RO116969B1 - Derivati de stafilokinaza, procedeu pentru prepararea acestora si compozitie farmaceutica care ii contine - Google Patents

Abstract

Inventia se refera la derivati de stafilokinaza care au secventa de aminoacizi data in fig. 1, in care unul sau mai multi aminoacizi, din unul sau mai multe din grupurile subliniate, sunt inlocuiti cu un alt aminoacid, astfel distrugandu-se epitopii corespunzatori, la procedeul pentru prepararea acestor derivati care cuprinde prepararea unui fragment ADN care cuprinde secventa care codifica stafilokinaza, obtinerea ADN-ului mutant prin mutageneza dirijata in situ, clonarea fragmentului ADN mutant intr-un vector corespunzator, transformarea sau transfectarea unei celule gazda adecvate cu vectorul si cultivarea celulei gazda in conditii corespunzatoare pentru expresia fragmentului ADN si o compozitie farmaceutica cu acesti derivati administrati in tratamentul trombozei arteriale.

Description

Invenția se referă la derivați de stafilokinază cu imunogenicitate redusă, la un procedeu pentru prepararea a acestora și la o compoziție farmaceutică pentru tratarea trombozei arteriale. Mai precis, ea se referă la utilizarea derivaților de stafilokinază asupra cărora s-a acționat prin inginerie genetică pentru prepararea unei compoziții farmaceutice administrată în tratamentul infarctului miocardic.

Sunt cunoscute, din WO 93/13209, fragmente ale lanțului de stafilokinază precum și variante alelice artificiale ale acesteia, utilizate în tratamentul trombozei.

Este, de asemenea, cunoscut că complicațiile trombotice ale bolilor cardiovasculare sunt o cauză principală de deces și invaliditate și, în consecință, tromboliza (adică dizolvarea farmacologică a cheagului sangvin) ar putea influența favorabil prognosticul unor astfel de boli cum ar fi, infarctul miocardic, tromboza cerebrovasculară și trombembolismul venos, care pun în pericol viața. Agenții trombolitici sunt activatori ai plasminogenului care realizează conversia plasminogenului, din forma de proenzimă inactivă a sistemului fibrinolitic plasmatic, la enzima proteolitică plasmină. Plasmina dizolvă fibrina din cheagul sangvin, dar, poate să degradeze și componentele normale ale sistemului hemostatic și să inducă așa numita stare litică. Cu toate acestea, fibrinoliza fiziologică are ca substrat fibrina și se realizează în urma interacțiunilor moleculare specifice dintre activatorul de plasminogen de tip tisular, fibrină, plasmină(palsminogen) și a₂-antiplasmină (Collen D: On the regulation and control of fibrinolysis. Edward Kowalski Memorial Lecture. Thromb. Haemostas 43: 77-79, 1980; Collen D, Lijnen HR: Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombolysis. Blood 78: 3114-3124, 1991.).

în prezent, se cunosc șase agenți trombolitici care sunt, fie aprobați pentru folosire clinică, fie în curs de investigare clinică la pacienți cu infarct miocardic acut. Aceștia sunt reprezentați de streptokinază, urokinază, activator de plasminogen tisulat recombinant (rt-PA) sau derivații lui, activator anizoilat de complex plasminogen/ streptokinază (APSAC), activator al plasminogenului recombinat de tip urokinază monocatenară (rscu-PA, prourokinază recombinantă) și stafilokinază recombinantă (Sak) (Collen D, Lijnen HR: Basis and clinical aspects of fibrinolysis and thrombolysis. Blood 78: 3114-3124, 1991; Collen D, Van de Werf F: Coronary thrombolysis with recombinant staphylokinase in patients with evolving myocardial infarction. Circulation 87: 1850-1853, 1993). La pacienți cu infarct miocardic acut s-a observat reducerea mărimii infarctului, conservarea funcției ventriculare și reducerea mortalității după tratament, fie cu streptokinază, fie cu rt-PA sau cu APSAC (Collen D, Lijnen HR: Basis and clinical Aspects of fibrinolysis and thrombolysis. Blood 78: 3114-3124, 1991).

Unul dintre agenții trombolitici, folosit de obicei în terapie, este streptokinază, o proteină M,. 45000 secretată de streptococii ^-hemolitici. Administrarea sa se asociază, totuși, cu o dereglare majoră a sistemului fibrinogenului și eficacitatea sa în tromboliza coronariană la pacienți cu infarct miocardic acut în evoluție este limitată, la aproximativ 50% cazuri de recanalizare a arterei coronariene în decurs de 90 min (Collen D, Lijnen HR: Basis and clinical aspects of fibrinolysis and thrombolysis. Blood 78: 3114-3124, 1991). Mai mult, expunerea la streptokinază provoacă reacții alergice la circa 5% din pacienții tratați și ca urmare induce formarea de anticorpi specifici fapt care exclude posibilitatea utilizării sale repetate în următoarea perioadă de timp de luni sau ani (Vanderschueren S, Collen D: Immunogeniciteit van streptokinase en implicaties voor gebruik. Tijdschr Geneesk 50: 1639-1644, 1994).

RO 116969 Bl

Stafilokinaza, o proteină produsă de anumite tulpini de Staphylococcus aureus, care s-a dovedit a avea proprietăți profibrinolitice cu mai mult de 4 decenii în urmă (LackCH: Staphylokinase: An activator of plasma protease. Nature 161: 559, 1948;

Lewis JH, ferguson JH: A proteolytic enzyme system ofthe blood. III: activation of dog 5o serum profibrinolysin by staphylohinase. Am J Physiol 166: 594, 1951; Winkler KC, DeWaart J, Grootsen C, Zegers BJM, Tellier NF, Vertegt CD: Lysogenic conversion of staphylococci to loss of beta-toxin. G Gen Microbiol 39: 321, 1965), de asemenea, pare să constituie un agent trombolitic puternic la pacienții cu infarct miocardic acut (Collen D, Zijnen HR: Staphylokinase, a fibrispecific plasminogen activator with 55 therapeutic potențial Blood 84: 680686, 1994). Gena stafilokinazei s-a donat de la bacteriofagii sak(pC (Sako T, SawakiS, SakuraiT, Ito Sm YoshizawaY, Kondo I: Cloning and expression of the staphylokinase gene of Staphylococcus aureus in Escherichia coli. Molec Gen genet 190: 271-277, 1983) și sak42D (Behnke D, Gerlach D: Cloning and expression in Escherichia coli, Bacillus Subtilis and Streptococcus sangvin 6 o of a gene for staphylokinase - a bacterial plasminogen activator. Molec Gen Genet 210: 528-534, 1987) precum și de la ADN-ul genomic fsakSTARl al unei tulpini lizogene de Staphylococcus aureus (Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR: Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokinase. Fibrinolysis 6: 203-213, 1992). Ea s-a exprimat sub controlul promotorului XPR și al 65 semnalelor sale de translație în Escherichia coli precum și sub controlul promotorului său natural și al semnalelor de translație în Bacillus subtilis sau Escherichia coli, rezultând acumularea produsului genei în spațiul periplasmatic sau, respectiv, în mediul de cultură (Behnke D, Gerlach D: Cloning and expression in Escherichia coli, Bacillus Subtilis and Streptococcus sangvin of a gene for staphylokinase - a bacterial ίο plasminogen activator. Molec Gen Genet 210: 528-534, 1987; Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR: Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokinase. Fibrinolysis 6: 203-213, 1992; SakoT: Overproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization. Eur J Biochem 149: 557-563, 1985; Gerlach D, Kraft R, Behnke D: Purification and characterization of 75 the bacterial plasminogen activator staphylokinase secreted by a recombinant Bacillus subtilis. Zbl Bakt Mikr Hyg 269: 314-322, 1988).

Gena stafilokinazei codifică o proteină de 163 aminoacizi, cu aminoacidul 28 corespunzător restului NH₂-terminal al stafilokinazei mature de lungime întreagă (Behnke D, Gerlach D: Cloning and expression in Escherichia coli, Bacillus Subtilis and so Streptococcus sangvis of a gene for staphylokinase - a bacterial plasminogen activator. Molec Gen Genet 210: 528-534, 1987; Sako T, Tsuchida N: Nucleotide sequence ofthe staphylokinase gene tron Staphylococcus aureus. Nucleic Acids Res 11: 76797693, 1983; Collen D, Zhao ZA, Holvoet P, Marynen P: Primary structure and gene structure of staphylokinase. Fibrinolysis 6: 226-231, 1992). Secvența proteinei 85 variantei de tip sălbatic SakSTAR (Collen D, Zhao ZA, Holvoet P, Marynen P: Primary structure and gene structure of staphylokinase. Fibrinolysis 6: 226-231, 1992) este reprezentată în fig. 1. S-au găsit numai 4 diferențe nucleotidice în regiunile de codificare ale genelor sakcfrC. sak42D și sakSTAR. din care una constitue o mutație latentă ((Behnke D, Gerlach D: Cloning and expression in Escherichia coli, Bacillus 90 Subtilis and Streptococcus sangvis of a gene for staphylokinase - a bacterial plasminogen activator. Molec Gen Genet 210: 528-534, 1987; Sako T, Tsuchida N:

RO 116969 Bl

Nucleotide sequence of the staphylokinase gene fron Staphylococcus aureus. Nucleic

Acids Res II: 7679-7693, 1983; Collen D, Zhao ZA, Holvoet P, Marynen P: Primary structure and gene structure of staphylokinase. Fibrinolysis 6: 226-231, 1992).

Au fost purificate câteva forme moleculare ale streptokinazei cu ușoare diferențe de M4165OO la 18000 pe SDS-PAGE] și ale punctelor izoelectrice (Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR; Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokinase. Fibrinolysis 6: 203-213, 1992; Sako T: Overproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization. Eur J Biochem 149: 557-563, 1985; Gerlach D, Kraft R, Behnke D: Purification and characterization of the bacteria! plasminogen activator staphylokinase secreted by a recombinant Bacillus subtilis. Zbl Bakt Mikr Hyg 269: 3I4-322, 1988.). Derivați cu M_r mai mică ai stafilokinazei mature s-au obținut îndepărtând cei 6 (Sak-A6) sau cei 10 (Sak-ΔΙΟ) aminoacizi NH₂-terminali. Prin interacțiune cu plasmină(ogen) într-un mediu tamponat, stafilokinaza matură (NH₂-terminal Ser-Ser-Ser) este transformată rapid și cantitativ la Sak-ΔΙΟ (NH₂-terminal Lys-Gly-Asp-J. Stafilokinaza matură și SakΔΙΟ s-au dovedit a avea aceiași activitate fibrinolitică (Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR: Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokinase. Fibrinolysis 6: 203-213, 1992; Sako T: Overproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization. Eur J Biochem 149: 557563, 1985).

Aminoacidul din poziția 26 pare a fi de importanță crucială pentru activarea plasminogenului de către stafilokinază. într-adevăr, substituirea unicului rest Met din poziția 26, fie cu-Arg fie cu Val are ca urmare pierderea activității funcționale, în timp ce substituirea cu Leu sau Cys are un efect mic sau nu are efect asupra activității (Schlott B, Hartmann M, Guhrs KH, Birch-Hirschfeld E, Gase A, Vetterman S, Collen D, Lijnen HR: Funcțional properties of recombinant staphylokinase variants obtained by site-specific mutagenesis of methionin-2B. Biochem BiophysActa 1204: 235-242, 1994). Deoarece, nici una dintre schimbările unui singur aminoacid nu produce schimbări semnificative în structura proteinelor mutante, mecanismul acestui comportament diferențiat rămâne necunoscut.

într-un mediu plasmatic, stafilokinaza este capabilă să dizolve cheagurile de fibrină fără degradarea secundară a fibrinogenului (Sakai M, Watanuki M, Matsuo O: Mechanism of fibrinspecific fibrinolysis by staphylokinase: participation of a₃-plasmin inhibitor. Biochem Biophys Res Comm 162: 830-837, 1989; Matsuo 0, Okada K, Kukao H, Tomioka Y, Ueshima S, Watanuku M, Sakai M: Thrombolytic properties of staphylokinase. Blood 76: 925-929, 1990; Lijnen HR, Van Hoef B, De Cock F, Okada K, Ueshima S, Matsuo 0, Collen D: On the mechanism of fibrin specific plasminogen activation by staphylokinase. J Biol Chem 266: 11826-11832, 1991). Această specificitate față de fibrină a stafilokinazei este rezultatul inhibării reduse prin tr₂’^ant'· plasmină a complexului plasmină-stafilokinază legat la fibrină, și al reciclării stafilokinazei din complexul plasmină-stafilokinază consecutive inhibării prin a₃antiplasmină și prevenirii conversiei complexului circulant plasminogen-stafilokinază la compelx plasmină-stafilokinază prin a₂-antiplasmină (Lijnen HR, Van Hoef B, Matsuo □, Collen D: On the molecular interactions between plasminogen-staphylokinase, a_santiplasmin and fibrin. Biochim Biophys Acta 1118: 144-148, 1992; Silence K, Collen D, Lijnen HR: Interaction between staphylokinase, plasminfogen] and a₂-antiplasmin.

RO 116969 Bl

140

Recycling of staphylokinase after neutralization of the plasmin-staphylokinase complex by a₂-antiplasmin. J Biol Chem 268; 9811-9816, 1993; Silence K, Collen D, Lijnen HR: Regulation by cr₂-antiplasmin and fibrin of the activation of plasminogen with recombinant staphylokinase in plasma. Blood 82: 1175-1183, 1993). în câteva experimente pe animale, statilokinaza s-a dovedit a fi la fel de eficientă ca streptokinaza la dizolvarea cheagurilor plasmatice sau sanguine, dar semnificativ mai eficientă pentru dizolvarea trombilor plachetari sau retractați (Collen D, Se Cock F, Vanlinthout I, Declerck PJ, Lijnen HR, Stassen JM; Comparative thrombolytic and immunogenic properties of staphylokinase and streptokinase. Fibrinolysis 6: 232-242, 1992; Collen D, De Cock F, Stassen JM: Comparative immunogenicity and thrombolytic properties toward arterial and venous thrombi of streptokinase and recombinant staphylokinase in baboons. Circulation 87: 996-1006, 1993).

Rezultatele încurajatoare obținute cu stafilokinază la animale experimentale cu tromboză, au format baza pentru evaluarea sa, la scară pilot, la pacienți cu infarct miocardic acut (Collen D, Van de Werf F: Coronary thrombolysis with recombinant staphylokinase in patients with evolving myocardial infarction. Circulation 87: 18501853, 1993; Schlott B, Hartmann M, Guhrs KH, Birch-Hirschfeid E, Pohl HD, Vandershueren S, Van de Werf F, Michoel A, Collen D, Behnke D: High yield production and purification of recombinant staphylokinase for thrombolytic therapy. Bio/technology 12: 185-189, 1994). La 4 din 5 pacienți cu infarct miocardic acut, 10 mg de statilokinază recombinantă (SakSTAR), administrată intravenos, timp, de 30 min, s-a dovedit a induce recanalizarea arterei coronariene, dovedită angiografic, în 40 min. Nivelurile plasmatice ale fibrinogenului plasmatic și a₂-antiplasminei au fost neafectate (niveluri reziduale, la 40 min, de 90-95% din cele de bazale) și nu s-au observat reacții alergice (Collen D, Van de Werf F: Coronary thrombolysis with recombinant staphylokinase in patients with evolving myocardial infarction. Circulation 87: 1850-1853, 1993). La a doua serie de 5 pacienți cu ocluzie coronariană acută, administrarea intravenoasă, de 10 mg stafilokinază (SakSTAR), timp de 30 min a indus recanalizare la toți pacienții, în 20 min, fără degradarea asociată a fibrinogenului (Schlott B, Hartmann M, Giihrs KH, Birch-Hirschfeid E, Pohl HD, Vandershueren S, Van de Werf F, Michoel A, Collen D, Behnke D: High yield production and purification of recombinant staphylokinase for thrombolytic therapy. Bio/technology 12: 185-189, 1994). Controlul angiografic la 24 h a arătat că recanalizarea a persistat.

Imunogenicitatea stafilokinazei (SakSTAR) comparată cu cea a streptokinazei s-a studiat la câini (Collen D, Se Cock F, Vanlinthout I, Declerck PJ, Lijnen HR, Stassen JM: Comparative thrombolytic and immunogenic properties of staphylokinase and streptokinase. Fibrinolysis 6: 232-242, 1992) și babuini (Collen D, De Cock F, Stassen JM: Comparative immunogenicity and thrombolytic properties toward arterial and venous thrombi of streptokinase and recombinant staphylokinase in baboons. Circulation 87: 996-1006, 1993). în total, aceste date experimentale de la animale au sugerat o imunogenicitate mai scăzută a stafilokinazei față de cea a streptokinazei. Cu toate acestea, la primii 5 pacienți cu infarct miocardic acut la care s-a făcut perfuzie intravenoasă de 10 mg stafilokinază, timp, de 30 min, titrurile de anticorpi neutralizați anti-stafilokinază (SakSTAR) au fost scăzute la început și în primele 6 zile după perfuzie, însă, la 14...35 zile titrurile de anticorpi au avut valori demonstrabil crescute (titruri de anticorpi neutralizanți anti-stafilochinază, de 12...42 pg/ml plasmă

145

150

155

160

165

170

175

180

RO 116969 Bl (Collen D, Van de Werf F: Coronary thrombolysis with recombinant staphylokinase in patients with evolving myocardial infarction. Circulation 87: 18501853, 1993). Aceste observații s-au confirmat în întregime în al doilea grup experimental de 5 pacienți (Schlott B, Hartmann M, Guhrs KH, Birch-Hirschfeid E, Pohl HD, Vandershueren S, Van de Werf F, Michoel A, Collen D, Behnke β: High yield production and purification of recombinant staphylokinase for thrombolytic therapy. Bio/technology 12: 185-189, 1994). Astfel, în legătură cu imunogenicitatea, observațiile inițiale la om nu au fost la fel de încurajatoare ca experiențele pe animale. Astfel, ca și streptokinaza, administrarea de stafilokinază ar fi restricționată la utilizare unică. Totuși, absența reactivității încrucișate a anticorpilor sintetizați împotriva stafilokinazei și streptokinazei (Declerck PJ, Vanderchueren S, Billiet J, Moreau H, Colen D: Prevalence and industion of circulating antibodies against recombinant staphylokinase. Thromb Haemostas 71: 129-133, 1994; Vanderschueren SMF, Stassen JM, Collen D: On the immunogenicity of recombinant staphylokinase in patiensts and in animal models. Thromb Haemostas 72: 297-301, 1994), sugerează că administrarea ambelor substanțe nu ar fi incompatibilă.

Imunogenitatea intrinsecă a streptokinazei și stafilokinazei împiedică clar utilizarea lor fără restricție. Nu numai că, pacienții cu titruri de anticorpi preexistente ridicate vor fi refractari la efectul trombolitic al acestor agenți, dar se pot întâlni și efecte secundare alergice și ocazional, anafilaxie care amenință viața (Whitw H: Thrombolytic treatment for recurrent myocardial infarction. Br Med J 302: 429-430, 1991). Deoarece, atât streptokinaza, cât și stafilokinaza, sunt proteine heteroloage, nu reiese în mod evident dacă imunogenicitatea lor ar putea fi redusă prin tehnici de inginerie genetică a proteinei. într-adevăr, nu au fost raportate încercări reușite de a genera fragmente active cu greutate moleculară scăzută de la streptokinază. La stafilokinază, îndepărtarea fragmentului de 17 aminoacizi NH₂-terminal sau a fragmentului de 2 aminoacizi COOH-terminal, inactivează molecula, care în plus, este foarte sensibilă la inactivare prin mutageneză cu specificitate de situs (Schlott B, Hartmann M, Guhrs KH, Birch-Hirschfeid E, Pohl HD, Vandershueren S, Van de Werf F, Michoel A, Collen D, Behnke D: High yield production and purification of recombinant staphylokinase for thrombolytic therapy. Bio/technology 12: 185-189, 1994; Gase A, Hartmann M, Guhrs KH, Rocker A, Collen D, Behnke D, Schlott B: Funcțional significance of NH₂and COOH-terminal regions of staphylokinase in plasminogen activation, Submitted).

Problema, pe care o rezolvă invenția, este de a obține derivați de stafilokinază cu reactivitate redusă printr-un procedeu special conceput și o compoziție farmaceutică cu acești derivați.

Derivații de stafilokinază, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că, au secvența de aminoacizi prezentată în fig. 1, în care unul sau mai mulți aminoacizi din unul sau mai multe dintre grupurile subliniate sunt înlocuiți cu alt aminoacid, astfel distrugându-se epitopii corespunzători.

Procedeul pentru prepararea derivaților de stafilokinază, conform invenției, cuprinde etapele:

- prepararea unui fragment ADN care cuprinde secvența care codifică stafilokinaza,

- realizarea ADN-ului mutant prin mutageneză dirijată în situ, in vitro, printr-un sistem de mutageneză orientat pe oligonucleotidă, pentru a înlocui unul sau mai mulți dintre codonii care codifică stafilokinaza,

RO 116969 Bl

235

- donarea fragmentului ADN mutant într-un vector corespunzător,

- transformarea sau transfectarea unei celule gazdă adecvate cu vectorul; și

- cultivarea celulei gazdă în condiții corespunzătoare pentru expresia fragmentului ADN.

Compoziția farmaceutică, conform invenției, conține derivații de stafilokinază definiți mai sus într-o cantitate eficientă terapeutic împreună cu un excipient acceptabil farmaceutic.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- imunogenicitate redusă față de stafilokinaza de tip sălbatic;

- toxicitate redusă.

Varianta de tip sălbatic a stafilokinazei SakSTAR (Collen D, Zijnen HR; Staphylokinase, a fibrispecific plasminogen activator with therapeutic potențial Blood 84: 680-686, 1994; Collen D, Zhao ZA, Holvoet P, Marynen P: Primary structure and gene structure of staphylokinase. Fibrinolysis 6: 226-23I, 1992) conține 3 epitopi imunodominanți nesuprapuși, din care, cel puțin 2 pot fi eliminați prin mutageneza dirijată în situs, fără inactivarea moleculei. Aceste variante de stafilokinază la care s-a acționat prin inginerie genetică sunt mai puțin reactive cu anticorpii provocați la pacienți tratați cu stafilokinază de tip sălbatic și sunt semnificativ mai puțin imunogene decât stafilokinaza de tip sălbatic, așa cum s-a demonstrat în cazul iepurelui și babuinului și la pacienți cu ocluzie arterială periferică.

Derivații de stafilokinază au în principal secvența aminoacidă a stafilokinazei de tip sălbatic, sau versiuni modificate ale acesteia, astfel, încât, cel puțin un epitop imunodominant este eliminat fără distrugerea activității biologice a derivaților. într-o realizare a invenției, derivații au în principal, secvența aminoacidă așa cum s-a ilustrat în fig. 1, în care unul sau mai mulți aminoacizi din unul sau mai multe grupuri subliniate s-au înlocuit prin alt aminoacid, modificând astfel epitopul(i) corespunzători. De preferință, aminoacizii sunt înlocuiți prin alanină. Prin modificarea epitopului(lor), reactivitatea derivaților cu o gamă de anticorp monoclonal dirijat spre unul sau mai multe dintre cele trei grupuri epitop I, II și III, este redusă. Aceasta arată că prin înlocuirea aminoacizilor de tip sălbatic cu alanină, antigenicitatea stafilokinazei se reduce.

Invenția se referă în particular la derivatul stafilokinază M8, care are secvența aminoacidă cum s-a ilustrat în fig. 1, în care aminoacizii Lys în poziția 74, Glu în poziția 75 și Arg în poziția 77, în grupul 8 subliniat au fost înlocuiți prin alanină, modificând astfel epitopul corespunzător; la derivatul stafilokinază M3, care are secvența aminoacidă cum s-a ilustrat în fig. 1, în care aminoacizii Lys din poziția 35 și Glu din poziția 38 din grupul 3 subliniat, s-au înlocuit cu alanină, modificând astfel epitopul corespunzător; la derivatul stafilokinază M9, care are secvența aminoacidă cum s-a ilustrat în fig. 1, în care aminoacizii Glu din poziția 80 și Asp din poziția 82 din grupul 9 subliniat, s-au înlocuit prin alanină modificând astfel epitopul corespunzător, la derivatul stafilokinază M3.8, care are secvența aminoacidă, cum s-a ilustrat în fig. 1, în care aminoacizii Lys din poziția 35, Glu în poziția 38, Lys în poziția 74, Glu poziția 75 și Arg din poziția 77 din grupurile 3 și 8 subliniate, s-au înlocuit prin alanină, modificând astfel epitopii corespunzători și la derivatul stafilokinază M8.9, care are secvența aminoacidă cum s-a ilustrat în fig. 1, în care aminoacizii Lys din poziția 74, Glu în poziția 75, Arg în poziția 77, Glu în poziția 80 și Asp în poziția 82, din grupurile 8 și 9 subliniate, s-au înlocuit prin alanină, modificând astfel epitopii corespunzători. Astfel, M3.8 M8.9 sunt mutanți dubli având 2 epitopi distruși.

240

245

250

255

260

265

270

275

RO 116969 Bl

Invenția demonstrează că variantele, de stafilokinază asupra cărora s-a acționat prin inginerie genetică, având imunogenicitate redusă, pot reprezenta o variantă practică de agenți trombolitici alternativa la streptokinază sau stafilokinază de tip sălbatic.

De asemenea, invenția se referă la procedeu pentru producerea derivaților invenției, prin prepararea unui fragment ADN, care corespunde, cel puțin parțial secvenței de codificare a stafilokinazei și care asigură activitatea sa biologică; realizarea mutagenezei dirijată în situs in vitro asupra fragmentului ADN pentru înlocuirea unuia sau mai multor codoni corespunzători aminoacizilor de tip sălbatic printr-un codon corespunzător altui aminoacid; donarea fragmentului ADN mutat într-un vector adecvat; transformarea sau transfectarea unei celule gazdă corespunzătoare cu respectivul vector; și cultivarea celulei gazdă în condiții adecvate pentru expresia fragmentului ADN. De preferință, fragmentul ADN este un fragment de 453 bp EcoRIHindiW al plasmidului pMEX602SAK, mutageneza dirijată în situs in vitro se realizează printr-un sistem de mutageneză cu specificitate de oligonucleotidă folosind plasmidul pMa/c și reparația tulpinii deficiente E.coli WK6MutS, iar fragmentul ADN mutat se donează în E.coli tulpina WK6.

De asemenea, invenția se referă la compoziții farmaceutice care cuprind, cel puțin unul dintre derivații stafilokinazei, conform invenției, împreună cu un excipient corespunzător pentru tratamentul trombozei arteriale. Compoziții farmaceutice care conțin variante de stafilokinază, mai puțin imunogenă ca ingredient activ, pentru tratarea trombozei arteriale în practica umană sau veterinară pot lua forma de pudre sau soluții și se pot folosi pentru administrare intravenoasă, sau intra-arterială. Astfel de compoziții se pot prepara prin combinarea (de exemplu, amestecare, dizolvare, etc.) compusului activ cu excipienți acceptabili farmaceutic, având caracter neutru (cum ar fi, solvenți apoși sau neapoși, stabilizatori, emulsionanți, detergenți, aditivi) și în plus, dacă este necesar, cu coloranți. Concentrația ingredientului activ într-o compoziție terapeutică poate varia larg, între 0,1 și 100%, în funcție de caracterul bolii și modul de administrare. în plus, doza ingredientului activ de administrat poate varia, între 0,05 și 1,0 mg per kg de greutate corporală.

Mai mult decât atât, invenția se referă la utilizarea derivaților de stafilokinază pentru tratamentul trombozei arteriale, în special, al infarctului miocardic și, la utilizarea derivaților de stafilokinază pentru prepararea unei compoziții farmaceutice administrată în tratamentul trombozei arteriale, în special, infarct miocardic.

în cele de mai sus și în cele care urmează, termenii ‘‘derivați, “mutante și “variante, sunt folosiți interschimbabil.

Prezenta invenție, va fi demonstrată mai în detaliu în exemplele care urmează, care totuși, nu au intenția să limiteze întinderea invenției. Pe baza prezentei invenții, pentru persoana pregătită în domeniu vor fi evidente câteva variante și îmbunătățiri. Astfel, prin mutageneza întâmplătoare pornind de la combinația mutantă 3.8 și de la combinația mutantă 8.9, este probabil să se obțină mutanți alternativi cu imunogenicitate redusă și posibil cu activitate funcțională crescută, în timp ce, prin mutageneza alternativă la nivelul grupurilor de epitopi de neutralizare, vor da alte variante cu imunogenicitate redusă.

Se prezintă, în continuare, 6 exemple de realizare a invenției, în legătură cu cele două figuri, care reprezintă:

RO 116969 Bl

325

- fig. 1, secvența proteinei stafilokinază de tip sălbatic, SakiSTAR; numărătoarea începe cu aminoacidul NH₂-terminal al stafilokinazei mature de lungime întreagă; sunt indicate variantele grupTncărcat-la-alanină” care s-au studiat;

- fig 2, reprezentare schematică a specificității epitopului unei game de 17 anticorpi monoclonali murinici, provocați împotriva SakSTAR.

Exemplul 1. Diagrama epitopului stafilokinazei de tip sălbatic

Specificitatea epitopului unei game de 17 anticorpi monoclonali murinici produși împotriva stafilokinazei de tip sălbatic (varianta SakSTAR] se determină prin analiza interreacției biospecifice în timp real (BIA),folosind instrumentul BIAcore^ÎRr(Pharmacia, Biosensor AB, Uppsala, Suedia). Anticorpii monoclonali împotriva SakSTAR, sunt produși în esență prin metoda lui Galfre și Milstein (Galfre G, Milstein C: Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol 73: 3-46, 1981). șoareci BALB/c se imunizează prin injectare subcutanată cu 10 pg SakSTAR în adjuvant Freund complet, care este urmată 2 săptămâni mai târziu de injectare intraperitoneală, de 10 pg SakSTAR în adjuvant Freund incomplet. După un interval, de cel puțin 6 săptămâni, șoarecii vor primi intraperitoneal un rapel cu 10 pg SakSTAR în soluție salină în zilele 4 și 2, înaintea fuziunii celulare. Se izolează celule splenice și se fuzionează cu celule mielomice P3X63-Ag.8-6.5.3 (obținute de la Dr. O. Schonherr, Organon, Oss, Olanda), conform lui Fazekas de St. Groth și Scheidegger (de St. Groth SF, Scheidegger D: Production of monoclonal antibodies: strategies and tactics. J Immuno Methods 35: 1-21, 1980). După selecție în hipoxantină, aminopterină, în mediu de timidină, supernatantele se cercetează pentru producere de anticorpi specifici cu o micro-ELISA, cu un sit necompetitiv folosind plăci microtitru acoperite cu stafilokinază. Imunoglobulinele legate au fost detectate cu IgG de iepure anti-șoarece conjugată cu peroxidaza de hrean (HP) (Nakane PK, Kawaoi A: Peroxidase-lebeled antibody. A new method for conjugation. J. Histochem Cytochem 22: 1084-1091, 1974). Clonele pozitive sunt folosite pentru producere de lichid de ascită în șoareci BALB/c stimulați cu pristan (Anderson N, Potter M: Induction of plasma cell tumors in Balb-c mice with 2, 6, 10, 14 tetramethylpentadecane (pristane). Nature 222: 994-995, 1969). Fracțiunea IgG a anticorpilor monoclonali se purifică din ascite prin cromatografie de afinitate pe Proteina A-Sepharose (Ey PL, Prowse SJ, jenkin CR: Isolation of pure IgGI, IgGza și lgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose. Immunochestry 15: 429-436, 1978).

Această tehnică de analiză a interacțiunii biospecifice bazată pe rezonanță plasmonică de suprafață (SPR) permite măsurarea directă a interacțiunilor în timp real fără utilizare de markeri (Jonsson U, Malmqvist M: Real time biospecific interaction analysis. The integration of surface plasmon resonance detection, general biospecific interface chemistry and microfluidics into one analytical system. Adv. Biosensors 2: 291-336, 1992). Stafilokinaza (SakSTAR) se imobilizează pe suprafața Sensor Chip CM5 folosind kit-ul de cuplare a aminelor (Pharmacia Biosensor AB), așa cum s-a recomandat de către fabricant. Această procedură leagă inițial grupările amino din ligand la suprafața dextran carboximetilat a Sensor Chip (Johnsson B, Lofas S, Lindquist G: Immobilization of proteins to a carbomethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Anal biochem 198: 268-277, 1991). Imobilizarea se realizează din soluțiile de proteină la o concentrație, de 10 pg/ml în acetat de sodiu 10 mM la pH=5,0, la un

330

335

340

345

350

355

360

365

370

RO 116969 Bl debit, de 5 μΙ/min, timp, de 6 min. Aceasta are ca urmare atașarea covalentă a 1OOO-15QO RU (unități de rezonanță) de fragmente stafilokinază (corespunzând, la aproximativ 0,07 pmol/mm²) (BIAcore system manual, 5-2, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suedia). Al doilea component de interacțiune (analitul: adică anticorpul monoclonal) se injectează în soluție peste senzor. Concentrația analitului liber s-a menținut constantă printr-o curgere continuă a soluției, la 2O°C, trecută peste suprafața senzorului. La cel puțin 4 concentrații ale fiecărui analit (domeniul 0...400 nM, sau O...50 pM) în 10 mM HEPES, 3,4 mM EDTA, 0,15 M NaCI și 0,005% Surfactant P20, pH=7,2, se injectează la o rată de curgere, de 5 μΙ/min, timp, de 6 min în faza de asociere. Apoi, proba se va înlocui cu tampon, de asemenea la o rată de curgere, de 5 μΙ/min, timp, de 6 la 30 min. După fiecare ciclu, s-a regenerat suprafața sensor chip-ul prin injectarea a 5 pl de HCI 15 mM. Constantele de asociere (k_ass) și disociere (k_dlss) au fost obținute din senzograme, așa cum s-a descris în detaliu în Karlsson R, Michaelsson A, Mattsson L: Kinetic analysis of monoclobal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system. J Immunol Methods 145: 229,-240, 1991. Echilibrul constantelor de asociere (K_A), calculat ca raportul lui k_ass și k_diss, pentru legarea la stafilokinaza de tip sălbatic a gamei de 17 anticorpi monoclonali studiați, este cuprinsă în domeniul de la 0,6 și > 25x10⁹ M¹ (valoare medie 1O¹⁰ M'¹) (Tabelul 1).

în tabelul 1, coloana indicată cu ID menționează diverși derivați stafilokinază. Indicațiile 1/G11, 26A2 etc, se referă la anticorpii monoclonali, care se leagă la epitopul indicat în grupurile I, II și III. în coloana variantă aminoacizii mutați și pozițiile lor sunt indicate prin codul de o literă pentru aminoacizi. Grupul I de epitopi este recunoscut de anticorpii 17G11, 25A2, 30A2, 2B12 și 3G10, în timp ce grupul II de epitopi este recunoscut de anticorpii 2901, 18F12, 14H5, 28H4, 20D6, 32B2 și 7F10, iar grupul III de epitopi de anticorpii 7H11, 25E1, 40C8, 24C4 și 4A10.

Anticorpii monoclonali orientați împotriva epitopilor separați, se vor lega independent unul de altul, în timp ce anticorpii monoclonali orientați împotriva epitopilor strâns înrudiți, vor interfera fiecare cu legarea altora. Prin urmare, specificitatea de epitop a unei game de anticorpi monoclonali este cel mai ușor de determinat prin testarea abilității perechilor de anticorpi monoclonali, de a se lega simultan la antigen. Analiza interacțiunii biospecifice în timp real (BIA), se poate folosi pentru a măsura legarea competitivă a perechilor de anticorpi monoclonali la stafilokinaza legată la suprafața sensor chip. Analiza se realizează așa cum este descris în Application Note 101 (Pharmacia Biosensor AB). Testele de legare în perechi împart cei 17 anticorpi monoclonali în 3 grupuri reprezentând 3 epitopi nesuprapuși pe antigen, așa cum se ilustrează în fig. 2. Independența acestor epitopi se confirmă prin demonstrarea directă a legării cumulative a anticorpilor monoclonali 26A2, 28H4 și 24C4. Anticorpii se aliniează conform specificității lor la epitop, așa cum este ilustrat în tabelul 1.

Exemplul 2. Construcția și alcătuirea diagramei epitop a variantelor de stafilokinază grup-încărcat-alanină în scanările grup-încărcat-alanină se țin grupurile de aminoacizii încărcate hidrofil. Stafilokinaza (SakSTAR) conține 45 de aminoacizi încărcați (2 His, 14 Glu, 8 Asp, 1 Arg, și 20 Lys). Aceste resturi încărcate au fost mutate la Ala, în grupuri de 2 sau 3 aminoacizi, cum s-a prezentat în rezumat în fig. 1. S-au desemnat un total de 21 de mutante, în care aminoacizii încărcați subliniați s-au înlocuit cu alanină.

420

RO 116969 Bl

Aminoacizii care trebuie înlocuiți prin alanină, sunt indicați cu o linie verticală mică în grup.

Mutantele se prepară prin mutageneză dirijată în situs și se exprimă în E.coli, așa cum este prezentat în detaliu mai jos. Enzimele de restricție se pot procura de la Pharmacia, Uppsala, Suedia sau Bohringer, Mannheim (Mannheim, Germania). Ligaza ADN T4, fragmentul Klenow al ADN polimerazei I din E.coli și fosfataza alcalină s-au obținut de la Bohringer Mannheim. Sistemul de mutageneză cu specificitate de oligonucleotidă și plasmidele pMa/c sunt furnizate de către Corvas (Ghent, Belgia) (Stanssens P, Opsomer C, McKeown Y, Kramer W, Zabeau M, Friz MJ; Efficient oligonucleotide-directed construction of mutations in expression vectors by the gapped duplex DNA method using alternating selectable markers. Nucleic Acids Res 17: 4441-4454, 1989). Vectorul de expresie pMEX602SakB a fost furnizat de Institut Fur Molekulare Biotechnologie, Jena, Germania. Fagul helper M123KO7 este procurat de la Promega (Leiden, Olanda). Mediul de creștere bulion Luria se procură de la Life Technologies (Merelbeke, Belgia). Plasminogenul s-a purificat din plasmă umană, așa cum s-a descris în lucrarea Deutsch DG, mertz ET: Plasminogen: purification from human plasma by affinity chromatography, science 170: 1095-1096, I970.

Se realizează reacții enzimatice folosind condițiile sugerate de către furnizor. Se izolează plasmida ADN folosind un protocol de purificare QIAGEN (asigurat de către Westburg, Leusden, Olanda). Transformările E.coli se realizează utilizând procedura cu fosfat de calciu. Secvențarea ADN se realizează folosind metoda terminației catenei dideoxi și laser automat fluorescent A.L.F.^(R) (Pharmacia). Mutageneză dirijată în situs pentru mutanții D5, K5 (M20) până la k86, E88 (M10), se realizează folosind pMa/c, folosind reparația tulpinii deficiente E.coli WK6MutS. Propagarea plasmidelor pMa/c sau a derivaților, prepararea de ADN monocatenară și expresia lui s-a făcut în E. coli WK6 (Stanssens P, Opsomer C, McKeown Y, Kramer W, Zabeau M, Friz MJ: Efficient oligonucleotide-directed construction of mutations in expression vectors by the gapped duplex DNA method using alternating selectable markers. Nucleic Acids Res 17: 4441-4454, 1989). Mutantele D93, K94 (M11) până la K134, K135, K136 (M19) sunt construite la Institutul de Biotehnologie Mononucleară Jena, Germania, așa cum s-a descris mai sus (Schlott B, Hartmann M, Guhrs KH, Birch-Hirschfeld E, Gase A, Vetterman S, Collen D, Lijnen HR: Funtional properties of recombinant staphylokinase variants obtained by site-specific mutagenesis of methionin-26. Biochem Biophys Acta 1204: 235-242, 1994). Substratul cromogenic (S2403) clorhidrat de L-piroglutamil-L-fenilalanikL-lizină-P-nitroanilină s-a procurat de la Chromogenix. Fibrinogenul marcat cu ¹²⁵l este procurat de la Amersham.

Fragmentul EcoRI-Hindlll de 453 baze perechi conținând întreaga regiune de codificare pentru SakSTAR se taie din plasmida pMEXS02SakB (rezistentă ampicilină) și se donează în situsurile EcoRI-Hindlll ale plasmidei pMcS-8 (rezistentă cloramfenicol) dând pMc-STAR. Pentru mutageneză dirijată în situs, in vitro, ADN-ul monocatenar al acestui construct se prepară prin transformarea constructului pMc-STARîn E.coli și injectarea unei culturi, de 24 h cu fag helper MI3K07. La 4 h după injectare, celulele se izolează din mediu prin precipitare PEG și extracție cu fenol-cloroform. în continuare, pMc-STAR mono catenar se hibridizează cu vectorul ADN mono catenar pMa [EcoRI-Hindlll] și cu oligonucleotida sintetică corespunzătoare, de 28 până la 44 baze cu o mutație latentă care crează sau îndepărtează un situs de restricție. Reacțiile de

425

430

35

440

445

450

460

RO 116969 Bl extensie se realizează cu fragmentul Klenow al ADN polimerazei, așa cum este descris. După transformarea E.coli WK6MutS și selecție pe ampicilină, coloniile sunt crescute pe membrane de nitroceluloză, se denaturează in situ și ADN-ul se hibridizează peste noapte, la temperatura camerei, folosind oligonucleotidele mutante corespunzătoare radiomarcate (1,5x10⁸ cpm de [γ³²Ρ]-ΑΤΡ folosit pentru T4 polinucleotid kinază care marchează 20...30 ng de oligonucleotidă). Filtrele se spală, la 42°C, folosind soluții care conțin 0,1% SDS și 2xSSC, 1xSSC, O,2xSSC, D,1xSSC. Plasmida ADN se extrage din 10 ml culturi bacteriene din fiecare clonă pozitivă și se analizează prin digestie enzimatică de restricție. Mutațiile dorite se confirmă prin secvențarea secvenței de codificare completă folosind A.L.F.^(R1.

Fragmentul mutant Hindlll-EcoRI este apoi ligat înapoi în vectorul de expresie pMEX602SakB, care conține promotorul pTaq (Stanssens P, Opsomer C, McKeown Y, Kramer W, Zabeau M, Friz MJ: Efficient oligonucleotide-directed construction of mutations in expresssion vectors by the gapped duplex DNA method using alternating selectable markers. Nucleic Acids res 17: 4441-4454, 1989). Proteinele mutante se produc intracelular și în formă solubilă în celule E.coli WK6 transformate cu acest vector. Mutantele se purifică din extractele bacteriene sonicate folosind cromatografia de schimb cationic și cromatografia de interacțiune hidrofobă (Schlott B, Hartmann M, Guhrs KH, Birch-Hirschfeid E, Pohl HD, Vandershueren S, Van de Werf F, Michoel A, Collen D, Behnke D: High yield production and purification of recombinant staphylokinase for thrombolytic therapy. Bio/technology 12: 185-189, 1994).

Mutantele SakSTAR se obțin cu randamente, între 10 și 80 mg/l, reprezentând recuperări, a 15 până la 88% din materia primă. Materialul purificat este pur, așa cum s-a dovedit prin electroforeză pe geluri gradient 10-15% nereduse (neprezentate). Analiza aminoacidului NH₂-terminal a confirmat secvența Ser-Ser-SerPhe-Asp a stafilokinazei mature. 0 caracterizare biochimică mai detaliată a acestor stafilokinaze mutante este raportată în Silence K, Hartmann M, Guhrs KH, Gase A, Schlott B, Collen D, Lijnen HR: Structure-function relationships in staphylokinase as revealed by clustered-charge-to-alanine” mutagenesis. J Biol Chem (in press).

Concentrațiile proteinei se determină conform lui Bradford (Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248, 1976). Activitățile fibrinolitice ale soluțiilor SakSTAR se determină printr-o analiză de substrat cromogenic realizată în plăci microtitru, folosind un amestec, de 80 pl soluție SakSTAR, și 100 pl soluție Glu-plasminogen (concentrație finală 0,5 mM). După incubare, timp, de 30 min, la 37°C, plasmida generată se cuantifică prin adăugarea a 30 pl S2403 (concentrație finală 1 pM) și măsurarea absorbției la 405 nm. Activitatea se exprimă în unități interne (HU) prin comparație cu un standard intern (lot STAN5), care a atribuit o activitate de 1OOOOO HU per mg proteină, așa cum s-a determinat prin compoziția aminoacidă (Collen D, Silence K, Demarsin E, De Mol M, Lijnen HR: Isolation and characterization of natural and recombinant staphylokinase. Fibrinolysis 6: 203- 213, 1992). Se realizează SDS-PAGE cu Phast System^(R) (Pharmacia, Uppsala, Suedia), folosind gradiente de geluri 10-15% și colorație Coomassie Brilliant blue. Reducerea probelor s-a realizat prin încălzire, la 100°C, timp.de 3 min, în prezență, de 1% SDS și 1% ditioeritritol.

RO 116969 Bl

Construcția, producția și purificarea mutantelor M3.8 și M8.9 se realizează cum se descrie în detaliu mai jos. Oligonucleotidele, folosite pentru construcție, 5'ATAGCAATGCATTTCCTGCACTATCAAC-3' (M3), 5'- sio

CTAATTCAACTACTGCAAACGCTGCATATGCTGTCGCATC-3' (M8) și 5'TTTGCGCTTGGCGCCAATGCAACTACTCTAAACTCTTTATAT-3' (M9) sunt sintetizate la cerere de către Pharmacia Biotech.

Pentru construcția mutantului M3.8, pMc-STAR monocatenar și a fragmentului EccBl-HindW al pMa5-8 se folosesc pentru a prepara o moleculă ADN duplex cu 515 omisiuni, care se hibridizează cu oligonucleotida sintetică de 28 baze M3 (care conține un sit de restricție Nsil). Reacțiile de extensie s-au realizat cu fragmentul Klenow al ADN polimerazei și ligază așa cum este descris. După transmisia E.coli WK6MutS și selecție pe ampicilină, se cresc 81 colonii pe membrane de nitroceluloză, se denaturează in situ și ADN-ul se hibridizează peste noapte, la temperatura camerei, folosind 520 oligonucleotida M3 radiomarcată (1,5x1ο⁸ cpm de [y³²P]-ATP pentru T4 polinucleotid kinază, care marchează 20-30 ng de oligonucleotidă). Filtrele se spală, la 42°C folosind soluții care conțin 0,1% SDS și 2xSSC, 1XSSC, 0,2xSSC, 0,1xSSC. ADN dintr-o clonă selectată din 16 pozitive se prepară din 150 ml culturi bacteriene și se analizează prin digestie enzimatică de restricție cu Nsil și Pvul. Se confirmă mutația 525 M3 [pMa-STAR3} prin secvențarea regiunii de codificare completă folosind A.L.F.^tR). Apoi, se prepară ADN mono catenar prin transformarea pMa-STAR3m E.coli, așa cum s-a descris mai sus. Se hibridizează pMa-STAR3 mono catenar cu pMc (EcoRIHindlll) și cu oligonucleotida sintetică de 40 baze M8, care conține un sit de restricție

Ndel, așa cum s-a descris mai sus. După transformarea E.coli GIK6MutS și selecția 530 pe cloramfenicol, se cresc 100 de colonii pe membrane de nitroceluloză și se hibridizează cu oligonucleotida M8 marcată. Se cresc clonele pozitive (2 din 7) și se analizează prin digestie enzimatică de restricție (Nsil-Hindlll și Ndel), dând o clonă pozitivă. Apoi, mutantul dublu M3.8 este ligat înapoi în vectorul de expresie pMEX602SakB.

Din cele 12 minipreparate de ADN, 6 au tiparul de restricție corect. Una din aceste 535 clone [pMEXSakSTAR.M3B] este supusă secvențializării și se folosește pentru prepararea mutantului M3.8, sub controlul promotorului tac, a inductorului IPTG și 2 secvențe Shine-Dalgarno în tandem.

Se incubează 100 pl dintr-o suspensie de celule E.coli WK6 transformate cu plasmida recombinantă pMEXSakSTAR.M3Bm 100 ml mediu LB (Gibco/BRL), care 540 conține 100 pg/ml ampicilină. Amestecul se incubează peste noapte, la 37°C în același timp agitând, la 200 rot/min, rezultând o densitate celulară de aproximativ 5 unități de absorbanță la 600 nm. Se transferă alicote de 20 ml, la volume, de 2 I (în baloane de 5 I) mediu LB conținând 100 pg/ml ampicilină. Amestecurile se incubează, timp, de 3 h, la 37°C, agitând în același timp înaintea adăugării a 200 μΜ 545 IPTG pentru inducerea expresiei M3.8, care este lăsată să se desfășoare, timp de 4 h. Celulele sunt peletate prin centrifugare, la 4000 rot/min, timp, de 20 min, sunt resuspendate, în 1/10 volum de tampon fosfat 0,01 M, pH=6,5 și se distrug prin sonicare, la 0°C. Se îndepărtează prin centrifugare, timp, de 30 min, la 20000 rot/min, restul celular și supernatantul se păstrează, la -20°C până la folosire. 550

Uzatele celulare colectate clarificate (2 I volum),din 20 până la 30 I culturi bacteriene, se aduc la pH=5,9, se sterilizează prin filtrare prin filtru Sartorius de 0,22 pm și se aplică la o coloană 5x25 cm de SP-Sepharose, precondiționată cu 0,5 M

RO 116969 Bl

NaOH și cu tampon fosfat 0,01 M sterilizat, la o rată de curgere, de 12 ml/min și, la 4°C în curgere laminară. Coloana se spală cu 2-3 I tampon și se eluează cu un gradient sare, de la O la 1 M pe 500 ml și, de la 1 M la 2 M pe 250 ml, la o rată de curgere, de 10 ml/min și, la 4°C. Fracțiunile care conțin M3.8, localizate prin electroforeză gel SDS, sunt colectate (aproximativ 200 ml) și se dializează contra 15 I tampon fosfat 0,01 M, pH=8,0, la 4°C. Materialul centrifugat, la 4000 rot/min, timp, de 30 min, sterilizat din nou prin filtrare și se aplică la o coloană 2,5x12 cm de Q-Sepharose curgere rapidă, precondiționată cu 0,5 M NaOH și cu tampon fosfat 0,01 M sterilizat, pH=8,0, la o rată de curgere, de 3 ml/min, la 4°C. Coloana se spală cu aproximativ 600 ml tampon fosfat 0,01 M, pH=8,0, la o rată de curgere, de 8 ml/min și se eluează cu un gradient de sare, de la O la 0,17 M pe 30 ml, de la 0,17 la 0,2 M pe 100 ml și, de la 0,2 la 1,5 M pe 200 ml, la o rată de curgere, de 4 ml/min. Fracțiunile care conțin M3.8, localizate prin electroforeză gel SDS, se colectează, se ajustează concentrația proteinei la 1 mg/ml și materialul se sterilizează prin filtrare prin filtru Millipore 0,22 pm. Trei preparate M3.8 dau 80 ± 25 mg proteină pură (medie ± SD) cu o activitate specifică, de 45000 ± 5200 HU/mg.

Pentru construcția mutantului M8.9, pMc-STAR și fragmentul EcoRI-H/ndlll al pMa5-8 se folosesc pentru a prepara o moleculă ADN duplex cu omisiuni, care se hibridizează cu oligonucleotida sintetică de 42 de baze M9, care conține un sit de restricție Nari. Reacțiile de extensie se realizează cu fragmentul Klenow al ADN polimerazei și ligază așa cum este descris. După transformarea E.coli WK6MutS și selecție pe ampicilină, coloniile se cresc pe membrane de nitroceluloză, se denaturează in situs și se hibridizează ADN-ul peste noapte,la temperatura camerei, folosind oligonucleotida M9 radiomarcată [1,5 x 10⁸ cpm de [γ³²Ρ]-ΑΤΡ pentru T4 polinucleotid kinază, care marchează 20...30 ng oliqonucleotidă). Filtrele se spală, la 42°C folosind soluții conținând 0,1% SDS și 2xSSC, 1xSSC, 0,2xSSC, 0,1xSSC. ADNul de la 2 clone selectate din 4 pozitivi sunt preparate și, una din ele [pMA-STAR9] se caracterizează prin analiza secvenței nucleotidice folosind A.L.F.™. Insertul EcoRIH/ndlll din pMa-STAR9 este apoi ligat înapoi în vectorul de expresie pMEX6O2SakB. Clonele se sitează prin hibridizare in situs cu oligonueleotida M9 radiomarcată drept sondă. □ clonă, pMEXSakSTAR.M9, se caracterizează prin analiza secvenței nucleotidice și, în continuare se folosește pentru construcția mutantului M8.9.

La constructul M8.9, mutația 8 se introduce în M9 prin reacție în lanț a polimerazei (PCR). PCR se realizează într-un volum total de 100 pl, folosind 5 U enzimă și 1 pg din fiecare din primerii următori:

oligonucleotida ll= 5'CAGGAAACAGAATTCAGGAG, oligonucleotida lll= 5'TATATAATATTCGACATAGTATTCAATTTTT-3', oligonucleotida IV= 5'TATCCCGGGCATTAGATGCGACAGCATATGCAGCGTTTGCAGTA-3' și oligonucleotida V= 5'-CP,AAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC-3'. Concentrațiile dATP, dCTP, dGTP și dTTP sunt 200 μΜ. Denaturarea se realizează 1 min, la 94°C, decălirea 2 min, la 55°C și extensia 1,5 min, la 72°C. După 30 cicluri probele se incubează 10 min, la 72°C și se răcesc, la 4°C. în prima reacție PCR s-au amplificat 2 ng de pMEXSakSTAR. M9 folosind ca primeri oligonucleotidele IV și V. Ampliconul PCR se digeră cu Smal și Hindlll și se purifică după electroforeză într-un gel de agaroză 1,5% folosind un kit Prep-A-gene (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA). Fragmentul rezultant se donează în situsurile Smal-Hindlll ale pUC18 (Pharmacia BioTech,

RO 116969 Bl

600

Uppsala, Suedia) folosind kit de ligare rapidă ADN (Boehringer Mannheim). După transformare în celule E.coli WK6, se prepară ADN de la 12 colonii și toate 12 generează un fragment de aproximativ 230 baze perechi, când se digeră cu EcoRI și Hindlll. Unul dintre aceste ADN-uri (pUCI8-M89A] se folosește pentru donarea unui al doilea produs PCR (vezi mai jos). Se realizează a doua reacție PCR pe 2 ng de pMEXSakSTAR.M9 folosind oligonucleotidele II și III ca primeri, Produsul reacției PCR se digeră cu Sspl și EcoRI și se purifică suplimentar, cum s-a descris mai sus. Fragmentul rezultat este ligat în situsurile Smal-EcoRI ale pUCI8-M89A. După transformare în celule E.coli WK6, se selectează 6 clone pentru prepararea ADN. Din cele 6 clone, 5 generează un fragment de aproximativ 453 baze perechi după digestie cu EcoRI și Hindlll. Acest fragment care codifică mutantul M8.9 întreg este donat în situsurile EcoRI-Hindlll ale vectorului de expresie pMEX6O2SakB. După transformarea celulelor E.coli WK6, se analizează ADN din 6 colonii prin digestie cu EcoRI și Hindlll, care generează în toate cazurile un fragment de aproximativ 453 baze perechi. Unul dintre aceste ADN-uri se caracterizează ulterior prin analiza secvenței nucleotidice.

Se inoculează 100 ml de mediu LB (GIBCO/BRL) conținând 100 pg/ml ampicilină cu 100 pl dintr-o suspensie de celule E.coli WK6 transformate cu plasmida recombinantă pMEXSakSTAR.M89. Cultura se incubează peste noapte, la 37°C, agitând în același timp, la 140 rot/min până la o densitate celulară de aproximativ 5 unități de absorbantă, la 600 nm. Se folosesc alicote de 4 ml pentru a inocula culturi, de 2 I (în baloane SL cu șicane) în mediu “Terrific Broth”,conținând 150 μΙ/ml ampicilină. Culturile se incubează, circa 20 h, la 30°C și, la 140 rot/min, rezultând în final, o densitate celulară de aproximativ 4x10⁹ celule/ml. Celulele se peletează prin centrifugare, la 4000 rot/min, 20 min, se resuspendă, în 1/5 voi de tampon fosfat 0,01 M, pH=6,5 și se distrug cu ultrasunete, la 0°C. Apoi, se ajustează pH-ul la 5,8 și deșeurile celulare se îndepărtează prin centrifugare 30 min, la 20000 rot/min. Supernatantul se păstrează, la -20°C, până la prelucrarea ulterioară.

Uzatelor celulare clarificate colectate (1800 ml) li se corectează pH-ul la 5,8 și sunt aplicate la o coloană 2,5x20 cm de SP-Sepharose, precondiționată cu NaOH 0,5 M și fosfat 0,01 M proaspăt, tampon NaCI 2,5 M, pH=7,5, la o rată de curgere, de 2 ml/min, la 4°C. Coloana s-a spălat cu 500 pl tampon și se eluează cu un gradient sare, de la O la 1 M pe 200 ml, la o rată de curgere de 6 ml.

Fracțiunile M8.9 colectate, identificate cu electroforeză în gel SDS, se ajustează la 2,5 M cu NaCI solid și se supun la cromatografie de interacție hidrofobă pe o coloană 2,5x20 cm de fenil-Sepharose, precondiționată cu NaOH 0,5 M și fosfat proaspăt 0,01 M, tampon NaCI 2,5 M, pH=7,5, la o rată de curgere, de 2 ml/min și 4°C. Coloana se spală cu aproximativ 500 ml tampon și se eluează cu tampon fosfat 0,01 M, pH=6,5. Fracțiunile conținând M8.9, localizate prin electroforeză gel SDS, se colectează și se supune dializei împotriva a 2 I tampon fosfat 0,01 M, pH=9,0. Materialul dializat se centrifugează, la 4000 rot/min, 30 min și se aplică la o coloană 1,6x5 cm de Q-Sepharose la curgere rapidă, precondiționată cu NaCI 0,5 M și cu tampon fosfat proaspăt 0,01 M, pH=9,0 la o rată de curgere, de 2 ml/min și 4°C. Coloana se spălă cu aproximativ 150 ml tampon fosfat 0,01 M, pH=9,0 și se eluează cu un gradient sare, de la O la 1M NaCI pe 100 ml, la o rată de curgere, de 4 ml/min. Fracțiunile conținând M8.9, localizate prin electroforeză în gel SDS se

605

610

615

620

625

630

635

640

RO 116969 Bl colectează. Concentrația proteinei se corectează, la 1 mg/ml și materialul se sterilizează prin filtrare printr-un filtru Millipore 0,22 pM. Trei preparate ale M8.9 dau 73 ± 17 mg proteină pură cu o activitate specifică de 50000 ± 3500 HU/mg.

Activitățile fibrinolitice ale diferitelor mutante SakSTAR determinate cu testul substratului cromogenic sunt prezentate în tabelul 1.

Din cele 21 mutante, desemnate cum este ilustrat în fig. 1, E99.E100 (M13) și E99,E100,E102 (M14) nu se obține în formă purificată, în timp ce K11, D13, D14 (M1), E46.K50 (M4) și E65.D69 (M7) sunt inactive. Se studiază în detaliu, 16 mutante prezentate în tabelul 1, împreună cu tipul sălbatic SakSTAR. Din aceste mutante, DS.K6 (M20), K8.K1O (M21), D33.K35 (M2), K57.E58.K58 (M5), E61 ,E65 (M6), K86.E88 (MIO), D93.K94 (M11), K96.K97.K98 (M12), E108.K109 (M15), D115.E118,H119 (M16), H119.K121 (m17), K130 (M18) și

E134,K135,K136 (M19) reacționează cu gama de anticorp monoclonal într-un mod similar ca SakSTAR. Cu toate acestea, K35.E38 (M3) și E80.D82 (M9) reacționează puțin cu anticorpul grup 7H11, 25E1,4OC8, în timp ce K74,E75,R77 (M8) reacționează puțin cu grupul 26A2, 3OA2, 2B12, și 3G1O. Aditivitatea eliminării epitopului se stabilește cu mutantele K35, E38/K74,E75,R77 (M3. 8) și K74,E75,R77/E80, D8? (M8. 9), care se combină cu reactivitatea redusă cu anticorpii monoclonali ai ambelor molecule parentale.

Exemplul 3. Adsorbția cu stafilokinază tip sălbatic și variante de stafilokinază grup-incărcat-la-alanină a anticorpilor, produși la pacienți prin tratament cu SakSTAR în scopul obținerii informației asupra specificității epitopului a anticorpilor induși provocați la pacienți cu infarct miocardic acut, după tratament cu SakSTAR, probe de plasmă de la 16 pacienți sunt adsorbite cu un exces de 2 ori molar (peste activitatea de neutralizare stafilokinază) a mutantelor singulare și combinate grup-încărcat-laalanină, timp, de 10 min înaintea determinării legării reziduale la SakSTAR prin analiza interacției biospecifice. Activitatea de neutralizare a stafilokinazei din aceste probe se determină, după cum urmează. Se adăugă concentrații în creștere ale tipului sălbatic sau variantei SakSTAR (50 pl voi, conținând 0,2 la 1000 pg/ml) la un amestec de 300 pl plasmă umană citratată și 50 pl tampon sau plasmă test, imediat după adăugarea a 100 pl dintr-un amestec care conține trombină (50 NIH unități/ml) și CaCI₂ (25 mM). Timpul de liză al cheagului plasmatic se măsoară și se marchează față de concentrația jumătății SakSTAR. De la această curbă se determină concentrația activatorului plasminogen care produce liza completă a cheagului, în 20 min. Titrul activității de neutralizare se determină ca diferența dintre valorile plasmei test și tampon și se exprimă în pg per ml plasmă test.

Rezultatele sunt prezentate în tabelul 2. în timp ce SakSTAR tip sălbatic absoarbe mai mult decât 90% din legarea anticorpilor din toate probele, se observă absorbție incompletă cu mutantul K35.E38 (M3) la 4 pacienți, cu mutantul K74.E75.R77 (MH) la 12 pacienți și cu mutantul E80,D82 (M9) la 5 pacienți. Absorbția cu, combinația mutantelor K35,E38/K74,E75,R77 (M3.8) și

K74,E75,R77/E80,D82 (M8.9) îndepărtează mai puțin decât 90% din anticorpi în 13 pacienți (valoarea medie de 68 și respectiv, 65% pentru 16 pacienți), în timp ce, așa cum s-a anticipat, un amestec de molecule parentale a combinației mutantelor (M8 și M3 sau M9) adsoarbe constant peste 90% din anticorpi.

RO 116969 Bl

Exemplul 4. Imunogenicitatea variantelor de stafilokinază “grup-încărcat-laalanină la iepurii imunizați cu stafilokinazăde tip sălbatic (SakSTAR), cu mutante K35, E3.8 (M3), K74, E75, R77 (M8) și E8O.D82 (M9) și combinația de mutante K35.E38/K74, E75, R77 (M3.8) și K74,E75,R77/E8O,D82 [M8.9]

Imunogenicitatea comparativă a SaKSTAR fața de fiecare din variantele SakSTAR, M3, M8, M9, M3.8 și M8.9 se studiază după imunizare subcutanată în grupuri de 4 sau 8 iepuri alocați la SakSTAR și în grupuri de 8 iepuri alocați la variantă. Imunizarea se realizează prin infuzare intravenoasă a 400 pm/kg SakSTAR și a 200-1000 pg/kq a mutantelor la săptămâna zero (pentru determinarea capacității de bază de liză a cheagului) urmată de injectarea subcutanată a 400 pg din același agent în adjuvant Freund complet la săptămâna 2 și în adjuvant Freund incomplet la săptămânile 3 și 5. Imunogenicitatea se cuantifică la 6 săptămâni prin determinarea activității de neutralizare stafilokinază în plasmă și potenței trombolitice reziduale, așa cum se detaliază mai jos.

Pe scurt, activitatea de neutralizarea stafilokinazei în plasmă se determină prin adăugarea concentrațiilor crescute de SakSTAR de tip sălbatic sau mutantă (50 pl volume conținând 0,2-1000 pg/ml) la un amestec de 300 pl plasmă umană citratată și 50 pl tampon sau plasmă de iepure, urmat imediat de adăugarea a 100 pl dintr-un amestec care conține trombină (50 NIH unițăti/ml) și CaCI₂ (25 mM). Timpul de liză al cheagului plasmatic este măsurat și marcat față de concentrația de SakSTAR sau variantă. Din această curbă se determină concentrația de activator plasminogen care produce complet liza cheagului, în 20 min. Titrul activității de neutralizare se determină ca diferența dintre valorile plasmei de iepure și tampon și se exprimă, în pg / ml plasmă de iepure.

Proprietățile trombolitice se studiază folosind 0,3 ml de cheaguri plasmatice de iepure sărace în plachete cu fibrină marcată ¹²⁵l, introduse într-un șunt arteriovenos extracorporal. Prin urmare, o arteră femurală evidențiată, se cateterizează cu un cateter 4 French (Portex White, Portex, Hythe, UK) și se conectează prin intermediul a două seringi hipodermice la o venă cateterizată a urechii. Fluxul sangvin prin șuntul extracorporal se menține, la 10 ml/min cu o pompă peristaltică. Se introduc cheaguri plasmatice cu fibrină marcată ^l25l în fiecare dintre cele două seringi inserate în șunt. Cheagurile plasmatice se prepară prin amestecarea a 0,3 ml de plasmă săracă în trombocite cu o cantitate infimă (aproximativ 1,5 pCi) soluție de fibrinogen uman marcat ¹²⁵l (Amersham, Buckinahamshire, UK) și 0,07 ml dintr-un amestec de trombină bovină (15 NIH unități/ml) și 0,5 M CaCI₂ urmat de incubare 30 min, la 37°C. Cu 30 min înainte de începutul infuzării se administrează 7,5 mg/kg ridogrel (un inhibitor al tromboxan sintetazei și un antagonist de receptor prostaglandin endoperoxid) (De Clerck F, Beetens J, de Chaffoy de Courcelles D, Freyne E, Janssen PA: R68070: thromboxane A2 synthetase inhibition and thromboxane A2/prostaglandin endoperoxide receptor blockade combined in one molecule. I. Biochemical profile in vitro. Thromb Haemost 61: 35-42; 1989) în bolus intravenos pentru a preveni depozitarea plachetelor în șuntul extracorporal. Animalele se anticoagulează cu heparină (300 unități/kg urmat de o perfuzie continuă, cu 200 unități/kg/h, în timpul experimentului) și se adaugă întâmplător în perfuzie 400 pg/kg SakSTAR, (4 sau 8 iepuri) sau 200 la 1000 pg/kg variantă SakSTAR (8 iepuri). La 6 săptămâni, jumătate din iepurii tratați cu varianta SakSTAR sunt tratați din nou cu

690

695

700

705

710

715

720

725

730

735

RO 116969 Bl aceiași variantă SakSTAR și altă jumătate cu SakSTAR de tip sălbatic, în timp ce iepurii imunizați cu SakSTAR sunt tratați, fie cu varianta SakSTAR (dacă acest grup martor a constat din 4 iepuri), fie tratat în mod aleator cu SakSTAR tip sălbatic, sau cu varianta SakSTAR (dacă acest grup martor a conținut 8 iepuri). Agenții trombolitici se administrează intravenos în bolus 10% și perfuzie 90% în cursul unei ore. Durata timpului lizei cheagului se monitorizează continuu prin numărare gama externă, folosind 2 cristale 3x0,5 inch iodură de sodiu/taliu (Bicron, Newbury, OH] plasate pe șunturile extracorporale. Cristalele de scintilație sunt conectate la un sistem specializat Canberra-5100 (Canberra-Packard, Meriden, CT) și datele sunt analizate, așa cum este descris în altă parte (Stassen JM, Vanlinthout I, Lijnen HR, Collen D: A hamster pulmonary embolism model for the evaluation of the thrombolytic and pharmacokinetic rpoperties of thrombolytic agents. Fibrinolysis 4 (Suppl 2): 15-21, 1990). La sfârșitul experimentului, se recuperează de asemenea, cheagurile reziduale din seringi pentru determinarea conținutului lor de radioizotop. Experimentele pe animale se dirijează, conform principiilor directoare ale American Physiological Society și Internațional Commitete on Thrombosis and Haemostasis (Giles AR: Guidelines for the use ofanimals in biomedical research. Thromb Haemost 58: 1078-1084, 1987).

Imunogenicitatea SakSTAR și a mutantelor singulare respective (M3, MS și M9) este comparată în tabelul 3A. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± abaterea standard.

La 8 iepuri randomizați la mutanta M3, activitatea de neutralizare de bază este 0,0 ± 0,0 pg/ml ambele împotriva SakSTAR și împotriva M3. Infuzarea intravenoasă a 200 pg/kg M3 induce 76 ± 23 procent liză cheag. Acești 8 iepuri se imunizează apoi cu M3, suspendat în 500 pl de adjuvant Freund complet la săptămâna 2 și în 500 μΙ adjuvant Freund incomplet la săptămânile 3 și 5. La săptămâna 6, activitatea de neutralizare a plasmei este crescută, la 11 ± 6,7 pg/ml, împotriva a SakSTAR și la 11 ± 7,2 pg/ml, împotriva M3. la săptămâna 6, infuzarea a 400 pg SakSTAR în 4 din acești iepuri, selectați randomic, a produs 18 + 27 per sută liza cheagului, în timp ce infuzarea, a 200 pg/kg M3 în alți 4 iepuri a indus 16 ± 17 per sută liză. La 4 iepuri atribuți la SakSTAR, activitatea de neutralizare de bază este 0,2 ± 0,2 pg/ml, împotriva SakSTAR și 0,0 ± 0,0 mg/ml, împotriva M3. Infuzarea intravenoasă a 400 pg/kg SakSTAR produce 89 ± 8,6 per sută liză de bază. Acești 4 iepuri sunt apoi imunizați cu 400 pg SakSTAR suspendat, fie în 500 pg de adjuvant Freund complet (la săptămâna 2), fie adjuvant Freund incomplet (la săptămânile 3 și 5). La săptămâna 6, activitatea de neutralizare plasmă crește la 35 ± 23 pg/ml, împotriva SakSTAR și la 19 ± 13 pg/ml, împotriva M3. Infuzarea intravenoasă a 200 pg/kg SakSTAR.M3 în acești 4 iepuri la săptămâna 6 induc 9,3 ± 8,2 per sută liză.

La 8 iepuri atribuiți mutantei M8, activitatea de neutralizare de bază din plasmă este 1,4 ± 0,2 pg/ml, împotriva SakSTAR și 0,6 ± 0,5 pg/ml, împotriva M8. Infuzarea intravenoasă a 1000 pg/kg M8 produce 41 ± 13 per sută liză. Apoi, acești iepuri se imunizează 400 ug M8 suspendat în adjuvant Freund complet la săptămâna 2 și cu aceiași cantitate în adjuvant Freund incomplet la săptămânile 3 și 5. La săptămâna 6, activitatea de neutralizare a plasmei crește la 3,8 ± 1,8 pg/ml împotriva SakSTAR și la 5,9 ± 2,7 pg/ml împotriva M8. Infuzarea a 400 pg/kg SakSTAR în 4 din acești iepuri, produce 49 ± 28 per sută liza cheagului, în timp ce infuzarea a 1000 pg/k M8 în alți 4 iepuri produce 24+11 per sută liză. La 8 iepuri atribuiți

RO 116969 Bl grupului SakSTAR activitatea de neutralizare de bază în plasmă a fost 0,9 ± 0,6 pg/ml, împotriva SakSTAR și 0,6 ± 0,3 pg/ml, împotriva M8. Infuzarea intravenoasă a 400 pg/kg SakSTAR produce 68 ± 18 per sută liză. Acești iepuri sunt imunizați apoi subcutanat cu 400 pg SakSTAR suspendat în adjuvant complet Freund la săptă- 7 85 mâna 2 și cu aceiași cantitate în adjuvant Freund incomplet la săptămânile 3 și 5. La săptămâna 6, activitatea neutralizare a plasmei crește la 59 ± 47 pg/ml, împotriva SakSTAR și la 22 ± 16 pg/ml, împotriva M8, în timp ce potența trombolitică reziduală a 400pg/kg SakSTAR scade 7,5 ± 2,4 per sută și a 1000 pg/kg M8 la 4,1 ± 4,8 per sută. 790

La 8 iepuri atribuiți mutantei M9, activitatea de neutralizare de bază din plasmă este 0,2 ± 0,05 pg/ml, împotriva SakSTAR și 0,03 ± 0,05 pg/ml, împotriva M9.

Infuzarea intravenoasă a 400 pg/kg M9 produce 72 + 11 per sută liză. Apoi, acești iepuri se imunizează cu 400 pg M9 suspendat în adjuvant Freund complet la săptămâna 2 și cu aceiași cantitate în adjuvant Freund incomplet la săptămânile 3 și 795 5. La săptămâna 6, activitatea de neutralizare a plasmei crește la 8,0 ± 4,6 pg/ml, împotriva SakSTAR și la 3,5 ± 2,6 pg/ml, împotriva M9. La săptămâna 6, infuzarea a 400 pg/kg SakSTAR în 4 din acești iepuri, produce 53 ± 11 per sută liza cheagului, în timp ce infuzarea a 400 pg/ka M9 în alți 4 iepuri produce 40 + 7,8 per sută liză.

La 4 iepuri martor atribuiți la SakSTAR, activitatea de neutralizare de bază în plasmă eoo este 0,1 + 0,05 pg/ml, împotriva SakSTAR și 0,05 + 0,06 pg/ml, împotriva M9. Infuzarea intravenoasă a 400 pg/kg SakSTAR produce 78 ± 13 per sută liză. Acești iepuri sunt imunizați, apoi cu 400 pg SakSTAR suspendat în adjuvant complet Freund (săptămâna 2) și respectiv, adjuvant Freund incomplet (săptămânile 3 și 5). La săptămâna 6, activitatea neutralizare a plasmei crește la 16 + 5,0 pg/ml, împotriva sos SakSTAR și la 12 + 9,1 pg/ml, împotriva M9, în timp ce activitatea trombolitică reziduală a M9 crește la 24 + 23 per sută.

Imunogenicitatea SakSTAR față de mutantele duble M3.8 și M8.9 este comparată în tabelul 3B. La 8 iepuri atribuiți grupului M3.8, activitatea de neutralizare de bază din plasmă este 0,6 ± 0,3 pg/ml, împotriva SakSTAR și 3,5 ± 2,0 pg/ml, sio împotriva M3.8. Infuzarea intravenoasă a 1000 pg/kg M3.8 produce 53+13 per sută liză. Acești iepuri se imunizează apoi, cu 400 pg M3.8 suspendat în adjuvant Freund complet la săptămâna 2 și cu aceiași cantitate în adjuvant Freund incomplet la săptămânile 3 și 5. La săptămâna 6, activitatea de neutralizare a plasmei a crescut numai la 1,7 ± 0,7 pg/ml, împotriva SakSTAR și la 6,1 + 3,0 pg/ml, împotriva M3.8. 815

Infuzarea a 400 pg/kg SakSTAR în 4 din acești iepuri produce 77+18 per sută liza cheagurilor, în timp ce infuzarea a 1000 pg/kg M3.8 în alți 4 iepuri produce 59 ± 25 per sută liză. La 8 iepuri atribuiți grupului SakSTAR, activitatea de neutralizare de bază în plasmă este 0,6 ± 0,4 pg/ml, împotriva SakSTAR și 2,0 + 2,0 pg/ml, împotriva M3.8. Infuzarea intravenoasă a 400 pg/kg SakSTAR a produs 80 ± 10 per sută liză. Apoi, acești iepuri se imunizează subcutanat cu 400 pg SakSTAR suspendat în adjuvant Freund complet la săptămâna 2 și cu aceiași cantitate în adjuvant Freund, incomplet la săptămânile 3 și 5. La săptămâna 6 activitatea de neutralizare a plasmei a crescut la 20 + 15 pg/ml, împotriva SakSTAR și la 21 +22 pg/ml, împotriva M3.8, în timp ce activitatea trombolitică reziduală a 400 pg/kg SakSTAR a scăzut la 8, 5 825 ±6,7 per sută și a 1000 pg/kg M3.8 la 30 ± 29 per sută.

RO 116969 Bl

La 8 iepuri atribuiți grupului M8.9, activitatea de neutralizare de bază din plasmă este 0,3 ± 0,2 pg/ml, împotriva SakSTAR și 1,6 ± 0,5 pg/ml,împotriva M8.9. Infuzarea intravenoasă a 800 pg/kg M8.9 produce 39+13 per sută liza cheagului la bază. Apoi, acești 8 iepuri se imunizează cu 400 pg M8.9 suspendat în adjuvant Freund complet (săptămâna 2] sau adjuvant Freund incomplet (săptămânile 3 și 5). La săptămâna 6, activitatea de neutralizare a plasmei a crescut numai la 2,5 ±1,5 pg/ml, împotriva SakSTAR și la 4,9 ±1,3 pg/ml, împotriva M8.9. La săptămâna 6, infuzarea a 400 pg/kg SakSTAR în 4 din acești iepuri, produce 51 ± 35 per sută liza cheagului, în timp ce infuzarea a 800 pg/kg M8.9 la alți 4 iepuri produce 39 + 12 per sută liză. La 4 iepuri martor atribuiți la SakSTAR pretratamentul activității de neutralizare este 0,2 ±0,1 pg/ml, împotriva SakSTAR și 0,7 ± 0,3 pg/ml, împotriva M8.9. Infuzarea intravenoasă a 400 pg/kg SakSTAR induce 67 ± 19 per sută liza cheagului. Acești 4 iepuri sunt imunizați apoi, cu 400 pg SakSTAR suspendat în adjuvant complet Freund (săptămâna 2] și respectiv, adjuvant Freund incomplet (săptămânile 3 și 5). La săptămâna 6, activitatea neutralizare plasmă crește la 20 ± 15 pg/ml, împotriva SakSTAR și la 18 ± 15 pg/ml, împotriva M8.9, în timp ce activitatea trombolitică reziduală a M8.9 a scăzut numai la 31 ±30 per sută liză.

Aceste rezultate arată că în acest studiu comparativ al SakSTAR și variantelor selectate, în special, mutantele duble (M3.8 și M8.9) induc o activitate de neutralizare a anticorpilor, în mod semnificativ mai slabă și rezistență la liză mai mică decât SakSTAR.

Exemplul 5. Imunogenicitatea comparativă a SakSTAR și M3.8 la babuini

Se studiază imunogenicitatea comparativă a SakSTAR și M3.8 din punct de vedere al inducerii de anticorpi neutralizați și al refractarității la tromboliză după administrare repetată.

Experimentele pe animale se realizează,conform principiilor directoare, ale American Physiological Society și Internațional Commitete on Thrombosis and Haemostasis (Giles AR: Guidelines for the use of animals in biomedical research. Thromb Haemost 58: 1078-1084, 1987). La babuini anesteziați și intubați, se creează un circuit arteriovenos extracorporal prin conectarea, prin intermediul unui tub extern din polietilenă, a arterei tibiale sau brahiale cateterizate la o venă periferică. O pompă peristaltică dirijează și menține fluxul sangvin continuu monitorizat, prin bucla extracorporală, în care se adaptează două seringi hipodermice, conținând fiecare 0,3 ml cheag plasmatic proaspăt colectat de la babuin cu fibrină marcată ¹²⁵l. Durata de timp a lizei cheagului în timpul infuzării de SakSTAR sau variantă M3.8 se monitorizează continuu, prin numărare gama externă pe seringi. Alternativ, se determină balanța recuperării izotopului prin compararea sumei radioactivității sangvine totale la sfârșitul experimentului (multiplicat cu un factor 3 pentru corectarea distribuției extravasculare), plus radioactivitatea în trombii recuperați, cu cea prezentă inițial în cheaguri.

înaintea fiecărui experiment de tromboliză, babuinilor li s-a administrat în bolus intravenos ridogrel, 3 mg/kg, pentru a preveni depozitarea plachetelor în sistemul extracorporal. în timpul experimentelor de tromboliză, se dă heparină intravenoasă în bolus, de 300 lU/kg, urmat de perfuzia, a 200 lU/kg/h.

Se alocă randomic 12 babuini masculi adulți (Papio hamadryas] în momemntul inițial (săptămâna O), pentru tratament cu 50 pg/kg, fie de SakSTAR (grupul 1), fie

RO 116969 Bl de varianta M3.8 (grupul 2), în perfuzie intravenoasă în bolus 10%,timp, de o oră și se cercetează activitatea trombolitică de bază prin monitorizarea dispariției radioactivității din cheaguri, timp, de 2 h. Apoi, babuinii se imunizează subcutanat, cu 500 pg, 875 fie de SakSTAR (grupul 1), fie de variantă M3.8 (grupul 2], suspendat în adjuvant Freund complet, la două săptămâni, și în adjuvant Freund incomplet la săptămânile 3 și 5. La 6 săptămâni, se cuantifică eficacitatea trombolitică cu ajutorul modelului de tromboliză extracorporală, în decurs de 4 h: 3 din 6 babuini ai grupului 1 tratați la început și imunizați ulterior cu SakSTAR și 3 din 6 babuini ai grupului 2, tratați la bază 88o și ulterior, imunizați cu M3.8, se selectează randomic și au primit întâi 50 pg/kg SakSTAR, infuzat intravenos, timp, de o oră, în bolus 10% și apoi, după 2 h de la începutul perfuziei SakSTAR, aceeași cantitate de M3.8 (grupurile 1A și, respectiv, 2A). Alți 6 babuini primesc aceeași terapie, dar în ordine inversă: mai întâi M3.8, apoi SakSTAR (grupurile 1B și 2B pentru babuini imunizați anterior cu SakSTAR și, 885 respectiv, M3.8), La 18 săptămâni, se evaluează eficacitatea trombolitică a 3-a oară prin monitorizarea dispariției radioactivității din cheagurile de fibrină în decurs de 3 h: 3 din cei 6 babuini imunizați cu SakSTAR au primit 250 pg/kg SakSTAR în bolus intravenos, în 2,5 min (grupul 1A), în timp ce alți 3 babuini imunizați cu SakSTAR au primit aceiași cantitate de M3.8 (grupul 1B). Din cei 6 babuini imunizați cu M3.8, 3 890 primesc în bolus intravenos 250 pg/kg SakSTAR (grupul 2A) și 3, aceiași cantitate de M3.8 (grupul 2B].

Se colectează probe de sânge în eprubete citratate (concentrație finală 0,01 M] înițial și la câteva momente de timp după aceea pentru măsurarea timpului de tromboplastină parțial activată (aPTT), a fibrinogenului, a₂-antiplasminei (la începutul 895 și sfârșitul fiecărui experiment] și activitățile de neutralizare SakSTAR și M3.8 (înainte de infuzarea trombolitică). Prin urmare, cantități crescute, fie de sakSTAR, fie M3.8 (50 pl voi, conținând 0,2 până la 1000 pg/ml) se adaugă la un amestec de 300 pl plasmă umană citratată și 50 pl tampon sau plasmă test de babuin, urmată imediat de adăugarea a 100 pl dintr-un amestec de trombină (50 NIH U/ml] și CaCI₂ (25 900 pM). Timpul de liză a cheagului plasmatic se măsoară și se reprezintă grafic, în funcție de concentrația de SakSTAR sau M3.8. Din această curbă se determină concentrația de activator de plasminogen care produce liza completă a cheagului, în 20 min. Activitatea de neutralizare se definește ca diferența dintre valorile plasmei testate și a soluției tampon și se exprimă, în pg/ml plasmă. 905

Fibrinogenul sistemic nu este degradat și nici ayantiplasmina nu este consumată, ceea ce reflectă specificitatea totală pentru fibrină a ambilor agenți.

Din a 6-a săptămână, activitățile de neutralizare SakSTAR ale grupului 1 sunt semnificativ mai ridicate decât activitățile de neutralizare M3.8 ale grupului 2. Grupul 1 a prezentat activități de neutralizare mai rapid și în mod considerabil, mai marcate 910 împotriva SakSTAR, decât împotriva M3.8, în timp ce activitățile de neutralizare M3.8 niciodată nu depășesc activitățile de neutralizaze SakSTAR în grupul 2 (Tabelul 4], Din a 8-a săptămână, grupul 1 prezintă în mod semnificativ mai multe activități de neutralizare împotriva, atât a SakSTAR, cât și împotriva M3.8,decât grupul 2 (Tabelul 4],

Inițial, 50 pg/kg SakSTAR infuzat intravenos în decurs de o oră, induce 77 ± 915

2,9% liza cheagului, în 2 h, la 6 babuini (grupul 1) și 50 pg/kg M3.8 induc 83% ± 3,6% liza cheagului, în 2 h, la alți 6 babuini (grupul 2) (medie ± SEM, p= 0,2). La 6 săptămâni, eficacitatea litică, în 2 h a 50 pg/kg SakSTAR, infuzat intravenos într-o

RO 116969 Bl oră, scade la 9,2 ± 1,0% la 3 babuini imunizați cu SakSTAR (grupul 1) și la 8,5 ± 3,2%, la 3 babuini imunizați cu M3.8 (grup 2A), în timp ce eficacitatea litică a 50 pg/kg M3.8 intravenos, în 2 h scade la 10 ± 6,9%, la 3 babuini imunizați cu SakSTAR (grupul 1B] și la 11 ± 7,4%, la 3 babuini imunizați cu M3.8 (grupul 2B; p<0,001 față de liza de bază corespunzătoare pentru toate grupurile; p=NS între grupuri). Două ore după începutul primei infuzări trombolitice, se infuzează 50 pg/kg intravenos din alt agent, timp, de o oră, obținându-se eficacități litice reziduale comparabile: 7,7 ± 1,5% și 11 ± 5,7% liza cheagului în curs, de 2 h cu M3.8 în grupurile 1A și, respectiv, 2A, și 13 ± 2,7% și 12 ± 2,1% liza cheagului pe 2 h cu SakSTAR la grupurile 1B și, respectiv, 2B.

La 18 săptămâni injectarea intravenoasă în bolus a 250 pg/kg SakSTAR dă 39 ± 5,3% liza cheagului, în 3 h la 3 babuini imunizați cu SakSTAR (grupul 1A), în timp ce activitatea trombolitică reziduală a 250 pg/kg M3.8 la 3 babuini imunizați cu M3.8 (grupul 2B) este semnificativ mai mare: 68 ± 4,5% liză cheag în 3 h (p< 0,05%). 250 pg/kg SakSTAR produc 58 ± 9,5% liza cheagului, în 3 h, la 3 babuini imunizați cu M3.8 (grupul 2A; p=O,1, față de grupul 1 A), în timp ce liza cheagului, în 3 h cu 250 pg/kg M3.8 la 3 babuini imunizați cu SakSTAR (grupul 1B) este 39 ± 3,6% (p=0,0005, față de grupul 2B). Rezultatele analizei, indiferent de agentul administrat la 18 săptămâni, arată o liză reziduală, în 3 h, de 39 ± 3,0% pentru grupul 1, imunizat cu SakSTAr, față de 63 ± 5,2% pentru grupul 2, imunizat cu M3.8 (p<0,0005).

Activitățile trombolitice se corelează invers cu activitățile de neutralizare corespondente, pe perioada studiului (Spearman r= -0,83; p<0,0001).

Astfel, mutanta M3.8 are acțiune și specificitate pentru fibrină, comparabile cu SakSTAR de tip sălbatic la babuin, dar este în mod considerabil mai puțin antigenică decât acesta, după cum reiese din faptul că are loc o inducere mai slabă a activităților de neutralizare din plasmă și prin recuperarea mai rapidă a potențialului trombolitic după imunizare. Aceste rezultate obținute la primate, confirmă și extind observațiile de mai sus la iepuri.

Exemplul 6. Eficacitate trombolitică comparativă și imunogenicitatea M.8 și M8.9 față de SakSTAR la pacienți cu ocluzie arterială periferică

Se administrează intra-arterial SakSTAR (n=8), M3.8 (n=4) și M8.9 (n=4) la nivelul trombusului ocluziv sau la capătul său proximal, în bolus de 2 mg urmat de o perfuzie, a 1 mg/h, la pacienți cu ocluzie arterială evidențiată angiografic, la nivelul unei artere periferice sau la nivelul unei grefe bypass. Pacienții se studiază după ce și-au dat acordul și protocolul este aprobat de Human Committee of the University of Leuven. Criteriile de includere și excludere sunt în esență cele descrise anterior (Vanderschueren S, Stockx L, Wilms G, Lacroix H, Verhaeghe R, Vermylen J, Collen D: Thrombolytic therapy of peripheral arterial occlusion with recombinant staphylokinase. Circulation 92: 2050- 2057, 1995) cu excepția faptului că, este permisă reluarea retratamentului cu fragment de stafilokinază recombinantă, în 48 h. Tratamentul antitrombotic asociat cu heparină, aspirină și anticoagulante orale este cel descris anterior (Vanderschueren S, Stockx L, Wilms G, Lacroix H, Verhaeghe R, Vermylen J, Collen D: Thrombolytic therapy of peripheral arterial occlusion with recombinant staphylokinase. Circulation 92: 2050-2057, 1995).

Starea de blocare a arterei periferice sau grefei bypass ocluzionate este evaluată serial înainte, la cel puțin fiecare 4 h, în timpul și la sfârșitul perfuziei intraarteriale a SakSTAR de tip sălbatic sau variant. Evaluarea angiografică a permeabilității

970

RO 116969 Bl vasului țintă la sfârșitul perfuziei a constituit rezultatul principal al studiului. Administrarea agentului trombolitic încetează, atunci când se realizează permeabilizarea adecvată a vasului, când complicațiile apărute fac necesară întreruperea sa sau când două angiograme consecutive, nu demonstrează progresul lizei chegului. Recanalizarea este definită ca liza cheagului, suficientă pentru a relua fluxul anterograd prin segmentul ocluzionat anterior. Sunt permise proceduri intravasculare complementare cum ar fi, angioplastia transluminală percutanată (PTA), când investigatorii au apreciat că trombusul este lizat suficient sau că nu se preconizează o activitate litică suplimentară.

Tensiunea arterială și ritmul cardiac se monitorizată înainte, în timpul și după perfuzia cu SakSTAR, M3.8 sau M8.9. Se recoltează probe de sânge înainte și la sfârșitul a 6 h, după procedura angiografică. Măsurătorile includ măsurarea activității sângelui periferic, timpul de protrombină (PT), aPTT, fibrinogen, a_P-antiplasmină, plasminogen teste biochimice ale funcției hepatice și renale. Activitățile de neutralizare SakSTAR, M3.8 și M8.9 și IgG și IgM anti-SakSTAR, anti-M3.8 și anti-M8.9 sunt determinate serial pe probe de sânge recoltate în timpul spitalizării și după externare. Urmărirea clinică are în vedere recurența trombozei și reacțiile adverse cum ar fi, reacții alergice și sângerare importantă (adică, nevoia de transfuzie de sânge sau controlul chirurgical al hemostazei, scăderea hematocritului cu >10%, sau hemoragie intracraniană).

Grupuri de 4 la 8 pacienți (41 la 73 ani) cu PAO documentată angiografic, cu o durată estimată, de 1 la 120 zile și o lungime, de 8 la 50 cm, sunt tratați cu M8.9 sau SakSTAR. Un pacient (WAL) care primește SakSTAR de tip sălbatic prezintătă o reacție de tip anafilactic, în primele 5 min de la administrarea în bolus a 2 mg. Perfuzia este întreruptă imediat și tensiunea arterială revine la normal, în 20 min de perfuzie cu expanderi plasmatici. Acest pacient nu este inclus pentru calcularea mediei ± SEM din tabelele 5 la 7. Un pacient (LAN) care primește M8.9 prezintă reocluzie, după 30 h, care se tratează cu 6,5 mg de variantă. Acest pacient a prezentat la

2...3 săptămâni, o activitate de neutralizare M8.9 de 7,8 pg/ml și IgG specifice antiM8.9 de 270 pg/ml.

Caracteristicile relevante de bază ale pacienților individuali sunt prezentate în tabelul 5. Majoritatea PAO sunt la nivelul femuro-popliten. Toate se datorează trombozei in situ. Sunt incluse 2 grefe și 2 ocluzii iliace dilatate. Dintre pacienți, 9 au prezentat claudicație invalidantă, 2 aveau durere ischemică cronică în repaus, 4 aveau ischemie subacută și unul cu ischemie acută.

Tabelul 6 rezumă rezultatele individuale și urmările. Infuzarea intra-arterială, la o doză, de 5,5 la 13 mg, timp, de 3,5 la 11 h, induce recanalizarea completă, la 13 pacienți, recanalizarea parțială la un pacient și, nici o îmbunătățire la alt pacient. Complementar se realizează proceduri endovasculare (în principal PTA), la 12 pacienți și intervenție chirurgicală imediat după tromboliză la 1 pacient. Recurența trombozei după sfârșitul procedurii angiografice este întâlnită la 4 pacienți: primul pacient este retratat cu succes, după 30 h cu 6,5 mg M8.9, la al doilea s-a realizat bypass aorteo-biiliac, al treilea pacient este recanalizat cu succes, după 20 h, cu 40 mg rtPA, iar la al patrulea pacient trombusul este aspirat transluminal pacient. Complicațiile hemoragice sunt absente sau limitate la formarea de hematom ușor până la moderat la locurile puncției angiografice cu excepția unui pacient care dezvoltă un hematom în

975

980

985

990

995

1000

1005

1010

RO 116969 Bl mușchiul cvadriceps drept. Alte complicații legate de manipulările endovasculare includ embolizarea distală și disecția arterială care necesitată încetarea prematură a infuzării trombolitice la pacientul respectiv. O ocluzie a arterei femurale superficiale se dovedește a fi rezistentă, la 8,0 mg SakSTAR infuzat, în 6 h și este ulterior rezolvată cu succes prin PTA (Tabelul 6).

Nivelurile circulatorii de fibrinogen, plasminogen și a^-antiplasmină rămân neschimbate în timpul perfuziei cu fragmente SakSTAR (Tabelul 7), reflectând specificitatea absolută pentru fibrină a acestor agenți la dozajele folosite. A avut loc digestia substanțială a fibrinei in vivo, așa cum s-a dovedit prin creșterea nivelurilor de Ddimer. Terapia intra-arterială cu heparină a prelungit aPTT (Tabelul 7).

Activitatea de neutralizare a anticorpilor legat de SakSTAR-, M3.8- și M8.9- și nivelul de IgG specfică anti-SakSTAR-, M3.8- și M8.9-, este scăzută la bază și în timpul primei săptămâni după infuzare (Tabelul 8). Din a doua săptămână, nivelurile activității de neutralizare cresc la valorile medii de 2,9 pg și 3,3 pg, variantă SakSTAR neutralizată per ml plasmă la pacienți tratați cu M3.8 și, respectiv, M8.9, care este semnificativ mai scăzută față de valoarea medie de 9,1 pg SakSTAR.de tip sălbatic neutralizată per ml la pacienți tratați cu SakSTAR (p=O,O3 pentru variante față de tipul sălbatic prin testul Mann-Whitney suma rangurilor). Nivelurile IgG specifice SakSTAR cresc la valorile medii de 51 și 31 pg/ml plasmă la pacienți tratați cu M3.8 și, respectiv, M8.9, cea ce este semnificativ mai scăzut decât valoarea medie de 240 pg/ml la pacienții tratați cu SakSTAR (p=O,O1 pentru variante, față de tipul sălbatic prin testul Mann-Whitney suma rangurilor).

Astfel, la pacienți cu ocluzie arterială dozele date, de 5,5 la 13 mg de compus, M3.8 și M8.9 induc semnificativ mai puțini anticorpi de neutralizare și IgG specifice anti-stafilokinază decât SakSTAR. Aceste variante asigură dovada conceptului că reducerea răspunsului umoral împotriva stafilokinazei recombinante prin ingineria proteinei este fezabil.

2 co CD

2 ω CD

2 CD

M18

2 sj

M16

M15

2 ro

2

2 O

2 (0

2 00

2 σι

2 UI

2 ω

2 ro

2 ro

2 ru O

O

7Ϊ

X

m

X

I

O

m

X

Π

X

m

X

m

X

x

o

X

Q

sj

co

(0

(0

00

m

si

CD

UI

ω

co

CD

UI

X»

cn

(0

ω

O

CD

ω X co

CD ’m 00

O

Xi

sl ’m UI

UI

’m Sl

’m ω

Xi X

CJ

(0 x

cn ’m

CD m

X 10

b 00

m sj

m 0)

’m ω

X

X Q

m

cn m sl sj X

00 X m sl ϋ

ω UI X

_i ro

co T

s

xj X CD CD

Xi

00

ro

Ui m s| Sl

UI

ω X UI CD

0)

UI

4P 1

g

m 00 O

’m Sl cn

ω CD

CD

&

h

ZJ

00

sj

ro

sl

cn

Xi UI

sj X»

o

8

ω ro

Xi •sl

(0 •s|

sj ω

ω o

O

8

8

(0 Sl

ru UI

ru Xi

8

ω O

O

ro

CD

ro

ro

CD

sj

V

CD

Xi

ro

m

sl

CD

ro

ω

O

ui

0)

CD

iu

’ro

ui

ω

UI

’o

00

_*

CD

io

Xi

0

0.034

O O cn

ru

ro

ru •X»

ω ro

cn

Xi

(0

_a Xi

ω

o ro

V o

co sl

-

(0

0)

ru

sj

ru

5.

O O ω

O O (0

CD

ω

sl

ro

ω

O

00

CD

UI

UI

Sl

ω o

8 TJ

’xj

x>

ro

ω

ω

sj

o

io ro

(D

Q

sl

Xi

ru

Xi

δ

(O 2 T3

BO'O

O O ω

TU

ro

ro

ω

ω

CD

ro

O

IU

sj

V

ru

CD

ro 03

cn

cn

cn

(0

sj

O

Xi

_î

ω

Xi

xî

(0

’ro

CD

ro

O

O O sj

ro

ro

CD

CD

(0

ro

Xi

ro

O

ru

IU

(0

CD

ω

ω 0

'2

UI

Xi

cd

sl

o

A

ϋ)

00

iu Xi

(0

sj

in

(0

ui

sl

ui

O

ω

CD

ro CD

CD

ro

m

ro

UI

V

1

s|

co

00

CD

V CD

cu CD

sj

in

UI

O

00

ω

U

in

ro

CD

00

ru

in

si

*

iu

o

CD

cn co

V 00

CD cn

ro cn

ω

ro CD

V CD

00

cn ’sl

A s|

V IU O

ru

CD

m

cn

IU ro

_* CU

V ro

00 “Π

ru

ro O

CD ΓΟ

V ω cn

Xi

CD CD

in

CD

-

Xi io

V ro UI

V ru UI

V m

Xi

o

IU Xi

ui

ru ω

V ru ui

A T UI

m

Ό

s

ω

G)

V

Xi

ro

ro

ro

_*

V

sl

V

V

m

0)

CD

ω

ru

V

ru CD

<□

CD

’xl

ui

®

CD

ω

(0

O

Sl

O

CD

’s|

in

ro

CD

xj

(D

I Xi

2 Ό

O

P

Xi

ω

ω

ro

CD

ω

Xi

ro

O O

O n

O

ru

ru o

ΓΟ

-»

CD

—i

’ro

ro

iu

UI

sj

m

ru

m

in

Xi

CD

σ

00

u

0

ω

Oi

V

o

CD

ro

(0

V ro

V

V Sl

UI

V <0

V

ω IU

O

CD

ro

in

ro

ω

cn

cn

o

0)

iu

m

iu

O

co

O

Xi

CD ru

O

O

O

p

o

o

A

Xi

o

V

UI

O

sj

ω

g

sj

CD

UI ro

ro

’ro

Xi

CD 00

Xi

CD

sj

m

’m ro

b

ω

’o

Xi

-*

O

O

o

O

O

o

o

O

O

O

o

o

O

o

8 ω

o σ>

ro

ro

O

X» ω

in CD

Xi

b CD

O ω

ώ ω

in (O

ω m

’o ro

C0 ω

ω

m

ru

O

O O Xi

□

ro

0)

UI

O

Xi

O

cn

ω

ro

o CD

ω

A

CD

sj

Xi

o Sj

cn

m

’sj

O UI

CD

m

TJ

O

O

o

□

ro

ro

ro

o

o

(0

o

o

ω

o

Xi

8

cn

O cn

CD X>

Xi Xi

CD

~*

Xi

’ro

Xi

ω

o cn

iu

Xi ro

UI

ω

ω

m

8 ro

<□ 2 u

O O

CD

CD

ω 0)

ro O

CD

O

ω

sj

ro CD

V O O

V 0) ’m

UI CD

O

m

cn

(U 00

Xi cn

m io

ru Xi 2

o b

O O ω

o

ro

CD

CD

O 8

ru

p ω

iu

ω

’m

ro m

ω b

o sj cn

ω ’ro

ro ’o

> O

o o

o Cn CT

O cr O

r o t—» o ⁱX>

O co o o

cr>

Absorbția a 90 procente este reprezentată ca +. Grupurile de epitopi sunt cele identificate în tabelul 1

Mediană

Medie +SD

Epitop lipsă

SWIN

â Γ O

ASSE

PELG

DED0

VBR0

VBR0

FLUY

G0DT

VERB

VERM

DEBE

VERS

FLUS

BANC

COEL

□

ω

ω 1+ ΓΌ CD

60

CD

75

85

35

47

33

ui

47

00

45

—i

75

ro

98

Titru (pg/mi)

95

ω ui 1+

□

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

SakSTAR

96

90±B

=

+

+

+

+

+

+

85

75

+

00 co

+

+

+

68

+

ω

72

1+ ΓΌ O

-

CD (O

+

B3

75

78

84

+

75

ro ω

+

64

47

+

49

59

83

MB

93

00 ω 1+ ro

--

+

+

+

+

+

+

+

85

56

+

88

00

+

+

64

+

6ΙΛΙ

Procent <

o

+

+

+

+

+

+

M3+M8

anticorpi absorbiți

o

+

+

+

+

+

+

+

M9+M8

cu

CD CO

CD 00 1+ Γύ

Ț

CD CD

+

00 o

68

75

CD

87

CD

Γϋ o

+

65

53

+

38

50

CD 00

M3.8

01 UI

CD \l 1+ ΓΌ O

T

CD O

+

78

67

73

cn

+

CD ru

ro ru

85

54

67

+

42

56

CD no

M8.9

Rezultatele reprezintă medie±SD a numărului de experimente date între paranteze.

Semnificația nivelurilor s-a determinat cu testul Student-t pentru valorile perechi sau neperechi sau prin testul suma rangurilor Mann-Whitney, unde a fost aplicabil.

TJ

CD

SakSTAR

c. SakSTAR vs M9 Agent imuniz.

TJ

00

SakSTAR

B. SakSTAR vs MB Agent imuniz.

Ό

M3

SakSTAR

A. SakSTAR vs M3 Agent imuniz.

Imunogenicitatea SakSTAR, M3, M8 și M9 la iepuri Tabelul 3A

60'0

p RJ o UJ CD

0.1 ±0,05(4)

σ 0) N m<

ω 0) X § D

Activitate de neu

o g

A & ru ω

O CD & CD ro

CT 0) ΓΜ ax

ω 0) X § X

Activitate de neu

o o ro

O O & S2 S

O ro & ro Z

CT Q> N QX

CD 0) X § ro

Activitate de neutralizare (pg/ml)

0,03

00 O H· CO S

CD l+ Ol O £

CD (0 ax u CY

o 8 oi

ω bo H· 00 ω

UI CD H· £> X ω

CD cd QX Ό ct

p ’ru

11 ±8,7(8)

ω ui H· tu ω s

CD CD ax T3 et

1

o 8

O 8 CD

T)

•

o o

o o

Ό

O 8 ω

o b CD

“0

0,6

o o ω & O UI ω

o 8 5 O cn Έ

cr 0) N ax

CD

tralizare (pg/ml)

o

o CD & UI ω

o CD & ω ω

CT 0) N ax

2 ro

tralizare (pg/ml)

-

o b & o m

O o & fl A

CT 0) N ax

ω

O b U

ω ui Htu CD m

IU 1+ CD

CD CD ax o ct

o o

CD CD H* TU xJ 00

ΓΌ Γϋ Η- cn ω

CD CD ax Ό ct

p no

H· X ΓΌ ω

•A CD H· ω S

CD CD ax TJ ct

o o xl

o o ω

T)

o 8 UI

o o

TJ

o 8

o 8

ro

xj CD H- ω £

CT ω N QX

ω ω 7Γ ω —1 >

•

CD 0D H· 00 S

CT ω N ax

ω 0) X CD -1 > 13

Γ N QX O D CD 0)

•

B9±8,6(4)

CT QJ N ax

SakSTAR (400 pg/kg)

Liză cheag (procent)

UI ω H- s

CD CD QX TJ «t

o 8

4^ CD Hru 00 £

Xj UI 1+ ΓΌ 4* Z

CD CD ax TJ ct

«A 00 HTU X 5

CD CD ax TJ <t

TI

Liză cheag (procent)

o 8

Έ

Ti

Xj TU 1+ OT

cr 0) N ax

ω Z 8 C CQ X x* CQ,

•

4^ Hω ω

•

cr 0) N ax

M3 (1000pg/kg)

Ό “J O O CD □ ct

XJ CD H· TU ω 00

σ QJ N ax

2 ω ΓΌ 8 T CQ X X* CQ,

0,2

O 1+ Xj C0 £

Γϋ 1+ ω ω £

CD CD QX TJ ct

V o oi

ιυ A Η· S

4,1 ±1,8(4)

0) CD ax TJ ct

o b Ol

0) H- X £

CD ω H00 ru s

CD CD □X Ό ct

Λ O 8

TI

o o ω

•

TJ

Λ p

TJ

O

l·-⁴

o o

o kD CH

RO 116969 Bl

ω	ru
cn	o
H-	H-
ω	W
Q	fî
ro	·&
CD	ru
H-	H-
ω	ΪΌ
fi 00	2(4)

RO 116969 Bl ho o o

LC> Cn

CO (J1 o

BR0	LAN	110	Β. M8.9 HEC	Medie±SEM	MER	H00	VLA	A. M3.8 STO	Compus pacient Id.
							Π		Sex
73	35	ω		60±4	32	ω CD	70	63	Vârstă [ani]
Ischemie subacută	Claudicație	Ischemie subacută	Claudicație		Durere ischemică în repaus	Claudicație	Claudicație	Claudicație	Prezentare clinică
Hiperlipidimie; hipertensiune: CAD; insuficiență renală moderată	Infarct miocardic; dilatație arteră iliacă comună dreaptă	Grefă popliteopopliteală stângă	Dilatația arteră iliacă bilateral		Grefă aortobifemurală; amputare picior	Transplant renal	Hipertensiune; boala arterei carotide	t	Istoric relevant
1	+	+	+		+	1	+	+	Fumător
SFA medie dreaptă	CIA dreaptă (dilatată]	Grefă PA stângă	CIA dreaptă (dilatată]		SFA dreaptă	SFA dreaptă	SFA medie stângă	SFA medie dreaptă	Locul ocluziei
-		ω	CD	ro o 1+ CD	co	xl	ro CJl	40	Vârsta ocluziei (zile)
ui	ui	ui	ui	ΓΌ H00	45	ΓΌ □	□	O	Lungime ocluzie (cm]

o c

CD cn

0) c

3]

IO

IO (_n

CD ω i+

CD 1+

CD

CD 1+

CD

CD cn -ι >

CD CD

I ~σ

CD £

Σ3 cn c' □ CD

73'

CD

T, 5'

CL

CD

CD

CD xl

CD CD

ω n c

Hxl

CD

CD

-U O xj ăj‘ 3 m □ Ș o CD CT CL O 3 Σ3 CD cn

Ci

Q)>

CQ CD<

O ω

a. -j CD ω

TJ ct

IO ΓΟ o

TI >

CD

CD Q_

CD

CL “3

T5 ct□)<

CD

Γϋ i—¹ ro i-» (_n

ω ui Hω

CD

CD O

-J CD

CD

CD

ZJ ct

TI C o o c_ o o.

c N cp’

O < ν' Q. CD> cF N Dl cd m o

CD

CJ1

C Qj

to o <_n

o

RO 116969 Bl

ΓΌ

Ο

ΙΌ

CH

Ο

Μ

Ui (Ό

Ο

I-¹ ΓΟ

UJ (_Π

			Β. M8.9					A. M3.8	Compus
00 JJ ο	LAN	OTT	HEC	Medie±SEM	MER	H00	VLA	CD —1 o	Pacient Id.
Completă	Completă	Completă	Completă		Completă		Completă	Completă	Recanalizare prin tromboliză
Ο	-	o	O	□0 00 1+ O ω	JD bi	CD bi	o	CD O	Doză totală agent trombolitic (mg)
C0 ο	_co CJl	00 o	8,0	9‘0+8‘9	7.5	4,5	00 o	O	Durată totală infuz. trombolitic (ore)
Aspirare placă + dilatație	PTA + dilatație	Deloc	PTA + dilatație		Grefă femurotibială	PTA	PTA	PTA	Terapie suplimentară
30 mg rt-PA dat pe 20 ore (*)	Embolizare distală după PTA, rezolvată prin aspirare; reocluzie după 30 ore, retratată cu 6,5 mg SakSTAR.M8.9 (pe 4 ore) și PTA	Deloc	Reocluzie după 8 zile, rezolvată prin grefă aorto- biiliacă		Deloc	Disecție arterială; febră pasageră	Embolizare distală după PTA; rezolvare prin perfuzie continuă cu SakSTAR M3.8; vomă	Frisoane (fără febră)	Complicații ale procedurii angiografice

RO 116969 Β1 ^? neinclus pentru calculare medie+SEM 128 5

Q) -D

Q) ω I

QJ

O O Z) rț D

O c

o

T0 c ω

CD o

r~ ni

□ JJ

1+

O

CD CD 1+ o

□ CD_ O O

CD &

O

ν'

ZJ ω

D CD O m ax (D o

CD o

-I >

ω ui xl bi ro O o

xl bi

ΙΌ □x

ti

O

I	9 =D
CD	0) CD
q	-j o
0)	CD O
	C C
o	=) N.
	2. CD
m	ac nai
—	Q)< C
o	ci
o c:	3 ffit
“Q	-m
C 23
O	0) Q)
ție	στ ω -3 T3
i ve	O “j‘ 3 9>
D	CF CD
O	O
ω	CD
ω	c
CD	c

1x3

Oj

O

-I >

O CD_ O

O

CD O g

m rr m -c+ cd'

CL c u m<

CD

CD a>< το c-tCD O

Ί0 -I >

-J Cn ui bi

I CD 3 m c+ O 3

92.

o o m το co CD

o.

“3 CD

U <rtCD

ΟΊ cn

H¹ (O (_n cn

1315

Η*	Η1	Μ
00	C0	CO
t—*	Ο	ο
Ο	σι	ο

ΓΟ (_Π

ΓΟ

Ο

Ό +

Medie±SEM

BR0

£ ζ

110

HEC

+

Medie±SEM

MER

H00

VLA

8T0

Pacient ld.

ω

ui

înai

XJ 1+ η

ω

ω

ω

1+

ω

ω

ΠΊ

ω

σι

_i

ΓΌ

UI

o

□

CD

□

O “7

ο

ΓΌ

o

o

CD

nog

ΓΌ

ΓΌ

CD

k

UI

□

ΓΌ

4^>

ω

4^

CD

ui

CD

ui

U

□

a?

1+ ρ

Ο

cd

CD

CD

HO

o

O

o

Ό DX

X

ΓΌ

CD

ω

—X

înai

XJ 1+

Χ1

(0

CD

CD

8 Hxl O

120

CD

CD

T)

Ο

σι Ο

σι

CD

ΓΌ

O

CD

8

CD

inte

asminc

Ο

96+

XJ

ω

CD

CD

UI

o o

ΓΌ O

CD

00

□ c

CQ CD □

υι

ω

CD

ΓΌ

HCD

ΓΌ

o

Ό QX

sP

Ο

□

ω

CD

_____>

03 1+

CD

CD

CD

CD

CD 1+

CD

00

□ ω

ΓΌ

Χ|

UD

CD

xl

CJl

o

8

XJ

xl

□

ZJ

Ο

Ο

n

o

CD

tipia

cd

ΓΌ

ω

94±2

92

o o

CD O

93

□0±5,

110

o

o

89

După

3 ZJ ax

O

Xl

ο ο

ω

V

ΓΌ

CD

00

CD

1200

Λ CD

înainte

D-dii

1+ xl

ο

6 O

90

80

1+ ΓΌ

80

ΓΌ O

o o

ρ

Ο

Q

ZJ

O

CD

04

ΓΌ

o CD

-U

D

Q

ca

Ο

ΓΌ

—i

—i

O

ω

ΓΌ

CD

o

X

υ

-Λ

ω

ΓΌ

CD

O

ω

()

Q

UI

c

3

1+

η

( )

U

g

H-

□

( 1

f“)

g

“O

XJ

ο

O

O

O

CD

O

O

Q

O

σι

xl

υ

O

ω

ω

ΞΓ

G0

CD

1+

cd

ΓΌ

ω

ω

i+

ω

ω

ω

ω

ω

ΓΌ

CD

ΓΌ

O

O

ω

CD

ui

□

Ο

ό

o

o

CD

ω Ό —1

’ο

s

=1

ω CD 1+

CD

XI

CD

ui

96+29

Xl

ω

V —>

4^

O c

U1 Ο

σι

UI

ΓΌ

ΓΌ

08

CD

Ό QX

RO 116969 Β1

O 4-	(D Q_ H ω m	STA	POT	VEL	SM0	G	G0D	DRI	KNA	Pacient Id.
	ω
	o	ru	ω	ru	t^	ω	ω	ω	ru	nainti	m
	H· O	CJl	ro	o	ui	CD	CD	ti	O	cr 2.
O	ω									CD	D O CQ
ω	ω										0)
									□
	ru	ω	ru	ru	ϋ	ω	ti	ω	ru	□	S
	H· o		CD	ti	ru	xj	b	CD		T) ax	X
	ω
	CD									înai
	CJ1 H-		CD	CD	ΓΊ	—i ΓΊ	CD	CD	CD	Plas
	ru	o		—i	8	8	ru	CD		nte
	CD									8
o											□
ω	ω,										o CQ CD
	CD H-	—Λ IU O	UI	xl	CD	CD	CD	CD	CD	O c	D
	Xj	UI	CD	ti	£	CD	CJl	O	T> ax	xP
	UI
	CD CD H-		ΓΊ	CD		—Λ	CD	CD	CD	înai
	ω o	O	8	CD	8	8	ω	CD	xl	nte	□
n											“O ω
□1	CD										cn
									3
	4^ H·	— ru O	CD	CD	ω	CD	CD		CD	σ c	q'
	UI	ru	CD	ω	ω	ω	8	O	Ό	QX
							LJ		QX	xP CT'
	ru									5”
	ω	Λ	Λ	650	Λ	Λ	Λ		Λ
	O±87	100	100	8	—i 8	—i 8	+i XJ O	8	ainte	D-dirn
o											CD
o	CD										“3
IU	X										Z3
	8	ti	ϋ	ΓΌ		ui	ti	(U ω	CD	Q	CQ X
	1+ [Ό	ui	xl	—Λ	ru	CD	CD	xl	c
	U	Q	Q	ui	Q	O	8	O	n	3
	XI 8	O	O	O	O O	o	u	8	o	□X
	CD
	ω					r—,				□
	1+	ru	ω	ω	ω	ω	ω	ω	ω	0)
	—ăk	Xl	ω	CD	ω	ti	XJ	O	CD	□	CD
o	CD									CD
LJ
ru	CD										CD
	σι		ui		CD	ω	ti	ti	UI	□ c
		ti	ui	ΓΊ	CD	ru	CD	CD	ω	T>
	o									ax

f—*	I—1	1—1	H*
CO	G0	CO	CO
ax	co	CO	ho
O	cn	o	cn

RO 116969 Bl

I-»	Η*	H*
CU	CU	o>
σι	σι	CP
CP	o	CP

CU CP O

CU

CP

ω

u

X

> ώ ώ CD ΖΓ ω

CD

LAI

o

I

CD ώ

5

I

<

ω

î>

A. împopt

-4 τ 0) zj ω ® 3

O u

5

z >

X O

4

=1

m CD

3 ω

IER

00

£

•Η Ο

M3.

riva

ω N

Ct ’ ω

-4

CD

Q

o

J>

CD

ω

~i

ct

X)

0)

CD

<.

7Γ

ct

ω

0}

> χ

ct CD

ΓΌ

-i

O

o

no

no

no

o

ΓΌ

ci

r

CD

CD

xl

ω

ω

u

CD

CD

-U

4>

0)

b

O

O

o

b

b

b

h

h

b

□

a

r U 0) ct

xl

xJ

XJ

XJ

Dl

CJl

ui

UI

CJl

CJl

Ε

-

CD

CD

CD

CD

CD

ώ

CD

CD

CD

ώ

ώ

CD

ax

CJl

UI

UI

CJ1

UI

ui

UI

UI

CJl

CJl

CJ1

r

r

0,25

O b

O O

O o

0,0

o o

0'0

o b

0,8

O

□ b

Bază

□

□

O

o

o

o

o

o

1 săpt

Ac

ω

25

ΓΌ UI

O

ω

o

o

CD

1

tivitate

X

CD

□

ω

no

no

o

o

CD

nj CD

neu

CD

□

no

UI

o

O

ω

ω

o

ω

b

Q)( “0

ct “5 0)

ct

N ω “j

3 săp

CD

Γ0 Xl

O o

CD

0,5

7,5

-k ui

4,5

4,0

o CJl

□ b

o'g

t? CQ X

Ct

ml)

ΓΌ CJl

o o

ui

o ω

CD ΓΌ

o

t

3,0

o

o o

7,0

ω □x

ct

-O

ω

xl

ω

no

ω

□

CD 0)

UI

o

—i

00

CD

no

CD

no

N ax

>

—,

0

CD

CD

ω

UI

—*

CD

ω

CD

ct

UI

xl

CD

CD

m

ω

£D< “0 ct

corpi

CD

Ό

270

ro O O

ω O

5,6

no O O

79

ru CD

1 33 j

9,2

5,6

46

2 săpt

ecifici IgG

ΓΌ O O

ro

ω

ΊΣ

O O

CD

4^

ω

CD

ω

4^

cn

CQ X 3.

o o

-U

CD

—h

-*

xl

-Λ

ΓΌ

O

CDc τι

«—»

ΓΟ Gl)

Xl

CD

no

120

U

no

XJ

ω

CD

o

O o

CD

□

CD

CD

ui

0X •σ

<£Γ

Gl

o ă* o’ co

CD CD C

w JD O

£ *

110

HEC

CD 00 CD

MER

H00

VLA

CD —1 o

B.1.M3.8

B. împotriva M3.8

STA

POT

VEL

SMR

ί r; ♦ 4

Tratament activitate neutralizare

13.09,95

12.10.95

31.08.95

17.08.95

26.07.95

Dată tratament

O O

o o

o o

O O

O Q

O O

O O

o b

O □

O □

O b

O b

0,25

Bază

Activitate neutralizare (pg/ml)

t

o b

ro ui

o ’o

O ω

O ui

o O

1

O b

□ b

O O

o o

O ro

1 săpt

σι b

00 b

O

ω b

ω ω

O b

o CD .

k b

XJ —i

□

-

o o

CD O

Γϋ ω αχ 73 ct

0'9

CD o

UI □

CD o

CD Ο

ro ui

o b

CD b

Xl ω

4^ ω

no

o o

k UI

3 săpt

O

□

ΓΟ O

1

Ο

ro b

o CD

ro CD

p ω

o

o CD

00 CD

4 săpt

5,2

Γ0

ro xl

CD

—h b

ω O

o XJ

ω

p ω

ro CD

CD b

no ω

Xl ω

00 ω N ax

Anticorpi specifici IgG (pg/ml)

1

ΓΌ ω

ui ΓΟ

ΓΌ 00

ω O

p ω

p

—Λ

ω ω

o 00

ro ro

CD

1 săpt

2,3

220

—i Xl O

ω CD

CD Xj

ω

CD ω

CD O

270

310

ro o

ω ω

no O

2 săpt

3,3

ΓΌ O

O

Γϋ

O o

ΓΌ ui

Xl CD

ω o

ΓΟ 00 □

380

250

ω ω

150

3 săpt

3,5

ω O O

Γϋ —5 O

)

CD ω

—i

-U 00

o o

1

480

092

ts Xl

190

4 săpt

RO 116969 Bl co

CO

O co <_n co cn co -0 o i-¹

CO co o

OJ LO

UI

O (JI

O o

MER

H00

VLA

ST0

C.1.M3.8

C. M8.9

STA

POT

VEL

SMR

* *

GDD

DRI

ΚΝΑ

CD ώ ω ω ω X

Tratament activitate neutralizare

Cată tratament

o o

O

O O

o UI

0,0

0'0

0'0

o o

o UI

O ui

Ο b

Ο b

Bază

0,5

O UI

O ui

1

o

Γϋ UI

O b

0.0

□ UI

O ui

ο b

□ b

(0 □X O ct

Activitate neutralizare [pg/ml]

□,8

o UI

O UI

ω ui

ω □

Γϋ b

CD O

O b

ru b

ω ω

U1 ω

Γϋ

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 2 săpt

Γϋ

Γϋ o

O o

ω ui

ω b

Γϋ ’o

CD O

o o

b

Γϋ xl

-t. XI

-

3 săpt

3,0

Γϋ o

o

Γϋ o

ω b

Γϋ o

ω O

o o

UI b

Γϋ Γϋ

Ο

—i Γϋ

4 săpt

Γϋ

xl UI

Γϋ ω

ω

CD b

Γϋ

-U b

ω ui

ω

CD ω

_ω

00 ω

ro ω N □X

Γϋ UI

xj xl

00

Γϋ

CD

Γϋ CD

’ru

ω

00 ω

XJ

υι ω

XJ υι

1 săpt

Anticorpi i

55

ω

CD

00 00

Γϋ —Λ o

UD CD

Γϋ Xj

CD xl

G0 □

500

XI Ο Ο

008

Γϋ ω αχ TJ ct

specifici IgG [pg/ml]

58

ui

UD Γϋ

ui 00

UI o

130

CD ω

Γϋ b

CD CD

400

ω ο ο

xl υι

3 săpt

65

Γϋ

xl

xl

140

CD ω

ω o

ω O

00 Ο

ω ο ο

—Λ ο

4 săpt

RO 116969 Bl (*) retratament după 30 h;

(* *) tratament întrerupt după administrarea în bolus.

OJ O

I—¹ (_n

I-¹ cn

RO 116969 Bl

BRU	£ z * *	OTT	HEC
□ □	o o	O o	O □
1	0.0	o UI	0,0
□	6,5	0,5	2,0
□	9,0	6.0	CJl o
o o	7,5	ω b	<
b	-	5,8	—A CD
•	44	m ω	2,3
CD k) CJ1	ω ιυ o	CD ΓΌ	ro
UI CD	220	xl CD	UI O
5,8	310	110

RO 116969 Bl

Revendicări

Claims (15)

1. Derivați de stafilokinază, caracterizați prin aceea că au secvența de aminoacizi prezentată în fig. 1, în care unul sau mai mulți aminoacizi din unul sau mai multe dintre grupurile subliniate sunt înlocuiți cu alt aminoacid, astfel distrugându-se epitopii corespunzători.

2. Derivați de stafilokinază, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că au secvența de aminoacizi prezentată în fig. 1, în care unul sau mai mulți aminoacizi din unul sau mai multe dintre grupurile subliniate sunt înlocuiți cu alanină, modificând astfel epitopii corespunzători, fără a distruge activitatea biologică.

3. Derivați de stafilokinază, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizați prin aceea că, prin modificarea epitopilor, este redusă reactivitatea derivaților de stafilokinază cu o gamă de anticorpi monoclonali dirijați spre unul sau mai multe dintre cele 3 grupe de epitopi I, II sau III.

4. Derivați de stafilokinază, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizați prin aceea că, prin modificarea epitopilor, se reduce reactivitatea derivaților de stafilokinază cu o gamă de anticorpi monoclonali aleși dintre 17G11, 26A2, 3OA2, 2B12 și 3G1O, față de epitopi din grupa I.

5. Derivați de stafilokinază, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizați prin aceea că, prin modificarea epitopilor, se reduce reactivitatea derivaților de stafilokinază cu o gamă de anticorpi monoclonali aleși dintre 7H11, 25E1,4DC8, 24C4 și 1A1O, față de epitopi din grupa I.

6. Derivați de stafilokinază, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizați prin aceea că, Lys din poziția 74, Glu din poziția 75 și Arg din poziția 77 din grupul 8 subliniat s-au înlocuit cu alanină rezultând derivatul M8 de stafilokinază.

7. Derivați de stafilokinază,conform revendicărilor 1 și 2, caracterizați prin aceea că, Lys din poziția 35 și Glu din poziția 38 din grupul 3 subliniat s-au înlocuit cu alanină rezultând derivatul M3 de stafilokinază.

8. Derivați de stafilokinază, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizați prin aceea că, Glu din poziția 80 și Asp din poziția 82 din grupul 9 subliniat s-au înlocuit cu alanină rezultând derivatul M9 de stafilokinază.

9. Derivați de stafilokinază, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizați prin aceea că, Lys din poziția 35, Glu din poziția 38, Lys din poziția 74, Glu din poziția 75 și Arg din poziția 77 din grupurile 3 și 8 subliniat s-au înlocuit cu alanină rezultând derivatul M3.8 de stafilokinază.

10. Derivați de stafilokinază, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizați prin aceea că, Lys din poziția 74, Glu din poziția 75, Arg din poziția 77, Glu din poziția 80 și Asp din poziția 82 din grupurile 8 și 9 subliniat s-au înlocuit cu alanină rezultând derivatul M8.9 de stafilokinază.

11. Derivați de stafilokinază, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizați prin aceea că se administrează în tratamentul trombozei arteriale.

12. Procedeu pentru prepararea derivaților de stafilokinază, caracterizat prin aceea că, cuprinde:

- prepararea unui fragment ADN care cuprinde secvența care codifică stafilochinaza,

RO 116969 Bl

1480

- realizarea ADN-ului mutant prin mutageneza dirijată în situ, in vitro, printr-un sistem de mutageneză orientat pe oligonucleotidă, pentru a înlocui unul sau mai mulți dintre codonii care codifică stafilochinaza,

- donarea fragmentului ADN mutant într-un vector corespunzător,

- transformarea sau transfectarea unei celule gazdă adecvate cu vectorul; și

- cultivarea celulei gazdă în condiții corespunzătoare pentru expresia fragmentului ADN.

13. Procedeu, conform revendicării 12, caracterizat prin aceea că fragmentul ADN este un fragment EcoRI-Hindlll de 453 bp al plasmidului pMEX6O2SAK, procesul de mutageneza dirijată în situ, în vitro, se realizează printr-un sistem de mutageneză orientat pe oligonucleotidă folosind plasmidul pMa/c și tulpina de E.coli WK6MutS corectoare de deficit, iar fragmentul ADN mutant este donat în tulpina WK6 de E.coli.

14. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că, conține derivații de stafilokinază, definiți în revendicările 1 și 2, într-o cantitate eficientă terapeutic împreună cu un excipient acceptabil farmaceutic.

15. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 14, caracterizată prin aceea că se administrează în tratamentul trombozei arteriale.