FR3024731B1 - Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers - Google Patents
Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers Download PDFInfo
- Publication number
- FR3024731B1 FR3024731B1 FR1457704A FR1457704A FR3024731B1 FR 3024731 B1 FR3024731 B1 FR 3024731B1 FR 1457704 A FR1457704 A FR 1457704A FR 1457704 A FR1457704 A FR 1457704A FR 3024731 B1 FR3024731 B1 FR 3024731B1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- peptide
- antibodies
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 144
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 15
- 102100023972 Keratin, type II cytoskeletal 8 Human genes 0.000 claims description 87
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 65
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 20
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 6
- 101000975496 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 8 Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 claims 1
- 108010070511 Keratin-8 Proteins 0.000 abstract description 86
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 102000005712 Keratin-8 Human genes 0.000 abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 81
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 34
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 12
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 11
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 4
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 3
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 3
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101000699762 Homo sapiens RNA 3'-terminal phosphate cyclase Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 102100029143 RNA 3'-terminal phosphate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000043139 CK2 family Human genes 0.000 description 1
- 108091054872 CK2 family Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000975474 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 10 Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102100023970 Keratin, type I cytoskeletal 10 Human genes 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001421711 Mithras Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000011795 OF1 mouse Methods 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000978776 Senegalia senegal Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- -1 cachets Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 201000006845 reticulosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029922 reticulum cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4741—Keratin; Cytokeratin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3015—Breast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3046—Stomach, Intestines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3061—Blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2410/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving peptides of less than 20 animo acids
Abstract
La présente invention concerne un anticorps, ou fragment d'anticorps, liant spécifiquement le peptide ayant la séquence selon SEQ ID No. 29 ou un peptide présentant au moins 60% d'homologie avec le peptide ayant la séquence selon SEQ ID No. 29, pouvant être utilisés à des fins thérapeutiques, en particulier pouvant être utiles dans le traitement des cancers exprimant la cytokératine 8 (CK8).
Description
ANTICORPS ANTI-CK8 POUR UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DES CANCERS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine des anticorps pouvant être utilisés à des fins thérapeutiques. En particulier, la présente invention concerne un anticorps anti cytokératine 8. Ces anticorps s’avèrent être utiles dans le traitement des cancers exprimant la cytokératine 8 (CK8), en particulier des cancers colorectaux.
ARRIERE PLAN DE L'INVENTION
La cytokératine 8 (CK8) est une protéine qui constitue les filaments intermédiaires du cytosquelette des cellules épithéliales.
Différentes études ont montré que la protéine CK8 serait présente à la membrane de différentes cellules cancéreuses. Ainsi, Godfroid et al. (Journal of Cell Science, 99 : 595-607, 1991) ont décrit la présence des protéines CK8 à la surface de cellules de carcinome du sein mis en culture. Hembrough et al. (Journal of Cell Science, 108 :1071-1082, 1995) ont décrit la présence de CK8 ou d’une protéine « CK8 like » à la surface des hépatocytes, des cellules HepG2 et des cellules de carcinomes du sein.
La protéine CK8 a également été détectée à la surface de carcinomes d’autres cancers comme le cancer du tractus digestif supérieur (Gires et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 328 :1154-1162, 2005). Il a également été montré que la protéine CK8 est exposée à la surface des cellules tumorales invasives ou non invasives dans les cancers colorectaux (WO2010/136536). Plus particulièrement, il a été montré que dans les cancers colorectaux, l’apparition de cellules invasives et/ou métastatiques s’accompagne d’un clivage de la protéine CK8 humaine exposée à la surface de ces cellules. La partie N-terminale de la protéine CK8 reste exposée à la surface des cellules d’adénocarcinome colique alors que la partie C-terminale de la protéine disparaît partiellement ou totalement de la surface de ces cellules.
Le cancer colorectal est un cancer particulièrement invasif. Bien que des améliorations significatives ont été obtenues dans le traitement des patients atteints de cancer colorectal métastatique (CRC), ce type de cancer demeure un important problème de santé publique dans le monde entier (Weitz et al Lancet 2005; 365: 153-65). Le CRC est le troisième cancer le plus diagnostiqué chez les deux sexes avec 940 000 cas estimés / an et la deuxième cause de décès par cancer avec environ 500 000 cas / an (Weitz et al Lancet 2005; 365: 153-65). En France, 37 000 nouveaux patients sont diagnostiqués avec un CRC chaque année, dont environ la moitié décédera de la maladie métastatique. Cependant, environ 50% des 36 000 nouveaux patients présentent déjà des métastases au moment du diagnostic ou développeront des métastases (Weitz et aï Lancet 2005; 365: 153-65 ; Cunningham et al Lancet 2010 ; Chevreul Eur J Health Econ 2010).
La mise sur le marché de médicaments plus efficaces (Irinotecan, Oxaliplatin) a permis d’améliorer significativement le traitement des patients atteints de CRC. La dernière décennie a également vu l’émergence de thérapies à base de molécules, les anticorps monoclonaux, dirigées contre des cibles spécifiques surexprimées (récepteur à l’EGF ou VEGF) dans les cellules tumorales par rapport aux cellules saines. Ces molécules améliorent significativement les traitements.
Différents anticorps monoclonaux se liant à la protéine CK8 humaine ont été décrits. En particulier, Erlandsson et al. (J. of Molecular Récognition, 16 :157-163, 2003 ; Johansson et aï Cancer Res 1999, 59, 48-51) ont décrit l’anticorps monoclonal TS1 dirigé contre la protéine CK8 humaine et son anti-idiotype aTSl ainsi que leur utilisation en immunothérapie pour le traitement des carcinomes. Doljak et al. (Cancer Letters, 267 :75-84, 2008) ont décrit un anticorps monoclonal se liant au motif VKIALEVEIATY conservé parmi différentes cytokératines. Cet anticorps monoclonal se lie notamment aux protéines CK2, CK8, CK10 et CK18 dans des cellules MCF-7 de cancer du sein. Cet anticorps inhibe in vitro l’activation du plasminogène sur des cellules MCF-7. L’anticorps monoclonal M20 commercialisé par Sigma® a été décrit par Van Muijen, G. et al. (Lab. Invest., 57 : 359, 1987 ; Waseem et al Biochemistry 2004, 43, 1283-1295). Il a été montré que cet anticorps, liant spécifiquement la protéine CK8, inhibe la croissance et la capacité invasive des cellules tumorales de cancer colorectal dans des tests réalisés in vitro et in vivo (WO2010/136536). En particulier, dans la demande internationale de brevet WO2010/136536, il a été montré que cet anticorps se lie spécifiquement à la partie non clivée de la protéine CK8 humaine présente à la surface des cellules tumorales d’adénocarcinome colique. Même si des progrès ont été réalisés dans l’identification des antigènes à la surface des cellules tumorales et dans la compréhension des mécanismes associés au développement des cancers et que ces progrès ont permis le développement d’anticorps monoclonaux pouvant améliorer significativement les traitements, leur efficacité et leur spécificité peuvent encore être améliorées. Ainsi, des besoins demeurent pour la mise au point de moyens thérapeutiques pour traiter les tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8 à leur surface, en particulier pour traiter les cancers colorectaux.
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
La présente invention porte sur un anticorps, ou fragment d’anticorps, liant spécifiquement le peptide ayant la séquence selon SEQ ID No. 29 ou un peptide présentant au moins 60% d’homologie avec le peptide ayant la séquence selon SEQ ID No. 29.
La présente invention porte également sur un anticorps, ou fragment d’anticorps pour son utilisation dans le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8, en particulier le peptide de séquence selon SEQ ID No.29, à leur surface.
La présente invention porte également sur un peptide antigénique de la CK8 humaine ayant la séquence selon SEQ ID No. 29.
Enfin, la présente invention porte sur une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon la présente invention et un véhicule pharmaceutique approprié, en particulier pour son utilisation dans le traitement dans le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8, en particulier le peptide de séquence selon SEQ ID No. 29, à leur surface.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
Les figures IA et IB illustrent la mise en évidence par western-blot des isoformes de la CK8 à l’aide des anticorps anti-CK8 dont l’anticorps monoclonal murin D-A10.
La figure 2 illustre la compétition ou non via les peptides 1 (SEQ ID N°l) et 2 (SEQ ID N°2) sur le marquage cellulaire des Ac anti CK8 analysée par cytométrie en flux.
La figure 3 illustre l’effet des peptides 1 (SEQ ID N°l) et 2 (SEQ ID N°2) sur la mise en évidence des isoformes de la protéine CK8 par western-blot à l’aide de l’anticorps M20 et de l’anticorps monoclonal murin D-A10.
La figure 4 illustre l’effet des anticorps anti-CK8 (50 ug/mL) dont l’anticorps monoclonal murin D-A10 sur l’invasion des cellules Isreco-1 induite par 10% de FBS.
La figure 5 illustre l’effet des anticorps anti-CK8 sur la prolifération cellulaire Isreco-1.
La figure 6 illustre l’effet des anticorps anti-CK8 dont l’anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale (Isreco-1) chez la souris.
La figure 7 illustre l’effet dose-dépendant de la concentration en anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale (Isreco-1) chez la souris.
La figure 8 illustre l’effet des anticorps anti-CK8 dont l’anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale (HCT116) chez la souris.
La figure 9 illustre l’effet dose-dépendant de la concentration en anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale (HCT116) chez la souris.
La figure 10 illustre le positionnement des peptides 1 (SEQ ID N°l), 2 (SEQ ID N°2), 3 (SEQ ID N°3) et 4 (SEQ ID N°4) dans la séquence de la cytokératine 8 humaine (ref Uni-ProtKB P05787).
La figure 11 illustre la réactivité de l’anticorps M20 et de l’anticorps monoclonal murin D-A10 pour les différents peptides 1 (SEQ ID N°l), 2 (SEQ ID N°2), 3 (SEQ ID N°3) et 4 (SEQ ID N°4) par test ELISA.
La figure 12 illustre la réactivité de l’anticorps monoclonal murin D-A10 pour les différents peptides 5 à 16 et de 18 à 28 (SEQ ID N°5 à SEQ ID N°16) et (SEQ ID N°18 à SEQ ID N°28) par test ELISA.
La figure 13A illustre l’effet des peptides 5 et 10 à 16 (SEQ ID N°5 et SEQ ID N°10 à SEQ ID N°16) sur la reconnaissance du peptide 1 (SEQ ID N°l) par l’anticorps monoclonal murin D-A10 en ELISA et la figure 13B l’effet des peptides 18 à 24 (SEQ ID N°18 à SEQ ID N°24) sur la reconnaissance du peptide 17 (SEQ ID N°17) par l’anticorps monoclonal murin D-A10 en ELISA.
La figure 14 illustre les séquences en acides aminés et en acides nucléiques de la région variable de la chaine légère (VL) de l’Ac Mo murin D-A10 (chaîne légère murine variable de l’anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d’après IMGT®).
La figure 15 illustre les séquences en acides aminés et en acides nucléiques de la région variable de la chaine lourde (VH) de l’Ac Mo murin D-A10 (chaîne lourde murine variable de l’anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d’après IMGT®).
DEFINITIONS
Le terme « anticorps » tel qu’utilisé dans la description de la présente invention désigne des anticorps monoclonaux (Ac Mo) ou polyclonaux. Les anticorps peuvent être des anticorps chimériques, humanisés ou conjugués. L’expression « anticorps monoclonal » telle qu’utilisée dans la description de la présente invention désigne un anticorps issu d'une population d'anticorps sensiblement homogènes. Plus particulièrement, les anticorps individuels d'une population sont identiques à l'exception de quelques mutations éventuelles pouvant se produire naturellement qui peuvent se retrouver en proportions minimes. En d'autres termes, un anticorps monoclonal consiste en un anticorps homogène résultant de la prolifération d'un seule clone cellulaire (par exemple un hybridome, une cellule hôte eucaryote transfectée avec une molécule d'ADN codant pour l'anticorps homogène, une cellule hôte procaryote transfectée avec une molécule d'ADN codant pour l'anticorps homogène, etc.) et qui est généralement caractérisé par des chaînes lourdes d'une seule et même classe et sous-classe, et des chaînes légères d'un seul type. Les anticorps monoclonaux sont fortement spécifiques et sont dirigés contre un seul antigène. En outre, contrairement aux préparations d'anticorps polyclonaux qui comprennent classiquement différents anticorps dirigés contre différents déterminants, ou épitopes, chaque anticorps monoclonal est dirigé contre un seul épitope de l'antigène. L’expression « anticorps chimérique(s) » telle qu’utilisée dans la description de la présente invention désigne des anticorps comprenant les parties constantes des chaînes lourdes et légères d’un anticorps d’une espèce donnée, par exemple d’un anticorps humain, sur lesquelles sont greffées les parties variables des chaînes lourdes et légères d’un anticorps d’une espèce hétérologue, par exemple d’un anticorps murin. L’expression « anticorps humanisé(s) » telle qu’utilisée dans la description de la présente invention désigne des anticorps humains dans lesquels les régions hypervariables (CDR) sont remplacées par les régions hypervariables (CDR) d’un anticorps d’origine hétérogène, par exemple d’origine murine, qui constituent le site de liaison de l’antigène. Certains acides aminés situés dans les régions adjacentes aux régions CDR (régions FR) jouant un rôle dans la structure du site de liaison de l’antigène, les anticorps humains peuvent en outre être modifiés (CDR) de manière à comprendre les acides aminés de la région FR de l’anticorps d’origine hétérogène. L’expression « anticorps conjugués » telle qu’utilisée dans la description de la présente invention désigne des molécules mixtes artificielles dans lesquelles des composants sont associés à un anticorps capable de reconnaître sélectivement un antigène. Ces composants peuvent être drogues cytotoxiques, des agents anticancéreux, des toxines, des fragments et/ou des radioéléments. L’expression « fragment(s) d’anticorps » telle qu’utilisée dans la description de la présente invention désigne des portions d’anticorps (par opposition à des anticorps entiers) qui sont fonctionnelles, c’est-à-dire des portions d’anticorps capables de lier un antigène. Des exemples de fragments d’anticorps incluent les fragments Fv (constitués des régions variables des chaînes lourdes et légères d’un anticorps), ScFv (fragment variable simple chaîne divalent), Fab (constitués de la chaîne légère en entier et d’une partie de la chaîne lourde), F(ab’)2 (constitués de deux fragments Fab reliés par la région charnière) ou tout fragment dont la durée de demi-vie aurait été augmentée par modification chimique.
Le terme « cancer » tel qu’utilisé dans la description de la présente invention désigne toutes les formations néoplasiques malignes, quelle qu'en soit la nature histologique. Il existe deux grandes catégories de tumeurs malignes : les carcinomes, d'origine épithéliale, et les sarcomes, d'origine conjonctive. Les tumeurs malignes sont formées de cellules atypiques, envahissantes ou avec une capacité de dissémination, caractérisées généralement par un pouvoir d'accroissement autonome, une délimitation imprécise, une capacité d'envahissement des tissus et vaisseaux voisins et une tendance à disséminer par la production de métastases.
Le terme « polynucléotide » tel qu’utilisé dans la description de la présente invention désigne une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire pouvant être de type ADN ou ARN, ou une chaîne nucléotidique double brin pouvant être de type ADNc (complémentaire) ou génomique.
Le terme « épitope » tel qu’utilisé dans la description de la présente invention désigne une molécule qui peut être reconnue par un paratope (partie variable d'un anticorps ou d'un récepteur membranaire des lymphocytes T : TCR) pour déterminer si elle appartient au domaine du soi ou au domaine du non-soi.
Le terme « homologie » tel qu’utilisé dans la présente description désigne la ressemblance entre séquences peptidiques. Les séquences peptidiques peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d’au moins un acide aminé par rapport au polypeptide de référence. Le pourcentage d’homologie est basé sur le pourcentage d’identité des séquences.
LISTE DES SEQUENCES
La SEQ ID N°1 désigne le peptide suivant : AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C
La SEQ ID N°2 désigne le peptide suivant : AEQRGELAIKDANAKLSELE-C
La SEQ ID N°3 désigne le peptide suivant : AALQRAKQD-C
La SEQ ID N°4 désigne le peptide suivant : SELEAALQRAKQD-C
La SEQ ID N°5 désigne le peptide suivant : AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD
La SEQ ID N°6 désigne le peptide suivant : AALQRAKQD
La SEQ ID N°7 désigne le peptide suivant : EAALQRAKQD
La SEQ ID N°8 désigne le peptide suivant : LEAALQRAKQD
La SEQ ID N°9 désigne le peptide suivant : ELEAALQRAKQD
La SEQ ID N°10 désigne le peptide suivant : SELEAALQRAKQD
La SEQ ID N°11 désigne le peptide suivant : LSELEAALQRAKQD
La SEQ ID N°12 désigne le peptide suivant : KLSELEAALQRAKQD
La SEQ ID N°13 désigne le peptide suivant : AKLSELEAALQRAKQD
La SEQ ID N°14 désigne le peptide suivant : N AKLSELEAALQRAKQD
La SEQ ID N°15 désigne le peptide suivant : ANAKLSELEAALQRAKQD
La SEQ ID N°16 désigne le peptide suivant : D ANAKLSELEAALQRAKQD
La SEQ ID N°17 désigne le peptide suivant : C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD
La SEQ ID N°18 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAALQRAKQ
La SEQ ID N°19 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAALQRAK
La SEQ ID N°20 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAALQRA
La SEQ ID N°21 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAALQR
La SEQ ID N°22 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAALQ
La SEQ ID N°23 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAAL
La SEQ ID N°24 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEAA
La SEQ ID N°25 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELEA
La SEQ ID N°26 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSELE
La SEQ ID N°27 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSEL
La SEQ ID N°28 désigne le peptide suivant : AIKDANAKLSE
La SEQ ID N°29 désigne le peptide suivant : LSELEAAL
La SEQ ID N°30 désigne la séquence nucléotidique suivante :
AACATTGTTATGACCCAGGCCGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGT
ATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTTCTGTATAGTAATGGCAACACTTATT
TGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCGCCTGATATATTATATG
TCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGAGGGTCAGGAACTG
ATTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTG
TATGCAAAGTCTAGAATATCCTTTCACG
La SEQ ID N°31 désigne le peptide suivant : NIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLYSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSN LASGVPDRFSGRGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGGGTKLEIK La SEQ ID N°32 désigne la séquence nucléotidique suivante :
GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCGGGGGGGTCACGG
GGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTTACTTTTAGTGGCTTCTGGATGAGCTGGGT
TCGACAGACACCTGGGAAGACCCTGGAGTGGATTGGAGACATTAATTCTGATGGC
AGTGCAATAAAATACGCACCATCCATAAAGGATCGATTCACTATCTTCAGAGACA
ATGACAAGAGCACCCTGTACCTGCAGATGAGCAATGTGCGATCTGAGGACACAGC
CACGTATTTCTGTATCGCCCATTACTCCGGTGGGGGGTTTGCTTACTGGGGTCAAG
GAACCTCGGTCACCGTCTCCTCA
La SEQ ID N°33 désigne le peptide suivant :
EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFTFSGFWMSWVRQTPGKTLEWIGDINSDGSAI
KYAPSIKDRFTIFRDNDKSTLYLQMSNVRSEDTATYFCIAHYSGGGFAYWGQGTSVT vss
La SEQ ID N°34 désigne le peptide suivant : KSLLYSNGNTY
La SEQ ID N°35 désigne le peptide suivant : YMS
La SEQ ID N°36 désigne le peptide suivant : MQSLEYPFT
La SEQ ID N°37 désigne le peptide suivant : GFTFSGFW
La SEQ ID N°38 désigne le peptide suivant : INSDGSAI
La SEQ ID N°39 désigne le peptide suivant : IAHYSGGGFAY
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Anticorps et fragments d’anticorps
Les inventeurs ont développés des anticorps, ou fragments d’anticorps, qui lient spécifiquement le peptide ayant la séquence des acides aminés de la position 353 à la position 360 de la protéine CK8 humaine (ref ETni-ProtKB P05787) ou le peptide ayant au moins 60%, ou au moins 70% voire au moins 85%, d’homologie avec ladite séquence. La séquence d’acides aminés de la position 353 à la position 360 de la protéine CK8 humaine est présentée dans la SEQ ID N°29. Par « spécifiquement », il est entendu que les anticorps, ou fragments d’anticorps, lient uniquement le peptide de la CK8 humaine ayant ladite séquence ou présentant au moins 60%, ou au moins 70% voire au moins 85%, d’homologie avec ladite séquence. Il est entendu que les anticorps, ou fragments d’anticorps, peuvent liés tout fragment protéique/peptidique comprenant ladite séquence.
La présente invention porte donc sur des anticorps, ou fragments d’anticorps, liant spécifiquement le peptide selon la séquence SEQ ID N°29 ou un peptide présentant au moins 60%, ou au moins 70% voire au moins 85%, d’homologie avec le peptide ayant la séquence selon SEQ ID No. 29. Ces anticorps ou fragments d’anticorps sont désignés dans la description de la présente invention par l’expression « anticorps ou fragments d’anticorps de la présente invention ».
Les anticorps, ou fragments d’anticorps, de la présente invention (anticorps anti-CK8, ou fragments d’anticorps anti-CK8) s’avèrent inhiber de manière efficace les capacités invasives des cellules tumorales in vitro et inhiber efficacement la croissance tumorale in vivo.
Les anticorps de la présente invention sont de préférence des anticorps monoclonaux. Ces anticorps monoclonaux peuvent être des anticorps d’origine murine, chimériques ou humanisés. Ils peuvent être obtenus selon les méthodes standards bien connues de l’homme du métier.
Les anticorps monoclonaux, notamment d'origine murine, peuvent être préparés selon les techniques décrites dans le manuel Antibodies (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) ou préparés ou à partir d'hybridomes. De telles techniques sont bien connues de l’homme du métier.
En particulier, les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent être obtenus par exemple à partir de cellules d'un animal immunisé avec un fragment de la protéine CK8 humaine comprenant le peptide ayant la SEQ ID N°29. Les fragments de la protéine CK8 humaine pourront être produits selon les modes opératoires usuels par expression dans un organisme hôte recombinant ou par synthèse peptidique par exemple. Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisé un fragment de la CK8 humaine comprenant le peptide de la SEQ ID N°29. D’autres techniques de purification bien connues de l’homme du métier pourront être utilisées simultanément ou successivement.
Les anticorps chimériques peuvent être préparés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps chimérique peut être réalisé en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal non humain, notamment murin, et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. ETn anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN murin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Les méthodes de préparation d’anticorps chimériques sont largement décrites dans la littérature.
Les anticorps humanisés peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme du métier.
Les fragments d'anticorps de la présente invention peuvent être obtenus à partir des anticorps tels que décrits précédemment par digestion enzymatique, par exemple au moyen de pepsine ou de papaïne, et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. De manière alternative, les fragments d'anticorps de la présente invention peuvent être obtenus par des techniques de recombinaisons génétiques ou par synthèse peptidique. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier.
Les anticorps, ou fragments d’anticorps, de la présente invention sont de préférence des anticorps, ou fragments d’anticorps choisis parmi les anticorps murins, chimériques, et humanisés, présentant de préférence une séquence optimisée. L'expression «séquence optimisée» indique notamment que les codons codant pour les acides aminés constitutifs de la protéine d'intérêt (par exemple, les domaines variables d'anticorps) peuvent être optimisés pour une meilleure reconnaissance par la machinerie de traduction dans un type de cellule dédiée. A cet égard, la séquence d'acides aminés de la protéine codée par la séquence optimisée est identique à la séquence non optimisée, mais la séquence de nucléotides est différente.
Les anticorps, ou fragments d’anticorps, de la présente invention sont de préférence des anticorps, ou fragments d’anticorps, humanisés.
Les anticorps, ou fragments d’anticorps, de la présente invention peuvent comprendre au moins Tune des séquences suivantes : SEQ ID N°31 ou SEQ ID N°33 et leurs dérivés
Les anticorps, ou fragments d’anticorps, de la présente invention peuvent comprendre des régions variables codées par des polynucléotides ayant la séquence nucléotidique de la chaîne légère murine variable (SEQ ID No. 30) et/ou la séquence nucléotidique de la chaîne lourde murine variable (SEQ ID No.32).
La SEQ ID N°30 désigne la séquence nucléotidique de la chaîne légère murine variable d’un anticorps selon la présente invention (anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d’après IMGT® présentée en figure 14).
La SEQ ID N°31 désigne la séquence d’acides aminés de la chaîne légère murine variable d’un anticorps selon la présente invention (anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d’après IMGT® présentée en figure 14).
La SEQ ID N°32 désigne la séquence nucléotidique de la chaîne lourde murine variable d’un anticorps selon la présente invention (anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d’après IMGT® présentée en figure 15).
La SEQ ID N°33 désigne la séquence d’acides aminés de la chaîne lourde murine variable d’un anticorps selon la présente invention (anticorps anti-CK8 D-A10 avec description des FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3 et CDR3 d’après IMGT® présentée en figure 15).
Les séquences des régions CDR sont définies conformément à IMGT ®, Rabat ® ou le système de numérotation commun qui conserve les séquences communes entre IMGT ® et Rabat ® (voir section exemples). Les régions CDR de l’anticorps monoclonal murin anti-CR8 D-A10 (mD-AlO) selon la présente invention sont présentées au tableau 1.
Tableau : Numérotation des séquences CDR.
Par définition, ces régions CDR, comprennent des régions CDR variantes, par délétion, substitution ou addition d’un ou plusieurs acide(s) aminé(s), lequel variant maintient la spécificité de la CDR d'origine. Le système de numérotation commune prévoit une définition CDR ayant les séquences courtes d'acides aminés ou de la définition du CDR minimal.
Ce polypeptide comprend un ou deux domaines de liaison comprenant une paire de chaînes VH et VL dans laquelle la chaîne VL contient une région CDR1 de séquence SEQ ID N° 34, CDR2 de séquence SEQ ID N° 35, CDR3 de séquence SEQ ID N° 36; et la chaîne VH comprenant une région CDR1 de séquence SEQ ID N° 37, CDR2 de séquence SEQ ID N° 38 et une région CDR3 de séquence SEQ ID N° 39. Ce polypeptide se lie spécifiquement à l’épitope de CK8 (SEQ ID NO : 29). Dans cet exemple, ce polypeptide comprend ces deux domaines de liaison. L’anticorps ou fragment d’anticorps selon la présente invention peut être un fragment F(ab')2, Fab, Fv, ScFv ou un anticorps monoclonal ou tout fragment d’anticorps.
Les anticorps, ou fragments d’anticorps, de la présent invention s’avèrent inhiber de manière efficace les capacités invasives des cellules tumorales in vitro et inhiber efficacement la croissance tumorale in vivo. En particulier, les inventeurs ont montré selon la présente invention que l’anticorps monoclonal murin D-A10 (désigné indifféremment «DA-10» ou « mD-AlO »), inhibe efficacement les capacités invasives des cellules Isreco-1 in vitro (figure 4) et inhibe efficacement la croissance tumorale des cellules Isreco 1 et HCT116 chez les souris (figures 6 à 9). En particulier, les inventeurs ont montré que l’anticorps D-A10 inhibe in vitro les capacités invasives des cellules Isreco-1, tandis que l’anticorps D-D6 n’exerce aucun effet. Cette activité antagoniste est également observée avec l’anticorps M20 (figure 4). In vivo, seuls les anticorps D-A10 et M20 contrôlent également le développement des tumeurs.
Si les anticorps D-A10 et M20 reconnaissent tous deux la protéine CK8 humaine et présentent des propriétés antagonistes, il a été montré que les anticorps D-A10 et M20 ne reconnaissent pas le même épitope (figure 2, figure 3, figure 11). En effet, l’anticorps M20 reconnaît spécifiquement le peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 366 de la CK8 humaine (SEQ ID N°l), mais ne détecte pas les peptides ayant soit la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 357 de la protéine CK8 humaine (SEQ ID N°2), soit la séquence correspondant aux acides aminés de la position 358 à 366 de la protéine CK8 humaine (SEQ ID N°3),ou soit la séquence correspondant aux acides aminés de la position 354 à 366 de la protéine CK8 humaine (SEQ ID N°4). Alors que l’anticorps monoclonal murin D-A10 reconnaît à la fois le peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 366 de la CK8 humaine (SEQ ID N°l) et le peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 354 à 366 de la CK8 humaine (SEQ ID N°4), et ne détecte pas les peptides ayant soit la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 357 de la CK8 humaine (SEQ ID N°2), soit la séquence correspondant aux acides aminés de la position 358 à 366 de la CK8 humaine (SEQ ID N°3), (figurell).
De plus, la détection soit en cytométrie de flux (figure 2) ou par western blot (figure 3) des isoformes de la protéine CK8 humaine par l’anticorps M20 n’est inhibée ni par le peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 366 de la CK8 humaine (SEQ ID N°l), ni par le peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 338 à 357 de la CK8 humaine (SEQ ID N°2) alors que la détection des isoformes de la CK8 humaine par l’anticorps monoclonal murin (Mab)D-AlO est fortement inhibée par le peptide ayant la séquence selon SEQ ID N°1 mais pas par le peptide ayant la séquence selon SEQ ID N°2 et celle du MAb D-D6 est inhibée à la fois par les deux peptides ayant la séquence selon SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Le positionnement des peptides 1 (SEQ ID N°l), 2 (SEQ ID N°2), 3 (SEQ ID N°3) et 4 (SEQ ID N°4) sur la séquence de la cytokératine 8 humaine (ref Uni-ProtKB P05787) est présenté à la figure 10.
La figure 12 décrit la réactivité de l’anticorps monoclonal murin D-A10 pour des peptides anti-CK8 délimités en N et C terminal (peptide 5àl6etl8à28, SEQ ID N°5 à SEQ ID N°16 et SEQ ID N°18 à SEQ ID N°28). L’anticorps D-A10 se fixe sur les peptides 5, 11 à 16 et sur les peptides 18, 19 à 23. La leucine en position 353 du peptide 11 est essentielle à la reconnaissance par l’anticorps. En effet, l’anticorps D-A10 ne se fixe pas sur le peptide 10. La leucine en position 360 du peptide 23 est essentielle à la reconnaissance par l’anticorps. En effet, l’anticorps D-A10 ne se fixe pas sur le peptide 24. La présence essentielle des leucines en position 353 et 360 de la séquence de l’épitope est confirmée par la non compétition des peptides 10 (SEQ ID N°10) et 24 (SEQ ID N°24) pour la reconnaissance par l’anticorps monoclonal murin D-A10 en ELISA (figure 13 A et 13B) lorsque cette compétition est réalisée avec le peptide 1 et peptide 17 respectivement. L’épitope reconnu par l’anticorps monoclonal murin D-A10 anti-cytokératine 8 est donc la séquence de 8 acides aminés « LSELEAAL » correspondant aux acides aminés de la position 353 à la position 360 (SEQ ID N°29). L’ensemble des séquences en acides aminés ainsi que la reconnaissance ou pas par l’anticorps monoclonal murin D-A10 des peptides 1, 5 à 28 (SEQ ID N°l, SEQ ID N°5 à SEQ ID N°28) sont présentés dans le tableau 5.
Dans certains modes de réalisation, l’anticorps de la présente invention est l’anticorps monoclonal murin D-A10.
La présente invention porte également sur un anticorps, ou fragments d’anticorps, se liant spécifiquement au peptide ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 353 à la position 360 de la protéine CK8 humaine, c’est-à-dire se liant spécifiquement au peptide ayant la séquence telle que montrée dans la SEQ ID N°29 pour utilisation dans le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8 à leur surface, en particulier dont les cellules expriment le peptide de séquence selon SEQ ID N°29 à leur surface.
Tout particulièrement, l’anticorps, ou fragments d’anticorps, de la présente invention peuvent être utilisés pour traiter les cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou. Les cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou se caractérisent par la présence de cellules tumorales exprimant la protéine CK8 à leur surface.
En particulier, les anticorps, ou fragments d’anticorps, de la présente invention peuvent être utilisés pour traiter les cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou invasifs et/ou métastatiques.
De préférence, les anticorps, ou fragments d’anticorps, utilisés en thérapie sont des anticorps humanisés.
Peptides L’invention porte également sur un peptide antigénique de la CK8 humaine ayant la séquence selon SEQ ID N°29.
Un tel peptide peut être utilisé en vaccination.
Polynucléotides L’invention a aussi pour objet des polynucléotides codant pour le peptide dérivé de la CK8 humaine ayant la séquence correspondant aux acides aminés de la position 353 à la position 360 de la protéine CK8 humaine (SEQ ID N°29). De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les polynucléotides modifiés.
Les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse chimique. L’invention a aussi pour objet des polynucléotides codant pour les régions variables de l’anticorps D-A10 ayant la séquence nucléotidique de la chaîne légère murine variable (SEQ ID No. 30) et la séquence nucléotidique de la chaîne lourde murine variable (SEQ ID No.32). Ainsi, la présente invention porte également sur des polynucléotides pouvant comprendre l’une des séquences suivantes : SEQ ID No. 30 ou SEQ ID N°32.
Les séquences en acides aminés et acides nucléiques des régions variables de la chaine lourde et de la chaine légère de l’anticorps D-A10 sont représentées dans le tableau 2.
Tableau 2: Numérotation des séquences VL ou VH en acides aminés et acides nucléiques.
Compositions pharmaceutiques L’invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un anticorps, ou fragments d’anticorps, de la présente invention.
Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre un anticorps ou fragment d’anticorps et un véhicule pharmaceutique approprié. Des exemples de véhicule pharmaceutique approprié incluent les solvants, la gélatine, l’amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. Les compositions peuvent en outre comprendre des agents de dispersion, des agents mouillants, des agents de mise en suspension, des agents de solubilisation, des stabilisants, des conservateurs, des correcteurs du goût et/ou des édulcorants.
Les compositions peuvent être formulées pour l’administration aux mammifères, en particulier à l’homme. Elles peuvent être destinées à être administrées par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale.
Les compositions se présentent alors sous toutes formes appropriées selon les modes d'administration souhaités. Elles peuvent donc être sous la forme d'une solution ou d'une suspension liquide orale ou injectable, ou sous la forme solide ou semi-solide, de poudres, de
comprimés, de capsules, de granules, de dragées, de gélules, de sprays, de cachets, de pilules, de tablettes, ou de pâtes. La posologie varie selon le traitement et selon l’affection en cause. L’invention concerne aussi des compositions vaccinales comprenant un peptide selon la présente invention et un adjuvant approprié. En vaccination, les adjuvants sont classiquement définis comme des substances capables de potentialiser ou de moduler la réponse immunitaire contre un ou plusieurs antigènes co-administrés. Les vaccins sont habituellement inoculés par injection, mais ils peuvent l'être par voie orale ou par spray nasal. L’invention se rapporte à des compositions pharmaceutiques ou vaccinales pour la prévention et/ou le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8 à leur surface, en particulier des cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou. L’invention concerne aussi des méthodes de traitement thérapeutique des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8 à leur surface, en particulier des cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou, comprenant l’administration à un individu d’une quantité efficace d’un anticorps, ou fragment d’anticorps, selon la présente invention. L’invention concerne enfin l’utilisation des anticorps, ou fragment d’anticorps, selon la présente invention pour la fabrication de médicaments pour le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8 à leur surface, en particulier des cancers colorectaux, des ovaires, du sein, du poumon, des testicules, du pancréas, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du rein, et/ou cancers tête-cou.
EXEMPLES L’anticorps M20 auquel il est fait référence ci-dessous est l’anticorps disponible commercialement sous la référence C5301 (Sigma) et l’anticorps 1 E8 est l’anticorps commercialement disponible sous la référence ab28050 (abcam).
Préparation des anticorps anti-CK8
Les anticorps anti-CK8, sont générés en utilisant des techniques d’obtention hybridomes (Zola et al., Aust J. Exp Biol Med Sci. 1981 ; 59 : 303--6). Différents peptides composés de 5, 7, 10, 15, 20 acides aminés reconnus par l’anticorps M20 ont été synthétisés. Ces fragments peptidiques comprennent au moins un épitope correspondant aux positions 338 à 367 de la CK8 humaine. L’immunisation a été réalisée par des peptides M20-like, c’est-à-dire des peptides contenant en quasi-totalité (peptide 1) ou en partie (peptide 2) la séquence reconnue par l’anticorps M20. Leurs séquences sont les suivantes :
Peptide 1 : AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C (SEQ ID N°l)
Peptide 2 : AEQRGELAIKDANAKLSELE-C (SEQ ID N°2) L’immunisation a été réalisée sur 3 souris OF1 avec un mélange des 2 peptides couplés à la KLH. Les rates de souris dont le sérum était détecté positif par tests ELISA pour les peptides CK8 et la protéine CK8 issue de fraction cellulaire enrichie en CK8 ont été sélectionnés. Les splénocytes ont été fusionnés avec la lignée de myélome de souris X63-Ag8.653. Après clonage de l’hybridome, deux Ac Mo murins ont été obtenus D-A10 et D-D6. Le clone D-A10 ou le clone D-D6 a été injecté dans le péritoine d’une souris Nude. Le liquide d’ascite murin a été purifié par colonne de chromatographie d’affinité sur protéine A (la protéine A à une affinité pour la partie Fc des IgG murines). Les IgG ont été éluées à pH acide, puis transférées dans du PBS. Après concentration, la solution de PBS contenant les IgG a été filtrée et le dosage a été réalisé à 280 nm.
Culture cellulaire
Les cellules de cancer du côlon (CC) humaines établies Isreco-1, Isreco-2, Isreco-3, HCT116+/+, HCT116 -/- et HT29 sont cultivées dans un milieu d’Eagle modifié par Dulbecco (Sigma, St Quentin Fallavier, France) complété avec 10% de sérum fœtal bovin (SFB) inactivé par la chaleur (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 4 mM de L-glutamine (Sigma, St Quentin Fallavier, France) et 50 U/ml,50 pg/ml de pénicilline - streptomycine (Sigma, St Quentin Fallavier, France).
Les cellules de l’adénocarcinome du sein humain établies MCF-7 (disponibles auprès de l’ECACC) sont cultivées dans du Minimum Essential Medium Eagle (Sigma, St Quentin Fallavier, France) complété avec 10% de sérum fœtal bovin (SFB) inactivé par la chaleur (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 2 mM de L-glutamine (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 100 U/mL, 100 gg/mL de pénicilline - streptomycine (Sigma, St Quentin Fallavier, France) et 1% Non Essential Amino Acids (Sigma, St Quentin Fallavier, France).
Les cellules de leucémie des cellules B-précurseurs humaines établies Nalm-6 (disponibles auprès de DSMZ), les cellules du lymphome humain de Burkitt établies Raji (disponibles auprès de l’ECACC), les cellules du lymphome humain non Hodgkin établies RL (disponibles auprès de DSMZ), les cellules du lymphome humain histiocytic établies U937 (disponibles auprès de l’ECACC), les cellules de leucémie lymphoblastique aigüe humaine établies Cem (disponibles auprès de DSMZ), les cellules de leucémie lymphoblastique aigüe humaine établies Molt4 (disponibles auprès de DSMZ), les cellules de plasma humain établies Fravel (disponibles auprès de l’ECACC) sont cultivées dans du RPMI-1640 (Sigma, St Quentin Fallavier, France) sont cultivées dans du RPMI-1640 (Sigma, St Quentin Fallavier, France) complété avec 10 % de sérum fœtal bovin (SFB) inactivé par la chaleur (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 2 mM de L-glutamine (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 100 U/mL, 100 gg/mL de pénicilline - streptomycine (Sigma, St Quentin Fallavier, France).
Etude de l’expression cellulaire de CK8 par cytométrie en flux
Cet exemple décrit des méthodes d’investigation de l’expression cellulaire de CK8 à la surface des cellules et de détermination des épitopes suite à une compétition d’anticorps ou de peptides analysée par cytométrie en flux. 2.105 cellules pour 96 puits sont incubées avec une dilution d’un anticorps monoclonal anti-CK8 non conjugué à 10 pg/ml, puis diluées à 1/10. Les anticorps non liés sont retirés par lavage avec du PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, France) complété par 1 % d’albumine bovine (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Ensuite, les cellules sont centrifugées (5 min à 400 g) et l'anticorps lié est détecté avec un Ac polyclonal de chèvre anti Ig de souris (Fab'T conjugué à de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (MP Biomédical, Illkirch, France) à 4 °C pendant 30 minutes. Après lavage, les cellules sont centrifugées (5 min à 400 g) et remises en suspension dans 300 μΐ de PBS. L’anticorps de détection lié est quantifié sur un appareil FACSCAN (BD Biosciences, Rungis, France), (canal FL1, 2000 événements par acquisition). Pendant l'expérience, les contrôles des isotypes respectifs sont inclus afin d’exclure les événements de liaison non spécifique. L’expression de CK8 est déterminée suite à l’analyse du marquage via les anticorps anti-CK8 (1E8, M20, D-D6 ou D-A10) de façon comparative au marquage cellulaire observé avec les anticorps irrelevants de même isotype.
Les résultats des expériences (pourcentage et intensité de marquage) sont illustrés dans le tableau ci-dessous avec une concentration en AcM ou à 5 pg/ml. Diverses lignées de cellules cancéreuses telles que cancer du côlon ou du sein expriment les antigènes CK8. Aucune expression n’est observée sur des cellules de lymphomes ou de leucémies.
Compétition Anticorps et peptides analysée par cytométrie en flux.
Brièvement, 2.105 cellules Isreco-1 pour 96 puits sont incubées en présence d’un anticorps anti-CK8 avec ou sans peptides apparentés à CK8 (peptide 1 ou peptide 2 tel que décrit ci-dessus) testés à différentes concentrations et incubées à 4 °C pendant 30 minutes. Seules les données avec 1.25 pg/mL d’un anticorps anti-CK8 sont illustrées. Les anticorps non liés sont retirés par lavage avec du PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, France) complété par 1 % d’albumine bovine (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Ensuite, les cellules sont centrifugées (5 min à 400 g) et l'anticorps lié est détecté st détecté avec un Ac polyclonal de chèvre anti Ig de souris (Fab')2 conjugué à de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (MP Biomédical, Illkirch, France) à 4 °C pendant 30 minutes. Après lavage, les cellules sont centrifugées (5 min à 400 g) et remises en suspension dans 300 μΐ de PBS. L’anticorps de détection lié est quantifié sur un appareil FACSCAN (BD Biosciences, Rungis, France), (canal FL1, 2000 événements par acquisition). Pendant l'expérience, les contrôles des isotypes respectifs sont inclus afin d’exclure les événements de liaison non spécifique.
Les résultats des expériences sont présentés à la Figure 2. Le marquage cellulaire Isreco-1 (2.105 cellules / mL) par l’anticorps 1E8, M20, D-D6 ou D-A10 est réalisé en présence ou non du peptide 1 ou peptide 2. Le pourcentage d’inhibition de l’intensité de marquage de l’Anticorps testé à 12.5 pg/mL en présence de différentes concentrations de peptides est reporté. Détection des isoformes de la protéine CK8 par western-blot après mise en compétition ou non des anticorps anti-CK8 avec des peptides CK8
Lors des expériences de western-blot (WB), cinq microgrammes de protéines issues d’un lysat de cellules colorectales cancéreuses Isreco-1 sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE et transférées sur membrane de nitrocellulose. La membrane est saturée avec une solution de de TB S-T (Tris-HCL 20 mM ph 7 ; NaCL 130 mM ; 0,lTween 20) contenant 5 % de lait, puis incubée avec différents anticorps anti-CK8 dilués dans une solution de TBS-T contenant 2,5 % de lait. L’anticorps M20 (50 pg/mL) ou les anticorps monoclonaux murins tels que 1 E8 (1/500 eme), D-A10 (1 pg/mL) ouD-D6 (1 pg/mL) sont incubés pendant lh avec la membrane. Les anticorps primaires sont révélés avec des anticorps secondaires anti-souris couplés à la péroxydase (HRP). Les résultats sont présentés figure 1.
Les isoformes de la protéine CK8 sont différemment détectées selon les anticorps anti-CK8 testés. La forme entière de la protéine CK8 (CK8-E) est révélée par tous les anticorps. La forme tronquée en C terminale de la protéine CK8 (CK8-C) révélée par les anticorps M20 et D-A10, tandis que l’anticorps 1E8 dirigé contre l’extrémité C terminale de CK8 ne la reconnaît pas. Les différentes isoformes, ainsi que leur masse moléculaire estimée et leur séquence correspondante en acides aminés sont indiquées dans le tableau 3.
Lors des expériences de compétition en WB, les anticorps M20 (lpg/mL) ou les anticorps monoclonaux murins tels que D-Al 0(1 pg/mL) ouD-D6 (1 pg/mL) sont préalablement incubés 2 heures à température ambiante avec le peptide 1 ou le peptide 2 avec un ratio moléculaire de 1/100 (1 molécule d’anticorps pour 100 molécules de peptide) dans une solution de TBS-T. Le mélange anticorps-peptides est ensuite mis en contact des membranes dans une solution de TBS-T avec 2,5% de lait pendant lh pour une révélation par anticorps secondaire anti-souris couplés HRP. Les résultats sont présentés à la figure 3. E : Forme entière de CK8 I : Isoforme de CK8 indéterminée C : Isoforme de CK8 tronquée en C terminal
Les isoformes de la CK8 sont présentées dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 : isoformes de la protéine CK8
Effet de l’anticorps monoclonal murin D-A10 sur les capacités invasives des cellules colorectales cancéreuses Isreco-1 in cellulo : Analyse de l’invasion des cellules cancéreuses par mesure en temps réel de l’impédance des cellules ( système xCELLigence-ACEA Biosciences™)
Le système de mesure en temps réel, xCELLigence (ACEA Biosciences™), est basé sur la mesure de l’impédance des cellules générée par la fixation des cellules sur des microélectrodes. Le système utilisé pour tester l’invasion des cellules cancéreuses est le système RTCA DP. Ce système utilise des plaques CIM composée de 16 puits. Les puits sont constitués d’une chambre inférieure et d’une chambre supérieure. La chambre supérieure est perforée par des pores de 8 μΜ de diamètre eux-mêmes placés au-dessus des microélectrodes. Lors de la mesure de la capacité invasive des cellules Isreco-1, la chambre inférieure est remplie de milieu de culture avec 10 % de sérum de veau fœtal (SVF). Lescellules Isreco-1 (20 000 cellules) en présence de milieu sans SVF sont placées dans la chambre supérieure préalablement recouverte d’une couche de matrigel (matrigel™, BD biosciences) avec ou non l”anticorps anti-CK8 (M20, D-A10 ou D-D6 à 50 ug/ml). Lors de l’invasion, les cellules, attirées par le gradient de SVF établi entre la chambre inférieure et la chambre supérieure, digèrent le matrigel avant de migrer au travers des pores et de contacter les micro-électrodes. La mesure de l’impédance générée après invasion est réalisée toutes les 15 minutes pendant 70 heures et enregistrée par un ordinateur relié à l’appareil RTCA DP. Les résultats des mesures de la capacité invasive des cellules sont présentés à la figure 4. Le pourcentage d’inhibition de la capacité invasive des cellules Isreco-1 est reporté avec un écart-type pour 3 expériences indépendantes.
Analyse de la viabilité des cellules suite à la détermination du taux d’ATP.
La viabilité des cellules est déterminée d’après la quantification de ΓΑΤΡ, un indicateur de cellules métaboliquement actives. La détection est basée sur rutilisation du kit CellTiter-Glo® (Promega, Charbonnières-les Bains, France). En quelques minutes, après une perte de l'intégrité de la membrane, les cellules perdent la capacité à synthétiser de ΓΑΤΡ et les ATPases endogènes détruisent tout l’ATP restant, entraînant ainsi une chute abrupte des taux d'ATP. Les cellules Isreco-1 (5.104 cellules/mL) sont incubées seules pendant 72 heures ou en présence d’un anticorps anti-CK8 ou d’un anticorps isotype contrôle (B-Zl IGgl, B-E4
IgG2a). Le réactif CellTiter-Glo® est ajouté directement aux cellules en culture selon un rapport de 50 μΐ de réactif pour 200 μΐ de milieu de culture. Les plaques de dosage sont incubées à température ambiante pendant 10 minutes et le signal bioluminescent est enregistré en utilisant un fluorimètre multipuits standard Mithras LB940, (Berthold, Thoiry, France). Les résultats des expériences pour déterminer l’activité des anticorps anti-CK8 sont présentés à la figure 5. Les cellules Isreco-1 (2.104 cellules / mL) sont cultivées durant 72 heures en présence ou non d’Ac anti-CK8 (M20, 1E8, D-D6 ou D-A10) ou en présence d’Ac murin irrelevant de même isotype (B-Zl, B-E4). La viabilité cellulaire est déterminée par quantification d’ATP. Le pourcentage d’inhibition de la prolifération cellulaire des cellules Isreco-1 est reporté, avec un écart-type pour 2 expériences indépendantes.
Seul l’anticorps 1E8 est capable de neutraliser la prolifération cellulaire Isreco-1. Détermination des régions CDR et FR de l’anticorps monoclonal murin D-A10
De l'ADNc correspondant à la région variable de l'hybridome est obtenu en utilisant deux approches. La première approche consiste à utiliser dans la PCR un jeu d'amorces dégénérées associées à des acides aminés N-terminaux générées depuis le séquençage N-terminal et la seconde approche consiste à utiliser dans la PCR un jeu d'amorces dégénérées générées par la base de données d'amorces IMGT® et les amorces spécifiques décrites précédemment (Essono et al., J Immunol Methods. 2003 ; 203 : 279 : 25-66, Wang et al., Mol Immunol. 1991 ; 28 : 1387-97).
La séquence de la région variable N-terminale est déterminée par dégradation d'Edman. L'extraction de l'ARN total est effectuée en utilisant le kit Tri Reagent selon le protocole décrit par le fournisseur Sigma. Les fragments VL et VH amplifiés sont clonés dans le vecteur de clonage TOPO-TA (Invitrogen) pour les analyses de séquences par la méthode de la didésoxyterminaison (Sanger et al., Nature. 1977 ; 265 : 687-95). Ensuite, les constructions d'anticorps sont amplifiées par PCR et clonées dans le vecteur d'expression.
Les régions CDR et FR des anticorps sont déterminées selon les différentes approches de numérotation tels que le système de numérotation IMGT (ImMunoGeneTics Information System® http://imgt.cines.fr), de Kabat ou le système de numérotation commun. Toutefois, les régions CDR déterminées par IMGT pour un anticorps donné ne sont pas nécessairement identiques aux CDR définies par les autres systèmes de numérotation. Les CDR du domaine variable et les régions de cadre ont été identifiées par l'inventeur, grâce aux systèmes de numérotation IMGT.
Les positions sont numérotées selon IMGT® et l'index de Kabat® (séquences d'acides aminés de la région V et segments de séquences identiques dans les anticorps de spécificités différentes). Les contributions relatives des gènes VH et VL, des minigènes et des régions déterminant la complémentarité se liant aux sites de combinaison d'anticorps sont analysées (Kabat et a/., NIHPubl. 1991 ; No. 91-3242, Vol. 1, 647-669).
Effet de l’anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale des cellules colorectales cancéreuses Isreco-1 implantées en sous cutanée chez la souris.
Les cellules Isreco-1 (10x106) et leur milieu de culture complet (10% sérum de veau fœtal et 1 % pénicilline-streptomycine) ont été injectés en sous cutané à 12 souris SCID CB 17. Au bout de 15 jours, la tumeur formée a atteint un volume entre 100 et 150 mm3. A ce temps, les souris ont été séparées en 4 groupes de 3 souris. Chaque groupe a reçu ou non un traitement spécifique par injection intrapéritonéale à l’opposé de la tumeur. Une fois par semaine pendant 4 semaines (jours 15, 22, 29 et 36-flêches noires sur le graphique), les souris ont reçu une injection de 30 mg/kg de l’anticorps de référence M20, du MAb D-A10, D-D6 ou n’ont pas reçu d’injection (groupe contrôle). Pour chaque souris, le volume de la tumeur a été mesuré deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Le volume moyen de chaque groupe de souris est représenté sur le graphique avec un écart-type correspondant à 3 souris par groupe. Les résultats sont présentés à la figure 6.
Effet dose-dépendant de la concentration de l’anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale des cellules colorectales cancéreuses Isreco-1 implantées en sous-cutané chez la souris.
Des fragments de tumeurs formées à partir de cellules colorectale cancéreuses Isreco-1 ont été implantés en sous cutané à 18 souris SCID CB 17. Au bout de 15 jours, la tumeur a atteint un volume entre 100 et 150 mm . A ce temps, les souris ont été séparées en 6 groupes de 3 souris. Chaque groupe a reçu ou non un traitement spécifique par injection intrapéritonéale à l’opposé de la tumeur. Une fois par semaine pendant 4 semaines (jours 15, 22, 29 et 36-flêches noires sur le graphique), les souris ont reçu une injection de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg ou 60 mg/kg du l’anticorps monoclonal murin (MAb) D-A10 ou n’ont pas reçu d’injection (groupe contrôle). Pour chaque souris, le volume de la tumeur a été mesuré deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Le volume moyen de chaque groupe de souris est représenté sur le graphique avec un écart-type correspondant à 3 souris par groupe.
Les résultats sont présentés à la figure 7.
Effet de l’anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale des cellules colorectales cancéreuses HCT116 implantées en sous-cutanée chez la souris. 10x106 cellules HCT116 et leur milieu de culture complet (10% sérum de veau fœtal et 1 % pénicilline-streptomycine) ont été injectés en sous cutané à 12 souris SCID CB 17. Au bout de 6 jours, la tumeur formée a atteint un volume entre 100 et 150 mm . A ce temps, les souris ont été séparées en 4 groupes de 3 souris. Chaque groupe a reçu ou non un traitement spécifique par injection intrapéritonéale à l’opposé de la tumeur. Une fois par semaine pendant 3 semaines (jours 6, 13 et 20-flêches noires sur le graphique), les souris ont reçu une injection de 30 mg/kg de l’anticorps de référence M20, du MAb D-A10, MAb D-D6 ou n’ont pas reçu d’injection (groupe contrôle). Pour chaque souris, le volume de la tumeur a été mesuré deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Le volume moyen de chaque groupe de souris est représenté sur le graphique avec un écart-type correspondant à 3 souris par groupe.
Les résultats sont présentés à la figure 8.
Effet dose-dependant de la concentration de l’anticorps monoclonal murin D-A10 sur la croissance tumorale des cellules colorectales cancéreuses HCT116 implantées en sous-cutané chez la souris. 10x106 cellules HCT116 et leur milieu de culture complet (10% sérum de veau fœtal et 1 % pénicilline-streptomycine) ont été injectés en sous cutané à 18 souris SCID CB17. Au bout de 10 jours, la tumeur formée a atteint un volume entre 100 et 150 mm3. A ce temps, les souris ont été séparées en 6 groupes de 3 souris. Chaque groupe a reçu ou non un traitement spécifique par injection intrapéritonéale à l’opposé de la tumeur. Une fois par semaine pendant 3 semaines (jours 10, 17, et 24-flêches noires sur le graphique), les souris ont reçu une injection de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg ou 60 mg/kg de l’anticorps monoclonal murin (MAb) D-A10 ou n’ont pas reçu d’injection (groupe contrôle). Pour chaque souris, le volume de la tumeur a été mesuré deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Le volume moyen de chaque groupe de souris est représenté sur le graphique avec un écart-type correspondant à 3 souris par groupe.
Les résultats sont présentés à la figure 9.
Détermination de la spécificité des Ac anti-CK8 par ELISA
Principe général
Les peptides CK8, couplés ou non à l’albumine de sérum bovin (BSA) au niveau du groupement SH de la cystéine C terminale, sont immobilisés au fond des puits d’une plaque 96 puits pendant une nuit. Les puits sont ensuite saturés avec une solution de tampon phosphate salin (PBS) contenant 2, 5% de lait et incubés avec des dilutions des anticorps anti-CK8 avec une solution de PBS-Tween contenant 0,5% de BSA pendant 2 heures. Les anticorps anti-CK8 sont ensuite révélés par des anticorps secondaires anti IgG murines couplés à la péroxydase ( HRP). L’absorbance est lue à 450 nm.
Les conditions spécifiques pour les différentes expériences réalisées sont détaillées ci-dessous. Réactivité de l’anticorps monoclonal murin D-A10 ou de l’anticorps M20 pour les différents peptides 1 (SEQ ID N°l), 2 (SEQ ID N°2), 3 (SEQ ID N°3) et 4 (SEQ ID N°4) de la CK8 humaine.
Les peptides 1, 2, 3 et 4 de la CK8 humaine ont été couplés à la BSA au niveau du groupement SH de la cystéine C terminale et immobilisés au fond de puits de plaque 96 puits.
La séquence protéique complète de la cytokératine 8 humaine (ref Uni-ProtKB P05787), 483 acides aminés (aa), est présentée à la figure 10. Les positions des séquences des peptides 1, 2, 3 et 4 sont indiquées par des flèches grises et noires sur la séquence de la CK8 humaine : Peptide 1 (SEQ ID N°l) : AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C (aa 338- aa 366) Peptide 2 (SEQ ID N°2): AEQRGELAIKDANAKLSELE-C (aa 338- aa 357)
Peptide 3 (SEQ ID N°3): AALQRAKQD-C (aa 358- aa 366)
Peptide 4 (SEQ ID N°4): SELEAALQRAKQD-C (aa 354- aa 366)
Différentes concentrations (10, 1 et 0,1 pg/mL) de l’anticorps M20 ou de l’anticorps monoclonal murin D-A10 ont été incubés pendant 2h à température ambiante avec soit le peptide 1, soit le peptide 2, soit le peptide 3 ou encore le peptide 4 et utilisé pour une détection en ELISA. Les valeurs de densité optique (DO) lues à 450 nm sont présentées sur le graphique. Les résultats sont présentés à la figure 11 et présentés dans le tableau 4 ci-dessous. La reconnaissance ou non par l’anticorps M20 ou le l’anticorps monoclonal murin D-A10 des peptides 1 à 4 est respectivement indiquée par un signe + ou -.
Tableau 4 : codification et séquence en acides aminés des peptides 1, 2, 3 et 4 de la CK8 humaine, ainsi que leur reconnaissance ou non par l’anticorps M20 ou le l’anticorps monoclonal murin D-A10 (signe + ou - respectivement). Réactivité de l’anticorps monoclonal murin D-A10 pour les différents peptides 5àl6etl8à 28 (SEQ ID N°5 à SEQ ID N°16 et SEQ ID N°18 à SEQ ID N°28) de la CK8 humaine.
Les peptides 5 à 16 et 18 à 28 de la CK8 humaine ont été immobilisés au fond de puits de plaque 96 puits. Différentes concentrations (10 ; 1 ; 0,1 ; 0,01 ; 0,001 et 0,0001 pg/mL) de l’anticorps monoclonal murin D-A10 ont été incubés pendant 2h à température ambiante avec les différents peptides et utilisé pour une détection en ELISA. Les valeurs de densité optique (DO) lues à 450 nm sont présentées sur le graphique. Les résultats sont présentés à la figure 12. La codification, la séquence et leur reconnaissance l’anticorps monoclonal murin D-A10 sont présentées au tableau 5.
Effet des peptides 5, 10 à 16 et 18 à 24 (SEQ ID N°5 et SEQ ID N°10 à SEQ ID N°16 et SEQ ID N°18 à SEQ ID N°24 ) sur la reconnaissance des peptides CK8 1 et 17 (SEQ ID N°1 et SEQ ID N°17) par l’anticorps monoclonal murin D-A10,
Lors de la mise en compétition de l’anticorps monoclonal murin D-A10 avec différents peptides CK8, le mélange anticorps-peptides est incubé pendant 30 minutes avant d’être mis
en présence du peptide à détecter et immobilisé au fond des puits. L’anticorps monoclonal murin D-A10 est soit mis en présence des peptides 5 et 10 à 16 (SEQ ID N°5 et SEQ ID N°10 à SEQ ID N°16) pour la reconnaissance du peptide 1 (SEQ ID N°l) ou soit mis en présence des peptides 18 à 24 (SEQ ID N°18 à SEQ ID N°24) pour la reconnaissance du peptide 17.
Le peptide 1 de la CK8 humaine a été couplé à la BSA au niveau du groupement SH de la cystéine C terminale et a été immobilisé au fond de puits de plaque 96 puits. L’anticorps monoclonal murin D-A10 à la concentration de 0,03 pg/mL a été incubé pendant 30 minutes en présence des peptides 5etl0àl6à différentes concentrations (10 ; 1 ; 0,1 ; 0,01 ; 0,001 et 0,0001 pg/mL). Le mélange peptide-anticorps ou l’anticorps seul a ensuite été mis en présence pendant 2h à température ambiante avec le peptide 1 et utilisé pour une détection en ELISA. Les valeurs de densité optique (DO) lues à 450 nm sont présentées sur le graphique. Les résultats sont présentés à la figure 13 A. La codification, la séquence et leur reconnaissance par l’anticorps monoclonal murin D-A10 sont présentées au tableau 5.
Le peptide 17 de la CK8 humaine a été couplé à la BSA au niveau du groupement SH de la cystéine N terminale et a été immobilisé au fond de puits de plaque 96 puits. L’anticorps monoclonal murin D-A10 à la concentration de 0,01 pg/mL a été incubé pendant 30 minutes en présence des peptides 18 à 24 à différentes concentrations (10 ; 1 ; 0,1 ; 0,01 ; 0,001 et 0,0001 pg/mL). Le mélange peptide-anticorps ou l’anticorps seul a ensuite été mis en présence pendant 2h à température ambiante avec le peptide 17 et utilisé pour une détection en ELISA. Les valeurs de densité optique (DO) lues à 450 nm sont présentées sur le graphique. Les résultats sont présentés à la figure 13B et dans le tableau 5 ci-dessous. La reconnaissance ou non par l’anticorps monoclonal murin D-A10 des peptides 1 et 5 à 28 est respectivement indiquée par un signe + ou -.
Tableau 5 : codification et séquence en acides aminés des peptides 1 et 5 à 28 de la CK8 humaine, leur reconnaissance ou non par l’anticorps monoclonal murin D-A10 (signe + ou -respectivement).
Claims (13)
- REVENDICATIONS1. Anticorps, ou fragment d’anticorps, liant spécifiquement le peptide ayant la séquence selon SEQ ID No. 29, ledit anticorps étant caractérisé en ce qu’il comprend une chaîne lourde comprenant les régions hypervariables de séquence selon SEQ ID N°37, SEQ ID N°38 et SEQ ID N°39 et une chaîne légère comprenant les régions hypervariables de séquence selon SEQ ID N°34, SEQ ID N°35 et SEQ ID N°36.
- 2. Anticorps, ou fragment d’anticorps, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un anticorps monoclonal.
- 3. Anticorps, ou fragment d’anticorps, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un anticorps humanisé.
- 4. Anticorps, ou fragment d’anticorps, selon la revendication I, caractérisé en ce qu’il comprend les séquences suivantes : SEQ ID No 31 et SEQ ID No 33.
- 5. Anticorps, ou fragment d’anticorps, selon la revendication 1 caractérisé en ce qu’il comprend des régions variables codées par des polynucléotides ayant la séquence nucléotidique de la chaîne légère murine variable (SEQ ID No. 30) et la séquence nucléotidique de la chaîne lourde murine variable (SEQ ID No,32).
- 6. Anticorps, ou fragment d’anticorps, selon l’une des revendications 1 à 5, pour son utilisation dans le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8, en particulier le peptide de séquence selon SEQ ID No.29, à leur surface.
- 7. Anticorps, ou fragment d’anticorps, selon l’une des revendications 1 à 6 pour son utilisation dans le traitement des cancers colorectaux, des ovaires, du sein, des testicules, du poumon, du rein, du système nerveux, des ganglions lymphatiques, du pancréas, de la tête et du cou.
- 8. Anticorps, ou fragment d’anticorps, selon la revendication 7, pour son utilisation dans le traitement des cancers invasifs.
- 9. Anticorps, ou fragment d’anticorps, selon l’une des revendications 1 à 7, pour son utilisation dans le traitement des cancers colorectaux, de préférence des cancers colorectaux invasifs.
- 10. Peptide antigènique de la CK8 humaine consistant en la séquence selon SEQ ID No. 29.
- 11. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle comprend un anticorps selon l’une des revendications 1 à 5 et un véhicule pharmaceutique approprié.
- 12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11 pour utilisation dans le traitement des tumeurs dont les cellules expriment la protéine CK8, en particulier 1e peptide de séquence selon SEQ ID No. 29, à leur surface.
- 13. Composition pharmaceutique selon les revendications 11 ou 12 pour utilisation dans le traitement des cancers colorectaux.
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1457704A FR3024731B1 (fr) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers |
| PCT/EP2015/068400 WO2016020553A1 (fr) | 2014-08-08 | 2015-08-10 | Anticorps anti-ck8 destinés à être utilisés dans le traitement de cancers |
| KR1020177006409A KR102478986B1 (ko) | 2014-08-08 | 2015-08-10 | 암 치료용 항-ck8 항체 |
| EP15748040.1A EP3189078B1 (fr) | 2014-08-08 | 2015-08-10 | Anticoprs anti ck-8 et leurs utilisations dans le traitement de cancers |
| US15/502,469 US10533046B2 (en) | 2014-08-08 | 2015-08-10 | Anti-CK8 antibodies for use in the treatment of colorectal cancers |
| CN201580048278.9A CN107001452B (zh) | 2014-08-08 | 2015-08-10 | 用于治疗癌症的抗ck8抗体 |
| JP2017526766A JP6689847B2 (ja) | 2014-08-08 | 2015-08-10 | がんの治療における使用のための抗−ｃｋ８抗体 |
| EA201790341A EA036368B1 (ru) | 2014-08-08 | 2015-08-10 | Анти-ck8 антитела для применения в лечении рака |
| CA2959671A CA2959671C (fr) | 2014-08-08 | 2015-08-10 | Anticorps anti-ck8 destines a etre utilises dans le traitement de cancers |
| IL250507A IL250507B (en) | 2014-08-08 | 2017-02-08 | Anti-ck8 antibodies for use in cancer treatment |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1457704 | 2014-08-08 | ||
| FR1457704A FR3024731B1 (fr) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR3024731A1 FR3024731A1 (fr) | 2016-02-12 |
| FR3024731B1 true FR3024731B1 (fr) | 2019-06-14 |
Family
ID=51987264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR1457704A Active FR3024731B1 (fr) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10533046B2 (fr) |
| EP (1) | EP3189078B1 (fr) |
| JP (1) | JP6689847B2 (fr) |
| KR (1) | KR102478986B1 (fr) |
| CN (1) | CN107001452B (fr) |
| CA (1) | CA2959671C (fr) |
| EA (1) | EA036368B1 (fr) |
| FR (1) | FR3024731B1 (fr) |
| IL (1) | IL250507B (fr) |
| WO (1) | WO2016020553A1 (fr) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3024731B1 (fr) * | 2014-08-08 | 2019-06-14 | International - Drug - Development - Biotech | Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers |
| EP3444272A1 (fr) | 2017-08-17 | 2019-02-20 | International-Drug-Development-Biotech | Traitement de cancers positifs ck8 en relation avec le statut du gène kras |
| CN111018984B (zh) * | 2019-11-26 | 2021-09-21 | 山东立菲生物产业有限公司 | 抗ck8单克隆抗体及其应用 |
| CN113234156B (zh) * | 2021-05-25 | 2022-05-03 | 宁波赛珀生物技术有限公司 | 一种抗肌红蛋白的抗体及其制备方法和应用 |
| CN114874320B (zh) * | 2022-06-28 | 2023-08-04 | 王玉 | 含有外泌体的药物组合物及其制备方法 |
| CN116478285B (zh) * | 2023-01-20 | 2024-03-12 | 上海大格生物科技有限公司 | 诊断性小鼠源化抗人ck抗体及其制备方法和应用 |
| CN117430707B (zh) * | 2023-10-25 | 2024-04-19 | 重庆天科雅生物科技有限公司 | 一种cik细胞的制备方法及其在治疗癌症中的用途 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8168181B2 (en) * | 2006-02-13 | 2012-05-01 | Alethia Biotherapeutics, Inc. | Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15 |
| FR2945952B1 (fr) | 2009-05-27 | 2013-10-04 | Univ Claude Bernard Lyon | Anticorps anti-ck8 pour utilisation comme medicament. |
| EP2602265A1 (fr) * | 2011-12-07 | 2013-06-12 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Anticorps anti sPLA2-X et leurs utilisations |
| FR3024731B1 (fr) * | 2014-08-08 | 2019-06-14 | International - Drug - Development - Biotech | Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers |
-
2014
- 2014-08-08 FR FR1457704A patent/FR3024731B1/fr active Active
-
2015
- 2015-08-10 US US15/502,469 patent/US10533046B2/en active Active
- 2015-08-10 JP JP2017526766A patent/JP6689847B2/ja active Active
- 2015-08-10 EA EA201790341A patent/EA036368B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2015-08-10 WO PCT/EP2015/068400 patent/WO2016020553A1/fr active Application Filing
- 2015-08-10 CA CA2959671A patent/CA2959671C/fr active Active
- 2015-08-10 CN CN201580048278.9A patent/CN107001452B/zh active Active
- 2015-08-10 KR KR1020177006409A patent/KR102478986B1/ko active IP Right Grant
- 2015-08-10 EP EP15748040.1A patent/EP3189078B1/fr active Active
-
2017
- 2017-02-08 IL IL250507A patent/IL250507B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2959671C (fr) | 2023-10-03 |
| KR102478986B1 (ko) | 2022-12-16 |
| EP3189078A1 (fr) | 2017-07-12 |
| US20180237508A1 (en) | 2018-08-23 |
| FR3024731A1 (fr) | 2016-02-12 |
| CN107001452B (zh) | 2021-01-08 |
| IL250507B (en) | 2021-10-31 |
| WO2016020553A1 (fr) | 2016-02-11 |
| KR20170082495A (ko) | 2017-07-14 |
| JP6689847B2 (ja) | 2020-05-27 |
| EA036368B1 (ru) | 2020-10-30 |
| CA2959671A1 (fr) | 2016-02-11 |
| JP2017534661A (ja) | 2017-11-24 |
| EA201790341A1 (ru) | 2017-06-30 |
| EP3189078B1 (fr) | 2020-11-04 |
| CN107001452A (zh) | 2017-08-01 |
| IL250507A0 (en) | 2017-03-30 |
| US10533046B2 (en) | 2020-01-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FR3024731B1 (fr) | Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers | |
| JP7129449B2 (ja) | ヒト化ｃｃケモカイン受容体４（ｃｃｒ４）抗体およびその使用法 | |
| KR102574549B1 (ko) | 항-fam19a5 항체 및 이의 용도 | |
| JP7012384B2 (ja) | 癌治療のための抗ｆａｍ１９ａ５抗体の用途 | |
| JP7352973B2 (ja) | 二重特異性抗体及びその使用 | |
| EP2513143A1 (fr) | Anticorps diriges contre le recepteur de la transferrine et leurs utilisations pour l'immunotherapie des tumeurs qui dependent du fer | |
| ES2764418T3 (es) | Anticuerpo anti-FGFR4 humano | |
| JP6918005B2 (ja) | 細胞内抗原に対して向けられた単一ドメイン抗体 | |
| WO2011141653A1 (fr) | Nouveaux anticorps humanises 12g4 mutes et leurs fragments diriges contre le recepteur humain de l'hormone anti-mullerienne de type ii | |
| EP2435076B1 (fr) | Anticorps anti-ck pour l'utilisation dans le traitment du cancer colorectal | |
| WO2021099418A1 (fr) | Anticorps anti-cd117 et leurs procédés d'utilisation | |
| CN113423830A (zh) | 对muc18特异性的抗体 | |
| CN117295766A (zh) | 对唾液酸结合性ig样凝集素15具特异性的抗体及其用途 | |
| TW202340258A (zh) | 抗lilrb1抗體或其抗原結合片段、製備其的方法、藥物組成物、核酸分子、重組載體以及重組細胞 | |
| CN114641307A (zh) | 抗cd19抗体及其用途 | |
| WO2023109962A1 (fr) | Anticorps se liant au cd73 humain, son procédé de préparation et son utilisation | |
| IL285313A (en) | Antibodies for cancer treatment | |
| TW201706308A (zh) | 人類抗－ｆｇｆｒ４抗體 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 2 |
|
| PLSC | Publication of the preliminary search report |
Effective date: 20160212 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 3 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 4 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 5 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 6 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 7 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 8 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 9 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 10 |