ ID No.40最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-H2’包含序列SEQ ID No.41，或与序列SEQ ID No.41最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-H3’包含序列SEQ ID No.39，或与序列SEQ ID No.39最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
-轻链，其包括分别为CDR-L1’、CDR-L2’和CDR-L3’的三个CDR，其中：
CDR-L1’包含序列SEQ ID No.42，或与序列SEQ ID No.42最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-L2’包含序列SEQ ID No.35，或与序列SEQ ID No.35最佳比对后具有至少70％，优选80％、85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和
CDR-L3’包含序列SEQ ID No.36，或与序列SEQ ID No.36最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列。
在本文的下表3中总结了本发明的人源化抗体，特别是Hz-DA-10Mab的CDR序列。
表3：Hz DA-10Mab的VH和VL的CDR序列
本发明的人源化抗体或其抗体片段可以包括：SEQ ID NO：43，或与序列SEQ IDNo.43最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和/或SEQID NO：44，或与序列SEQ ID No.44最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列。
本发明的人源化抗体或抗体片段可以包括多核苷酸编码的可变区，所述多核苷酸编码具有：鼠源轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：45)，或与序列SEQ ID No.45最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列；和/或鼠源重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)，或与序列SEQ ID No.46最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列。
SEQ ID NO：45对应于根据本发明的抗体的人源化重链可变区的核苷酸序列(图18中给出的根据
的带有对FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的说明的Hz D-A10Mab)。
SEQ ID NO：46对应于根据本发明的抗体的人源化轻链可变区的核苷酸序列(图18中给出的根据
的带有对FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的说明的Hz D-A10Mab)。
SEQ ID NO：43对应于根据本发明的抗体的人源化轻链可变区的氨基酸序列(图19中给出的根据
的带有对FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的说明的Hz D-A10Mab)。
SEQ ID NO：44对应于根据本发明的抗体的人源化重链可变区的氨基酸序列(图19中给出的根据
的带有对FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的说明的Hz D-A10Mab)。
表4给出了Hz D-A10Mab的轻链可变区和重链可变区的核酸序列和氨基酸序列。
| VL核酸序列 | VH核酸序列 | |
| Hz D-A10 | SEQ ID NO：46 | SEQ ID NO：45 |
| VL氨基酸序列 | VH氨基酸序列 | |
| Hz D-A10 | SEQ ID NO：44 | SEQ ID NO：43 |
表4：Hz D-A10Mab的CDR VH或CDR VL的序列汇编
根据本发明的抗体片段可以为F(ab′)2、Fab、Fv或ScFv片段。
本发明的抗体或抗体片段在体外有效地抑制肿瘤细胞的侵袭能力和在体内有效抑制肿瘤生长。特别地，发明人已经表明了mD-A10Mab在体外有效抑制了Isreco-1细胞的侵袭能力(图4)和有效抑制了小鼠体内的Isreco-1和HCT116肿瘤细胞的生长(图7至图10)。特别地，发明人已经表明mD-A10Mab在体外抑制了Isreco-1细胞的侵袭能力，而抗体mD-D6没有任何作用。这种拮抗活性也在使用抗体M20的情况下观察到了(图4)。在体内，只有mD-A10或M20抗体还控制肿瘤生长。
在凋亡期间，细胞经历巨大形态变化，部分是由于它们的细胞质和细胞核的细胞骨架结构的完全再组织。这个分解过程经充分精心安排，并且涉及到胱天蛋白酶的逐步激活。细胞骨架组分中的一些在凋亡的不同阶段保留功能，因此在该过程的后期阶段只是被分解。由于在早期凋亡期间，胱天蛋白酶原-3和胱天蛋白酶原-9被特异性地靶向CK8/18的中间丝网络，因此这可以解释凋亡期间细胞角蛋白支架的快速分解。
发明人已经表明，mD-A10或M20抗体通过独特的分子机制表现出抗肿瘤生长作用。用在未经处理(NT)的小鼠中得到的肿瘤和经mD-A10、M20或用mD-D6处理的小鼠中得到的肿瘤分析了表明细胞凋亡效率的胱天蛋白酶3的激活。在该试验中分析的肿瘤是与图7对应的试验中得到和分析的那些肿瘤。在处理结束时(53天)，收集肿瘤、用缓冲福尔马林固定并用石蜡包埋。组织切片经历用兔克隆抗切割胱天蛋白酶3抗体进行免疫组织化学分析(图6B)。对于每种肿瘤，在2mm2的表面上计数胱天蛋白酶3激活的阳性细胞的数量。如图6A中所示，在用mD-A10Mab处理的动物的肿瘤中胱天蛋白酶3激活的阳性细胞的数量显著高于未经处理的动物或用M20或mD-D6处理的动物。
该结果清楚地表明，mD-A10Mab能够在体内诱导与Isreco-1细胞凋亡有关的胱天蛋白酶3裂解，而M20和mD-D6没有表现出该能力。这些结果证实了M20和mD-A10Mab通过极其独特的机制表现出了它们的抗肿瘤生长的作用。mD-A10Mab的作用模式依赖胱天蛋白酶3裂解细胞凋亡诱导。在M20的存在下没有观察到类似的作用。
因此，在一些方面，本发明涉及对胱天蛋白酶3依赖性细胞凋亡表现出特异性激动活性和对细胞侵袭表现出特异性拮抗活性的抗体或抗体片段。因此，其可以用于治疗涉及到CK8的疾病。
虽然mD-A10Mab和M20都识别人CK8蛋白且具有拮抗性能，但是已经示出了mD-A10Mab和M20不识别相同的表位(图2、图3、图12).事实上，M20特异性地识别具有与人CK8的第338至366位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：1)或者与人CK8的第345至366位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：17)的肽，但是并不检测具有与人CK8蛋白的第338至357位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：2)或者与人CK8蛋白的第358至366位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：3)或者与人CK8蛋白的第354至366位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：4)的肽，而mD-A10既识别具有与人CK8的第338至366位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：1)的肽，也识别具有与人CK8的第354至366位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：4)的肽或具有与人CK8的第345至366位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：17)的肽，而不检测具有与人CK8的第338至357位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：2)或者与人CK8的第358至366位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：3)的肽(图12)。
此外，通过抗体M20使用流式细胞术(图2)或蛋白质印迹(图3)对人CK8蛋白同种型的检测既不受具有与人CK8的第338至366位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：1)的肽抑制，也不受具有与人CK8的第338至357位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：2)的肽的抑制，而通过mD-A10Mab进行的人CK8同种型的检测受到具有根据SEQ ID NO：1的序列的肽的强烈抑制，但是不受具有根据SEQ ID NO：2的序列的肽的抑制，且Mab D-D6的检测受到具有根据SEQID NO：1的序列的肽和具有根据SEQ ID NO：2的序列的肽二者的抑制。
图11给出了肽1(SEQ ID NO：1)、肽2(SEQ ID NO：2)、肽3(SEQ ID NO：3)和肽4(SEQID NO：4)在人细胞角蛋白8序列中的定位(参比：Uni-ProtKB P05787)。
图13A描述了mD-A10Mab对在N末端和C末端界定的抗CK8肽(肽1、肽5-28，SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：28)的反应性。mD-A10Mab结合至肽1、5、11至23。肽11的第353位的亮氨酸对抗体的识别是必需的。事实上，与mD-A10Mab和肽11的结合相比，mD-A10Mab和肽10的结合几乎被取消了。肽23的第360位的亮氨酸对抗体的识别是必需的。事实上，与mD-A10Mab和肽23的结合相比，mD-A10Mab和肽24的结合几乎被取消了。亮氨酸在表位序列的第353和360位的关键存在通过在分别用BSA缀合肽1或肽17进行竞争时使用ELISA技术对通过mD-A10Mab识别的肽10(SEQ ID NO：10)和肽24(SEQ ID NO：24)几乎无竞争(图14和图15)得到了证实。因此，将由mD-A10Mab识别的表位设计为与第353位至第360位氨基酸对应的8-氨基酸序列“LSELEAAL”(SEQ ID NO：29)。如图13B所示，观察到了与mD-A10Mab相比不同的M20概况。相比之下，明显地，抗体M20没有识别表位“LSELEAAL”。
表8给出了氨基酸序列集和mD-A10Mab对肽5至肽28(SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：28)的识别或低识别或没有识别。
本发明还涉及特异性结合至具有与人CK8蛋白的第353位至第360位氨基酸对应的序列的肽(即特异性地结合至具有SEQ ID NO：29所示的序列的肽)的抗体或抗体片段，用于治疗其细胞在该细胞的表面表达CK8蛋白的肿瘤，特别是其细胞在该细胞的表面表达根据SEQ ID NO：29的序列的肽的肿瘤。所述抗体或抗体片段可以为如上所述的抗体或抗体片段。
特别地，本发明的抗体或抗体片段可用于治疗结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睾丸癌、胰腺癌、神经系统癌、淋巴结癌、肾癌和/或头颈癌。结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睾丸癌、胰腺癌、神经系统癌、淋巴结癌、肾癌和/或头颈癌的特征在于存在在其表面表达CK8蛋白的肿瘤细胞。特别地，本发明的抗体或抗体片段可用于治疗侵袭性和/或转移性结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睾丸癌、胰腺癌、神经系统癌、淋巴结癌、肾癌和/或头颈癌。
优选地，治疗所使用的抗体或抗体片段为人源化抗体。
肽及其用途
本发明还涉及人CK8抗原肽，其由具有8至16个氨基酸的多肽组成并且包含SEQ IDNo.29的序列。特别地，本发明涉及由根据SEQ ID No.29的序列组成的人CK8抗原肽。
这样的肽可以用作治疗剂，特别是用在疫苗中。
本发明还涉及一种试剂盒，其包括含有特异性结合至所述肽的分子的容器。所述试剂盒可特别地用于检测癌症，特别是以存在在其表面表达CK8蛋白的肿瘤细胞为特征的癌症，如上述那些癌症。
多核苷酸
本发明还涉及编码源自具有与人CK8蛋白的第353位至第360位氨基酸对应的序列(SEQ ID NO：29)的人CK8的肽的多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸为DNA型的多核苷酸，特别是双链DNA型的多核苷酸。术语“多核苷酸”也指修饰的多核苷酸。
本发明的多核苷酸从它们的天然环境分离或纯化出来。优选地，本发明的多核苷酸可以通过由Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989)描述的常规分子生物学技术或通过化学合成来制备。
本发明还涉及编码mD-A10Mab的可变区的多核苷酸，所述多核苷酸具有鼠源轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)和鼠源重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：32)。因此，本发明还涉及包含如下序列中的一种的多核苷酸：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32，或与序列SEQ ID No.30或SEQ ID No.32最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列。
本发明还涉及编码Hz D-A10Mab的可变区的多核苷酸，所述多核苷酸具有人源化轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)和人源化重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：45)。因此，本发明还涉及包含如下序列中的一种的多核苷酸：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46，或与序列SEQ ID No.45或SEQ ID No.46最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的序列。
药物组合物
本发明还涉及一种药物组合物或试剂盒，其包含本发明的抗体或抗体片段。所述抗体或抗体片段可以为如上所述的抗体或抗体片。特别地，抗体或抗体片段为Fv、Fab、F(ab’)2、scFv，抗体，优选为单克隆抗体。
药物组合物可以包含抗体或抗体片段和合适的药物载体。合适的药物载体的实例包括溶剂、明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯树胶或类似物。所述组合物可进一步包含分散剂、润湿剂、悬浮剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、增味剂和/或甜味剂。
试剂盒可以包括含有本发明的抗体或抗体片段的容器。
试剂盒可特别地用于检测癌症，特别是以存在在其表面表达CK8蛋白的肿瘤细胞为特征的癌症，如上面所述的癌症。
所述组合物可以配制为用于给药至哺乳动物，特别是人。它们可以配制为用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、透皮、局部或直肠给药。因此，可以根据所需的给药方式提供所有合适形式的组合物。因此，它们可以口服或可注射溶液或液体悬浮液形式，或者固体或半固体形式、粉末、片剂、软胶囊、颗粒剂、糖衣片剂、硬胶囊、喷雾剂、扁囊剂、丸剂、棒剂或膏剂的形式提供。剂型随治疗和关注的疾病而变化。
所述组合物或试剂盒可进一步包括另一种抗体和/或另一种抗癌药物。
本发明还涉及本发明的药物组合物在治疗或预防癌症、自身免疫病、炎性病症、病毒感染或病毒病中的用途和/或作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物的用途。
本发明还涉及一种用于治疗或预防癌症、自身免疫病、炎性病症、病毒感染或病毒病的方法，和/或一种用于诱导肿瘤细胞凋亡的方法，包括向哺乳动物(包括人)施用有效量的根据本发明的抗体或抗体片段。
所述癌症的特征特别地在于存在在其表面表达CK8蛋白的肿瘤细胞，如上面描述的那些癌症。
本发明还涉及包括根据本发明的肽和合适的佐剂的疫苗组合物。在疫苗中，佐剂通常定义为能够增效或调节针对一种或多种同时施用的抗原的免疫应答的物质。通常注射疫苗，但是也可以通过口服或鼻喷来施用。
本发明涉及药物或疫苗组合物，用于预防和/或治疗其细胞在该细胞的表面表达CK8蛋白的肿瘤，特别是结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睾丸癌、胰腺癌、神经系统癌、淋巴结癌、肾癌和/或头颈癌。
本发明还涉及用于治疗性治疗和/或预防其细胞在该细胞的表面表达CK8蛋白的肿瘤的方法，特别是治疗性治疗和/或预防结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睾丸癌、胰腺癌、神经系统癌、淋巴结癌、肾癌和/或头颈癌的方法，包括向有需要的个体施用有效量的根据本发明的抗体或抗体片段。本发明涉及通过诱导表达CK8的癌细胞死亡来治疗癌症的方法，特别是通过诱导表达CK8的癌细胞的细胞凋亡来治疗癌症的方法，该诱导是通过向有需要的个体施用有效量的根据本发明的抗体或抗体片段来进行的。所述抗体或抗体片段可以为如上所述的抗体或抗体片段。
本发明涉及根据本发明的抗体或抗体片段在用于制备用于治疗或预防其细胞在该细胞的表面表达CK8蛋白的肿瘤的药物中的用途，特别是结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睾丸癌、胰腺癌、神经系统癌、淋巴结癌、肾癌和/或头颈癌。
实施例
下文所称的M20抗体是可商购获得的抗体C5301(Sigma公司)，1E8抗体是可商购获得的抗体ab28050(abcam公司)。
抗CK8抗体的制备
使用标准的杂交瘤技术(Zola等人，Aust J.Exp Biol Med Sci.1981；59：303-6)制备对CK8特异性的鼠源单克隆抗体。合成了两种不同的CK8相关肽，用于小鼠免疫。肽序列如下：
肽1：AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C(SEQ ID NO：1)
肽2：AEQRGELAIKDANAKLSELE-C(SEQ ID NO：2)
用与KLH偶联的肽1和肽2的混合物对三只OF1小鼠进行免疫。选择通过CK8相关ELISA检测到的血清为阳性的小鼠的脾脏。使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系X63-Ag8.653融合。通过ELISA和通过对CK8阳性细胞系进行的免疫荧光细胞染色来筛选用于CK8结合的杂交瘤上清液。在杂交瘤克隆后，得到称为mD-A10和mD-D6的两种鼠源Mab。将D-A10或D-D6克隆注射到裸鼠的腹膜内。在蛋白质A柱上通过亲和层析纯化腹水，然后在酸性pH下洗脱IgG，然后转移到PBS中。在浓缩后，将含有IgG的PBS溶液过滤，确定280nm处的Mab浓度。
细胞系
使已建立的人结肠癌(CC)Isreco-1、Isreco-2、Isreco-3、HCT116+/+、HCT116-/-或HT29(CLB)在补充有10％的热灭活的胎牛血清(FBS)(Sigma，伊泽尔省(St QuentinFallavier)，法国)、4nM L-谷氨酰胺(Sigma，伊泽尔省，法国)和50U/mL、50μg/mL的青霉素-链霉素(Sigma，伊泽尔省，法国)的达尔伯克改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium)(Sigma，伊泽尔省，法国)中生长。
使已建立的人乳腺癌细胞MCF-7(ATCC)在补充有10％的热灭活的胎牛血清(FBS)(Sigma，伊泽尔省，法国)、2nM L-谷氨酰胺(Sigma，伊泽尔省，法国)和100U/mL，100μg/mL的青霉素-链霉素(Sigma，伊泽尔省，法国)的极限必需培养基Eagle(Minimum EssentialMedium Eagle)(Sigma，伊泽尔省，法国)中生长。
使已建立的人B-前体细胞Nalm-6(DSMZ)、伯基特人淋巴瘤细胞Raji(ECACC)、非霍奇金淋巴瘤人RL(DSMZ)、组织细胞性淋巴瘤U937(ECACC)的白血病细胞、人急性淋巴母细胞性白血病细胞Cem(DSMZ)、已建立的人急性淋巴母细胞性白血病细胞Molt4(DSMZ)、人浆细胞Fravel(ECACC)在RPMI-1640培养基(Sigma，伊泽尔省，法国)中生长，其中所述RPMI-1640培养基补充有10％的热灭活的胎牛血清(FBS)(Sigma，伊泽尔省，法国)、4nM L-谷氨酰胺(Sigma，伊泽尔省，法国)和100U/mL，100μg/mL的青霉素-链霉素(Sigma，伊泽尔省，法国)。
通过流式细胞术分析的抗体细胞标记
通过流式细胞术分析细胞表面的CK8细胞表达。简言之，用10μg/mL的未缀合的抗CK8鼠源Mab按1∶10稀释后的稀释液孵育2×105个细胞/96-孔。用补充有1％的牛血清蛋白(Sigma，伊泽尔省，法国)的PBS(Invitrogen，维勒邦叙尔伊沃特，法国)洗掉未结合的抗体。随后，离心细胞(以400g，5分钟)，并用异硫氰酸荧光素缀合的山羊(Fab’)2多克隆抗小鼠(MP医疗公司，伊利柯克奇(Illkirch)，法国)在4℃下于30分钟内检测结合的抗体。洗掉检测试剂，离心细胞(以400g，5分钟)，并使细胞悬于300μL的PBS中。在FACS CAN(BD生物科学公司(BD Biosciences)，伦吉斯(Rungis)，法国)上对结合的检测抗体定量(FL1通道，每次采集2000个事件)。
表5中示出了用浓度为5μg/mL的Mab进行的试验的结果。各种癌细胞系如结肠细胞系或乳腺细胞系表达CK8。在淋巴瘤或白血病的细胞中没有观察到表达。
表5：对人细胞系的Mab细胞反应性
对于mAb竞争性结合的流式细胞术试验
用生物素化的抗体抗CK8(12.5μg/mL)在存在或不存在在不同浓度下测试的肽1或肽2的情况下孵育2×105个Isreco-1细胞/96-孔，并在4℃下孵育30分钟。用补充有1％的牛血清蛋白(Sigma，伊泽尔省，法国)的PBS(Invitrogen，维勒邦叙尔伊沃特(Villebon surYvette)，法国)洗掉未结合的抗体。随后，离心细胞(以400g，5分钟)，并用藻红蛋白缀合的链霉亲和素(Interchim，蒙吕松(Montlucon)，法国)在4℃下于30分钟内检测结合抗体。洗掉检测试剂，离心细胞(以400g，5分钟)，并使细胞悬于300μL的PBS中。在FACS CAN(BDBiosciences，伦吉斯(Rungis)，法国)上对结合的检测抗体定量(FL2通道，每次采集2000个事件)。在试验期间，包括相应的同种型对照以排除任何非特异性结合事件。试验结果在图2中示出。肽1的存在抑制了用mD-D6或mD-A10Mab的细胞标记，而对M20Mab细胞染色没有任何影响。
通过蛋白质印迹法检测CK8蛋白的同种型
表6示出了不同同种型以及它们的估计分子量(kDa)和它们的对应的氨基酸序列。
表6：不同CK8同种型的说明
E：CK8整个形式，I：不确定的CK8同种型，C：C端的CK8截短的同种型
在蛋白质印迹法试验(WB)中，通过SDS-PAGE从Isreco-1结肠直肠癌细胞的溶解产物中分离出5微克的蛋白，并转移到硝化纤维素膜上。用包含5％的乳的TBS-T(Tris-HCl20mM pH 7、NaCl 130mM、0.1％的吐温20)溶液使膜饱和，然后用以含有2.5％的乳的TBS-T溶液稀释的各种抗CK8抗体孵育。在室温下用膜孵育M20(50μg/mL)、1E8(1/500)、mD-A10(1μg/mL)或mD-D6(1μg/mL)1小时。用与过氧化物酶(HRP)(ab97040)(Abcam，法国)偶联的抗小鼠二级抗体揭示一级抗体。结果在图1中示出。根据所测试的抗体抗CK8不同地检测CK8蛋白的同种型。全长形式的CK8蛋白(CK8-E)通过所有抗体检测。C-末端截短形式的CK8蛋白(CK8-C)只通过mD-A10抗体被强烈地检测到，而通过M20被弱地检测到。1E8或mD-D6Mab没有识别CK8-C形式。这些结果清楚地证实了，mD-A10Mab与测试的其它抗体抗CK8相比，对不同的CK8同种型表现出了特异性反应性特征(profile)。
用CK8肽进行的蛋白质印迹竞争测定
对于竞争试验，在室温下，在TBS-T溶液中以1/100的分子比(1个抗体分子/100个肽分子)用肽1或肽2预孵育抗体M20(1μg/mL)或鼠源单克隆抗体，如mD-A10(1μg/mL)或mD-D6(1μg/mL)。然后，使抗体-肽混合物与在含有2.5％的乳的TBS-T溶液中的膜接触1小时，用于通过与HRP偶联的抗小鼠二级抗体来进行揭示。结果在图3中示出。肽2的存在降低了mD-D6Mab对所有CK8同种型的识别，而不干扰抗体M20和mD-A10Mab对CK8同种型的识别。相反地，肽1的存在强烈地降低了mD-A10Mab和mD-D6Mab对所有CK8同种型的识别，而它不干扰抗体M20对CK8同种型的识别。
鼠源单克隆抗体D-A10对结肠直肠癌Isreco-1细胞的侵袭能力的影响：通过实时
测量细胞阻抗(xCELLigence-ACEA BiosciencesTM系统)对癌细胞侵袭能力的细胞内(in
cellulo)分析
实时测量仪器xCELLigence(ACEA BiosciencesTM)以与微电极上的细胞固定成比例的阻抗值为基础。用于评价细胞的侵袭能力的系统为RTCA DP系统。该系统使用包含16个孔的CIM板。孔由上下室形成。上室与下室通过微电极上方的8μM直径小孔连通。在评价Isreco-1侵袭能力时，下室含有补充有10％的胎牛血清(FBS)的培养基。将存在不含FBS的培养基的Isreco-1细胞(20000个细胞)置于存在或不存在抗CK8抗体(50μg/mL的M20、mD-A10或mD-D6)的上室中。该上室预先在其底部覆盖有一层基质胶(matrigel)(matrigelTM，BDbiosciences)。在侵袭过程中，细胞受上下室之间已建立的FBS梯度的吸引，降低基质胶以使它们迁移穿过小孔，并接触下室的微电极。由细胞接触产生的阻抗测量值在70小时内每15分钟测量一次，并由与RTCA DP系统连接的计算机记录。图4呈现了细胞侵袭能力的结果。用与3个独立试验对应的标准偏差表示Isreco-1侵袭能力的抑制百分比。在存在抗体M20或mD-A10的情况下观察到了对FBS引起的Isreco-1细胞的侵袭能力的显著抑制，而在存在mD-D6的情况下没有观察到任何影响。
ATP水平确定后的细胞生活力分析
使用
荧光细胞生活力测定(Promega，沙尔本涅尔雷班(Charbonnières les Bains)，法国)用于基于存在的ATP(代谢活跃细胞的指示物)的定量来确定培养物中活细胞的数量。检测是基于使用萤光素酶反应，来测量活细胞的ATP的量。在膜完整性丧失后的数分钟内，细胞失去合成ATP的能力，内源ATP酶破坏剩下的任何ATP；因此，ATP水平急剧下降。将细胞培养物(5×104个细胞/mL)单独或在抗体(B-Z1、B-E4、M20、1E8、D-D6、D-A10)的存在下孵育72小时，在浓度为10μg/ml下测试，然后按1/10稀释(图5)。同种型对照Mab(IgG1-B-Z1、IgG2a-B-E4)是由Diaclone购买的(Besancon，法国)。将
试剂以50μL试剂：200μL培养基的比直接加入到培养中的细胞中。将测定板在室温下孵育10分钟，并使用标准的多孔荧光计Mithras LB940(Berthold，图瓦里(Thoiry)，法国)记录生物发光信号。结果在图5中示出。只有Mab 1E8抗CK8抑制Isreco-1细胞增殖。
通过免疫组织化学染色法对Isreco-1异种移植瘤中的胱天蛋白酶3激活的阳性细
胞累积的定量
从用Mab以30mg/kg处理或未处理的小鼠的Isreco-1异种移植瘤中分离组织。评价抗体M20、mD-A10或mD-D6诱导胱天蛋白酶3激活的效能。对于染色，将组织样品用10％的缓冲福尔马林固定，并用石蜡包埋。根据常规程序制备经福尔马林固定并用石蜡包埋的4μm厚的组织切片。根据制造商的指示使用DABmap试剂盒在自动化的免疫染色器(VentanaDiscovery XT，罗氏(Roche)，梅朗(Meylan)，法国)上进行免疫组织化学。在用细胞前处理清洗缓冲液(Cell Conditioning 1)(CC1)恢复程序后，用兔单克隆抗裂解的胱天蛋白酶3抗体(按1∶200稀释，克隆5A1E，细胞信号传导)孵育切片。用含有3，3′-二氨基联苯胺的DAB溶液作为显示底物对染色可视化。最后，用Gill’s苏木精对切片进行复染。在显微镜可视化后通过与照相机连接的Histolab软件进行每mm2中胱天蛋白酶3激活的阳性细胞的数量的定量。对于每种肿瘤，在2mm2的表面上实现对胱天蛋白酶3激活的阳性细胞的数量的计数。将肿瘤和纤维囊的坏死区域排除在分析之外。图6A给出了激活的胱天蛋白酶3的定量结果。用与每组三只小鼠对应的标准偏差表示胱天蛋白酶3激活的阳性细胞的数量。在图6B中，示出了从未经处理的动物和用mD-A10Mab、M20和mD-D6Mab处理的动物得到的厚组织切片的免疫组织化学分析的实例。如图6A中所示，与未经处理的动物相比，用mD-A10Mab处理的动物的肿瘤中胱天蛋白酶3激活的阳性细胞的数量显著更高。在用M20或用mD-D6Mab处理的动物中没有观察到显著影响。该结果清楚地表明，mD-A10Mab能够在体内诱导与Isreco-1细胞的胱天蛋白酶3激活有关的细胞凋亡，而M20或mD-D6Mab没有引起胱天蛋白酶裂解。这些结果证实了M20和mD-A10通过极其独特的机制表现出它们抗肿瘤生长的作用。mD-A10Mab被定义为与胱天蛋白酶3引起的细胞凋亡诱导有关的激动性Mab，而M20Mab与该途径无关。
抗体抗CK8对小鼠皮下植入的Isreco-1结肠直肠癌细胞的肿瘤生长的作用
在12只SCID CB17小鼠皮下注射Isreco-1细胞(10×106个)。15天后，肿瘤体积达到100～150mm3。此时，将小鼠分成4组，每组三只。每组接受或不接受在肿瘤的相对部位处进行的覆膜内注射的特定处理。在4周期间一周一次(第15、22、29和36天)，小鼠接受或不接受抗体M20、mD-A10Mab或mD-D6的30mg/kg的注射(图7)。对于每只小鼠，在整个试验过程中每周测试肿瘤体积两次。每组小鼠的肿瘤体积的平均值在图上用与每组三只小鼠对应的标准偏差表示。如图7所示，抗体M20或mD-A10抑制小鼠皮下植入的Isreco-1结肠直肠癌细胞的生长，而mD-D6不控制肿瘤发展。
mD-A10Mab对小鼠皮下植入的Isreco-1结肠直肠癌细胞的肿瘤生长的剂量依赖性
作用
向18只SCID CB17小鼠皮下植入得自结肠直肠癌细胞Isreco-1的肿瘤Isreco-1片段。15天后，肿瘤体积达到100～150mm3。此时，将小鼠分成6组，每组三只。每组接受或不接受在肿瘤的相对部位处进行的覆膜内注射的特定处理。在4周期间一周一次(第15、22、29和36天)，小鼠接受或不接受注射1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或60mg/kg的mD-A10Mab。对于每只小鼠，在整个试验过程中每周测试肿瘤体积两次。每组小鼠的平均肿瘤体积在图上用与每组三只小鼠对应的标准偏差表示。结果在图8中给出。甚至在1mg/kg的最低Mab浓度下观察到了对小鼠皮下植入的Isreco-1结肠直肠癌细胞生长的抑制。
mD-A10Mab对小鼠皮下植入的HCT116结肠直肠癌细胞的肿瘤生长的作用
向12只SCID CB17小鼠皮下注射HCT116细胞(10×106个)。6天后，肿瘤体积达到100～150mm3。此时，将小鼠分成4组，每组三只。每组接受或不接受在肿瘤的相对部位处进行的覆膜内注射的特定处理。在3周期间一周一次(第6、13和20天)，小鼠接受或不接受注射30mg/kg的抗体抗CK8(M20、mD-A10Mab或mD-D6)。对于每只小鼠，在整个试验过程中每周测试肿瘤体积两次。每组小鼠的平均体积在图上用与每组三只小鼠相等的标准偏差表示。如图7所示，与抗体M20相比，mD-A10在最高水平下抑制小鼠皮下植入的Isreco-1结肠直肠癌细胞的生长，而mD-D6不控制肿瘤发展。
mD-A10Mab的浓度对小鼠皮下植入的HCT116结肠直肠癌细胞的肿瘤生长的剂量依
赖性作用
向18只SCID CB17小鼠皮下注射HCT1161细胞(10×106)。10天后，肿瘤体积达到100～150mm3。此时，将小鼠分成6组，每组三只。每组接受或不接受在肿瘤的相对部位处进行的覆膜内注射的特定处理。在3周期间一周一次(第10、17和24天)，小鼠接受或不接受注射1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或60mg/kg的mD-A10Mab。对于每只小鼠，在整个试验过程中每周测试肿瘤体积两次。每组小鼠的平均体积在图上用与每组三只小鼠相等的标准偏差表示。结果在图10中示出。
由mD-A10Mab制备人源化Mab抗CK8衍生物
将编码抗体的DNA分离出来并使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码鼠源抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)测序。杂交瘤细胞用作这样的DNA的优选来源。
鼠源Mab向天然嵌合Mab的转化
使用两种方法得到与来自杂交瘤的可变区对应的cDNA。第一种方法在于在PCR中使用由于N末端测序产生的退化的N-末端氨基酸有关的引物组。第二种方法在于在PCR中使用由
引物数据库产生的退化的引物组和前述的特定引物(Essono等人，J ImmunolMethods.2003；203：279：25-66，Wang等人，Mol Immunol.1991；28：1387-97)。通过埃德曼(Edman)降解法确定N-末端可变区的序列。根据供应商Sigma描述的方案使用Tri试剂盒进行总RNA提取。将扩增的VL和VH片段克隆到TOPO-TA克隆载体(Invitrogen)中，用于通过双脱氧终止法进行序列分析(Sanger等人.，Nature.1977；265：687-95)。然后，通过PCR扩增抗体变体构建体，并克隆到表达载体中。
根据
指数和共同编号系统(Common Numbering Systems)(具有不同特异性的抗体中相同的V区氨基酸序列和序列片段)对位置编号。分析VH和VL基因、小基因和互补性决定区对抗体结合位点的结合的相对贡献(Kabat等人.，NIH Publ.1991；No.91-3242，Vol.1，647-669)。
关于嵌合D-A10Mab的核酸序列或氨基酸序列在序列表中示出：
-mD-A10Mab的可变鼠源轻链的核苷酸序列(SEQ ID N0：30)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID N0：31)。
-mD-A10Mab的可变鼠源重链的核苷酸序列(SEQ ID N0：32)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID N0：33)。
-chD-A10Mab的恒定人重链的核苷酸序列(SEQ ID N0：48)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID N0：47)。
-chD-A10Mab的恒定人轻链的核苷酸序列(SEQ ID N0：50)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID N0：49)。
已经根据各种编号方法如IMGT(ImMunoGeneTics Information
http：//imgt.cines.fr)、Kabat或共同编号系统确定了抗体的CDR区和FR区。然而，给定抗体的IMGT确定的CDR不一定与其它编号系统定义的CDR相同。感谢IMGT编号系统，发明人已经鉴定了可变域CDR区和骨架区。
嵌合Mab向人源化Mab的转化
通过PCR方法使用CDR-移植法产生人源化H和L链。为了产生小鼠单克隆抗体的CDR移植到人抗体上的人源化抗体，优选在小鼠单克隆抗体的可变区与人抗体的可变区之间得到高同源性。因此，使用软件IMGT/DomainGapAlign比较小鼠抗人CK8单克隆抗体的H链V区和L链V区与所有已知的人抗体的V区。根据需要，当通过常规技术使小鼠抗体人源化时，可将小鼠抗体的支持CDR的V区FR中的一些的氨基酸序列移植到人V区的FR上。
对于人源化的H链和L链V区二者，可以分别选择与mD-A10的H和L链V区和J区具有高同源性的L和H链V区(IGKV2-28*01，IGHV13-74*01)和J区(IGKJ2*01，IGHJ4*01)。Hz D-A10的H和L的可变区通过PCR扩增，并克隆到包含人IgG1恒定区的表达载体p3U中。
在鼠源CDR移植的抗体的情况下，通过只移植人抗体中的CDR的氨基酸序列降低结合活性。为了避免这种降低，在人抗体和小鼠抗体之间不同的FR中的氨基酸残基中，被认为对结合活性有影响的氨基酸残基与CDR的氨基酸序列一起移植。因此，在本实施例中也尝试了鉴定FR中被认为对结合活性有影响的氨基酸残基。
在表3中示出了在SDR移植后，Hz D-A10Mab的VH和VL的CDR序列。
通过ELISA确定的对CK8肽的Mab反应性
将与牛血清蛋白(BSA)在C-末端半胱氨酸的SH基团上偶联或不偶联的CK8肽固定于96孔板的孔底部(分别为0.5μg/ml或1μg/ml)，在室温下过夜。用补充有吐温(Sigma，伊泽尔省，法国)的纯化水洗掉未结合的肽。然后，在室温(RT)下，用包含5％的BSA的盐水磷酸盐缓冲液(PBS)使孔饱和，保持2小时。然后，用补充有吐温的纯化水冲洗板。在室温下在补充有1％牛血清蛋白(Sigma，伊泽尔省，法国)的PBS(Invitrogen，维勒邦叙尔伊沃特(Villebon sur Yvette)，法国)中孵育2小时后，测试不同Mab浓度下结合至包被肽的Mab。用补充有吐温的纯化水洗掉未结合的Mab。然后，通过与辣根过氧化物酶(HRP)(Biorad，法国)偶联的山羊抗小鼠IgG二级抗体揭示结合的Mab。读取450nm处的吸光度，并在630nm处校正。下面详细描述不同试验的具体要求。
对不同人CK8肽1(SEQ ID No.1)、2(SEQ ID No.2)、3(SEQ ID No.3)、4(SEQ ID
No.4)和17(SEQ ID No.17)的Mab反应性
通过添加C-末端半胱氨酸修饰的人CK8的肽1、2、3或4与BSA在C-末端半胱氨酸的SH基团处偶联，并固定于96孔板的底部。包含483个氨基酸(aa)的完整人CK8序列(参比：Uni-ProtKB P05787)在图11中示出。肽1、2、3和4的序列的位置在人CK8序列上通过灰黑箭头指明：
肽1(SEQ ID No.1)：AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C(aa 338-aa 366)
肽2(SEQ ID No.2)：AEQRGELAIKDANAKLSELE-C(aa 338-aa 357)
肽3(SEQ ID No.3)：AALQRAKQD-C(aa 358-aa 366)
肽4(SEQ ID No.4)：SELEAALQRAKQD-C(aa 354-aa 366)
肽17(SEQ ID No.17)：C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD(aa 345-aa 366)
用肽1、肽2、肽3、肽4或肽17中任一种在室温下孵育不同Mab浓度(从10μg/mL开始，然后按1/10稀释)2小时。读取450nm处的光密度值(OD)，并在630nm处校正。结果在图12中示出，并总结在下表7中。这些结果清楚地证实了与M20抗体相比不同的mD-A10反应性特征。
表7：与包被BSA缀合肽1至肽4和肽17的Mab反应性
识别或不识别包被BSA缀合肽1、2、3、4或17的Mab反应性的水平分别用标记如+++(强)、++(中等)、+(弱)或-(无)来表示。
对不同的包被来缀合的人CK8相关肽1、5至28(SEQ ID No 1、SEQ ID No 5至SEQ
ID No 28)的Mab反应性
将人CK8的未缀合的肽1、5至28固定于96-孔板的底部(2μg/ml)。在室温下单独或与测试的每种肽一起孵育不同的Mab浓度(从10μg/mL开始，然后以1/10稀释)2小时。读取450nm处的光密度值(OD)，并在630nm处校正。结果在图13A(与mD-A10有关)中或在图13B(与M20有关)上示出。对比分析总结在下表8中。这些结果清楚地证实了与M20抗体相比对测试的一系列肽的不同的mD-A10反应性特征。
表8：与不同包被未缀合肽的Mab反应性
识别或不识别包被未缀合肽的Mab反应性水平分别用标记如+++(强)、++(中等)、+(弱)或-(无)来表示。
游离肽1、5至28(SEQ ID No 1、SEQ ID No 5至SEQ ID No 28)对mD-A10Mab识别包
被BSA缀合肽1或17的影响
在设定mD-A10Mab与不同CK8肽的竞争测定时，将肽-抗体混合物孵育30分钟，然后在肽的存在下加入以检测肽在孔底部的固定。在肽1、5至28(SEQ ID No 1、SEQ ID No 5至SEQ ID No 28)的存在下加入mD-A10Mab，用于识别BSA缀合肽1(SEQ ID No 1)，或者用于识别BSA缀合肽17(SEQ ID No 17)。
通过在C-末端位置插入半胱氨酸修饰的人CK8的肽1与BSA在其C-末端半胱氨酸的SH基团处偶联，并固定于96孔板的底部。在不同浓度(10、1、0.1或0.01μg/mL)的肽1、5至28的存在下，将浓度为1ng/mL的鼠源单克隆抗体D-A10孵育30分钟。然后，添加肽-抗体混合物或只添加抗体，并与包被BSA缀合肽1或与包被BSA缀合肽17在室温下保持2小时，并用于通过ELISA进行检测。读取450nm处的光密度值(OD)，并在630nm下校正。图14示出与包被BSA缀合肽1的结果，或者图15示出与包被BSA缀合肽17的结果。
Claims (11)
1.一种抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合具有SEQID No.29的氨基酸序列的肽，所述抗体包括：
-重链，其包括分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的三个CDR，其中：
CDR-H1的序列为SEQ ID No.37；和
CDR-H2的序列为SEQ ID No.38；和
CDR-H3的序列为SEQ ID No.39；以及
-轻链，其包括分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的三个CDR，其中：
CDR-L1的序列为SEQ ID No.34；和
CDR-L2的序列为SEQ ID No.35；和
CDR-L3的序列为SEQ ID No.36。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为人源化抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包含如下序列：SEQID No.31；和SEQ ID No.33。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括由多核苷酸编码的可变区，所述多核苷酸具有：鼠源轻链可变区的核苷酸序列SEQ IDNO.30；和鼠源重链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO.32。
6.一种人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合具有SEQ ID No.29的氨基酸序列的肽，所述抗体包括：
-重链，其包括分别为CDR-H1’、CDR-H2’和CDR-H3’的三个CDR，其中：
CDR-H1’的序列为SEQ ID No.40；和
CDR-H2’的序列为SEQ ID No.41；和
CDR-H3’的序列为SEQ ID No.39；以及
-轻链，其包括分别为CDR-L1’、CDR-L2’和CDR-L3’的三个CDR，其中：
CDR-L1’的序列为SEQ ID No.42；和
CDR-L2’的序列为SEQ ID No.35；和
CDR-L3’的序列为SEQ ID No.36。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗结肠直肠癌的药物中的用途，所述结肠直肠癌的细胞在该细胞的表面表达CK8蛋白。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述结肠直肠癌是侵袭性结肠直肠癌。
9.一种药物组合物，包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和合适的药物载体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段为Fv、Fab、F(ab’)2、scFv、单克隆抗体。
11.一种诊断用试剂盒，包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
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